JP2002371063A - 2,6-pyridinecarboxylic acid or its salt, method for producing the same and chelating agent - Google Patents
2,6-pyridinecarboxylic acid or its salt, method for producing the same and chelating agentInfo
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pyridine Compounds (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、実質的にアルキル
ピリジン類を不純物として含まない優れた生分解性を有
する2,6-ピリジンジカルボン酸またはその塩とその製造
方法およびそれらを用いたキレート剤に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a 2,6-pyridinedicarboxylic acid having excellent biodegradability substantially free of alkylpyridines as an impurity or a salt thereof, a method for producing the same, and a chelating agent using the same. About.
【０００２】[0002]
【従来の技術】2,6-ピリジンジカルボン酸は、2,6-ルチ
ジンから酸化反応によって合成されることが知られてい
る。すなわち、ニッケル化合物の存在下で次亜ハロゲン
酸塩を酸化剤として用いる方法（特開平１１−３２２７
１６号公報）や、オゾンを用いた酸化による製造方法
（特開平１１−３４３４８３号公報、ＳＵ９４３２３６
Ａ１）、電解酸化法（ＥＰ２５３４３９Ｂ１）、空気酸
化法（Synthesis Commun.(1992),22,2691-6）などが開
示されている。しかし、これらの方法では、反応の転化
率や選択率が不十分なため、原料である2,6-ルチジンや
反応中間体である6-メチル-2-ピリジンカルボン酸が反
応液中に残存し、これらが製品である2,6-ピリジンジカ
ルボン酸中に不純物として混入するという問題点があっ
た。2. Description of the Related Art It is known that 2,6-pyridinedicarboxylic acid is synthesized from 2,6-lutidine by an oxidation reaction. That is, a method using a hypohalite as an oxidizing agent in the presence of a nickel compound (JP-A-11-3227)
No. 16) or a production method by oxidation using ozone (Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-343483, SU943236).
A1), electrolytic oxidation method (EP253439B1), air oxidation method (Synthesis Commun. (1992), 22, 2691-6) and the like are disclosed. However, in these methods, the conversion and selectivity of the reaction are insufficient, so that 2,6-lutidine as a raw material and 6-methyl-2-pyridinecarboxylic acid as a reaction intermediate remain in the reaction solution. However, there is a problem that these are mixed as impurities into the product 2,6-pyridinedicarboxylic acid.
【０００３】2,6-ピリジンジカルボン酸は、漂白促進剤
（特開平６−２１４３６５号公報、米国特許第５５３６
６２５号公報）や金属隠蔽剤（特開平５−１５８１９５
号公報）として、写真処理用途や各種洗浄剤で使用でき
ることが知られている。2,6-ピリジンジカルボン酸は、
天然物であり生分解性が高いことが知られているが、不
純物として含まれる2,6-ルチジンや6-メチル-2-ピリジ
ンカルボン酸の生分解性が悪いことから、大量に使用さ
れた場合には、環境保護の観点から問題となっている。[0003] 2,6-pyridinedicarboxylic acid is used as a bleaching accelerator (JP-A-6-214365, US Patent No. 5536).
625) and a metal concealing agent (JP-A-5-158195)
It is known that it can be used in photographic processing applications and various cleaning agents. 2,6-pyridinedicarboxylic acid is
It is a natural product and is known to have high biodegradability, but it was used in large quantities due to poor biodegradability of 2,6-lutidine and 6-methyl-2-pyridinecarboxylic acid contained as impurities. In some cases, it is a problem from the viewpoint of environmental protection.
【０００４】微生物を用いた2,6-ピリジンジカルボン酸
の製造方法としては、胞子を形成する微生物であるバシ
ラス(Bacillus)属を用いた発酵法による製造方法（ＤＥ
２３０００５６）やカビを用いた製造方法（米国特許第
３３３４０２１号公報）が知られているが、胞子を形成
する能力を持たない微生物による2,6-ピリジンジカルボ
ン酸の生産は、これまで知られていなかった。[0004] As a method for producing 2,6-pyridinedicarboxylic acid using a microorganism, a method for producing a 2,6-pyridinedicarboxylic acid by fermentation using a bacterium belonging to the genus Bacillus (DE) is disclosed.
Production method using mold (US Pat. No. 3,340,221) is known, but production of 2,6-pyridinedicarboxylic acid by a microorganism having no ability to form spores has been known. Did not.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】金属隠蔽剤や補足剤
は、その使用状況から環境へ放出されることが多く、生
分解性に優れた製品が望まれている。2,6-ピリジンジカ
ルボン酸は、微生物の胞子中に存在する天然のキレート
作用を持つ物質として知られていた。こうした背景か
ら、安価で、かつ、生分解性に優れた2,6-ピリジンジカ
ルボン酸が望まれていた。SUMMARY OF THE INVENTION Metal concealing agents and supplements are often released to the environment due to their usage, and products with excellent biodegradability are desired. 2,6-pyridinedicarboxylic acid has been known as a natural chelating substance present in spores of microorganisms. From such a background, 2,6-pyridinedicarboxylic acid which is inexpensive and has excellent biodegradability has been desired.
【０００６】すなわち、本発明は、生分解性に優れた2,
6-ピリジンジカルボン酸に関するものであり、その製造
方法およびその用途を提供するものである。That is, the present invention provides a biodegradable 2,2
The present invention relates to 6-pyridinedicarboxylic acid, and provides a production method and a use thereof.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者はかかる状況に
鑑み、創意工夫の結果、リジンおよびリジン生合成系中
間体を生育に要求する微生物が、2,6-ピリジンジカルボ
ン酸を著量に生産し、また、こうした微生物を用いて得
られた2,6-ピリジンジカルボン酸精製物が、極めて生分
解性が高いことを見出し本発明を完成した。すなわち、
本発明は、リジンおよびリジン生合成系中間体を生育に
要求する微生物が、著量の2,6-ピリジンジカルボン酸を
生産するという発見によって、安価にかつ大量に2,6-ピ
リジンジカルボン酸を製造する新規な製造方法を提供す
るものである。また、本発明で得られる2,6-ピリジンジ
カルボン酸に含まれる不純物は、アミノ酸や有機酸およ
び2,3-ジヒドロジピコリン酸などであり、これらはいず
れも生分解性に優れており、環境中では速やかに分解さ
れる。Means for Solving the Problems In view of this situation, the present inventor has found that as a result of ingenuity, microorganisms that require growth of lysine and lysine biosynthetic intermediates can significantly reduce 2,6-pyridinedicarboxylic acid. The inventors have found that the purified 2,6-pyridinedicarboxylic acid produced and obtained using such a microorganism has extremely high biodegradability, and thus completed the present invention. That is,
The present invention provides an inexpensive and large amount of 2,6-pyridinedicarboxylic acid by the discovery that microorganisms that require lysine and lysine biosynthetic intermediates for growth produce significant amounts of 2,6-pyridinedicarboxylic acid. The present invention provides a novel manufacturing method for manufacturing. The impurities contained in the 2,6-pyridinedicarboxylic acid obtained in the present invention include amino acids, organic acids, and 2,3-dihydrodipicolinic acid, all of which are excellent in biodegradability, and Then it is quickly decomposed.
【０００８】すなわち上記課題は、実質的にアルキルピ
リジンを不純物として含まない生分解性に優れた2,6-ピ
リジンジカルボン酸またはその塩を提供することとその
製造方法およびその使用方法を提供することによって解
決された。That is, the object of the present invention is to provide a 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof which is substantially free of alkylpyridine as an impurity and which is excellent in biodegradability, and a method for producing the same and a method for using the same. Solved by
【０００９】すなわち、本発明は、 （１）アルキルピリジンの含有量が２重量％以下である
ことを特徴とする2,6-ピリジンジカルボン酸またはその
塩。 （２）バリン、アラニン、α−ケトグルタル酸および
２，３−ジヒドロキシピコリン酸から選ばれる少なくと
も一つを不純物として含むことを特徴とする2,6-ピリジ
ンジカルボン酸またはその塩。 （３）胞子を形成する能力がなく、かつ、2,6-ピリジン
ジカルボン酸を産生する能力を有する微生物を増殖させ
る工程と、その菌体の培養上清または反応水溶液から2,
6-ピリジンジカルボン酸を回収、精製する工程からなる
ことを特徴とする2,6-ピリジンジカルボン酸の製造方法 （４） 生育にリジンまたはリジン生合成系中間体を要
求し、かつ、2,6-ピリジンジカルボン酸を産生する能力
を有する微生物を増殖させる工程と、その菌体の培養上
清または反応水溶液上清から2,6-ピリジンジカルボン酸
を回収、精製する工程からなることを特徴とする2,6-ピ
リジンジカルボン酸の製造方法 （５） ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（EC1.3.1.
26）が、欠損、変異または破壊された微生物を増殖させ
る工程と、その菌体の培養上清または反応水溶液上清か
ら2,6-ピリジンジカルボン酸を回収、精製する工程から
なることを特徴とする2,6-ピリジンジカルボン酸の製造
方法。 （６） ジピコリネートシンターゼ（dipicolinate syn
thase)をコードする遺伝子を導入した形質転換体を増殖
させる工程と、その菌体の培養上清または反応水溶液上
清から2,6-ピリジンジカルボン酸を回収、精製する工程
からなることを特徴とする2,6-ピリジンジカルボン酸の
製造方法。 （７） ２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を
含むキレート剤であって、生分解性が９８％以上である
キレート剤。 （８） 上記の２，６−ピリジンジカルボン酸またはそ
の塩を含むキレート剤。 （９） 上記の製造方法で得られる２，６−ピリジンジ
カルボン酸を含むキレート剤。That is, the present invention provides: (1) 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof, wherein the content of alkylpyridine is 2% by weight or less. (2) 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof, which contains at least one selected from valine, alanine, α-ketoglutaric acid and 2,3-dihydroxypicolinic acid as an impurity. (3) a step of growing a microorganism having no ability to form spores and capable of producing 2,6-pyridinedicarboxylic acid;
A method for producing 2,6-pyridinedicarboxylic acid, which comprises a step of recovering and purifying 6-pyridinedicarboxylic acid (4) lysine or a lysine biosynthetic intermediate is required for growth, and 2,6 -A step of growing a microorganism capable of producing pyridinedicarboxylic acid, and a step of recovering and purifying 2,6-pyridinedicarboxylic acid from a culture supernatant or a reaction aqueous solution supernatant of the cells. Method for producing 2,6-pyridinedicarboxylic acid (5) Dihydrodipicolinate reductase (EC1.3.1.
26) is characterized in that it comprises a step of growing a defective, mutated or destroyed microorganism, and a step of recovering and purifying 2,6-pyridinedicarboxylic acid from a culture supernatant or a reaction aqueous solution supernatant of the cells. For producing 2,6-pyridinedicarboxylic acid. (6) dipicolinate synthase
a step of growing a transformant into which a gene encoding thase) has been introduced, and a step of recovering and purifying 2,6-pyridinedicarboxylic acid from a culture supernatant or a reaction aqueous solution supernatant of the cells, For producing 2,6-pyridinedicarboxylic acid. (7) A chelating agent containing 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof, wherein the chelating agent has a biodegradability of 98% or more. (8) A chelating agent containing the above 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof. (9) A chelating agent containing 2,6-pyridinedicarboxylic acid obtained by the above production method.
【００１０】から構成されるものである。[0010]
【００１１】[0011]
【発明の実施の形態】以下、本発明に関し詳細に説明す
る。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described below in detail.
【００１２】本発明において提供される2,6-ピリジンジ
カルボン酸またはその塩は、実質的にアルキルピリジン
を不純物として含まないものであり、アルキルピリジン
の含有量が２重量％以下のものである。さらに好ましく
は、含有量が０．５重量％以下のものである。The 2,6-pyridinedicarboxylic acid or salt thereof provided in the present invention does not substantially contain alkylpyridine as an impurity, and has a content of alkylpyridine of 2% by weight or less. More preferably, the content is 0.5% by weight or less.
