JP2002221520A - 免疫型の予測方法 - Google Patents
免疫型の予測方法Info
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- JP2002221520A JP2002221520A JP2001019851A JP2001019851A JP2002221520A JP 2002221520 A JP2002221520 A JP 2002221520A JP 2001019851 A JP2001019851 A JP 2001019851A JP 2001019851 A JP2001019851 A JP 2001019851A JP 2002221520 A JP2002221520 A JP 2002221520A
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- Japan
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- cytokine
- test substance
- type
- expression level
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】化学物質により誘導される免疫反応のタイプを
予測する方法を提供可能とすること。 【解決手段】被験物質が投与されたTh1優位マウスの組
織におけるTh1サイトカインの発現量とTh2サイトカイン
の発現量との比率に基づいて、該被験物質により誘導さ
れる免疫反応のタイプを予測することを特徴とする被験
物質により誘導される免疫型の予測方法。
予測する方法を提供可能とすること。 【解決手段】被験物質が投与されたTh1優位マウスの組
織におけるTh1サイトカインの発現量とTh2サイトカイン
の発現量との比率に基づいて、該被験物質により誘導さ
れる免疫反応のタイプを予測することを特徴とする被験
物質により誘導される免疫型の予測方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、化学物質により誘
導される免疫型の予測方法に関する。
導される免疫型の予測方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】化学物質によって誘導される免疫には、
細胞性免疫と液性免疫とがある。細胞性免疫は遅延型過
敏症等を引き起こし、液性免疫は即時型過敏症やアナフ
ィラキシー等を引き起こす。かかる免疫は、化学物質に
よる感作を引き金としてヘルパーＴ細胞が関与して誘導
される。ヘルパーＴ細胞はTh0、Th1またはTh2細胞に分
類され、細胞性免疫の誘導にはTh1細胞が関与し、液性
免疫の誘導にはTh2細胞が関与する。細胞性免疫と液性
免疫のどちらが優位に誘導されるかは、化学物質の種類
によって異なる。
細胞性免疫と液性免疫とがある。細胞性免疫は遅延型過
敏症等を引き起こし、液性免疫は即時型過敏症やアナフ
ィラキシー等を引き起こす。かかる免疫は、化学物質に
よる感作を引き金としてヘルパーＴ細胞が関与して誘導
される。ヘルパーＴ細胞はTh0、Th1またはTh2細胞に分
類され、細胞性免疫の誘導にはTh1細胞が関与し、液性
免疫の誘導にはTh2細胞が関与する。細胞性免疫と液性
免疫のどちらが優位に誘導されるかは、化学物質の種類
によって異なる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】化学物質により細胞性
免疫と液性免疫のどちらが優位に誘導されるかを把握す
ることができると、化学物質の取り扱いに際し事前に安
全対策を講ずる上で、また、化学物質に感作された場合
の治療方針を決定するために役立つことから、化学物質
により誘導される免疫反応のタイプを予測する方法の開
発が求められていた。
免疫と液性免疫のどちらが優位に誘導されるかを把握す
ることができると、化学物質の取り扱いに際し事前に安
全対策を講ずる上で、また、化学物質に感作された場合
の治療方針を決定するために役立つことから、化学物質
により誘導される免疫反応のタイプを予測する方法の開
