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JP2002505300A - 組換え生ワクチンおよび補助剤 - Google Patents

組換え生ワクチンおよび補助剤

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JP2002505300A
JP2002505300A JP2000534234A JP2000534234A JP2002505300A JP 2002505300 A JP2002505300 A JP 2002505300A JP 2000534234 A JP2000534234 A JP 2000534234A JP 2000534234 A JP2000534234 A JP 2000534234A JP 2002505300 A JP2002505300 A JP 2002505300A
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JP
Japan
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virus
vaccine
gene
vector
vaccine according
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JP2000534234A
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English (en)
Inventor
オードネ，ジャン−クリストフ，フランシス
ミンク，ジュールス，マーテン
Original Assignee
メリアル
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 異種遺伝子をインビボで組み込み且つ発現するようにした組換え生ワクチンの改良。 【解決手段】 異種ヌクレオチド配列、好ましくは病原性遺伝子をインビボで組み込み且つ発現するウイルス性ベクターと、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよび無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーの中から選択される少なくとも１つの補助剤化合物とからなる組換え生ワクチン。補助剤化合物は砂糖またはポリアルコールのポリアルケニルエーテル(カルボメール)、特にアリールスクロース、またはアリールペンタエリスリトールで架橋したアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーか、例えばジビニルエーテルで架橋した無水マレイン酸とエチレンとのコポリマーにすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は１種または複数の異種遺伝子をインビボで組み込み且つ発現するよう
にした組換え生ワクチンの改良に関するものである。 本発明は特に、補助剤（アジュバンド）含有ワクチンと、このワクチン製造で
の補助剤化合物の使用と、そのワクチン接種方法とに関するものである。本発明
のさらに他の対象はこのワクチンの製造方法にある。
【０００２】
【従来の技術】
不活化ワクチンまたはサブユニットワクチンに補助剤（アジュバンド）を組み
合わせてワクチンに含まれる抗原に対する免疫反応を増加させることは既に知ら
れている。 微生物を弱毒化し、免疫反応が弱くなった時に弱毒生ワクチンに補助剤を組み
込むことも知られている。 最近では１つのワクチン価に対する不活化ワクチンと他のワクチン価に対する
弱毒生ワクチンとを用いて複数の病原に対する複合ワクチンも提案されている。
さらに、補助剤含有不活化ワクチン組成中に冷凍乾燥保存した弱毒生ワクチンを
再添加する方法も提案されている。この方法では補助剤は生ワクチン用製造時の
ベヒクルの役目をし、補助剤含有不活化ワクチン組成物に対しては補助剤効果は
ない。 欧州特許出願第５３２，８３３号はウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）によって
引き起される病気であるウマ鼻肺炎に対するワクチンが提案されている。このワ
クチンはポリアクリルポリマーをベースにした補助剤：ハブロゲン（Havlogen、
登録商標）を含む不活化ＥＨＶ−１ウイルス、不活化ＥＨＶ−４ウイルスとして
グループ化された不活性化された補助剤含有ワクチンである。
【０００３】 ほとんどのヘルペスウイルスに対して、感染後にウイルスを急激に除去できる
有効なワクチンはない。公知のワクチンは臨床的症状が出てからの対処保護手段
であり、ウイルス排出効果は一般に限られている。 欧州特許出願第５３２，８３３号で開発されたワクチンはウイルス排出率は約
７９〜９３％に達している(結果を参照)。ワクチン投与後の排出期間は通常は５
日以上であるのに対し、この特許では９匹中８匹の対照動物がワクチン投与後平
均１．４日でウイルスを排出している。このことは弱いワクチン投与がワクチン
接種したウマは対照群に比較して人工的な保護を高くするということを表してい
る。従って、この実験ではウイルス排出は重要ではない。
【０００４】 不活化ウイルスを含むウマインフルエンザワクチン（ＩＥＶ）にカルボメール
（carbomere）(カルボマー)型補助剤を用いることも知られている。 Mumford達（Epidemiol. Infect. (1994), 112, 421-437）に記載のように、一
過性の体液性反応およびウマウイルスに対する弱い保護を引き起こすには、二回
のウマＩＥＶワクチン投与が必要である。この著者は破傷風類毒素の存在下また
は非存在下で不活化ワクチンでのカルボメールおよび燐酸アルミニウムの補助剤
効果を比較している。全ての場合に１回目のワクチン接種後に菌株Ｈ７Ｎ７およ
びＨ３Ｎ８にＳＲＨ（単放射溶血）法で測定した抗体価が得られ、さらに強い一
過性反応を出現させるには２回目、３回目のワクチン接種が必要である。
【０００５】 米国特許出願第４，５００，５１３号にもカルボメールの存在下での不活化ワ
クチンを用いたウマインフルエンザウイルスに対するワクチン接種の試みが記載
されている。動物の起源およびその医学的状態は正確には記載されていないが、
地上動物のようである(第二パラグラフ、第１１行目)。赤血球凝集阻止法で測定
される高い抗体価から、この動物はおそらくインフルエンザに既に感染しており
、ワクチン接種後に引き起こされた反応は一次ワクチン接種ではなく、ブースタ
ー型のものであることが分かる。
【０００６】 さらに、Fort Dodge Solvayはカルボメール補助剤を含む不活性ウマインフル エンザワクチン(Durvaxyn IEおよび IE-Tプラス(登録商標))および不活性ウマ鼻
肺炎ワクチン（Durvaxyn EHV1,4(登録商標)を市販している。 水酸化アルミニウム補助剤を含むウマインフルエンザ用不活化ワクチン(例え ばTetagripiffa(登録商標), Merial, Lyon, France)も市販されている。
【０００７】 不活化ワクチンまたはサブユニットワクチンにはその他多数の補助剤が使用さ
れている。例えば水酸化アルミニウム、燐酸アルミニウム、アブリジン（Avridi
ne、登録商標）、ＤＤＡ、モノホスホリルリピッドＡ、プルロニック（Pluronic
） L121およびその他のブロックコポリマー、ムラミルペプチド、サポニン、ト レハロースジミコレート（dimycolate）、無水マレイン酸コポリマーおよびエチ
レンコポリマー、スチレンコポリマーおよびアクリル酸またはメタクリル酸コポ
リマー、ポリホスファゼン、油性乳剤等を挙げることができる。 国際特許出願第ＷＯ−Ａ−９４−１６６８１号ではウイルスの異種遺伝子を発
現する組換え生ワクチンを油中水、水中油または水中油 型の乳剤状補助ワクチ
ン組成物で被ってアジュバンドすることが提案されている。
【０００８】 しかし、これらの解決法にはいくつかの欠点がある。 すなわち、最終ユーザが冷凍乾燥された活性成分および既に構成された乳剤を