【００１３】アルキルピリジンとは、例えば、2,6-ジメ
チルピリジンや6-メチル-2-ピリジンカルボン酸、3,5-
ジメチルピリジン、5-メチル-3-ピリジンカルボン酸、
2,5-ジメチルピリジン、5-メチル-2-ピリジンカルボン
酸などが挙げられる。これら、アルキルピリジンは生分
解性が悪く、環境に放出された場合は土壌、河川、湖沼
などに蓄積しやすく、環境保護の観点から好ましくな
い。しかしながら、従来、工業的に生産されていた2,6-
ピリジンジカルボン酸には、微量ながらアルキルピリジ
ンが不純物として含まれている。従って、従来の2,6-ピ
リジンジカルボン酸を大量に使用した場合、これら不純
物が蓄積することで環境に悪影響を及ぼすことが懸念さ
れる。Alkylpyridine is, for example, 2,6-dimethylpyridine, 6-methyl-2-pyridinecarboxylic acid, 3,5-
Dimethylpyridine, 5-methyl-3-pyridinecarboxylic acid,
Examples thereof include 2,5-dimethylpyridine and 5-methyl-2-pyridinecarboxylic acid. These alkylpyridines have poor biodegradability, and when released into the environment, tend to accumulate in soil, rivers, lakes and marshes, and are not preferred from the viewpoint of environmental protection. However, conventionally, 2,6-
The pyridine dicarboxylic acid contains a small amount of alkylpyridine as an impurity. Therefore, when a large amount of conventional 2,6-pyridinedicarboxylic acid is used, there is a concern that the accumulation of these impurities may adversely affect the environment.
【００１４】2,6-ピリジンジカルボン酸またはその塩に
含まれるアルキルピリジンは、ＨＰＬＣなどを用いて簡
便に定量することができる。例えば、カラムとしてＴＳ
Ｋ-ｇｅｌＯＤＳ-８０ＴＭ（東ソー社製）、溶離液とし
て０.１％リン酸と０.１％トリエチルアミンを含む水と
０.１％リン酸と０.１％トリエチルアミンを含むメタノ
ールを８５：１０に混合した溶液を用いて、検出波長２
５４ｎｍ、流速１ｍｌ／分の条件で分析することで、2,
6-ピリジンジカルボン酸中の含量が０.０５％以上のア
ルキルピリジンを定量することができる。すなわち、本
発明のアルキルピリジンの含有量が２重量％以下の2,6-
ピリジンジカルボン酸またはその塩とは、2,6-ピリジン
ジカルボン酸またはその塩の粉末がすべて溶解する適切
な溶媒に溶解した後、ＨＰＬＣなどの分析によって２重
量％を越えるアルキルピリジンを含まないようなものを
いう。The alkylpyridine contained in 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof can be easily quantified by using HPLC or the like. For example, TS as a column
K-gel ODS-80TM (manufactured by Tosoh Corporation), water containing 0.1% phosphoric acid and 0.1% triethylamine and methanol containing 0.1% phosphoric acid and 0.1% triethylamine were used as eluents at a ratio of 85:10. Using the mixed solution, detection wavelength 2
By analyzing under the conditions of 54 nm and a flow rate of 1 ml / min, 2,
Alkyl pyridine whose content in 6-pyridine dicarboxylic acid is 0.05% or more can be determined. That is, when the content of the alkylpyridine of the present invention is 2% by weight or less,
Pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof is such that after dissolving in a suitable solvent in which all the powder of 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof dissolves, it does not contain alkylpyridine exceeding 2% by weight by analysis such as HPLC. A thing.
【００１５】また、本発明は生分解性の高い不純物を含
む2,6-ピリジンジカルボン酸またはその塩を提供する。
生分解性の高い不純物とは例えば、アミノ酸、核酸、タ
ンパク質、多糖など、天然に生産されているような物質
は、本来生分解性が良好であることから、不純物として
含まれてもかまわない。これらの不純物は、安価に製造
する目的で簡便な精製法を採用することによって含まれ
ることもあるし、また、2,6-ピリジンジカルボン酸また
はその塩を用いる用途に応じて、安定性を付与したり機
能を向上させる目的のために人為的に添加されることも
あり得る。[0015] The present invention also provides 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof containing impurities having high biodegradability.
The naturally biodegradable impurities include, for example, naturally produced substances, such as amino acids, nucleic acids, proteins, and polysaccharides, because they have good biodegradability by nature, and may be included as impurities. These impurities may be included by adopting a simple purification method for the purpose of inexpensive production, or impart stability depending on the use of 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof. It may also be added artificially for the purpose of improving the function or function.
【００１６】特に、バリン、アラニンなどのアミノ酸、
α-ケトグルタル酸、コハク酸、乳酸などの有機酸や2,3
-ジヒドロジピコリン酸などは、2,6-ピリジンジカルボ
ン酸のキレート作用を妨害することもなく、またこれら
が含まれることは、安価な2,6-ピリジンジカルボン酸の
製造を容易にすることができることが考えられる。本明
で提供される2,6-ピリジンジカルボン酸に含まれ得るア
ミノ酸、有機酸、核酸、タンパク質、多糖などの定量
は、それぞれの化合物に応じた適切な定量法を採用する
ことで実施可能である。例えば、バリン、アラニンなど
のアミノ酸は、全自動アミノ酸分析計（日本電子製）を
用いて測定することができる。有機酸はＨＰＬＣで定量
可能であるし、核酸は加水分解後にＨＰＬＣを用いて定
量することができる。タンパク質はローリー法、多糖は
アンズロン硫酸法などによって定量することができる。In particular, amino acids such as valine and alanine;
Organic acids such as α-ketoglutaric acid, succinic acid, lactic acid and 2,3
-Dihydrodipicolinic acid does not interfere with the chelating action of 2,6-pyridinedicarboxylic acid, and the inclusion of these can facilitate the production of inexpensive 2,6-pyridinedicarboxylic acid Can be considered. The quantification of amino acids, organic acids, nucleic acids, proteins, polysaccharides, etc. that can be contained in the 2,6-pyridinedicarboxylic acid provided in the present invention can be performed by employing an appropriate quantification method according to each compound. is there. For example, amino acids such as valine and alanine can be measured using a fully automatic amino acid analyzer (manufactured by JEOL). Organic acids can be quantified by HPLC, and nucleic acids can be quantified by HPLC after hydrolysis. The protein can be quantified by the Lowry method, and the polysaccharide can be quantified by the azuron sulfate method.
【００１７】本発明の２，６−ピリジンジカルボン酸は
アルキルピリジンの含有量が少なく、かつ、バリン、ア
ラニン、α-ケトグルタル酸のいずれか一つを不純物と
して含むものが好ましい。The 2,6-pyridinedicarboxylic acid of the present invention preferably has a low alkylpyridine content and contains any one of valine, alanine and α-ketoglutaric acid as impurities.
【００１８】本発明の２，６−ピリジンジカルボン酸の
塩としては、ナトリウム塩などのアルカリ金属塩、カル
シウム塩などがあげられる。The salt of 2,6-pyridinedicarboxylic acid of the present invention includes alkali metal salts such as sodium salt, calcium salt and the like.
【００１９】本発明で提供する2,6-ピリジンジカルボン
酸またはその塩の製造方法には、特に制限はないが、微
生物を用いた発酵法あるいは微生物菌体を用いた菌体反
応法で製造することが好ましい。本発明の2,6-ピリジン
ジカルボン酸を製造する目的で使用される微生物には以
下のようなものがある。The method for producing 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof provided in the present invention is not particularly limited, but is produced by a fermentation method using a microorganism or a cell reaction method using a microorganism cell. Is preferred. Microorganisms used for producing 2,6-pyridinedicarboxylic acid of the present invention include the following.
【００２０】一つは、胞子を形成する能力がない微生物
で、かつ、2,6-ピリジンジカルボン酸を菌体外に分泌す
る能力のある微生物である。こうした微生物は、例え
ば、胞子を形成する能力がない微生物を親株として、通
常の変異処理によって得られる2,6-ピリジンジカルボン
酸を分泌する能力を持つ変異株を分離することで得られ
る。変異株の誘導は、親株を紫外線照射するか、あるい
は変異誘発剤（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸等）で
処理した後、天然培地などの良好に生育する寒天培地で
純化した後、良好に生育する培地を用いて培養した培養
上清中の2,6-ピリジンジカルボン酸を定量し、有意に2,
6-ピリジンジカルボン酸を培養上清中に蓄積する変異株
を選抜することによって得ることができる。また、2,6-
ピリジンジカルボン酸を分泌する変異株は、変異処理し
た菌体を、十分量の鉄イオンを含む最少培地に塗布し、
生じたコロニーのうち赤く着色したものを選ぶことによ
っても得ることができる。One is a microorganism having no ability to form spores and having the ability to secrete 2,6-pyridinedicarboxylic acid outside the cells. Such a microorganism can be obtained, for example, by isolating a mutant strain capable of secreting 2,6-pyridinedicarboxylic acid obtained by ordinary mutagenesis using a microorganism having no ability to form spores as a parent strain. Mutants can be induced by irradiating the parent strain with ultraviolet light or by using a mutagen (eg, N-methyl-N'-nitro-N
-Nitrosoguanidine, ethyl methanesulfonic acid, etc.), and then purified on a well-growing agar medium such as a natural medium, and then cultured in a well-growing medium. Dicarboxylic acid was quantified and significantly
It can be obtained by selecting a mutant strain that accumulates 6-pyridinedicarboxylic acid in the culture supernatant. Also, 2,6-
Mutants that secrete pyridinedicarboxylic acid apply the mutated cells to a minimal medium containing a sufficient amount of iron ions,
It can also be obtained by selecting red colonies among the resulting colonies.
【００２１】ここで、胞子を形成する能力のない微生物
としては、エシェリヒア（Escherichia）属、ブレビバ
クテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム
（Corynebacterium）属、プロビデンシア（Providenci
a）属、セラチア（Serratia）属などがあげられ、とく
に、エシェリヒア（Escherichia）属、ブレビバクテリ
ウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム（Coryne
bacterium）属が好ましい。Here, microorganisms having no ability to form spores include genus Escherichia, genus Brevibacterium, genus Corynebacterium, and Providencia.
a) genus, Serratia genus, etc., in particular, Escherichia genus, Brevibacterium genus, Corynebacterium (Coryne)
bacterium) is preferred.
【００２２】二つ目の微生物は、生育にリジンまたはリ
ジン生合成系中間体を要求し、かつ、2,6-ピリジンジカ
ルボン酸を産生する能力を有する微生物である。ここ
で、リジンまたはリジン生合成中間体に対する要求性と
は、いわゆるリーキータイプの要求性株も含むものであ
る。こうした微生物は、親株を上記のように通常の変異
処理をした後、通常の栄養要求性変異株の取得方法に従
って得ることができる。すなわち、変異処理した菌体を
天然培地などの良好に生育する寒天培地上でコロニーを
形成させる。これらコロニーを、リジンまたはリジン生
合成系中間体を含む最少寒天培地とリジンまたはリジン
生合成系中間体を含まない最少寒天培地にレプリカす
る。リジンまたはリジン生合成系中間体を含む最少培地
上にのみ生育するコロニーを取得することによって、リ
ジンまたはリジン生合成系中間体を生育に要求する変異
株を得ることができる。得られたリジンまたはリジン生
合成系中間体要求性変異株を純化した後、良好に生育す
る培地を用いて培養した培養上清中の2,6-ピリジンジカ
ルボン酸を定量し、親株より有意に2,6-ピリジンジカル
ボン酸を培養上清中に蓄積する変異株を選抜することに
よって得ることができる。The second microorganism is a microorganism that requires lysine or a lysine biosynthetic intermediate for growth and has the ability to produce 2,6-pyridinedicarboxylic acid. Here, the requirement for lysine or a lysine biosynthesis intermediate includes so-called leaky-type requirement strains. Such a microorganism can be obtained by subjecting the parent strain to the usual mutagenesis treatment as described above, and then following the usual method for obtaining an auxotrophic mutant. That is, the mutated cells are allowed to form colonies on a well-growing agar medium such as a natural medium. These colonies are replicated on a minimal agar medium containing lysine or a lysine biosynthetic intermediate and a minimal agar medium containing no lysine or a lysine biosynthetic intermediate. By obtaining a colony that grows only on a minimal medium containing lysine or a lysine biosynthetic intermediate, a mutant strain that requires lysine or a lysine biosynthetic intermediate for growth can be obtained. After purifying the resulting lysine or lysine biosynthesis intermediate-requiring mutant, the 2,6-pyridinedicarboxylic acid in the culture supernatant cultured using a medium that grows well is quantified, and is significantly more significant than the parent strain. It can be obtained by selecting a mutant strain that accumulates 2,6-pyridinedicarboxylic acid in the culture supernatant.
【００２３】ここで、生育にリジンまたはリジン生合成
系中間体を要求する微生物として、ジヒドロジピコリン
酸レダクターゼ（EC1.3.1.26）が、欠損、変異または破
壊された微生物を用いることができる。Here, as a microorganism that requires lysine or a lysine biosynthetic intermediate for growth, a microorganism in which dihydrodipicolinate reductase (EC1.3.1.26) is deficient, mutated, or destroyed can be used.
