JP2002360247A - Nucleic acid-immobilized product - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学分野に
おいて有用なＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ）を含有するハイブリダイゼーション用ポリヌ
クレオチド、該ポリヌクレオチドの作製方法、ＬＮＡ
（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を含有す
る増幅核酸、該核酸を固定化した核酸固定化物および該
ポリヌクレオチドあるいは核酸固定化物を用いた標的核
酸の検出方法に関する。The present invention relates to an LNA (locked nucleic acid) useful in the field of genetic engineering.
Acid), a polynucleotide for hybridization, a method for producing the polynucleotide, and LNA
The present invention relates to an amplified nucleic acid containing (locked nucleic acid), an immobilized nucleic acid having the nucleic acid immobilized thereon, and a method for detecting a target nucleic acid using the polynucleotide or the immobilized nucleic acid.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ハイブリダイゼーション法は、細胞や組
織において発現するｍＲＮＡの種類を同定するために、
あるいは各ｍＲＮＡ分子量を定量するために通常よく利
用される方法である。それゆえ、ｍＲＮＡの同定、定量
のためのハイブリダイゼーション技術は、生物学ならび
に医学の分野において非常に重要である。また、ゲノム
ＤＮＡの解析においてもよく利用される方法である。上
記ハイブリダイゼーション法として例えば、全ＲＮＡま
たは精製されたＲＮＡをナイロン膜のような多孔性の担
体上に固定化し、蛍光物質あるいは放射性同位元素（Ｒ
Ｉ）等で標識した、検出しようとする遺伝子（ＲＮＡ）
に相補的なプローブと混合してハイブリダイズさせる方
法がある。このカテゴリーに属する技術としてノーザン
・ハイブリダイゼーション法が挙げられる。また、ＤＮ
Ａ解析の場合は、ゲノムＤＮＡあるいは核酸増幅産物を
制限酵素等により断片化し、アガロース電気泳動により
分離し、該ＤＮＡ断片をアルカリ変性した後メンブレン
にトランスファーして、標識プローブとハイブリダイズ
させるサザン・ハイブリダイゼーション法が挙げられ
る。また、別法としては、検出しようとする遺伝子（Ｒ
ＮＡ）を含む混合物、若しくは該混合物から精製したＲ
ＮＡを蛍光物質あるいは放射性同位元素等で標識し、こ
れを膜上に固定されたプローブとハイブリダイズさせる
方法がある。このカテゴリーの属する技術としては、逆
ドットブロット法が挙げられる。一方、ｍＲＮＡ、核酸
増幅産物等を膜上に固定化し、標識したプローブとハイ
ブリダイズさせる方法があり、いわゆるドットブロット
法である。これら４法は、遺伝子工学分野の研究の様々
な実験で使用されている。2. Description of the Related Art Hybridization methods are used to identify the type of mRNA expressed in cells and tissues.
Alternatively, it is a commonly used method for quantifying each mRNA molecular weight. Therefore, hybridization techniques for mRNA identification and quantification are very important in the fields of biology and medicine. It is also a method often used in the analysis of genomic DNA. As the above hybridization method, for example, total RNA or purified RNA is immobilized on a porous carrier such as a nylon membrane, and a fluorescent substance or a radioisotope (R
Gene (RNA) to be detected, labeled with I)
There is a method of hybridizing by mixing with a probe complementary to the above. Techniques belonging to this category include the Northern hybridization method. Also, DN
In the case of A analysis, genomic DNA or nucleic acid amplification product is fragmented with a restriction enzyme or the like, separated by agarose electrophoresis, and the DNA fragment is alkali-denatured, transferred to a membrane, and hybridized with a labeled probe. Hybridization method. Alternatively, the gene to be detected (R
NA) or R purified from said mixture.
There is a method in which NA is labeled with a fluorescent substance or a radioisotope or the like, and this is hybridized with a probe immobilized on a membrane. Techniques belonging to this category include the reverse dot blot method. On the other hand, there is a method of immobilizing mRNA, nucleic acid amplification products, and the like on a membrane and hybridizing with a labeled probe, which is a so-called dot blot method. These four methods are used in various experiments in the field of genetic engineering.
【０００３】従来のハイブリダイゼーション法では通
常、膜上に固定化された核酸が使用されてきたが、最
近、上記のハイブリダイゼーション技術について、ガラ
スのような非多孔性の硬質の担体上に、主として既知の
ＤＮＡ断片を固定化して使用するハイブリダイゼーショ
ン技術が開発されている。この技術においては、担体表
面上のあらかじめ定められた領域に数多くの種類のＤＮ
Ａ断片を極めて高密度に固定することができる。このよ
うな高密度にＤＮＡ断片が固定化された担体は、一般に
ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）と呼ばれてい
る。当該ＤＮＡマイクロアレイを使用することにより、
少量の試料中の多種類のｍＲＮＡの同定、定量を一度に
実施することが可能になった。[0003] In the conventional hybridization method, nucleic acids immobilized on a membrane have been usually used. Recently, however, the above-mentioned hybridization technique has been mainly applied to a non-porous hard carrier such as glass. Hybridization techniques using a known DNA fragment immobilized have been developed. In this technique, a large number of types of DN
The fragment A can be fixed at an extremely high density. Such a carrier on which DNA fragments are immobilized at high density is generally called a DNA microarray (DNA chip). By using the DNA microarray,
It became possible to identify and quantify many types of mRNA in a small amount of sample at a time.
【０００４】上記ＤＮＡマイクロアレイを使用する場合
には、試料中の核酸を、例えば蛍光物質を用いて標識
し、担体上に固定化されたＤＮＡ断片とハイブリダイズ
させて検出するのが一般的である。すなわち、試料中の
ｍＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイで検出する場合には、
例えば、以下のような方法で試料を標識することができ
る。 １．試料中のｍＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成の際に
蛍光標識ヌクレオチドを添加して蛍光標識ｃＤＮＡを作
成する方法、あるいは ２．試料中のｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、蛍光
標識ヌクレオチド存在下に該ｃＤＮＡを鋳型としてＲＮ
Ａポリメラーゼで転写反応を行い、蛍光標識ＲＮＡプロ
ーブを作成する方法。[0004] When the above DNA microarray is used, it is common practice to label a nucleic acid in a sample with, for example, a fluorescent substance and to hybridize with a DNA fragment immobilized on a carrier for detection. . That is, when detecting mRNA in a sample with a DNA microarray,
For example, a sample can be labeled by the following method. 1. 1. a method of preparing a fluorescent-labeled cDNA by adding a fluorescent-labeled nucleotide during cDNA synthesis using mRNA in a sample as a template, or After synthesizing cDNA from mRNA in the sample, RN is used as a template in the presence of fluorescently labeled nucleotides.
A method in which a transcription reaction is performed with A polymerase to prepare a fluorescently labeled RNA probe.
【０００５】上記方法によって作製された標識ＤＮＡあ
るいはＲＮＡは、試料中のｍＲＮＡ由来の塩基配列、若
しくはこれに相補的な塩基配列を有しており、適切なＤ
ＮＡ断片が固定されたマイクロアレイ上で検出すること
ができる。[0005] The labeled DNA or RNA prepared by the above method has a base sequence derived from the mRNA in the sample or a base sequence complementary thereto,
NA fragments can be detected on the immobilized microarray.
