JP2002500022A

JP2002500022A - 植物の形質転換および再生法

Info

Publication number: JP2002500022A
Application number: JP2000527135A
Authority: JP
Inventors: ジョンラーキン、フィリップ; アンチッティ、ジュリー; イアンスコットブレッテル、リチャード
Original assignee: ジョンソンアンドジョンソンリサーチプロプライアトリーリミテッド; コモンウェルスサイエンティフィックアンドインダストリアルリサーチオーガナイゼーション
Priority date: 1998-01-08
Filing date: 1999-01-07
Publication date: 2002-01-08
Also published as: US6930224B1; WO1999034663A1; TR200002555T2; HUP0101277A2; EP1061794A1; SK10452000A3; CA2317508A1; IL137180A0

Abstract

(57)【要約】本発明は、培養培地のｐＨの上昇を防止し、上昇の速度を低下させ、または上昇を遅らせる特殊な培地条件下で、植物材料をトランスフェクションおよび／または再生することによる、トランスジェニック植物とくにケシ植物の作製法に関連づけられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［技術分野］本発明は、植物の遺伝子的形質転換法およびトランスジェニック植物の再生法
に関する。とくに、本発明は、形質転換法および／またはトランスジェニックケ
シ植物の再生法に関する。

【０００２】［背景技術］ケシ科植物、たとえば、パパバル（Ｐａｐａｖｅｒ）およびハナビシソウ（Ｅ
ｓｃｈｓｃｈｏｌｔｚｉａ）の種の医療用アヘン製剤および関連化合物の商業的
供給源としての重要性はよく知られているが、ほとんど紹介されていない。これ
らの植物製品に対する需要は高い。

【０００３】ケシ植物を商業的に栽培するのに適した農地は限られている。ケシ植物は、あ
まり酸性でない水はけのよい肥沃な土壌を必要とする。商業的に栽培されている
ケシ植物における病気の発生を減らすために、作物は少なくとも３年周期で栽培
しなければならない（たとえば、少なくとも２つから３つの異なる作物を、ケシ
植物が再度栽培される前にその土壌で栽培することが望ましい）。灌漑用水の地
形学および確保などの他の制限がある。現在、いくつかの地域においては、作物
面積は持続的再生産が可能な限界に近いと考えられる：ケシ製品のより大きな収
量が望ましい場合には、栽培周期を短縮するか、または周辺の土壌タイプを含め
るような栽培下で面積を広げなければならない。望ましいとは言えないこのよう
なことの実施は収量および品質などの要因に影響し、そして土壌浸食などの望ま
しくない関連する結果が生じることが予想される。

【０００４】たとえば、タスマニアで収穫されたケシの茎におけるアルカロイド含有量は、
一般に、乾燥重量基準で１．２％から２．７％の範囲である。栽培者の経済的利
益は、アルカロイド含有量に基づいて計算されている。したがって、アルカロイ
ド含有量が大きな植物は、ケシ産業が、同じ土壌で潜在的に栽培できる代わりの
作物と競争できることを意味している。ケシ作物における大きなアルカロイド含
有量は、その産業全体がより競争に耐え得るものとなるようにする。同じ量のア
ルカロイドを生産するために栽培される作物の、栽培面積を少なくする必要があ
り、それにより収穫、輸送、保管、抽出および廃棄物処理にともなうコストが低
下する。したがって、アルカロイド高生産性のケシ植物は、栽培者、製薬企業お
よび精製されたケシ製品の消費者にとって非常に望ましい。

【０００５】従来の植物育種は、この２０年間にわたってケシ植物のアルカロイド含有量に
おける著しい進歩を遂げた。しかし、従来の育種によって可能になるさらなる改
善の量は限られているようである。

【０００６】ケシ植物の遺伝子的形質転換により、ケシ作物およびケシ茎のアルカロイド含
有量を改善する機会が得られる。これは、下記の方法を含む多数の方法によって
可能になる：・アルカロイド生合成経路における「ネック」部での酵素の活性強化；・望ましくない「副反応」の阻止；および・特定の望ましいアルカロイド（たとえば、テバイン、コデイン、オリパビンな
ど）が蓄積するような合成経路の阻止。

【０００７】したがって、これらのタイプの改善によって、産業は、作物の栽培面積を増大
させることなく拡大を続けることができる。このような改善はまた、製造プロセ
ス全体にわたる効率化をもたらす。

【０００８】所望する植物産物の収量を増大させるのと同様に、関連する生物工学的手法を
使用して除草剤耐性をケシ植物に導入することは望ましい。現在、ケシ作物にお
ける除草剤による雑草抑制は困難であり費用がかかる。とくにケシ用の除草剤は
開発されておらず、任意のいずれかの除草剤の雑草抑制作用範囲はあまり広くな
い。したがって、タンク混合された多数の異なる製品を含む除草剤プログラムが
適用され、そして連続して適用されている。除草剤耐性のケシ植物を開発するこ
とによって、現在得られるよりも広い安全域の作物安全性および広い雑草作用範
囲を有する除草剤の使用が可能になる。そのような雑草抑制のコストは、現在行
なわれているものよりも著しく少なくなることが予想される。

【０００９】遺伝子的形質転換はまた、他の遺伝子をケシ植物に導入して、商業的に望まし
い特質、たとえば、耐病性、酸性土壌耐性、ならびに昆虫および他の害虫に対す
る抵抗性を付与するために使用することができる。