入手して冷凍乾燥された活性成分を再構成できるようにすべきである。 貯蔵時の乳剤の不安定性が再構成されたワクチンの効果および安全性に問題と
なることがある。 油相での不安定性の次に、弱毒化微生物の活性が問題になる。特に、生存度が
ゼロになるウイルスの場合にはこれが問題になる。 乳状ワクチンは注射時の安全性（innocuite）の問題もある。
【０００９】
【発明が解決しよとする課題】
本発明の目的は、補助剤を全く含まない同じワクチンに比べて免疫性を驚くほ
ど高くすることができ且つこのタイプのワクチンに完全に適した補助剤を含む、
異種遺伝子、特に少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を発現する組換え生ワ
クチンをベースにした新規なワクチン組成物を提供することにある。
【００１０】 本件出願人は、カルボメール化合物がこのタイプのワクチンに求められる条件
下で補助剤として予期し得ない割合で作用するということを発見した。動物のヘ
ルペスウイルス（ＥＨＶ−１、ウマヘルペスウイルス）で行なった試験でカルボ
メールを用いると試験感染時に予期しない比率でウイルス排出が減すことが示さ
れた。ウマインフルエンザＡウイルスで行なった他の試験でも、最もよい市販の
ワクチンを用いて得られるものよりも驚くほど早く、ウマに優れた非常に高い血
清価が得られた。
【００１１】
【課題を解決する手段】
本発明の対象は、異種ヌクレオチド配列、好ましくは病原性遺伝子がインビボ
で組み込まれ且つ発現するウイルス性ベクターと、アクリル酸またはメタクリル
酸のポリマーおよび無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーの中から選
択される少なくとも１つの補助剤化合物とからなる組換え生ワクチンにある。
【００１２】
【実施の態様】
好ましい化合物は砂糖(sucre)またはポリアルコールのポリアルケニルエーテ ルで架橋したアクリル酸またはメタクリル酸ポリマーである。これらの化合物は
カルボメール(carbomere)の用語で知られている（Pharmeuropa Vol.8, No.2, Ju
ne 1996）。米国特許出願第２，９０９，４６２号も参照のこと。この特許の内 容は本明細書の一部をなす。この特許には少なくとも３つ、好ましくは８つ以下
のポリヒドロキシル基を有し、少なくとも３つのヒドロキシルの水素原子が少な
くとも２つの炭素原子を有する不飽和脂肪族基で置換されたポリヒドロキシル化
合物で架橋されたアクリルポリマーが記載されている。好ましい基は２〜４個の
炭素原子を含むもの、例えばビニル、アリール、その他のエチレン性不飽和基で
ある。不飽和基自体が他の置換基、例えばメチルを含むことができる。カルボポ
ール(Carbopol、登録商標)（BF Goodrich社製、オハイオ、アメリカ合衆国）の 名称で市販の製品が特に適している。これはアリルサッカロースまたはアリルペ
ンタエリスリトールで架橋されている。これらの中で特にカルボポール(Carbopo
l、登録商標) 974P、934Pおよび971Pを挙げることができる。
【００１３】 無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーの中では線形または架橋し
たコポリマー、例えばジビニルエーテルで架橋した無水マレイン酸とエチレンと
のコポリマーであるエマ(ＥＭＡ、登録商標)(Monsanto社製)が好ましい。これに
関しては寧. Fields 達、Nature, 186: 778-780, 4 June 1960媒を参照できる。
この文献は本明細書の一部をなす。 構造の点からはアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよびコポリマーＥ
ＭＡは下記式の基本単位であるのが好ましい：
【００１４】
【化１】
【００１５】 （ここで、 Ｒ１とＲ２はＨまたはＣＨ３を表し、互いに同一でも異なっていてもよく、 ｘ＝０または１、好ましくはｘ＝１であり、 ｘ＋ｙ＝２、ｙ＝１または２である）。 コポリマーのエマ（ＥＭＡ、登録商標）ではｘ＝０、ｙ＝２であり、カルボメ
ールではｘ＝ｙ＝１である。 これらのポリマーを水に溶解すると酸性溶液となり、この溶液を好ましくは生
理学的ｐＨに中和して補助剤溶液とし、それとワクチンとを組み合わせる。ポリ
マーのカルボキシル基の一部はＣＯＯ-状態にある。
【００１６】 好ましくは、本発明の補助剤、特にカルボメール溶液は塩化ナトリウムの存在
下の蒸留水中に作るのが好ましい。得られた溶液は酸性ｐＨである。この原液に
ＮａＣｌを入れた水、好ましくは生理食塩水（ＮａＣｌ ９ｇ／ｌ）の必要量（
望ましい最終濃度を得るための量）を１回または複数回に分けて添加して希釈し
、それと同時にまたは後で、好ましくはＮａＯＨを用いて中和（ｐＨ７．３〜７
．４）する。生理学的ｐＨのこの溶液はワクチン、特に凍結乾燥状態で貯蔵され
たワクチンの再構成でそのまま用いられる。 最終ワクチン組成物中でのポリマー含有量は０．０１〜２％ｗ／ｖ、特に０．
０６〜１％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜０．６％ｗ／ｖである。
【００１７】 本発明は動物のヘルペスウイルスに対するワクチン接種に特に有用であること
が証明されている。本発明は特にウマヘルペスウイルス（特にＥＨＶ−１および
ＥＨＶ−４）、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、イヌヘルペスウイルス（ＣＨ
Ｖ）、トリヘルペスウイルス（MarekおよびＩＬＴＶ）、ウシヘルペスウイルス （ＢＨＶ）およびブタヘルペスウイルス（ＰＲＶ＝オーエスキー病ウイルスまた
は仮性狂犬病ウイルス）に有効である。 本発明の対象は少なくとも一種のこれらのヘルペスウイルスの遺伝子を組み込
み且つ発現する少なくとも一種のウイルスベクターと少なくとも一種の本発明補
助剤とからなる組換え生ワクチンにある。
【００１８】 このような遺伝子を発現できるポックスウイルスをベースにした発現ベクター
の製造の例は国際特許出願第ＷＯ−９２−１５６７２号を参照できる。この特許
の内容は本明細書の一部をなす。この特許には例えばＥＨＶ−１のｇＢ、ｇＣお
よびｇＤ遺伝子（ｖＣＰ３２）を発現するカナリア痘（これはＥＨＶ−４にも当
てはまる）、同じ遺伝子（ｖＰ １０４３）を発現するワクシニアウイルス、Ｂ
ＨＶ−１のｇＩ（ｇＢ）、ｇＩＩＩ（ｇＣ）およびｇＩＶ（ｇＤ）遺伝子を発現
するワクシニアウイルス、ＦＨＶ−１のｇＤを発現するカナリア痘、その他にＰ
ＲＶのｇＩＩ（ｇＢ）、ｇＩＩＩ（ｇＣ）およびｇｐ５０（ｇＤ）を発現する組
換え型が記載されている。さらに国際特許出願第９５−２６７５１号(参照とし て組み込まれている)を参照できる。この特許にはＣＨＶのｇＢ、ｇＣおよびｇ Ｄ遺伝子を発現する組換ウイルスｖＣＰ３２０、ｖＣＰ３２２およびｖＣＰ２９
４が記載されている。当業者はさらに、フランス国特許出願２，６４７，８０８
号または国際特許出願第９５−２６７５１号のＦＨＶ、ＰＲＶおよびＢＨＶ遺伝
子を発現する組替え型を参照できる。これらは本明細書の一部をなす。
【００１９】 本発明はさらに、インフルエンザウイルスに対するワクチン接種にも重要であ
ることが証明されている。ここではＥＩＶ(ウマインフルエンザウイルス)を挙げ
てある。さらにトリインフルエンザ(ＡＩＶ)、ブタインフルエンザ(ブタインフ ルエンザウイルス)を挙げることもできる。例として、当業者は国際特許出願第 ＷＯ−９２−１５６７２号のＥＩＶのＨＡ遺伝子を発現する組換えカナリア痘を
参照できる。
【００２０】 本発明の他の対象は、これらのヘルペスウイルスの少なくとも一種の遺伝子を
組み込み且つ発現する少なくとも一種のウイルスベクターと、少なくとも一種の
本発明補助剤とからなる組換え生ワクチンにある。このワクチンはＨＡ遺伝子が
組み込まれ且つ発現する２個または３個のベクターの混合物からなり、これらの
遺伝子は互いに異なる菌株、例えばウマインフルエンザ菌株Prague、Kentuckyと
Newmarketとを起源とするものである。２個または３個の菌株のＨＡを組み込み 且つ発現するのに単一のベクターを用いてもよい。
