JP2002239368A

JP2002239368A - 新規界面活性剤およびその生産方法

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Publication number: JP2002239368A
Application number: JP2001037180A
Authority: JP
Inventors: Akira Miura; 彰三浦; Toshio Iiyama; 利夫飯山
Original assignee: Petroleum Energy Center PEC; Japan Energy Corp
Current assignee: Japan Petroleum Energy Center JPEC; Eneos Corp
Priority date: 2001-02-14
Filing date: 2001-02-14
Publication date: 2002-08-27
Anticipated expiration: 2021-02-14
Also published as: JP5210474B2

Abstract

(57)【要約】【課題】新規な界面活性剤及びその生産方法の提供。【解決手段】ゴルトニア属またはロドコッカス属の微
生物を用いて生産され、中性糖、脂肪酸を主な構成成分
とする、油の分散性を有する新規界面活性剤。この界面
活性剤は、該微生物を炭素源としてn-パラフィンを含有
する培養液で培養することによって培養液中に産生され
る。海上流出油処理剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、油などに対して、
優れた乳化性能を有し、海上流出油処理剤などに使用で
きる界面活性剤、界面活性剤を生産する微生物、および
この微生物を使用した界面活性剤を生産する方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】界面活性剤は、洗浄剤、乳化剤、消泡剤
などとして、幅広く利用されているが、近年、安全性、
環境適合性の高い界面活性剤が求められており、特に、
タンカー事故時などに使用される流出油処理剤など、環
境中で利用される分野においては、この傾向は強くなっ
ている。現在、日本国内で販売されている流出油処理剤
は、ポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸エステル
などの生分解性、安全性の比較的高い界面活性剤20〜30
％と、溶剤としてノルマルパラフィン70〜80％程度含む
ものが一般的となっている。しかし、これら流出油処理
剤は、処理剤散布時に攪拌を必要とするものであるか
ら、航空機散布し、波力のみによって攪拌させて利用す
る自己攪拌型には使用できない。自己攪拌型の油処理剤
は、欧米では既に使用されているものの、我が国で一般
的に使用している油処理剤より毒性の高い点が問題とな
っており、より安全性が高く、乳化能などの物性面でも
優れた界面活性剤が強く求められてきている。

【０００３】このような、安全性の高い界面活性剤の一
つとして、微生物由来の界面活性剤（バイオサーファク
タント）が知られている。バイオサーファクタントとし
ては、アシネトバクター・カルコアセティカスの生産す
るエマルサン、トロルプシス・ボンビコーラが生産する
ソホロリピッド、ロドコッカス属の生産するトレハロー
スリピッドなどが知られているが、実用化されている例
としては、ソホロリピッド誘導体が化粧品として利用さ
れた例や、エマルサンが、タンカー油槽の洗浄剤に使用
された例など、数例に過ぎず、油処理剤などの用途で
は、物性面および生産コスト面で化学合成品を上回るも
のは知られていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、流出油処理剤などに使用できる環境負荷の低い新規
界面活性剤を提供することを目的とする。また、本発明
は、このような界面活性剤の生産方法及びこの界面活性
剤の用途を提供することを目的とする。さらに、本発明
は、このような界面活性剤を産生する微生物を提供する
ことを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、微生物の
生産する界面活性剤（バイオサーファクタント）が、こ
のような海上に流出した油等の処理等の用途に使用でき
ないか、鋭意検討したところ、土壌等から分離されるGo
rdonia属またはRhodococcus属微生物の生産する界面活
性剤が、優れた乳化能を有し、流出油処理剤としても利
用できる可能性があることを見出すに至った。さらに、
これら微生物の培養条件を検討したところ、ある条件で
は、多量の界面活性剤を培養液中に蓄積することを見出
した。

【０００６】本発明に用いられる微生物としては、Gord
onia属またはRhodococcus 属に属する微生物で、界面活
性剤生産能を有するものが用いられ、その例として、土
壌から採取された、 JE1058 株、BS481 株、BS567 株、
YT634 株などが挙げられる。これら菌株の菌学的性質を
表１に示す。これら４株の微生物はいずれも非運動性の
グラム陽性不規則桿菌で、カタラーゼ陽性、オキシダー
ゼ陰性であることから、コリネ型細菌と推定した。そこ
で、API Coryne system (Bio Merieux社: 表１の硝酸塩
還元からゼラチン液化までがその結果）により迅速同定
を行った結果、いずれも Rhodococcus属に属する微生物
と同定された。さらに16S rDNA塩基配列分析を実施し、
他の微生物との相同性を解析したところ、JE1058株は、
Gordoniapolyisoprenivoransと 98.58％の最も高い相同
性を示した。API Coryne system では、Gordonia属微生
物は Rhodococcus属として同定されうること(J.Clin. M
icrobiol. vol35, 3122-3126, 1997) 、および16S rDNA
塩基配列の相同性解析の結果から、JE1058株について
は、Gordonia sp.と同定できる。 YT634、BS567 株の16
S rDNA塩基配列は、 Rhodococcus fasciansとの相同性
がそれぞれ98.8％、99.8％で最も高く、BS481 株の16S
rDNA塩基配列は Rhodococcus globerulusと99.8％一致
していた。これらの結果から YT634、BS481 、BS567 株
は Rhodococcus sp.と同定できる。

