JP2002338599A - Biologically active protein having improved retentivity in blood and method for preparing the same - Google Patents
Biologically active protein having improved retentivity in blood and method for preparing the sameInfo
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、血中滞留性が向上
した生理活性タンパク質およびその調製方法に関する。
本発明の血中滞留性が向上した生理活性タンパク質は、
生体内に投与したときの持続性に優れ、医薬として有用
である。TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a physiologically active protein having improved retention in blood and a method for preparing the same.
The physiologically active protein of the present invention having improved retention in blood,
It has excellent persistence when administered in vivo and is useful as a medicine.
【０００２】[0002]
【従来の技術】近年、種々の生理活性タンパク質を遺伝
子工学技術によって大量生産することが可能となり、医
薬品として使用されるようになってきている。このよう
な生理活性タンパク質は、種々の疾患の患者に治療目的
で投与される。しかし、生理活性タンパク質は生体内に
投与したとき、血中から速やかに消失あるいは排出され
てしまい、目的とする治療効果を得るためには、長時間
の持続投与、例えば静脈内への持続点滴など特殊な投与
技術や器具・装置の使用が必要であった。また、目的と
する治療効果を得るために大量投与が必要となり、この
ために予期せぬ副作用の発生が問題として指摘されるよ
うになってきた。このため、生理活性タンパク質の有効
性を高め、かつ投与に伴う副作用の発生を低下させるた
めに様々な試みがなされている。2. Description of the Related Art In recent years, it has become possible to mass-produce various bioactive proteins by genetic engineering techniques, and they have been used as pharmaceuticals. Such bioactive proteins are administered to patients with various diseases for therapeutic purposes. However, when a bioactive protein is administered to a living body, it is rapidly eliminated or excreted from the blood, and in order to obtain a desired therapeutic effect, continuous administration for a long time, for example, continuous infusion into a vein, etc. Special administration techniques and the use of instruments and devices were required. In addition, large doses are required to obtain the desired therapeutic effect, and the occurrence of unexpected side effects has been pointed out as a problem. For this reason, various attempts have been made to enhance the effectiveness of the bioactive protein and to reduce the occurrence of side effects associated with the administration.
【０００３】例えば、生理活性タンパク質のＮ−末端又
はＣ−末端にヒトＩｇＧのＦｃ領域を結合させ、その血
中滞留時間を延長させることによって投与後の効果持続
や副作用の低減を行うことが試みられた。例えば、ＴＮ
Ｆ可溶性レセプターのＮ−末端にＩｇＧのＦｃ領域を結
合させた融合蛋白質がすでに提案されている（New Engl
and Journal of Medicine,Vol.337,1559-1561,1999）。
この融合蛋白質は既存のリウマチ薬が効果の無い中等度
から重度の活動性慢性関節リウマチ（ＲＡ）及び若年性
関節リウマチの治療薬としてＥｍｂｒｅｌの名称で既に
米国で販売されている（日経バイオ年鑑２０００、３０
６−３０９頁）。また一方でOsteoprotegerin（ＯＰ
Ｇ）のＮ−末端又はＣ−末端にＩｇＧのＦｃ領域を結合
させた融合蛋白質も開発されている（S.Moronyetal.，A
Chimeric Form of Osteoprotegerin Inhibits Hyperca
lcemia and Bone Resorption Induced by IL-1，TNF，P
TH，PTHrP，and 1，25(OH)2D3.; J. Bone Miner. Re
s.，14，9，1478-1485，1999)。また、生理活性タンパ
ク質をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾して血
中滞留時間の延長や安定性の改善を図る試みがなされて
いる。例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の免疫原性の低
下（特表昭６２−２８９５２２）、インターロイキン２
（ＩＬ−２）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）
の水溶液中での凝集性の低下、血中半減期の延長、免疫
原性の減少（特表昭６２−５０３１７１）、プラスミノ
―ゲン活性化因子の血中半減期の延長（特表昭６３−６
０９３８）、スーパーオキサイドデスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）の血中半減期の延長（特表昭６３−１０８００）、
インシュリン分泌増強活性タンパク質（ＩＡＰ）の血中
半減期の延長（特表昭６３−１２６９００）、顆粒球コ
ロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の活性増強と血中内半減
期の延長（ＷＯ９０／０６９５２）などを例示すること
ができる。また特開昭６２−２５５４３５号公報に、効
果の持続性延長を目的としてＳＯＤ及びインシュリンを
カルボジイミドを介してコンドロイチン硫酸で修飾する
技術が開示されている。また血中滞留性の向上を目的と
して、大腸菌で生産したトロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍ
ｂｏｐｏｉｅｔｉｎ、ＴＰＯ）を制癌剤の投与等で引き
起こされる血小板減少症の治療薬として使用する試みが
なされている（ＮｅｗＣｕｒｒｅｎｔ、９（４）１９９
８年２月１０日号、研究開発Ｒｅｐｏｒｔ、４８−５０
頁）。For example, attempts have been made to bind the Fc region of human IgG to the N-terminus or C-terminus of a physiologically active protein and extend the residence time in the blood to maintain the effect after administration and reduce side effects. Was done. For example, TN
Fusion proteins in which the Fc region of IgG is linked to the N-terminus of the F-soluble receptor have already been proposed (New Engl).
and Journal of Medicine, Vol. 337, 1559-1561, 1999).
This fusion protein is already marketed in the US under the name Embrel as a treatment for moderate to severe active rheumatoid arthritis (RA) and juvenile rheumatoid arthritis where existing rheumatic drugs are ineffective (Nikkei Bio Yearbook 2000 , 30
6-309). On the other hand, Osteoprotegerin (OP
A fusion protein having an IgG Fc region bound to the N-terminus or C-terminus of G) has also been developed (S. Morony et al., A.
Chimeric Form of Osteoprotegerin Inhibits Hyperca
lcemia and Bone Resorption Induced by IL-1, TNF, P
TH, PTHrP, and 1, 25 (OH) 2 D3 .; J. Bone Miner. Re
s., 14, 9, 1478-1485, 1999). Attempts have also been made to modify the bioactive protein with polyethylene glycol (PEG) to extend the residence time in blood and improve stability. For example, decrease in immunogenicity of tumor necrosis factor (TNF) (Japanese Patent Publication No. 62-289522), interleukin 2
(IL-2), interferon beta (IFN-β)
Of coagulation in aqueous solution, prolongation of blood half-life, reduction of immunogenicity (Japanese Patent Publication No. 62-503171), prolongation of the plasma half-life of plasminogen activator (Japanese Patent Publication No. 63-503) 6
0938), superoxide desmutase (SO
D) Prolongation of the half-life in blood (Tokusho 63-10800),
Prolongation of blood half-life of insulin secretion enhancing activity protein (IAP) (JP-T-63-126900), enhancement of granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) activity and prolongation of blood half-life (WO90 / 06952) And the like. Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-255435 discloses a technique for modifying SOD and insulin with chondroitin sulfate via carbodiimide for the purpose of prolonging the effect. In addition, thrombopoietin produced by E. coli (Throm
Attempts have been made to use bopoietin (TPO) as a therapeutic agent for thrombocytopenia caused by the administration of anticancer drugs and the like (New Current, 9 (4) 199).
February 10, 2008 issue, Research and Development Report, 48-50
page).
【０００４】また、遺伝子工学の手法を用いて、生理活
性タンパク質の糖鎖やアミノ酸配列の一部を改変して血
中滞留性を改善した、組織性プラスミノーゲン活性化因
子（ｔｉｓｓｕｅ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉ
ｖａｔｏｒ、ｔＰＡ）やＥＰＯ変異体（New Erythropoi
esis Stimulating Protein）が提案されている（ＷＯ９
５／０５４６５）。さらにまた、特開平１１−２１２５
０号公報にはペプチドやタンパク質を還元性を有する糖
類と反応させて生体内の挙動を変化させる技術が開示さ
れている。このように、生理活性タンパク質の持続性や
血中滞留時間延長を目的として種々の技術が提案されて
いる。しかし簡便性や効率性、あるいは持続性延長効果
の点でまだ解決すべき問題が多数存在する。[0004] In addition, tissue plasminogen activator (tissue Plasminogen Acti- ti) has been improved in blood retention by modifying a part of the sugar chain and amino acid sequence of a physiologically active protein using genetic engineering techniques.
vector, tPA) and EPO mutant (New Erythropoi)
esis Stimulating Protein) (WO9)
5/05465). Furthermore, Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-2125
No. 0 discloses a technique in which a peptide or protein is reacted with a reducing saccharide to change the behavior in a living body. As described above, various techniques have been proposed for the purpose of maintaining the physiologically active protein and extending the blood retention time. However, there are still a number of issues that need to be solved in terms of simplicity, efficiency, or sustainability.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、生理活性タ
ンパク質を疾患治療の目的でヒトまたは動物に投与した
際の血中滞留性を改善し、効果を長時間持続させること
ができるデキストラン硫酸によって修飾された生理活性
タンパク質の提供を課題とする。また、本発明は生理活
性タンパク質を疾患治療の目的でヒトまたは動物に投与
した際の血中滞留性を改善し、効果を長時間持続させる
ことのできる、デキストラン硫酸によって修飾された生
理活性タンパク質の調製方法を提供することを課題とす
る。さらにまた、本発明は遺伝子組換え技術によって生
産された生体内半減期が短い生理活性タンパク質、特に
サイトカイン類を治療に用いるために大きな問題となっ
ていた血中滞留性を改善するための方法を提供すること
を課題とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention relates to a dextran sulfate capable of improving the blood retention when a bioactive protein is administered to a human or animal for the purpose of treating a disease and maintaining the effect for a long time. It is an object to provide a modified bioactive protein. Further, the present invention improves the blood retention when a bioactive protein is administered to humans or animals for the purpose of treating diseases, and can maintain the effect for a long time. It is an object to provide a preparation method. Furthermore, the present invention provides a method for improving blood retention, which has been a major problem for the therapeutic use of bioactive proteins, particularly cytokines, having a short half-life in vivo produced by genetic recombination technology. The task is to provide.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明は、（１）デキス
トラン硫酸が結合しており、且つ、デキストラン硫酸が
結合していない生理活性タンパク質に比較して血中滞留
時間が長いことを特徴とする修飾生理活性タンパク質、
（２）デキストラン硫酸がデキストラン硫酸ナトリウム
イオウ５である、（１）記載の修飾生理活性タンパク
質、（３）デキストラン硫酸が結合していない生理活性
タンパク質がサイトカインである、（１）又は（２）記
載の修飾生理活性タンパク質、（４）サイトカインがエ
リスロポエチン（erythropoietin）、腫瘍細胞障害因子
（tumor cytotoxic factor）、脂肪細胞分化抑制因子
（adipogenesis inhibitory factor）又は骨芽細胞増殖
因子（osteoblast growth factor 2）である、（３）記
載の修飾生理活性タンパク質、（５）生理活性タンパク
質及びデキストラン硫酸を含有する溶液をｐＨ９以上の
アルカリ性条件下で保温することを特徴とする、（１）
乃至（４）のいずれか一つに記載の修飾生理活性タンパ
ク質の製造方法、（６）（５）記載の製造方法により製
造された修飾生理活性タンパク質、及び、（７）（１）
乃至（４）及び（６）のいずれか一つに記載の修飾生理
活性タンパク質を含有する医薬組成物、に関する。The present invention is characterized in that (1) dextran sulfate is bound and the residence time in blood is longer than that of a physiologically active protein to which dextran sulfate is not bound. A modified bioactive protein,
(2) The modified bioactive protein according to (1), wherein the dextran sulfate is dextran sulfate sodium sulfur 5, (3) the bioactive protein not bound to dextran sulfate is a cytokine, (1) or (2). (4) cytokine is erythropoietin, tumor cytotoxic factor, adipogenesis inhibitory factor, or osteoblast growth factor 2 (1) wherein a solution containing the modified bioactive protein according to (3), (5) a solution containing the bioactive protein and dextran sulfate is kept under alkaline conditions of pH 9 or more, (1).
To (4), (6) the modified bioactive protein produced by the production method according to (5), and (7) (1).
To a pharmaceutical composition containing the modified bioactive protein according to any one of (4) and (6).