【００２１】 本発明は上記以外の他の動物の病原体、例えばＦｅＬＶ(例えばｅｎｖ、ｇａ ｇ＝ｖＣＰ９３およびｖＣＰ９７を発現する国際特許出願第ＷＯ−９２−１５６
７２号のカナリア痘組換え型を参照)、破傷風（国際特許出願第ＷＯ−９２−１ ５６７２号と、破傷風毒素を発現する組換え型ｖＣＰ１６１およびｖＰ１０７５
、カナリア痘およびワクシニア参照）、カレ病ウイルス（イヌジステンパーウイ
ルスまたはＣＤＶ）(参照として組み込まれている国際特許出願第ＷＯ−９５− ２７７８０号の組替え型ｖＣＰ２５８参照)にも適用することができる。
【００２２】 本発明の他の対象はこのようなウイルスの少なくとも１個の遺伝子を組み込み
且つ発現する少なくとも１個のウイルスベクターを含む組換え生ワクチンにある
。 本発明のさらに他の対象は、多価の組換えワクチンすなわち２つ以上の疾病の
抗原を２つ以上発現する組換えベクターを本発明の補助剤溶液中の混合物の状態
で含むものにある。
【００２３】 本発明はさらに、任意タイプのウイルス発現ベクター、例えばポックスウイル
ス（国際特許出願第ＷＯ−Ａ−９２−１５６７２号のＮＹＶＡＣを含むワクシニ
アウイルス、鶏痘、カナリア痘、鳩痘、豚痘等）、アデノウイルス、ヘルペスウ
イルスの使用にも適用される。本発明がカナリア痘すなわちＡＬＶＡＣ（国際特
許出願第ＷＯ−Ａ−９５−２７７８０号および第９２−１５６７２号）に特に適
している事が分かっている。 すぐ使用可能な状態のワクチン、特に再構成したワクチンでは、文献で説明さ
れる一般的な量のウイルスベクターが存在する。
【００２４】 組換え生ワクチンは一般に貯蔵できるように凍結乾燥状態で存在し、溶媒また
は賦形剤（ここでは本発明の補助剤）溶液中で用いる直前に再構成される。 本発明のさらに他の対象は、別々に包装された凍結乾燥状態のワクチンと本発
明補助剤化合物の溶液とからなる、凍結乾燥ワクチン再構成用のワクチン接種セ
ットにある。 本発明のさらに他の対象は、非経口、好ましくは皮下、筋肉内または皮内経路
或いは粘膜経路で本発明のワクチン(組換えベクター)を一回またはそれ以上の投
与回数で投与するワクチン接種方法にある。この方法では必要に応じて補助剤化
合物の溶液中で凍結乾燥ワクチンを再構成する予備段階が含まれる。
【００２５】 この方法の一つの目的は動物を臨床的観点から保護し、ウイルス排出を減らす
ことにある。これは特にヘルペスウイルスの場合に当てはまる。 この方法の他の目的は反応をより早く起こさせること、特に最初の投与から抗
体を免疫反応を増加させることにある。 本発明のさらに他の対象はより早い免疫反応および／または増加したウイルス
排出の減少を与える改良された組換え生ワクチンの製造での本発明補助剤化合物
の使用にある。これに関しては前記のことを参照のこと。 以下、添付図面を参照して本発明をより詳細に説明するが、本発明が下記実施
例に限定されるものではない。
【００２６】
【実施例】実施例１ カナリア痘ウイルス“ＡＬＶＡＣ”の挿入部位Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６用ドナープラス ミドの作成 カナリア痘ウイルス“ＡＬＶＡＣ”(Tartaglia 達、Virology, 1992. 188. 21
7-232、この内容は本明細書の一部をなす)の異なる挿入部位に対するドナープラ
スミドは国際特許出願第ＷＯ−Ａ−９５−２７７８０号、実施例２０に記載され
ている。 これらのプラスミドは本明細書で下記のように表される： “Ｃ３”部位用“プラスミドＶＱＨ６ＣＰ３ＬＳＡ．２” “Ｃ５”部位用“プラスミドＨＣ５ＬＳＰ２８” “Ｃ６”部位用“プラスミドｐＣ６Ｌ”。
【００２７】実施例２ 組換えウイルスｖＣＰ２５８（ＡＬＶＡＣ／ＣＤＶ ＨＡ＋Ｆ）の作成 ＣＤＶウイルスのOnderstepoort菌株を用いてＨＡおよびＦ遺伝子を単離した （Curran達、Virology. 1991. 72. 443-447（この内容は本明細書の一部をなす ）に記載のＨＡ遺伝子およびBarrett達、Virus Research. 1987. 8. 373-386に 記載のＦ遺伝子の配列）。 ＡＬＶＡＣウイルスのＣ６遺伝子座に発現カセットＨ６ワクチンプロモータ−
ＣＤＶ Ｆ遺伝子およびＨ６ワクチンプロモータ−ＣＤＶ ＨＡ遺伝子を挿入す
るためのドナープラスミドｐＭＭ１０３の構成は国際特許出願第ＷＯ−Ａ−９５
−２７７８０号の実施例１９に説明されている。 このプラスミドは前記明細書の実施例１９にｖＣＰ２５８として示された組換
えウイルスを作るインビトロ組換え用のドナープラスミド(Piccini達、Methods
in Enzymology. 1987. 153. 545-563)（この内容は本明細書の一部をなす）とし
てＡＬＶＡＣウイルスと一緒に用いられる。
【００２８】実施例３ 組換えウイルスｖＣＰ１５０２（ＡＬＶＡＣ／ＥＩＶ ＨＡ Prague）の作成 ＨＡ遺伝子（ＨＡ Prague菌株）の配列は国際特許出願第ＷＯ−Ａ−９２−１
５６７２号明細書の図２３に表されている。ウマインフルエンザウイルス菌株Pr
gue56のゲノムのウイルス性ＲＮＡをこのウイルスのウイルス顕濁液１００μｌ からCLONTECH社（Palo Alto, CA）製の抽出キット“全ＲＮＡ単離キット”(Cat#
K1042-1)を用いて抽出した。ＲＮＡペレットを１０μｌの超純水に溶解し、Prag
ue ＥＩＶ ＨＡ遺伝子を増幅するため、２μｌの純ウイルスＲＮＡおよび下記
オリゴヌクレオチドをテンプレートとして、補助ＤＮＡ合成反応、続いてＰＣＲ
反応（＝“ＲＴ−ＰＣＲ”反応）を実施した：
【００２９】
【式１】 得られたＰＣＲ断片をベクターｐＣＲＩＩ(Invitrogen, San Diego, CA)に結 合し、プラスミドｐＪＴ００７にした。
【００３０】 プラスミドｐＪＴ００７をＮｒｕＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、Ｈ６プロモ
ータの端部およびPrague 56 ＨＡ遺伝子全体を含む約１８００ｂｐのＮｒｕＩ−
７１８断片を単離する。この断片を予めＮｒｕＩおよびＡｓｐ７１８で消化した
ドナープラスミドＣ５ ＨＣ５ＬＳＰ２８と結合して、最終的にプラスミドｐＪ
Ｔ００８にする。このプラスミドは、ＡＬＶＡＣウイルスのＣ５遺伝子座に発現
カセットＨ６−Prague 56 ＨＡ遺伝子を含む。このプラスミドの構造は配列決定
および完全な制限酵素地図によって確認した。
【００３１】 このプラスミドはＣ５遺伝子座に発現カセットＨ６−Prague 56 ＨＡ遺伝子を
挿入するためのドナープラスミドである。 ＮｏｔＩで直線化した後、プラスミドｐＪＴ００８をインビトロ組換え用ドナ
ープラスミド(Piccini達、Methods in Enzymology. 1987. 153. 545-563)として
ＡＬＶＡＣウイルスとして用いてｖＣＰ１５０２で表される組換えウイルスを作
った。
【００３２】実施例４ 組換えウイルスｖＣＰ１５２９（ＡＬＶＡＣ／ＥＩＶ ＨＡ Kentucky 1/94） の作成 ウマインフルエンザウイルス菌株Kentucky 1/94のゲノムのウイルス性ＲＮＡ(
Daly他、J. Gen. Virol. 1996.77. 661-671、この内容は本明細書の一部をなす)
をこのウイルスのウイルス顕濁液１００μｌから、CLONTECH社（Palo Alto, CA ）製の抽出キット“全ＲＮＡ単離キット”(Cat#K1042-1)を用いて抽出した。Ｒ ＮＡペレットを１０μｌの超純水に溶解し、ＨＡ遺伝子を増幅するため、２μｌ
の純ウイルスＲＮＡおよび下記オリゴヌクレオチドをテンプレートとして、ＲＴ
−ＰＣＲ反応を実施した：
【００３３】
【式２】 得られたＰＣＲ断片をベクターｐＣＲＩＩ(Invitrogen, San Diego, CA)に結 合し、プラスミドｐＪＴ００１にした。プラスミドｐＪＴ００１でクローン化し
たKentucky 1/94菌株ＥＩＶ ＨＡ遺伝子の配列は遺伝子データバンクで入手可 能なKentucky 1/94菌株ＥＩＶ ＨＡ遺伝子の配列（アクセス番号Ｌ３９９１４ 、この内容は本明細書の一部をなす）と同じである。