【００１０】そのような形質転換は望ましいにも関わらず、実用的なトランスジェニックケ
シ植物の作製はこれまで困難であると示されていた。従来の方法を使用して、特
定の特性をコードする特定の遺伝子配列を導入する試み、および予測可能な特性
を有するトランスジェニックケシ植物のそののちの再生は、したがって今までの
ところ、ほとんど成功していない。

【００１１】したがって、実用的であり、かつ所望する形質を有する植物をもたらす遺伝物
質を植物に安定的に導入する方法の開発が求められている。

【００１２】本発明の目的は、先行技術における少なくとも１つまたは複数の上記の欠点を
解決または改善することであり、あるいは有用な代替を提供することである。

【００１３】［発明の開示］本特許出願により、培養培地のｐＨの予想外で迅速な上昇が、ケシ植物の細胞
などの植物細胞が培養されているときに生じることが見出されている。ｐＨのこ
の上昇は、最初の外植片（たとえば、実生胚軸）、未分化カルス、および体細胞
胚またはシュートを介して再生するカルスを含むケシ培養物の周囲で認められて
いる。ケシ植物の培養物などの植物培養物のこの特徴は、ケシ植物の再生および
トランスジェニックケシ植物の回収が成功しないことの少なくとも一部の原因で
ある。

【００１４】本明細書を通して、「Ｉ型カルス」は、無色または茶色であり得る光透過性カ
ルスであり、大きな液胞細胞からなっている。「II型カルス」は、白色から茶色
を帯びた不透明のカルスであり、小さな細胞質細胞からなり、体細胞胚および分
裂組織様体を形成する能力を有している。

【００１５】本明細書に関連して用語「ｐＨ測定値」は、培養組織が生育している培地に由
来する寒天片を使用し、水に均一化して、通常の手段でそのｐＨを読み取ること
によって得られるｐＨ測定値をいう。植物組織または細胞に近い微小環境におけ
るｐＨの変化は、細胞から少し離れたところ（通常的には、１ｃｍ）で測定され
る測定値よりも大きく異なり得ることは当業者には明らかである。

【００１６】第１の局面により、本発明は、下記の工程を含むトランスジェニック植物の作
製方法を提供する：１）培養培地もしくは植物材料のｐＨ上昇を防止し、上昇の速度を低下させ、
または上昇を遅らせる緩衝剤の存在下で、植物材料に外生遺伝物質を導入する工
程；２）培養培地もしくは植物材料のｐＨ上昇を防止し、上昇の速度を低下させ、
または上昇を遅らせる緩衝剤の存在下で、前記植物材料を培養する工程；および３）トランスジェニック植物を前記植物材料から再生する工程。

【００１７】第２の局面により、本発明は、培養培地もしくは植物材料のｐＨ上昇を防止し
、上昇の速度を低下させ、または上昇を遅らせる緩衝剤の存在下で、植物材料に
外生遺伝物質を導入する工程からなる植物の形質転換方法を提供する。

【００１８】第３の局面により、本発明は、外生遺伝物質を有する（ｈａｒｂｏｕｒｉｎｇ
）植物材料からトランスジェニック植物を作製する方法を提供する。この方法は
下記の工程からなる：１）培養培地もしくは植物材料のｐＨ上昇を防止し、上昇の速度を低下させ、
または上昇を遅らせる緩衝剤の存在下で、前記植物材料を培養する工程；および２）トランスジェニック植物を再生する工程。

【００１９】好ましくは、前記植物は、アルカロイド産生ケシ植物であり、さらにより好ま
しくは、該植物は、パパバル種およびハナビシソウ種から選択される。最も好ま
しい種は、パパバルソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ
）である。

【００２０】好ましくは、前記植物材料は、種子、吸水した種子または植物の実生部から得
られる。好ましくは、該植物材料は、種子外植片、実生外植片、Ｉ型カルス、II
型カルス、体細胞胚形成性カルス、および体細胞胚またはシュートを生成する任
意の培養組織（ｃｕｌｔｕｒｅ）からなる群から選択される。あるいは、該植物
材料は、葉、茎、根または花などの植物組織から得ることができる。

【００２１】好ましくは、使用される前記緩衝剤は、植物材料が形質転換されている培養培
地、または形質転換された植物材料がトランスジェニック植物に再生されつつあ
る培養培地のｐＨの急速な上昇を防止し、または遅らせる。より好ましくは、ｐ
ＨはｐＨ５．５〜６．５のあいだに保持される。

【００２２】好ましくは、緩衝剤は、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸緩衝剤（Ｍ
ＥＳ）、Ｎ−［２−アセトアミド］−２−イミノ二酢酸緩衝剤（ＡＤＡ）、およ
びビス［２−ヒドロキシエチル］イミノトリス［ヒドロキシメチル］メタン緩衝
剤（ＢＩＳ−ＴＲＩＳ）、またはアンモニウムイオンおよび硝酸塩イオンを所定
の割合で含有する溶液から構成される群から選択される。この開示の教示を考慮
して、当業者は、この方法において使用されるのに好適な他の緩衝剤を認めるこ
とができる。

【００２３】好ましくは、前記外生遺伝物質は、植物形質転換剤によって、最も好ましくは
アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）によって植物細胞に導入される。別の好ましい実施態様にお
いて、外生遺伝物質は、微粒子衝撃法（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂ
ａｒｄｍｅｎｔ）などの機械的な方法を使用して導入することができる。外生遺
伝物質を植物材料に導入する他の方法は当業者には明らかである。