【０００７】

【表１】

【０００８】本発明ではこれらの菌株を通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。そして、JE
1058株はFERM BP-7406、BS481 株はFERM BP-7408、BS56
7 株株はFERM BP-7409、YT634 株はFERM BP-7407として
受託番号が付されている。

【０００９】本発明で示した界面活性剤は、微生物の生
育炭素源としてノルマルパラフィンを使用したときに培
養液中に蓄積されるもので、例えば次の方法によって回
収することができる。まず、本菌株をノルマルパラフィ
ンを含む炭素源、窒素源、無機塩を含む培地で培養し、
遠心分離によって菌体等を分離した後、上清に硫安など
の塩を飽和になるような濃度添加して、塩析により界面
活性剤を析出させる。その後、透析により脱塩したの
ち、凍結乾燥などの方法で水分を除去する。こののち、
回収物に炭素源として添加したノルマルパラフィンなど
が残存する場合には、ヘキサンで洗浄後、真空乾燥を行
ってノルマルパラフィンは除去できる。しかし、油処理
剤として使用する場合であれば、ノルマルパラフィンは
油処理剤の溶剤として使用できるので、ヘキサン洗浄は
必ずしも行わなくてもよい。また、培養液を加熱などに
より滅菌した液体、または菌体などを遠心分離や、静置
分離などの方法で除去した水溶液の状態でも油処理剤と
して使用可能である。また、回収品をノルマルパラフィ
ンと混合したものを、油処理剤として使用することがで
きる。本発明におけるノルマルパラフィンとしては、炭
素数11〜18のものを用いることが、添加の容易さ、揮発
ロスの低減、経済性等から好ましい。これらのノルマル
パラフィンとして、n-ウンデカン、n-ドデカン、n-トリ
デカン、n-テトラデカン、n-ペンタデカン、n-ヘキサデ
カン、n-ヘプタデカン、n-オクタデカン等を例示でき
る。

【００１０】回収した界面活性剤は、その主な構成成分
として糖および脂肪酸を主成分とし、蛋白質を含む場合
もある。最も油分散能の高いJE-1058 株の生産する界面
活性剤では、構成成分として、中性糖、飽和脂肪酸、3-
ヒドロキシ脂肪酸が主な構成成分となっているが、これ
らの組成は、培養条件によって異なる。また、回収した
界面活性剤は分子量40万から 120万（高速液体クロマト
グラフィー法）であること、アルカリ加水分解により脂
肪酸が遊離すること、酸分解により糖が遊離することか
ら、本界面活性剤は多糖に脂肪酸がエステル結合した化
合物が主成分と推定できる。従来ロドコッカス属の生産
する界面活性剤としては、トレハロースジコリノミコレ
ートや、スクシノイルトレハロースリピッドなどのトレ
ハロースリピッドが知られている（Antonie Van Leeuwe
nhoek, vol74,59-70 (1998))が、本発明で得られる界面
活性剤は既知のトレハロースリピッド類とは異なる化合
物である。また、微生物の生産する多糖系界面活性剤と
しては、アシネトバクター・カルコアセティカスの生産
するエマルザンやBSF-217 が知られている（特開平3-13
0073号公報) が、これらも、化学組成および分子量で、
本発明での界面活性剤とは異なる化合物である。

【００１１】本発明によって生産される界面活性剤は、
洗浄剤、乳化剤など、界面活性剤として各種用途に利用
可能である。その中でも特に、流出油処理剤として使用
した場合、非常に高い能力を発揮する。とくに、自己攪
拌型の油処理剤としてMDPC法（油防除資機材の性能の評
価および再評価に関する調査研究報告書III 、海上災害
防止センター、平成12年３月）により分散能の評価をお
こなったところ、非常に高い重油分散能を示すことが明
らかとなった。

【００１２】

【発明の効果】本発明により、流出油油処理剤などの用
途で有用な微生物由来の界面活性剤、およびその生産微
生物が提供される。また、界面活性剤を成分とする油処
理剤が提供される。