【００３４】 ＨＡ遺伝子（Kentucky 1/94）を含むプラスミドｐＪＴ００１をＮｒｕＩおよ びＡｓｐ７１８で消化し、約１８００ｂｐのＮｒｕＩ−Ａｓｐ７１８断片（Ｈ６
プロモータの端部およびKentucky 1/94ＨＡ遺伝子全体を含む）を単離する。こ の断片を予めＮｒｕＩおよびＡｓｐ７１８で消化したドナープラスミドＣ５ Ｈ
Ｃ５ＬＳＰ２８と結合して、最終的にプラスミドｐＪＴ００５にする。このプラ
スミドは、ＡＬＶＡＣウイルスのＣ５遺伝子座に発現カセットＨ６−Kentucky 1
/94ＨＡ遺伝子を含む。このプラスミド構造は配列決定および完全な制限酵素地 図によって確認した。
【００３５】 このプラスミドはＣ５遺伝子座に発現カセットＨ６−Kentucky 1/94ＨＡ遺伝 子を挿入するためのドナープラスミドである。 ＮｏｔＩで直線化した後、プラスミドｐＪＴ００５をインビトロ組換え用ドナ
ープラスミド(Piccini他、Methods in Enzymology. 1987. 153. 545-563)として
ＡＬＶＡＣウイルスとして用いてｖＣＰ１５２９と示された組換えウイルスを作
った。
【００３６】実施例５ 組換えウイルスｖＣＰ１５３３（ＡＬＶＡＣ／ＥＩＶ ＨＡ Newmarket 2/93） の発生 ウマインフルエンザウイルス菌株Newmarket 2/93 (Daly達、J. Gen. Virol. 1
996.77. 661-671、この内容は本明細書の一部をなす)のゲノムのウイルス性ＲＮ
Ａをこのウイルスのウイルス顕濁液１００μｌから、CLONTECH社（Palo Alto, C
A）製の抽出キット“全ＲＮＡ単離キット”(Cat#K1042-1)を用いて抽出した。Ｒ
ＮＡペレットを１０μｌの超純水に溶解し、ＨＡ遺伝子を増幅するため、２μｌ
の純ウイルスＲＮＡおよび下記オリゴヌクレオチドをテンプレートとして、ＲＴ
−ＰＣＲ反応を実施した：
【００３７】
【式３】 得られたＰＣＲ断片をベクターｐＣＲＩＩ(Invitrogen, San Diego, CA)に結 合し、プラスミドｐＣＣＬ０２６にする。ＨＡ遺伝子（Newmarket 2/93菌株ＥＩ
Ｖ）の配列は、図１(配列番号７)で表される。
【００３８】 ＨＡ遺伝子（Newmarket 2/93）を含むプラスミドｐＣＣＬ０２６をＳｐｅＩお
よびＡｃｃＩで消化した。下記ヌクレオチドを徐冷し、ＳｐｅＩおよびＡｃｃＩ
で消化したプラスミドｐＣＣＬ０２６に結合して、プラスミドｐＪＴ００５にし
た：
【式４】 ２重線状のオリゴヌクレオチドＴＡＹ９９Ｎ／ＴＡＹ１００Ｎは、ＮｒｕＩ部
位までのＨ６プロモータ−の３‘領域およびＨＡ遺伝子の始めの４０個のコード
塩基を含む。
【００３９】 プラスミドＪＴ００３をＮｒｕＩおよびＸｈｏＩで消化し、Ｈ６プロモータの
端部およびNewmarket 2/93ＨＡ遺伝子全体を含む約１８００ｂｐのＮｒｕＩ−Ｘ
ｈｏＩ断片を単離する。この断片を予めＮｒｕＩおよびＸｈｏＩで消化したドナ
ープラスミドＣ５ ＨＣ５ＬＳＰ２８と結合して、最終的にプラスミドｐＪＴ０
０４にする。このプラスミドは、ＡＬＶＡＣウイルスのＣ５遺伝子座に発現カセ
ットＨ６−Newmarket 2/93遺伝子を含む。このプラスミドの構造は配列決定およ
び完全な制限酵素地図によって確認した。
【００４０】 このプラスミドは、Ｃ５遺伝子座に発現カセットＨ６−Newmarket 2/93遺伝子
を挿入するためのドナープラスミドである。 ＰｖｕＩで直線化した後、プラスミドｐＪＴ００４をインビトロ組換え用ドナ
ープラスミド(Puccini他、Methods in Enzymology. 1987. 153. 545-563)として
ＡＬＶＡＣウイルスを用いてｖＣＰ１５３３と示された組換えウイルスを作った
。
【００４１】実施例６ 組換えウイルスｖＣＰ１３２（ＡＬＶＡＣ／ＥＨＶ−１ｇＢ＋ｇＣ＋ｇＤ）の作 成 組換えウイルスの構成は国際特許出願第ＷＯ−Ａ−９２−１５６７２号の実施
例２５および２６に説明されている。このウイルスはＡＬＶＡＣウイルスとドナ
ープラスミドｐＪＣＡ０４９とのインビトロの組換えにより生じた。このプラス
ミドは、挿入部位Ｃ３にクローン化される下記の３つの発現カセットを含む：
【００４２】 Ｉ３Ｌワクシニアプロモータ−ＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子 Ｈ６ワクシニアプロモータ−ＥＨＶ−１ ｇＣ遺伝子 ４２Ｋ昆虫ポックスプロモータ−ＥＨＶ−１ ｇＤ遺伝子 ＥＨＶ−１ ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ遺伝子は、国際特許出願第ＷＯ−Ａ−９２−１
５６７２号の図２（ＥＨＶ−１遺伝子ｇｐ１３＝ｇＣの配列）、図６（ＥＨＶ−
１遺伝子ｇｐ１４＝ｇＢの配列）および図１２（ＥＨＶ−１遺伝子ｇＤ、ｇｐ６
３およびｇＥの配列）に記載されている。
【００４３】実施例７ 組換えウイルスｖＣＰ２４３（ＡＬＶＡＣ／ＦＨＶ−１ ｇＢ＋ｇＣ＋ｇＤ）の 作成 ＦＨＶ−１ ｇＢ遺伝子(ＣＯ菌株)の配列は国際特許出願第ＷＯ−Ａ−９０−
１２８８２号の図３４に記載されている。 ＦＨＶ−１ ｇＣ遺伝子(ＣＯ菌株)（配列は図２に表される）(配列番号１０)
は、ＥｃｏＲＩ Ｆ断片（７．６ｋｂｐ）からクローン化された。これは１５９
９ｂｐの大きさで、５３３アミノ酸のプロテインをコード化する。 ＦＨＶ−１ ｇＤ遺伝子(ＣＯ菌株)（配列は国際特許出願第ＷＯ−Ａ−９２−
１５６７２号の図２８に表される）(配列番号１０)は、ＥｃｏＲＩ Ｍ断片（４
．４ｋｂｐ）(プラスミドｐＦＨＶＥｃｏＲＩＭ)からクローン化された。
【００４４】転写終結信号（ＴＴＴＴＴＮＴ）の所で変異した発現カセットＩ３Ｌ−ＦＨＶ− １ ｇＢ遺伝子の構成。 下記オリゴヌクレオチドを１２０ｂｐの末端のＸｂａＩプロモータＩ３Ｌ（Ｉ
３Ｌワクシニアプロモータを含む）＝断片Ａを発生するためワクシニアプロモー
タ（Riviere 他、J. Virol. 1992. 66. 3424-3434、参照として組み込まれる） を含むプラスミドのテンプレートを用いたＰＣＲ増幅に用いた：
【式５】
【００４５】 下記オリゴヌクレオチドを、プラスミドｐＪＣＡ００１のテンプレートからの
ＰＣＲによって末端のＢａｍＨＩ断片７２０ｂｐ（ＦＨＶ−１ｇＢ遺伝子の５‘
部分を含む）＝断片Ｂを作るために用いた：
【式６】
【００４６】 断片ＡをＸｂａＩで消化し、次に燐酸化した。断片ＢをＢａｍＨＩで消化し、
次に燐酸化した。断片ＡおよびＢを予めＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化したベクタ
ーpBluescript ＳＫ＋と結合し、プラスミドｐＪＣＡ０７５にする。 下記オリゴヌクレオチドは、プラスミドｐＪＣＡ０７５のテンプレートからの
ＰＣＲによって末端の５１０ｂｐのＸｂａＩ断片（信号ＴＴＴＴＴＮＴの所で変
異したＦＨＶ−１ ｇＢ遺伝子の５‘部分に融合されるＩ３Ｌプロモータを含む
）＝断片Ｃを作るために用いた：
【式７】
【００４７】 下記オリゴヌクレオチドを、プラスミドｐＪＣＡ０７５のテンプレートからの
ＰＣＲによって３３０ｂｐの末端のＢａｍＨＩ断片（ＦＨＶ−１ ｇＢ遺伝子の
中心部分を含む）＝断片Ｄを作るめに用いた：
【式８】
【００４８】 断片ＣをＸｂａＩで消化し、次に燐酸化した。断片ＤをＢａｍＨＩで消化し、
次に燐酸化した。断片ＣおよびＤを予めＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化したベクタ
ーpBluescript ＳＫ＋と結合し、プラスミドｐＪＣＡ０７６にした。 下記オリゴヌクレオチドを、プラスミドｐＪＣＡ００１のテンプレートからの
ＰＣＲによって６９５ｂｐの末端のＥｃｏＲＩ断片（ＦＨＶ−１ ｇＢ遺伝子の
最初の３‘部分を含む）＝断片Ｅを作るめに用いた：
【式９】
【００４９】 下記オリゴヌクレオチドを、プラスミドｐＪＣＡ００１のテンプレートからのＰ
ＣＲによって５６０ｂｐの末端のＰｓｔＩ断片（信号ＴＴＴＴＴＮＴの水準で変
異したＦＨＶ−１ ｇＢ遺伝子の第２の３‘部分を含む）＝断片Ｆを作るめに用
いた：
【図１０】
【００５０】 断片ＥをＥｃｏＲＩで消化し、次に燐酸化した。断片ＦをＰｓｔＩで消化し、