【００２４】遺伝物質はＤＮＡまたはＲＮＡであり得、遺伝子または遺伝子フラグメントを
コードし得る。あるいは、遺伝物質は、内生遺伝子のアンチセンスヌクレオチド
配列を表わし得る。好ましくは、外生遺伝物質は、トランスジェニック植物につ
いて、下記の特性を含む群から選択される特性を付与するｍＲＮＡまたはタンパ
ク質をコードする：天然のアルカロイド産生植物に対して増大したアルカロイド
収量、天然のアルカロイド産生植物に対して増大した除草剤耐性、天然のアルカ
ロイド産生植物に対して増大した土壌酸性耐性、天然のアルカロイド産生植物に
対して増大した耐病性、天然のアルカロイド産生植物に対して増大した昆虫耐性
、天然のアルカロイド産生植物に対して増大した生育速度、天然のアルカロイド
産生植物に対して改善された開花性、天然のアルカロイド産生植物に対して増大
した霜耐性、および天然のアルカロイド産生植物に対して変化したアルカロイド
割合。最も好ましくは、外生遺伝物質は、トランスジェニックケシ植物について
、天然のアルカロイド産生植物に対して変化したアルカロイド割合の特性を付与
するｍＲＮＡまたはタンパク質をコードする。外生遺伝物質が除草剤耐性の特性
をトランスジェニックケシ植物に付与するｍＲＮＡまたはタンパク質をコードす
る場合、好ましくは、その除草剤耐性は、Ｂａｓｔａ除草剤耐性、グリホサート
耐性、ブロモキシニル耐性、またはスルホニルウレア耐性である。

【００２５】好ましくは、外生遺伝物質は、バイナリーベクターｐＰＺＰ、最も好ましくは
３５Ｓ５’：ｐａｔ：３５Ｓ３’を有するｐＴＡＢ１０１に基づくＤＮＡ構
築物に含まれる。別の好ましい実施態様において、バイナリーベクターはｐＢＳ
Ｆ１６である。とくに好ましい実施態様において、バイナリーベクターはｐＰＯ
Ｐ５である。

【００２６】第４の局面により、本発明は、前記局面のいずれかの方法によって調製された
トランスジェニック植物にある。

【００２７】好ましくは、前記植物は、アルカロイド産生ケシ植物である。さらにより好ま
しくは、該植物は、パパバル種またはハナビシソウ種から選択される。最も好ま
しい種は、パパバルソムニフェルムである。

【００２８】文脈において別途明らかに示されていない限り、明細書および請求項の全体を
通して、「からなる（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）など
」の表現は、排他的または網羅的な意味とは反対に、包含的な意味で解釈され得
る：すなわち、「に限定される（ｌｉｍｉｔｅｄｔｏ）ではなく、含む（ｉｎ
ｃｌｕｄｉｎｇ）」の意味で解釈され得る。

【００２９】［発明を実施するための最良の形態］本発明の方法は、部分的には、植物の形質転換およびトランスジェニック植物
の再生を行なう従来方法を使用することを含むが、培養培地または植物材料のｐ
Ｈの急激な上昇を防止すること、または上昇を遅らせることのいずれかによって
培地のｐＨを安定化させることにより従来方法を改善する工程をさらに含む。本
発明の方法のとくに好都合な別の形において、ｐＨは、形質転換およびトランス
ジェニック植物の再生の両方が行なわれているあいだは、ｐＨ５．５〜６．５の
範囲内において安定化される。

【００３０】研究された大部分の植物種においては、組換えＤＮＡの導入および標準的な組
織培養培地での実生外植片の培養は、ｐＨの大きな上昇にともなわれていない。
しかし、これまで予想されなかったこの現象がケシ植物の培養で確認された。パ
パバルソムニフェルムの組織または細胞の増殖を支持するために使用される組
織培養培地のｐＨが予想外にも急激に上昇することが出願者らによって観測され
た。この現象は他の植物にも当てはまるかもしれないが、これは当業者によって
簡単に確認することができる。この非常に早くて大きな上昇、たとえば、３０分
以内に生じるＢ５Ｏ培地でのII型カルスのまわりの近傍領域におけるｐＨ５．６
からｐＨ＞６．４への上昇（これは最終的にはｐＨ８．７にまで上昇する）が、
生育不良およびトランスジェニックケシ植物の作製が困難なことの主原因として
同定されている。

【００３１】形質転換およびトランスジェニック植物の培養に好ましい培地は、ＭＥＳで緩
衝化された１９Ｄである（これはカルス化培地とも呼ばれる）。しかし、好まし
くは培地のｐＨをｐＨ５．５〜６．５の範囲内に維持する任意の方法または培地
の改変は、本明細書に記載される方法に適する。そのような改変には、ＭＥＳ緩
衝剤の添加（たとえば、１０ｍＭ）、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ緩衝剤の添加（たとえば
、１０ｍＭ）、ＡＤＡの添加（たとえば、１０ｍＭ）、培地におけるアンモニウ
ムイオンおよび硝酸塩イオンの量および割合の改変（たとえば、ＮＯ₃ ^-：ＮＨ₄ ⁺ が１．３であり、総Ｎ量が３０ｍＭであるような改変）が含まれる。

【００３２】培養中の培地ｐＨの制御を助けることに加えて、緩衝剤は、アグロバクテリウ
ムによって媒介される遺伝子転移、II型カルス形成または体細胞胚形成および発
達などのプロセスに対して直接的または間接的な効果をもたらし得る。多くの著
者により、アグロバクテリウムによるＴ−ＤＮＡ転移に対するｐＨの重要性が示
されている（Ｈｏｌｆｏｒｄｅｔａｌ．，１９９２；Ｆｅｎｎｉｎｇｅｔ
ａｌ．，１９９６ａ，ｂ；ＬｉａｎｄＫｏｍａｔｓｕｄａ、１９９５）。