【００１３】次に実施例により本発明を説明する。

【実施例１】各種の土壌から分離した菌の培養液を希釈
し、重油を添加した後、試験管ミキサーで20秒間撹拌
し、静置後の水層の濁度を測定し、濁度の高いものにつ
いて、高い重油乳化能を有する菌株として選択した。選
択された微生物について、フラスコ中、30℃、160rpmの
振とう数で酵母エキス1g/L、ノルマルテトラデカン１容
積％含む培地中、４日間培養し、得られた培養液50mL、
JIS2510(潤滑油さび止め性能試験法) に規定された人工
海水 500mL、Ｃ重油（JIS K2205 規格３種１号に適合す
るもの）１ｇを添加し、横揺れ振とう法での自己攪拌型
油処理剤としての能力を室温（25℃）条件で分散率を測
定した。結果を表２に示す。なお、分散率は次の方法に
より測定した。分液ロートに人工海水550 ml (実施例１
では培養液を含む）を添加後、試験油を１ｇ加えたの
ち、30分、35往復、振幅40mmで水平方向に寝かせて振と
うする。振とう後、分液ロートを立て、10分間静置後、
分液ロート下部より100ml の乳化層を取る。乳化層を塩
化メチレン20mlで３回抽出し、５mlのイソプロパノール
を加え、さらに塩化メチレンを加えて全量を100 mlとし
た抽出液の、波長580nm による吸光度を測定する。そし
て、あらかじめ試験油により作成した検量線により、抽
出液中の油分量を求め、次式により分散率を求める。分散率（％) ＝ (抽出液中の油分量 (ｇ) ／分液ロート
に加えた試験油の全量(ｇ))×550

【００１４】

【表２】

【００１５】

【実施例２】上記に示した高い乳化能を示す菌株を上記
条件で４日間培養した培養液から、界面活性剤成分の回
収を行った。JE1058株の培養液については、培養液1Lに
硫酸アンモニウム 472ｇを添加して、界面活性成分を塩
析した後、析出物を透析膜中、２日間室温で流水中に晒
すことで、透析による脱塩をし、凍結乾燥した。YT634
株、 BS481株、BS567 株の培養液については、硫酸アン
モニウムでの塩析後、析出物をヘキサン洗浄した後、上
記と同様に透析による脱塩、凍結乾燥を行った。上記回
収物を、ノルマルパラフィンを４％含むＣ重油と混合
し、横揺れ振とう法での自己攪拌型油処理剤評価試験を
室温条件で実施した。Ｃ重油に対する濃度（重量％）、
および分散率を表３に示す。また市販油処理剤（カクタ
スクリーンL10-A、株式会社テスコ）、特開平9-296162
号公報の表１実施例１に示した成分に調製した高粘度型
油処理剤を、Ｃ重油に対してそれぞれ４％混合した条件
と比較したところ、JE1058株からの回収物については対
Ｃ重油１％添加で、その他の菌株からの回収物について
は、対重油４〜10％添加で、高粘度油処理剤を上回る分
散率を示した。

【００１６】

【表３】

【００１７】

【実施例３】JE1058株について、グルタミン酸１ナトリ
ウム20g/L 、酵母エキス 10g/L、表４に示した各種ノル
マルパラフィン20容積％含む培地50mLに一白金耳植菌
し、500mL 坂口フラスコ中、30℃、160 回転／分の条件
で７日間培養を行った。遠心分離により、菌体およびノ
ルマルパラフィンと、水層とを分離後、水層に硫酸アン
モニウムを添加し塩析により界面活性剤を析出させ、遠
心分離後、界面活性剤を回収した。回収物を、透析、凍
結乾燥、さらに、ノルマルヘキサンにより洗浄後、真空
乾燥を行い、培地100mL から表４に示す量の界面活性剤
を回収した。この回収した界面活性剤について、実施例
２と同様の方法で、４％のノルマルパラフィンを含むＣ
重油に対し、１％の界面活性剤を添加し、分散率を測定
した。その結果を表４に示す。