発が求められていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは鋭意検討を行った結果、化学物質が投与された
ある種のマウスの組織における特定のサイトカインの発
現量の比率に基づいて、該化学物質により誘導される免
疫反応のタイプを予測し得ることを見いだし、本発明に
至った。すなわち、本発明は、 １）被験物質が投与されたTh1優位マウスの組織におけ
るTh1サイトカインの発現量とTh2サイトカインの発現量
との比率に基づいて、該被験物質により誘導される免疫
反応のタイプを予測することを特徴とする被験物質によ
り誘導される免疫型の予測方法、 ２）（１）被験物質が投与されたTh1優位マウスの組織
におけるTh1サイトカインの発現量とTh2サイトカインの
発現量とを測定し、前記２種のサイトカインの発現量の
比率を求める工程、および（２）標準物質が投与された
Th1優位マウスの組織におけるTh1サイトカインの発現量
とTh2サイトカインの発現量との比率と、工程（１）で
求められた比率とを比較し、前記被験物質により誘導さ
れる免疫反応のタイプを予測する工程を含むことを特徴
とする被験物質により誘導される免疫型の予測方法、 ３）発現量がｍＲＮＡ量である前項１）または２）に記
載の予測方法。 ４）組織が局所リンパ節である前項１）〜３）のいずれ
かに記載の予測方法、 ５）被験物質が投与されたTh1優位マウスが、陰性対照
群のTh1優位マウスと比較して局所リンパ節重量が２倍
以上に増加したマウスである前項１）〜４）のいずれか
に記載の予測方法、 ６）Th1サイトカインがIL-12p40であり、Th2サイトカイ
ンがIL-4である前項１）〜５）のいずれかに記載の予測
方法、 ７）被験物質が投与されたTh1優位マウスの組織におけ
るTh1サイトカインの発現量とTh2サイトカインの発現量
との比率に基づいて、該被験物質により誘導される免疫
反応のタイプを予測することを特徴とする被験物質によ
り誘導される免疫型の予測システム を提供するものである。
明者らは鋭意検討を行った結果、化学物質が投与された
ある種のマウスの組織における特定のサイトカインの発
現量の比率に基づいて、該化学物質により誘導される免
疫反応のタイプを予測し得ることを見いだし、本発明に
至った。すなわち、本発明は、 １）被験物質が投与されたTh1優位マウスの組織におけ
るTh1サイトカインの発現量とTh2サイトカインの発現量
との比率に基づいて、該被験物質により誘導される免疫
反応のタイプを予測することを特徴とする被験物質によ
り誘導される免疫型の予測方法、 ２）（１）被験物質が投与されたTh1優位マウスの組織
におけるTh1サイトカインの発現量とTh2サイトカインの
発現量とを測定し、前記２種のサイトカインの発現量の
比率を求める工程、および（２）標準物質が投与された
Th1優位マウスの組織におけるTh1サイトカインの発現量
とTh2サイトカインの発現量との比率と、工程（１）で
求められた比率とを比較し、前記被験物質により誘導さ
れる免疫反応のタイプを予測する工程を含むことを特徴
とする被験物質により誘導される免疫型の予測方法、 ３）発現量がｍＲＮＡ量である前項１）または２）に記
載の予測方法。 ４）組織が局所リンパ節である前項１）〜３）のいずれ
かに記載の予測方法、 ５）被験物質が投与されたTh1優位マウスが、陰性対照
群のTh1優位マウスと比較して局所リンパ節重量が２倍
以上に増加したマウスである前項１）〜４）のいずれか
に記載の予測方法、 ６）Th1サイトカインがIL-12p40であり、Th2サイトカイ
ンがIL-4である前項１）〜５）のいずれかに記載の予測
方法、 ７）被験物質が投与されたTh1優位マウスの組織におけ
るTh1サイトカインの発現量とTh2サイトカインの発現量
との比率に基づいて、該被験物質により誘導される免疫
反応のタイプを予測することを特徴とする被験物質によ
り誘導される免疫型の予測システム を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】以下、本発明の予測方法につき説
明する。本発明の予測方法に用いることのできるTh1優