次に燐酸化した。断片ＥおよびＦを予めＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化したベクタ
ーｐＩＢＩ２４(Intenational Biotechnologies Inc., New Haven, CT)と結合し
、プラスミドｐＪＣＡ０７６(カセットＩ３ＬワクシニアプロモータＦＨＶ−１ Ｂ遺伝子)を生じる。
【００５１】 発現カセット４２Ｋ−ＦＨＶ−１ｇＤの構成 下記オリゴヌクレオチドは、４２Ｋの昆虫ポックスウイルスＡｍＥＰＶプロモ
ータ（米国特許出願第５，５０５，９４１号の実施例２１で説明されている）を
含むプラスミドのテンプレートからのＰＣＲによって１３０ｂｐの末端のＥｃｏ
ＲＩ断片（４２Ｋの昆虫ポックスプロモータを含む）＝断片Ａを作るめに用いた
：
【式１１】
【００５２】 下記オリゴヌクレオチドは、プラスミドｐＦＨＶＥｃｏＲＩＭのテンプレートか
らのＰＣＲによって１８５ｂｐの末端のＢａｍＨＩ断片（ＦＨＶ−１ ｇＤ遺伝
子の‘５部分を含む）＝断片Ｂを作るめに用いた：
【式１２】 断片ＡをＥｃｏＲＩで消化し次に燐酸化した。断片ＢをＢａｍＨＩで消化し、次
に燐酸化した。断片ＡおよびＢを予めＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化したベクタ
ーpBluescript SK＋と結合し、プラスミドｐＪＣＡ０７8にした。
【００５３】 プラスミドｐＦＨＶＥｃｏＲＩＭ(前記参照)をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し
、１２７０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片（ＦＨＶ−１ ｇＤ遺伝子の‘３部
分を含む）を単離した。この断片を予めＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化したベクタ
ーｐＩＢＩ２４と結合し、プラスミドｐＪＣＡ０７２にした。下記オリゴヌクレ
オチドは、プラスミドｐＦＨＶＥｃｏＲＩＭのテンプレートからのＰＣＲによっ
て、平滑末端のＸｂａＩ−ＸｈｏＩ断片、２９０ｂｐを作るめに用いた。：
【式１３】 この断片をＸｂａＩとＸｈｏＩ＝断片Ｃ（ＦＨＶ−１ ｇＤ遺伝子の端部を含む
）で消化した。
【００５４】 プラスミドｐＪＣＡ０７２をＸｂａＩとＸｈｏＩで消化し、３５７５ｂｐのＸ
ｂａＩ−ＸｈｏＩ断片（ベクターｐＩＢＩ２４＋ＦＨＶ−１ ｇＤ遺伝子の‘３
部分の開始点）＝断片Ｄを単離した。断片ＣとＤを結合し、プラスミドｐＪＣＡ
０７３にした。 プラスミドｐＪＣＡ０７３をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、９６０ｂｐのＢ
ａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片（ＦＨＶ−１ ｇＤ遺伝子の‘３部分を含む）＝断片Ａ
を単離した。断片ＣとＤを結合し、プラスミドｐＪＣＡ０７３にした。プラスミ
ドｐＪＣＡ０７８をＨｐａＩとＢａｍＨＩで消化し、３１０ｂｐのＨｐａＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片（ＦＨＶ−１ ｇＤ遺伝子の‘５部分に融合した４２Ｋプロモータ
を含む）＝断片Ａを単離した。断片ＡおよびＢを予めＥｃｏＲＶとＸｈｏＩで消
化したベクターpBluescript SK＋で結合し、プラスミドｐＪＣＡ０８０を作る( カセット４２Ｋプロモータ−ＦＨＶ−１ｇＤ遺伝子を含む)。
【００５５】カセットＨ６−ＦＨＶ−１ｇＣの構成 ＦＨＶ−１ウイルス(ＣＯ菌株)のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、約７５
００ｂｐのＥｃｏＲＩ Ｆ断片をpBluescript SK＋にクローン化してプラスミド
ｐＦＨＶＥｃｏＲＩＦを作る。下記オリゴヌクレオチドを、プラスミドｐＦＨＶ
ＥｃｏＲＩＦのテンプレートからのＰＣＲによって、ＮｒｕＩとＳａｌＩで予め
消化した断片を作り、１０７ｂｐのＮｒｕＩ−ＳａｌＩ断片（ＦＨＶ−１ ｇＣ
遺伝子の５‘部分に融合されるＨ６ワクシニアプロモータの３’部分を含む）＝
断片Ａを作るために用いられた：
【式１４】
【００５６】 下記オリゴヌクレオチドは、プラスミドｐＦＨＶＥｃｏＲＩＦのテンプレート
からのＰＣＲによって、ＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩで予め消化した断片を作り
、３７０ｂｐのＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩ断片（ＦＨＶ−１ ｇＣ遺伝子の３
‘部分とＨｐａＩ−ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む）＝断片
Ｂを作るために用いた：
【式１５】
【００５７】 プラスミドｐＪＣＡ０２０（上記参照）をＮｒｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消
化し、ＮｒｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｈ６ワクシニアプロモータの５‘を含む
）＝断片Ｃを単離した。プラスミドｐＦＨＶＥｃｏＲＩＦをＢａｍＨＩおよびＥ
ｃｏＲＶで消化し、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片（ＦＨＶ−１ｇＣ遺伝子の中心
部分を含む）＝断片Ｄを単離した。断片ＡおよびＣを予めＨｉｎｄＩＩＩとＳａ
ｌＩで消化したベクターpBluescript SK＋で結合し、プラスミドｐＪＣＡ０９７
にした。断片ＢおよびＤを予めＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したベクター
pBluescript SK＋で結合し、プラスミドｐＪＣＡ０９９にした。
【００５８】 プラスミドｐＪＣＡ０９７をＰｓｔＩおよびＳａｌＩで消化し、２００ｂｐの
ＰｓｔＩ−ＳａｌＩ断片（ｇＣのカセットＨ６−５‘部分を含む）＝断片Ｅを単
離した。プラスミドｐＦＨＶＥｃｏＲＩＦをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し
、６００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片（ＦＨＶ−１ｇＣ遺伝子の第２の中心
部分を含む）＝断片Ｆを単離した。断片ＥおよびＦを予めＢａｍＨＩとＰｓｔＩ
で消化したベクターpBluescript SK＋で結合し、プラスミドｐＪＣＡ０９８にし
た。プラスミドｐＪＣＡ０９８をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、８２０ｂｐ
のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＦＨＶ−１ｇＣのカセットＨ６−５‘部分を含
む）＝断片Ｇを単離した。プラスミドｐＪＣＡ０９９をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化し、９６０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ＦＨＶ−１ｇＣ
遺伝子の３‘部分を含む）＝断片Ｈを単離した。断片ＧおよびＨを予めＥｃｏＲ
ＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したベクターpBluescript SK＋で結合し、プラスミド
ｐＪＣＡ１００にした（発現カセットＨ６ワクシニアプロモータ−ＦＨＶ−１ｇ
Ｃ遺伝子を含む）。
【００５９】 プラスミドｐＪＣＡ１００をＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、１６５０ｂ
ｐのＦＨＶ−１ｇＣ遺伝子と融合したＨ６プロモータの３‘を含むＮｒｕＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片を単離した。この断片をＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化したプラ