【０００７】本発明は、生理活性タンパク質をデキスト
ラン硫酸で修飾することにより得られる、血中滞留性が
改善された修飾生理活性タンパク質、その製造方法（調
製方法）等を提供する。本発明において、血中滞留性の
改善又は向上とは、血中滞留時間が長くなること（延長
されること）を意味する。本発明においては、生理活性
タンパク質のうち、特に動物細胞が生産し、細胞間の情
報伝達を担う生理活性タンパク質をサイトカインと総称
する。本発明者らは、すでに生理活性タンパク質、特に
サイトカインの一種である破骨細胞形成抑制因子（ＯＣ
ＩＦ）を注射剤として製剤化する際にヘパリンやペクチ
ン、デキストラン硫酸等の多糖類を用いて中性条件で製
剤化すると血中内持続時間が顕著に延長されることを見
出し、すでに特許出願を行った（ＷＯ００／２４４１６
号公報）。さらに本発明者らが研究を進めたところ、生
体内の半減期を延長するためデキストラン硫酸を用いた
場合には、生理活性タンパク質がデキストラン硫酸と特
定の条件で反応して修飾され、デキストラン硫酸修飾生
理活性タンパク質が得られることが確認できた。そして
このデキストラン硫酸により修飾された生理活性タンパ
ク質は血中滞留性が顕著に向上することが明らかとなっ
た。このような生理活性タンパク質をデキストラン硫酸
で修飾するためには、生理活性タンパク質とデキストラ
ン硫酸を含有する溶液をアルカリ性条件下で１〜２昼夜
静置する。このような特定ｐＨ条件下でデキストラン硫
酸による生理活性タンパク質の修飾反応が進行し、デキ
ストラン硫酸修飾生理活性タンパク質を得ることができ
る。本発明においては、そのようにして得られたタンパ
ク質を、修飾生理活性タンパク質という。[0007] The present invention provides a modified bioactive protein having improved retention in blood, which is obtained by modifying a bioactive protein with dextran sulfate, and a method for producing (preparing) the same. In the present invention, “improvement or improvement of blood retention” means that the blood retention time is prolonged (extended). In the present invention, among bioactive proteins, bioactive proteins produced by animal cells and responsible for intercellular communication are collectively referred to as cytokines. The present inventors have already proposed a bioactive protein, particularly an osteoclast formation inhibitory factor (OC), which is a kind of cytokine.
It has been found that if a compound is formulated under neutral conditions using polysaccharides such as heparin, pectin, dextran sulfate, etc. when preparing IF) as an injection, the duration in the blood will be significantly prolonged. (WO00 / 24416
No.). The present inventors further studied and found that when dextran sulfate was used to extend the half-life in vivo, the biologically active protein was modified by reacting with dextran sulfate under specific conditions, resulting in dextran sulfate modification. It was confirmed that a physiologically active protein was obtained. It has been clarified that the physiologically active protein modified with this dextran sulfate significantly improves the blood retention. In order to modify such a bioactive protein with dextran sulfate, a solution containing the bioactive protein and dextran sulfate is allowed to stand for one to two days under alkaline conditions. Under such specific pH conditions, the modification reaction of the bioactive protein with dextran sulfate proceeds, and a dextran sulfate-modified bioactive protein can be obtained. In the present invention, the protein thus obtained is referred to as a modified bioactive protein.
【０００８】デキストラン硫酸がどのような反応機構を
介しているか不明であるが、デキストラン硫酸と生理活
性タンパク質は、実施例に示すようにゲルろ過、透析、
電気泳動処理を行っても解離しない強い力で結合してい
る。デキストラン硫酸が結合した修飾生理活性タンパク
質は、上記に述べたように生理活性タンパク質とデキス
トラン硫酸を溶解させた溶液をアルカリ条件下で、好ま
しくはｐＨ８以上のアルカリ性条件、特に好ましくはｐ
Ｈ１０〜１１で、室温または冷蔵庫中で１〜３昼夜静置
もしくはゆるやかに振盪することにより製造（調製）す
ることができる。生理活性タンパク質とデキストラン硫
酸を溶解するための溶媒としては、生理活性タンパク質
を失活させないために、生理活性タンパク質を安定に保
持することのできる緩衝液、例えばリン酸塩緩衝生理食
塩水（ＰＢＳ）などを用いることが好ましく、これは通
常目的とする生理活性タンパク質にあわせて適宜選択さ
れる。[0008] It is unclear what reaction mechanism dextran sulfate takes, but dextran sulfate and a bioactive protein were analyzed by gel filtration, dialysis,
They bind with a strong force that does not dissociate even after electrophoresis. As described above, the modified bioactive protein to which dextran sulfate is bound can be prepared by dissolving a solution of the bioactive protein and dextran sulfate under alkaline conditions, preferably at pH 8 or higher, particularly preferably p
It can be produced (prepared) by standing at room temperature or in a refrigerator at room temperature or in a refrigerator for 1 to 3 days and night or gently shaking. As a solvent for dissolving the bioactive protein and dextran sulfate, a buffer capable of stably retaining the bioactive protein in order not to inactivate the bioactive protein, for example, phosphate buffered saline (PBS) And the like are preferably used, and are usually appropriately selected in accordance with the intended bioactive protein.
【０００９】生理活性タンパク質を修飾するデキストラ
ン硫酸は、生理活性タンパク質の性質によって結合する
量が変化する。一般的には、塩基性を示すタンパク質に
は比較的多く結合する。またデキストラン硫酸の構造と
分子量、イオウ含量によっても結合する量が変化する。
修飾に当たっては、生理活性タンパク質１重量に対して
デキストラン硫酸を１〜２００倍量、好ましくは５〜５
０倍量を用いて修飾反応を行うと好ましい結果を与え
る。本件実施例に開示したデキストラン硫酸ナトリウム
イオウ５を用いて、生理活性タンパク質を修飾する場合
には、生理活性タンパク質のモル数を特に考慮する必要
はなく、所望する生理活性タンパク質の重量の約１００
倍重量を用いて修飾操作を行うと、所望する生理活性タ
ンパク質の血中滞留性が向上した修飾物を効率良く取得
することができる。The amount of dextran sulfate that modifies a bioactive protein varies depending on the nature of the bioactive protein. Generally, it binds relatively more to a protein showing basicity. The amount of dextran sulfate changes depending on the structure, molecular weight and sulfur content.
In the modification, dextran sulfate is used in an amount of 1 to 200 times, preferably 5 to 5 times based on 1 weight of the bioactive protein.
Performing the modification reaction using 0-fold amount gives preferable results. When modifying the bioactive protein using the dextran sulfate sodium sulfur 5 disclosed in the present example, the number of moles of the bioactive protein does not need to be particularly considered, and the weight of the desired bioactive protein is about 100%.
When the modification operation is performed using twice the weight, a modified product in which the desired physiologically active protein has improved retention in blood can be efficiently obtained.
【００１０】本発明を実施するにあたって、デキストラ
ン硫酸で修飾するタンパク質は、生理活性タンパク質で
あればどのようなタンパク質でも本発明に開示した方法
で修飾可能である。そしてデキストラン硫酸修飾により
血中滞留性が向上し、半減期が延長される。また生理活
性タンパク質の当量あたりの生理活性（比活性）は修飾
により低下しない。デキストラン硫酸は、デキストラン
の硫酸エステルの総称であり、本発明の実施にあたって
は、どのような分子量や分岐鎖を持ったものでも使用可
能である。またナトリウム塩などの塩の形態をとったも
のであっても良い。デキストラン硫酸は、α１−６グル
カンの水酸基に硫酸がエステル結合したもので、水溶液
中では、スルホン基（ＳＯ3―）がマイナスにチャージ
している。またα１−３結合やα１−２結合を分岐鎖に
含むものも存在するが、このような分岐鎖を有するもの
も本発明は包含する。In practicing the present invention, any protein that is modified with dextran sulfate can be modified by the method disclosed in the present invention, as long as it is a physiologically active protein. The dextran sulfate modification improves the retention in blood and prolongs the half-life. The physiological activity (specific activity) per equivalent of the bioactive protein is not reduced by the modification. Dextran sulfate is a generic term for sulfate esters of dextran, and in the practice of the present invention, those having any molecular weight or branched chain can be used. It may be in the form of a salt such as a sodium salt. Dextran sulfate is sulfuric acid ester-bonded to a hydroxyl group of α1-6 glucan, and a sulfone group (SO 3 −) is negatively charged in an aqueous solution. In addition, there are also those containing an α1-3 bond or an α1-2 bond in the branched chain, and those having such a branched chain are also included in the present invention.
【００１１】しかし通常デキストラン硫酸として市販さ
れている分子量約６５００、イオウ含量１６〜１８％の
ものには、ヘパリン様の活性や血清コレステロールの低
下作用などの生理作用が知られている。このようなデキ
ストラン硫酸自身の生理活性が、目的とする生理活性タ
ンパク質の治療効果に影響することを避けるために、で
きるだけ硫酸基の少ないものを選択することが好まし
い。このようなデキストラン硫酸としては、硫酸とのエ
ステル化反応を制御することで所望のイオウ含量を有す
るデキストラン硫酸を調製することができる。デキスト
ラン硫酸のイオウ含量は１０％以下にすることが好まし
いが、特にイオウ含量が６％以下のデキストラン硫酸を
用いることが好ましい。このようなイオウ含量が６％以
下であるデキストラン硫酸としては、デキストラン硫酸
ナトリウムイオウ５として日本薬局方１２版（１９９６
年）に収載されているものを例示することができる。本
特許出願においてはデキストラン硫酸ナトリウムイオウ
５をデキストラン硫酸Ｓ５と表記する。このデキストラ
ン硫酸Ｓ５は、医薬品または医薬品原料として販売され
ており容易に入手可能である。However, dextran sulfate having a molecular weight of about 6,500 and a sulfur content of 16 to 18%, which is commercially available, is known to have physiological effects such as heparin-like activity and serum cholesterol lowering effect. In order to prevent such a biological activity of dextran sulfate itself from affecting the therapeutic effect of the target biologically active protein, it is preferable to select one having as few sulfate groups as possible. As such dextran sulfate, dextran sulfate having a desired sulfur content can be prepared by controlling the esterification reaction with sulfuric acid. The sulfur content of dextran sulfate is preferably 10% or less, and it is particularly preferable to use dextran sulfate having a sulfur content of 6% or less. As such dextran sulfate having a sulfur content of 6% or less, dextran sulfate sodium sulfur 5 as Japanese Pharmacopoeia 12th Edition (1996)
Year)). In this patent application, dextran sulfate sodium sulfur 5 is referred to as dextran sulfate S5. This dextran sulfate S5 is sold as a drug or a drug raw material, and is easily available.
【００１２】デキストラン硫酸Ｓ５は以下に示す性質を
有している。 分子量 約１２００ イオウ含量 ３〜６％（乾燥物重量当たり） 極限粘度 日本薬局方に記載の方法で測定した時、０．
０３０〜０．０４０を示す。Dextran sulfate S5 has the following properties. Molecular weight Approx. 1200 Sulfur content 3-6% (per weight of dry matter) Intrinsic viscosity It is 0.1 when measured by the method described in the Japanese Pharmacopoeia.
030 to 0.040.
【００１３】上記に従って得られた反応液から透析、塩
析、限外ろ過、ゲルろ過、電気泳動、イオン交換クロマ
トグラフィーなど通常のタンパク質の精製方法で、目的
とする修飾生理活性タンパク質を製造（調製）すること
ができる。特に未反応のデキストラン硫酸やその他修飾
反応に使用した物質を除去するためには、ゲルろ過によ
って精製すると効率良く製造（調製）することができ
る。かくして得られるデキストラン硫酸修飾生理活性タ
ンパク質は、本来の未修飾生理活性タンパク質が有する
生理活性に加えて、生体内での血中滞留時間の延長とい
う特性が付与される。さらに、デキストラン硫酸修飾に
より、ゲルろ過による分子量が高分子側にシフトす
る、酸性糖タンパク質としての物理化学的特性を示す
（等電点の酸性側へのシフト、陰イオン交換樹脂への吸
着等）などの変化が観察され、修飾前の生理活性タンパ
ク質と明確に区別することができる。本発明は、以上の
ような修飾生理活性タンパク質の製造方法（調製方法）
をも提供する。The desired modified bioactive protein is produced (prepared) from the reaction solution obtained as described above by a conventional protein purification method such as dialysis, salting out, ultrafiltration, gel filtration, electrophoresis, ion exchange chromatography and the like. )can do. In particular, in order to remove unreacted dextran sulfate and other substances used in the modification reaction, purification (gel filtration) enables efficient production (preparation). The dextran sulfate-modified bioactive protein thus obtained has the property of prolonging the residence time in blood in a living body, in addition to the bioactivity of the original unmodified bioactive protein. Furthermore, due to dextran sulfate modification, the molecular weight by gel filtration shifts to the high molecular side, and exhibits physicochemical properties as an acidic glycoprotein (shift of isoelectric point to the acidic side, adsorption to anion exchange resin, etc.) Such changes are observed, and can be clearly distinguished from the bioactive protein before modification. The present invention provides a method for producing the above modified bioactive protein (preparation method).
