JP2002540799A

JP2002540799A - 新規なタイプのトランスポゾンに基づいた遺伝子マーカー

Info

Publication number: JP2002540799A
Application number: JP2000609602A
Authority: JP
Inventors: ビュロー，トマ; チャン，リュイン; ランドリ，ブノア; オドヌーグー，ルイーズ・ステファニー
Original assignee: マクギル・ユニヴァーシティ; ディーエヌエイ・ランドマークス・インコーポレーテッド
Priority date: 1999-04-01
Filing date: 2000-03-30
Publication date: 2002-12-03
Also published as: AU3547800A; PL351816A1; HUP0201423A2; CN1351671A; EP1163370A2; CA2371128A1; RU2279482C2; HUP0201423A3; WO2000060113A2; CZ20013532A3; HK1047139A1; WO2000060113A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、核酸配列中の多型性検出のための方法における、ＭＩＴＥに相同なＤＮＡプライマーの使用に関する。上記方法は、ＭＩＴＥに相同またはそうどうでない別のプライマーとの組み合わせにおいて、ＭＩＴＥに相同な第１プライマーを使用して核酸配列を増幅し、増幅された核酸配列の断片を分離し、そして核酸配列中の多型性を検出するために、ＭＩＴＥに相同なプライマーを用いて核酸配列を増幅することから得られる参照用断片に関して得られた断片を分析する工程からなる。ＭＩＴＥに相同なＤＮＡプライマーは、本発明に従い、遺伝子型決定、フィンガープリンティング、マッピングまたはクローニングにも使用してよい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景（ａ）発明の分野本発明は、小型の逆向き繰り返しの転移性要素（ＭＩＴＥ）に相同なＤＮＡ配
列を有する第１プライマーおよび第１プライマーと同一かまたは異なる第２プラ
イマーを含む、プライマー対による増幅を用いて核酸の遺伝子型を決定する方法
に関する。本発明は、一般的には、フィンガープリンティングの研究または連鎖
の研究におけるＭＩＴＥプライマーの使用に関する。（ｂ）従来の技術ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ（ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋＢ．１９４６．Ｍａｉｚｅ
ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ＣａｒｎｅｇｉｅＩｎｓｔ．ＷａｓｈＹｅａｒｂｏｏｋ
４５：１７６−１８６；およびＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋＢ．１９４７．Ｃｙｔ
ｏｇｅｎｅｔｉｃｓｔｕｄｉｅｓｏｆｍａｉｚｅａｎｄｎｅｕｒｏｓ
ｐｏｒａ．ＣａｒｎｅｇｉｅＩｎｓｔ．Ｗａｓｈ．Ｙｅａｒｂｏｏｋ４６：
１４６−１５２．）による、転移性要素系Ａｃ／Ｄｓの発見の後に、新規な転移
性要素系（ファミリー）の遺伝子の同定が、植物（ＰｅｔｅｒｓｏｎＰ．Ａ．
１９８６．Ｍｏｂｉｌｅｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｍａｉｚｅ．Ｐｌａｎｔ
ＢｒｅｅｄｉｎｇＲｅｖｉｅｗｓ４：３−１２２．）並びに他の生物におけ
る遺伝子研究のポピュラーなエリアになった。これは、遺伝子の同定および単離
の手段として、特にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるコピアレトロトランスポゾン
によるｗｈｉｔｅ座のクローニング後の、転移性要素の分子の特徴付けおよびこ
れらの要素の活用（ＢｉｎｇｈａｍＰ．Ｍ．，Ｒ．ＬｅｗｉｓａｎｄＧ．
Ｍ．Ｒｕｂｉｎ１９８１．ＣｌｏｎｉｎｇｏｆＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｓｆｒｏｍｔｈｅｗｈｉｔｅｌｏｃｕｓｏｆＤ．ｍｅｌａｎｏｇａ
ｓｔｅｒｂｙａｎｏｖｅｌａｎｄｇｅｎｅｒａｌｍｅｔｈｏｄ．Ｃ
ｅｌｌ２５：６９３−７０４．）、およびトウモロコシの転移性要素Ａｃ（Ｐ
ｏｈｌｍａｎＲ．Ｆ．，Ｎ．Ｖ．ＦｅｄｏｒｏｆｆａｎｄＪ．Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ１９８４．Ｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔ
ｈｅｍａｉｚｅｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔＡｃｔｉｖａｔ
ｏｒ．Ｃｅｌｌ３７：６３５−６４３．）およびＥｎ／Ｓｐｍ（Ｐｅｒｅｉｒ
ａＡ．，Ｚｓ．Ｓｃｈｗａｒｚ−Ｓｏｍｍｅｒ，Ａ．Ｇｉｅｒｌ，Ｉ．Ｂｅｒ
ｔｒａｍ，Ｐ．Ａ．ＰｅｔｅｒｓｏｎａｎｄＨ．Ｓａｅｄｌｅｒ１９８５
．Ｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔ
ｈｅＥｎｈａｎｃｅｒ（Ｅｎ）ｔｒａｎｓｐｏｒｓａｂｌｅｅｌｅｍｅ
ｎｔｓｙｓｔｅｍｏｆＺｅａｍａｙｓ．ＥＭＢＯＪ．４：１７−２５
．）の分子特徴付けへと続いた。それ以来、転移性要素に関する研究が生物科学
における主要な中心となった。

【０００２】生物学上の研究の別のエリアにおけるように、転移性要素の同定は現代のコン
ピューター技術により促進されてきた。Ｂｕｒｅａｕｅｔａｌ．（Ｂｕｒｅ
ａｕＴ．Ｅ．，Ｐ．Ｃ．Ｒｏｎａｌｄ，ａｎｄＳ．Ｒ．Ｗｅｓｓｌｅｒ１９
９６．Ａｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｂａｓｅｄｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓｕｒｖｅ
ｙｒｅｖｅａｌｓｔｈｅｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｃｅｏｆｓｍａｌｌ
ｉｎｖｅｒｔｅｄ−ｒｅｐｅａｔｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｗｉｌｄ−ｔｙｐ
ｅｒｉｃｅｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：８
５２４−８５２９．）は、このアプローチを、転移性要素の莫大な数の新規なフ
ァミリーを同定するのに採用した。これらの要素は、末端逆向き繰り返し（ＴＩ
Ｒｓ）を有することにおいて、伝統的なＤＮＡ−媒介性転移性要素に似ている（
ＲＮＡ中間体により転移するレトロ要素とは反対に、ＢｏｅｋｅＪ．Ｄ．，Ｄ
．Ｊ．Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ，Ｃ．Ａ．ＳｔｙｌｅｓａｎｄＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ
１９８５．Ｔｙｅｌｅｍｅｎｔｓｔｒａｎｓｐｏｓｅｔｈｒｏｕｇｈ
ａｎＲＮＡｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ．Ｃｅｌｌ４０：４９１−５００．
）。しかしながら、古典的な遺伝子により特徴付けされた転移性要素とは違い、
これらの要素はサイズが小さく、そして見かけ上はコーディングキャパシティを
示さない。これらの要素は、小型の逆向き繰り返し転移性要素またはＭＩＴＥｓ
と呼ばれてきた（Ｂｕｒｅａｕｅｔａｌ．前記）。

【０００３】制限断片長多型性（ＲＥＬＰ）技術（ＢｏｓｔｅｉｎＤ．，Ｒ．Ｗｈｉｔｅ
，Ｍ．ＳｋｏｌｎｉｃｋａｎｄＲ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ１９８０．Ｃｏｎｓｔ
ｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｇｅｎｅｔｉｃｌｉｎｋａｇｅｍａｐｉｎ
ｍａｎｕｓｉｎｇｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔ
ｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３２：３１４
−３３１．）の分子マッピング手段としての導入以来、ゲノムマッピングおよび
フィンガープリンティング技術は実質上進歩しており、他の新規な技術、例えば
ランダムに増幅されたＤＮＡ多型（ＲＡＰＤ，ＷｅｌｓｈＪ．ａｎｄＭ．Ｍ
ｃＣｌｅｌｌａｎｄ１９９０．Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇｇｅｎｏｍｅ
ｓｕｓｉｎｇＰＣＲｗｉｔｈａｒｂｉｔｒａｒｙｐｒｉｍｅｒｓ．Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：７２１３−７２１８．；Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓＪ．Ｇ．Ｋ．，Ａ．Ｒ．Ｋｕｂｅｌｉｋ，Ｋ．Ｊ．Ｌｉｖａｋ，Ｊ．Ａ
．ＲａｆａｌｓｋｉａｎｄＳ．Ｖ．Ｔｉｎｇｅｙ１９９０．ＤＮＡｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙａｒｂｉｔｒａｒｙｐ
ｒｉｍｅｒｓａｒｅｕｓｅｆｕｌａｓｇｅｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒｓ
．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：６５３１−６５３５．）、およ
び増幅された断片の長さ多型性（ＡＦＬＰ，ＶｏｓＰ．，Ｒ．Ｈｏｇｅｒｓ，
Ｍ．Ｂｌｅｅｋｅｒ，Ｍ．Ｒｅｉｊａｎｓ，Ｔ．ｖａｎｄｅＬｅｅ，Ｍ．Ｈ
ｏｒｎｅｓ，Ａ．Ｆｒｉｊｔｅｒｓ，Ｊ．Ｐｏｔ，Ｊ．Ｐｅｌｅｍａｎ，Ｍ．Ｋ
ｕｉｐｅｒａｎｄＭ．Ｚａｂｅａｕ１９９５．ＡＦＬＰ：ａｎｅｗｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＣ￥ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３：４４０７−４４１４．）の開発により
証明されたとおりである。レトロ要素を使用する最近採用された技術（Ｓｉｎｎ
ｅｔＤ．，Ｊ．−Ｍ．Ｄｅｒａｇｏｎ，Ｌ．Ｒ．ＳｉｍａｒｄａｎｄＤ．
Ｌａｂｕｄａ１９９０．Ａｌｕｍｏｒｐｈｓ−ｈｕｍａｎＤＮＡｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈｉｓｍｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａ
ｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｕｓｉｎｇＡｌｕ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅ
ｒｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ７：３３１−３３４；およびＮｅｌｓｏｎＤ．Ｌ．
，Ｓ．Ａ．Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｌ．Ｃｏｒｂｏ，Ｍ．Ｆ．Ｖｉｃｔｏｒｉａ，
Ｒ．Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉｓ，Ｔ．Ｄ．Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｄ．Ｈ．Ｌｅｄｂ
ｅｔｔｅｒａｎｄＣ．Ｔ．Ｃａｓｋｅｙ１９８９．Ａｌｕｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ：Ａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｐ
ｉｄｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＤＮＡｓ
ｅｑｕｅｎｃｅｓｆｒｏｍｃｏｍｐｌｅｘＤＮＡｓｏｕｒｃｅ．Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：６６８６−６６９０．）および単純な
配列繰り返し（ＳＳＲｓ）（ＬｉｔｔＭ．ａｎｄＪ．Ａ．Ｌｕｔｙ１９８
９，Ａｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｒｅｖ
ｅａｌｅｄｂｙｉｎｖｉｔｒｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａ
ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｒｅｐｅａｔｗｉｔｈｉｎｔｈｅｃａｒｄ
ｉａｃｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎｇｅｎｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ
．４４：３９７−４０１；ＴａｕｔｚＤ．１９８９．Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂ
ｉｌｉｔｙｏｆｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｓａｇｅｎｅｒ
ａｌｓｏｕｒｃｅｆｏｒｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡｍａｒｋｅｒ
ｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７６４６３−６４７１；およびＷ
ｅｂｅｒＪ．Ｌ．ａｎｄＰ．Ｅ．Ｍａｙ１９８９．Ａｂｕｎｄａｎｔ
ｃｌａｓｓｏｆｈｕｍａｎＤＮＡｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｗｈｉ
ｃｈｃａｎｂｅｔｙｐｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４４：３８
８−３９６．）が、ゲノムマッピングおよびフィンガープリンティング手段の新
たな世代のステージを用意してきた。