【００３３】形質転換において使用される好ましい外生遺伝物質は、３５Ｓ５’：ｐａｔ
：３５Ｓ３’を含有するバイナリーベクターＴＡＢ１０１である。

【００３４】別の好ましい外生遺伝物質はバイナリーベクターＢＳＦ１６である。

【００３５】さらなる好ましいベクターはＴ−ＤＮＡに２つの遺伝子：Ｂａｓｔａ（または
、ＰＰＴ）耐性を付与するｐａｔ遺伝子：シトクロームＰ４５０リダクターゼ酵
素をトランスジェニック組織においてより大きなレベルにまで蓄積させることが
できるパパバルソムニフェルムのＰ４５０レダクターゼ遺伝子を有しているｐ
ＰＯＰ５である。この酵素は、モルヒネ生合成に関与する多数のシトクロームＰ
４５０依存性酵素に対する律速であり得るシトクロームＰ４５０複合体を再構成
するために電子を供与する。したがって、この導入遺伝子によって、モルヒネア
ルカロイドの生合成は増大することが予想される。

【００３６】ｐａｔ遺伝子は、インビトロでの選抜マーカーとして、およびトランスジェニ
ック植物における除草剤耐性遺伝子としての２つの目的を果たしている。選抜遺
伝子として、これは、Ｂａｓｔａ除草剤またはその有効成分のグルホシナートア
ンモニウムもしくはホスフィノトリシン（ＰＰＴとしても知られている）が使用
される培養におけるトランスジェニック細胞の選抜を可能にする。当業者は、ハ
イグロマイシン耐性、カナマイシン耐性またはスペクチノマイシン耐性を付与す
る遺伝子などの、代わりになる選抜遺伝子が用いられ得ることを理解している。

【００３７】２つ以上の所望する特性をコードする外生遺伝物質を導入することができるこ
ともまた当業者には知られている。たとえば、ｐＢＳＦ１６ベクターは、３つの
遺伝子をＴ−ＤＮＡに有している：Ｂａｓｔａ（または、ＰＰＴ）耐性を付与す
るｂａｒ遺伝子：新規なヒマワリ種子アルブミンをトランスジェニック植物の種
子に蓄積させることができるヒマワリアルブミン遺伝子（ＳＦ８ｇ）：β−グル
クロニダーゼをコードし、トランスジェニック植物の検出を可能にするＧＵＳレ
ポーター遺伝子。

【００３８】［実施例］実施例１植物材料使用したパパバルソムニフェルムの遺伝子型は、タスマニアンアルカロイ
ド（ＴａｓｍａｎｉａｎＡｌｋａｌｏｉｄｓ）から得られたＣ０４６−３−５
、Ｃ０５８、Ｃ０６０、Ｃ０４８−６−１４−６４およびＤ２３３（Ｎｏｒｍａ
ｎ）であった。種子の表面を７０％エタノールで３０〜６０秒間洗浄し、ついで
オートクレーブしたトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０またはトリトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）Ｘの１〜２滴を加えた１％（ｗ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム溶液で攪拌しな
がら２０分間洗浄することによって殺菌する。種子を、滅菌蒸留水での３回〜４
回の洗浄、あるいは漂白剤のにおいが残らなくなるまでの洗浄を行ない、Ｂ５Ｏ
培地（下記参照）を含有する９０×２５ｍｍペトリ皿に置く。ペトリ皿をミクロ
ポア（Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ）テープでシールし、通常は４℃で２４〜４８時間保
管する。種子を２４℃で１６時間明期−８時間暗期の周期のもとで発芽させる。
胚軸を培養の７〜８日後の実生から切り出し、３〜６ｍｍの外植片（通常、１個
の実生につき１〜３個の外植片）に切断して、形質転換実験において使用する。

【００３９】実施例２組織培養培地および条件Ｂ５Ｏ培地は、Ｂ５の主要栄養成分、微量栄養成分、鉄塩およびビタミン類（
Ｇａｍｂｏｒｇｅｔａｌ．，１９６８）、２０ｇ／Ｌのショ糖からなる。ゲ
ル化剤として、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社の寒天が０．８％で使用される。ｐＨを
１ＭのＫＯＨでｐＨ５．６に調整する。

【００４０】カルス化培地（これは１９Ｄとも呼ばれる）は、１ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロ
ロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）が含まれることを除いてＢ５Ｏと同一である。

【００４１】１９Ｄは、ＭＥＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ＡＤＡ、または改変されたＮＯ₃ ^-：Ｎ
Ｈ₄ ⁺イオン比から選択される適切な緩衝剤で緩衝化することができる。

【００４２】＃７培地は１９Ｄであるが、ＮＯ₃ ^-：ＮＨ₄ ⁺含有量において、総Ｎ量が３０ｍ
Ｍであり、１：３の割合が得られるように改変されている。

【００４３】緩衝剤はオートクレーブ処理の前に加えられる。

【００４４】すべての培地は１２１℃で２０分間オートクレーブ処理される。

【００４５】チメンチン（ｔｉｍｅｎｔｉｎ）などの好適な抗生物質は、オートクレーブ処
理して５５℃〜６５℃に冷えたのちのすべての培地に加えられる。

【００４６】外植片およびＩ型カルスの培養物は、ミクロポアテープでシールしたペトリ皿
において２４℃で生育させる。II型カルスおよび体細胞胚は１８℃〜２１℃で培
養される。