【０００６】しかしながら、これらのハイブリダイゼー
ションにおいて、大きな問題点は、ホモロジーの高い領
域が固定化された核酸にクロスハイブリダイゼーション
し、標的核酸の正確な検出が困難であることである。従
来、ハイブリダイゼーションの温度や、ハイブリダイゼ
ーション溶液の組成、ハイブリダイゼーション後の洗浄
条件を工夫することによって特異性を上げる努力が試み
られているが、これらハイブリダイゼーション条件の検
討に加えて、より特異性の高いプローブの調製方法が求
められていた。However, a major problem with these hybridizations is that regions having high homology cross-hybridize with the immobilized nucleic acid, making it difficult to accurately detect the target nucleic acid. Conventionally, efforts have been made to increase the specificity by devising the hybridization temperature, the composition of the hybridization solution, and the washing conditions after hybridization. Thus, there has been a demand for a method for preparing a probe having a high level of resistance.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、標的
核酸に対する特異性の高いポリヌクレオチドを作製し、
ハイブリダイゼーションにおいて特異的な標的核酸の検
出方法を提供することにある。さらに本発明の目的は、
ハイブリダイゼーションにおける特異性の高い増幅核酸
を作製し、該増幅核酸を固相へ固定化し、特異的な標的
核酸の検出方法を提供することにある。An object of the present invention is to prepare a polynucleotide having high specificity for a target nucleic acid,
An object of the present invention is to provide a method for detecting a specific target nucleic acid in hybridization. Further objects of the present invention are:
It is an object of the present invention to provide a method for detecting a specific target nucleic acid by preparing an amplified nucleic acid having high specificity in hybridization and immobilizing the amplified nucleic acid on a solid phase.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、一部又は全部のヌクレオチドをヌクレオチドア
ナログであるＬＮＡ（ｌｏｃｋｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａ
ｃｉｄ）で置換することにより得られたポリヌクレオチ
ドプローブを用いることにより、ハイブリダイゼーショ
ンの特異性が向上することを見出した。さらに本発明者
らは、一部又は全部のヌクレオチドをＬＮＡで置換した
オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸を増
幅し、固相へ固定化することにより、ハイブリダイゼー
ションの特異性が向上することを見出して、本発明を完
成させた。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies, the present inventors have found that some or all of the nucleotides are LNAs (locked nucleic acids) which are nucleotide analogues.
It has been found that the use of the polynucleotide probe obtained by substituting with the cid) improves the specificity of hybridization. Furthermore, the present inventors have found that the specificity of hybridization is improved by amplifying a nucleic acid using an oligonucleotide in which some or all nucleotides have been substituted with LNA as a primer and immobilizing the nucleic acid on a solid phase. Thus, the present invention has been completed.
【０００９】本発明を概説すれば、本発明の第１の発明
は、一部又は全部のヌクレオチドがＬＮＡ（ｌｏｃｋｅ
ｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）に置換され、かつ標識
物質が付加されていることを特徴とするポリヌクレオチ
ドに関する。[0009] In general, the first invention of the present invention is characterized in that some or all of the nucleotides are LNA (locked).
d polynucleotide (d nucleic acid) and a labeling substance added thereto.
【００１０】本発明の第１の発明において、標識物質は
放射線同位元素、化学発光物質、蛍光物質、抗体、リガ
ンドあるいはレセプターのいずれかから選択される物質
であるものが好適に使用できる。また、当該ポリヌクレ
オチドは、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａ
ｃｉｄ）３リン酸存在下、ヌクレオチド伸長反応により
調製することができる。In the first aspect of the present invention, the labeling substance is preferably a substance selected from radioisotopes, chemiluminescent substances, fluorescent substances, antibodies, ligands and receptors. In addition, the polynucleotide is LNA (locked nucleic acid a).
cid) It can be prepared by a nucleotide extension reaction in the presence of triphosphate.
【００１１】本発明の第２の発明は、標的核酸を含有す
る試料より得られた核酸を鋳型として、ＬＮＡ（ｌｏｃ
ｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）３リン酸存在下に
ヌクレオチド伸長反応を行って調製されたポリヌクレオ
チドとプローブをハイブリダイズさせる工程を包含する
ことを特徴とする標的核酸の検出方法に関する。The second invention of the present invention provides an LNA (loc.) Using a nucleic acid obtained from a sample containing a target nucleic acid as a template.
The present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid, which comprises a step of hybridizing a probe with a polynucleotide prepared by performing a nucleotide extension reaction in the presence of a nucleic acid (phosphate).
【００１２】本発明の第２の発明において、ポリヌクレ
オチドは標識物質が付加されたポリヌクレオチドである
ものが好適に使用でき、該標識物質としては、放射線同
位元素、化学発光物質、蛍光物質、抗体、リガンドある
いはレセプターのいずれかから選択される物質が好適に
使用できる。また、本発明の第２の発明において、２本
鎖核酸からなるプローブが使用され、該プローブを変性
処理することなく、ポリヌクレオチドとハイブリダイゼ
ーションを行うことができる。[0012] In the second aspect of the present invention, the polynucleotide may preferably be a polynucleotide to which a labeling substance is added, and the labeling substance may be a radioisotope, a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, an antibody. A substance selected from the group consisting of a ligand and a receptor can be suitably used. Further, in the second invention of the present invention, a probe comprising a double-stranded nucleic acid is used, and hybridization with the polynucleotide can be performed without denaturing the probe.
【００１３】本発明の第３の発明は、少なくとも１種類
のプライマーの一部又は全部のヌクレオチドがＬＮＡ
（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）に置換さ
れたプライマーを用いて増幅された核酸であって；該プ
ライマーが、担体表面上の官能基および／または標識化
合物と共有結合可能な官能基を有することを特徴とする
増幅核酸に関する。[0013] The third invention of the present invention is the method of the present invention, wherein a part or all of nucleotides of at least one kind of primer is LNA.
A nucleic acid amplified using a primer substituted with (locked nucleic acid), wherein the primer has a functional group on the surface of a carrier and / or a functional group capable of covalently binding to a labeling compound. It relates to an amplified nucleic acid.
【００１４】本発明の第３の発明において、核酸増幅方
法はＬＣＲ法、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法ある
いはＳＤＡ法からなる群から選択される方法が好適に使
用できる。In the third invention of the present invention, a method selected from the group consisting of the LCR method, the PCR method, the ICAN method, the LAMP method and the SDA method can be suitably used as the nucleic acid amplification method.
【００１５】本発明の第４の発明は、本発明の第３の発
明の増幅核酸を担体表面のあらかじめ定められた領域に
固定化した核酸固定化物に関する。The fourth invention of the present invention relates to a nucleic acid-immobilized product in which the amplified nucleic acid of the third invention of the present invention is immobilized on a predetermined region on the surface of a carrier.
【００１６】本発明の第４の発明において、増幅核酸は
担体に静電結合を介してあるいは共有結合を介して固定
化されることが好ましい。In the fourth aspect of the present invention, it is preferable that the amplified nucleic acid is immobilized on the carrier via an electrostatic bond or a covalent bond.
【００１７】本発明の第５の発明は、本発明の第４の発
明の核酸固定化物を用いることを特徴とする標的核酸の
検出方法に関する。The fifth invention of the present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid, which comprises using the immobilized nucleic acid of the fourth invention of the present invention.
【００１８】[0018]
【発明の実施の形態】本明細書においてＬＮＡ（ｌｏｃ
ｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）とは国際公開第９
９／１４２２６号パンフレットで開示された一連のヌク
レオシドアナログの総称であり、例えば、塩基部分にア
デニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルを有す
るものが挙げられる。通常のヌクレオシドが糖成分とし
てリボース又はデオキシリボースを持つのに対して、Ｌ
ＮＡは５炭糖の２’位と４’位又は２’位と３’位が架
橋されたものを持つ。また、ＬＮＡ３リン酸とは、上記
ＬＮＡに３分子のリン酸が結合したものである。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In this specification, LNA (loc
Ked nucleic acid) is International Publication No. 9
9/14226 is a generic term for a series of nucleoside analogs disclosed in pamphlet No. 9/14226, and includes, for example, those having adenine, cytosine, guanine, thymine, and uracil in the base portion. While ordinary nucleosides have ribose or deoxyribose as the sugar component, L
NA has a pentose in which the 2′- and 4′-positions or the 2′- and 3′-positions of pentose are crosslinked. The LNA triphosphate is obtained by binding three molecules of phosphoric acid to the above LNA.
【００１９】本明細書において、デオキシリボヌクレオ
チドとは、糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成さ
れたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にア
デニン、シトシン、グアニン、チミンを有するものが挙
げられる。さらに、７−デアザグアノシン等の修飾塩基
を有するデオキシリボヌクレオチドやデオキシイノシン
ヌクレオチドのようなデオキシリボヌクレオチドアナロ
グも上記のデオキシリボヌクレオチドに包含される。As used herein, the term "deoxyribonucleotide" refers to a nucleotide having a sugar moiety composed of D-2-deoxyribose, and examples thereof include those having adenine, cytosine, guanine, and thymine in the base moiety. . Further, deoxyribonucleotide analogs such as deoxyribonucleotides and deoxyinosine nucleotides having modified bases such as 7-deazaguanosine are also included in the above deoxyribonucleotides.