Also provide.
【００１４】本発明の製造方法によれば、上記したよう
にどのような種類のタンパク質でも容易にデキストラン
硫酸修飾することができる。実施例には、ヒト腫瘍細胞
障害因子（tumor cytotoxic factor、以下「ＴＣＦ」と
いう。）、エリスロポエチン（erythropoietin、以下
「ＥＰＯ」という。）、ヒト骨芽細胞増殖因子（osteob
last growth factor 2、以下「ｂＯＧＦ−II」とい
う。）、脂肪細胞分化抑制因子（adipogenesis inhibit
ory factor、以下「ＡＤＩＦ」という。）の例を挙げた
が、これらのタンパク質はいずれも生体内半減期が短
く、血中から速やかに消失するタンパク質であるが、本
発明の実施により、血中半減期が延長される効果を確認
できた。本発明はこれ以外の生理活性タンパク質とし
て、血中保持時間が短い物質に適用することができる。
一例として、プロテアーゼ、エステラーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、スーパーオキサイドデスムターゼなどの酵素
類、インシュリン、グルカゴン、ヒト成長ホルモン（ｈ
ＧＨ）等のホルモン類、インターフェロン、インターロ
イキン、ＴＮＦ、ＣＳＦ、トロンボポエチン（ＴＰ
Ｏ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）などのサイトカ
イン類を例示することができる。本発明は、例示したこ
れらの生理活性タンパク質に限定されるものではない。According to the production method of the present invention, any kind of protein can be easily modified with dextran sulfate as described above. Examples include human tumor cytotoxic factor (hereinafter referred to as “TCF”), erythropoietin (hereinafter referred to as “EPO”), and human osteoblast growth factor (osteob).
last growth factor 2, hereinafter referred to as "bOGF-II". ), Adipogenesis inhibit
ory factor, hereinafter referred to as “ADIF”. ), All of these proteins have short in vivo half-lives and are rapidly eliminated from the blood. However, the effect of extending the blood half-life by the practice of the present invention has been confirmed. did it. The present invention can be applied to substances having a short retention time in blood as other physiologically active proteins.
Examples include enzymes such as proteases, esterases, peroxidases, superoxide desmutases, insulin, glucagon, human growth hormone (h
Hormones such as GH), interferon, interleukin, TNF, CSF, thrombopoietin (TP
O), osteoprotegerin (OPG) and other cytokines. The present invention is not limited to these exemplified bioactive proteins.
【００１５】本発明の製造方法により得られる修飾生理
活性タンパク質は、従来の生理活性タンパク質と比較し
て血中滞留性が改善されているため、少量の投与で目的
とする治療効果を得ることができるとともに、投与量を
減少させることができるため、サイトカイン類の大量投
与に伴う副作用の発生、例えばインターフェロンによる
発熱、ＴＮＦによるるい痩等の副作用発生を予防でき
る。[0015] The modified bioactive protein obtained by the production method of the present invention has improved blood retention in comparison with conventional bioactive proteins, so that a desired therapeutic effect can be obtained with a small amount of administration. In addition, since the dose can be reduced, it is possible to prevent the occurrence of side effects associated with the large dose administration of cytokines, for example, the occurrence of side effects such as fever due to interferon and slimming due to TNF.
【００１６】本発明の修飾生理活性タンパク質は、医薬
上許容可能な希釈剤、等張化剤、ｐＨ調整剤など製剤化
に必要な成分と調合して通常のタンパク質製剤と同様に
してヒトに投与するための医薬組成物とすることができ
る。本発明はそのような医薬組成物をも提供する。本発
明の修飾生理活性タンパク質を、治療を目的としてヒト
に投与する場合の製剤の形態や投与量は対象疾患や患者
の年齢などによって異なるが、通常は血中への速やかな
移行が期待できる注射剤とすることが好ましい。投与量
は修飾前のタンパク質が治療効果を発揮する量の１／１
０〜１／１０００に低減することが可能である。The modified physiologically active protein of the present invention is administered to humans in the same manner as ordinary protein preparations by mixing with components necessary for preparation such as pharmaceutically acceptable diluents, isotonic agents, pH adjusters and the like. And a pharmaceutical composition for The present invention also provides such a pharmaceutical composition. When the modified bioactive protein of the present invention is administered to humans for the purpose of treatment, the form and dosage of the preparation vary depending on the target disease, the age of the patient, and the like, but are usually injections that can be expected to rapidly transfer to the blood. It is preferable to use an agent. The dose is 1/1 of the amount that the protein before modification exerts a therapeutic effect.
It can be reduced to 0 to 1/1000.
【００１７】[0017]
【実施例】以下実施例を示し、本発明を説明するが、こ
れらによって本発明が何ら限定されるものではない。The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited by these examples.
【００１８】[0018]
【実施例１】 デキストラン硫酸修飾エリスロポエチン
（１） エリスロポエチン（ＥＰＯ）は赤血球の増加ホルモンと
して知られており、腎臓で生産され、骨髄中の血液幹細
胞表面のレセプターに結合し、赤血球への分化を促進さ
せ、腎透析患者の貧血治療や癌による貧血治療に使用さ
れる。本実施例発明で使用するＥＰＯは、特開昭６２−
２６９６９７号に開示された遺伝子組換え技術によって
生産し、精製したものを用いた。エチレンジアミン４酢
酸４ナトリウム塩（ＥＤＴＡ４Ｎａ、シグマ社製）２ｇ
及びデキストラン硫酸Ｓ５（名糖産業社製）１ｇ、遺伝
子組換え型ＥＰＯ１０ｍｇを生理食塩水に溶解し、溶解
後ｐＨを９．０に調整した。４℃の冷蔵庫中に一昼夜静
置し、翌日、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（ミリポア社
製）を用いて約１ｍｌに遠心濃縮し、さらに４℃で一昼
夜放置して、ＥＰＯをデキストラン硫酸により修飾し
た。次いで、下記の条件でゲルろ過を行い未反応の過剰
なデキストラン硫酸を除去した。Example 1 Dextran sulfate-modified erythropoietin (1) Erythropoietin (EPO) is known as an erythrocyte increasing hormone, is produced in the kidney, binds to a receptor on the surface of blood stem cells in the bone marrow, and promotes differentiation into erythrocytes. It is used to treat anemia in renal dialysis patients and anemia due to cancer. EPO used in the present invention is disclosed in
Produced and purified by the genetic recombination technique disclosed in No. 269697. Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt (EDTA4Na, manufactured by Sigma) 2 g
1 g of dextran sulfate S5 (manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd.) and 10 mg of recombinant EPO were dissolved in physiological saline, and after dissolution, the pH was adjusted to 9.0. The mixture was allowed to stand in a refrigerator at 4 ° C. for 24 hours, and the following day, it was centrifuged and concentrated to about 1 ml using Centricon-10 (manufactured by Millipore), and further left at 4 ° C. for 1 day to modify EPO with dextran sulfate. Next, gel filtration was performed under the following conditions to remove unreacted excess dextran sulfate.
【００１９】ゲルろ過条件 カラム；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０（アマ
シャム−ファルマシア−バイオテック社製、１ｘ３０ｃ
ｍ、２４ｍｌ） 移動相；０．１５ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸塩緩
衝液（ｐＨ７．０） 流速；０．５ｍｌ／ｍｉｎ 分画サイズ；０．５ｍｌ／ｆｒａｃｔｉｏｎ ゲルろ過終了後、各分画のＥＰＯ活性を特開平１−２５
０６１号公報に開示されたエンザイムイムノアッセイ法
（ＥＬＩＳＡ）によって測定し、高分子側のＥＰＯのピ
ークを集め、約５ｍｌの修飾ＥＰＯを得た。ＥＰＯはゲ
ルろ過分子量、７０〜９０ｋＤａに相当する位置に溶出
された。この結果からＥＰＯ１分子当たりデキストラン
硫酸Ｓ５が５〜２０分子結合していると推測された。Gel filtration conditions Column: Superdex200 HR10 / 30 (Amersham-Pharmacia-Biotech, 1 × 30c)
Mobile phase: 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.15 M NaCl Flow rate: 0.5 ml / min Fraction size: 0.5 ml / fraction After completion of gel filtration, EPO activity of each fraction Is described in JP-A-1-25
Measurement was performed by the enzyme immunoassay method (ELISA) disclosed in JP-A-6161, and the peak of EPO on the high molecular side was collected to obtain about 5 ml of modified EPO. EPO was eluted at a position corresponding to a gel filtration molecular weight of 70 to 90 kDa. From this result, it was inferred that 5 to 20 molecules of dextran sulfate S5 were bound per EPO molecule.
【００２０】次いでこのデキストラン硫酸修飾ＥＰＯ画
分のタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミンを標準とし
て、ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（バイオラッド
社製）キットで測定した。デキストラン硫酸修飾画分の
タンパク質濃度は、３．３０ｍｇ／ｍｌであった。なお
ゲルろ過パターンを図１に示した。Next, the protein concentration of the dextran sulfate-modified EPO fraction was measured with a DC Protein Assay (manufactured by Bio-Rad) using bovine serum albumin as a standard. The protein concentration of the dextran sulfate-modified fraction was 3.30 mg / ml. The gel filtration pattern is shown in FIG.
【００２１】[0021]
【実施例２】デキストラン硫酸Ｓ５修飾ＥＰＯ（２） デキストラン硫酸Ｓ５（名糖産業社製）１ｇ、遺伝子組
換え型ＥＰＯ１０ｍｇを生理食塩水に溶解し、溶解後１
Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１．２ｍｌを添加しｐＨ１０
に調整した。その後４℃の冷蔵庫中に一昼夜静置し、翌
日、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（ミリポア社製）を用い
て約１ｍｌに遠心濃縮し、さらに４℃で一昼夜放置し
て、ＥＰＯをデキストラン硫酸により修飾した。次い
で、実施例１と同様の条件でゲルろ過を行い未反応の過
剰なデキストラン硫酸を除去した。ゲルろ過終了後、各
分画のＥＰＯ活性をエンザイムイムノアッセイ法（ＥＬ
ＩＳＡ）によって測定し、高分子ＥＰＯのピークを集め
た。ＥＰＯはゲルろ過分子量、７０〜９０ｋＤａに相当
する位置に溶出された。この結果からＥＰＯ１分子当た
りデキストラン硫酸Ｓ５が５〜２０分子結合していると
推測された。Example 2 Dextran sulfate S5 modified EPO (2) 1 g of dextran sulfate S5 (manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd.) and 10 mg of recombinant EPO were dissolved in physiological saline and dissolved.
N 2 aqueous sodium hydroxide solution (1.2 ml) was added,
Was adjusted. Thereafter, the mixture was allowed to stand in a refrigerator at 4 ° C. for 24 hours, and the following day, it was centrifuged and concentrated to about 1 ml using Centricon-10 (manufactured by Millipore), and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours to modify EPO with dextran sulfate. Next, gel filtration was performed under the same conditions as in Example 1 to remove unreacted excess dextran sulfate. After the gel filtration, the EPO activity of each fraction was determined by enzyme immunoassay (EL).
ISA), and the peak of the high molecular weight EPO was collected. EPO was eluted at a position corresponding to a gel filtration molecular weight of 70 to 90 kDa. From this result, it was inferred that 5 to 20 molecules of dextran sulfate S5 were bound per EPO molecule.
【００２２】次いでこのデキストラン硫酸修飾ＥＰＯ画
分のタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミンを標準とし
て、ローリー法で測定した。デキストラン硫酸修飾画分
のタンパク質濃度は、５．３６ｍｇ／ｍｌであった。Next, the protein concentration of the dextran sulfate-modified EPO fraction was measured by the Lowry method using bovine serum albumin as a standard. The protein concentration of the dextran sulfate-modified fraction was 5.36 mg / ml.