【００４７】実施例３細菌株およびバイナリーベクター無害化したアグロバクテリウムツメファシエンスのＡＧＬＯ株およびＡＧＬ
１株（Ｌａｚｏｅｔａｌ．，１９９１）を形質転換実験において使用する。
ＤＮＡ構築物は、バイナリーベクターｐＰＺＰ２０１（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃ
ｚｅｔａｌ．，１９９４）、たとえば、３５Ｓ５’：ｐａｔ：３５Ｓ３
’を有するｐＴＡＢ１０１（図１参照）に基づている。アグロバクテリウム株は
、グリセロール中で−８０℃で維持されるか、または適切な選択剤を加えたＬＢ
寒天プレートで４℃で維持される。新鮮な培養物は、２８℃で、抗生物質を加え
ることなく１０ｍＬのＭＧブロス（ＧａｒｆｉｎｋｌｅａｎｄＮｅｓｔｅｒ
、１９８０）で一晩生育させる。このアグロバクテリウム懸濁物を約５×１０⁸ 細胞ｍＬ^-1（ＯＤ６００＝０．２５）に希釈して、形質転換実験において使用す
る。

【００４８】実施例４形質転換および胚形成胚軸を実生から切り出し、液体のアグロバクテリウム培養液に１０分間〜１５
分間浸漬することによって直ちに接種する。ついで、外植片を、緩衝剤を加えた
１９Ｄまたは緩衝剤を加えていない１９Ｄまたは＃７培地に直接移す。４〜５日
間の共存培養を行なったのち、外植片を、水にアグロバクテリウムが含まれなく
なるまで滅菌蒸留水で洗浄して、滅菌ろ紙で水滴を取り、１５０ｍｇ／Ｌのチメ
ンチンおよび１０ｍｇ／ＬのＰＰＴ（ホスフィノトリシン、Ｂａｓｔａ除草剤の
有効成分）を含有する、緩衝剤の添加もしくは無添加の１９Ｄまたは＃７培地に
移す。チメンチンは、アグロバクテリウムの過増殖を抑制するために加えられて
おり、代わりになる適切な抗生物質または薬剤もまた使用できることはこの分野
の当業者には明らかである。外植片を、３週間の間隔で、新しく調製した緩衝剤
の添加もしくは無添加の１９Ｄまたは＃７培地に移す。外植片から、茶色がかっ
た砕けやすいＩ型カルスが最初に生成し、そして約７〜８週間の培養によって、
非常に白い密集した胚形成性カルス（II型）の小さな領域が続いて形成され得る
。

【００４９】 II型カルスを、１５０ｍｇ／Ｌのチメンチンおよび１０ｍｇ／ＬのＰＰＴを含
有するＢ５Ｏに移し、培養物を３週間毎に新鮮な培地に移す。分裂組織様体／胚
の発生は、通常的には、Ｂ５Ｏ培地での１または２期間の後で生じ、約１４〜１
６週間の総培養時間により認められる。

【００５０】胚からの幼植物の発達は遅く、そして土壌への問題のない移植が確実に行なえ
るためにシュートおよび根の生育が充分になるまでに、さらに３ヶ月を組織培養
において必要とすることがある。

【００５１】実施例５ｐＨ緩衝化の重要性培地の初期ｐＨが５．８であり、緩衝剤が除かれている場合、ケシ植物培養物
のｐＨは、カルス塊が約１ｃｍの直径に達したときにはｐＨ８．０またはそれ以
上に急激に上昇する。ｐＨ５．６に調整して新しく作製した寒天固化Ｂ５型培地
（ａｇａｒ−ｓｏｌｉｄｉｆｉｅｄＢ５−ｂａｓｅｄｍｅｄｉｕｍ）は、３
０分以内にII型カルスの近傍領域においてｐＨ＞６．４に上昇した。クロロフェ
ノールレッドを培地に含めることによって、このような局所的ｐＨ上昇がよく観
測されていた：培地はｐＨ６．４で紫色になる。プレート全体は２４時間以内に
ｐＨ＞７になった。培養期間の終わりにおいて、８．７のｐＨ値が測定された。
このようなｐＨの急激な上昇は非常にわるい生育をもたらし、これは培地の頻繁
な交換によって補われない。この急激な上昇は、２．５ｍＭのＭＥＳによってで
さえ著しく遅らされたが、１０ｍＭのＭＥＳが、培地を適切に緩衝し、そして３
週間の継代培養期間にわたって改善された生育を助けるためには好ましい。表１
に示されているように、ＭＥＳ緩衝剤を使用することによって、とくに形質転換
および培養の全プロセスにわたってＭＥＳ緩衝剤が使用されたとき、トランスジ
ェニック植物の回収における実質的な増大が得られている。

【００５２】総窒素量およびＮＯ₃ ^-：ＮＨ₄ ⁺比の何らかの作用を調べる実験を行なった。こ
の実験は、ｐＨ変化の駆動力としての培地でのＮ相互変換の関与を示唆する文献
がきっかけであった（ＧａｌｖｅｚａｎｄＣｌａｒｋ、１９９１；Ｎｉｅｄ
ｚ、１９９４；ＳｃｈｍｉｔｚａｎｄＬｏｒｚ、１９９０；Ｓｍｉｔｈａ
ｎｄＫｒｉｋｏｒｉａｎ、１９９０）。ＭＥＳをどの培地にも加えなかった。
新鮮な培地への２回の移し換えを含む１２週間の培養後、Ｉ型カルスおよびII型
カルスの重量を測定した。結果を図４に示す。とくにII型（胚形成性）カルスの
産生に関して、本発明者らの標準的なカルス化培地１９Ｄよりも優れていると考
えられる多数の培地処理が明らかに存在する（図４の＃１２培地）。この実験に
おいて、いずれのII型カルスも標準的な培地によって生成しないことは、ＭＥＳ
が存在しないことに帰因し得る。＃７培地をさらなる研究のために、そして培地
におけるｐＨ変化を抑制する代わりの培地として選択した。