位マウス(Heinzel F.P. etc、J.Exp. Med、 169、 59-7
2(1989); Heinzel F.P. etc、J. Exp. Med、 177、 150
5-1509(1993); Hocart M.J. etc、J. Gen. Virol、 7
0、 2439-2448(1989))としては、例えば、C57BL/6マウ
ス、CBA/CaHマウス等があげられる。かかるTh1優位マウ
スは６〜15週令程度の若齢の成獣を用いるとよく、雄性
および雌性のいずれを用いてもよい。その飼育方法とし
ては、例えば、マウスをケージに収容し、固型飼料およ
び濾過した上水道水を自動給水装置を介して自由に摂取
させる方法があげられる。上記のようなTh1優位マウス
に被験物質を投与する。マウスの数としては、被験物質
あたり１群１匹以上、好ましくは１群２〜３匹を用い
る。被験物質の投与の方法としては、例えば、被験物質
溶液を、除毛した背部と耳介とに塗布する方法、耳介の
みに塗布する方法、Foot Padに皮内投与する方法等があ
げられる。被験物質溶液は、被験物質を適当な溶媒に溶
解させて調製する。溶媒としては、例えば、被験物質が
溶解し、かつアレルギー性および刺激性がない液体を使
用することができ、具体的には例えば、アセトンとコーンオイルと
の混合液、エタノール、DMSO、生理食塩液等があげられる。
被験物質の投与量としては、例えば、被験物質が投与さ
れたTh1優位マウスにおいて、陰性対照群のマウスと比
較して、局所リンパ節重量の２倍以上の増加が認められ
る投与濃度および容量をあげることができる。陰性対照
群としては、例えば、被験物質溶液に替えて該溶液の調
製に用いられた溶媒のみが同様に投与された群をあげる
ことができる。
明する。本発明の予測方法に用いることのできるTh1優
位マウス(Heinzel F.P. etc、J.Exp. Med、 169、 59-7
2(1989); Heinzel F.P. etc、J. Exp. Med、 177、 150
5-1509(1993); Hocart M.J. etc、J. Gen. Virol、 7
0、 2439-2448(1989))としては、例えば、C57BL/6マウ
ス、CBA/CaHマウス等があげられる。かかるTh1優位マウ
スは６〜15週令程度の若齢の成獣を用いるとよく、雄性
および雌性のいずれを用いてもよい。その飼育方法とし
ては、例えば、マウスをケージに収容し、固型飼料およ
び濾過した上水道水を自動給水装置を介して自由に摂取
させる方法があげられる。上記のようなTh1優位マウス
に被験物質を投与する。マウスの数としては、被験物質
あたり１群１匹以上、好ましくは１群２〜３匹を用い
る。被験物質の投与の方法としては、例えば、被験物質
溶液を、除毛した背部と耳介とに塗布する方法、耳介の
みに塗布する方法、Foot Padに皮内投与する方法等があ
げられる。被験物質溶液は、被験物質を適当な溶媒に溶
解させて調製する。溶媒としては、例えば、被験物質が
溶解し、かつアレルギー性および刺激性がない液体を使
用することができ、具体的には例えば、アセトンとコーンオイルと
の混合液、エタノール、DMSO、生理食塩液等があげられる。
被験物質の投与量としては、例えば、被験物質が投与さ
れたTh1優位マウスにおいて、陰性対照群のマウスと比
較して、局所リンパ節重量の２倍以上の増加が認められ
る投与濃度および容量をあげることができる。陰性対照
群としては、例えば、被験物質溶液に替えて該溶液の調
製に用いられた溶媒のみが同様に投与された群をあげる
ことができる。
【０００６】次いで、被験物質が投与されたTh1優位マ
ウスの組織におけるTh1サイトカインの発現量とTh2サイ
トカインの発現量とを測定する。組織としては、局所リ
ンパ節、脾臓等があげられる。組織の採取の方法として
は、例えば、最終投与の一定時間後に、動物を屠殺し採
取する方法があげられる Th1サイトカインおよびTh2サイトカインとは、それぞれ
Th1型反応（細胞性免疫）およびTh2型反応（液性免疫）
に密接に関連しているサイトカイン［成内秀雄、細胞、
30、343-346(1998);Buschenfelde C.M.Z.et al、Clin.