【００２３】[0023]
【実施例３】実施例１および２で得られたデキストラン
硫酸修飾ＥＰＯの特性を分析した （１）ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動 デキストラン硫酸修飾によりＥＰＯの等電点が変化して
いることを確認した。 （器具及び装置） １）電極ろ紙：アマシャム−ファルマシア−バイオテッ
ク社製 ２）サンプルアプリケーションろ紙：アマシャム−ファ
ルマシア−バイオテック社製 ３）ゲルボンドＰＡＧフィルム：アマシャム−ファルマ
シア−バイオテック社製 ４）等電点電気泳動装置：アマシャム−ファルマシア−
バイオテック社製 ＵＬＴＲＯＦＯＲ泳動装置２２１７Electrofocusing Un
it 安定電源装置２２９７Macrodrive 5 Power Supply ゲル冷却装置２２０９Multi Temp ゲルキャスティングキット（０．５ｍｍ厚用）Example 3 Characteristics of the dextran sulfate-modified EPO obtained in Examples 1 and 2 were analyzed. (1) Polyacrylamide gel isoelectric focusing It was confirmed that the isoelectric point of EPO was changed by the dextran sulfate modification. confirmed. (Equipment and device) 1) Electrode filter paper: Amersham-Pharmacia-Biotech 2) Sample application filter paper: Amersham-Pharmacia-Biotech 3) Gel bond PAG film: Amersham-Pharmacia-Biotech 4) Isoelectric Point electrophoresis device: Amersham-Pharmacia-
Biotech ULTROFOR electrophoresis device 2217 Electrofocusing Un
it Stable power supply 2297 Macrodrive 5 Power Supply Gel cooler 2209 Multi Temp Gel casting kit (for 0.5mm thickness)
【００２４】（試薬及び標準品） １）アクリルアミド：ファルマシア製（電気泳動用） ２）Ｎ，Ｎ'−メチレンビスアクリルアミド（ビス）：
アマシャム−ファルマシア−バイオテック社製（電気泳
動用） ３）アンフォライン（ｐＨ２．５〜５．０）：アマシャ
ム−ファルマシア−バイオテック社製 ４）過硫酸アンモニウム：アマシャム−ファルマシア−
バイオテック社製（電気泳動用） ５）クマシーブリリアントブルーＲ−２５０：バイオラ
ッド社製 ６）酢酸：試薬特級（和光純薬社製） ７）メタノール：試薬特級（和光純薬社製） ８）５−スルホサリチル酸二水和物：試薬特級（和光純
薬社製） ９）トリクロロ酢酸：試薬特級（和光純薬社製） １０）Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミ
ン（ＴＥＭＥＤ）：アマシャム−ファルマシア−バイオ
テック社製（電気泳動用） １１）リン酸（１４．６Ｍ）：試薬特級（和光純薬社
製） １２）１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム：和光純薬社製
（容量分析用） １３）ケロシン：和光純薬社製 １４）水：ミリポア社製限外ろ過Ｂｉｏ−Ｍａｘで製造
したもの １５）等電点マーカー：アマシャム−ファルマシア−バ
イオテック社製ＬｏｗｐＩキャリブレーション・キット
（２．５〜６．５） (Reagents and Standards) 1) Acrylamide: manufactured by Pharmacia (for electrophoresis) 2) N, N'-methylenebisacrylamide (bis):
Amersham-Pharmacia-Biotech (for electrophoresis) 3) Amphorine (pH 2.5-5.0): Amersham-Pharmacia-Biotech 4) Ammonium persulfate: Amersham-Pharmacia
Biotech (for electrophoresis) 5) Coomassie Brilliant Blue R-250: Biorad 6) Acetic acid: Special grade reagent (Wako Pure Chemical Industries) 7) Methanol: Special reagent grade (Wako Pure Chemical Industries) 8) 5-Sulfosalicylic acid dihydrate: Reagent grade (Wako Pure Chemical Industries) 9) Trichloroacetic acid: Reagent grade (Wako Pure Chemical Industries) 10) N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) : Amersham-Pharmacia-Biotech (for electrophoresis) 11) Phosphoric acid (14.6 M): Special grade reagent (Wako Pure Chemical Industries) 12) 1 mol / L sodium hydroxide: Wako Pure Chemical Industries (Volume analysis) 13) Kerosene: manufactured by Wako Pure Chemical Co., Ltd. 14) Water: manufactured by Millipore Ultrafiltration Bio-Max 15) Isoelectric point marker: Lowp manufactured by Amersham-Pharmacia-Biotech I Calibration Kit (2.5-6.5)
【００２５】（試液の調製） １）２９．１ｇ／ｄＬアクリルアミド溶液 アクリルアミド１４．５５ｇを水に溶解し、全量５０ｍ
Ｌとした。 ２）０．９ｇ／ｄＬＮ，Ｎ'−メチレンビスアクリルア
ミド溶液 ３）１ｇ／ｄＬ過硫酸アンモニウム溶液 過硫酸アンモニウム１０ｍｇを水に溶解し、全量１ｍＬ
とした。 ４）陰極液（０．２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム） １ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム１ｍＬに水を加え、５ｍ
Ｌとした。 ５）陽極液（０．５Ｍリン酸） １４．６Ｍリン酸１００μｌに水を加え、２．９２ｍｌ
とした。 ６）固定液 トリクロロ酢酸１００ｇおよび５−スルホサリチル酸二
水和物５０ｇを水に溶解し、全量１Ｌとした。 ７）染色液 メタノール３００ｍＬおよび酢酸２００ｍＬに水を加え
て１Ｌとした。これにクマシーブリリアントブルー１．
０ｇを溶解しながら加え、ろ過した。 ８）脱色液 メタノール３００ｍＬおよび酢酸１００ｍＬに水を加え
て１Ｌとした。(Preparation of test solution) 1) 29.1 g / dL acrylamide solution 14.55 g of acrylamide was dissolved in water, and the total amount was 50 m.
L. 2) 0.9 g / dLN, N'-methylenebisacrylamide solution 3) 1 g / dL ammonium persulfate solution 10 mg of ammonium persulfate is dissolved in water, and the total volume is 1 mL.
And 4) Catholyte (0.2 mol / L sodium hydroxide) Water was added to 1 mL / L sodium hydroxide (1 mL), and 5 m
L. 5) Anolyte (0.5 M phosphoric acid) Water is added to 14.6 M phosphoric acid (100 μl) and 2.92 ml
And 6) Fixing solution 100 g of trichloroacetic acid and 50 g of 5-sulfosalicylic acid dihydrate were dissolved in water to make a total volume of 1 L. 7) Staining solution Water was added to 300 mL of methanol and 200 mL of acetic acid to make 1 L. Coomassie brilliant blue
While dissolving 0 g, the mixture was filtered. 8) Decolorizing solution Water was added to 300 mL of methanol and 100 mL of acetic acid to make 1 L.
【００２６】（等電点マーカー溶液の調製）ｐＩキャリ
ブレーョン・キット１バイアルに水５０μＬを加えた。(Preparation of Isoelectric Point Marker Solution) 50 μL of water was added to one vial of the pI calibration kit.
【００２７】（試料溶液の調製）上記実施例１及び実施
例２で得たデキストラン硫酸修飾ＥＰＯ溶液を限外ろ過
膜で濃縮した後、水を加え、たん白濃度が約５ｍｇ／ｍ
Ｌとなるように調製した。(Preparation of sample solution) After the dextran sulfate-modified EPO solution obtained in the above Examples 1 and 2 was concentrated by an ultrafiltration membrane, water was added, and the protein concentration was about 5 mg / m2.
L was prepared.
【００２８】（操作方法） １）ゲルの作製 水１１．０ｍＬ、２９．１ｇ／ｄＬアクリルアミド溶液
３．５ｍＬ、０．９ｇ／ｄＬＮ，Ｎ'−メチレンビスア
クリルアミド溶液３．５ｍＬ及びアンフォライン１．５
ｍＬを混合した後、吸引脱気した。脱気後、１ｇ／ｄＬ
過硫酸アンモニウム溶液１．０ｍＬ及びＴＥＭＥＤ５０
μＬを加え混合し、速やかにゲルキャスティングキット
を用いた泳動プレート（ゲルボンドＰＡＧフィルム）に
流し込み一晩静置した。 ２）泳動 作製したゲル（プレート）をゲルキャスティングキッ
トから外し電気泳動装置にセットした（泳動装置とゲル
の間にケロシンを少量滴下した後塗布し、気泡が入らな
いようにセットする）。電極ろ紙に電極液を浸し、泳動
条件を下記に設定した。 泳動温度１０℃ 電流（ｍＡ）２５ｍＡ 電圧（Ｖ）１５００Ｖ 電力（Ｗ）１５Ｗ ２０分間予備泳動後電源を切り、サンプルアプリケー
ションろ紙を陽極側に置き、１レーンあたり、等電点マ
ーカー溶液を１５μＬ、試料溶液を１０μＬ（５０μ
ｇ）負荷し、６０分間泳動した。電源を切り、サンプル
アプリケーションろ紙を取り除き、更に３０分間泳動し
た。 ３）染色 泳動終了後、ゲルを脱色液で十分に洗い、固定液に約６
０分間、脱色液に約３０分間、染色液に約６０分間浸し
た後、脱色液に一晩浸した。十分に脱色したことを確認
した後、水に３０分間浸し、自然乾燥した。乾燥したゲ
ルはレーン番号等を表示した台紙にのせ、ラミネートし
た。 ４）等電点の測定 等電点マーカー及び未修飾ＥＰＯの泳動パターンと試料
の泳動パターンを比較し、試料の等電点範囲及び未修飾
ＥＰＯとの差異を比較した。結果を図２に示した。デキ
ストラン硫酸修飾ＥＰＯの等電点は、約2〜３であり、
未修飾ＥＰＯの等電点が３．５〜５．２を示すのに比し
て、著明に酸性側にシフトしていることが確認された。(Operation method) 1) Preparation of gel 11.0 mL of water, 3.5 mL of 29.1 g / dL acrylamide solution, 3.5 mL of 0.9 g / dLN, N'-methylenebisacrylamide solution, and 1.5 ml of ampholine
After mixing mL, it was degassed by suction. After degassing, 1g / dL
1.0 mL of ammonium persulfate solution and TEMED50
μL was added, mixed, and immediately poured into an electrophoresis plate (gel-bonded PAG film) using a gel casting kit, and allowed to stand overnight. 2) Electrophoresis The prepared gel (plate) was removed from the gel casting kit and set in an electrophoresis apparatus. (A small amount of kerosene was dropped between the electrophoresis apparatus and the gel, then applied, and set so that air bubbles did not enter.) The electrode solution was immersed in the electrode filter paper, and the electrophoresis conditions were set as follows. Electrophoresis temperature 10 ° C Current (mA) 25mA Voltage (V) 1500V Power (W) 15W After pre-migration for 20 minutes, turn off the power, place the sample application filter paper on the anode side, and put 15μL of isoelectric marker solution per lane, sample 10 μL of the solution (50 μL
g) Loaded and run for 60 minutes. The power was turned off, the sample application filter paper was removed, and the sample was run for another 30 minutes. 3) Staining After completion of electrophoresis, wash the gel thoroughly with a destaining solution and add about 6
After immersion in the destaining solution for about 30 minutes and in the staining solution for about 60 minutes for 0 minutes, it was immersed in the destaining solution overnight. After confirming that the color was sufficiently bleached, the film was immersed in water for 30 minutes and air-dried. The dried gel was placed on a backing paper on which lane numbers and the like were displayed, and laminated. 4) Measurement of isoelectric point The electrophoretic pattern of the isoelectric marker and the electrophoretic pattern of unmodified EPO were compared with the electrophoretic pattern of the sample, and the isoelectric point range of the sample and the difference from the unmodified EPO were compared. The results are shown in FIG. The isoelectric point of dextran sulfate modified EPO is about 2-3,
Compared to the unmodified EPO having an isoelectric point of 3.5 to 5.2, it was confirmed that the isoelectric point was significantly shifted to the acidic side.