【０００４】制限断片長さ多型（ＲＥＬＰ）のマーカー方法論は、ゲノミックＤＮＡを制限
酵素で切断し、ＤＮＡ断片を電気泳動により分離し、分離されたＤＮＡ断片をナ
イロン膜からなる支持体に移すことからなり、それにより、公知ＤＮＡとのハイ
ブリダイゼーション実験に使用できる固相支持体上のゲルのイメージを得る。公
知のＤＮＡ配列は、クローン化されたゲノミックまたはｃＤＮＡの配列または特
定のＰＣＲ産物でありうる。このＤＮＡ配列（プロービング配列）は放射性、蛍
光または発色ヌクレオチドにより標識される。ハイブリダイゼーションの結果は
、Ｘ線感受性フィルムに固相支持体を暴露することにより観察するか、または発
色ヌクレオチドをプローブを標識するために使用する場合は支持体上で直接観察
できる。一つまたはわずかなＤＮＡバンドがプロービング配列のオリジンに依存
してしばしば観察される。制限断片長さ多型は、異なる遺伝子型のバンド形成パ
ターンの間の違いとして可視化され、そして与えられた制限酵素切断部位の分布
を反映する。

【０００５】ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）のマーカーの方法論は、全ゲノミックＤ
ＮＡを鋳型として使用するＰＣＲ反応を操縦するためにプライマーとして使用さ
れる１０ヌクレオチドの短いＤＮＡ配列からなる。オリゴヌクレオチドプライマ
ーのヌクレオチドの組成は、存在するＤＮＡ配列に対する何の参照もなしに勝手
に選択される。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動後に直接可視化される。
一般的に、１から１５の増幅されたＤＮＡ断片が真核生物のゲノムの増幅産物と
して観察できる。多型性は遺伝子型の間の増幅パターンにおける違いとしてアガ
ロースゲル上で直接検出され、そしてプライマー中の単一のヌクレオチドの変化
および挿入／欠失を反映する。

【０００６】増幅された断片の長さ多型性（ＡＦＬＰ）のマーカーは、ゲノミックＤＮＡを
制限酵素で切断し、その結果のゲノミックＤＮＡ断片をアダプター配列（ゲノミ
ックＤＮＡを消化するために使用された制限酵素により生じるのと同じ配列部位
を一方の末端に有する短い二本鎖ＤＮＡ配列）に連結し、そして上記アダプター
配列に相同なオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するＰＣＲ反応を実施
することからなる。増幅の結果は、数個の（６０まで）ＤＮＡ断片として染色後
にアクリルアミドゲル上で直接可視化される。多型性は、別の遺伝子型における
特定の増幅されたＤＮＡ断片の存在／不在の違いとして観察され、そしてＲＥＬ
Ｐと同様に、与えられた制限酵素切断部位の分布の違いを反映するが、ゲノミッ
クＤＮＡのサブセットを伴う。

【０００７】単純配列繰り返し（ＳＳＲ）のマーカー方法論は、単純なＤＮＡ配列繰り返し
（例えば、（ＴＡ）ｎ，（ＣＡＧＡ）ｎ，（ＧＡ）ｎ等、「ｎ」は一般的に５か
ら１８の間を変動する）を、これらの単純な配列モチーフを有する生物の遺伝子
ライブラリーからゲノミッククローンを同定するためのプローブとして使用する
ことからなる。単離されたクローンは次に配列決定し、そして上記ＳＳＲを囲む
ＤＮＡプライマーの対をＳＳＲおよび上記周囲ＤＮＡ配列の増幅のためにデザイ
ンする。多型性は異なる遺伝子型の一つまたはわずかなヌクレオチドの差異によ
り変わる一つまたは極めてわずかな増幅ＤＮＡ断片として観察され、そして単純
配列の繰り返し（「ｎ」）の数の差異を反映する。

【０００８】レトロ要素および他の大きな繰り返し要素に基づくＤＮＡマーカーは、要素を
囲むプライマーをデザインすることからなり、そして多型性は、上記要素が別の
遺伝子型の存在するかまたは不在の場合に、見いだされる。

【０００９】別の種類のＤＮＡマーカーが存在するが、それらは上記ＤＮＡマーカーの種類
の組み合わせである。例えば、ＰＣＲ産物がＰＣＲ増幅後に制限酵素により切断
される場合に、ＣＡＰｓは切断された増幅多型ＤＮＡである。プライマー対は繰
り返し要素およびＡＦＬＰプライマーから、または別の繰り返し要素からデザイ
ンすることができる。

【００１０】連鎖の研究およびフィンガープリンティングの研究における使用のために新規
な普及した核酸配列が提供されることが大変望ましい。この新規な普及した核酸配列を使用して真核生物中の多型性を検出する方法が
提供されることも大変望ましい。発明の概要本発明の一つの目的は、連鎖の研究およびフィンガープリンティングの研究に
おける使用のための新規な普及した核酸配列を提供することである。

【００１１】本発明の別の目的は、この新規な普及した核酸配列を使用して真核生物中の多
型性を検出する方法を提供することである。本発明によれば、興味のある核酸配列の多型性を検出する方法が提供される。
上記方法は、工程：ａ）興味のある核酸配列を、小型の逆向き繰り返し転移性要素（ＭＩＴＥ）に
相同の第１プライマー、その断片またはその誘導体、および上記第１プライマー
が上記興味のある核酸配列中に存在する場合に上記ＭＩＴＥにアニールする第２
プライマーで増幅するが、但し、第２プライマーは上記第１プライマーに同一で
あるかまたは同一ではなく、そしてＭＩＴＥ配列に相同であるかまたは相同でな
く；ｂ）工程ａ）で増幅された興味のある上記核酸配列の断片を分離し；そしてｃ）工程ｂ）で得られた断片と参照用の間の核酸配列の違いを検出するための
少なくとも一つのプライマーを用いた核配列の増幅により得られる参照断片に関
して、工程ｂ）で得られた断片を分析し、それにより差異が興味のある核酸中の
多型性の指標であることからなる。

【００１２】また、本発明によれば、真核生物の遺伝子型を決定する方法が提供される。上
記方法は、工程：ａ）興味のある核酸配列を、小型の逆向き繰り返し転移性要素（ＭＩＴＥ）に
相同の第１プライマーその断片またはその誘導体、および第２プライマーで増幅
するが、但し、上記第１プライマーは上記真核生物の上記核酸配列中に存在する
場合に上記ＭＩＴＥにアニールし、そして第２プライマーは上記第１プライマー
に同一であるかまたは同一ではなく、そしてＭＩＴＥ配列に相同であるかまたは
相同でなく；ｂ）工程ａ）で増幅された興味のある上記核酸配列の断片を分離し；そしてｃ）工程ｂ）で得られた断片と、上記真核生物からの参照用核酸配列を比較し
、それにより工程ｂ）の断片と参照用核酸配列の同一性が、上記核酸配列を有す
る真核生物の指標であることからなる。

【００１３】さらに、本発明によれば、真核生物体をフィンガープリンティングする方法が
提供される。上記方法は、工程：ａ）真核生物体の核酸配列を、ＭＩＴＥに相同な第１プライマー、その断片ま
たはその誘導体、および第２プライマーで増幅するが、但し、上記第１プライマ
ーはＭＩＴＥ配列に特異的であり、そして第２プライマーは上記第１プライマー
に同一であるかまたは同一ではなく、そしてＭＩＴＥ配列に相同であるかまたは
相同でなく；ｂ）工程ａ）の核酸配列を増幅することから得られた断片を分離し、それによ
り、そうして分離された断片が真核生物体の典型であることからなる。

【００１４】好ましくは、増幅の工程は、ＰＣＲの手法により作用させる。第１プライマー
は、ＭＩＴＥ要素からのコンセンサス配列に由来する。より好ましくは、第１プ
ライマーは、Ｔｏｕｒｉｓｔ，Ｓｔｏｗａｗａｙ，ＢａｒｆｌｙまたはＭａｒｉ
ｎｅｒからのコンセンサス配列に由来する核酸配列を有する。

【００１５】もっとも好ましくは、第１プライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号
３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号
９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４
、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、
配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配
列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、は３
０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４および配列番号
３５からなる群から選択される核酸配列を有する。

【００１６】第２プライマーは、任意に、ＭＩＴＥ配列特異的プライマー、ＳＳＲ配列に基
づくプライマー、レトロ要素配列に基づくプライマーＲＥＬＰ演出するクローン
化された核酸配列に基づくプライマー、ランダムなゲノミック配列に基づくプラ
イマーおよび遺伝子配列に基づくプライマーからなる群から選択されるプライマ
ーである。

【００１７】また、本発明によれば、真核生物体の子孫を追跡するため、真核生物体の雑種
形成を測定するため、真核生物体中の連鎖した表現型の特性のバリエーションを
同定するため、交配から個々の子孫を同定するための、本発明の方法によるよう
な、多型性の使用法が提供され、但し、上記子孫は、親ドナーおよび／またはレ
シピエントの親から、あるいは遺伝子マップを構築するための遺伝子マーカーと
して、所望の遺伝学上の寄与を有する。

【００１８】本発明の方法は、遺伝子コードＤＮＡ配列または非コードＤＮＡ配列を囲むゲ
ノミックＤＮＡ配列を単離するために使用してよい。遺伝子コードＤＮＡ配列を
囲むゲノミックＤＮＡ配列は、好ましくはプロモーター配列または制御配列であ
る。