Exp.Immunol.、110、378-385(1997)］である。具体的に
は例えば、Th1サイトカインとしてはIL-12p40、IL-18等
があげられ、Th2サイトカインとしてはIL-4、IL-10等が
あげられる。サイトカインの発現量の測定方法として
は、例えば、測定対象のサイトカインのmRNA量を測定す
る方法や、測定対象のサイトカインの蛋白質量を測定す
る方法があげられる。mRNA量を測定する方法としては、
例えば、RT-PCR法、ノーザンブロット法等があげられ
る。
ウスの組織におけるTh1サイトカインの発現量とTh2サイ
トカインの発現量とを測定する。組織としては、局所リ
ンパ節、脾臓等があげられる。組織の採取の方法として
は、例えば、最終投与の一定時間後に、動物を屠殺し採
取する方法があげられる Th1サイトカインおよびTh2サイトカインとは、それぞれ
Th1型反応（細胞性免疫）およびTh2型反応（液性免疫）
に密接に関連しているサイトカイン［成内秀雄、細胞、
30、343-346(1998);Buschenfelde C.M.Z.et al、Clin.
Exp.Immunol.、110、378-385(1997)］である。具体的に
は例えば、Th1サイトカインとしてはIL-12p40、IL-18等
があげられ、Th2サイトカインとしてはIL-4、IL-10等が
あげられる。サイトカインの発現量の測定方法として
は、例えば、測定対象のサイトカインのmRNA量を測定す
る方法や、測定対象のサイトカインの蛋白質量を測定す
る方法があげられる。mRNA量を測定する方法としては、
例えば、RT-PCR法、ノーザンブロット法等があげられ
る。
【０００７】測定されたTh1サイトカインの発現量とTh2
サイトカインの発現量との比率（以下、Th1/Th2比と記
す。）に基づいて、投与された被験物質により誘導され
る免疫反応のタイプを予測する。具体的には例えば、上
記のようにして測定されたTh1サイトカインの発現量とT
h2サイトカインの発現量とからTh1/Th2比を求めて、当
該比と、標準物質が投与されたTh1優位マウスの組織に
おけるTh1/Th2比とを比較する。標準物質としては、例
えば、Th1型反応またはTh2型反応を優位に誘導すること
が知られている物質を用いることができる。具体的には
例えば、Th1型反応を優位に誘導する標準物質として、シ
゛ニトロクロロヘ゛ンセ゛ン(DNCB)、トリニトロクロロヘ゛ンセ゛ン(TNCB)等をあげ
ることができ、Th2型反応を優位に誘導する標準物質と
して、無水トリメリット酸(TMA)、シ゛フェニルメタンシ゛イソシアネート(MDI)等
があげられる。かかるTh1型反応を優位に誘導する標準
物質とTh2型反応を優位に誘導する標準物質とをそれぞ
れ被験物質と同様にTh1優位マウスに投与し、局所リン
パ節等の組織におけるTh1サイトカインの発現量とTh2サ
イトカインの発現量とを測定してTh1/Th2比を求める。
被験物質について求められたTh1/Th2比を、Th1型反応を
優位に誘導する標準物質とTh2型反応を優位に誘導する
標準物質のそれぞれについて求められたTh1/Th2比と比
較して、どちらにより近いかを判定することにより、被
験物質により誘導される免疫反応のタイプを予測するこ
とができる。
サイトカインの発現量との比率（以下、Th1/Th2比と記
す。）に基づいて、投与された被験物質により誘導され
る免疫反応のタイプを予測する。具体的には例えば、上
記のようにして測定されたTh1サイトカインの発現量とT
h2サイトカインの発現量とからTh1/Th2比を求めて、当
該比と、標準物質が投与されたTh1優位マウスの組織に
おけるTh1/Th2比とを比較する。標準物質としては、例
えば、Th1型反応またはTh2型反応を優位に誘導すること
が知られている物質を用いることができる。具体的には
例えば、Th1型反応を優位に誘導する標準物質として、シ
゛ニトロクロロヘ゛ンセ゛ン(DNCB)、トリニトロクロロヘ゛ンセ゛ン(TNCB)等をあげ
ることができ、Th2型反応を優位に誘導する標準物質と