スミドｐＪＣＡ０５３（ベクターpBluescript SK＋内のカセットＶＱＨ６−ＩＢ
Ｖ Ｍ）で結合し、プラスミドｐＪＣＡ１０８にした（pBluescript SK＋内のカ
セットＶＱＨ６−ｇＣを含む）。プラスミドｐＪＣＡ０７９（前記参照）をＳｍ
ａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、８４０ｂｐのＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片(ＦＨ Ｖ−１ｇＢ遺伝子のカセットＩ３Ｌ−５’部分を含む)＝断片Ａを単離した。ま たプラスミドｐＪＣＡ０７９をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、２１
５５ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片(ＦＨＶ−１ｇＢ遺伝子の３’部分 を含む)＝断片Ｂを単離した。プラスミドｐＪＣＡ１０８（前記参照）をＨｉｎ ｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、１８３０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ断片(カセットＶＱＨ６−ＦＨＶ−１ｇＣを含む)＝断片Ｃを単離した。プラス
ミドｐＪＣＡ０８０（前記参照）をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、１２７
５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片(カセット４２Ｋ−ＦＨＶ−１ｇＤ遺伝子を 含む)＝断片Ｄを単離した。断片Ａ、Ｂ、ＣおよびＤをプラスミドｐＣ６Ｌで結 合し、プラスミドｐＪＣＡ１０９にした。
【００６０】 このプラスミドは、ＡＬＶＡＣウイルスのＣ６遺伝子座に発現カセットＨ６−
ＦＨＶ−１遺伝子ｇＣ、Ｉ３Ｌ−ＦＨＶ−１ｇＢ遺伝子および４２Ｋ−ＦＨＶ−
１ｇＤ遺伝子を含む。このプラスミドの構造は配列決定および完全な制限酵素地
図によって確認した。 ＮｏｔＩで直線化した後、プラスミドｐＪＣＡ１０９をインビトロ組換え用ド
ナープラスミド(Piccini他、Methods in Enzymology. 1987. 153. 545-563)とし
てＡＬＶＡＣウイルスを用いてｖＣＰ２４３と示された組換えウイルスを作った
。
【００６１】実施例８ 補助剤 本発明のワクチンに用いられたカルボメールはBF Goodrich社が製造したカー ボポール（Carbopol 974P、登録商標）である（ＭＷは約３，０００，０００） 。 １．５％ｗ／ｖのCarbopol 974Pを含む原液を先ず１ｇ／ｌの塩化ナトリウム を含む蒸留水中に作った。この原液を４ｍｇ／ｍｌのCarbopol生理食塩水溶液を
製造するのに用いた。原液を生理食塩水全体（必要な場合にはその大部分）に１
度または必要に応じて数回にわけてＮａＯＨ（例えば１Ｎまたはそれ以上に濃縮
された）を用いてｐＨを約７．３〜７．４に調整した。 こうして、最終ユーザが凍結乾燥生ワクチンを再構成するのに使用可能なカー
ボポール（Carbopol）の溶液を得た。
【００６２】実施例９ １型ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ−１）の糖タンパクｇＢ、ｇＣおよびｇＤを 発現する組換えカナリア痘ベクターｖＣＰ１３２（実施例６参照）を用いたウマ へのワクチン接種 １．免疫処置およびワクチン投与のプロトコル ＥＨＶ−１およびＥＨＶ−４に露出していないその血清学的兆候を全く示さな
い２０頭のポニー(ウェルシュ・マウンテンポニー)を５頭のポニーから成る４グ
ループ（Ａ〜Ｄ）にランダムに分布させた。
【００６３】 グループＡおよびＢにはＥＨＶ−１のKentucky D菌株の糖タンパクｇＢ、ｇＣ
およびｇＤを発現する組換えカナリア痘ｖＣＰ１３２を接種した。ワクチンは実
施例８に従い滅菌水(グループＡ)または４ｍｇ／ｍｌのカルボメール溶液(グル ープＢ)で再構成した。 グループＣには一回の投与量１．５ｍｌ中に不活性のＥＨＶ−１およびＥＨＶ
−４のワクチン価および６ｍｇのカルボメールを含む市販の完全不活化ＥＨＶワ
クチンを接種した。 グループＤは対照群であり、そこでは動物にグループＢと同じ条件下のカルボ
メール中で再構成したインフルエンザＡ／ウマ−1／Prague56ウイルス(実施例３
参照)を発現する組換えカナリア痘ウイルスｖＣＰ１５０２を接種した。 各ワクチンは下記［表１］に詳細に説明されている：
【００６４】
【表１】
【００６５】 各動物には首の深い筋肉内注射でＤ０〜Ｄ３５に対応するワクチンの一回分を
投与した。 Ｄ５６では、ポニーにＥＨＶ−１のＡｂ４／８菌株の１０5ＴＣＩＤ50を鼻空 内滴下注入でワクチン投与した。
【００６６】 ２．血清試験 “Thompson他、Equine Vet. J., 8, 58-65, 1976”に記載の方法で中和試験Ｓ
Ｎを実施した。ＥＨＶ−１ウイルス（ＲＡＣＨ）を抗原として用いた。 ＳＮ滴定量は５０％中和となる血清希釈の逆数で表される。
【００６７】 ３．ウイルスのモニタリング ウイルスの発現をウイルス移送培地に集められた鼻咽頭スワブを用いて１０日
以上毎日モニターした。スワブ抽出物をマイクロタイタープレートのウサギの肝
細胞ＲＫ１３上で滴定した。滴定量をｌｏｇ10ＴＣＩＤ50で表されるKarber方程
式を用いて計算した。
【００６８】 ４．結果 ワクチン接種後に局所または全身の有意な反応は全く見られなかった。 平均血清中和ＳＮ抗体反応（希釈のｌｏｇ１０が５０％中和をもたらす）は下
記の通り（D＝日）： グループ D.0の滴定量 D.56の滴定量 (ワクチン投与前) Ａ 1.69±0.49 1.93±0.15 Ｂ 1.69±0.47 2.61±0.42 Ｃ 1.19±0.30 2.47±0.32 Ｄ 1.57±0.45 1.55±0.37
【００６９】 抗体滴定量の有意な増加がカルボメール中のワクチンｖＣＰ１３２に見られる
。 ５頭の対照ポニー全てが上咽頭からウイルスを排出した。これらのワクチン接
種していないポニーにおけるウイルスの排出は平均５日間続き、最大ウイルス排
出は感染後４日である。
【００７０】 グループＡ、ＣおよびＤのポニー全てがワクチン投与後にウイルスを排出した
。これとは対照的に、本発明に従ってワクチン接種をしたＢグループの５頭のポ
ニーは２頭のみがウイルスを排出した。さらに、グループＢで排出されたウイル
ス量は、グループＣを含む他のグループから排出された量より有意に少ない。同
様に、グループＢの動物の排出期間は他のグループの動物に比べてずっと短い。
【００７１】 図１および曲線の下の面積値から、カルボメールを含むｖＣＰ１３２をワクチ
ン接種したポニーにはウイルスの排出が見られないことが視覚的にはっきりと示
されている。この結果は市販のワクチンと比較すると非常に重要である。対照群
と比較してグループＢの動物にウイルス排出の有意な減少が見られたが、グルー
プＣの動物と対照群との間には有意な違いは見られなかった。こうした驚くべき
そして予想外のウイルスの減少は特にウマからウマへのウイルスの伝播を制限す
るのに非常に好ましく、特に有利である。
【００７２】 ポニー１頭当たりの全ウイルス(曲線の下の領域) Ａ： １７．１ Ｂ： ３．０ Ｃ： ９．７ Ｄ： １６．３
【００７３】実施例１０ カルボメールの存在下でのインフルエンザＡ／ウマ−２／Newmarket／2／93ウイ ルスのＨＡ糖タンパクを発現するカナリア痘ベクターｖＣＰ１５３３(実施例５ 参照)を用いたウマへのワクチン接種。 １．免疫処置およびワクチン投与のプロトコル ＳＲＨ（単ラジカル溶血反応に対して）テストで測定されたＨ３Ｎ８およびＨ
７Ｎ７ウイルスに対する検出可能な抗体を全く示さない２０頭の７〜８ヶ月のポ
ニー(ウェルシュ・マウンテンポニー)をこの実験に使用した。動物が負の状態で
あることによって最良の条件下で体液反応の点から種々のワクチンの有効性を実
験することができる。ポニーは５〜６頭のポニーから成る４グループ（Ａ〜Ｄ）