【００２０】本明細書においてリボヌクレオチド（本明
細書中ではＮとも記載する）とは、糖部分がＤ−リボー
スで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分に
アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するもの
が挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドには修飾
リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の
酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド
［（α−Ｓ）リボヌクレオチド、（α−Ｓ）Ｎとも記載
する］やこの他の誘導体等も含まれる。In the present specification, a ribonucleotide (also referred to as N in the present specification) refers to a nucleotide having a sugar moiety composed of D-ribose, and adenine, cytosine, guanine, or uracil as a base moiety. Ones having. Further, the ribonucleotide includes a modified ribonucleotide, for example, a modified ribonucleotide in which an oxygen atom of a phosphate group at the α-position is replaced with a sulfur atom [also referred to as (α-S) ribonucleotide and (α-S) N. And other derivatives thereof.
【００２１】さらに、ＬＮＡ［ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄ、プロシーディングズ オブ ザ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ
ザＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ）、第９７巻、第５６３３〜５６３８頁（２００
０）、国際公開第９９／１４２２６号パンフレット］の
ようなリボースの誘導体を有するヌクレオチドアナロ
グ、あるいはペプチド核酸［ＰＮＡ、Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、第３６５巻、第５６６〜５６８頁（１９９３）］
も上記デオキシヌクレオチドあるいはリボヌクレオチド
の範疇である。Further, LNA [locked Nucl]
eic Acid, Proceedings of the National Academy of Sciences of
The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA), 97, pp. 5633-5638 (200
0), WO99 / 14226], or a nucleotide nucleic acid having a derivative of ribose or a peptide nucleic acid [PNA, Peptide]
Nucleic Acid, Nature
e), 365, 566-568 (1993)]
Are also in the category of the above deoxynucleotides or ribonucleotides.
【００２２】本明細書において逆転写酵素（ＲＴａｓ
ｅ）とは、ＲＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成
する酵素のことを言い、天然型の逆転写酵素の他、前記
活性を有する変異体酵素も包含される。As used herein, reverse transcriptase (RTas)
e) refers to an enzyme that synthesizes a new DNA chain using the RNA chain as a template, and includes a mutant enzyme having the above-mentioned activity in addition to a natural reverse transcriptase.
【００２３】本明細書においてＲＮＡポリメラーゼと
は、ＤＮＡを鋳型として新たなＲＮＡ鎖を合成する酵素
のことを言い、天然型のＲＮＡポリメラーゼの他、前記
活性を有する変異体酵素も包含される。In the present specification, the term "RNA polymerase" refers to an enzyme that synthesizes a new RNA chain using DNA as a template, and includes a naturally occurring RNA polymerase and a mutant enzyme having the above-mentioned activity.
【００２４】本明細書において標的核酸とは、検出しよ
うとする核酸配列、たとえば任意の遺伝子の核酸配列の
ことをいう。該核酸配列は、ＤＮＡあるいはＲＮＡのい
ずれであってもよい。As used herein, the term "target nucleic acid" refers to a nucleic acid sequence to be detected, for example, a nucleic acid sequence of any gene. The nucleic acid sequence may be either DNA or RNA.
【００２５】本明細書において５’末端とは、核酸、例
えば、プライマーにおいてその中央より５’末端にかけ
ての部分を指す。As used herein, the 5 'end refers to a nucleic acid, for example, a portion of a primer from the center to the 5' end.
【００２６】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）本発明のポリヌクレオチドとその調製方法 本発明のポリヌクレオチドは、標的核酸と特異的にハイ
ブリダイズ可能なものであれば特に限定はなく、例えば
その一部又は全部がヌクレオチドアナログおよび／又は
修飾ヌクレオチドで置換されていてもよい。即ち、本発
明のポリヌクレオチドには、当該標的核酸とのハイブリ
ダイゼーション機能を失わない範囲で１以上のヌクレオ
チドアナログを含有させることができ、さらに、当該ヌ
クレオチドアナログは複数の種類のものを組合せて使用
することができる。該ヌクレオチドアナログとしては、
特に限定はされないが、例えば、デオキシイノシンヌク
レオチド、デオキシウラシルヌクレオチドあるいは７−
デアザグアニンのような修飾塩基を有するデオキシリボ
ヌクレオチドアナログ、ＬＮＡ［Locked Nucleic Aci
d、プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカ
デミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA）、第９７巻、第５６３３〜
５６３８頁（２０００）、国際公開第９９／１４２２６
号パンフレット］のようなリボースの誘導体を有するヌ
クレオチドアナログを使用することができる。また、本
発明のポリヌクレオチドは、上記の機能を保持する範囲
内で種々の修飾、例えば標識物質等の付加がなされてい
るデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチドあるいはヌ
クレオチドアナログを含有してもよい。さらに、本発明
のポリヌクレオチドはペプチド核酸［ＰＮＡ、Peptide
Nucleic Acid、ネイチャー（Nature）、第３６５巻、第
５６６〜５６８頁（１９９３）］を含有するものであっ
てもよい。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、標識
物質と結合可能なように官能基を有していてもよい。該
官能基は、特に限定はされないが例えば、アミノ基、水
酸基、チオール基、アルデヒド基、エステル基、アシル
基、カルボキシル基、エポキシ基等が挙げられる。Hereinafter, the present invention will be described in detail. (1) Polynucleotide of the Present Invention and Preparation Method Thereof The polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it can specifically hybridize with a target nucleic acid. For example, a part or all of the polynucleotide is a nucleotide analog and / or It may be substituted with a modified nucleotide. That is, the polynucleotide of the present invention can contain one or more nucleotide analogs as long as the hybridization function with the target nucleic acid is not lost, and the nucleotide analogs may be used in combination of a plurality of types. can do. As the nucleotide analog,
Although not particularly limited, for example, deoxyinosine nucleotide, deoxyuracil nucleotide or 7-
A deoxyribonucleotide analog having a modified base such as deazaguanine, LNA [Locked Nucleic Aci
d, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA (Pr
Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 97, No. 5633-
5638 (2000), WO 99/14226
No. Pamphlet], a nucleotide analog having a ribose derivative can be used. Further, the polynucleotide of the present invention may contain deoxynucleotides, ribonucleotides or nucleotide analogs to which various modifications, for example, addition of a labeling substance or the like have been made, as long as the above functions are maintained. Furthermore, the polynucleotide of the present invention may be a peptide nucleic acid [PNA, Peptide
Nucleic Acid, Nature, Vol. 365, pp. 566-568 (1993)]. Further, the polynucleotide of the present invention may have a functional group so that it can bind to a labeling substance. The functional group is not particularly limited, and examples thereof include an amino group, a hydroxyl group, a thiol group, an aldehyde group, an ester group, an acyl group, a carboxyl group, and an epoxy group.
【００２７】上記標識物質としては特に限定はされない
が、放射線同位元素、化学発光物質、蛍光物質、抗体、
リガンドあるいはレセプター等の標識物質から選択され
るものが好ましく、例えば、標識がフルオレセイン、カ
スケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ，ロ
ーダミン、Ａｌｅｘａ、テキサスレッド、ＦＡＭ、Ｃｙ
３あるいはＣｙ５等の蛍光物質のいずれかから選択する
ことができる。The labeling substance is not particularly limited, but may be a radioisotope, a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, an antibody,
Those selected from labeling substances such as ligands and receptors are preferable. For example, the label is fluorescein, cascade blue, Oregon green, BODIPY, rhodamine, Alexa, Texas red, FAM, Cy.
3 or a fluorescent substance such as Cy5.