して、無水トリメリット酸(TMA)、シ゛フェニルメタンシ゛イソシアネート(MDI)等
があげられる。かかるTh1型反応を優位に誘導する標準
物質とTh2型反応を優位に誘導する標準物質とをそれぞ
れ被験物質と同様にTh1優位マウスに投与し、局所リン
パ節等の組織におけるTh1サイトカインの発現量とTh2サ
イトカインの発現量とを測定してTh1/Th2比を求める。
被験物質について求められたTh1/Th2比を、Th1型反応を
優位に誘導する標準物質とTh2型反応を優位に誘導する
標準物質のそれぞれについて求められたTh1/Th2比と比
較して、どちらにより近いかを判定することにより、被
験物質により誘導される免疫反応のタイプを予測するこ
とができる。
【０００８】
【実施例】以下に実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例１アセトン およびコーンオイルを４:１で混合した溶液を溶媒とし
て、1% DNCB、10% TMA、0.4% 2,4-シ゛ニトロフルオロヘ゛ンセ゛ン(DNF
B)、0.25% 4-エトキシメチレン-2-フェニルオキサソ゛ル-5-オン(OXA)、0.4%
トルエン 2,4-シ゛イソシアネート(TDI)および15% 無水フタル酸(PA)を調
製した。６週令の雄性C57BL/6系マウス（日本チャール
ス・リバー株式会社）を、７日間予備飼育した。マウス
はプラスチック製置式ケージ（W290×D340×H170mm，床
敷き：ホワイトフレーク，日本クレア株式会社）に収容
し、６〜10匹／ケージ飼いとした。当該マウスにはCRF-
1固型飼料（オリエンタル酵母工業株式会社）および濾
過した上水道水を自由に摂取させた。飼育ケージは３回
／週の頻度で洗浄・滅菌済ケージと交換した。飼育室の
環境は、温度23±２℃、相対湿度55±15％、換気回数10
回以上／時間、照明時間12時間（８時〜20時）に設定し
た。予備飼育後のC57BL/6系マウス(７週令)の背部を除
毛した後、上記の化合物溶液または溶媒（アセトンとコーンオイル
の４:１混合液）100μlずつを塗布し、５日後に再度100
μlずつを除毛した背部に塗布し、さらに５日後から３
日間連続して、両耳介に20μlずつを１日１回塗布し
た。１化合物あたりマウス２匹を１群とした。最終塗布
から24時間後に左右耳介リンパ節を採取し、１群２匹分
を集めてその重量を測定し、1匹あたりのリンパ節重量
を算出した。結果を表１に示す。化合物投与群では、溶
媒投与群と比較して、約３倍〜約４倍の重量増加が認め
られた。
するが、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例１アセトン およびコーンオイルを４:１で混合した溶液を溶媒とし
て、1% DNCB、10% TMA、0.4% 2,4-シ゛ニトロフルオロヘ゛ンセ゛ン(DNF
B)、0.25% 4-エトキシメチレン-2-フェニルオキサソ゛ル-5-オン(OXA)、0.4%
トルエン 2,4-シ゛イソシアネート(TDI)および15% 無水フタル酸(PA)を調
製した。６週令の雄性C57BL/6系マウス（日本チャール
ス・リバー株式会社）を、７日間予備飼育した。マウス
はプラスチック製置式ケージ（W290×D340×H170mm，床
敷き：ホワイトフレーク，日本クレア株式会社）に収容
し、６〜10匹／ケージ飼いとした。当該マウスにはCRF-
1固型飼料（オリエンタル酵母工業株式会社）および濾
過した上水道水を自由に摂取させた。飼育ケージは３回
／週の頻度で洗浄・滅菌済ケージと交換した。飼育室の
環境は、温度23±２℃、相対湿度55±15％、換気回数10
回以上／時間、照明時間12時間（８時〜20時）に設定し
た。予備飼育後のC57BL/6系マウス(７週令)の背部を除
毛した後、上記の化合物溶液または溶媒（アセトンとコーンオイル
の４:１混合液）100μlずつを塗布し、５日後に再度100
μlずつを除毛した背部に塗布し、さらに５日後から３
日間連続して、両耳介に20μlずつを１日１回塗布し