にランダムに分布させた。
【００７４】 グループＡにはインフルエンザＡ／ウマ−２／Newmarket／2／93ウイルスのＨ
Ａ糖タンパクを発現する組換えカナリア痘（ｖＣＰ１５３３）をワクチン接種し
た。このワクチンは４ｍｇ／ｍｌのカルボメール：Carbopol 974P8(登録商標)を
含む溶液中で再構成した。 グループＢには、一回の投与量１．５ｍｌ中に３種のインフルエンザの不活化
菌株すなわちPrague/56、Suffolk/89およびMiami/63の混合物、破傷風毒素と補 助剤としてカルボメール（４ｍｇ）および水酸化アルミニウム（２．２ｍｇ）を
含む市販のワクチンを接種した。
【００７５】 グループＣには２種の不活化インフルエンザ価すなわちPrague/56、Newmarket
/2/93および水酸化アルミニウム中の破傷風毒素を含むワクチンＣを接種した。 グループＤには上記の４ｍｇ／ｍｌのカルボメール974Pを含む溶液で再構成し
た組換えカナリア痘ベクターｖＣＰ１３２をワクチン接種した。このグループを
ワクチン投与の対照群とした。 各ワクチンは下記［表ＩＩ］に詳細に説明されている：
【００７６】
【表２】
【００７７】 各動物には５週間隔で首へ深い筋肉内注射して各ワクチン１ｍｌを２回分投与
した。２回目のワクチン接種から２週間後、熱unford達、Equine Vet, J., 22:
93-98, 1990媒に記載のようにULTRA 2000モデル噴霧装置（De Villbiss, Somers
et PA）を用い、全部で１０7.3ＥＩＤ50のインフルエンザＡ−ウマ−２−/Susse
x／2／93ウイルスに対して約２０ｍｌの尿膜腔液から得られた煙霧剤に各ポニー
を露出して感染させた。
【００７８】 ２．血清試験 全血サンプルを下記の日に回収した：０日(１回目のワクチン接種と同じ日で 接種前)、７日、１４日、３５日（２回目のワクチン接種と同じ日で接種前）、 ４９日（ワクチン投与と同じ日で接種前）、５６日および６３日。 血清を作り、貯蔵し、使用するまで−２０℃で冷凍保存した。Wood達(J. Hyg.
, 90: 371-384, 1983)に記載のように全ての血清をインフルエンザＡ／ウマ−1 ／Prague／56およびインフルエンザＡ／ウマ−２／Newmarket／2／93に対するＳ
ＲＨ抗体の存在に関してテストした。 溶血範囲の直径を自動読み取り器を用いて２方向に直角に測定した。この範囲
の表面積を計算し、５０％の増加が有意であるとみなした。滴定量は溶血のｍｍ 2 で表された。
【００７９】 ３．ウイルスのモニタリング ウイルス移送培地に鼻咽頭スワブを回収し、１０日以上毎日、ウイルスの排出
をモニターした。各スワブからの浸出液をｐＨ７．２のＰＢＳ中の１０倍の連続
希釈し、０．１ｍｌの各希釈溶液を１０日目の孵化鶏卵の尿膜腔に接種した。ス
ワブ抽出物中のウイルス滴定量（ＥＩＤ50／ｍｌ）を７２時間３４℃で卵を保温
した後回収された尿膜腔液中の赤血球凝集活性度から計算した。
【００８０】 ４．結果 グループＢの１頭のウマを除き、一回目のワクチン接種後に局所または全身の
有意な反応は全く見られなかった。 菌株SuffolkおよびNewmarketは互いに類似し（Daly達、J.Gen. Virol. 1996,
661-671）、臨床条件下で完全に有効である市販のワクチンに匹敵することは注 目すべきである。実験開始時にはどのポニーもインフルエンザＡ／ウマ−1／Pra
gue／56またはインフルエンザＡ／ウマ−２／Newmarket／2／93に対する検出可 能なＳＲＨ抗体を有していなかった。１回目のワクチン接種の１週間後の血清学
的結果は、どのポニーも予めインフルエンザに感染していなかったことを示して
いる（観察できる追加免疫効果無し）。
【００８１】 １回目のワクチン接種の２週間後、どのポニーもインフルエンザＡ／ウマ−1 ／Prague／56に対する検出可能な抗体反応を発生しなかった。さらに、ワクチン
Ｃを接種した６頭のうち６頭、市販のワクチンＢを接種した５頭のうち４頭、対
照グループＤに、インフルエンザＡ／ウマ−２／Newmarket／2／93に対する検出
可能なＳＲＨ抗体が無かった。対照的に、カルボメール補助剤の存在下でカナリ
ア痘をワクチン接種した５頭のポニー全てに非常に高いＳＲＨ抗体滴定量が見ら
れた(平均１５５．４±３２．９。下記［表III］はＳＲＨ抗体滴定量に関する動
物１頭ずつに対して得られた結果を表す。
【００８２】 表III ＳＲＨ結果（ｍｍ2）
【表３】 本発明のワクチンによって、１回目のワクチン接種後１４日から高い抗体滴定
量が現れた。全体にワクチンＢおよびＣに対しては一回目のワクチン接種はこの
日に検出可能な水準の抗体の出現は引き起こさなかった。こうした早期に滴定量
が得られることは以前には決して見られなかった、驚くべき予想外の結果である
。
【００８３】実施例１１ カルボメールの存在下でインフルエンザＡ／ウマ−１／Prague 56ウイルスのＨ Ａ糖タンパクを発現する組換えカナリア痘ベクターｖＣＰ１５０２(実施例３参 照)を用いたウマへのワクチン接種。 ｖＣＰ１５０２を接種した実施例１の対照群を血清学的見地からモニターした
。 下記[表IV]は０日（１回目の注射Ｖ1）および３５日（２回目の注射Ｖ2）にCa
rbopol 974Pを用いて１０8ｐｆｕのｖＣＰ１５０２で免疫化した動物に得られた
ＩＨＡ（赤血球凝集抑制）滴定量を示す。
【００８４】
【表４】
【００８５】 前記実施例のように、カルボメールと混合したカナリア痘−ＥＨＶ（Ａウマ−
PragueウイルスのＨＡ遺伝子を発現する）の注射によって、ワクチン接種後Ｄ１
４から高い特有のＩＨＡ滴定量が得られることが分かる。驚くべきことに、これ
らの高い滴定量は追加免疫後に有意に増加し、第一刺激を受けたことの無いウマ
へのＥＩＶ Ｈ７Ｎ７ウイルスのＨＡ抗原に対して今まで決して見られなかった
水準の非常に高い平均滴定量に達する。
【００８６】実施例１２ ネコへの応用 テストする組換えウイルスはネコヘルペスウイルス（Feline Herpesvirus＝Ｆ
ＨＶ）のｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を発現する組換えカナリア痘ウイルスであ
る。この組換えウイルスをｖＣＰ２４３(実施例７参照)と同定された。。 ＦＨＶモデルのワクチン接種／ワクチン投与プロトコルは下記の通り。
【００８７】
【表５】
【００８８】 各ネコにはＤ０とＤ２８に皮下経路でワクチン接種した(Ｄ＝日)。 ワクチンCORIFELIN(登録商標)は、少なくとも２００ＩＤＲユニットのＦＨＶ ウイルス断片、２５μｇの精製ネコカリチウイルス抗原、０．１ｍｇのチオメル
サールおよび油性賦形剤ＱＳを１ｍｌ含むメリアル社（リヨン、フランス）から
市販のサブユニットＦＨＶワクチンである。 ワクチン投与はＤ４９にＦＨＶワクチン投与菌株に対して口鼻経路で実施する
。 ワクチン投与後１４日間、臨床的兆候に注意して（European Pharmacopoeiaの
規則による臨床的兆候に注意する）臨床モニタリングを実施する。
【００８９】 下記判定基準でワクチン投与後に保護を推定する。 (1) 各グループの平均臨床スコア(対照グループの平均臨床スコアと比較)。 (2) ワクチン投与後のＦＨＶウイルス排出レベル（ワクチン投与後Ｄ０からＤ １０まで毎日咽頭のスワブのウイルス負荷を測定） (3) Ｄ０、Ｄ２８、Ｄ４９、Ｄ６３に回収された血液サンプル上のＦＨＶウイ ルス中和抗体滴定量。 これら全ての判定基準ついて各グループの平均水準を互いにおよび対照グルー
プの平均水準と比較した。
【００９０】実施例１３ イヌへの適用 テストする組換えウイルスは、カレ病ウイルス（イヌジステンパーウイルス：
Caline Distemper Virus＝ＣＤＶ）ＨＡおよびＦ遺伝子を発現する組換えカナリ
ア痘ウイルスである。この組換えウイルスをｖＣＰ２５８(実施例２参照)と同定
された。 ＣＤＶモデルのワクチン接種／ワクチン投与プロトコルは下記の通り。
【００９１】
【表６】
【００９２】 各イヌにはＤ０とＤ２８に皮下経路でワクチン接種した。 ワクチンEURICAN(登録商標)（ＣＨＰＰＩ２）はメリアル社（リヨン、フラン ス）から市販の生ワクチンである。市販の一回量は最小で１０4ｐｆｕのＣＤＶ