【００５３】下記の実験は、ｐＨの上昇を抑えることを中心にした。同系交配の栽培品種Ｃ
０４８−６−１４−６４を実験で使用し、選抜用のｐａｔ遺伝子を有するｐＰＯ
Ｐ５バイナリーベクターを保有するアグロバクテリウムを使用した（選抜剤とし
てＰＰＴ）。

【００５４】アグロバクテリウムとの共存培養およびＰＰＴ選抜によって、非緩衝化培地（
１９Ｄ）は、含まれる組織量が非常に少ないとしても、許容されないほどのｐＨ
上昇（図５Ｃ）および黒色または茶色の色素の蓄積をもたらした。ｐＨは、１０
ｍＭのＭＥＳ、ＡＤＡまたはＢＩＳ／ＴＲＩＳの緩衝剤を加えることによって抑
制され、そして色素はほとんど形成しなかった。培地ｐＨの許容できないほどの
上昇はまた、ＮＯ₃ ^-：ＮＨ₄ ⁺比がモル比で１：３である＃７培地における硝酸塩
対アンモニウム比を変化させることに基づく緩衝化方法によって抑制された。ｐ
Ｈの上昇は、外植片がＰＰＴ選抜下に置かれているが、アグロバクテリアによっ
て処理されていないときに最大であった（図５Ａ）。最初の３週間ののち、これ
らの培養物は予想されるほどの生育を示さなかった。ＰＰＴ選抜を行なわず、そ
してアグロバクテリアとの共存培養を行なっていない場合（図５Ｂ）、ｐＨの上
昇傾向は、組織重量が増大した第３回目の培養期間までは明確ではなかった。

【００５５】使用した条件のもとでのｐＨの適切な制御が、１０ｍＭのＭＥＳで達成された
（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ）。アグロバクテリアが存在せず、そしてＰＰＴが存在し
ない５０ｍＭのＭＥＳにより、色素を形成しない正常な生育が可能になった。し
かし、アグロバクテリアの存在下およびＰＰＴ選抜のもとでは、２０ｍＭおよび
５０ｍＭのＭＥＳは、ほとんど効果的でなく、生育しなかった。

【００５６】２つのケシ植物の栽培品種および多数のバイナリープラスミドを使用した、多
数の実験について集められた結果を表１に示す。これらの実験はすべてＰＰＴ選
抜のもとで行なわれた。

【００５７】

【表１】

【００５８】

【表２】

【００５９】実施例６本発明者らは、初めにＰＡＴ検定によって、土壌における２３のケシ植物のト
ランスジェニック状態を確認した（たとえば、図７）。この植物は、少なくとも
５個の独立した形質転換事象を表わしている。該事象のうち２つは、栽培品種Ｃ
０５８にあり、３つはＮｏｒｍａｎにある。全植物は、温室で開花し種子が集め
られた。Ｃ０５８の１株およびＮｏｒｍａｎの４株からの種子（Ｔ₁）は殺菌され、種子の生存能力、ｐａｔ遺伝子発現の安定性および導入遺伝子の分離（segr
egation）を確かめるために、ＰＰＴ１０μg／mlを加えた培地および加えていな
い培地上に広げられた。本発明者らは、Ｔ₁種子が生存でき、そのほとんどの子孫がＰＰＴ耐性を受け継いでいることを示した（表３）。

【００６０】

【表３】

【００６１】３つの株で許容され得る分離体（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅｓｅｇｒｅｇａｎ
ｔｓ）が見られないことは、それらが多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）挿入断片を有し
ているとすれば、驚くべきことではない。

【００６２】実生もまた発芽し、ＰＰＴ選抜なしで育成され、ＰＡＴ酵素活性の分離が１つ
の株において決定された。

【００６３】

【表４】

【００６４】本発明者らはさらに、少なくとも５つの独立した事象を表わしている９個の植
物のトランスジェニック状態を、サザンブロット分析により確認した。いくつか
の株はpat遺伝子の単コピーのみを有し、一方ほかの株は多重の挿入断片を示す（表５）。

【００６５】

【表５】

【００６６】本発明者らは、さらに、ｐBSF16バイナリーベクターを用いて作製されたトランスジェニック体の種子中のヒマワリ種子アルブミンの蓄積を証明することによ
って、植物およびそれらの子孫のトランスジェニック状態を確認した。これは、
ヒマワリアルブミンに特異的な抗体を用いて、コントロールおよびトランスジェ
ニック種子から調製されたタンパク質のウエスタンブロッドによって確かめられ
た（図８参照）。

【００６７】ｐBSF16より得られる植物のトランスジェニック状態は、さらに、様々な組織を、gus遺伝子にコードされる酵素β−グルクロニダーゼに対する基質と共にインキュベートすることにより確かめられた。基質、X-グルクロニド存在下では、
葉、茎、朔果および種子はすべて強く青色に染まり、一方、トランスジェニック
されていないコントロールからの同じ組織は、いずれも青色にはならなかった。

【００６８】本発明は、特定の実施態様を参考のため記載しているが、当業者の知識の範囲
内の改変（modifications）も、本発明の範囲に入るものであると意図される。