【００２４】生育にリジンまたはリジン生合成系中間体
を要求し、かつ2,6-ピリジンジカルボン酸を産生する能
力を有する微生物としては、特に制限はないが、エシェ
リヒア（Escherichia）属、ブレビバクテリウム(Brevib
acterium)属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）
属、バシラス(Bacillus)属、プロビデンシア（Providen
cia）属、セラチア（Serratia）属、ペニシリウム（Pen
icillium）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属
に属する微生物のうちいずれか一つの微生物を使用する
ことが工業的に有利である。Microorganisms that require lysine or a lysine biosynthetic intermediate for growth and that have the ability to produce 2,6-pyridinedicarboxylic acid are not particularly limited, but microorganisms of the genus Escherichia, Brevibacterium (Brevib
acterium), Corynebacterium
Genus, Bacillus, Providencia
cia), Serratia, Penicillium (Pen)
It is industrially advantageous to use any one of the microorganisms belonging to the genus Icillium or Saccharomyces.
【００２５】３つ目は、ジヒドロジピコリン酸レダクタ
ーゼ（EC1.3.1.26）が、欠損、変異または破壊された微
生物である。当該酵素の欠損、変異または破壊は、上記
に述べた変異処理によって行うこともできるが、遺伝子
組換え技術を用いて行うことでより的確に実施できる。
すなわち、目的とする微生物のジヒドロジピコリン酸レ
ダクターゼをコードする遺伝子を通常の分子生物学的手
法によってクローニングした後、その遺伝子に対して人
為的に欠損または変異を導入する。この変異の導入は、
制限酵素やＤＮＡ修飾酵素を使用した遺伝子配列の欠損
や異種遺伝子の挿入、亜硝酸などの変異剤による変異の
導入、ＰＣＲを用いた変異の導入などによって実施する
ことができる。こうして改変されたジヒドロジピコリン
酸レダクターゼをコードする遺伝子は、通常形質転換に
使用されるベクターに挿入し、通常の方法によって、目
的の微生物に形質転換される。得られた形質転換体のう
ちから、改変されたジヒドロジピコリン酸レダクターゼ
をコードする遺伝子が、染色体ＤＮＡに組み込まれた組
換え体を選出することによって、ジヒドロジピコリン酸
レダクターゼ（EC1.3.1.26）が、欠損、変異または破壊
された微生物を得ることができる。形質転換に使用でき
るベクターとしては、例えばｐＵＣ１８，ｐＨＳＧ３９
８などが挙げられ、その他、温度感受性のプラスミド、
レプリコンを欠損させた環状ＤＮＡなどを用いることも
できる。ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードす
る遺伝子が、染色体ＤＮＡに組み込まれた組換え体を選
出するのを容易にする目的で、ある種のマーカー遺伝子
を利用することが好適である。例えば、クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子
を、改変したジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコー
ドする遺伝子の５’末端と３’末端の間に挿入し、通常
のベクターに連結する。得られたプラスミドを、目的の
微生物に形質転換し、クロラムフェニコール耐性の組換
え体を得ることによって、ヒドロジピコリン酸レダクタ
ーゼ（EC1.3.1.26）が、欠損、変異または破壊された微
生物を容易に得ることができる。The third is a microorganism in which dihydrodipicolinate reductase (EC1.3.1.26) is deleted, mutated or destroyed. Deletion, mutation, or destruction of the enzyme can be performed by the above-described mutation treatment, but can be performed more accurately by using a gene recombination technique.
That is, after a gene encoding dihydrodipicolinate reductase of a microorganism of interest is cloned by a usual molecular biological technique, a deletion or mutation is artificially introduced into the gene. The introduction of this mutation
Deletion of a gene sequence using a restriction enzyme or a DNA modifying enzyme, insertion of a heterologous gene, introduction of a mutation using a mutagen such as nitrite, introduction of a mutation using PCR, and the like can be performed. The gene encoding the thus-modified dihydrodipicolinate reductase is inserted into a vector usually used for transformation, and transformed into a target microorganism by a usual method. From the obtained transformants, a dihydrodipicolinate reductase (EC1.3.1.26) was obtained by selecting a recombinant in which the gene encoding the modified dihydrodipicolinate reductase was integrated into chromosomal DNA. , Deficient, mutated or disrupted microorganisms can be obtained. Vectors that can be used for transformation include, for example, pUC18, pHSG39
8 and the like, and other temperature-sensitive plasmids,
A circular DNA lacking a replicon or the like can also be used. For the purpose of facilitating selection of a recombinant in which a gene encoding dihydrodipicolinate reductase has been integrated into chromosomal DNA, it is preferable to use a certain marker gene. For example, a gene encoding chloramphenicol acetyltransferase is inserted between the 5 'end and the 3' end of a gene encoding a modified dihydrodipicolinate reductase, and ligated to an ordinary vector. By transforming the obtained plasmid into a microorganism of interest and obtaining a chloramphenicol-resistant recombinant, a microorganism in which hydrodipicolinate reductase (EC1.3.1.26) is deleted, mutated or destroyed is transformed. Can be easily obtained.
【００２６】ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（EC1.
3.1.26）が、欠損、変異または破壊された微生物として
は、特に制限はないが、エシェリヒア（Escherichia）
属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバ
クテリウム（Corynebacterium）属、バシラス(Bacillu
s)属、プロビデンシア（Providencia）属、セラチア（S
erratia）属、ペニシリウム（Penicillium）属、サッカ
ロマイセス（Saccharomyces）属に属する微生物のうち
いずれか一つの微生物を使用することが工業的に有利で
ある。Dihydrodipicolinate reductase (EC1.
3.1.26), although there is no particular limitation on the microorganism that has been deleted, mutated or destroyed, Escherichia
Genus, Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus
s), Providencia, Serratia (S
It is industrially advantageous to use any one of microorganisms belonging to the genus Erratia, Penicillium, or Saccharomyces.
【００２７】４つ目は、ジピコリネートシンターゼ（di
picolinate synthase)をコードする遺伝子を導入した形
質転換体である。ジピコリネートシンターゼ（dipicoli
natesynthase)をコードする遺伝子は、通常の遺伝子工
学的手法を用いて得ることができるが、例えば、ジピコ
リネートシンターゼ（dipicolinate synthase)をコード
する遺伝子配列を元に設計したプライマーを用いてポリ
メラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによ
って得ることができる。得られたジピコリネートシンタ
ーゼ（dipicolinate synthase)をコードする遺伝子は、
通常に用いられる発現ベクターに連結した後、2,6-ピリ
ジンジカルボン酸を分泌する能力を持つ微生物に導入さ
れる。得られた形質転換体は、2,6-ピリジンジカルボン
酸を産生する能力獲得するか、または、その生産性が向
上する。ジピコリネートシンターゼ（dipicolinate syn
thase)をコードする遺伝子のリボゾーム結合配列より上
流側に、強いまたは構成的に作用するプロモーター領域
を結合させる構造を構築することで、2,6-ピリジンジカ
ルボン酸を産生する能力をさらに向上させることができ
る。The fourth is dipicolinate synthase (di
It is a transformant into which a gene encoding picolinate synthase has been introduced. Dipicolinate synthase
The gene encoding natesynthase can be obtained using ordinary genetic engineering techniques. For example, a polymerase chain reaction using a primer designed based on the gene sequence encoding dipicolinate synthase can be used. (Hereinafter abbreviated as PCR). The resulting gene encoding dipicolinate synthase,
After ligation to a commonly used expression vector, it is introduced into a microorganism capable of secreting 2,6-pyridinedicarboxylic acid. The obtained transformant acquires the ability to produce 2,6-pyridinedicarboxylic acid or has an improved productivity. Dipicolinate synthase
thase) to further enhance the ability to produce 2,6-pyridinedicarboxylic acid by constructing a structure that binds a strong or constitutively acting promoter region upstream of the ribosome binding sequence of the gene encoding Can be.
【００２８】ジピコリネートシンターゼ（dipicolinate
synthase)をコードする遺伝子を導入した形質転換体と
しては、エシェリヒア（Escherichia）属、ブレビバク
テリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム（Co
rynebacterium）属、バシラス(Bacillus)属、プロビデ
ンシア（Providencia）属、セラチア（Serratia）属、
ペニシリウム（Penicillium）属、サッカロマイセス（S
accharomyces）属に属する微生物のうちいずれか一つの
微生物を使用することが工業的に有利である。Dipicolinate synthase (dipicolinate)
Transformants into which a gene encoding synthase has been introduced include Escherichia, Brevibacterium, and Corynebacterium (Co).
rynebacterium), Bacillus, Providencia, Serratia,
Penicillium, Saccharomyces (S
It is industrially advantageous to use any one of the microorganisms belonging to the genus Accharomyces.
【００２９】上記４つの微生物が示す性質を組み合わせ
ることで、さらに2,6-ピリジンジカルボン酸を生産性高
く製造することが可能となる。具体的には、例えば、胞
子を形成する能力がなく、かつ、２，６−ピリジンジカ
ルボン酸を産生する能色を有する微生物、または、生育
にリジンまたはリジン生合成系中間体を要求し、かつ、
２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する
微生物の、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼを欠損、
変異、または破壊した微生物、あるいは、これらの微生
物にジピコリネートシンターゼをコードする遺伝子を導
入した微生物などは、より好ましく２，６−ピリジンジ
カルボン酸の生産に使用することができる。By combining the properties of the above four microorganisms, it becomes possible to produce 2,6-pyridinedicarboxylic acid with high productivity. Specifically, for example, a microorganism having no ability to form spores and having the ability to produce 2,6-pyridinedicarboxylic acid, or requiring lysine or a lysine biosynthetic intermediate for growth, and ,
A microorganism capable of producing 2,6-pyridinedicarboxylic acid, deficient in dihydrodipicolinate reductase,
Mutated or disrupted microorganisms, or microorganisms into which a gene encoding dipicolinate synthase has been introduced, can more preferably be used for the production of 2,6-pyridinedicarboxylic acid.
【００３０】本発明で用いる微生物を増殖させる方法に
特に制限はないが、通常の微生物の培養方法を用いるこ
とができる。すなわち、使用する培地は、炭素源、窒素
源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含む
通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ラク
トース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんおよび
セルロースの加水分解物、糖蜜などの糖類、グリセロー
ル、エタノール、ソルビトールなどのアルコール類、フ
マール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸を用いること
ができる。窒素源として硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、
大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アン
モニア水、尿素などを用いることができる。有機微量栄
養源として、ビタミン類、アミノ酸などの要求物質、ま
たは、必要に応じて酵母エキス、コーンスティープリカ
ーなどを含有させることが望ましい。これらの他に、必
要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化
カルシウム、塩化ナトリウム、銅イオン、鉄イオン、マ
ンガンイオンなどを添加することが望ましい。場合によ
っては、消泡剤なども添加される。The method of growing the microorganism used in the present invention is not particularly limited, but a usual microorganism culturing method can be used. That is, the medium to be used is an ordinary medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic components as required. As a carbon source, glucose, lactose, galactose, fructose, starch and cellulose hydrolysates, sugars such as molasses, glycerol, ethanol, alcohols such as sorbitol, fumaric acid, citric acid, and organic acids such as succinic acid are used. be able to. Inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate as a nitrogen source,
Organic nitrogen such as soybean hydrolyzate, ammonia gas, aqueous ammonia, and urea can be used. It is desirable to include required substances such as vitamins and amino acids, or yeast extract, corn steep liquor and the like as necessary as organic trace nutrients. In addition to these, it is desirable to add potassium phosphate, magnesium sulfate, calcium chloride, sodium chloride, copper ions, iron ions, manganese ions, and the like, if necessary. In some cases, an antifoaming agent or the like is also added.
【００３１】培養は、振盪または通気撹拌によって通常
好気条件で１６から１２０時間行うのが好ましい。培養
の間ｐＨは４〜８に、培養温度は２０℃から４５℃に制
御する。尚、ｐＨ調整には、無機あるいは有機の酸性あ
るいはアルカリ性物質、更にアンモニアガスなどを使用
することができる。The cultivation is preferably carried out by shaking or aeration under aerobic conditions for 16 to 120 hours. During the cultivation, the pH is controlled at 4 to 8 and the culturing temperature is controlled at 20 to 45 ° C. For pH adjustment, an inorganic or organic acidic or alkaline substance, furthermore, ammonia gas or the like can be used.