【００２９】（２）陰イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱカ
ラム）クロマトによる分析 デキストラン硫酸修飾により、陰イオン交換体への親和
性が高まることを確認した。実施例１、２で調製したデ
キストラン硫酸修飾ＥＰＯ、及び未修飾ＥＰＯを５０ｍ
ＭＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で１０倍希釈した
後、１．５ｍｇのＥＰＯに相当するサンプルを、予め５
０ｍＭＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化して
おいたＭｏｎｏＱカラム（ファルマシア製）に注入し、
５０ｍＭＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）でカラムを
洗浄した後、以下の条件で吸着したＥＰＯを溶出してそ
の溶出パターンを比較した。 ＭｏｎｏＱカラムクロマト分析条件 カラム；ＭｏｎｏＱＨＲ５／１０（アマシャム−ファル
マシア−バイオテック社製、０．５ｘ５ｃｍ、１．０ｍ
ｌ） 移動相Ａ；５０ｍＭＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．２） 移動相Ｂ；１．０ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭＴｒｉｓ塩
酸緩衝液(ｐＨ７．２) グラジエント；０−３０％Ｂの直線的グラジエント、３
０ｍｌ 流速；０．５ｍｌ／ｍｉｎ チャートスピード；２ｍｍ／ｍｉｎ 検出法；Ａ２８０ｎｍ、Ｒａｎｇｅ０．５ デキストラン硫酸修飾エリスロポエチンは未修飾ＥＰＯ
がカラムに十分には吸着されないのに対して、より完全
にカラムに吸着されることが確認された。ＭｏｎｏＱカ
ラムは陰イオン交換カラムであり、上記の結果から、デ
キストラン硫酸修飾ＥＰＯの陰電荷が増していることが
確認された。(2) Analysis by Anion Exchange Column (MonoQ Column) Chromatography It was confirmed that the affinity for an anion exchanger was increased by dextran sulfate modification. The dextran sulfate-modified EPO prepared in Examples 1 and 2 and the unmodified EPO
After a 10-fold dilution with MTris HCl buffer (pH 7.2), a sample equivalent to 1.5 mg EPO was
A MonoQ column (Pharmacia) equilibrated with 0 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2) was injected.
After washing the column with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2), the adsorbed EPO was eluted under the following conditions, and the elution patterns were compared. MonoQ column chromatographic analysis conditions Column; MonoQHR5 / 10 (Amersham-Pharmacia-Biotech, 0.5 × 5 cm, 1.0 m)
l) Mobile phase A; 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2) Mobile phase B; 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2) containing 1.0 M NaCl Gradient; 0-30% B linear gradient, 3
0 ml flow rate; 0.5 ml / min chart speed; 2 mm / min detection method; A280 nm, Range 0.5 dextran sulfate-modified erythropoietin is unmodified EPO
Was not sufficiently adsorbed to the column, but was more completely adsorbed to the column. The MonoQ column was an anion exchange column, and from the above results, it was confirmed that the dextran sulfate-modified EPO had an increased negative charge.
【００３０】[0030]
【実施例４】デキストラン硫酸修飾ＥＰＯの血中動態 実施例１および２で調製したデキストラン硫酸修飾ＥＰ
Ｏ、及び未修飾ＥＰＯの各々を、９週齢のＷｉｓｔａｒ
系雄性ラット（ＣＲＪ社）に１μｇ／ｋｇの用量で静脈
内投与した。被検物質投与の１５、３０分後、および
１、２、３、４、６、８、１０、２４時間後に、エーテ
ル麻酔下で、眼窩静脈より血液約２００μｌを部分採血
した。採取した血液は３、０００ｒｐｍで１０分間遠心
分離し、血清を調製した。調製した血清サンプルは分析
するまで、−４０℃で保存した。これら血清サンプル中
のＥＰＯ濃度は、後藤らの酵素免疫学的方法（ＥＬＩＳ
Ａ法，M.Goto et al.，Blood，Vol.74，1415-1423，198
9）で測定した。尚、ＥＬＩＳＡ法での測定に用いるＥ
ＰＯ標準品として、それぞれ投与した修飾デキストラン
硫酸修飾ＥＰＯを用いた。デキストラン硫酸修飾ＥＰＯ
血中動態の測定結果を図３に示した。この結果から、デ
キストラン硫酸修飾ＥＰＯの血中滞留性が顕著に向上し
ていることが確認できた。Example 4 Blood kinetics of dextran sulfate-modified EPO Dextran sulfate-modified EP prepared in Examples 1 and 2
O and unmodified EPO were each replaced with a 9-week-old Wistar.
A male rat (CRJ) was intravenously administered at a dose of 1 μg / kg. Approximately 200 μl of blood was partially collected from the orbital vein under ether anesthesia at 15, 30 minutes and 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, and 24 hours after administration of the test substance. The collected blood was centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes to prepare serum. The prepared serum samples were stored at -40 ° C until analysis. The EPO concentration in these serum samples was determined by the enzyme immunoassay (ELIS) of Goto et al.
Method A, M. Goto et al., Blood, Vol. 74, 1415-1423, 198
Measured in 9). In addition, E used for the measurement by the ELISA method
The modified dextran sulfate-modified EPO to which each was administered was used as a PO standard product. Dextran sulfate modified EPO
FIG. 3 shows the measurement results of the kinetics in blood. From this result, it was confirmed that the blood retention of dextran sulfate-modified EPO was significantly improved.
【００３１】[0031]
【実施例５】デキストラン硫酸修飾腫瘍細胞障害因子
（ＴＣＦ）（１） ＴＣＦは東尾らによってヒト細胞ＩＭＲ−９０の培養液
から精製された糖タンパク質で、すでに遺伝子配列が明
らかとなっている（ＷＯ９０／１０６５１号公報）。本
実施例ではこの遺伝子配列を発現させて得たＴＣＦを用
いた。なおＴＣＦはHepatocyte Growth Factor(ＨＧ
Ｆ)、Scatter Factor(ＳＣＦ)の名称で呼ばれることも
ある。本発明はこれらの別称でよばれるものや、基本的
な機能に影響しない微細な変異を有する変異体について
も適用しうる。デキストラン硫酸Ｓ５ ２００ｍｇ、エ
チレンジアミン４酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ４Ｎａ）２
００ｍｇを１ＭＮａＣｌ、０．０１％ｐｏｌｙｓｏｒｂ
ａｔｅ８０を含む１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．
０）１０ｍｌで溶解し、その９ｍｌに１０ｍｇ／ｍｌの
濃度に調製したＴＣＦ溶液（溶媒は０．３ＭＮａＣｌ、
０．０１％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０を含有する１０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）１ｍｌを加
え、更に１ＮＮａＯＨを加えｐＨ１０に調整した。次い
で、４℃の冷蔵庫中で一昼夜反応を進行させた。翌日、
この溶液をセントリプラス−３０（Ａｍｉｃｏｎ社製）
で約１ｍｌに遠心濃縮して、次いで４℃で一昼夜放置し
て、さらに反応を進行させた。次いで、この溶液を、Ｓ
ｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０カラムを用いてゲ
ルろ過して未反応のデキストラン硫酸Ｓ５を除去した。Example 5 Dextran Sulfate Modified Tumor Cytotoxic Factor (TCF) (1) TCF is a glycoprotein purified from a culture of human cells IMR-90 by Higashio et al. / 10651). In this example, TCF obtained by expressing this gene sequence was used. TCF stands for Hepatocyte Growth Factor (HG
F) or Scatter Factor (SCF). The present invention is also applicable to those so-called aliases and mutants having minute mutations that do not affect basic functions. Dextran sulfate S5 200mg, Sodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA4Na) 2
00 mg in 1 M NaCl, 0.01% polysorb
ate80 in 10 mM phosphate buffer (pH 7.
0) The solution was dissolved in 10 ml, and the TCF solution adjusted to a concentration of 10 mg / ml in 9 ml thereof (the solvent was 0.3 M NaCl,
10 containing 0.01% Polysorbate 80
mM sodium phosphate buffer, pH 6.0), and adjusted to pH 10 by further adding 1N NaOH. Then, the reaction was allowed to proceed overnight in a refrigerator at 4 ° C. next day,
This solution was centriplus-30 (manufactured by Amicon).
Then, the mixture was centrifugally concentrated to about 1 ml and then left at 4 ° C. for 24 hours to further proceed the reaction. This solution is then
Gel filtration was performed using an upperdex200HR10 / 30 column to remove unreacted dextran sulfate S5.
【００３２】ゲルろ過の条件を以下に記載する。 カラム；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ｂｉｏｔｅｃｈ）
２４ｍｌ 移動相；１ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液
（ｐＨ７．０） 流速；０．５ｍｌ／ｍｉｎ 分画サイズ；０．５ｍｌ／ｆｒａｃｔｉｏｎThe conditions for gel filtration are described below. Column: Superdex200HR10 / 30 (Am
ersham / Pharmacia / Biotech)
24 ml mobile phase; 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 M NaCl Flow rate: 0.5 ml / min Fraction size; 0.5 ml / fraction
【００３３】ゲルろ過終了後、各分画のＴＣＦを特開平
５−９７号公報に開示されたエンザイムイムノアッセイ
法（ＥＬＩＳＡ）によって測定し、ＴＣＦのピークを集
めた分画液約５ｍｌを得た。ＴＣＦはゲルろ過分子量、
約100ｋＤａに相当する位置に溶出された。この結果か
らＴＣＦ１分子当たりデキストラン硫酸Ｓ５が２０〜２
５分子結合していると推測された。次いでこのデキスト
ラン硫酸修飾ＴＣＦ画分をＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓ
ｓａｙ（バイオラッド社製）キットを用いた評価に供
し、ウシ血清アルブミンを標準としてタンパク質濃度を
測定した。デキストラン硫酸修飾画分のタンパク質濃度
は、６．２ｍｇ／ｍｌであった。なおゲルろ過パターン
を図４に示した。After the completion of the gel filtration, the TCF of each fraction was measured by the enzyme immunoassay (ELISA) disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-97 to obtain about 5 ml of a fraction containing the peak of TCF. TCF is the molecular weight of gel filtration,
It was eluted at a position corresponding to about 100 kDa. From these results, it was found that dextran sulfate S5 was 20 to 2 per molecule of TCF.
It was presumed that five molecules were bonded. Next, this dextran sulfate-modified TCF fraction was subjected to DC Protein As.
The samples were subjected to evaluation using a kit (manufactured by Bio-Rad Inc.), and the protein concentration was measured using bovine serum albumin as a standard. The protein concentration of the dextran sulfate-modified fraction was 6.2 mg / ml. The gel filtration pattern is shown in FIG.
【００３４】[0034]
【実施例６】デキストラン硫酸修飾ＴＣＦ（２） デキストラン硫酸Ｓ５ ２００ｍｇ、１ＭＮａＣｌ、
０．０１％ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０を含む１０ｍＭ
リン酸バッファー（ｐＨ７．０）１０ｍｌで溶解し、そ
の９ｍｌに１０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したＴＣＦ溶液
（溶媒は０．３ＭＮａＣｌ、０．０１％Ｐｏｌｙｓｏｒ
ｂａｔｅ８０を含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ６．０）１ｍｌを加え、更に１ＮＮａＯＨを加
えｐＨ１０に調整した。次いで、４℃の冷蔵庫中で一昼
夜反応を進行させた。翌日、この溶液をセントリプラス
−３０（Ａｍｉｃｏｎ社製）で約１ｍｌに遠心濃縮し
て、さらに４℃で一昼夜放置してさらに反応を進行させ
た。次いで、この溶液を実施例５と同様にＳｕｐｅｒｄ
ｅｘ２００HR１０／３０カラムを用いてゲルろ過し、未
反応のデキストラン硫酸Ｓ５を除去した。ゲルろ過終了
後、各分画のＴＣＦを実施例５と同様に、エンザイムイ
ムノアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）によって測定しＴＣＦの
ピークを集め、５ｍｌを得た。ＴＣＦはゲルろ過分子
量、約100ｋＤａに相当する位置に溶出された。この結
果からＴＣＦ１分子当たりデキストラン硫酸Ｓ５が２０
〜２５分子結合していると推測された。次いでこのデキ
ストラン硫酸修飾ＴＣＦ画分をＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａｓａａｙ（バイオラッド社製）キットを用いて評価に
供し、ウシ血清アルブミンを標準としてタンパク質濃度
を測定した。デキストラン硫酸修飾画分のタンパク質濃
度は、５．４ｍｇ／ｍｌであった。Example 6 Dextran sulfate modified TCF (2) Dextran sulfate S5 200 mg, 1 M NaCl,
10 mM containing 0.01% polysorbate80
The TCF solution was dissolved in 10 ml of a phosphate buffer (pH 7.0) and adjusted to a concentration of 10 mg / ml in 9 ml thereof (the solvent was 0.3 M NaCl, 0.01% Polysorber).