【００１９】さらに、本発明によれば、真核生物の核酸配列を少なくとも一つのＭＩＴＥに
相同な一つのプライマーで増幅することにより得られた、核酸断片またはその誘
導体が、核酸配列上のプローブとしての使用のために提供される。

【００２０】上記核酸断片またはその誘導体は、マーカーで補助された選択（ＭＡＳ）、マ
ップに基づくクローニング、ハイブリッド検定、フィンガープリンティング、遺
伝子型決定、および対立遺伝子特異的マーカーのために使用してよい。

【００２１】真核生物または真核生物体は好ましくは植物、動物または真菌である。さらに本発明によれば、ゲノミックマッピングの方法が提供され、工程：ａ）真核生物体のゲノミックを分画し；ｂ）そうして分画されたゲノミックをベクター中にクローン化し；ｃ）そうしてクローン化されたベクター中のＤＮＡを、小型逆向き繰り返し転
移性要素（ＭＩＴＥ）に相同な第１プライマーおよび第２プライマーを用いて増
幅することにより、そうして増幅されたベクターを試験するが、但し第１プライ
マーは上記ＤＮＡ中の小型逆向き繰り返し転移性要素（ＭＩＴＥ）にハイブリダ
イズすることができ、そして第２プライマーは第１プライマーに同一であるかま
たは同一でなく、そしてＭＩＴＥ配列に相同であるかまたは相同でなく；ｄ）上記増幅工程望ましい伸長産物をサイズにより分離し；ｅ）伸長産物のパターンを測定し；そしてｆ）オーバーラップするパターンからゲノミックを再構成することからなる。

【００２２】また、本発明によれば、多型性遺伝子マーカーをマッピングする方法が提供さ
れ、ａ）真核生物体からの生物学上のサンプルから制限酵素で消化された核酸配列
の混合物を用意し；ｂ）上記酵素消化された核酸配列の混合物を、小型逆向き繰り返し転移性要素
（ＭＩＴＥ）に相同な第１プライマー、その断片またはその誘導体、および第２
プライマーを用いて増幅するが、但し、第１プライマーはＭＩＴＥに特異的であ
り、そして第２プライマーは第１プライマーと同一であるかまたは同一でなく、
そしてＭＩＴＥ配列の相同であるかまたは相同でなく；ｃ）上記混合物中の別々に増幅された核酸配列のセットを、同定し；そしてｄ）別々に増幅された核酸配列の少なくとも一つを唯一の遺伝子多型性にマッ
プし、それにより多型性のマーカーを提供することからなる。

【００２３】ＭＩＴＥに基づく本発明のマーカー系は、従来技術のアプローチのいかなるも
のとも違い、そしてより単純であり、より多くの情報を与え、そして繰り返し可
能である。

【００２４】本発明の目的のため、以下の用語を、以下のとおりに定義する。用語「ＭＩＴＥ」は、小型逆向き繰り返し転移性要素を意味することを意図す
る。事実、ＭＩＴＥｓは転移性要素のスーパーファミリーである。これらの要素
は、３キロベースの長さよりも短く、完全かまた縮重した末端逆向き繰り返しを
含み、１０塩基対に等しいかまたはそれ未満の標的部位重複を周囲に有し、そし
てゲノム中で中程度から大変に富裕である。

【００２５】ＭＩＴＥｓは１キロベースの長さよりも短く、完全かまたは縮重した逆向き繰
り返しを含み、ＴＡまたはＴＡＡ標的部位重複を周囲に有し、そしてゲノム中で
中程度からたいへんに富裕である。

【００２６】用語「ＭＩＴＥに基づくプライマー」はＭＩＴＥまたはその断片を含むプライ
マー、およびＭＩＴＥ由来のプライマーおよびＭＩＴＥを認識してそれにハイブ
リダイズするかまたはアニールするプライマーを含むことを意図する。

【００２７】用語「ＭＩＴＥに基づく遺伝子マーカー」（ＭＧＭ）は、ＭＩＴＥ要素にハイ
ブリダイズするマーカー、または少なくとも一つのＭＩＴＥプライマーおよび任
意に別のＭＩＴＥプライマーまたはＳＳＲ配列、レトロ要素配列、ＲＥＬＰ配列
または遺伝子配列を用いて核酸配列のＰＣＲ増幅により生産されたマーカーを意
味することを意図する。

【００２８】用語「ＭＩＴＥ間多型性」（ＩＭＰ）は、ＭＧＭのサブセットに関し、そして
一つのＭＩＴＥプライマーまたは２つの異なるＭＩＴＥプライマーを使用して核
酸配列のＰＣＲ増幅により得られたマーカーを意味することを意図する。

【００２９】用語「真核生物」または「真核生物体」は、植物、動物および真菌を意味する
ことを意図する。用語相同は、相同な核酸配列のコンテクストにおいて、ストリンジェント条件
下で相同な核酸配列の相補体にハイブリダイズする核酸配列を意味することを意
図する。

【００３０】発明の詳細な説明本発明は、ＭＩＴＥを基本とした遺伝子マーカー（ＭＧＭ）として、本明細書
に言及した新規遺伝子マーカーを提供する。ＰＣＲを用いるこの新規な方法にお
いて、多型は豊富な転位性因子、ＭＩＴＥから設計したプライマーを用いて表わ
される。これらの転位性因子を基本としたプライマーの有用性は、大麦の二倍化
した一倍体のマッピング群において、及びオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍｖｕｌｇ
ａｒｅ）の２６品種及びオオムギ野生種（Ｈｏｒｄｅｕｍｓｐｏｎｔａｎｅｕ
ｍ）の１つの系を遺伝子型を分類することにおいて、分離パターンを研究するこ
とによって決定した。本発明に従うと、新規なタイプのＤＮＡマーカーであって
、本明細書中ＭＩＴＥを基本とした遺伝子マーカーとして言及され、並びにこれ
らのマーカーの染色体の局在、それらの普遍性及び多才さ、及びフィンガープリ
ンティングの結果を提供する。最後に、出願人は、本発明のＭＧＭ及びＩＭＰア
プローチの実行可能性と一般化を検討する。

【００３１】現存の技術に優る利点と改善点上述のように、ＭＩＴＥメンバーはしばしば遺伝子と関連して見出され、即ち
、繰返し領域に制限されない。このＭＩＴＥの普及は、非常な価値を有する。そ
れは、実際にはゲノムのいかなる領域も多数の真核生物体においてＩＭＰ増幅し
やすいことを示す。

【００３２】総５０−１００の評点可能なバンドはあらゆる単一のプライマーで増幅し、Ｍ
ＩＴＥが高いコピー数でゲノムに存在することを示している。いくつかのプライ
マーとプライマーあたりの５０−１００の遺伝子座を用いて、スクリーニングに
おいて、ゲノム全体をすぐにカバーすることができる。

【００３３】ＭＩＴＥプライマーは、他の型のプライマー、例えば、ＳＳＲ、レトロエレメ
ント、シークエンスしたＲＦＬＰ、ランダムゲノム配列、ベクター配列、及び遺
伝子に対して特異的なプライマーと組み合わせることができる。これは確かに本
発明のＭＧＭ方法の可能性を増大する。

【００３４】本発明の方法は、高分解能ＬＩ−ＣＯＲ自動化蛍光ゲノタイピングシステムと
組み合わせて、ＤＮＡマッピング及びフィンガープリンティング技術に非常な力
を与える。ＲＡＰＤとＲＦＬＰに優るその力と分解能は、より多くの遺伝子座を
一度の反応において検出することができるものとして明らかである。ＭＧＭ及び
ＩＭＰ解析は容易で、迅速であり、そしてコスト効果がある。ＲＡＰＤ解析とは
対照的に、必要なプライマーは有意に少ない。ＡＦＬＰ及びＲＦＬＰ技術とは異
なり、ＭＧＭ及びＩＭＰは制限酵素消化又はアダプターライゲーションを必要と
しない。

【００３５】技術の説明ｉ）植物の材料使用したマッピング群は、オオムギ品種Ｌｉｎａとオオムギ野生品種Ｃａｎａ
ｄａＰａｒｋとの間の交配に由来する８８の二倍化した一倍体の個体からなる
。この群は、ほとんどＲＦＬＰマーカーに基づいたリンケージマップを構築する
ために使用されてきた。

【００３６】２６のオオムギのエントリーと１つのオオムギ野生種エントリーのＣａｎａｄ
ａＰａｒｋを含む、総数２７の品種（表１を参照）はフィンガープリントに使
用し、マッピング群を生成するために親（ｐａｒｅｎｔ）としてＬｉｎａと共に
使用した。回収物は、二条及び六条型を含んだ。二条型の中には、春と冬の品種
の両方が含まれた。２７品種の全てを予めＲＦＬＰゲノタイピング調査に使用し
、したがって、これらの品種の間の、ＲＬＦＰを基本とした遺伝的相関が知られ
た。

【００３７】

【表１】

【００３８】ｉｉ）ＰＣＲ検出システム２つの検出システムを使用して、多型の同定における分解能及び有効性を比較
した。第一は、通常のアガロース検出システムであった。このシステムにおいて
は、通常のプライマー（非標識）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、Ｎｕ
ｓｉｅｖｅアガロース（２／３Ｎｕｓｉｅｖｅ：１／３アガロース）を用いて、
又は用いないで２％アガロースゲルで視覚化した。第二は、ＬＩ−ＣＯＲ自動化
ＤＮＡシークエンシング／ゲノタイピングシステムであった。このシステム用の
プライマーは、ＩＲＤ７００（商標）蛍光色素（Ｌｉ−ＣＯＲ，Ｉｎｃ．，
Ｌｉｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）で標識した。ＰＣＲ産物は、４１ｃｍ長さ
のガラスプレートの装置を用いて６％アクリルアミド変性ゲルで視覚化した。ゲ
ル電気泳動はＬＩ−ＣＯＲ４２００システムで行った。