【００６９】［参照文献］ Fenning TM, Tymens SS. Brasier CM. Gartland JS, Gartland KMA, Ahuja MR,
Boerjan W. and Neale DB. 1996. A strategy for the genetic manipulation o
f English elm. IN "Somatic cell genetics and molecular genetics of trees
", pp. 105-112. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht. Netherlands. publishers. Dordrecht, Netherlands. Fenning TM, Tymens SS. Gartland JS, Brasier CM, and Gartland KMA. 1996. Transformation and regeneration of English elm using wild-type Agrobacte
rium tumefaciens, Plant Science (Limerick) 116:p37-46. Galvez. L., and R.B. Clark. 1991. Nitrate and Ammonium Uptake and Soluti
on pH Changes for Al-Tolerant and Al-Sensitive Sorghum (Sorghum biocolor
) Genotypes Grown with and Without Aluminium. Plant and Soil 134: 179-88. Gamborg. O.L., Miller. R.A. and Ojima, K. (1968). Nutrient requirements
of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cells Res. 50, 151-15
8. Garfinkle. D.J. and Nester. E.W. (1980) Agrobacterium tumefaciens mutant
s affected in crown gall tumorigenesis and octopine catabolism. J. Bacte
riol, 144, 732-743. Hajdukgewicz, P., Svab, Z and Maliga, P. (1994). The small, versatile pP
ZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plan
t Mol. Biol. 25, 989-994. Holford P. Hemandez N. and Newbury HJ. 1992. Factors influencing the eff
iciency of T-DNA transfer during co-cultivation of Antirrhinum majus wit
h Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports 11:pl96-99. Lazo, G.R. Stein, P.A. and Ludwig. R.A.(1991) A DNA transformation-compe
tent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium Bio/Technology, 9,963-
967. Li WB, and Komatsuda T. 1995. Impact of several factors related ot inocu
lum, explants, compound and growth medium on tumorigenesis in vitro cult
ure of soybean (Glycine gracilis and G. Max). Soybean Genetics Newslette
r 22:p93-98. Niedz. R.P. 1994. Growth of embryogenic sweet orange callus on media var
ying in the ratio of nitrate to ammonium nitrogen. Plant cell Tissue and
Organ Culture 39: 1-5. Schmitz: U., and H. Lorz. 1990. Nutrient Uptake in Suspension Cultures o
f Gramineae 2. Suspension Cultures of Rice (Oryza Sativa L). Plant Scien
ce 66:95-111. Smith. D.L.. and A.D. Krikorian. 1990. Somatic Embryogenesis of Carrot i
n Horrnone-Free Medium-External pH Control over Morphogenesis. American
Journal of Botany 77:1634-47.

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明にしたがって外生遺伝物質を導入するために好ましいベクター
であるプラスミドｐＴＡＢ１０１を示す。

【図２】図２は、本発明にしたがって外生遺伝物質を導入するための別のバイナリーベ
クターであるｐＢＳＦ１６を示す。

【図３】図３は、本発明にしたがって外生遺伝物質を導入するための別のバイナリーベ
クターであるｐＰＯＰ５を示す。

【図４】図４は、Ｉ型カルスおよびII型カルスの重量に対する培養培地のさまざまなＮ
Ｏ₃ ^-：ＮＨ₄ ⁺比の影響を示す。

【図５】図５は、カルス増殖培地のｐＨに対するさまざまな緩衝剤の影響を示す。

【図６】図６は、カルス増殖培地のｐＨに対するさまざまなＭＥＳ緩衝剤濃度の影響を
示す。

【図７】図７は、ＰＡＴ（ホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）
アセチルトランスフェラーゼ）アッセイを示す。矢印は、ＰＡＴ酵素活性から生
じた放射性を有するアセチル化ＰＰＴバンドを示す。１および９：陽性コントロ
ールとしてのトランスジェニックタバコの抽出物。２および１０：トランスジェ
ニックされていないコントロールのケシ植物。３〜８：ｐＴＡＢ１０１バイナリ
ーベクターで形質転換された植物から得られたさまざまな初代トランスジェニッ
クケシ植物の抽出物。