1 ml of a 10 mM sodium phosphate buffer containing pH80 (pH 6.0) was added, and the pH was adjusted to 10 by further adding 1N NaOH. Then, the reaction was allowed to proceed overnight in a refrigerator at 4 ° C. The next day, this solution was centrifugally concentrated to about 1 ml with Centriplus-30 (manufactured by Amicon), and left at 4 ° C. for 24 hours to further promote the reaction. Then, this solution was prepared in the same manner as in Example 5 except that
Gel filtration was performed using an ex200HR10 / 30 column to remove unreacted dextran sulfate S5. After the completion of the gel filtration, the TCF of each fraction was measured by enzyme immunoassay (ELISA) as in Example 5, and the TCF peak was collected to obtain 5 ml. TCF was eluted at a position corresponding to a molecular weight of gel filtration of about 100 kDa. From these results, it was found that dextran sulfate S5 was 20 per molecule of TCF.
It was estimated that 25 molecules were bonded. Next, the dextran sulfate-modified TCF fraction was added to DC Protein.
The assay was performed using an Asay (manufactured by Bio-Rad) kit, and the protein concentration was measured using bovine serum albumin as a standard. The protein concentration of the dextran sulfate-modified fraction was 5.4 mg / ml.
【００３５】[0035]
【実施例７】デキストラン硫酸修飾ＴＣＦ（３） デキストラン硫酸Ｓ５ ２ｇ、１ＭＮａＣｌ、０．０１
％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０を含む１０ｍＭリン酸バ
ッファー（ｐＨ７．０）１００ｍｌで溶解し、その９０
ｍｌに１０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したＴＣＦ溶液（溶
媒は０．３ＭＮａＣｌ、０．０１％ｐｏｌｙｓｏｒｂａ
ｔｅ８０を含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ６．０）１０ｍｌを加え、更に１ＮＮａＯＨにより
ｐＨ１０に調整した。次いで、４℃の冷蔵庫中で一昼夜
静置し反応を進行させた。翌日、この溶液をセントリプ
ラス−３０（Ａｍｉｃｏｎ社製）で約４．９ｍｌに遠心
濃縮して、さらに４℃で一昼夜静置してさらに反応を進
行させた。次いで、この溶液を、実施例５と同様にＳｕ
ｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ１６／６０カラムを用いてゲル
ろ過して未反応のデキストラン硫酸Ｓ５を除去した。ゲ
ルろ過条件を下記に示す。Example 7 Dextran sulfate modified TCF (3) Dextran sulfate S5 2 g, 1 M NaCl, 0.01
% Polysorbate 80, dissolved in 100 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.0).
A TCF solution prepared at a concentration of 10 mg / ml per ml (solvent: 0.3 M NaCl, 0.01% polysorba)
10 mM sodium phosphate buffer containing te80,
(pH 6.0) (10 ml) and adjusted to pH 10 with 1N NaOH. Then, the mixture was allowed to stand in a refrigerator at 4 ° C. for one day to allow the reaction to proceed. The next day, this solution was centrifuged and concentrated to about 4.9 ml with Centriplus-30 (manufactured by Amicon), and further allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours to further promote the reaction. Next, this solution was added to Su in the same manner as in Example 5.
Gel filtration was performed using a perdex200pg16 / 60 column to remove unreacted dextran sulfate S5. The gel filtration conditions are shown below.
【００３６】カラム；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ１６
／６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ）１２０ｍｌ 移動相；１ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液
（ｐＨ７．０） 流速；１ｍｌ／ｍｉｎ 分画サイズ；２ｍｌ／ｆｒａｃｔｉｏｎColumn: Superdex200pg16
/ 60 (Amersham / Pharmacia / Bi
otech) 120 ml mobile phase; 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 M NaCl Flow rate: 1 ml / min Fraction size; 2 ml / fraction
【００３７】ゲルろ過終了後、各分画のＴＣＦを実施例
５と同様に、エンザイムイムノアッセイ法（ＥＬＩＳ
Ａ）によって測定しＴＣＦのピークを集め、１４ｍｌを
得た。次いでこのデキストラン硫酸修飾ＴＣＦ画分をＤ
Ｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓａａｙ（バイオラッド社製）
キットを用いた評価に供し、ウシ血清アルブミンを標準
としてタンパク質濃度を測定した。デキストラン硫酸修
飾画分のタンパク質濃度は、４．７ｍｇ／ｍｌであっ
た。After the completion of the gel filtration, the TCF of each fraction was determined by enzyme immunoassay (ELIS) in the same manner as in Example 5.
The peak of TCF measured by A) was collected to obtain 14 ml. Next, this dextran sulfate-modified TCF fraction was
C Protein Asay (Bio-Rad)
The sample was subjected to evaluation using the kit, and the protein concentration was measured using bovine serum albumin as a standard. The protein concentration of the dextran sulfate-modified fraction was 4.7 mg / ml.
【００３８】[0038]
【実施例８】実施例７で得られたデキストラン硫酸修飾
ＴＣＦの特性を分析した （１）ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動 ＴＣＦがデキストラン硫酸修飾でＴＣＦの等電点が酸性
側にシフトしていることを確認した。分析法の詳細を以
下に記載する。Example 8 The characteristics of the dextran sulfate-modified TCF obtained in Example 7 were analyzed. (1) Polyacrylamide gel isoelectric focusing TCF was modified with dextran sulfate, and the isoelectric point of TCF shifted to the acidic side. I confirmed that. Details of the analytical method are described below.
【００３９】（器具及び装置） １）電極ろ紙：アマシャム−ファルマシア−バイオテッ
ク社製 ２）サンプルアプリケーションろ紙：アマシャム−ファ
ルマシア−バイオテック社製 ３）ゲルボンドＰＡＧフィルム：アマシャム−ファルマ
シア−バイオテック社製 ４）泳動装置２２１７Ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃｕｓｉｎｇ
Ｕｎｉｔ安定電源装置２２９７Ｍａｃｒｏｄｒｉｖｅ
５ Ｐｏｗｅｒ Ｓｕｐｐｌｙ ゲル冷却装置２２０９Ｍｕｌｔｉ Ｔｅｍｐ ゲルキャスティングキット（０．５ｍｍ厚用）(Equipment and Apparatus) 1) Electrode filter paper: Amersham-Pharmacia-Biotech 2) Sample application filter paper: Amersham-Pharmacia-Biotech 3) Gel bond PAG film: Amersham-Pharmacia-Biotech 4 ) Electrophoresis device 2217 Electrofocusing
Unit stable power supply 2297 Macrodrive
5 Power Supply Gel Cooling Device 2209 Multi Temp Gel Casting Kit (for 0.5mm thickness)
【００４０】（試薬及び標準品） １）アクリルアミド：アマシャム−ファルマシア−バイ
オテック社製（電気泳動用） ２）Ｎ，Ｎ'−メチレンビスアクリルアミド（ビス）：
アマシャム−ファルマシア−バイオテック社製（電気泳
動用） ３）アンフォライン（ｐＨ３．５〜９．５）：アマシャ
ム−ファルマシア−バイオテック社製 ４）尿素：ＩＣＮバイオメディカルズ社製（Ｕｌｔｒａ
ｐｕｒｅ） ５）過硫酸アンモニウム：ファルマシア製（電気泳動
用） ６）クマシーブリリアントブルーＲ−２５０：バイオラ
ッド製 ７）酢酸：試薬特級（和光純薬社製） ８）メタノール：試薬特級（和光純薬社製） ９）５−スルホサリチル酸二水和物：試薬特級（和光純
薬社製） １０）トリクロロ酢酸：試薬特級（和光純薬社製） １１）Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミ
ン：アマシャム−ファルマシア−バイオテック社製（電
気泳動用） １２）Ｄ、Ｌ−グルタミン酸：試薬特級（和光純薬製） １３）１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム：和光純薬社製
（容量分析用） １４）ケロシン：和光純薬社製 １５）水：日本ミリポア社製Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ＲＥＡＧ
ＥＮＴ ＷＡＴＥＲ ＳＹＳＴＥＭで製したもの １６）等電点マーカー：アマシャム−ファルマシア−バ
イオテック社製ｐＩキャリブレーション・キット（ｐＩ
範囲５〜１０．５） １７）ＴＣＦ標準品（１０ｍｇ／ｍＬ） （試液の調製） １）２９．１ｇ／ｄＬアクリルアミド溶液 アクリルアミド１４．５５ｇを水に溶解し、全量５０ｍ
Ｌとした。 ２）０．９ｇ／ｄＬＮ，Ｎ'−メチレンビスアクリルア
ミド溶液 ３）１ｇ／ｄＬ過硫酸アンモニウム溶液 過硫酸アンモニウム１０ｍｇを水に溶解し、全量１ｍＬ
とした。 ４）陰極液（０．２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム） １ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム１ｍＬに水を加えて５ｍ
Ｌとした。 ５）陽極液（０．０４ｍｏｌ／Ｌグルタミン酸） Ｄ、Ｌ−グルタミン酸０．３３ｇを水に溶解し、全量５
０ｍＬとした。 ６）固定液 トリクロロ酢酸１００ｇおよび５−スルホサリチル酸二
水和物５０ｇを水に溶解し、全量１Ｌとした。 ７）染色液 メタノール３００ｍＬおよび酢酸２００ｍＬに水を加え
て１Ｌとした。これにクマシーブリリアントブルー１．
０ｇを溶解しながら加え、ろ過した。 ８）脱色液 メタノール３００ｍＬおよび酢酸１００ｍＬに水を加え
て１Ｌとした。 （等電点マーカー溶液の調製）ｐＩキャリブレーョン・
キット１バイアルに水５０μＬを加えた。 （試料溶液の調製）デキストラン硫酸修飾ＴＣＦサンプ
ルに水を加え、たん白濃度が約１０ｍｇ／ｍＬとなるよ
うに調製した。(Reagents and Standards) 1) Acrylamide: manufactured by Amersham-Pharmacia-Biotech (for electrophoresis) 2) N, N'-methylenebisacrylamide (bis):
Amersham-Pharmacia-Biotech (for electrophoresis) 3) Amphorine (pH 3.5-9.5): Amersham-Pharmacia-Biotech 4) Urea: ICN Biomedicals (Ultra)
pure) 5) Ammonium persulfate: manufactured by Pharmacia (for electrophoresis) 6) Coomassie Brilliant Blue R-250: manufactured by Bio-Rad 7) Acetic acid: special grade of reagent (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) 8) Methanol: special grade of reagent (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) 9) 5-Sulfosalicylic acid dihydrate: Reagent grade (Wako Pure Chemical Industries) 10) Trichloroacetic acid: Reagent grade (Wako Pure Chemical Industries) 11) N, N, N ', N'-tetramethyl Ethylenediamine: Amersham-Pharmacia-Biotech (for electrophoresis) 12) D, L-glutamic acid: Special grade reagent (Wako Pure Chemical Industries) 13) 1 mol / L sodium hydroxide: Wako Pure Chemical Industries (for volumetric analysis) 14) Kerosene: manufactured by Wako Pure Chemical Industries 15) Water: Milli-Q REAG manufactured by Nippon Millipore
ENT WATER SYSTEM 16) Isoelectric point marker: Amersham-Pharmacia-Biotech pI calibration kit (pI
(Range 5-10.5) 17) TCF standard product (10 mg / mL) (Preparation of test solution) 1) 29.1 g / dL acrylamide solution 14.55 g of acrylamide was dissolved in water, and the total amount was 50 m.
L. 2) 0.9 g / dLN, N'-methylenebisacrylamide solution 3) 1 g / dL ammonium persulfate solution 10 mg of ammonium persulfate is dissolved in water, and the total volume is 1 mL.
And 4) Catholyte (0.2 mol / L sodium hydroxide) Water was added to 1 mol / L sodium hydroxide (1 mL) and 5 m
L. 5) Anolyte (0.04 mol / L glutamic acid) 0.33 g of D, L-glutamic acid was dissolved in water, and the total amount was 5%.