【００３９】ｉｉｉ）ＰＣＲ７つのマスタープライマー（表２）及びそれらの３’−アンカー誘導体（表３
）を設計し、本研究において評価した。６個のマスタープライマーはＭＩＴＥプ
ライマー（ＴＥＭ−１、ＴＥＭ−２、ＴＥＭ−３、ＴＥＭ−１０、ＴＥＭ−１１
及びＴＥＭ−１２）であり、及びＴＥＭ−４はいくつかのＴｙｌ／ｃｏｐｉａ様
レトロトランスポゾン（ＨｉｒｏｃｈｉｋａＨ．ａｎｄＲ．Ｈｉｒｏｃ
ｈｉｋａ１９９３．Ｔｙｌ−ｃｏｐｉａｇｒｏｕｐｒｅｔｒｏｔｒａｎ
ｓｐｏｓｏｎｓａｓｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆ
ｐｌａｎｔｇｅｎｏｍｅｓ．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．６８：３５
−４６．）の逆転写酵素（ＲＴ）ドメインの保存配列の部分であった。１個以上
のヌクレオチドがある位置にあり得る場合に、マスタープライマーは変性してい
た。アンカープライマーは、マスタープライマーの３’端に添加された追加のヌ
クレオチドを有するマスタープライマーであった（表３）。ＭＩＴＥプライマー
は、それぞれのカテゴリーからのＭＩＴＥの末端逆向き繰返し（ＴＩＲ）領域に
おける共通配列から設計した。両ＴＩＲを使用して、プライマーを設計した。Ｔ
ＥＭ−４のみ、他のプライマーと組み合せて使用した。プライマーはアガロース
ゲル検出システムとＬＩ−ＣＯＲ自動化検出システムにおいて使用したが、後者
のためのプライマーは蛍光色素を用いて標識することを除いた。

【００４０】

【表２】

【００４１】

【表３】

【００４２】アガロース検出システム用のＰＣＲ増幅は、２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．４
ｍＭｄＮＴＰ、各１μＭのプライマー及び０．６２５ユニットのＡｍｐｌｉＴ
ａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含む２５μｌ
体積中で行った。次のプロフィールを用いた：９４℃で１分３０秒の初期変性、
続く９４℃で３０秒、５８℃で４５秒及び７２℃で１分の３５サイクル、及び７
２℃で５分の最終的な伸長。ＴＥＭ−１を含むときはいつでも６０℃のアニーリ
ング温度を使用した。

【００４３】ＬＩ−ＣＯＲ検出システム用のＰＣＲ増幅は、通常のアガロースシステムにお
ける場合と同様の条件で行ったが、２０μｌの総反応体積及び０．５ユニットの
ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用し
たことは除いた。同様の一般的なプロフィール（ＴＥＭ−１の温度変化なしに）
を使用した。ＰＣＲ増幅は、２工程で行った。第一の工程は、プレ増幅であり、
３５サイクル用に非標識プライマーを用いた。プレ増幅ミックスの３μｌのアリ
コートを増幅の第二の工程のために使用した。０．１μＭ濃度の標識化プライマ
ーを第二ラウンドの増幅に使用した（第一の工程において１μＭの非標識プライ
マーと比較して）。

【００４４】ｉｖ）データ回収及び統計的解析ａ）フィンガープリンティング及び遺伝子の類似性の解析多型並びに共通のバンドは、それぞれの個体に対して、存在（１）、不在（０
）、又はデータ未回収（９）としてスコアにした。得られる生のデータマトリッ
クスは、Ｎｅｉ及びＬｉ（ＮｅｉＭ．ａｎｄＷ．Ｌｉ１９７９．Ｍ
ａｔｈｅｍａｔｉｃａｌｍｏｄｅｌｓｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｇｅｎｅ
ｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｔｅｒｍｓｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏ
ｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．７６：５２６９−５２７３）の方法、２ｎ_xy／（ｎ_x＋ｎ_y）（ここで
、ｎ_x及びｎ_yはそれぞれラインｘ及びｙにおけるバンド数であり、ｎ_xyは両方の
ラインによって共有されるバンド数である）を用いて相対的遺伝子類似性（ＧＳ
）マトリックスを生成するために使用した。多型及び共通バンドの両方を使用し
て、ＧＳ値を計算する。

【００４５】系統樹はＧＳマトリックスに基づいて、ＵＰＧＭＡ（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ
ｐａｉｒ−ｇｒｏｕｐｍｅｔｈｏｄａｒｉｔｈｍｅｔｉｃａｖｅｒａｇｅ
）を用いて作成した。２つのＭＩＴＥプライマーを用いた解析から得られる組み
合わさった系統樹を作成した。標準化したＭａｎｔｅｌ統計値（Ｍａｎｔｅｌ
Ｎ．Ａ．１９６７．Ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｄｉｓｅａｓｅ
ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇａｎｄａｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄｒｅｇｒｅｓｓ
ｉｏｎａｐｐｒｏａｃｈ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２７：２０９−２２
０）を使用し、３１３の多型ＲＦＬＰマーカーバンドに基づいた同じ品種の遺伝
的類似性マトリックスを伴う、ＭＩＴＥを基本とした遺伝子マーカーに基づいた
遺伝的類似性マトリックスを比較した。有意性の試験は、観察されたＺ値とマト
リックスの１０００のランダム置換の分布を比較することによって行った。全て
の統計的解析はＮＴＳＹＳ−ｐｃｓｏｆｔｗａｒｅ（ＲｏｈｌｆＦ．Ｊ．１
９９４. ＮＴＳＹＳ−ｐｃｎｕｍｅｒｉｃａｌｔａｘｏｎｏｍｙａｎｄ
ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍ，ｖｅｒｓｉ
ｏｎ１．８０，ＥｘｅｔｅｒＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｎ．Ｙ．）を用いて行っ
た。

【００４６】ｂ）遺伝子マッピングＴＥＭ−１及びＴＥＭ−１０プライマーを用いて作製した、ＭＩＴＥに基づく
遺伝子マーカーの局在化を行い、以前オオムギ栽培変種Ｌｉｎａ個体群×Ｈ．ｓ
ｐｏｎｔａｎｅｕｍＣａｎａｄａＰａｒｋ個体群のマップを作製するために用
いた７１種のＲＦＬＰマーカーの枠内でこれらをマッピングした。この個体群の
２倍化ハプロイド８８個体の亜集団をマッピングに用いた。分離比をχ²分析を
用いて解析した。マッピングはコンピュータプログラムＭＡＰＭＡＫＥＲ（Ｌａ
ｎｄｅｒＥ．Ｓ．，Ｐ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ，Ａ．Ｂａ
ｒｌｏｗ，Ｍ．Ｊ．Ｄａｌｙ，Ｓ．Ｅ．Ｌｉｎｃｏｌｎ及びＬ．Ｎｅｗｂｕｒｇ
１９８７年、ＭＡＰＭＡＫＥＲ：Ａｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｕｔ
ｅｒｐａｃｋａｇｅｆｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｐｒｉｍａｒｙｇｅ
ｎｅｔｉｃｌｉｎｋａｇｅｍａｐｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｄ
ｎａｔｕｒａｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１巻：１７４〜１
８１頁）を用いて行った。ＭＩＴＥに基づく遺伝子マーカーを、その閾値では２
群を形成する７Ｈ群を除いたＬＯＤ閾値４において２点解析を用いて連鎖群に特
定し、公表されているＲＦＬＰマーカーの局在に基づいて関連付けた。ＬＯＤ閾
値２における多点解析を用いて連鎖群内にマーカーを配置した。

【００４７】結果本発明のＰＣＲに基づく方法においてＭＩＴＥ配列を評価するために、末端逆
向き繰り返し配列（ＴＩＲ）領域からプライマーをデザインし、全てのプライマ
ーをＴＩＲから外向きにデザインした。このようにして、これらのプライマーに
よって増幅されたいかなる配列も増幅可能な距離内で隣接する２つのＭＩＴＥ間
に位置することが期待される。これらのプライマーは、オオムギ栽培変種Ｌｉｎ
ａ及びＨ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ栽培変種ＣａｎａｄａＰａｒｋの交配から得
られた８８個体の２倍化ハプロイド個体群を用いた分離解析おいて単独で又は組
合せて用いられる。

【００４８】ａ）単一プライマー増幅各ＭＩＴＥプライマーはアガロースゲル上で約１０本の数えられるバンドを生
成し、そのうち２〜５本は多型性であった。これらの多型性は、オオムギ親株Ｌ
ｉｎａ及びＨ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ親株ＣａｎａｄａＰａｒｋのあいだで明
確に検出され、多くは２倍化ハプロイドにおいて期待された１：１のメンデル分
離を示した。図１は分離パターンの１例を示す。

【００４９】ＭはλＰｓｔＩマーカーを示す。レーン１はオオムギＬｉｎａのＰＣＲ産物を
含む。レーン２はＨ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍＣａｎａｄａＰａｒｋのＰＣＲ産
物を含む。レーン３〜２８はマッピングした個体群の個々のＰＣＲ産物を含む。

【００５０】プライマーＴＥＭ−１は、非常に弱く、ほとんど目に見えないバンドを含む高
いバックグランドを示した。おそらくこれは多くの密接に関連した配列、例えば
ＴＩＲ領域における変異の結果得られた配列によるものである。この場合は、ホ
ルムアルデヒドはＰＣＲのバックグランドを軽減し、特異性を高めることが報告
されているため（ＮａｇａｏｋａＴ．及びＹ．Ｏｇｉｈａｒａ１９９７年、Ａ
ｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙｏｆｉｎｔｅｒ−ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｒｅｐｅａｔｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｉｎｗｈｅａｔａｎｄｔｈｅｉ
ｒｕｓｅａｓＤＮＡｍａｒｋｅｒｓｉｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｔｏＲＦ
ＬＰａｎｄＲＡＰＤｍａｒｋｅｒｓ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．
９４巻：５９７〜６０２頁）、２％ホルムアルデヒドを反応混合物に添加した。

【００５１】合計約１００本の数えられるバンドを、プライマーＴＥＭ−１を用いてＬＩ−
ＣＯＲ配列決定用ゲル上で検出した。プライマーＴＥＭ−１０を用いた場合は６
０〜７０本検出し、プライマーＴＥＭ−３では３０〜４０本検出することができ
るであろう。ＴＥＭ−１を用いたアクリルアミドゲル電気泳動の断片を図２に示
す。アガロース検出系と同様に、オオムギ親株Ｌｉｎａ及びＨ．ｓｐｏｎｔａｎ
ｅｕｍ親株ＣａｎａｄａＰａｒｋのあいだで明確に多型性を検出し、多くは２
倍化ハプロイド個体群において１：１のメンデル分離を示した。

【００５２】レーン１はオオムギ親株ＬｉｎａのＰＣＲ産物を含む。レーン２はＨ．ｓｐｏ
ｎｔａｎｅｕｍ親株ＣａｎａｄａＰａｒｋのＰＣＲ産物を含む。レーン３〜４
５はＬｉｎａ×ＣａｎａｄａＰａｒｋの交配から得られた個体群の個々のＰＣ
Ｒ産物を含む。