【００２８】本発明のポリヌクレオチドの調製方法は、
特に限定はされないが、例えば、ポリリボヌクレオチド
（例えば、ｍＲＮＡ）を鋳型とした逆転写反応が好適に
使用できる。また、逆転写反応に使用される酵素として
は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するもの
であれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイル
ス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネ
ズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａ
ｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２
ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられ
る。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラー
ゼを使用することもでき、例えばサーマス属細菌由来Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ等）、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラ
ーゼ）、さらにＢａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａ
ｘ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ ＤＮＡポリメラー
ゼ）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ
等を使用できる。例えば、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ
は、逆転写反応にマンガンイオンを必要とせず、また、
高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながら
ｃＤＮＡを合成することができる。上記の逆転写酵素活
性を有する酵素も、当該活性を有している範囲において
天然体、変異体のいずれもが使用できる。The method for preparing the polynucleotide of the present invention comprises:
Although not particularly limited, for example, a reverse transcription reaction using a polyribonucleotide (eg, mRNA) as a template can be suitably used. The enzyme used for the reverse transcription reaction is not particularly limited as long as it has a cDNA synthesis activity using RNA as a template. For example, avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase (AMV RTase), Moloney murine Leukemia virus-derived reverse transcriptase (MMLV RTa
se), Rous-related virus 2 reverse transcriptase (RAV-2)
RTase) and the like. In addition, a DNA polymerase having reverse transcription activity can also be used.
NA polymerase (Tth DNA polymerase, etc.),
Bacillus stearothermophil
us-derived DNA polymerase (Bst DNA polymerase), and Bacillus caldotena
A DNA polymerase derived from a thermophilic Bacillus bacterium such as x-derived DNA polymerase (Bca DNA polymerase) can be used. For example, Bca DNA polymerase does not require manganese ions for the reverse transcription reaction,
CDNA can be synthesized under high temperature conditions while suppressing secondary structure formation of template RNA. As for the enzyme having the above reverse transcriptase activity, any of natural and mutant enzymes can be used as long as the enzyme has the activity.
【００２９】上記逆転写反応のいずれの場合において
も、ＬＮＡ３リン酸アナログの存在下に反応を実施する
ことにより、ＬＮＡを含有するポリヌクレオチドを作製
することができる。また、標識デオキシヌクレオチド３
リン酸の存在下に反応を実施することにより、容易に標
識ポリヌクレオチド作製することができる。さらに、標
識物質を付加したＬＮＡ３リン酸を含有させてもよい。
本発明の調製方法で使用できる標識ヌクレオチドは、特
に限定はされないが例えば、放射線同位元素、化学発光
物質、蛍光物質、抗体、リガンドあるいはレセプター等
で標識されたヌクレオチド、さらに上記逆転写反応を阻
害しない標識ヌクレオチドあるいは該標識ヌクレオチド
のアナログが挙げられる。In any of the above reverse transcription reactions, a polynucleotide containing LNA can be prepared by carrying out the reaction in the presence of an LNA3 phosphate analog. In addition, labeled deoxynucleotide 3
By performing the reaction in the presence of phosphoric acid, a labeled polynucleotide can be easily prepared. Further, LNA3 phosphate to which a labeling substance has been added may be contained.
The labeled nucleotide that can be used in the preparation method of the present invention is not particularly limited, but, for example, a nucleotide labeled with a radioisotope, a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, an antibody, a ligand or a receptor, and further does not inhibit the reverse transcription reaction. Labeled nucleotides or analogs of the labeled nucleotides are mentioned.
【００３０】本発明のポリヌクレオチドの調製方法の一
態様としては、下記工程を包含する方法が挙げられる。 （ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リ
ン酸、ＬＮＡ３リン酸、標識デオキシリボヌクレオチド
３リン酸および／または標識ＬＮＡ３リン酸、逆転写酵
素およびＯｌｉｇｏ ｄＴプライマーを混合して反応混
合物を調製する工程；ここで該標識デオキシリボヌクレ
オチド３リン酸および／または標識ＬＮＡ３リン酸は、
放射線同位元素、化学発光物質、蛍光物質、抗体、リガ
ンドあるいはレセプターのいずれかから選択される物質
で標識されている； および、（ｂ）反応産物を生成す
るのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工
程。One embodiment of the method for preparing the polynucleotide of the present invention includes a method comprising the following steps. (A) preparing a reaction mixture by mixing a template nucleic acid, deoxyribonucleotide triphosphate, LNA triphosphate, labeled deoxyribonucleotide triphosphate and / or labeled LNA triphosphate, reverse transcriptase and Oligo dT primer; Here, the labeled deoxyribonucleotide triphosphate and / or the labeled LNA triphosphate is
Labeled with a substance selected from a radioisotope, a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, an antibody, a ligand or a receptor; and (b) incubating the reaction mixture for a time sufficient to produce a reaction product Process.
【００３１】また、本発明のポリヌクレオチドの調製方
法の別態様としては、特に限定はされないが、例えば２
本鎖ｃＤＮＡを鋳型としたＲＮＡ合成反応が好適に使用
できる。ポリリボヌクレオチドを鋳型として、５’側に
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を付加させたオリ
ゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応した後、２本鎖ｃ
ＤＮＡを合成し、該２本鎖ｃＤＮＡを鋳型にＲＮＡ合成
反応を行う。Another embodiment of the method for preparing the polynucleotide of the present invention is not particularly limited.
An RNA synthesis reaction using a single-stranded cDNA as a template can be suitably used. A reverse transcription reaction was performed using an oligo dT primer to which an RNA polymerase promoter sequence was added on the 5 ′ side using polyribonucleotide as a template, followed by double-stranded c.
DNA is synthesized, and an RNA synthesis reaction is performed using the double-stranded cDNA as a template.
【００３２】上記ＲＮＡ合成反応に使用される酵素とし
ては、ＤＮＡを鋳型としたＲＮＡ合成活性を有するもの
であれば特に限定はなく、例えばＴ７ファージ由来ＲＮ
Ａ合成反応酵素（Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ）、ＳＰ６ファージ由来ＲＮＡ合成反応酵素（ＳＰ６
ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、Ｔ３ファージ由来
ＲＮＡ合成反応酵素（Ｔ３ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ）等、種々の起源のＲＮＡポリメラーゼが挙げられ
る。上記のＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素も、当
該活性を有している範囲において天然体、変異体のいず
れもが使用できる。The enzyme used in the above RNA synthesis reaction is not particularly limited as long as it has an RNA synthesis activity using DNA as a template.
A-synthesis enzyme (T7 RNA Polymeras)
e), RNA synthesis reaction enzyme derived from SP6 phage (SP6
RNA Polymerase), T3 phage-derived RNA synthesis enzyme (T3 RNA Polymerase)
se) and other RNA polymerases of various origins. As for the enzyme having the RNA polymerase activity, any of natural and mutant enzymes can be used as long as the enzyme has the activity.
【００３３】上記ＲＮＡポリメラーゼ反応のいずれの場
合においても、ＬＮＡ３リン酸の存在下に反応を実施す
ることにより、ＬＮＡを含有するポリヌクレオチドを作
製することができる。さらに、標識リボヌクレオチド３
リン酸および／または標識ＬＮＡ３リン酸の存在下に反
応を実施することにより、容易に標識ポリヌクレオチド
を作製することができる。また、本発明の調製方法で使
用する標識ヌクレオチドは、放射線同位元素、化学発光
物質、蛍光物質、抗体、リガンドあるいはレセプターで
標識されたヌクレオチドから選択でき、上記逆転写反応
を阻害しない標識ヌクレオチドあるいは該標識ヌクレオ
チドアナログであってもよい。In any of the above RNA polymerase reactions, a polynucleotide containing LNA can be prepared by carrying out the reaction in the presence of LNA triphosphate. In addition, labeled ribonucleotide 3
By performing the reaction in the presence of phosphate and / or labeled LNA3 phosphate, a labeled polynucleotide can be easily produced. The labeled nucleotide used in the preparation method of the present invention can be selected from nucleotides labeled with a radioisotope, a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, an antibody, a ligand or a receptor, and does not inhibit the reverse transcription reaction or the labeled nucleotide. It may be a labeled nucleotide analog.