【００３２】上記のように増殖させた微生物を、アスパ
ラギン酸またはピルビン酸の少なくとも一つを含む水溶
液中に懸濁させることで2,6-ピリジンジカルボン酸を産
生させることも可能である。この時、エネルギー源とし
て上記培地に添加されるような物質を共存させることで
さらに効率よく2,6-ピリジンジカルボン酸を産生させる
ことが可能である。It is also possible to produce 2,6-pyridinedicarboxylic acid by suspending the microorganism grown as described above in an aqueous solution containing at least one of aspartic acid and pyruvic acid. At this time, it is possible to produce 2,6-pyridinedicarboxylic acid more efficiently by coexisting a substance added to the medium as an energy source.
【００３３】本発明の微生物の培養上清または反応上清
液から、2,6-ピリジンジカルボン酸を単離採取するには
公知の方法を組み合わせることで実施できる。例えば、
イオン交換樹脂による吸脱着、晶析による固液分離、膜
処理による不純物の除去などを組み合わせることで、容
易に2,6-ピリジンジカルボン酸の結晶または沈殿を得る
ことができる。From the culture supernatant or reaction supernatant of the microorganism of the present invention, 2,6-pyridinedicarboxylic acid can be isolated and collected by a combination of known methods. For example,
By combining adsorption and desorption with an ion exchange resin, solid-liquid separation by crystallization, and removal of impurities by membrane treatment, a crystal or precipitate of 2,6-pyridinedicarboxylic acid can be easily obtained.
【００３４】ここで、イオン交換樹脂処理などによって
得られた２，６−ピリジンジカルボン酸を含有する溶液
に目的に応じた量のアルカリを添加することで、２，６
−ピリジンジカルボン酸の塩を得ることができる。具体
的には、ＮａＯＨを添加することにより、２，６−ピリ
ジンジカルボン酸ナトリウム塩を得ることができる。Here, 2,6 pyridinedicarboxylic acid-containing solution obtained by ion-exchange resin treatment or the like is added with a desired amount of alkali to add 2,6-pyridinedicarboxylic acid.
A salt of pyridinedicarboxylic acid can be obtained. Specifically, 2,6-pyridinedicarboxylic acid sodium salt can be obtained by adding NaOH.
【００３５】本発明の２，６−ピリジンジカルボン酸ま
たはその塩、あるいは本発明の方法で得られる２，６−
ピリジンジカルボン酸またはその塩を用いることで、生
分解性に優れたキレート剤が得られる。キレート剤の生
分解性は、「新規化学物質等に係わる試験方法について
（環保業５号・薬発第６１５号・４９基局第３９２
号）」に従って測定する。本発明の２，６−ピリジンジ
カルボン酸またはその塩を含むキレート剤の生分解性は
９８％以上である。The 2,6-pyridinedicarboxylic acid of the present invention or a salt thereof, or the 2,6-pyridinedicarboxylic acid obtained by the method of the present invention.
By using pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof, a chelating agent excellent in biodegradability can be obtained. The biodegradability of a chelating agent can be determined by the method described in “Testing methods for new chemical substances, etc.
No.)). The biodegradability of the chelating agent containing 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof of the present invention is 98% or more.
【００３６】得られた2,6-ピリジンジカルボン酸または
その塩は、優れたキレート能を持っており様々な用途に
使用可能である。特に、本発明の2,6-ピリジンジカルボ
ン酸は、含まれる不純物も生分解性があることに特徴が
あることから、大量に使用されその一部が環境に排出さ
れる可能性のある様な用途で使用する際に高い価値を持
つ。The obtained 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof has excellent chelating ability and can be used for various uses. In particular, the 2,6-pyridinedicarboxylic acid of the present invention is characterized in that the impurities contained therein are also biodegradable, so that it is used in large quantities and some of them may be discharged to the environment. It has high value when used in applications.
【００３７】例えば、繊維工業における洗浄・漂白・染
色工程で、繊維の損傷や染めムラ、色あせ防止の目的
で、使用する水に含まれる金属の遮蔽剤として使用する
ことができる。また、紙パルプ工業においては、漂白工
程においてピッチトラブルや紙の変色防止のためにも使
用できる。さらに、洗剤に添加することで、その洗浄効
果を高めることができる。ボイラーやクーリングタワー
の洗浄においては、スケール防止剤として使用できる。
写真現像においても、定着液に添加することで写真感光
材料の仕上がりを改善することができる。また、写真工
業において排出される銀イオンを補足する目的でも使用
できる。For example, in the washing, bleaching and dyeing processes in the textile industry, it can be used as a shielding agent for metals contained in water used for the purpose of preventing fiber damage, uneven dyeing and fading. In the pulp and paper industry, it can also be used in the bleaching process to prevent pitch trouble and discoloration of paper. Furthermore, by adding to the detergent, the cleaning effect can be enhanced. It can be used as a scale inhibitor in washing boilers and cooling towers.
Also in photographic development, the finish of a photographic light-sensitive material can be improved by adding it to a fixing solution. It can also be used to supplement silver ions emitted in the photographic industry.
【００３８】本発明の2,6-ピリジンジカルボン酸または
その塩は、担体に結合させても構わない。担体として
は、有機系と無機系があるが、有機系担体としては、天
然由来として、アガロース、デキストラン、セルロース
などがあり、合成高分子として、ポリスチレン、ポリア
クリルアミドなどがある。無機系担体としては、多孔性
シリカゲル、アルミナ、ゼオライト、モンモリナイトが
挙げられる。[0038] The 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof of the present invention may be bound to a carrier. Carriers include organic and inorganic carriers. Organic carriers include agarose, dextran, and cellulose as natural sources, and polystyrene and polyacrylamide as synthetic polymers. Examples of the inorganic carrier include porous silica gel, alumina, zeolite, and montmorillonite.
【００３９】これら、担体に2,6-ピリジンジカルボン酸
またはその塩を担持する場合は、担体表面を化学的に修
飾して直接結合させてもよいが、担体と2,6-ピリジンジ
カルボン酸の間にスペーサー的な役割を持ったものを導
入しても良い。When 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof is supported on the carrier, the surface of the carrier may be chemically modified and directly bonded thereto. A spacer having a role as a spacer may be introduced therebetween.
【００４０】こうした担体は、円筒形の容器に充填さ
れ、固定床の分離カラムとして使用できる。例えば、銀
イオンなどの処理では、二本以上のカラムを並列に配列
し、一方で銀を補足している間、他のカラムで銀を脱離
処理して再生を行うことで、連続的に処理を行うことも
できる。Such a carrier is packed in a cylindrical vessel and can be used as a fixed-bed separation column. For example, in the treatment of silver ions, etc., two or more columns are arranged in parallel, while while supplementing silver, silver is desorbed in another column and regeneration is performed, thereby continuously Processing can also be performed.
【００４１】こうして得られた2,6-ピリジンジカルボン
酸またはその塩を、キレート剤として写真処理剤、各種
洗浄剤に用いることで、大量に使用した場合でも環境に
悪影響を与えることがなくなる。By using the thus obtained 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof as a chelating agent in a photographic processing agent or various cleaning agents, even when used in a large amount, there is no adverse effect on the environment.
【００４２】[0042]
【実施例】以下に本発明を実施例を持って説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples.
The present invention is not limited to these.
【００４３】実施例１ （ジヒドロジピコリン酸レダク
ターゼ（EC1.3.1.26）が欠損した微生物の作製） ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibact
erium lactofermentum）のジヒドロジピコリン酸レダク
ターゼの遺伝子配列（参考文献１）を参考に、5'-ＧＣ
ＴＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＴＧＧＧＣＧＴＴＴＧＡＡＡＡ
ＡＣＴ-3'（配列番号：１）と5'-ＧＣＴＡＡＧＣＴＴＣ
ＡＣＧＣＴＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＧＣＴＣＡＡＴ-3'
（配列番号：２）の２種類のプライマ−を合成した。上
記各プライマ−を２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８.０）、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２５ｍＭ
ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラチン、５０μＭ各ｄＮ
ＴＰ、４単位ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラ−ゼ（宝酒造
（株）製）となるように各試薬を加え、全量１００μｌ
とした。Brevibacterium lactofermentum ATCC13869の
菌体を少量反応液に加えた後、ＤＮＡの変性条件を９４
℃，１分、プライマ−のアニ−リング条件を５５℃、２
分、プライマ−の伸長条件を７２℃、３分の各条件で、
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−
マルサイクラ−を用い、３０サイクル反応させた。これ
を１％アガロ−スゲルにて電気泳動し、約８９０ｂｐの
ジヒドロジピコリン酸レダクターゼの遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を常法（文献２）に従って調製した。Example 1 (Preparation of microorganism deficient in dihydrodipicolinate reductase (EC 1.3.1.26)) Brevibacterium lactofermentum (Brevibactam)
5′-GC with reference to the gene sequence of dihydrodipicolinate reductase of E. erium lactofermentum (Reference 1).
TTCTAGACTGGGTGGGCGTTTGAAAA
ACT-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5'-GCTAAGCTTC
ACGCTATCAACTCCACGCCTCAAT-3 '
Two types of primers (SEQ ID NO: 2) were synthesized. 20 pmol of each of the above primers, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 1.5 mM MgCl 2 , 25 mM
KCl, 100 μg / ml gelatin, 50 μM each dN
TP, 4 units ExTaq DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.).
And After adding a small amount of cells of Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 to the reaction solution, the DNA
For 1 minute at 55 ° C. for 2 minutes.
And primer extension conditions at 72 ° C. for 3 minutes.
Perkin-Elmer Cetus DNA
The reaction was carried out for 30 cycles using a Marcycler. This was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA containing a dihydrodipicolinate reductase gene of about 890 bp was obtained.
The A fragment was prepared according to a conventional method (Reference 2).
【００４４】このＤＮＡ断片を、制限酵素ＸｂａＩおよ
びＨｉｎｄIIIで制限酵素処理し、ｐＵＣ１８（宝酒造
（株）製）のＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII部位へ常法に従い
挿入し、組換えプラスミドｐＤＡＰ１を得た。This DNA fragment was treated with restriction enzymes XbaI and HindIII, and inserted into pUC18 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) at the XbaI-HindIII site according to a conventional method to obtain a recombinant plasmid pDAP1.
【００４５】次に、クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼの遺伝子配列（文献３）を参考に、5'-
ＡＣＧＧＴＣＧＡＣＴＣＧＣＡＧＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡ
ＴＣＣＴＧＧＴＧ-3'（配列番号：３）と5'-ＡＴＧＡＧ
ＧＣＣＴＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＧ
Ａ-3'（配列番号：４）の２種類のプライマ−を合成し
た。Next, referring to the gene sequence of chloramphenicol acetyltransferase (Reference 3), 5′-
ACGGTCCGACTCGCAGAATAAAATAAA
TCCTGGTG-3 '(SEQ ID NO: 3) and 5'-ATGAG
GCCTGAGAGGCGGTTTGCGTATTGG
Two types of primers of A-3 ′ (SEQ ID NO: 4) were synthesized.
【００４６】プラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造（株）
製）の溶液を０．５ｍｌのミクロ遠心チュ−ブに２μｌ
づつ取り、各プライマ−を２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、
２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラチン、５０μ
Ｍ各ｄＮＴＰ、４単位 ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラ−ゼ
（宝酒造（株）製）となるように各試薬を加え、全量１
００μｌとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プ
ライマ−のアニ−リング条件を５５℃、２分、プライマ
−の伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−
Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−
を用い、３０サイクル反応させた。これを１％アガロ−
スゲルにて電気泳動し、クロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ遺伝子を含む約９７０ｂｐのＤＮＡ
断片を、常法（文献２）に従って調製した。得られたＤ
ＮＡ断片を、ＳａｌＩとＳｔｕＩで制限酵素処理したの
ち、１％アガロ−スゲルにて電気泳動し、ＤＮＡ断片Ｃ
ＡＴ/ＳａｌＩ,ＳｔｕＩを得た。また、上記ｐＤＡＰ１
をＳａｌＩとＳｔｕＩで制限酵素処理したのち、１％ア
ガロ−スゲルにて電気泳動し、ベクター部分の約２.９
ＫｂｐのＤＮＡ断片ｐＤＡＰ/ＳａｌＩ,ＳｔｕＩを得
た。ＤＡＮ断片ＣＡＴ/ＳａｌＩ,ＳｔｕＩとＤＮＡ断片
ｐＤＡＰ/ＳａｌＩ,ＳｔｕＩを混合し、常法に従ってラ
イゲーションしたのち、大腸菌JM109 に形質転換した。
得られたアンピシリン耐性の形質転換体から、常法に従
ってプラスミドｐＤＰ- ＣＡＴ１を得た。Plasmid pHSG398 (Takara Shuzo Co., Ltd.)
2) in a 0.5 ml microcentrifuge tube.
Each primer was taken up at 20 pmol, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 1.5 mM MgCl 2 ,
25 mM KCl, 100 µg / ml gelatin, 50 µ
M Each dNTP, 4 units ExTaq DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.)