【００５３】ｂ）プライマーの組合せプライマーの組合せ試験を、単にアガロース検出系を用いて行った。これらの
プライマーを異なる組合せで用いた場合にいくつかの状況に遭遇した。ＴＥＭ−
４／ＴＥＭ−１０の組合せはＴＥＭ−１０単独と同様のパターンを生成したのに
対し、ＴＥＭ−１／ＴＥＭ−１０の組合せは異なる結果を生成した。即ち、ＴＥ
Ｍ−１０単独で得られたバンドの多くは阻害され、ＴＥＭ−１単独で得られたバ
ンドもほとんど目に見えず、より小さなサイズのバンドが現れた。ＴＥＭ−３／
ＴＥＭ−１０の組合せで伸展時間を長くすると（１分１５秒）、いずれかのプラ
イマー単独の場合とは異なる３本の明確に見える分離バンドを含む異なるパター
ンを生成した（図３）。レーン１〜１６はそれぞれマッピングした個体群におけ
る各個体である。親株は示していない。

【００５４】同様の状況がプライマーＴＥＭ−１を用いたときにも見られた。ＴＥＭ−１を
ＴＥＭ−４と組合せたときにバンドのパターンが変化しなかったのに対し（図４
Ａ）、このプライマーをＴＥＭ−３又はＴＥＭ−１０と組合せたときはパターン
が変化した。その上、伸展時間を長くすると（１分１５秒）、ＴＥＭ−１／ＴＥ
Ｍ−４の組合せはより長い分離バンドを生成し、他のいくつかのバンドは抑制さ
れた（図４Ｂ）。興味深いことに、より長いバンド（プライマーの組合せ以降Ｔ
１−４ＡＡと称す）が、バンドＴ４−１０Ａとほとんど同様に分離した（図１）
。Ｔ１−４ＡＡ及びＴ４−１０Ａは、ＴＥＭ−１０単独でもバンドＴ４−１０Ａ
を増幅させるため、同じ共通プライマーＴＥＭ−４の産物ではない。又、Ｔ１−
４ＡＡはＴ４−１０Ａよりも約３００ｂｐ長い。これは、２種のプライマーの組
合せがＤＮＡのきつく連結した領域を増幅させたことを示している。これは、こ
れらの交換可能な配列が高コピー数で存在することが予想されるため、意外なこ
とではない。

【００５５】図４Ａ及び図４Ｂの説明は図１と同様である。レーン番号は図４Ａ及び図４Ｂ
で互いに対応している。いくつかのプライマーの組合せは矛盾した結果を示した。可能な説明を以下に
示す：各プライマー単独で１０本以上のバンドを増幅させており、したがって、これ
らのプライマーの組合せは、生成したバンドが多すぎて明確に可視化できないか
、又は微小な状態変化を伴って上下するバンドパターンを生成したのであろう；異なるアニーリング温度（非常に低いアニーリング温度を有するＴＥＭ−４を
用いた場合のように）が、生成したパターンを決定する重要な因子であるかもし
れない；及び異なるプライマーの親和性が、ＴＥＭ−１及びＴＥＭ−１０を用いた場合のよ
うに特定のバンドの優位性をもたらすのかもしれない。

【００５６】それにもかかわらず、単一プライマー反応の場合のように、蛍光標識検出系を
用いて、これらの問題のいくつかは解決され、プライマーの組合せは検出可能な
位置の数を増加させると思われる。

【００５７】ｃ）ＭＩＴＥに基づく遺伝子マーカーの染色体局在化アガロース検出系を用いて、３種のＭＩＴＥプライマー及びＴｙ１／ｃｏｐｉ
ａレトロトランスポゾンプライマーは、マッピングした個体群上に合計１５種の
検出可能な多型マーカーを生成した。２種を除く全ては期待した１：１の分離比
で分離した。これらのマーカーのうち１３種はマップ上に配置されるであろう。
他の２種のマーカーは関連づけられないままである。これらは予想される分離比
に対し有意な偏差を示すマーカーであり、アガロース上で分離できない同様のサ
イズの２本のバンドから成ると思われる。

【００５８】図５には、ＭＩＴＥに基づく（ＭＩＴＥ−ｂａｓｅｄ）ゲノムマーカーが、よ
り大きなフォント（デゲシュジャパンｆｏｎｔ）および太字で見られる。蛍光標
識されたＴＥＭ−１およびＴＥＭ−１０を用いたアクリルアミドゲル上で検出さ
れた遺伝子座（ｌｏｃｉ）のみが見ることができる。括弧内の遺伝子座は、２以
上のＬＯＤスコアで評価することができなかったものである。ほぼ１２０および
９０の明確なバンドが、プライマーＴＥＭ−１およびＴＥＭ−１０を用いたをそ
れぞれ用いたＬＩ−ＣＯＲシークエンシングゲル（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｇｅ
ｌ）上で検出された。検出されたバンドの大きさの範囲はおおよそ１００ｂｐ〜
１ｋｂであった。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって映像化された（ｖｉ
ｓｕａｌｉｚｅｄ）通りのＴＥＭ−１を用いた増幅結果の一部を図２に示す。

【００５９】７５個の多型バンド（ｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ）および１９個の多型バン
ドを、それぞれＴＥＭ−１プライマーおよびＴＥＭ−１０プライマーを用いて発
生させた。いくつかのペアのバンドはコドミナント挙動（ｃｏ−ｄｏｍｉｎａｎ
ｔｂｅｈａｖｉｏｒ）を示した（１Ｈ上の遺伝子座Ｔ１−０．２、２Ｈ上の遺
伝子座Ｔ１−４およびＴ１−１６、３Ｈ上の遺伝子座Ｔ１０−６、４Ｈ上の遺伝
子座Ｔ１０−８および７Ｈ上の遺伝子座Ｔ１−３６；図５）。しかし、残りのバ
ンドは、厳密にＬｉｎａ原種（ｐａｒｅｎｔ）由来の４１個および厳密にＨ．ｓ
ｐｏｎｔａｎｅｕｍ原種由来の４１個を有する存在／不存在パターンを示した。
７０のマッピンングされたＴＥＭ−１遺伝子座のうち、２４個の遺伝子座は予想
された１：１の分離割合（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎｒａｔｉｏ）から有意に外
れた。１個（７Ｈ上のＴ１−１９）を除く２４個すべての遺伝子座は、ＲＦＬＰ
マーカーもこのマッピング集団（ｍａｐｐｉｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）にお
いて歪んだ（ｄｉｓｔｏｒｔｅｄ）分離割合を示した領域に位置した。１８個の
ＴＥＭ−１０遺伝子座のうち２個が、予想された分離割合から外れた。これらは
、ＲＦＬＰ遺伝子座が予想された１：１の分離割合からやはり外れた領域に再度
確認された。

【００６０】合計８８個の遺伝子座がマッピングされた。これらの遺伝子座は７個の連鎖グ
ループ（ｌｉｎｋａｇｅｇｒｏｕｐｓ）すべてをカバーした（図５）。更に、
これらの遺伝子座の分布は、組換えが典型的に誘導されるセントロメアの領域（
ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃｒｅｇｉｏｎｓ）（例えば、１Ｈ、３Ｈおよび７Ｈの
グループ、図５）の回りに予想された集積性（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）を除いて
は有意の集積性を示さなかった。実際、この分布はｃＤＮＡ検出ＲＦＬＰ（ｃＤ
ＮＡｓｄｅｔｅｃｔｉｎｇＲＦＬＰｓ）に関して発見された分布と同じであ
る（Ｌ．Ｓ．Ｏ’Ｄｏｎｏｕｇｈｕｅ、未公表）。このことはＭＩＴＥがゲノム
含有コーディング配列の領域に位置すること、およびこのゲノム全体を限定され
た１組のＭＩＴＥに基づくプライマーでカバーすることが可能になることを示唆
している。

【００６１】ｄ）フィンガープリンティングＨ．ｖｕｌｇａｒｅ原種Ｌｉｎａ、Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ原種カナダパー
ク（ＣａｎａｄａＰａｒｋ）および２５Ｈ．ｖｕｌｇａｒｅ栽培品種（ｃｕｌ
ｔｉｖａｒｓ）を含む、合計２７の栽培品種を用いてフィンガープリンティング
におけるこれらのＭＩＴＥプライマーの有用性を評価した。アガロース上で、こ
れらのプライマー並びにプライマーの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ）
であるＴＥＭ−３、ＴＥＭ−１０、ＴＥＭ−１／−３およびＴＥＭ−１／−４が
これらの栽培品種を識別するのに有用であることが見出された。これらのプライ
マーおよび組み合わせの各々について１〜３個の多型バンドが見られた。アガロ
ース上でのフィンガープリンティング実験の一例を図６に示す。

【００６２】図６における３個の分離バンドは、２７個の栽培品種が７つのグループに分か
れることを示した。Ｍは分子量マーカーλＰｓｔＩを表す。その数は表１におけ
る数に対応する。

【００６３】２つのＭＩＴＥプライマーである、ＴＥＭ−１およびＴＥＭ−１０を蛍光標識
検出システム（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｌａｂｅｌｉｎｇｄｅｔｅｃｔｉ
ｏｎｓｙｓｔｅｍ）を用いてフィンガープリンティング解析において調べた。
ＴＥＭ−１については合計６２個のバンドが得られ、そのうち３７個は多型であ
り、残りの２２個は２７個の栽培品種すべてと同じであった。この電気泳動の１
セクションを図７に示す。ＴＥＭ−１０については合計６０個のバンドが得られ
、そのうち３４個は多型であり、残りの２６個は２７個の栽培品種すべてと同じ
であった。図７の系列（ｌｉｎｅｓ）の確認（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
は表１に見出すことができる。

【００６４】レーン（ｌａｎｅｓ）１〜２７は、それぞれＬｉｎａ、ＣａｎａｄａＰａｒ
ｋ、Ａｌｅｘｉｓ、Ａｎｇｏｒａ、Ａｒｉｅｌ、Ａｚｈｕｌ、Ｅｌｌｉｃｅ、Ｅ
ｘｐｒｅｓｓ、Ｆｉｌｌｉｐａ、Ｇｏｌｄｉｅ、Ｇｏｌｆ、高アミロースグレイ
シャー（Ｈｉｇｈａｍｙｌｏｓｅｇｌａｃｉｅｒ）、Ｉｇｒｉ、Ｉｎｇｒｉ
ｄ、Ｋｉｎｎａｎ、Ｍａｕｄ、Ｍｅｌｔａｎ、Ｍｅｎｔｏｒ、Ｍｅｔｔｅ、Ｍｏ
ｎａ、Ｒｏｌａｎｄ、Ｓａｘｏ、Ｓｖａｎｉ、Ｔｅｌｌｕｓ、Ｔｏｆｔａ、Ｔｒ
ｅｂｏｎおよびＶｉｘｅｎ由来の結果を表す。ダッシュは少なくとも１個の栽培
品種を他の栽培品種と区別したマーカーを示す。