【００３４】また、本発明のポリヌクレオチドの調製方
法の別態様としては、非標識のヌクレオチドをヌクレオ
チド伸長反応に使用し、反応終了後にさらに、酵素化学
的あるいは化学的に標識化合物を導入する、以下の方法
であってもよい。 （ａ）鋳型となる核酸を、５’末端にＲＮＡプロモータ
ー配列を含有するＯｌｉｇｏ ｄＴプライマーを用いた
逆転写反応およびヌクレオチド伸長反応により得られた
２本鎖ｃＤＮＡ、リボヌクレオチド３リン酸、ＬＮＡ３
リン酸、官能基を有するリボヌクレオチド３リン酸アナ
ログおよび／または官能基を有するＬＮＡ３リン酸アナ
ログおよびＲＮＡポリメラーゼを混合して反応混合物を
調製する工程； （ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物
をインキュベートする工程。 （ｃ）上記（ｂ）で得られたＲＮＡに標識物質を導入す
る工程In another embodiment of the method for preparing the polynucleotide of the present invention, an unlabeled nucleotide is used in a nucleotide extension reaction, and after completion of the reaction, a labeled compound is further introduced enzymatically or chemically. May be used. (A) Double-stranded cDNA, ribonucleotide triphosphate, LNA3 obtained by a reverse transcription reaction and a nucleotide extension reaction using an Oligo dT primer containing an RNA promoter sequence at the 5 'end,
Preparing a reaction mixture by mixing phosphate, a ribonucleotide triphosphate analog having a functional group and / or an LNA triphosphate analog having a functional group and RNA polymerase; (b) sufficient to produce a reaction product Incubating the reaction mixture for a period of time. (C) a step of introducing a labeling substance into the RNA obtained in (b) above
【００３５】さらに、本発明のポリヌクレオチドの調製
方法の別態様としては、鋳型としてポリリボアデニンヌ
クレオチド、プライマーとしてオリゴデオキシチミンヌ
クレオチドの存在下での逆転写反応において、デオキシ
ウラシルヌクレオチド３リン酸と塩基としてウラシルを
有するＬＮＡ３リン酸を基質として使用することによ
り、ＬＮＡを含有するポリデオキシウラシルヌクレオチ
ドを調製することができる。この場合、標識物質の付加
したデオキシウラシルヌクレオチド３リン酸とＬＮＡ３
リン酸を組み合わせることにより本発明のポリヌクレオ
チドを調製することができる。該ポリヌクレオチドは、
特に限定はされないが例えば、膜または固相表面上にス
ポットされたｍＲＮＡのポリＡテールとハイブリダイズ
することができ、ポリＡテール以外の核酸部分にハイブ
リダイズ可能な本発明のポリヌクレオチドと組み合わせ
ることができる。Further, in another embodiment of the method for preparing the polynucleotide of the present invention, in a reverse transcription reaction in the presence of a polyriboadenine nucleotide as a template and an oligodeoxythymine nucleotide as a primer, deoxyuracil nucleotide triphosphate is reacted with a base. By using LNA3 phosphate having uracil as a substrate, a polydeoxyuracil nucleotide containing LNA can be prepared. In this case, deoxyuracil nucleotide triphosphate to which a labeling substance is added and LNA3
The polynucleotide of the present invention can be prepared by combining phosphoric acid. The polynucleotide is
Although not particularly limited, for example, a polynucleotide of the present invention capable of hybridizing with a polyA tail of mRNA spotted on a membrane or a solid phase surface and capable of hybridizing to a nucleic acid portion other than the polyA tail can be used. Can be.
【００３６】以上のように、本発明の標識化されたポリ
ヌクレオチドを調製することができる公知の標識導入方
法であれば、いずれの方法でも好適に使用できる。As described above, any known method for introducing a label that can prepare the labeled polynucleotide of the present invention can be suitably used.
【００３７】（２）本発明の標的核酸の検出方法 本発明の検出方法において、標的核酸に本発明のポリヌ
クレオチドをハイブリダイズすることにより検出するこ
とができる。該ポリヌクレオチドに付加した標識物質
は、放射線同位元素、化学発光物質、蛍光物質、抗体、
リガンドあるいはレセプターで標識されたヌクレオチド
のいずれかから選択されるものが好ましく、例えば、標
識がフルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリ
ーン、ＢＯＤＩＰＹ，ローダミン、Ａｌｅｘａ、テキサ
スレッド、ＦＡＭ、Ｃｙ３あるいはＣｙ５等の蛍光物質
のいずれかから選択することができる。(2) Target nucleic acid detection method of the present invention In the detection method of the present invention, the target nucleic acid can be detected by hybridizing the polynucleotide of the present invention to the target nucleic acid. The label added to the polynucleotide is a radioisotope, a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, an antibody,
Those selected from any of nucleotides labeled with a ligand or a receptor are preferable. You can choose from either.
【００３８】ハイブリダイゼーションの工程において、
本発明のポリヌクレオチドを使用した場合にはハイブリ
ダイゼーションの特異性が向上しているため、非特異的
なハイブリダイゼーションが起こらないストリンジェン
トな条件下においても標的核酸とポリヌクレオチド間の
ハイブリダイゼーションは安定である。In the hybridization step,
When the polynucleotide of the present invention is used, hybridization specificity is improved, so that hybridization between the target nucleic acid and the polynucleotide is stable even under stringent conditions in which nonspecific hybridization does not occur. It is.
【００３９】本発明の検出方法において、よりストリン
ジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うこと
ができるため、固相に固定化された標的核酸を変性処理
することなく、ストリンジェントな条件下でハイブリダ
イゼーションを行うことができる。さらに、固相に固定
化された標的核酸の変性をハイブリダイゼーション時に
溶液中で行うことができ、例えば８５℃以上の高温でハ
イブリダイゼーションすることにより、標的核酸を検出
することができる。In the detection method of the present invention, hybridization can be carried out under more stringent conditions, so that the target nucleic acid immobilized on the solid phase can be hybridized under stringent conditions without denaturation treatment. It can be performed. Further, denaturation of the target nucleic acid immobilized on the solid phase can be performed in a solution at the time of hybridization. For example, the target nucleic acid can be detected by hybridization at a high temperature of 85 ° C. or higher.
【００４０】（３）本発明の増幅核酸とその調製方法 本発明の増幅核酸は、ＬＮＡ等のヌクレオチドアナログ
を含有したプライマーを用いて増幅された核酸であれば
いずれもが好適に使用できる。その際、該プライマー
は、他の物質と結合可能な官能基を有するヌクレオチド
あるいはヌクレオチドアナログを含有していてもよい。
該官能基は、特に限定はされないが例えば、アミノ基、
水酸基、チオール基、アルデヒド基、エステル基、アシ
ル基、カルボキシル基、エポキシ基等が好適に使用でき
る。(3) Amplified nucleic acid of the present invention and method for preparing the same Any of the amplified nucleic acids of the present invention can be suitably used as long as they are amplified using a primer containing a nucleotide analog such as LNA. In this case, the primer may contain a nucleotide or a nucleotide analog having a functional group capable of binding to another substance.
The functional group is not particularly limited, for example, an amino group,
A hydroxyl group, a thiol group, an aldehyde group, an ester group, an acyl group, a carboxyl group, an epoxy group and the like can be suitably used.
【００４１】本発明の増幅核酸の調製方法は、特に限定
はされないが、例えば、ＰＣＲ法を用いることができ
る。すなわち、鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオ
チド３リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、および少な
くとも１種類のプライマーを混合して反応混合物を調製
し、鋳型となる核酸の変性、プライマーのアニーリング
および伸長反応を繰り返すことにより得ることができ
る。The method for preparing the amplified nucleic acid of the present invention is not particularly limited. For example, a PCR method can be used. That is, a reaction mixture is prepared by mixing a template nucleic acid, deoxyribonucleotide triphosphate, a heat-resistant DNA polymerase, and at least one kind of primer, and denaturation of the template nucleic acid, and annealing and extension of the primer are repeated. Can be obtained by
【００４２】さらに、国際公開第００／５６８７７号パ
ンフレット記載のＩＣＡＮ法を用いて調製することが出
来る。すなわち、鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレ
オチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラー
ゼ、少なくとも１種類のキメラオリゴヌクレオチドプラ
イマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調
製し、反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物
をインキュベートする。Further, it can be prepared by using the ICAN method described in WO 00/56877. That is, a nucleic acid serving as a template, deoxyribonucleotide triphosphate, a DNA polymerase having a strand displacement activity, at least one kind of chimeric oligonucleotide primer, and RNaseH are mixed to prepare a reaction mixture, which is sufficient to generate a reaction product. Incubate the reaction mixture for a period of time.