It was 0 mL. 6) Fixing solution 100 g of trichloroacetic acid and 50 g of 5-sulfosalicylic acid dihydrate were dissolved in water to make a total volume of 1 L. 7) Staining solution Water was added to 300 mL of methanol and 200 mL of acetic acid to make 1 L. Coomassie brilliant blue
While dissolving 0 g, the mixture was filtered. 8) Decolorizing solution Water was added to 300 mL of methanol and 100 mL of acetic acid to make 1 L. (Preparation of isoelectric marker solution) pI calibration
50 μL of water was added to one vial of the kit. (Preparation of sample solution) Water was added to the dextran sulfate-modified TCF sample to prepare a protein concentration of about 10 mg / mL.
【００４１】（操作方法） １）ゲルの作製 尿素５．０５ｇ、水１２．０ｍＬ、２９．１ｇ／ｄＬア
クリルアミド溶液３．５ｍＬ、０．９ｇ／ｄＬＮ，Ｎ'
−メチレンビスアクリルアミド溶液３．５ｍＬ及びアン
フォライン１．５ｍＬを混合したのち、吸引脱気した。
脱気後、１ｇ／ｄＬ過硫酸アンモニウム溶液０．５ｍＬ
及びＴＥＭＥＤ３０μＬを加え混合し、速やかにゲルキ
ャスティングキットを用いた泳動プレート（ゲルボンド
ＰＡＧフィルム）に流し込み一晩静置した。 ２）泳動 作製したゲル（プレート）をゲルキャスティングキッ
トから外し電気泳動装置にセットした（泳動装置とゲル
の間にケロシンを少量滴下した後塗布し、気泡が入らな
いようにセットする）。泳動条件を下記に設定した。 泳動温度１５℃ 電流（ｍＡ）５０ｍＡ 電圧（Ｖ）２０００Ｖ 電力（Ｗ）２５Ｗ １０分間予備泳動後電源を切り、サンプルアプリケー
ションろ紙を陽極側に置き、１レーンあたり、等電点マ
ーカー溶液を１５μＬ、試料溶液及びＳＮＭ−２０１５
社内標準品を１０μＬ（１００μｇ）負荷し、４０分間
泳動した。電源を切り、サンプルアプリケーションろ紙
を取り除き、更に２０分間泳動した。 ３）染色 泳動終了後、ゲルを脱色液で十分に洗い、順に固定液に
約６０分間、脱色液に約３０分間、染色液に約６０分浸
した後、脱色液に一晩程度浸した。十分に脱色したこと
を確認した後、水に３０分浸し、自然乾燥した。乾燥し
たゲルはレーン番号等を表示した台紙にのせ、ラミネー
トした。 ４）等電点の測定 等電点マーカー及び未修飾ＴＣＦ標準品の泳動パターン
と試料の泳動パターンを比較し、試料の等電点範囲とＴ
ＣＦ標準品の等電点範囲との差異を比較した。結果を図
５に示した。未修飾ＴＣＦの等電点はｐＨ７．３〜９．
０の範囲を示した。一方、デキストラン硫酸修飾ＴＣＦ
の等電点はｐＨ５．５〜８．３の範囲にあり、等電点の
著明な酸性側へのシフトが確認された。(Operation method) 1) Preparation of gel 5.05 g of urea, 12.0 mL of water, 3.5 mL of 29.1 g / dL acrylamide solution, 0.9 g / dLN, N '
-After mixing 3.5 mL of methylenebisacrylamide solution and 1.5 mL of ampholine, the mixture was suctioned and degassed.
After degassing, 0.5 mL of 1 g / dL ammonium persulfate solution
And 30 μL of TEMED were added, mixed, and immediately poured into an electrophoresis plate (gel-bonded PAG film) using a gel casting kit, and allowed to stand overnight. 2) Electrophoresis The prepared gel (plate) was removed from the gel casting kit and set in an electrophoresis apparatus. (A small amount of kerosene was dropped between the electrophoresis apparatus and the gel, then applied, and set so that air bubbles did not enter.) The electrophoresis conditions were set as follows. Electrophoresis temperature 15 ° C Current (mA) 50mA Voltage (V) 2000V Power (W) 25W After pre-electrophoresis for 10 minutes, turn off the power, place the sample application filter paper on the anode side, and place the isoelectric point marker solution 15 μL per lane, sample Solution and SNM-2015
10 μL (100 μg) of the in-house standard was loaded and electrophoresed for 40 minutes. The power was turned off, the sample application filter paper was removed, and the sample was run for another 20 minutes. 3) Staining After completion of the electrophoresis, the gel was thoroughly washed with a destaining solution, immersed in a fixing solution for about 60 minutes, in a decolorizing solution for about 30 minutes, and in a staining solution for about 60 minutes, and then immersed in the destaining solution overnight. After confirming that the color was sufficiently bleached, it was immersed in water for 30 minutes and air-dried. The dried gel was placed on a backing paper on which lane numbers and the like were displayed, and laminated. 4) Measurement of isoelectric point Compare the migration pattern of the sample with the migration pattern of the isoelectric marker and the unmodified TCF standard, and determine the isoelectric point range of the sample and T
The difference from the isoelectric point range of the CF standard was compared. The results are shown in FIG. The isoelectric point of unmodified TCF is pH 7.3-9.
The range of 0 was shown. On the other hand, dextran sulfate-modified TCF
The isoelectric point was in the range of pH 5.5 to 8.3, and a remarkable shift of the isoelectric point to the acidic side was confirmed.
【００４２】[0042]
【実施例９】デキストラン硫酸修飾ＴＣＦの血中動態 実施例５、実施例７で調製したデキストラン硫酸修飾Ｔ
ＣＦ及び未修飾ＴＣＦの各々を、９週齢のＷｉｓｔａｒ
系雄性ラット（ＣＲＪ社製）に１ｍｇ／ｋｇの用量で静
脈内投与した。被検物質投与の２、５、１０、１５、３
０、４５、６０、及び１２０分後に、エーテル麻酔下
で、眼窩静脈より血液約２００μｌを採血した。採取し
た血液は３、０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血清
を調製した。調製した血清サンプルは分析するまで、−
４０℃で保存した。これら血清サンプル中のＴＣＦ濃度
を、植松らの酵素免疫学的方法（Yasuhiro Uematsu et
al.,Journal of Pharmacological Sciences,88,1,131-1
35,1999）の条件を一部改変して測定した。即ち、標識
抗体（ａｎｔｉ−ＴＣＦ ＩｇＧ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓ
ｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の希釈率を１００倍から４０
０倍に変更して測定を行った。尚、ＥＬＩＳＡ法での測
定に用いるＴＣＦ標準品として、未修飾のＴＣＦを用い
た。修飾、未修飾ＴＣＦの血中動態の測定結果を図６に
示した。この結果から、デキストラン硫酸修飾ＴＣＦ
は、未修飾ＴＣＦに比して血中滞留性が顕著に向上して
いることが確認できた。またこの試験結果から求めた薬
物動態学的パラメーターを下記表１に示した。デキスト
ラン硫酸修飾ＴＣＦは未修飾ＴＣＦに比して、ＡＵＣ値
が約１０倍以上に上昇しており、有用性が薬物動態学的
パラメーターから確認された。Example 9 Blood kinetics of dextran sulfate-modified TCF Dextran sulfate-modified T prepared in Examples 5 and 7
Each of the CF and unmodified TCF was transferred to a 9-week-old Wistar.
Male rats (CRJ) were intravenously administered at a dose of 1 mg / kg. 2, 5, 10, 15, 3 of test substance administration
At 0, 45, 60, and 120 minutes, about 200 μl of blood was collected from the orbital vein under ether anesthesia. The collected blood was centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes to prepare serum. Until the prepared serum sample is analyzed,
Stored at 40 ° C. The TCF concentration in these serum samples was determined by the enzyme immunological method of Uematsu et al. (Yasuhiro Uematsu et al.
al., Journal of Pharmacological Sciences, 88, 1,131-1
35, 1999) with some modifications. That is, a labeled antibody (anti-TCF IgG-peroxidas)
e conjugate) from 100-fold to 40-fold
The measurement was carried out with changing to 0 times. Unmodified TCF was used as a TCF standard used for measurement by the ELISA method. FIG. 6 shows the measurement results of the blood kinetics of the modified and unmodified TCF. From these results, it was found that dextran sulfate-modified TCF
It was confirmed that the blood retention was significantly improved as compared with the unmodified TCF. The pharmacokinetic parameters determined from the test results are shown in Table 1 below. The AUC value of the dextran sulfate-modified TCF was increased about 10-fold or more as compared with the unmodified TCF, and the usefulness was confirmed from the pharmacokinetic parameters.
【００４３】[0043]
【表１】 [Table 1]
【００４４】[0044]
【実施例１０】デキストラン硫酸修飾ＡＤＩＦの調製例 ＡＤＩＦは、本特許の発明者らによって１９９８年に見
出された脂肪細胞の分化を抑制するサイトカインであ
り、ＳＤＳゲル電気泳動で約４５ｋＤａの分子量を示
し、還元条件では２８ｋＤａまたは２３ｋＤａの分子量
を示す塩基性タンパク質である。ＡＤＩＦのアミノ酸配
列、遺伝子配列、製造方法はＷＯ９９／５３０５６号公
報に開示されている。ＡＤＩＦは肥満の予防や治療に有
用なサイトカインとして期待されている。本実施例発明
で使用するＡＤＩＦは、上記ＷＯ９９／５３０５６号国
際特許公報に開示された技術によって生産し、精製した
ものを用いた。デキストラン硫酸Ｓ５（名糖産業社製）
１ｇ、ＡＤＩＦ１０ｍｇを生理食塩水に溶解し、溶解後
１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨを１０．０
に調整した。４℃の冷蔵庫中に一昼夜静置し、翌日、Ｃ
ｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（ミリポア社製）を用いて約１
ｍｌに遠心濃縮し、さらに４℃で一昼夜放置して、ＡＤ
ＩＦをデキストラン硫酸により修飾した。次いで、下記
の条件でゲルろ過を行い未反応の過剰なデキストラン硫
酸を除去した。Example 10 Preparation Example of Dextran Sulfate-Modified ADIF ADIF is a cytokine found in 1998 by the present inventors to suppress the differentiation of adipocytes, and has a molecular weight of about 45 kDa by SDS gel electrophoresis. It is a basic protein that shows a molecular weight of 28 kDa or 23 kDa under reducing conditions. The amino acid sequence, gene sequence and production method of ADIF are disclosed in WO 99/53056. ADIF is expected as a cytokine useful for prevention and treatment of obesity. ADIF used in the present invention was produced and purified by the technique disclosed in the above-mentioned WO 99/53056 International Patent Publication. Dextran sulfate S5 (Meito Sangyo Co., Ltd.)
1 g and 10 mg of ADIF were dissolved in physiological saline, and after dissolution, a 1N aqueous sodium hydroxide solution was added to adjust the pH to 10.0.
Was adjusted. Leave it in a refrigerator at 4 ° C for 24 hours.
Approximately 1 using enricon-10 (Millipore)
After centrifugal concentration to 4 ml, leave at 4 ° C for 24 hours.
IF was modified with dextran sulfate. Next, gel filtration was performed under the following conditions to remove unreacted excess dextran sulfate.
【００４５】ゲルろ過条件 カラム；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ｂｉｏｔｅｃｈ、
１ｘ３０ｃｍ、２４ｍｌ） 移動相；０．１５ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸塩緩
衝液（ｐＨ７．０） 流速；０．５ｍｌ／ｍｉｎ 分画サイズ；０．５ｍｌ／ｆｒａｃｔｉｏｎ ゲルろ過終了後、ＡＤＩＦの活性ピークを集め、５ｍｌ
を得た。ＡＤＩＦはゲルろ過分子量、５５〜６５ｋDａ
に相当する位置に溶出された。この結果から、ＡＤＩＦ
１分子当たりデキストラン硫酸Ｓ５が１０〜２０分子結
合していると推測された。次いでこのデキストラン硫酸
修飾ＡＤＩＦ画分をＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓａａｙ
（バイオラッド社）キットを用いた評価に供し、ウシ血
清アルブミンを標準としてタンパク質濃度を測定した。
デキストラン硫酸修飾画分のタンパク質濃度は、３．３
０ｍｇ／ｍｌであった。Gel filtration conditions Column: Superdex200HR10 / 30 (Am
ersham / Pharmacia / Biotech,
1 × 30 cm, 24 ml) Mobile phase; 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.15 M NaCl Flow rate: 0.5 ml / min Fraction size: 0.5 ml / fraction After completion of gel filtration, ADIF activity peaks were collected. , 5ml
I got ADIF has a gel filtration molecular weight of 55 to 65 kDa.