Onderstepoortワクチン菌株を含む。 ワクチン投与はＤ５６に１／１０稀釈のＣＤＶ粘nider-Hill媒ワクチン投与菌
株(バッチはUSDAにより生成および提供される)を脳内投与して実施した。ワクチ
ン投与後２１日間、臨床的兆候に注意して（European Pharmacopoeiaの規則によ
る臨床的兆候に注意する）臨床モニタリングを実施した。
【００９３】 下記判定基準でワクチン投与後に保護を推定する。 (1) 各グループの平均臨床スコア(対照グループの平均臨床スコアと比較) (2) ワクチン投与後のＣＤＶウイルス血症レベル（ワクチン投与後Ｄ５６、Ｄ ６１、Ｄ６３、Ｄ６６、Ｄ７０、Ｄ７７に咽頭のスワブのウイルス負荷を測定） (3) Ｄ０、Ｄ１４、Ｄ２８、Ｄ４２、Ｄ５６、Ｄ７７におけるウイルス中和抗 体滴定量。 これら全ての判定基準について各グループの平均水準を互いにおよび対照グル
ープの平均水準と比較した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 EIV Newmarket 2/93菌株のＥＩＶ ＨＡ遺伝子のヌクレオチド配列
。
【図２】 ＦＨＶ−１ ｇＣ遺伝子のヌクレオチド配列。
【図３】 ウマヘルペスウイルスに対して異なるワクチンを用いてワクチン接
種したウマに実験的に感染させた後のウイルス排出量の変化を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/12 31/14 31/14 31/16 31/16 31/20 31/20 31/22 31/22 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C084 AA13 MA05 NA05 NA13 ZB091 ZB331 4C085 AA03 BA55 BA60 BA78 BA86 CC08 EE06 FF17

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 異種ヌクレオチド配列、好ましくは病原性遺伝子がインビボ
    で組み込まれ且つ発現するウイルス性ベクターと、アクリル酸またはメタクリル
    酸のポリマーおよび無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーの中から
    選択される少なくとも１種の補助剤化合物とからなる組換え生ワクチン。
  2. 【請求項２】 補助剤化合物として砂糖またはポリアルコールのポリアルケ
    ニルエーテルで架橋したアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーを含む請求項
    １に記載のワクチン。
  3. 【請求項３】 ポリマーがアリルスクロースまたはアリルペンタエリスリト
    ールで架橋されている請求項２に記載のワクチン。
  4. 【請求項４】 補助剤化合物として例えばジビニルエーテルで架橋された無
    水マレイン酸とエチレンとのコポリマーを含む請求項１に記載のワクチン。
  5. 【請求項５】 補助剤化合物がワクチン中に０．０１〜２％ｗ／ｖの量で存
    在する請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン。
  6. 【請求項６】 含有量が０．０６〜１％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜０．６
    ％ｗ／ｖである請求項５に記載のワクチン。
  7. 【請求項７】 少なくとも一種の動物のヘルペスウイルスの遺伝子が組み込
    まれ且つ発現するベクターを含む請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン
    。
  8. 【請求項８】 遺伝子がウマヘルペスウイルスＥＨＶ−１および／またはＥ
    ＨＶ−４、ネコヘルペスウイルスＦＨＶ、イヌヘルペスウイルスＣＨＶ、トリヘ
    ルペスウイルスＩＬＴＶまたはマレック(Marek)、ウシヘルペスウイルスＢＨＶ およびブタヘルペスウイルスＰＲＶから成る群から選択されるヘルペスウイルス
    から得られる請求項７に記載のワクチン。
  9. 【請求項９】 少なくとも一種のインフルエンザウイルスの遺伝子を組み込
    み且つ発現するベクターを含む請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン。
  10. 【請求項１０】 ウマインフルエンザ、トリインフルエンザおよびブタイン
    フルエンザウイルスから成る群から選択されるインフルエンザウイルスの遺伝子
    を発現するベクターを組み込んだ請求項９に記載のワクチン。
  11. 【請求項１１】 ネコ白血病ウイルスＦｅＬＶ、ジステンパーウイルスＣＤ
    Ｖまたは破傷風毒素から成る群から選択される動物のウイルスの少なくとも一種
    の遺伝子が組み込まれ且つ発現するベクターを含む請求項１〜６のいずれか一項
    に記載のワクチン。
  12. 【請求項１２】 ウイルスベクターがポックスウイルス、アデノウイルス、
    ヘルペスウイルスから成る群から選択される請求項１〜１１のいずれか一項に記
    載のワクチン。
  13. 【請求項１３】 ポックスウイルスがワクシニアウイルス、鶏痘、カナリア
    痘、鳩痘、豚痘ウイルスから成る群から選択される請求項１〜１２のいずれか一
    項に記載のワクチン。
  14. 【請求項１４】 ウマヘルペスウイルスＥＨＶ−１またはＥＨＶ−４のｇＢ
    、ｇＣおよびｇＤ遺伝子が組み込まれ且つ発現するカナリア痘を含む請求項１〜
    ６のいずれか一項に記載のワクチン。
  15. 【請求項１５】 ウマインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子を含む２種また
    は３種のカナリア痘ベクターを含み、各ＨＡ遺伝子が異なる菌株を起源とする請
    求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン。
  16. 【請求項１６】 ウマインフルエンザウイルスの異なる菌株の２種または３
    種のＨＡ遺伝子を含むカナリア痘ベクターを含む請求項１〜６のいずれか一項に
    記載のワクチン。
  17. 【請求項１７】 ネコヘルペスウイルスＦＨＶのｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝
    子が組み込まれ且つ発現するカナリア痘ベクターを含む請求項１〜６のいずれか
    一項に記載のワクチン。
  18. 【請求項１８】 ジステンパーウイルスＣＤＶのＨＡおよびＦ遺伝子を組み
    込み且つ発現するカナリア痘ベクターを含む請求項１〜６のいずれか一項に記載
    のワクチン。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜６のいずれか一項に記載のアクリル酸またはメ
    タクリル酸のポリマーおよび無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマー
    の中から選択される化合物の、異種ヌクレオチド配列がインビボで組み込まれ且
    つ発現する組換え生ワクチンの製造での使用。
  20. 【請求項２０】 別々に包装された、冷凍乾燥状態の、異種ヌクレオチド配
    列、好ましくは病原性遺伝子をインビボで組み込み且つ発現するウイルス性ベク
    ターからなる組換え生ワクチンと、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアクリ
    ル酸またはメタクリル酸のポリマーおよび無水マレイン酸とアルケニル誘導体と
    のコポリマーの中から選択される少なくとも一種の補助剤化合物の溶液とからな
    るワクチンセット。
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