【００４３】すなわち、オリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして利用する方法であれば特に限定はなく、ＰＣＲ
法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ
法などが好適に使用できる。また、鋳型となる核酸も特
に限定はなく、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれもが好適に
使用できる。上記増幅反応のいずれの場合においても、
一部又は全部のヌクレオチドをＬＮＡで置換したオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして使用することにより、
ＬＮＡリン酸を含有する増幅核酸を作製することができ
る。That is, there is no particular limitation as long as the method uses an oligonucleotide as a primer.
Method, RT-PCR method, ICAN method, LAMP method, SDA
Method can be suitably used. The nucleic acid used as a template is not particularly limited, and any of DNA and RNA can be suitably used. In any of the above amplification reactions,
By using as a primer an oligonucleotide in which some or all nucleotides have been replaced with LNA,
An amplified nucleic acid containing LNA phosphate can be produced.
【００４４】さらに、本発明の増幅核酸の別態様として
は、増幅核酸が固相への固定化のための修飾デオキシリ
ボヌクレオチドを含有することを特徴とする増幅核酸で
あってもよい。すなわち、特に限定はされないが例えば
使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、固相への固
定化のための官能基を該プライマーの５’末端に有して
もよい。この場合、官能基とプライマーの５’末端の間
にスペーサーを有していてもよい。即ち、固相への固定
化ができ、本発明の方法において増幅を阻害しないよう
な官能基であれば、特に限定はされない。該修飾プライ
マーは、本発明の方法により調製された核酸を固定化す
るのに可能な官能基を有しているものが好適に使用で
き、特に限定はされないが例えば、水酸基、アミノ基、
チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基、エポキシ
基、アシル基を５’末端に有する修飾プライマーが例示
される。該修飾プライマーとしては、５’アミノリンク
プライマーが好適に使用できる。Furthermore, as another embodiment of the amplified nucleic acid of the present invention, the amplified nucleic acid may be a modified nucleic acid containing a modified deoxyribonucleotide for immobilization on a solid phase. That is, although not particularly limited, for example, the oligonucleotide primer to be used may have a functional group for immobilization to a solid phase at the 5 ′ end of the primer. In this case, a spacer may be provided between the functional group and the 5 ′ end of the primer. That is, there is no particular limitation as long as the functional group can be immobilized on a solid phase and does not inhibit amplification in the method of the present invention. As the modified primer, those having a functional group capable of immobilizing the nucleic acid prepared by the method of the present invention can be suitably used, and are not particularly limited, for example, a hydroxyl group, an amino group,
Modified primers having a thiol group, an aldehyde group, a carboxyl group, an epoxy group, or an acyl group at the 5 ′ end are exemplified. As the modified primer, a 5 'amino link primer can be suitably used.
【００４５】さらに、本発明の核酸増幅中に増幅核酸を
修飾する方法も使用できる。すなわち、本発明の核酸増
幅方法で用いるＤＮＡポリメラーゼが基質として取り込
むことが可能な修飾デオキシリボヌクレオチドであれ
ば、特に限定はされず、使用できる。該修飾デオキシリ
ボヌクレオチド３リン酸は、本発明の方法により調製さ
れた核酸を固定化するのに可能な官能基を有しているも
のが好適に使用でき、特に限定はされないが例えば、水
酸基、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキ
シル基、エポキシ基、アシル基を有する修飾デオキシリ
ボヌクレオチド３リン酸が例示される。該修飾デオキシ
リボヌクレオチド３リン酸としては、Ａｍｉｎｏａｌｌ
ｙｌ ｄＵＴＰが好適に使用できる。Further, the method of the present invention for modifying an amplified nucleic acid during nucleic acid amplification can also be used. That is, any modified deoxyribonucleotide that can be incorporated as a substrate by the DNA polymerase used in the nucleic acid amplification method of the present invention is not particularly limited and can be used. As the modified deoxyribonucleotide triphosphate, those having a functional group capable of immobilizing the nucleic acid prepared by the method of the present invention can be suitably used, and are not particularly limited. Modified deoxyribonucleotide triphosphates having a group, thiol group, aldehyde group, carboxyl group, epoxy group, and acyl group are exemplified. As the modified deoxyribonucleotide triphosphate, Aminoall
yl dUTP can be suitably used.
【００４６】（４）本発明の増幅核酸の固定化物 核酸固定化物としては、上記（３）の増幅核酸を固定化
したものであれば特に限定はされないが例えば、上記
（３）の増幅核酸を固定化したＤＮＡチップが挙げられ
る。該核酸固定化物において、固相担体への固定化は、
スポッティング法あるいはインクジェット法等、公知の
方法のいずれもが好適に使用できる。(4) Immobilized product of the amplified nucleic acid of the present invention The nucleic acid-immobilized product is not particularly limited as long as the amplified nucleic acid of the above (3) is immobilized. An example is an immobilized DNA chip. In the nucleic acid immobilized product, immobilization on a solid phase carrier,
Any known method such as a spotting method or an ink jet method can be suitably used.
【００４７】また、該ＤＮＡチップは、多数の異なる遺
伝子あるいはＤＮＡの断片をスライドグラス等の固相担
体上の所定の領域あるいは所定の位置に整列させて固定
化した核酸固定化物であり、ＤＮＡマイクロアレイ（Ｄ
ＮＡアレイ）とも呼ばれる。上記所定の領域、所定の位
置あるいはあらかじめ定められた領域とは、その領域あ
るいはその位置にどの増幅核酸が固定化されているかが
わかっていることを言う。この場合、その位置にどの増
幅核酸が固定化されているかがわかればよく、該増幅核
酸の塩基配列は、未知あるいは既知のいずれであっても
よい。The DNA chip is a nucleic acid immobilized product in which a number of different genes or DNA fragments are aligned and immobilized in a predetermined region or a predetermined position on a solid support such as a slide glass. (D
NA array). The above-mentioned predetermined region, predetermined position or predetermined region means that it is known which amplified nucleic acid is immobilized in that region or that position. In this case, it is only necessary to know which amplified nucleic acid is immobilized at that position, and the base sequence of the amplified nucleic acid may be unknown or known.
【００４８】上記ＤＮＡチップは、試料より調製した核
酸試料、好ましくは標識された核酸試料と接触させてハ
イブリダイゼーションを行うことにより、核酸試料中に
存在する、ＤＮＡチップ上の所定の領域に整列させて固
定化されたＤＮＡと相補的な配列を有する核酸の存在を
調べる目的で使用される。試料中の多数の核酸を一度の
操作で検出、定量できることから、ＤＮＡチップは遺伝
子の発現解析や変異あるいは多型解析を飛躍的に加速さ
せる手段として非常に有用である。二本鎖核酸が所定の
領域に整列させて固定化されたＤＮＡチップは適切な変
性処理の後にハイブリダイゼーション工程に使用される
が、検出しようとする標的核酸に相補的な一本鎖ＤＮＡ
が所定の領域に整列させて固定化されたＤＮＡチップ
は、標的核酸の検出に特に好適である。The DNA chip is brought into contact with a nucleic acid sample prepared from the sample, preferably a labeled nucleic acid sample, and subjected to hybridization to align the DNA chip with a predetermined region present on the DNA chip. It is used for the purpose of examining the presence of a nucleic acid having a sequence complementary to the DNA immobilized. Since a large number of nucleic acids in a sample can be detected and quantified by a single operation, a DNA chip is very useful as a means for dramatically accelerating gene expression analysis, mutation or polymorphism analysis. A DNA chip in which double-stranded nucleic acids are aligned and immobilized in a predetermined region is used in a hybridization step after appropriate denaturation treatment, and a single-stranded DNA complementary to a target nucleic acid to be detected is used.
A DNA chip in which is aligned and immobilized in a predetermined region is particularly suitable for detecting a target nucleic acid.