Was eluted at a position corresponding to From this result, ADIF
It was presumed that 10 to 20 molecules of dextran sulfate S5 were bound per molecule. Next, this dextran sulfate-modified ADIF fraction was subjected to DC Protein Asay.
(Bio-Rad) was used for evaluation using a kit, and protein concentration was measured using bovine serum albumin as a standard.
The protein concentration of the dextran sulfate-modified fraction was 3.3.
It was 0 mg / ml.
【００４６】[0046]
【実施例１１】デキストラン硫酸Ｓ５修飾ｂＯＧＦ−II
の調製例 ｂＯＧＦ−IIは、本特許の発明者らによって見出された
骨芽細胞の増殖活性を有し、ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で約１５ｋＤａの分子量を示す塩基性タン
パク質である。ｂＯＧＦ−IIのアミノ酸配列、遺伝子配
列、製造方法はＷＯ９６／００２４０号国際特許公報に
開示されている。ｂＯＧＦ−IIは骨粗鬆症などの骨量減
少症の治療に有用なサイトカインである。本実施例発明
で使用するｂＯＧＦ−IIは、上記ＷＯ９６／００２４０
号国際特許公報に開示された技術によって生産し、精製
したものを用いた。デキストラン硫酸Ｓ５（名糖産業社
製）１ｇ、ｂＯＧＦ−II１０ｍｇを生理食塩水に溶解
し、溶解後１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を添加してｐＨを
１０．０に調整した。４℃の冷蔵庫中に一昼夜静置し、
翌日、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（ミリポア社製）を用
いて約１ｍｌに遠心濃縮し、さらに４℃で一昼夜放置し
て、ｂＯＧＦ−IIをデキストラン硫酸により修飾した。
次いで、下記の条件でゲルろ過を行い未反応の過剰なデ
キストラン硫酸を除去した。Example 11 Dextran sulfate S5 modified bOGF-II
Preparation Example of bOGF-II is a basic protein having an osteoblast growth activity discovered by the inventors of the present patent and showing a molecular weight of about 15 kDa by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The amino acid sequence, gene sequence and production method of bOGF-II are disclosed in WO96 / 00240 International Patent Publication. bOGF-II is a cytokine useful for treating osteopenia such as osteoporosis. The bOGF-II used in the present invention is described in WO96 / 00240 described above.
Produced and purified by the technique disclosed in International Patent Publication No. 1 g of dextran sulfate S5 (manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd.) and 10 mg of bOGF-II were dissolved in physiological saline, and after dissolution, the pH was adjusted to 10.0 by adding a 1N sodium hydroxide solution. Leave it in a refrigerator at 4 ° C all day and night,
The next day, the mixture was centrifuged and concentrated to about 1 ml using Centricon-10 (manufactured by Millipore), and the mixture was allowed to stand at 4 ° C for 24 hours to modify bOGF-II with dextran sulfate.
Next, gel filtration was performed under the following conditions to remove unreacted excess dextran sulfate.
【００４７】ゲルろ過条件 カラム；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ｂｉｏｔｅｃｈ、
１ｘ３０ｃｍ、２４ｍｌ） 移動相；０．１５ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸塩緩
衝液（ｐＨ７．０） 流速；０．５ｍｌ／ｍｉｎ 分画サイズ；０．５ｍｌ／ｆｒａｃｔｉｏｎ ゲルろ過終了後、ｂＯＧＦ−IIの活性ピークを集め、約
５ｍｌを得た。ｂＯＧＦ−IIはゲルろ過分子量、２５〜
３５ｋＤａに相当する位置に溶出された。この結果か
ら、ｂＯＧＦ−II１分子当たりデキストラン硫酸Ｓ５が
１０〜２０分子結合していると推測された。次いでこの
デキストラン硫酸修飾ｂＯＧＦ−II画分をＤＣ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎＡｓｓａｙ（バイオラッド社製）キットを用い
た評価に供し、ウシ血清アルブミンを標準としてタンパ
ク質濃度を測定した。デキストラン硫酸修飾画分のタン
パク質濃度は、３．５３ｍｇ／ｍｌであった。Gel Filtration Conditions Column: Superdex200HR10 / 30 (Am
ersham / Pharmacia / Biotech,
1x30cm, 24ml) Mobile phase; 10mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.15M NaCl Flow rate: 0.5ml / min Fraction size; 0.5ml / fraction After completion of gel filtration, bOGF-II activity peak Was collected to obtain about 5 ml. bOGF-II has a gel filtration molecular weight of 25 to 25.
It was eluted at a position corresponding to 35 kDa. From this result, it was estimated that 10 to 20 molecules of dextran sulfate S5 were bound per 1 molecule of bOGF-II. Next, this dextran sulfate-modified bOGF-II fraction was DC Pro
Evaluation was performed using a teinAssay (manufactured by Bio-Rad) kit, and the protein concentration was measured using bovine serum albumin as a standard. The protein concentration of the dextran sulfate-modified fraction was 3.53 mg / ml.
【００４８】[0048]
【発明の効果】本発明により提供されるデキストラン硫
酸修飾生理活性タンパク質は、生体での血中滞留時間が
延長されており、医薬として持続性がある。また少量で
治療効果を発揮する。EFFECT OF THE INVENTION The dextran sulfate-modified physiologically active protein provided by the present invention has an extended residence time in blood in a living body, and is persistent as a medicament. In addition, it shows a therapeutic effect with a small amount.
【図１】図１は、実施例１で行ったエリスロポエチンの
デキストラン硫酸修飾後のゲルろ過パターンを示す。FIG. 1 shows the gel filtration pattern of erythropoietin after dextran sulfate modification performed in Example 1.
【図２】図２は、実施例１、実施例２で得たデキストラ
ン硫酸修飾エリスロポエチン、未修飾エリスロポエチン
の等電点電気泳動の測定結果を示す。FIG. 2 shows the results of isoelectric focusing of dextran sulfate-modified erythropoietin and unmodified erythropoietin obtained in Examples 1 and 2.
図の縦軸は等電点（ｐＩ）値を示す。 １：等電点マーカータンパク質 ２：未修飾ＥＰＯ ３：実施例１で調製した修飾ＥＰＯ ４：実施例２で調製した修飾ＥＰＯ The vertical axis in the figure indicates the isoelectric point (pI) value. 1: isoelectric marker protein 2: unmodified EPO 3: modified EPO prepared in Example 1 4: modified EPO prepared in Example 2
【図３】図３は実施例４で測定したデキストラン硫酸修
飾エリスロポエチン及び未修飾エリスロポエチンを投与
した動物の血清内エリスロポエチン濃度の経時変化を示
す。FIG. 3 shows the time course of the serum erythropoietin concentration of an animal to which dextran sulfate-modified erythropoietin and unmodified erythropoietin were administered, measured in Example 4.
黒三角：未修飾エリスロポエチン 黒丸 ：実施例１で調製した修飾ＥＰＯ 黒四角：実施例２で調製した修飾ＥＰＯ Solid triangle: unmodified erythropoietin Solid circle: modified EPO prepared in Example 1 Solid square: modified EPO prepared in Example 2
【図４】図４は、実施例５で行ったＴＣＦのデキストラ
ン硫酸修飾後のゲルろ過パターンを示す。FIG. 4 shows a gel filtration pattern after dextran sulfate modification of TCF performed in Example 5.
【図５】図５は、実施例５及び６で得たデキストラン硫
酸修飾ＴＣＦ及び未修飾ＴＣＦの等電点電気泳動の測定
結果を示す。FIG. 5 shows the results of isoelectric focusing of dextran sulfate-modified TCF and unmodified TCF obtained in Examples 5 and 6.
図の縦軸は等電点（ｐＩ）値を示す。 １：等電点マーカータンパク質 ２：未修飾ＴＣＦ ３：実施例５で調製した修飾ＴＣＦ ４：実施例６で調製した修飾ＴＣＦ ５：等電点マーカータンパク質 The vertical axis in the figure indicates the isoelectric point (pI) value. 1: isoelectric marker protein 2: unmodified TCF 3: modified TCF prepared in Example 5: modified TCF prepared in Example 6 5: isoelectric marker protein
【図６】図６は実施例９で測定した、デキストラン硫酸
修飾ＴＣＦ及び未修飾ＴＣＦを投与した動物の血清内Ｔ
ＣＦ濃度の経時変化を示す。FIG. 6 shows the serum T of animals treated with dextran sulfate-modified TCF and unmodified TCF measured in Example 9.
5 shows the change over time of the CF concentration.
黒三角：未修飾ＴＣＦ 黒丸 ：実施例５で調製した修飾ＴＣＦ 黒四角：実施例７で調製した修飾ＴＣＦ Solid triangle: unmodified TCF Solid circle: modified TCF prepared in Example 5 Solid square: modified TCF prepared in Example 7
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 1/02 Ｃ０７Ｋ 1/02 14/505 14/505 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 津田 英資 栃木県河内郡南河内町祇園２−13−１ダイ アパレス自治医大５番館407 Ｆターム(参考） 4C084 AA01 AA02 AA03 AA06 AA07 BA34 BA44 CA53 DA01 DA25 DB56 NA12 ZA55 ZA70 ZA97 ZB26 4H045 AA10 AA20 AA30 BA53 DA01 DA13 EA20 FA30 FA50 GA22Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat II (Reference) A61P 35/00 C07K 1/02 C07K 1/02 14/505 14/505 A61K 37/02 (72) Inventor Eiji Tsuda Tochigi 2-13-1 Gion, Minamikawachi-cho, Kawachi-gun, Japan Apares Jichi Medical University Building No. 5 Building 407 F-term (reference) 4C084 AA01 AA02 AA03 AA06 AA07 BA34 BA44 CA53 DA01 DA25 DB56 NA12 ZA55 ZA70 ZA97 ZB26 4H045 AA10 AA20 AA30 BA53 FA30 GA22
Claims (7)
つ、デキストラン硫酸が結合していない生理活性タンパ
ク質に比較して血中滞留時間が長いことを特徴とする修
飾生理活性タンパク質。1. A modified bioactive protein characterized by having a longer residence time in blood than a bioactive protein to which dextran sulfate is bound and to which dextran sulfate is not bound.
トリウムイオウ５である、請求項１記載の修飾生理活性
タンパク質。2. The modified bioactive protein according to claim 1, wherein the dextran sulfate is dextran sulfate sodium sulfur 5.
活性タンパク質がサイトカインである、請求項１又は２
記載の修飾生理活性タンパク質。3. The bioactive protein to which dextran sulfate is not bound is a cytokine.
The modified bioactive protein according to the above.
hropoietin）、腫瘍細胞障害因子（tumor cytotoxic fa
ctor）、脂肪細胞分化抑制因子（adipogenesisinhibito
ry factor）又は骨芽細胞増殖因子（osteoblast growth
factor 2）である、請求項３記載の修飾生理活性タン
パク質。4. The method according to claim 1, wherein the cytokine is erythropoietin (eryt
hropoietin), tumor cytotoxic fa (tumor cytotoxic fa)
ctor), adipogenesis inhibito
ry factor) or osteoblast growth factor (osteoblast growth factor)
The modified bioactive protein according to claim 3, which is factor 2).
酸を含有する溶液をｐＨ９以上のアルカリ性条件下で保
温することを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一
つに記載の修飾生理活性タンパク質の製造方法。5. The method for producing a modified bioactive protein according to claim 1, wherein the solution containing the bioactive protein and dextran sulfate is kept warm under alkaline conditions of pH 9 or more. Method.
た修飾生理活性タンパク質。6. A modified bioactive protein produced by the production method according to claim 5.
一つに記載の修飾生理活性タンパク質を含有する医薬組
成物。7. A pharmaceutical composition comprising the modified bioactive protein according to any one of claims 1 to 4 and 6.
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-
2001
- 2001-12-27 JP JP2001395591A patent/JP2002338599A/en active Pending
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| JP2009536952A (en) * | 2006-06-20 | 2009-10-22 | イス アブジス カンパニー リミテッド | Bst2 inhibitor |
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| US10196625B2 (en) | 2013-09-30 | 2019-02-05 | Seikagaku Corporation | Method for improving blood persistence of protein |
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