The volume was set to 00 μl. DNA denaturation conditions were 94 ° C for 1 minute, primer annealing conditions were 55 ° C for 2 minutes, and primer extension conditions were 72 ° C for 3 minutes.
Elmer Cetus DNA Thermal Cycler
The reaction was carried out for 30 cycles. 1% agaro
Approximately 970 bp DNA containing chloramphenicol acetyltransferase gene
The fragment was prepared according to a conventional method (Reference 2). D obtained
The NA fragment was treated with a restriction enzyme with SalI and StuI, followed by electrophoresis on a 1% agarose gel.
AT / SalI and StuI were obtained. In addition, the above pDAP1
Was treated with restriction enzymes SalI and StuI, and electrophoresed on a 1% agarose gel.
The Kbp DNA fragments pDAP / SalI and StuI were obtained. The DNA fragment CAT / SalI, StuI was mixed with the DNA fragment pDAP / SalI, StuI, ligated according to a conventional method, and transformed into Escherichia coli JM109.
Plasmid pDP-CAT1 was obtained from the obtained ampicillin-resistant transformant according to a conventional method.
【００４７】エレクトロポーレーション法を用いて、プ
ラスミドｐＤＰ−ＣＡＴ１を常法どおりにBrevibacteri
um lactofermentum ATCC13869 に導入し、形質転換体を
得た。Using the electroporation method, the plasmid pDP-CAT1 was transformed into Brevibacacteri as usual.
lactofermentum ATCC13869 to obtain a transformant.
【００４８】得られた形質転換体１０株を選び、表１に
示す最少平板培地と最少平板培地に１００ｍｇ/ｌのＬ-
リジンを加えたリジン添加最少平板培地に塗布し、３０
℃で３日間培養した。その結果、すべての形質転換体
は、リジン添加最少平板培地でのみ生育が認められた。
このことから得られた形質転換体がリジン要求性を有す
ることが確認できた。得られた形質転換体から１０株を
選び、Brevibacterium lactofermentum ＴＲ-ＤＡＰ１
からＴＲ-ＤＡＰ１０と命名した。The obtained 10 transformants were selected, and the minimum plate medium shown in Table 1 and 100 mg / l of L-
Apply to lysine-added minimal plate medium with lysine and add
C. for 3 days. As a result, all the transformants grew only on the minimal plate medium containing lysine.
This confirmed that the obtained transformant had lysine requirement. Ten strains were selected from the obtained transformants and Brevibacterium lactofermentum TR-DAP1
From TR-DAP10.
【００４９】また、エレクトロポーレーション法を用い
て、プラスミドｐＤＰ−ＣＡＴ１を常法どおりにCoryne
bacterium glutamicum ATCC13032 に導入し、形質転換
体を得た。得られた形質転換体１０株を選び、表１に示
す最少平板培地と１００ｍｇ/ｌのＬ-リジンを加えたリ
ジン添加最少平板培地に塗布し、３０℃で３日間培養し
た。その結果、すべての形質転換体は、リジン添加最少
平板培地でのみ生育が認められた。このことから得られ
た形質転換体がリジン要求性を有することが確認でき
た。得られた形質転換体から１０株を選び、Corynebact
erium glutamicumＴＲ-ＤＡＰ１からＴＲ-ＤＡＰ１０と
命名した。Further, the plasmid pDP-CAT1 was ligated with Coryne as usual by electroporation.
It was introduced into bacterium glutamicum ATCC13032 to obtain a transformant. The obtained 10 transformants were selected, applied to a minimal plate medium shown in Table 1 and a lysine-added minimal plate medium supplemented with 100 mg / l L-lysine, and cultured at 30 ° C. for 3 days. As a result, all the transformants grew only on the minimal plate medium containing lysine. This confirmed that the obtained transformant had lysine requirement. Ten strains were selected from the obtained transformants, and Corynebact
erium glutamicum were designated TR-DAP1 to TR-DAP10.
【００５０】[0050]
【表１】 [Table 1]
【００５１】実施例２ （2,6-ピリジンジカルボン酸の
生産その１） Brevibacterium lactofermentum ATCC13869（親株）と
実施例１で得られたBrevibacterium lactofermentumＴ
Ｒ-ＤＡＰ１からＴＲ-ＤＡＰ１０を、３ｍｌブイヨン培
地（ニッスイ製）に１白金耳量を植菌し、３０℃で一晩
振盪培養した。また、同様に、Corynebacterium glutam
icum ATCC13032（親株）とCorynebacterium glutamicum
ＴＲ-ＤＡＰ１から１０を、３ｍｌブイヨン培地（ニッ
スイ製）に１白金耳量を植菌し、３０℃で一晩振盪培養
した。得られた培養液を、５００ｍｌ容エーレンマイヤ
ーフラスコ中の2,6-ピリジンジカルボン酸生産培地（表
２）３０ｍｌに加え、３０℃で３日間回転振盪培養し
た。得られた培養液から、遠心分離（４℃、６,０００
ｒｐｍ）によって菌体を除去し、上清中の2,6-ピリジン
ジカルボン酸をＨＰＬＣで分析した結果を表３に示し
た。この表から分かるように、親株の培養上清には2,6-
ピリジンジカルボン酸は検出されなかったが、実施例１
で得られた形質転換体の培養上清すべてにおいて、2,6-
ピリジンジカルボン酸が検出された。Example 2 (Production of 2,6-pyridinedicarboxylic acid, part 1) Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 (parent strain) and Brevibacterium lactofermentum T obtained in Example 1
One loopful of R-DAP1 to TR-DAP10 was inoculated into a 3 ml broth medium (manufactured by Nissui) and cultured with shaking at 30 ° C. overnight. Similarly, Corynebacterium glutam
icum ATCC13032 (parent strain) and Corynebacterium glutamicum
One loopful of TR-DAP1 to 10 was inoculated into 3 ml of bouillon medium (manufactured by Nissui) and cultured with shaking at 30 ° C overnight. The obtained culture solution was added to 30 ml of a 2,6-pyridinedicarboxylic acid production medium (Table 2) in a 500 ml Erlenmeyer flask, and cultured at 30 ° C. for 3 days with rotary shaking. From the obtained culture solution, centrifugation (4 ° C., 6,000
The cells were removed by rpm), and the results of HPLC analysis of 2,6-pyridinedicarboxylic acid in the supernatant are shown in Table 3. As can be seen from this table, 2,6-
No pyridinedicarboxylic acid was detected, but
In all the culture supernatants of the transformants obtained in
Pyridine dicarboxylic acid was detected.
【００５２】[0052]
【表２】 [Table 2]
【００５３】[0053]
【表３】 [Table 3]
【００５４】実施例３ （2,6-ピリジンジカルボン酸の
単離） ５０ｍｌのブイヨン培地（ニッスイ製）を５００ｍｌ容
エーレンマイヤーフラスコに入れ、１２０℃、２０分間
滅菌したのち、ブイヨン寒天培地（ニッスイ製）に生育
させたBrevibacterium lactofermentumＴＲ-ＤＡＰ１の
１白金耳量を植菌し、３０℃で一晩回転振盪培養した。
得られた培養液を、表２から炭酸カルシウムを除いた2,
6-ピリジンジカルボン酸生産培地１ｌを仕込んだ２ｌ容
ミニジャーファーメンターに植菌し、通気量１ｖｖｍ、
回転数８００ｒｐｍ、培養温度３０℃、ｐＨ７.０の条
件で通気撹拌培養を行った。得られた培養液から遠心分
離（４℃、６,０００ｒｐｍ）によって菌体を除去し、
培養上清９５０ｍｌを得た。Example 3 (Isolation of 2,6-pyridinedicarboxylic acid) A 50 ml bouillon medium (manufactured by Nissui) was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask, sterilized at 120 ° C for 20 minutes, and then bouillon agar medium (manufactured by Nissui). ), And inoculated with one loopful of Brevibacterium lactofermentum TR-DAP1 grown in), and cultivated by rotary shaking at 30 ° C. overnight.
The obtained culture solution was obtained by removing calcium carbonate from Table 2,
Inoculate a 2 liter mini-jar fermenter charged with 1 liter of 6-pyridine dicarboxylic acid production medium, and aeration volume of 1 vvm.
Aeration and agitation culture was performed under the conditions of a rotation speed of 800 rpm, a culture temperature of 30 ° C., and a pH of 7.0. Cells were removed from the resulting culture by centrifugation (4 ° C., 6,000 rpm),
950 ml of the culture supernatant was obtained.
【００５５】培養上清９００ｍｌを、５００ｍｌカチオ
ン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ（三菱化学製）を充
填したカラムに通液し、素通り画分を回収した。さら
に、１ｌイオン交換水をカラムに通液し、カラム洗浄液
約１ｌを得た。素通り画分と洗浄液を混合し、その混合
液１ｌを、６０℃で減圧濃縮したのち４℃で晶析した。
得られた淡黄白色固体を水に溶解させ濃縮した後、再
度、４℃で晶析することによって、白色固体の2,6-ピリ
ジンジカルボン酸０.９ｇを得た。[0055] 900 ml of the culture supernatant was passed through a column filled with 500 ml of cation exchange resin DIAION SK-1B (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), and a flow-through fraction was collected. Further, 1 liter of ion-exchanged water was passed through the column to obtain about 1 liter of a column washing solution. The flow-through fraction and the washing solution were mixed, and 1 liter of the mixed solution was concentrated under reduced pressure at 60 ° C and then crystallized at 4 ° C.
The obtained pale yellowish white solid was dissolved in water, concentrated, and then recrystallized at 4 ° C. to obtain 0.9 g of 2,6-pyridinedicarboxylic acid as a white solid.
【００５６】また、ダイヤイオンＳＫ-１Ｂの素通り画
分と洗浄液の混合液１ｌを、ＮａＯＨで中和したのち、
晶析によって淡黄白色の固体を得た。得られた固体を水
に溶解後、再度４℃で晶析することによって、白色固体
の2,6-ピリジンジカルボン酸ナトリウム塩１.１ｇを得
た。After neutralizing 1 L of a mixed solution of a flow-through fraction of Diaion SK-1B and a washing solution with NaOH,
A pale yellow-white solid was obtained by crystallization. The obtained solid was dissolved in water and crystallized again at 4 ° C to obtain 1.1 g of sodium 2,6-pyridinedicarboxylate as a white solid.
【００５７】これら、2,6-ピリジンジカルボン酸白色固
体と2,6-ピリジンジカルボン酸ナトリウム固体につい
て、ＨＰＬＣで分析したところ、2,6-ルチジンや6-メチ
ル-2-ピリジンカルボン酸などのアルキルピリジン類は
検出されなかった。また、得られた2,6-ピリジンジカル
ボン酸およびそのナトリウム塩について、「新規化学物
質等に係わる試験方法について（環保業５号・薬発第６
１５号・４９基局第３９２号）」に従って、生分解性を
調べたところ、ほぼ１００％の生分解されることが分か
った。また、得られた2,6-ピリジンジカルボン酸および
そのナトリウム塩を、水に溶解後、全自動アミノ酸分析
計（日本電子製、ＪＬＣ２００Ａ）で分析したところ、
アラニン、バリンが、それぞれ０.２％、０.３％含まれ
ていた。 実施例４ （ジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝
子の導入） コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium
glutamicum）のリボソームＲＮＡをコードする遺伝子配
列（参考文献４）を参考にオリゴヌクレオチド5’- GTG
CTTAACACATGCAAGTCG -3’（配列番号：５）、5’- CTTC
GTCCAATCGCCGATCCC -3’（配列番号：６）を合成した。
Corynebacterium glutamicum ATCC13032株から常法に従
い調整したゲノムDNAの溶液を増幅鋳型として０．２ｍ
ｌのミクロ遠心チューブに０．２μｌづつ取り、各プラ
イマーを２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１００μｇ／ｍｌゼ
ラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、２単位 ＬＡＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼ（宝酒造製）となるように各試薬を加
え、全量を５０μｌとした。ＤＮＡの変性条件を９４
℃、３０秒、プライマーのアニーリング条件を５５℃、
３０秒、ＤＮＡプライマーの伸長反応条件を７２℃、３
分の各条件でＢｉｏＲａｄ社のサーマルサイクラーを用
い、３０サイクル反応させた（ポリメラーゼ連鎖反応：
以後、ＰＣＲ法と記す）。尚、本実施例におけるＰＣＲ
法は特に断らない限り、本条件にて行った。このＰＣＲ
法により得られた産物を１％アガロースにて電気泳動
し、１６Ｓ−ｒＲＮＡを含む約１．６ｋｂのＤＮＡ断片
を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクタ
ーｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ
部位の3’-末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従
ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラス
ミドをｐＴ７−１６ＳＣＧと命名した。These 2,6-pyridinedicarboxylic acid white solids and sodium 2,6-pyridinedicarboxylate solids were analyzed by HPLC to find that alkyls such as 2,6-lutidine and 6-methyl-2-pyridinecarboxylic acid were obtained. No pyridines were detected. In addition, regarding the obtained 2,6-pyridinedicarboxylic acid and its sodium salt, "Test methods for new chemical substances, etc. (Kinho No. 5
No. 15, 49th base station No. 392) ", the biodegradability was examined, and it was found that biodegradation was almost 100%. When the obtained 2,6-pyridinedicarboxylic acid and its sodium salt were dissolved in water and analyzed by a fully automatic amino acid analyzer (JLC200A, manufactured by JEOL Ltd.),
Alanine and valine were contained in 0.2% and 0.3%, respectively. Example 4 (Introduction of Gene Encoding Dipicolinate Synthase) Corynebacterium glutamicum
glutamicum) and oligonucleotide 5′-GTG with reference to the gene sequence encoding ribosomal RNA (Reference 4).