【００６５】ＮｅｉおよびＬｉの係数（ＮｅｉａｎｄＬｉ、上記）を使用して、ＴＥＭ
−１、ＴＥＭ−１０および双方のプライマーの結合データ（ｃｏｍｂｉｎｅｄ
ｄａｔａ）についてＧＳマトリックスが得られた。同じデータの組み合わせにつ
いてデンドログラム（ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ）が得られた。ＴＥＭ−１およびＴ
ＥＭ−１０の結合データのデンドログラムを図８に示す。このデンドログラムは
Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ系統をＨ．ｖｕｌｇａｒｅ栽培品種と明かに区別して
いる。Ａｚｈｕｌ（６列タイプ（ｓｉｘ−ｒｏｗｔｙｐｅ））の例外はあるが
、スプリング２列タイプ（ｓｐｒｉｎｇｔｗｏ−ｒｏｗｔｙｐｅｓ）が群生
し、本発明に含まれる４ウィンタータイプ（４ｗｉｎｔｅｒｔｙｐｅｓ：Ａ
ｎｇｏｒａ、Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＩｇｒｉおよびＶｉｘｅｎ）から分かれた。上記
ウィンター２列とともに群生する高アミロースグレイシャー（ＨｉｇｈＡｍｙ
ｌｏｓｅＧｌａｃｉｅｒ）系統は６列タイプである。そのＧＳマトリックスを
ＲＦＬＰ解析について先に得られたＧＳマトリックスと比較した結果、Ｍａｎｔ
ｅｌ統計値がＺ＝０．６９４７５と両者には良好な相関があることが示された。
この正の相関はＰ＝０．００２０という確率で非常に有意であり、このＺの値は
偶然によってのみ得られるものであろうと考えられる。

【００６６】ｅ）プライマーの普遍性（ｕｎｉｖｅｒｓａｌｉｔｙ）プライマーの普遍性を裏付けるために、動物由来のＭＩＴＥマスタープライマ
ーおよび植物由来のＭＩＴＥマスタープライマーを植物のゲノムＤＮＡ、昆虫の
ゲノムＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡに使用した。

【００６７】図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、表２に記載されているように。マスタープ
ライマーＴＥＭ−１２（図９Ａ）；マスタープライマーＴＥＭ−１（図９Ｂ）；
マスタープライマーＴＥＭ−１０（図９Ｃ）およびマスタープライマーＴＥＭ−
１１（図９Ｄ）を用いて７つの異なるＤＮＡソース（ｓｏｕｒｃｅ）のＰＣＲ増
幅されたプロフィール（ｐｒｏｆｉｌｅｓ）の典型的な結果を示す。ＤＮＡのソ
ース（各レーンごとに上に掲載）は次の通りである：１）正常なヒトＤＮＡ（男性）２）正常なヒトＤＮＡ（女性）３）ヒトＤＮＡ（白化症（ａｌｂｉｎｉｓｍ）の男性）４）ヒトＤＮＡ（白化症（ａｌｂｉｎｉｓｍ）の女性）５）昆虫：タマゴヤドリバチ（Ｔｒｉｃｈｏｇｒａｍｍａ）６）マメ科植物：大豆７）マメ科植物：アルファルファ８）アブラナ科植物：カノーラ（Ｃａｎｏｌａ）９）穀類：小麦（ｗｈｅａｔ）１０）穀類：エンバク（ｏａｔ）１１）穀類：大麦（ｂａｒｌｅｙ）これらの結果は、ＭＩＴＥに基づくマーカーが広範囲の種において使用可能で
あることを明かに裏付けている。

【００６８】ｆ）マスター由来の配列の多用途性（ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ）ＭＩＴＥに基づくマーカーシステムの多用途性を裏付けるために、マスタープ
ライマー配列の３’末端に追加のヌクレオチドを付加することによってマスター
プライマー配列を修飾した。これは増幅された産物の特異性を増大させる効果を
有し、マスター配列によって得られた増幅プロフィールが複雑すぎてストウアウ
エイ（Ｓｔｏｗａｗａｙ）から誘導されたＴＥＭ−１プライマーに関するもので
あると解することが困難である時に特に有用である。

【００６９】図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄおよび１０Ｅは、増幅前段階（ｐｒｅａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｔｅｐ）におけるマスタープライマーＴＥＭ−１に
ついて得られた結果の一例および増幅に際して表３に記載されているその対応す
るアンカープライマー（ａｎｃｈｏｒｅｄｐｒｉｍｅｒ）を示す。これらの図
は、穀類ＤＮＡ（大麦）のプロフィールを、マスタープライマーＴＥＭ−１のみ
（図１０Ａ）；アンカープライマーＴＥＭ−１Ａ（その３’末端を追加の”Ａ”
でつなぎ止める）（図１０Ｂ）；アンカープライマーＴＥＭ−１Ｃ（”Ｃ”でつ
なぎ止める）（図１０Ｃ）；アンカープライマーＴＥＭ−１Ｇ（”Ｇ”でつなぎ
止める）（図１０Ｄ）およびアンカープライマーＴＥＭ−１Ｔ（”Ｔ”でつなぎ
止める）（図１０Ｅ）と比較して、穀類ＤＮＡ（大麦）のポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）により増幅されたプロフィールを示す。

【００７０】これらの結果から、ＴＥＭ−１がその３’末端においてＡ、Ｃ、ＴまたはＧの
いずれかでつなぎ止められてられている（ａｎｃｈｏｒｅｄ）ときに、より単純
な増幅パターンが得られることが明らかである。また、異なる３’末端アンカー
を用いて異なる相補的な増幅パターンが得られることも明らかである。

【００７１】一般的な目的及び商業的な応用様々な研究により、今日まで研究されている事実上全ての種において転移因子
が存在することが示されている。レトロトランスポゾンは、植物ゲノム中に高い
コピー数で存在する。Ａｌｕファミリーは、ヒトゲノム半数体当たり５×１０⁵
コピーと見積もられ、これは言い換えると、ＤＮＡ５ｋｂ毎に一つのＡｌｕ因子
が存在することになる。この因子だけでも、霊長類中のゲノムの５％を説明する
（ＢｅｒｇＤ．Ｅ．及びＭ．Ｍ．Ｈｏｗｅ，１９８９．移動性ＤＮＡ．
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ）。Ｔｙ１／コピア群因子は、種間で広範な多様性が見られる
が、ソラマメ属の種（Ｖｉｃｉａｓｐｅｃｉｅｓ）中のゲノム当たり１０⁶コ
ピーまで蓄積し、ゲノムの２％より多くを構成しうる（ＰｅａｒｃｅＳ．Ｒ．
，Ｈ．Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｌｉ，Ｊ．Ｓ．Ｈｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ，
Ａ．Ｋｕｍａｒ及びＡ．Ｊ．Ｆｌａｖｅｌｌ１９９６．ソラマメ属の
種中のＴｙ１−コピア群レトロトランスポゾン：コピー数、配列異質性（ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）及び染色体配置．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．２５０：３０５−３１５）。ＢＡＲＥ−１レトロトランスポゾンは
３×１０⁴のコピー数を有しており、そして、（ヤバネ）オオムギゲノムの６．
７％までを構成する（ＳｕｏｎｉｅｍｉＡ．，Ｋ．Ａｎａｍｔｈａｗａｔ−
Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｔ．Ａｒｎａ及びＡ．Ｈ．Ｓｃｈｕｌｍａｎ１９９６
．レトロトランスポゾンＢＡＲＥ−１は、（ヤバネ）オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕ
ｍｖｕｌｇａｒｅＬ．）ゲノムの主要な分散された成分である．Ｐｌａｎ
ｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ３０：１３２１−１３２９）。Ｓａ
ｎＭｉｇｕｅｌらによる研究では（ＳａｎＭｉｇｕｅｌＰ．，Ａ．Ｔｉｋｈ
ｏｎｏｖ，Ｙ．−Ｋ．Ｊｉｎ，Ｎ．Ｍｏｔｃｈｏｕｌｓｋａｉａ，Ｄ．
Ｚａｋｈａｒｏｖ，Ａ．Ｍｅｌａｋｅ−Ｂｅｒｈａｎ，Ｐ．Ｓ．Ｓｐｒｉｎ
ｇｅｒ，Ｋ．Ｊ．Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｍ．Ｌｅｅ，Ｚ．Ａｖｒａｍｏｖａ及
びＪ．Ｌ．Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ１９９６．トウモロコシゲノムの遺伝子間
領域中の入れ子型レトロトランスポゾン．Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：７６５−７
６８）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）クローン上に単離されたトウモロコシＡｄｈ
ｌ−Ｆ遺伝子の側面に接する隣接する２８０ｋｂ領域の配列決定により、クロー
ンの６０％より多くを説明する、３７クラスの入れ小型トランスポゾン繰り返し
が明らかにされた。

【００７２】Ｔｏｕｒｉｓｔ及びＳｔｏｗａｗａｙの因子（ＢｕｒｅａｕＴ．Ｅ．及びＳ
．Ｒ．Ｗｅｓｓｌｅｒ１９９２．Ｔｏｕｒｉｓｔ：トウモロコシの遺伝子に
しばしば伴う、小逆向き繰り返し因子の大きなファミリー．ＰｌａｎｔＣｅ
ｌｌ４：１２８３−１２９４；及びＢｕｒｅａｕＴ．Ｅ．及びＳ．Ｒ．
Ｗｅｓｓｌｅｒ１９９４．Ｓｔｏｗａｗａｙ：単子葉植物及び双子葉植物
の双方の遺伝子に伴う逆向き繰り返し因子の新たなファミリー．Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ６：９０７−９１６）は、Ａｃ及びＥｎ／Ｓｐｍ等の伝統的なＴＩＲ
転移因子ファミリーとは有意に異なるが、転移因子のＴＩＲクラスのメンバーで
ある。Ｔｏｕｒｉｓｔ及びＳｔｏｗａｗａｙのようなＴＩＲ転移因子の新たなメ
ンバーであるＢａｒｆｌｙは、（ヤバネ）オオムギのキシロースイソメラーゼ遺
伝子に伴うことが見出されている。この型のいくつかの他の因子とともに、集合
的にＭＩＴＥｓと言及されるこれらの因子（ＢｕｒｅａｕＴ．Ｅ．，Ｐ．Ｃ
．Ｒｏｎａｌｄ及びＳ．Ｒ．Ｗｅｓｓｌｅｒ１９９６．コンピュターに基づ
いた系統的な調査は、野生型コメの遺伝子における小逆向き繰り返し因子の優勢
を明らかにした．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：８５２４
−８５２９）は、これまで研究されている多数の植物種において見出された。Ｍ
ＩＴＥｓはまた、真核ゲノムにおｋても高コピー数で存在することが期待される
。