【００４９】本発明の核酸固定化物において増幅核酸と
担体との間の結合は、静電結合あるいは共有結合のいず
れもが好適に使用できる。すなわち、増幅核酸と固相と
の静電的な結合や、増幅核酸の修飾部位（例えば、官能
基）を介した共有結合が好適に使用できる。In the nucleic acid immobilized product of the present invention, any of an electrostatic bond and a covalent bond can be suitably used for the bond between the amplified nucleic acid and the carrier. That is, an electrostatic bond between the amplified nucleic acid and the solid phase or a covalent bond via a modified site (for example, a functional group) of the amplified nucleic acid can be preferably used.
【００５０】得られたＤＮＡを所定の領域に整列させて
固定する担体は不溶性のものであれば特に限定はなく、
ガラス、プラスチック等で作製された板状の担体の他、
ニトロセルロースやナイロン製の膜状の担体が好適に使
用される。また、その固定化にあたっては公知の核酸固
定化方法が使用できる。上記のＤＮＡはそのまま担体に
固定化を行う他、適当なリンカーを介して、または複数
分子のＤＮＡをライゲーションさせたうえで固定化して
もよい。The carrier for aligning and fixing the obtained DNA in a predetermined region is not particularly limited as long as it is insoluble.
In addition to plate-shaped carriers made of glass, plastic, etc.,
A film-like carrier made of nitrocellulose or nylon is preferably used. For immobilization, known nucleic acid immobilization methods can be used. The above DNA may be immobilized on a carrier as it is, or may be immobilized via an appropriate linker or after ligation of multiple molecules of DNA.
【００５１】ガラスの担体を使用する場合、特に限定は
されないが例えば、ガラスそのものは電荷が少なく、そ
のままではＤＮＡとの結合力が弱いため、コーティング
処理を行なったものを使用する。コーティング処理とし
ては、ポリ−Ｌ―リシン付加、シリレン化、シラン化等
などが挙げられる。こうしてコーティング処理を行なっ
たガラス担体に、得られたＤＮＡを静電力により固定化
することができる。When a glass carrier is used, the carrier is not particularly limited. For example, glass itself has a small electric charge and, as it is, has a low binding force to DNA. Examples of the coating treatment include poly-L-lysine addition, silylation, silanization, and the like. The obtained DNA can be immobilized on the glass carrier thus coated by electrostatic force.
【００５２】本発明の増幅核酸は、固相への固定化のた
めの修飾デオキシリボヌクレオチドを含有しており、た
とえば、上記のようなガラス担体との静電力による固定
化とは異なる形で担体への固定化が可能である。すなわ
ち、ガラス担体にコーティングされた官能基と、本発明
の増幅核酸中に含まれる修飾デオキシリボヌクレオチド
との化学反応による共有結合を利用した固定化が可能で
ある。The amplified nucleic acid of the present invention contains a modified deoxyribonucleotide for immobilization on a solid phase. For example, the amplified nucleic acid is immobilized on a carrier in a form different from the above-described immobilization with a glass carrier by electrostatic force. Can be fixed. That is, immobilization using a covalent bond by a chemical reaction between the functional group coated on the glass carrier and the modified deoxyribonucleotide contained in the amplified nucleic acid of the present invention is possible.
【００５３】また、この共有結合を利用して、鋳型とな
る核酸の塩基配列に実質的に相補的であり固相への固定
化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有する一
部又は全部のヌクレオチドをＬＮＡで置換したオリゴヌ
クレオチドプライマーと、鋳型となる核酸の塩基配列に
実質的に相補的であり固相への固定化のための修飾デオ
キシリボヌクレオチドを含有しないオリゴヌクレオチド
プライマーを使用して本発明の増幅核酸を作成し、この
増幅核酸を官能基をコーティングしたガラス担体の予め
定められた領域に化学反応により共有結合を生じさせる
ことで固定化し、整列させた後に、修飾デオキシリボヌ
クレオチドプライマーを含まない伸長鎖のみを変性操作
を行なうことで遊離させて、担体上にＬＮＡを含む一本
鎖となるＤＮＡが結合されている核酸固定化物を得るこ
とが可能である。By utilizing this covalent bond, a part or all of the nucleotides which are substantially complementary to the base sequence of the nucleic acid as a template and contain a modified deoxyribonucleotide for immobilization on a solid phase can be obtained. Amplification of the present invention using an LNA-substituted oligonucleotide primer and an oligonucleotide primer that is substantially complementary to the nucleotide sequence of the template nucleic acid and does not contain a modified deoxyribonucleotide for immobilization on a solid phase A nucleic acid is prepared, and the amplified nucleic acid is immobilized by forming a covalent bond by a chemical reaction in a predetermined region of a glass carrier coated with a functional group by a chemical reaction, and after alignment, the extended strand not containing the modified deoxyribonucleotide primer is used. Is released by performing a denaturing operation, and a single-stranded DNA containing LNA is formed on the carrier. It is possible to obtain together is by a nucleic acid immobilized product.
【００５４】上記の増幅核酸の変性条件は、特に限定は
されないが変性温度は１０℃〜６５℃の範囲、アルカリ
溶液濃度は０．１Ｎ〜２．０Ｎの範囲、変性処理時間は
５分〜３０分の範囲が変性条件として好適である。特に
増幅核酸を末端で固相上に固定化した場合、２０℃、
０．２Ｎ ＮａＯＨで５分間、もしくは２０℃、０．５
Ｎ ＮａＯＨで５分間の条件が好適である。The conditions for denaturing the amplified nucleic acid are not particularly limited, but the denaturation temperature ranges from 10 ° C. to 65 ° C., the alkaline solution concentration ranges from 0.1 N to 2.0 N, and the denaturation treatment time ranges from 5 minutes to 30 minutes. A range of minutes is suitable as a denaturing condition. In particular, when the amplified nucleic acid is immobilized on a solid phase at the ends,
5 minutes with 0.2N NaOH, or 20 ° C., 0.5
Conditions for 5 minutes with N NaOH are preferred.
【００５５】また、例えば増幅核酸を該増幅核酸中の修
飾デオキシリボヌクレオチドで固相上に固定化した場
合、６０℃、０．２Ｎ ＮａＯＨで３０分間の条件が好
適である。For example, when the amplified nucleic acid is immobilized on the solid phase with the modified deoxyribonucleotide in the amplified nucleic acid, the conditions are preferably 60 ° C. and 0.2 N NaOH for 30 minutes.
【００５６】これらのアルカリ変性処理以外の方法、特
に限定はされないが例えば、熱変性処理を行ってもよ
い。該熱変性処理の場合、例えば９５℃で３分間の条件
が挙げられる。すなわち、一本鎖核酸が末端であるいは
該核酸に含まれる修飾核酸の部位で固相に固定化された
本発明の増幅核酸固定化物を得ることができる。Methods other than these alkali modification treatments are not particularly limited. For example, a heat modification treatment may be performed. In the case of the heat denaturation treatment, for example, a condition of 95 ° C. for 3 minutes can be mentioned. That is, it is possible to obtain the amplified nucleic acid-immobilized product of the present invention in which the single-stranded nucleic acid is immobilized on the solid phase at the end or at the site of the modified nucleic acid contained in the nucleic acid.
【００５７】（５）本発明の核酸固定化物を用いた標的
核酸の検出方法 本発明の核酸固定化物において、二本鎖核酸が予め定め
られた所定の領域に整列させて固定化された核酸固定化
物の場合は、適切な変性処理の後にハイブリダイゼーシ
ョン工程に使用する事ができる。また、本発明の核酸固
定化物の別態様としては、固定化核酸は検出しようとす
る標的核酸に相補的な一本鎖ＤＮＡが所定の領域に整列
されて固定化されているため、上記変性処理なしに標的
核酸の検出に利用することができる。すなわち、本発明
の増幅産物を用いて作製された担体上に一本鎖となるＤ
ＮＡが結合されているＤＮＡチップは、従来よりも簡便
な操作で、かつ、高感度、高再現性で標的核酸を検出す
ることができる。(5) Method for Detecting Target Nucleic Acid Using Immobilized Nucleic Acid of the Present Invention In the immobilized nucleic acid of the present invention, double-stranded nucleic acid is aligned and immobilized on a predetermined region. In the case of a compound, it can be used in the hybridization step after an appropriate denaturation treatment. In another embodiment of the immobilized nucleic acid of the present invention, the immobilized nucleic acid is a single-stranded DNA complementary to a target nucleic acid to be detected, which is aligned and immobilized in a predetermined region. It can be used for the detection of a target nucleic acid without it. That is, a single-stranded D on a carrier prepared using the amplification product of the present invention
The DNA chip to which NA is bound can detect the target nucleic acid with a simpler operation than before and with high sensitivity and high reproducibility.