CTTAACACATGCAAGTCG -3 '(SEQ ID NO: 5), 5'-CTTC
GTCCAATCGCCGATCCC-3 '(SEQ ID NO: 6) was synthesized.
A genomic DNA solution prepared from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain according to a conventional method was used as an amplification template in an amount of 0.2 m.
0.2 μl of each primer was placed in a microcentrifuge tube (1 μl), and 20 pmol of each primer was added to a 20 mM Tris-HCl buffer (p
H8.0), 2.5 mM KCl, 100 μg / ml gelatin, 50 μM each dNTP, 2 units LATaqDN
Each reagent was added so as to become A polymerase (manufactured by Takara Shuzo), and the total volume was adjusted to 50 μl. DNA denaturation conditions were 94
30 ° C., 30 ° C.
30 seconds, the extension reaction conditions of the DNA primer
The reaction was performed for 30 cycles using a BioRad thermal cycler under each of the conditions described above (polymerase chain reaction:
Hereinafter, referred to as PCR method). The PCR in this example
The method was performed under these conditions unless otherwise specified. This PCR
The product obtained by the method was electrophoresed on 1% agarose, and a DNA fragment of about 1.6 kb containing 16S-rRNA was prepared according to a conventional method. This fragment was ligated with EcoRV of plasmid vector pT7blue (Novagen).
The resulting plasmid was inserted into the gap where a T base was added to the 3'-end of the site by a ligation reaction according to a conventional method, and the resulting plasmid was named pT7-16SCG.
【００５８】ブレビバクテリウム ラクトファーメンタ
ム（Brevibacterium lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８
６９株のｄａｐＢ遺伝子近傍のＤＮＡ配列（参考文献
１）を参考に、オリゴヌクレオチド5’- CAGAGGTTGTAGG
CGTTGAG -3’（配列番号：７）、5’- TATGCTCCTTCATTT
TCGTG -3’（配列番号：８）を合成した。Brevibacteri
um lactofermentumＡＴＣＣ１３８６９株から調整した
ゲノムＤＮＡを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配
列番号：７）、（配列番号：８）をプライマーセットと
して用いたＰＣＲ法によって得られた産物を１％アガロ
ースゲル電気泳動し、ｄａｐＢ遺伝子上流領域を含む
０．３ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断
片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅのＥｃｏＲＶ
部位の3’-末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従
ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラス
ミドをｐＴ７−ｄａｐＢＵＳと命名した。バチルス サ
チルス（Bacillus subtilis）ＡＴＣＣ６０５１株のジ
ピコリン酸シンターゼのサブユニットＡ（ｄｐａＡ）、
及びサブユニットＢ（ｄｐａＢ）をコードする遺伝子の
ＤＮＡ配列（参考文献５）を参考に、オリゴヌクレオチ
ド5’- GGAGCATAATGTTAACCGGATTGAAAATT -3’（配列番
号：９）、5’- CGCGGATCCAAAACTCCTTCCGCCAATCA -3’
（配列番号：１０）を合成した。Bacillus subtilisＡ
ＴＣＣ６０５１株から調整したゲノムＤＮＡを増幅鋳型
とし、オリゴヌクレオチド（配列番号：９）、（配列番
号：１０）をプライマーセットとして用いたＰＣＲ法に
よって得られた産物を１％アガロースゲル電気泳動し、
ｄｐａＡ、及びｄｐａＢ遺伝子を含む１．６ｋｂのＤＮ
Ａ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミド
ベクターｐＴ７ｂｌｕｅのＥｃｏＲＶ部位の3’-末端に
Ｔ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーショ
ン反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴ７−ｄ
ｐａＡＢと命名した。Brevibacterium lactofermentum ATCC 138
Oligonucleotide 5'-CAGAGGTTGTAGG was referred to with reference to the DNA sequence near dapB gene of 69 strains (Reference Document 1).
CGTTGAG -3 '(SEQ ID NO: 7), 5'-TATGCTCCTTCATTT
TCGTG-3 ′ (SEQ ID NO: 8) was synthesized. Brevibacteri
genomic DNA prepared from um lactofermentum ATCC 13869 strain was used as an amplification template, and a product obtained by a PCR method using oligonucleotides (SEQ ID NO: 7) and (SEQ ID NO: 8) as primer sets was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. A 0.3 kb DNA fragment containing the upstream region of the dapB gene was prepared according to a conventional method. This fragment was ligated with the EcoRV of the plasmid vector pT7blue.
The plasmid was inserted into the gap where a T base was added to the 3′-end of the site by a ligation reaction according to a conventional method, and the resulting plasmid was named pT7-dapBUS. Subunit A (dpaA) of dipicolinate synthase of Bacillus subtilis ATCC6051 strain,
And oligonucleotides 5′-GGAGCATAATGTTAACCGGATTGAAAATT-3 ′ (SEQ ID NO: 9), 5′-CGCGGATCCAAAACTCCTTCCGCCAATCA-3 ′ with reference to the DNA sequence of the gene encoding subunit B (dpaB) (Reference 5).
(SEQ ID NO: 10) was synthesized. Bacillus subtilisA
Using a genomic DNA prepared from the TCC6051 strain as an amplification template, a product obtained by a PCR method using oligonucleotides (SEQ ID NO: 9) and (SEQ ID NO: 10) as a primer set was subjected to 1% agarose gel electrophoresis,
1.6 kb DN containing dpaA and dpaB genes
The A fragment was prepared according to a conventional method. This fragment was inserted into a gap where a T base was added to the 3′-end of the EcoRV site of the plasmid vector pT7blue by a ligation reaction according to a conventional method, and the resulting plasmid was pT7-d
paAB.
【００５９】ｐＴ７−ｄａｐＢＵＳを増幅鋳型とし、オ
リゴヌクレオチド（配列番号：７）、（配列番号：８）
をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産
物を産物を１％アガロースゲル電気泳動し、ｄａｐＢ遺
伝子上流領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従
い調整した。また、ｐＴ７−ｄｐａＡＢ増幅鋳型とし、
オリゴヌクレオチド（配列番号：９）、 （配列番号：
１０）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得ら
れた産物を１％アガロースゲル電気泳動し、ｄｐａＡ、
及びｄｐａＢ遺伝子を含む１．６ｋｂのＤＮＡ断片を常
法に従い調整した。ここで得られた０．３ｋｂ断片、
１．６ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴ
ヌクレオチド（配列番号：７）、（配列番号：１０）を
プライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物
を１％アガロースゲル電気泳動して、ｄａｐＢ遺伝子上
流領域とｄｐａＡ、及びｄｐａＢ遺伝子が連結された
１．９ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断
片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅのＥｃｏＲＶ
部位の3’-末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従
ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラス
ミドをｐＴ７−ｄａｐＢＵＳ−ｄｐａＡＢと命名した。Using pT7-dapBUS as an amplification template, oligonucleotides (SEQ ID NO: 7) and (SEQ ID NO: 8)
The product obtained by the PCR method using as a primer set was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and a 0.3 kb DNA fragment containing the upstream region of the dapB gene was prepared according to a conventional method. Further, as a pT7-dpaAB amplification template,
Oligonucleotide (SEQ ID NO: 9), (SEQ ID NO:
The product obtained by the PCR method using 10) as a primer set was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and dpaA,
And a 1.6 kb DNA fragment containing the dpaB gene was prepared according to a conventional method. The 0.3 kb fragment obtained here,
The mixture obtained by mixing the 1.6 kb fragments was used as an amplification template, and the product obtained by the PCR method using oligonucleotides (SEQ ID NO: 7) and (SEQ ID NO: 10) as primer sets was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. A 1.9 kb DNA fragment in which the dapB gene upstream region was linked to the dpaA and dpaB genes was prepared according to a conventional method. This fragment was ligated with the EcoRV of the plasmid vector pT7blue.
The plasmid was inserted into the gap where a T base was added to the 3'-end of the site by a ligation reaction according to a conventional method, and the resulting plasmid was named pT7-dapBUS-dpaAB.
【００６０】ｐＴ７−１６ＳＣＧを増幅鋳型とし、オリ
ゴヌクレオチド5’- GAATTCGTGCTTAACACATGCAAGTCG -
3’（配列番号：１１）、5’- CAACTCTGCAGTCTCCCCTACA
GCACTC-3’（配列番号：１２）をプライマーセットとし
たＰＣＲ法によって得られた産物を１％アガロースゲル
電気泳動し、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子5’領域の一部分
を含む０．６ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。
また、ｐＴ７−ｄａｐＢＵＳ−ｄｐａＡＢ増幅鋳型と
し、オリゴヌクレオチドGGAGACTGCAGAGGTTGTAGGCGTTGAG
（配列番号：１３）、CGCGGATCCAAAACTCCTTCCGCCAATCA
（配列番号：１４）をプライマーとしたＰＣＲ法によっ
て得られた産物を１％アガロースゲル電気泳動し、ｄａ
ｐＢ遺伝子上流領域とｄｐａＡ、及びｄｐａＢ遺伝子が
連結された１．９ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整し
た。ここで得られた０．６ｋｂ断片、１．９ｋｂ断片を
混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配
列番号：１１）、（配列番号：１４）をプライマーとし
たＰＣＲ法によって得られた産物を１％アガロースゲル
電気泳動して、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の一部分、ｄａ
ｐＢ遺伝子上流領域とｄｐａＡ、及びｄｐａＢ遺伝子が
連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整し
た。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅの
ＥｃｏＲＶ部位の3’-末端にＴ塩基が付加された間隙
に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得
られたプラスミドをｐＴ７−１６Ｓ−ｄｐａＡＢと命名
した。Using pT7-16SCG as an amplification template, oligonucleotide 5'-GAATTCGTGCTTAACACATGCAAGTCG-
3 '(SEQ ID NO: 11), 5'-CAACTCTGCAGTCTCCCCTACA
The product obtained by the PCR method using GCACTC-3 ′ (SEQ ID NO: 12) as a primer set was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and a 0.6 kb DNA fragment containing a part of the 16S-rRNA gene 5 ′ region was constantly obtained. Adjusted according to the law.
In addition, as a pT7-dapBUS-dpaAB amplification template, oligonucleotide GGAGACTGCAGAGGTTGTAGGCGTTGAG
(SEQ ID NO: 13), CGCGGATCCAAAACTCCTTCCGCCAATCA
The product obtained by the PCR method using (SEQ ID NO: 14) as a primer was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and da
A 1.9 kb DNA fragment in which the pB gene upstream region was linked to the dpaA and dpaB genes was prepared according to a conventional method. A product obtained by a PCR method using a mixture of the obtained 0.6 kb fragment and 1.9 kb fragment as an amplification template and oligonucleotides (SEQ ID NO: 11) and (SEQ ID NO: 14) as primers was used. After electrophoresis on a 1% agarose gel, a portion of the 16S-rRNA gene, da
A 2.5 kb DNA fragment in which the pB gene upstream region was linked to the dpaA and dpaB genes was prepared according to a conventional method. This fragment was inserted into a gap where a T base was added to the 3′-end of the EcoRV site of the plasmid vector pT7blue by a ligation reaction according to a conventional method, and the resulting plasmid was named pT7-16S-dpaAB.