【００７３】転移因子のゲノム中における偏在及び分散は、これらがＰＣＲに基づくマッピ
ング用道具（ｔｏｏｌ）として利用しうることを示唆する。実際、Ｓｉｎｎｅｔ
ら（ＳｉｎｎｅｔＤ．，Ｊ．−Ｍ．Ｄｅｒａｇｏｎ，Ｌ．Ｒ．Ｓｉｍａｒ
ｄ及びＤ．Ｌａｂｕｄａ１９９０．Ａｌｕ特異的プライマーを用いた複製連
鎖反応によって検出されたＡｌｕｍｏｒｐｈｓ−ヒトＤＮＡ多型．Ｇｅｎｏｍ
ｉｃｓ７：３３１−３３４）は、Ａｌｕ−特異的プライマーを異なるヒトＤＮ
Ａ試料間の多型の探索に使用した。これらの研究者は、これらの多型（アルモフ
ス（ａｌｕｍｏｒｐｈｓ）と呼称する）をゲノム分析道具として使用することの
可能性を明らかに示し（Ｓｉｎｎｅｔら、上述）、そして、これらのアルモスを
使用して、一つのアルモフのあるヒト疾患への連鎖を検出することに成功した（
ＺｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚＥ．，Ｍ．Ｌａｂｕｄａ，Ｄ．Ｓｉｎｎｅｔ，
Ｆ．Ｈ．Ｇｌｏｒｉｅｕｘ及びＤ．Ｌａｂｕｄａ１９９２．Ａｌｕオリ
ゴヌクレオチド指向ＰＣＲを用いた複数の多型遺伝子座の同時スクリーニングに
よる連鎖マッピング．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：８４
４８−８４５１）。コピア様レトロトランスポゾン、ＰＤＲ１もまた、多型を研
究するのに、そして、他の特異的なプライマーとともにエンドウ（Ｐｉｓｕｍ）
における異なる系を診断するのに、成功裏に使用された（ＬｅｅＤ．，Ｔ．
Ｈ．Ｎ．Ｅｌｌｉｓ，Ｌ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．Ｐ．Ｈｅｌｌｅｎｓ及びＷ．
Ｇ．Ｃｌｅａｒｙ１９９０．エンドウ（Ｐｉｓｕｍ）におけるコピア様因子
は、遺伝学的分析における分散された繰り返し配列の使用を論証する．Ｐｌａ
ｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ１５：７０７−７２２）。

【００７４】本発明において、ＴＩＲ転移因子メンバー、ＭＩＴＥｓは、（ヤバネ）オオム
ギにおけるマッピング用およびフィンガープリンティング用道具として使用され
、そして、通常のアガロース系及びＬＩ−ＣＯＲ自動化ＤＮＡ分析系の双方にお
いて、Ｈ．ｖｕｌｇａｒｅ種群内の多型を検出すること、既存の遺伝子連鎖マッ
プにこれらのＭＧＭを位置づけること、そして、（栽培）品種のフィンガープリ
ントを作成することに成功した。

【００７５】通常のアガロース検出系において、本発明者らは３種のＭＩＴＥプライマー及
び１種のレトロトランスポゾンプライマーを用いて、１５の明らかに評点可能な
多型が検出され、そして、１５のうち１３が（ヤバネ）オオムギの４つの連鎖群
にマッピングされた。各ＭＩＴＥプライマー又はプライマー群が、１０より多く
の評点可能なバンドを生じ、２−５が多型であった。ＩＬ−ＣＯＲ自動化遺伝子
型決定系において、示された２つのＭＩＴＥプライマーの各々が、１００近くの
評点可能なバンドを生じ、７５までもが多型であった。７種の（ヤバネ）オオム
ギ連鎖群の全てをマッピングするためのマーカーは、これらの２種のプライマー
を用いて得られた。これは、ＭＩＴＥに基づいたマーカーのゲノム中におけるラ
ンダムな分布を示す。

【００７６】コンピュターに基づく配列類似性検索によって、新たなＭＩＴＥｓが常に発見
されている。ＭＩＴＥｓの数が増加するにつれ、ＭＩＴＥｓの高コピー数を有す
る事実上あらゆる種の詳細な連鎖マップが、ＭＧＭｓのみに基づいて容易に構築
されうる。ＭＧＭｓを有する重要な遺伝子の連鎖研究もまた、容易に実施しうる
。同じ種内の（栽培）品種間のこれらのＭＩＴＥに基づくプライマーによって検
出された高レベルの多様性は、これらのプライマーの実用的な価値を論証する。

【００７７】いくつかの置換可能な構成要素、たとえばAlu（Berg and Howe、上述; Makalo
wski W. G. A. Michell and D. Labuda 1994. Alu sequences in the coding r
egions of mRNA: a source of protein variability. Trends Genet. 10: 188
-193）、およびマウスB2構成要素（Clemens M. J. 1987. A potential role fo
r RNA transcribed from B2 repeats in the regulation of mRNA stability.
Cell 49: 157-158）が、しばしば遺伝子と関連していることが見いだされた。M
ITE構成分子もまた、植物および他の真核細胞遺伝子中にてしばしば同定される
。トウモロコシのwx座位での変異の原因として、隠れ場所（stowaway）が初めて
見つかった（Bureau and Wessler、上述）。100以上の遺伝子が、そのコード領
域および非コード領域中にMITEを保有していることが見いだされた（Bureau et
al.、上述）。レトロ構成要素と動物遺伝子および植物遺伝子との緊密な関連性
、およびMITEと作物学的穀物（agronomic crops）および他の植物における遺伝
子との緊密な関連性により、複数の遺伝子配列あるいは遺伝子配列の特性決定を
するための新規な方法が開かれた。実際、研究は、遺伝子配列の単離において（
Nelson D. L., S. A. Ledbetter, L. Corbo, M. F. Victoria, R. Ramirez-Soli
s, T. D. Webster, D. H. Ledbetter and C. T. Caskey 1989. Alu polymerase
chain reaction: A method for rapid isolation of human-specific DNA seq
uences from complex DNA sources. Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 6686-6690
; Souer E., F. Quattrocchio, N. de Vetten, J. Mol and R. Koes 1995. A g
eneral method to isolate genes tagged by a high copy number transposable
element. Plant Journal 7: 677-685）、ゲノム解析において（Hirochika H.
1997. Retrotransposons of rice: their regulation and use for genome a
nalysis. Plant molecular Biology 35: 231-240; Lee D., T. H. N. Ellis,
L. Turner, R. P. Hellens and W. G. Cleary 1990. A copia-like element i
n Pisum demonstrates the uses of dispersed repeated sequences in genetic
analysis. Plant Molecular Biology 15: 707-722）、そして遺伝子構造の解
析および遺伝子発現の解析において（White S. E., L. F. Habera and S. R. We
ssler 1994. Retrotransposons in the flanking regions of normal plant ge
nes: A role for copia-like elements in the evolution of gene structure
and expression. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 11792-11796）、他のタイプの
置換可能な構成要素を使用して行われた。

【００７８】本発明の方法の応用には、いくつかの形がある。 1）連鎖研究 a）本願において記載したように、連鎖地図をMITEマーカーを用いて構築する
ことができる。このためには、集団と親とを分離することが必要とされる。連鎖
地図は、分離に基づいて構築される。

【００７９】 b）表現形質あるいは遺伝子との連鎖もまた、行うことができる。このことは
、研究を促進するための容積を確かめられた分離物の解析と組み合わせることに
より、達成された。この場合において、2つの親および表現型質的に（形質を伴
う）あるいは遺伝学的に（遺伝子を伴う）異なるプールを、MITEプライマーを用
いるPCR増幅において使用して、多型マーカーを同定し、そしてしたがって推定
連鎖を同定することができる。

【００８０】 c）同一の原理により、MGMあるいはIMPと複合的な遺伝子調節下において形質
を調節する定量的形質座位（Quantitative Trait Loci；QTL）との関連性が、単
一点ANOVA（single point ANOVAs）、インターバルマッピング（Interval Mappi
ng）および混合インターバルマッピングなどの様々な統計学的解析を用いて、検
出された。

【００８１】 d）作物学的に重要な形質を伴うマーカーの連鎖がいったん知られると、これ
らのマーカーをマーカー関連性選択（marker assisted selection；MAS）におい
て使用し、繁殖プログラムを促進することが出来る。 2）フィンガープリント研究 MGMおよびIMPのアプローチを使用して、たとえばYAC（酵母人工染色体）およ
びBAC（バクテリア人工染色体）などの大型の挿入物ライブラリーを構築する助
けとして、栽培品種の同定の補助をし、そして遺伝子単離だけだけでなくマーカ
ー変換についても補助をすることができる。

【００８２】 a）生成されたMGMおよびIMPマーカーは、隣接物（contigs）をアラインメント
にする際に、そして染色体歩行の際に、目印として機能することができる。 b）MGMおよびIMPのアプローチは栽培品種をフィンガープリントする際に、そ
して系統を繁殖させる際に、それらの血統および遺伝子の関連性を決定し、親系
統の子孫系統への寄与の程度を決定し、そして新しい系統および栽培品種の検定
を行う際に、容易に探究されうる。

【００８３】 MGMのアプローチを使用して、遺伝子単離およびゲノム配列のサブクローニン
グの補助とすることができる。 a）遺伝子を置換可能な構成要素によりタグ付けする場合、ゲノム中に全体的
に存在するために、MGMを利用することができる。MITEプライマーをタグ付け用
トランスポゾンから設計したプライマーと組み合わせて使用することが出来る。
隣接する配列を増幅することができ、続いてそれを使用して、野生型遺伝子を単
離することができる。トランスポゾンタグ化遺伝子の通常のクローニングと比較
して、このアプローチにより、DNAライブラリースクリーニングの1ラウンドを省
略することができる。

【００８４】 b）遺伝子の単離に対して同様のシナリオを用いて、既知の遺伝子配列に隣接
するゲノム配列を単離するためにMGMを利用することができる。MITEプライマー
および既知の遺伝子配列から設計したプライマーをPCRにおいて使用し、隣接す
る配列を増幅することができる。

【００８５】 c）MITEプライマーと組み合わせて使用されるRFLPを検出するDNAクローン由来
のプライマーを使用する増幅を使用して、RFLP マーカーをPCRベースのマーカー
に変換することができる。

【００８６】本発明は、本発明の具体的な態様とともに記載されているが、さらなる修飾が
可能であることを理解できるだろうし、そしてこの応用には、一般的には、本発
明の原理による、そして、本発明が包含する技術分野中の既知の実施あるいは習
慣的な実施の範囲内に入るように、そして上述した本質的な特徴に対して応用で
きるものとして、本願開示からのそのような新発展を含み、そして添付した請求
の範囲の範囲にしたがって、本発明のいずれかのバリエーション、使用、または
適合を包含することを意図することを理解できるであろう。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、アガロースゲル上のプライマーコンビネーションＴＥＭ−４／−１０
またはＴＥＭ−１０のみのＰＣＲ産物を示す。