【００５８】本発明の検出方法において、標的核酸に標
識ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズすること
により検出することができる。該標識ヌクレオチドは、
放射線同位元素、化学発光物質、蛍光物質、抗体、リガ
ンドあるいはレセプターで標識されたヌクレオチドのい
ずれかから選択されるものが好ましく、例えば、標識が
フルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリー
ン、ＢＯＤＩＰＹ，ローダミン、Ａｌｅｘａ、テキサス
レッド、ＦＡＭ、Ｃｙ３あるいはＣｙ５等のいずれかか
ら選択される標識ヌクレオチドが好適に使用できる。In the detection method of the present invention, detection can be performed by hybridizing a labeled polynucleotide probe to a target nucleic acid. The labeled nucleotide is
Preferably selected from radioisotopes, chemiluminescent substances, fluorescent substances, antibodies, nucleotides labeled with ligands or receptors, for example, the label is fluorescein, cascade blue, Oregon green, BODIPY, rhodamine, Alexa, A labeled nucleotide selected from Texas Red, FAM, Cy3, Cy5, or the like can be suitably used.
【００５９】本発明の核酸固定化物を用いたハイブリダ
イゼーションの工程において、ハイブリダイゼーション
の特異性が向上しているため、非特異的なハイブリダイ
ゼーションが起こらないストリンジェントな条件下にお
いても標的核酸と標識ヌクレオチドプローブ間のハイブ
リダイゼーションは安定である。このことから、本発明
の核酸固定化物を用いることにより、標的核酸とより特
異性の高いハイブリダイゼーションを行うことができ、
その結果として、バックグラウンドの抑えられた高感度
検出を行うことができる。In the hybridization step using the nucleic acid-immobilized product of the present invention, since the specificity of hybridization is improved, the target nucleic acid and the label can be labeled under stringent conditions under which non-specific hybridization does not occur. Hybridization between nucleotide probes is stable. From this, by using the nucleic acid immobilized product of the present invention, it is possible to perform higher specific hybridization with the target nucleic acid,
As a result, high-sensitivity detection with a suppressed background can be performed.
【００６０】[0060]
【発明の効果】本発明により、ＬＮＡリン酸を含んだポ
リヌクレオチドを提供される。また、該ヌクレオチドを
用いてハイブリダイゼーションを行うことにより、特異
性の高い標的核酸の検出方法が提供される。さらに本発
明によりＬＮＡリン酸を含有する増幅核酸が提供され、
該核酸を固定化した核酸固定化物を用いることによりバ
ックグラウンドの抑制された標的核酸の検出方法が提供
される。According to the present invention, there is provided a polynucleotide containing LNA phosphate. Further, by performing hybridization using the nucleotide, a method for detecting a target nucleic acid having high specificity is provided. Further, the present invention provides an amplified nucleic acid containing LNA phosphate,
By using the nucleic acid-immobilized product on which the nucleic acid is immobilized, a method for detecting a target nucleic acid with suppressed background is provided.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 CA11 CA20 HA12 HA13 HA20 4B063 QA01 QQ41 QR32 QR41 QR48 QR51 QR56 QR62 QR66 QR84 QS24 QS25 QS34 QX02 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 15/00 F (72) Inventor Ikunoyuki Kato 3-4-1 Seta, Otsu City, Shiga Prefecture Takara Shuzo Central Research Institute Co., Ltd. F-term (reference) 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 CA11 CA20 HA12 HA13 HA20 4B063 QA01 QQ41 QR32 QR41 QR48 QR51 QR56 QR62 QR66 QR84 QS24 QS25 QS34 QX02
Claims (13)
（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）に置換さ
れ、かつ標識物質が付加されていることを特徴とするポ
リヌクレオチド。1. A method according to claim 1, wherein some or all of the nucleotides are LNA.
(Polynucleotide) substituted with (locked nucleic acid) and added with a labeling substance.
物質、蛍光物質、抗体、リガンドあるいはレセプターの
いずれかから選択される物質であることを特徴とする請
求項１記載のポリヌクレオチド。2. The polynucleotide according to claim 1, wherein the labeling substance is a substance selected from a radioisotope, a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, an antibody, a ligand and a receptor.
ａｃｉｄ）３リン酸存在下、ヌクレオチド伸長反応に
より調製されることを特徴とする請求項１又は２記載の
ポリヌクレオチド。3. An LNA (locked nuclear)
3. The polynucleotide according to claim 1, wherein the polynucleotide is prepared by a nucleotide extension reaction in the presence of (acid) triphosphate.
酸を鋳型として、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉ
ｃ ａｃｉｄ）３リン酸存在下にヌクレオチド伸長反応
を行って調製されたポリヌクレオチドとプローブをハイ
ブリダイズさせる工程を包含することを特徴とする標的
核酸の検出方法。4. Using a nucleic acid obtained from a sample containing a target nucleic acid as a template, LNA (locked nucleic acid)
c) a method for detecting a target nucleic acid, comprising a step of hybridizing a probe with a polynucleotide prepared by performing a nucleotide extension reaction in the presence of triphosphate.
たポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項４記
載の標的核酸の検出方法。5. The method for detecting a target nucleic acid according to claim 4, wherein the polynucleotide is a polynucleotide to which a labeling substance has been added.
光物質、蛍光物質、抗体、リガンドあるいはレセプター
のいずれかから選択される物質が付加されたポリヌクレ
オチドが使用されることを特徴とする請求項５記載の標
的核酸の検出方法。6. A polynucleotide to which a substance selected from a radioisotope, a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, an antibody, a ligand and a receptor is added as a labeling substance. The method for detecting a target nucleic acid according to the above.
れ、該プローブを変性処理することなく、ポリヌクレオ
チドとハイブリダイゼーションを行うことを特徴とする
請求項４〜６のいずれか１項に記載の標的核酸の検出方
法。7. The method according to claim 4, wherein a probe comprising a double-stranded nucleic acid is used, and the probe is hybridized with the polynucleotide without denaturing the probe. A method for detecting a target nucleic acid.
は全部のヌクレオチドがＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃ
ｌｅｉｃ ａｃｉｄ）に置換されたプライマーを用いて
増幅された核酸であって；該プライマーが、担体表面上
の官能基および／または標識化合物と共有結合可能な官
能基を有することを特徴とする増幅核酸。8. The method according to claim 8, wherein a part or all of the nucleotides of at least one kind of primer is LNA (locked nuc).
An amplified nucleic acid, wherein the amplified nucleic acid is obtained by using a primer substituted with a leic acid), wherein the primer has a functional group on a carrier surface and / or a functional group capable of covalently binding to a labeling compound. .
ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法あるいはＳＤＡ法からなる群か
ら選択される方法であることを特徴とする請求項８記載
の増幅核酸。9. The method according to claim 9, wherein the nucleic acid amplification method is an LCR method, a PCR method,
The amplified nucleic acid according to claim 8, which is a method selected from the group consisting of an ICAN method, a LAMP method, and an SDA method.
体表面のあらかじめ定められた領域に固定化した核酸固
定化物。10. A nucleic acid-immobilized product obtained by immobilizing the amplified nucleic acid according to claim 8 or 9 in a predetermined region on the surface of a carrier.
固定化されることを特徴とする請求項１０記載の核酸固
定化物。11. The nucleic acid-immobilized product according to claim 10, wherein the amplified nucleic acid is immobilized on a carrier via electrostatic bonding.
固定化されることを特徴とする請求項１０記載の核酸固
定化物。12. The immobilized nucleic acid according to claim 10, wherein the amplified nucleic acid is immobilized on a carrier via a covalent bond.
載の核酸固定化物を用いることを特徴とする標的核酸の
検出方法。13. A method for detecting a target nucleic acid, comprising using the immobilized nucleic acid according to any one of claims 10 to 12.
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| JP7500727B2 (en) | 2019-12-18 | 2024-06-17 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | Sequencing-by-synthesis method using sequential labeling schemes |
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