【００１８】

【表４】

【００１９】

【実施例４】培地中のノルマルパラフィンとしてｎ−テ
トラデカンを使用し、実施例３に示した方法で培養液か
ら回収したJE1058株の界面活性剤の組成分析を行った。
糖の組成分析として、中性糖についてはオルシノール硫
酸法、ウロン酸についてはカルバゾール法、アミノ糖は
Elson-Morgan法を用いて分析した。その結果、本界面活
性剤は、重量比で、中性糖34.5％、ウロン酸 4.9％、ア
ミノ糖 0.5％を含んでいた。さらに、JE1058株の培養液
から回収した界面活性剤を２Ｎトリフルオロ酢酸中、10
0 ℃で６時間加水分解し、減圧乾固後、乾固物を純水に
溶解し、ポストラベル蛍光検出法によるHPLC分析を行っ
た。HPLC測定条件は、カラムTSK-gel sugerAXG15cm ×
4.6mm I.D. (東ソー) 、カラム温度70℃、移動相 0.5M
ホウ酸カリウム緩衝液pH8.7 、流速 0.4mL/minとし、ポ
ストカラム標識として、反応試薬１％アルギニン／3 ％
ホウ酸を用い、反応温度 150℃、検出波長 EX320nm、EM
430nmにて測定した。各種中性糖の検量線から、JE1058
株の界面活性剤に含まれる中性糖の含量を測定した結
果、ラムノース 0.4％、マンノース 1.9％、ガラクトー
ス 6.7％、グルコース23.1％ (いずれも重量比) が含ま
れていた。

【００２０】また、本界面活性剤を５％塩酸・メタノー
ル中、 100℃にて３時間加熱し、ヘキサン抽出により得
られた画分をガスクロマトグラフィーにより分析した。
その結果、本界面活性剤は脂肪酸として、n-オクタン酸
2.1％、n-デカン酸 3.8％、3-ヒドロキシデカン酸 2.8
％、3-ヒドロキシドデカン酸 6.9％（いずれも重量％）
を含んでいることがわかった。また、本界面活性剤をカ
ラムとしてTSK-gelG6000PWXL（東ソー（株))を用いて、
ゲルろ過高速液体クロマトグラフィーを用いて分子量分
析を行った。このとき、展開溶剤は 0.1M リン酸水素２
ナトリウム水溶液、標準物質として、ポリエチレンオキ
シドを使用した。その結果、本界面活性剤の主成分は、
分子量 100万と推定された。

【００２１】

【実施例５】実施例２で示した方法により培養液から回
収したJE1058株の界面活性剤を用いて、排出油防除資材
の性能試験基準（昭和59年運輸省舶査第52号）に定める
方法に従い、油処理剤としての乳化率を測定した。ただ
し、用いる油として、基準ではJISK2205の規定する重油
のうち規格２種、すなわちＢ重油を使用することになっ
ているが、本実施例では、Ｂ重油より粘度が高く、乳化
し難いＣ重油を使用した。また、油処理剤添加量は上記
基準では「Ｂ重油10mlに対し、油処理剤を 2ml添加して
混合油とする」となっているところを、「Ｃ重油 10gに
対し、ノルマルパラフィン 0.4ｇ、回収した界面活性剤
0.1g 添加して混合油」とし、抽出溶媒としては四塩化
炭素のかわりに、ジクロロメタンを使用した。その結
果、判定基準では、乳化率が静置開始後30秒で60％以
上、10分で20％以上が合格とされるのに対し、本界面活
性剤を使用すると、乳化率は静置開始後30秒で91.2％、
10分で70.5％と、判定基準を上回る乳化率を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 ＡＣ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/18 (Ｃ１２Ｐ 13/18 Ｃ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者飯山利夫埼玉県戸田市新曽南三丁目17番35号株式会社ジャパンエナジー内Ｆターム(参考） 4B064 AD99 AH19 CA02 CA03 CB29 CC03 CD04 DA16 DA17 DA20 4B065 AA01X AA45X AC14 AC15 BA22 BB04 BD14 CA13 CA19 CA54 4D051 AA01 AB07 EA01 EA13 EC04 4D077 AA10 AC05 CA03 CA12 CA20 DA01Y DC02Z DD62Y DD63Y DE02Y DE09Y

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ゴルドニア（Gordonia）属または、ロド
コッカス（Rhodococcus)属に属する微生物を用いて生産
され得る、中性糖・脂肪酸を主な構成成分とし、油の分
散性を有する界面活性剤。
【請求項２】ゴルドニア属またはロドコッカス属に属
し、油の分散性を有する界面活性剤生産菌を、生育炭素
源としてノルマルパラフィンを含有する生産培地に接種
して培養し、中性糖、脂肪酸を主な構成成分とする界面
活性剤を培養液中に産生せしめ、これを培養液から回収
することを特徴とする中性糖、脂肪酸を主な構成成分と
し、油の分散性を有する界面活性剤の生産方法。
【請求項３】請求項１記載の界面活性剤を有効成分と
して含有する海上流出油処理剤。
【請求項４】中性糖、脂肪酸を主な構成物質とし、油
の分散性を有する界面活性剤産生能を有するGordonia s
p.JE1058(FERM BP-7406)、Rhodococcus sp.YT634 (FER
M BP-7407)、Rhodococcus sp. BS481(FERM BP-7408) ま
たはRhodococcus sp. BS567(FERM BP-7409) 。