【図２】図２は、ＩＲＤ７００（商標名）蛍光染料標識されたＴＥＭ−１プライマーの
ＰＣＲの結果のセクションを示し、本発明の好ましい態様に従いＬＩ−ＣＯＲ自
動化系４２００を用いて６％アクリルアミドゲル上で可視化され、但しＰ１は親
Ｈ．ｖｕｌｇａｒｅであり、Ｌｉｎａ（Ｐ１），Ｐ２は親Ｈ．ｓｐｏｎｔａｎｅ
ｕｍ，ＣａｎａｄａＰａｒｋ（Ｐ２）であり、そして分離された個々はＬｉｎ
ａとＣａｎａｄａＰａｒｋＤＨ（二倍ハプロイド）集団の間の交配からであ
る。

【図３】図３は、アガロースゲル上の１分および１５秒のより長い延長時間によるＴＥ
Ｍ−３／−１０のＰＣＲの結果を示す。

【図４】図４は、６０秒の延長時間および７５秒の延長時間による異なる産物を示すＴ
ＥＭ−１／−４のアガロースゲル上のＰＣＲの結果を示す。

【図５】図５は、ＴＥＭ−１およびＴＥＭ−１０プライマーを用いて検出されたＩＭＰ
座の分布を示す、Ｈ．ｖｕｌｇａｒｅｃｖ．ＬｉｎａｘＨ．ｓｐｏｎｔａ
ｎｅｕｍＣａｎａｄａＰａｒｋ集団の連鎖マップを示す。

【図６】図６は、アガロースゲル上の２７のＨｏｒｄｅｕｍ系のフィンガープリンテ
ィングを示す。

【図７】図７は、ＩＲＤ７００（商標名）蛍光染料標識されたＴＥＭ−１プライマーを
用いた２７のｈｏｒｄｅｕｍ系のフィンガープリンティングの結果のセクション
を示す。

【図８】図８は、ＴＥＭ−１およびＴＥＭ−１０のバンド形成パターンに基づいた、２
７の品種の遺伝子類似性マトリックスのＵＰＧＭＡクラスター化からもたらされ
たデンドログラムを示す。

【図９】図９Ａ，９Ｂ，９Ｃおよび９Ｄは、マスタープライマーＴＥＭ−１２（図９Ａ
）；マスタープライマーＴＥＭ−１（図９Ｂ）；マスタープライマーＴＥＭ−１
０（図９Ｃ）およびマスタープライマーＴＥＭ−１１（図９Ｄ）を使用した、」
１１の異なるＤＮＡ源のＰＣＲ増幅プロフィールを示す、異なる真核生物中のＭ
ＩＴＥに基づくマーカーのユニバーサルな使用を示す。

【図１０】図１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ，１０Ｄおよび１０Ｅは、マスタープライマー（Ｔ
ＥＭ−１）とその対応するアンカー化プライマーを用いて得られた結果の例を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ビュロー，トマカナダ国ケベックエイチ２ダブリュー２イー７，モントリオール，ドゥ・ブリヨン 4250 (72)発明者チャン，リュインアメリカ合衆国テネシー州38104，メンフィス，セントラル・アベニュー 2639，アパートメントブイ−４ (72)発明者ランドリ，ブノアカナダ国ケベックジェイ２ワイ１ビー３，ラカディー，アレ・デ・シガル 134 (72)発明者オドヌーグー，ルイーズ・ステファニーカナダ国ケベックジェイ３エイチ２エス５，モン・サン―ティレール，ドラール ―デ―ソルモー 524 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA03 CA09 HA14 4B063 QA12 QQ07 QQ09 QQ42 QR32 QR55 QR62 QS12 QS25 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】興味のある核酸配列の多型性を検出する方法であって、工程：ａ）興味のある核酸配列を、小型の逆向き繰り返し転移性要素（ＭＩＴＥ）に
相同の第１プライマー、その断片またはその誘導体、および上記第１プライマー
が上記興味のある核酸配列中に存在する場合に上記ＭＩＴＥにアニールする第２
プライマーで増幅するが、但し、第２プライマーは上記第１プライマーに同一で
あるかまたは同一ではなく、そしてＭＩＴＥ配列に相同であるかまたは相同でな
く；ｂ）工程ａ）で増幅された興味のある上記核酸配列の断片を分離し；そしてｃ）工程ｂ）で得られた断片と参照用の間の核酸配列の違いを検出するための
少なくとも一つのプライマーを用いた核配列の増幅により得られる参照断片に関
して、工程ｂ）で得られた断片を分析し、それにより差異が興味のある核酸中の
多型性の指標であることからなる上記方法。
【請求項２】真核生物の遺伝子型を決定する方法であって、工程：ａ）興味のある核酸配列を、小型の逆向き繰り返し転移性要素（ＭＩＴＥ）に
相同の第１プライマーその断片またはその誘導体、および第２プライマーで増幅
するが、但し、上記第１プライマーは上記真核生物の上記核酸配列中に存在する
場合に上記ＭＩＴＥにアニールし、そして第２プライマーは上記第１プライマー
に同一であるかまたは同一ではなく、そしてＭＩＴＥ配列に相同であるかまたは
相同でなく；ｂ）工程ａ）で増幅された興味のある上記核酸配列の断片を分離し；そしてｃ）工程ｂ）で得られた断片と、上記真核生物からの参照用核酸配列を比較し
、それにより工程ｂ）の断片と参照用核酸配列の同一性が、上記核酸配列を有す
る真核生物の指標であることからなる上記方法。
【請求項３】真核生物体をフィンガープリンティングする方法であって、工
程：ａ）真核生物体の核酸配列を、ＭＩＴＥに相同な第１プライマー、その断片ま
たはその誘導体、および第２プライマーで増幅するが、但し、上記第１プライマ
ーはＭＩＴＥ配列に特異的であり、そして第２プライマーは上記第１プライマー
に同一であるかまたは同一ではなく、そしてＭＩＴＥ配列に相同であるかまたは
相同でなく；ｂ）工程ａ）の核酸配列を増幅することから得られた断片を分離し、それによ
り、そうして分離された断片が真核生物体の典型であることからなる上記方法。
【請求項４】増幅の工程をＰＣＲの手法により作用させる、請求項１、２ま
たは３記載の方法。
【請求項５】第１プライマーがＴｏｕｒｉｓｔ，Ｓｔｏｗａｗａｙ，Ｂａｒ
ｆｌｙまたはＭａｒｉｎｅｒからのコンセンサス配列に由来する、請求項１、２
、３または４記載の方法。
【請求項６】第１プライマーが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配
列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配
列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列
番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番
号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号
２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、は３０、配
列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５か
らなる群から選択される核酸配列を有する、請求項１、２、３、４または５記載
の方法。
【請求項７】第２プライマーが、ＭＩＴＥ配列特異的プライマー、ＳＳＲ配
列に基づくプライマー、レトロ要素配列に基づくプライマーＲＥＬＰ演出するク
ローン化された核酸配列に基づくプライマー、ランダムなゲノミック配列に基づ
くプライマーおよび遺伝子配列に基づくプライマーからなる群から選択される、
請求項１、２、３、４、５または６記載の方法。
【請求項８】真核生物体の子孫を追跡するための、請求項１、２、３、４、
５、６または７記載の方法により検出された多型性の使用。
【請求項９】真核生物体中の雑種形成を測定するための、請求項１、２、３
、４、５、６または７記載の方法により検出された多型性の使用。
【請求項１０】連鎖した表現型の特性のバリエーションを同定するための、
請求項１、２、３、４、５、６または７記載の方法により検出された多型性の使
用。
【請求項１１】遺伝子マップを構築するための遺伝子マーカーとしての、請
求項１、２、３、４、５、６または７記載の方法により検出された多型性の使用
。
【請求項１２】交配から個々の子孫を同定するためであって、上記子孫は親
ドナーおよび／またはレシピエント親からの所望の遺伝子寄与を有する、請求項
１、２、３、４、５、６または７記載の方法により検出された多型性の使用。
【請求項１３】遺伝子コードＤＮＡ配列または非コードＤＮＡ配列を囲むゲ
ノミックＤＮＡ配列を単離するための、請求項１、２、３、４、５、６または７
記載の方法。
【請求項１４】遺伝子コードＤＮＡ配列を囲むゲノミックＤＮＡ配列がプロ
モーター配列または制御配列である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】真核生物の核酸配列を少なくとも一つのＭＩＴＥに相同な一
つのプライマーで増幅することにより得られた、核酸配列上のプローブとしての
使用のための核酸断片またはその誘導体。
【請求項１６】マーカーで補助された選択（ＭＡＳ）、マップに基づくクロ
ーニング、ハイブリッド検定、フィンガープリンティング、遺伝子型決定、およ
び対立遺伝子特異的マーカーのための、請求項１５記載の核酸断片またはその誘
導体の使用。
【請求項１７】真核生物が植物、動物または真菌である、請求項２記載の方
法。
【請求項１８】真核生物体が植物である、請求項３記載の方法。
【請求項１９】ゲノミックマッピングの方法であって、工程：ａ）真核生物体のゲノミックを分画し；ｂ）そうして分画されたゲノミックをベクター中にクローン化し；ｃ）そうしてクローン化されたベクター中のＤＮＡを、小型逆向き繰り返し転
移性要素（ＭＩＴＥ）に相同な第１プライマーおよび第２プライマーを用いて増
幅することにより、そうして増幅されたベクターを試験するが、但し第１プライ
マーは上記ＤＮＡ中の小型逆向き繰り返し転移性要素（ＭＩＴＥ）にハイブリダ
イズすることができ、そして第２プライマーは第１プライマーに同一であるかま
たは同一でなく、そしてＭＩＴＥ配列に相同であるかまたは相同でなく；ｄ）上記増幅工程望ましい伸長産物をサイズにより分離し；ｅ）伸長産物のパターンを測定し；そしてｆ）オーバーラップするパターンからゲノミックを再構成することからなる上記方法。
【請求項２０】多型性遺伝子マーカーをマッピングする方法であって、ａ）真核生物体からの生物学上のサンプルから制限酵素で消化された核酸配列
の混合物を用意し；ｂ）上記酵素消化された核酸配列の混合物を、小型逆向き繰り返し転移性要素
（ＭＩＴＥ）に相同な第１プライマー、その断片またはその誘導体、および第２
プライマーを用いて増幅するが、但し、第１プライマーはＭＩＴＥに特異的であ
り、そして第２プライマーは第１プライマーと同一であるかまたは同一でなく、
そしてＭＩＴＥ配列の相同であるかまたは相同でなく；ｃ）上記混合物中の別々に増幅された核酸配列のセットを、同定し；そしてｄ）別々に増幅された核酸配列の少なくとも一つを唯一の遺伝子多型性にマッ
プし、それにより多型性のマーカーを提供することからなる上記方法。