【００６１】カナマイシン耐性遺伝子のＤＮＡ配列（参
考文献６）を参考にオリゴヌクレオチド5’- CGCGGATCC
CTTGTTGTAGGTGGAC -3’（配列番号：１５）、5’- ACGC
TGACTTGACGGGACGGCTGGTGGT -3’（配列番号：１６）を
合成した。プラスミドｐＨＳＧ２９８を増幅鋳型とし、
オリゴヌクレオチド（配列番号：１５）、（配列番号：
１６）をプライマーセットとしたＰＣＲ法により得られ
た産物を１％アガロースゲル電気泳動し、カナマイシン
耐性遺伝子を含む１．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い
調整した。また、ｐＴ７−１６ＳＣＧを増幅鋳型とし、
オリゴヌクレオチド5’- GCATTTCACCGCTACACCAGCCGTCCC
G -3’（配列番号：１７）、5’- CGCAAGCTTCTTCGTCCAA
TCGCCGATCCC -3’（配列番号：１８）をプライマーセッ
トとしたＰＣＲ法によって得られた産物を産物を１％ア
ガロースゲル電気泳動し、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の一
部分を含む１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。
ここで得られた１．１ｋｂ断片、１ｋｂ断片を混合した
ものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号：
１５）、（配列番号：１８）をプライマーセットとした
ＰＣＲ法によって得られた産物を１％アガロースゲル電
気泳動して、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子3’領域の一部分
が連結された１．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整
した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ
のＥｃｏＲＶ部位の3’-末端にＴ塩基が付加された間隙
に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得
られたプラスミドをｐＴ７−Ｋｍ−１６Ｓと命名した。Referring to the DNA sequence of the kanamycin resistance gene (Ref. 6), the oligonucleotide 5'-CGCGGATCC
CTTGTTGTAGGTGGAC -3 '(SEQ ID NO: 15), 5'-ACGC
TGACTTGACGGGACGGCTGGTGGT-3 ′ (SEQ ID NO: 16) was synthesized. Plasmid pHSG298 was used as an amplification template,
Oligonucleotides (SEQ ID NO: 15), (SEQ ID NO:
The product obtained by the PCR method using 16) as a primer set was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and a 1.1 kb DNA fragment containing the kanamycin resistance gene was prepared according to a conventional method. Further, pT7-16SCG was used as an amplification template,
Oligonucleotide 5'-GCATTTCACCGCTACACCAGCCGTCCC
G-3 '(SEQ ID NO: 17), 5'-CGCAAGCTTCTTCGTCCAA
The product obtained by the PCR method using TCGCCGATCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 18) as a primer set was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and a 1 kb DNA fragment containing a part of the 16S-rRNA gene was prepared in a usual manner. did.
A mixture of the obtained 1.1 kb fragment and 1 kb fragment was used as an amplification template, and an oligonucleotide (SEQ ID NO:
15), a product obtained by PCR using (SEQ ID NO: 18) as a primer set was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and a 1.1 kb DNA fragment to which a part of the 3S region of the 16S-rRNA gene was ligated. Was adjusted according to a conventional method. This fragment was transformed into the plasmid vector pT7blue
Was inserted into the gap where a T base was added to the 3′-end of the EcoRV site by a conventional ligation reaction, and the resulting plasmid was named pT7-Km-16S.
【００６２】ｐＴ７−１６Ｓ−ｄｐａＡＢをＥｃｏＲ
Ｉ、及びＢａｍＨＩで消化した産物を１％アガロースゲ
ルにて電気泳動し、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の5’領域
の一部分、ｄａｐＢ遺伝子上流領域、及びｄｐａＡ、ｄ
ｐａＢ遺伝子を含む２．５ｋｂのＤＮＡ断片を調整し
た。また、ｐＴ７−Ｋｍ−１６ＳをＢａｍＨＩ、及びＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化した産物を１％アガロースゲルにて
電気泳動し、カナマイシン耐性遺伝子、及び１６Ｓ−ｒ
ＲＮＡ遺伝子の3’領域の一部分を含む２．１ｋｂのＤ
ＮＡ断片を調整した。ここで得られた２．５ｋｂ、２．
１ｋｂＤＮＡ断片を、予めＥｃｏＲＩ、及びＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化しておいたプラスミドベクターｐＵＣ１９の
ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ間隙に、常法に従ったライ
ゲーション反応により挿入した。この操作で得られたプ
ラスミドをｐＵＣ−１６Ｓ−ｄａｐＡＢと命名した。PT7-16S-dpaAB was replaced with EcoR
The products digested with I and BamHI were electrophoresed on a 1% agarose gel, and a part of the 5 'region of the 16S-rRNA gene, the upstream region of the dapB gene, and dpaA, d
A 2.5 kb DNA fragment containing the paB gene was prepared. Further, pT7-Km-16S was converted to BamHI and H
The product digested with indIII was electrophoresed on a 1% agarose gel, and the kanamycin resistance gene and 16S-r
2.1 kb D containing a portion of the 3 'region of the RNA gene
The NA fragment was prepared. 2.5 kb obtained here;
A 1 kb DNA fragment was previously prepared using EcoRI and HindI.
The plasmid vector pUC19 digested with II was inserted into the EcoRI / HindIII space by a ligation reaction according to a conventional method. The plasmid obtained by this operation was named pUC-16S-dapAB.
【００６３】エレクトロポレーション法を用いて、プラ
スミドｐＵＣ−１６Ｓ−ｄａｐＡＢを常法どおりにBrev
ibacterium lactofermentum ATCC13869に導入したとこ
ろ、カナマイシンに耐性を示すようになった形質転換体
を得た。得られた形質転換体から１０株を選定し、常法
に従い各株由来のゲノムＤＮＡ溶液を調整した。このゲ
ノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番
号：１１）、（配列番号：１４）をプライマーセットし
たＰＣＲ法を行い、得られた産物を１％アガロースゲル
にて電気泳動したところ、すべての株由来の産物から
２．５ｋｂの単一のバンドが観察された。このことか
ら、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子座に、ジピコリン酸シンタ
ーゼ遺伝子（ｄｐａＡ、及びｄｐａＢ）が挿入されてい
ることが確認できた。これら形質転換体を、Brevibacte
rium lactofermentum ＴＲ−ＤＰＡ１からＴＲ−ＤＰ
Ａ１０と命名した。Using the electroporation method, plasmid pUC-16S-dapAB was digested with
When introduced into ibacterium lactofermentum ATCC13869, a transformant which became resistant to kanamycin was obtained. Ten strains were selected from the obtained transformants, and genomic DNA solutions derived from each strain were prepared according to a conventional method. Using this genomic DNA as a template, PCR was performed with the oligonucleotides (SEQ ID NO: 11) and (SEQ ID NO: 14) as primers, and the resulting product was electrophoresed on a 1% agarose gel. A single band of 2.5 kb was observed from the derived product. This confirmed that the dipicolinate synthase genes (dpaA and dpaB) were inserted into the 16S-rRNA locus. These transformants were used for Brevibacte
rium lactofermentum TR-DPA1 to TR-DP
It was named A10.
【００６４】また、エレクトロポレーション法を用い
て、プラスミドｐＵＣ−１６Ｓ−ｄａｐＡＢを常法どお
りにCorynebacterium glutamicum ATCC13032に導入した
ところ、カナマイシンに耐性を示すようになった形質転
換体を得た。得られた形質転換体から１０株を選定し、
常法に従い各株由来のゲノムＤＮＡ溶液を調整した。こ
のゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド（配
列番号：１１）、（配列番号：１４）をプライマーセッ
トとして用いたＰＣＲ法を行い、得られた産物を１％ア
ガロースゲルにて電気泳動したところ、すべての株由来
の産物から２．５ｋｂの単一のバンドが観察された。こ
のことから、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子座に、ジピコリン
酸シンターゼ遺伝子（ｄｐａＡ、及びｄｐａＢ）が挿入
されていることが確認できた。これら形質転換体を、Co
rynebacterium glutamicum ＴＲ−ＤＰＡ１からＴＲ−
ＤＰＡ１０と命名した。Further, when the plasmid pUC-16S-dapAB was introduced into Corynebacterium glutamicum ATCC13032 by an ordinary method using an electroporation method, a transformant which became resistant to kanamycin was obtained. 10 strains were selected from the obtained transformants,
A genomic DNA solution from each strain was prepared according to a conventional method. Using this genomic DNA as a template, PCR was performed using oligonucleotides (SEQ ID NO: 11) and (SEQ ID NO: 14) as a primer set, and the resulting product was electrophoresed on a 1% agarose gel. A single band of 2.5 kb was observed from the product from the strain No. 1. This confirmed that the dipicolinate synthase genes (dpaA and dpaB) were inserted into the 16S-rRNA locus. These transformants were used as Co
rynebacterium glutamicum TR-DPA1 to TR-
It was named DPA10.
【００６５】更に、実施例１で得られたリジン要求性株
Brevibacterium lactofermentumＴＲ−ＤＡＰ１、及びC
orynebacterium glutamicum ＴＲ−ＤＡＰ１に、常法
に従ったエレクトロポレーション法により、プラスミド
ｐＵＣ−１６Ｓ−ｄａｐＡＢを導入した。その結果、カ
ナマイシンに対して耐性を示すようになった形質転換体
を得た。これら得られた形質転換体からそれぞれ１０株
を選定し、常法に従い各株由来のゲノムＤＮＡ溶液を調
整した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレ
オチド（配列番号：１１）（配列番号：１４）をプライ
マーセットとして用いたＰＣＲ法を行い、得られた産物
を１％アガロースゲルにて電気泳動したところ、すべて
の株由来の産物から２．５ｋｂの単一のバンドが観察さ
れた。このことから、得られた形質転換体のすべてが、
１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子座に、ジピコリン酸シンターゼ
遺伝子（ｄｐａＡ、及びｄｐａＢ）が挿入されているこ
とが確認できた。これら形質転換体を、それぞれBrevib
acterium lactofermentum ＴＲ−ＤＤＰ１からＴＲ−
ＤＤＰ１０、及びCorynebacterium glutamicumＴＲ−Ｄ
ＤＰ１からＴＲ−ＤＤＰ１０と命名した。実施例５
（2,6-ピリジンジカルボン酸の生産その２）Brevibacte
rium lactofermentum ATCC13869（親株）と実施例４で
得られたBrevibacterium lactofermentum ＴＲ−ＤＰ
Ａ１からＴＲ−ＤＰＡ１０、及びBrevibacterium lacto
fermentum ＴＲ−ＤＤＰ１からＴＲ−ＤＤＰ１０を３
ｍｌブイヨン培地（ニッスイ製）に１白金耳を植菌し、
３０℃で一晩培養した。また、Corynebacterium glutam
icum ATCC13032（親株）と実施例４で得られたCoryn
ebacterium glutamicum ＴＲ−ＤＰＡ１からＴＲ−Ｄ
ＰＡ１０、及びCorynebacterium glutamicum ＴＲ−Ｄ
ＤＰ１からＴＲ−ＤＤＰ１０を３ｍｌブイヨン培地（ニ
ッスイ製）に１白金耳を植菌し、３０℃で一晩培養し
た。それぞれ得られた培養液を、５００ｍｌ容エルリン
マイヤーフラスコ中の2,6-ピリジンジカルボン酸生産培
地（２）（表４）３０ｍｌに加え、３０℃で３日間回転
振とう培養した。得られた培養液から、遠心分離（４
℃、遠心加速度；６０００ｇ）によって、菌体を除去
し、上清中の2,6-ピリジンジカルボン酸をＨＰＬＣで分
析した結果を表５および表６に示した。この結果、親株
の培養液上清からは、2,6-ピリジンジカルボン酸は検出
されなかったが、実施例で得られた形質転換体の培養上
清すべてにおいて、2,6-ピリジンジカルボン酸が検出さ
れた。また、すべての形質転換体培養上清に含まれるア
ルキルピリジンの含有量は２重量％以下であった。更
に、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ遺伝子を破壊して
いない形質転換体と比較して、ジヒドロピコリン酸レダ
クターゼ遺伝子が破壊された形質転換体の方が培養上清
中に2,6-ピリジンジカルボン酸が高い濃度で検出される
ことを確認した。Further, the lysine-requiring strain obtained in Example 1
Brevibacterium lactofermentum TR-DAP1, and C
Plasmid pUC-16S-dapAB was introduced into orynebacterium glutamicum TR-DAP1 by electroporation according to a conventional method. As a result, a transformant which became resistant to kanamycin was obtained. Ten strains were selected from each of the obtained transformants, and a genomic DNA solution derived from each strain was prepared according to a conventional method. Using this genomic DNA as a template, a PCR method was performed using an oligonucleotide (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 14) as a primer set, and the resulting product was electrophoresed on a 1% agarose gel. A single band of 2.5 kb was observed from the product from the strain. From this, all of the obtained transformants
It was confirmed that the dipicolinate synthase genes (dpaA and dpaB) were inserted into the 16S-rRNA locus. Each of these transformants was
acterium lactofermentum TR-DDP1 to TR-
DDP10 and Corynebacterium glutamicum TR-D
Named DP1 to TR-DDP10. Example 5
(Production of 2,6-pyridinedicarboxylic acid, part 2) Brevibacte
rium lactofermentum ATCC13869 (parent strain) and Brevibacterium lactofermentum TR-DP obtained in Example 4.