【図８】図８は、ｐＢＳＦ１６で形質転換されたトランスジェニック株４５−２５から
得られた種子のウエスタンブロットである。ＳＳＡ標準は、さまざまな量のヒマ
ワリ種子アルブミンである。Ｃは、コントロールのトランスジェニックされてい
ない種子の抽出物である。Ｔは、トランスジェニック種子の抽出物である。シグ
ナルは、ヒマワリ種子アルブミンタンパク質に対する抗血清の特異的結合から生
じている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人コモンウェルスサイエンティフィックアンドインダストリアルリサーチオーガナイゼーションオーストラリア国キャピタルテリトリーキャムベルライムストーンアベニュー（番地なし) (72)発明者ラーキン、フィリップジョンオーストラリア連邦、2601 オーストレイリアンキャピタルテリトリー、ウェストン、マッキンズストリート 82 (72)発明者チッティ、ジュリーアンオーストラリア連邦、2614 オーストレイリアンキャピタルテリトリー、ウィータンゲラ、ギレスピストリート 35 (72)発明者ブレッテル、リチャードイアンスコットオーストラリア連邦、2600 オーストレイリアンキャピタルテリトリー、ヤラルーミア、ウェストンストリート８Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD13 CD14 CD17 4B024 AA08 BA80 CA04 DA05 EA04 GA11 GA17 4B065 AA11X AA89X AB01 AC05 AC14 BA02 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トランスジェニック植物の作製法であって：１）培養培地もしくは植物材料のｐＨ上昇を防止し、上昇の速度を低下させ、
または上昇を遅らせる緩衝剤の存在下で、植物材料に外生遺伝物質を導入する工
程、２）培養培地もしくは植物材料のｐＨ上昇を防止し、上昇の速度を低下させ、
または上昇を遅らせる緩衝剤の存在下で、該植物材料を培養する工程、および３）該植物材料からトランスジェニック植物を再生する工程からなる作製法。
【請求項２】培養培地もしくは植物材料のｐＨ上昇を防止し、上昇の速度
を低下させ、または上昇を遅らせる緩衝剤の存在下で、植物材料に外生遺伝物質
を導入する工程からなる植物の形質転換法。
【請求項３】外生遺伝物質を有する植物材料からトランスジェニック植物
を作製する方法であり、１）培養培地もしくは植物材料のｐＨ上昇を防止し、上昇の速度を低下させ、
または上昇を遅らせる緩衝剤の存在下で、該植物材料を培養する工程；および２）トランスジェニック植物を再生する工程からなる作製法。
【請求項４】前記植物がアルカロイド産生ケシ植物である、請求項１、２
または３記載の方法。
【請求項５】該植物がパパバル種またはハナビシソウ種から選択される、
請求項４記載の方法
【請求項６】該植物種がパパバルソムニフェルムである、請求項５記載
の方法。
【請求項７】植物材料が種子、吸水した種子または植物の実生部から得ら
れる請求項１、２または３記載の方法。
【請求項８】植物材料が種子外植片、実生外植片、Ｉ型カルス、II型カル
ス、体細胞胚遺伝カルス、体細胞胚またはシュートを生成する任意の培養組織、
および葉、茎、根または花のような植物組織からなる群から選択される、請求項
１、２または３記載の方法。
【請求項９】ｐＨの上昇が防止されるかまたは遅らされる、請求項１、２
または３記載の方法。
【請求項１０】ｐＨがｐＨ５．５とｐＨ６．５のあいだに保持される請求
項１、２または３記載の方法。
【請求項１１】緩衝剤が2-[Ｎ-モルホリノ]エタンスルホン酸緩衝剤（ＭＥＳ）、Ｎ-[2-アセトアミド]-2-イミノ二酢酸緩衝剤（ＡＤＡ）およびビス[2- ヒドロキシエチル]イミノトリス-[ヒドロキシメチル]メタン緩衝剤（ＢＩＳ-ＴＲＩＳ）から構成される群から選択されるか、または改変アンモニウムおよび硝
酸塩イオンを所定の割合で含有する請求項１、２または３記載の方法。
【請求項１２】外生遺伝物質が植物形質転換剤によって植物細胞に導入さ
れる請求項１、２または３記載の方法。
【請求項１３】形質転換剤がアグロバクテリウムツメファシエンスであ
る、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】外生遺伝子物質が機械的な方法を用いて導入される請求項
１、２または３記載の方法。
【請求項１５】機械的方法が微粒子衝撃法である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】外生遺伝物質が、トランスジェニック植物につぎの特性を
与えるｍＲＮＡまたはタンパク質をコードしている請求項１、２、３、４、５ま
たは６記載の方法であって、該特性が、天然のアルカロイド産生植物に対して増
大されるアルカロイド収量、天然のアルカロイド産生植物に対して増大される除
草剤耐性、天然のアルカロイド産生植物に対して増大される土壌酸性耐性、天然
のアルカロイド産生植物に対して増大される耐病性、天然のアルカロイド産生植
物に対して増大される昆虫耐性、天然のアルカロイド産生植物に対して増大され
る生育速度、天然のアルカロイド産生植物に対して改良される開花特性、天然の
アルカロイド産生植物に対して増大される霜耐性および天然のアルカロイド産生
植物に対して変化されたアルカロイド割合である方法。
【請求項１７】外生遺伝物質が、トランスジェニックケシ植物に天然のア
ルカロイド産生植物に対して変化されたアルカロイド割合特性を与えるｍＲＮＡ
またはタンパク質をコードしている、請求項１、２または３記載の方法。
【請求項１８】外生遺伝物質がトランスジェニックケシ植物に除草剤耐性
の特性を与えるｍＲＮＡまたはタンパク質をコードしている、請求項１、２また
は３記載の方法。
【請求項１９】除草剤耐性がＢａｓｔａ除草剤耐性、グリホサート耐性、
ブロモキシニル耐性およびスルホニルウレア耐性からなる群から選択される、請
求項１８記載の方法。
【請求項２０】外生遺伝物質がバイナリーベクターｐＰＺＰに基づくＤＮ
Ａ構築物に含まれる請求項１、２または３記載の方法。
【請求項２１】バイナリーベクターが３５Ｓ５′:pat:３５Ｓ３′を有するｐＴＡＢ１０１である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】バイナリーベクターがｐＢＳＦ１６である、請求項２０記
載の方法。
【請求項２３】バイナリーベクターがｐＰＯＰ５である、請求項２０記載
の方法。
【請求項２４】請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または
２３記載の方法により製造されるトランスジェニック植物。
【請求項２５】前記植物がアルカロイド産生ケシ植物である、請求項２４
記載のトランスジェニック植物。
【請求項２６】該植物が、パパバル種またはハナビシソウ種から選択され
る、請求項２５記載のトランスジェニック植物。
【請求項２７】該植物種がパパバルソムニフェルムである請求項２６記
載のトランスジェニック植物。
【請求項２８】請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または
２３記載の方法により製造される植物材料。
【請求項２９】種子外植片、実生外植片、Ｉ型カルス、II型カルスおよび
体細胞胚遺伝カルスからなる群から選択される請求項２８記載の植物材料。