A1 to TR-DPA10 and Brevibacterium lacto
fermentum TR-DDP1 to TR-DDP10
Inoculate one platinum loop into the ml broth medium (Nissui)
Cultured at 30 ° C. overnight. Also, Corynebacterium glutam
icum ATCC13032 (parent strain) and Coryn obtained in Example 4
ebacterium glutamicum TR-DPA1 to TR-D
PA10 and Corynebacterium glutamicum TR-D
One loopful of platinum loops from DP1 to TR-DDP10 was inoculated into a 3 ml broth medium (manufactured by Nissui) and cultured at 30 ° C. overnight. Each of the obtained culture solutions was added to 30 ml of a 2,6-pyridinedicarboxylic acid production medium (2) (Table 4) in a 500 ml Erlin-Meier flask, and cultured with rotation and shaking at 30 ° C. for 3 days. From the obtained culture, centrifugation (4
C., centrifugal acceleration; 6000 g), the cells were removed, and 2,6-pyridinedicarboxylic acid in the supernatant was analyzed by HPLC. The results are shown in Tables 5 and 6. As a result, 2,6-pyridinedicarboxylic acid was not detected from the culture supernatant of the parent strain, but 2,6-pyridinedicarboxylic acid was found in all the culture supernatants of the transformants obtained in the examples. was detected. In addition, the content of alkylpyridine contained in all the transformant culture supernatants was 2% by weight or less. Furthermore, compared to a transformant in which the dihydropicolinate reductase gene is not disrupted, the transformant in which the dihydropicolinate reductase gene has been disrupted has a higher concentration of 2,6-pyridinedicarboxylic acid in the culture supernatant. It was confirmed that it was detected by.
【００６６】[0066]
【表４】 [Table 4]
【００６７】[0067]
【表５】 [Table 5]
【００６８】[0068]
【表６】 [Table 6]
【００６９】[0069]
【発明の効果】本発明によれば、生分解性に優れた2,6-
ピリジンジカルボン酸またはその塩を提供することがで
きる。 参考文献 １．Pisabarro,A. et. al J. Bacteriol. 175： 2743-
2749 (1993) ２．Molecular Cloning.Cold Spring Harbor Loborator
y.New York.1982. ４．Tauch, A. et. al FEMS Microbiol. Lett. 201：5
3-58.（2001） ５．Daniel, R.A. and Errington, J. J. Mol. Biol.
232：468-483.（1995） ６．Takeshita, S. et. al Gene 61：63-74.（198
7）According to the present invention, 2,6-
A pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof can be provided. References 1. Pisabarro, A. et. Al J. Bacteriol. 175: 2743-
2749 (1993) 2. Molecular Cloning.Cold Spring Harbor Loborator
y.New York.1982. Tauch, A. et. Al FEMS Microbiol. Lett. 201: 5
3-58. (2001) Daniel, RA and Errington, JJ Mol. Biol.
232: 468-483. (1995) Takeshita, S. et. Al Gene 61: 63-74. (198
7)
【００７０】[0070]
SEQUENCE LISTING <110> 東レ株式会社 （Toray Industory Inc.） <120> ２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩、
製造方法ならびにキレート剤 <130> ５１Ｅ１６４９１ <160> 18 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 gcttctagac tggtgggcgt ttgaaaaact 30 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 gctaagcttc acgctatcaa ctccacgctc aat 33 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 acggtcgact cgcagaataa ataaatcctg gtg 33 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 atgaggcctg agaggcggt ttgcgtattg ga 32 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 gtgcttaaca catgcaagtc g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 cttcgtccaa tcgccgatcc c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 cagaggttgt aggcgttgag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 tatgctcctt cattttcgtg 20 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 ggagcataat gttaaccgga ttgaaaatt 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 cgcggatcca aaactccttc cgccaatca 29 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 gaattcgtgc ttaacacatg caagtcg 29 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 caactctgca gtctccccta cagcactc 28 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 ggagactgca gaggttgtag gcgttgag <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 cgcggatcca aaactccttc cgccaatca <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 cgcggatccc ttgttgtagg tggac 25 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 acgctgactt gacgggacgg ctggtggt 28 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 gcatttcacc gctacaccag ccgtcccg 28 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 cgcaagcttc ttcgtccaat cgccgatccc 30SEQUENCE LISTING <110> Toray Industory Inc. <120> 2,6-pyridinedicarboxylic acid or its salt,
Production method and chelating agent <130> 51E16491 <160> 18 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 gcttctagac tggtgggcgt ttgaaaaact 30 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 gctaagcttc acgctatcaa ctccacgctc aat 33 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 acggtcgact cgcagaataa ataaatcctg gtg 33 <210> 4 <211> 32 <212 > DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 atgaggcctg agaggcggt ttgcgtattg ga 32 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 gtgcttaaca catgcaagtc g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 cttcgtccaa tcgccgatcc c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 cagaggttgt aggcgttgag 20 <210> 8 <211> 20 <212 > DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 tatgctcctt cattttcgtg 20 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 ggagcataat gttaaccgga ttgaaaatt 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 cgcggatcca aaac tccttc cgccaatca 29 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 gaattcgtgc ttaacacatg caagtcg 29 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 caactctgca gtctccccta cagcactc 28 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 ggagactgca gaggttgtag gcgttgag <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 cgcggatcca aaactccttc cgccaatca <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 cgcggatccc ttgttgtagg tggac 25 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 acgctgactt gacgggacgg ctggtggt 28 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 gcatttcacc gctacaccag ccgtcccg 28 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 cgcaagcttc ttcgtccaat cgccgatccc 30
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:185） Ｃ１２Ｒ 1:15 (Ｃ１２Ｐ 17/12 1:07 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:01 (Ｃ１２Ｐ 17/12 1:425 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:80 (Ｃ１２Ｐ 17/12 1:85 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:85） (72)発明者 越後 裕司 愛知県名古屋市港区大江町９番地の１ 東 レ株式会社名古屋事業場内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA07 BA08 CA04 DA05 EA04 GA14 HA01 4B064 AE49 CA02 CA05 CA06 CA19 CC24 DA16 4C055 AA01 BA03 BA57 CA01 DA01 GA02 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12R 1: 185) C12R 1:15 (C12P 17/12 1:07 C12R 1:13) C12R 1:01 ( C12P 17/12 1: 425 C12R 1:15) C12R 1:80 (C12P 17/12 1:85 C12R 1:07) C12N 15/00 ZNAA (C12P 17/12 C12R 1:01) (C12P 17/12 C12R 1: 425) (C12P 17/12 C12R 1:80) (C12P 17/12 C12R 1:85) (72) Inventor Yuji Echigo 1 Nagoya Office, Nagoya City, Aichi Prefecture F term (reference) 4B024 AA03 BA07 BA08 CA04 DA05 EA04 GA14 HA01 4B064 AE49 CA02 CA05 CA06 CA19 CC24 DA16 4C055 AA01 BA03 BA57 CA01 DA01 GA02
Claims (13)
下であることを特徴とする2,6-ピリジンジカルボン酸ま
たはその塩。1. A 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof, wherein the content of alkylpyridine is 2% by weight or less.
ンおよび／または6-メチル-2-ピリジンカルボン酸であ
ることを特徴とする請求項１に記載の２，６−ピリジン
ジカルボン酸またはその塩。2. The 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof according to claim 1, wherein the alkylpyridine is 2,6-dimethylpyridine and / or 6-methyl-2-pyridinecarboxylic acid.
および2,3-ジヒドロジピコリン酸から選ばれる少なくと
も一つを不純物として含むことを特徴とする請求項１ま
たは２に記載の2,6-ピリジンジカルボン酸またはその
塩。3. The 2,6-pyridinedicarboxylic acid according to claim 1, wherein at least one selected from valine, alanine, α-ketoglutaric acid and 2,3-dihydrodipicolinic acid is contained as an impurity. Acid or salt thereof.
および2,3-ジヒドロジピコリン酸から選ばれる少なくと
も一つを不純物として含むことを特徴とする2,6-ピリジ
ンジカルボン酸またはその塩。4. A 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof, comprising as an impurity at least one selected from valine, alanine, α-ketoglutaric acid and 2,3-dihydrodipicolinic acid.
リジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物を増
殖させる工程と、その菌体の培養上清または反応水溶液
から2,6-ピリジンジカルボン酸を回収、精製する工程か
らなることを特徴とする2,6-ピリジンジカルボン酸また
はその塩の製造方法。5. A step of growing a microorganism having no ability to form spores and having the ability to produce 2,6-pyridinedicarboxylic acid, and a method comprising: A method for producing 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof, comprising a step of recovering and purifying pyridinedicarboxylic acid.
a）属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリ
ネバクテリウム（Corynebacterium）属、プロビデンシ
ア（Providencia）属およびセラチア（Serratia）属か
ら選ばれるいずれか一つの属に属する微生物であること
を特徴とする請求項５に記載の2,6-ピリジンジカルボン
酸またはその塩の製造方法。6. The method according to claim 6, wherein the microorganism is Escherichia.
a) a microorganism belonging to any one genus selected from the genus, genus Brevibacterium, genus Corynebacterium, genus Providencia and genus Serratia; Item 6. The method for producing 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof according to Item 5.
体を要求し、かつ、２，６−ピリジンジカルボン酸を産
生する能力を有する微生物を増殖させる工程と、その菌
体の培養上清または反応水溶液上清から2,6-ピリジンジ
カルボン酸を回収、精製する工程からなることを特徴と
する2,6-ピリジンジカルボン酸またはその塩の製造方
法。7. A step of growing a microorganism that requires lysine or a lysine biosynthetic intermediate for growth and has the ability to produce 2,6-pyridinedicarboxylic acid, and a culture supernatant or reaction of the microorganism. A method for producing 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof, comprising a step of recovering and purifying 2,6-pyridinedicarboxylic acid from an aqueous solution supernatant.
1.3.1.26）が、欠損、変異または破壊された微生物を増
殖させる工程と、その菌体の培養上清または反応水溶液
上清から2,6-ピリジンジカルボン酸を回収、精製する工
程からなることを特徴とする2,6-ピリジンジカルボン酸
またはその塩の製造方法。8. A dihydrodipicolinate reductase (EC)
1.3.1.26) must consist of a step of growing defective, mutated or destroyed microorganisms, and a step of recovering and purifying 2,6-pyridinedicarboxylic acid from the culture supernatant or reaction aqueous solution supernatant of the cells. A method for producing 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof, which is characterized by the following.
te synthase)をコードする遺伝子を導入した形質転換体
を増殖させる工程と、その菌体の培養上清または反応水
溶液上清から2,6-ピリジンジカルボン酸を回収、精製す
る工程からなることを特徴とする2,6-ピリジンジカルボ
ン酸またはその塩の製造方法。9. A method for preparing dipicolinate synthase
te synthase), and a step of recovering and purifying 2,6-pyridinedicarboxylic acid from the culture supernatant of the cells or the supernatant of the reaction aqueous solution. For producing 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof.
a）属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリ
ネバクテリウム（Corynebacterium）属、バシラス(Baci
llus)属、プロビデンシア（Providencia）属、セラチア
（Serratia）属、ペニシリウム（Penicillium）属、お
よびサッカロマイセス（Saccharomyces）属から選ばれ
るいずれか一つの属に属する微生物であることを特徴と
する請求項７から９のいずれか１項に記載の2,6-ピリジ
ンジカルボン酸またはその塩の製造方法。10. The microorganism may be Escherichia (Escherichia).
a) Genus, genus Brevibacterium, genus Corynebacterium, Bacillus (Baci
The microorganism according to claim 7, which is a microorganism belonging to any one genus selected from the genus llus, the genus Providencia, the genus Serratia, the genus Penicillium, and the genus Saccharomyces. 10. The method for producing 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof according to any one of items 9 to 9.
その塩を含むキレート剤であって、生分解性が９８％以
上であるキレート剤。11. A chelating agent containing 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof, wherein the chelating agent has a biodegradability of 98% or more.
２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を含むキレ
ート剤。12. A chelating agent comprising 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof according to claim 1.
製造方法で得られる２，６−ピリジンジカルボン酸また
はその塩を含むキレート剤。13. A chelating agent comprising 2,6-pyridinedicarboxylic acid or a salt thereof obtained by the production method according to claim 5. Description:
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