た。１化合物あたりマウス２匹を１群とした。最終塗布
から24時間後に左右耳介リンパ節を採取し、１群２匹分
を集めてその重量を測定し、1匹あたりのリンパ節重量
を算出した。結果を表１に示す。化合物投与群では、溶
媒投与群と比較して、約３倍〜約４倍の重量増加が認め
られた。
【０００９】
【表１】 ＊；溶媒投与群のリンパ節重量を１．０として表す。
【００１０】採取された耳介リンパ節におけるIL-4およ
びIL-12p40のmRNA量をそれぞれ以下の通り定量した。ま
ず、耳介リンパ節からIsogen(ニッホ゜ンシ゛ーン)を用い、該試
薬の添付マニュアルに記載の方法に準じてRNAを抽出し
た。抽出されたRNAから、SuperScript Reverse Transcr
iption System(Gibco BRL)を用い、該システムの添付マ
ニュアルに記載の方法に準じてcDNAを作製した。なお、
プライマーには、oligo(dT)12-18 プライマー(Gibco BR
L)を用いた。次いで、得られたcDNAを鋳型とし、Takara
Ex taq DNAホ゜リメラーセ゛(宝酒造)を用いてPCRを行った。IL
-4のcDNAを増幅するためには、配列番号１で示される塩
基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２で
示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライ
マーとし、94℃にて３分間の保温の後、94℃にて30秒間
次いで55℃にて30秒間さらに72℃にて１分間の保温を１
サイクルとしてこれを２４サイクル行い、さらに72℃に
て７分間の保温を行った。IL-12p40のcDNAを増幅するた
めには、配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチドおよび配列番号４で示される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、94℃にて３
分間の保温の後、94℃にて30秒間次いで60℃にて30秒間
さらに72℃にて１分間の保温を１サイクルとしてこれを
２６サイクル行い、さらに72℃にて７分間の保温を行っ
た。また、内部標準とするβactinのcDNAを増幅するた
めには、配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチドおよび配列番号６で示される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、94℃にて３
分間の保温の後、94℃にて30秒間次いで55℃にて30秒間
さらに72℃にて１分間の保温を１サイクルとしてこれを
１７サイクル行い、さらに72℃にて７分間の保温を行っ
た。かかるPCRで得られたDNAをそれぞれ、GelStar(宝酒
造)を添加した２%アガロースゲルに供して電気泳動を行
い、DNAのバンドの蛍光強度をルミノイメージアナライ
ザー(LAS-1000plus, Image Gauge; 富士写真フィルム)
を用いて定量した。各群について定量されたIL-4および
IL-12p40のcDNAの量をそれぞれ、βactinのcDNA量で補
正し、IL-4およびIL-12p40のmRNA量を表す数値とした。
各群について求められたIL-12p40のmRNA量に対してIL-4
のmRNA量をプロットし、Th1型反応誘導の標準物質とす
るDNCBの座標と、Th2型反応誘導の標準物質とするTMAの
座標とを対頂角として四角形を作成した。作成された四
角形においてDNCBの座標およびTMAの座標以外の対頂角
を結ぶ対角線を境界線として、DNCBの座標側をTh1型領
域、TMAの座標側をTh2型領域とし、各被験化合物につい
てプロットされた座標がどちらの領域に位置するかを判
定した（図１）。その結果、DNFBおよびOXAはTh1型、TD
IおよびPAはTh2型と判定された。尚、これらの化合物に
関して、DNFB(Garcia-Perez A et al; Contact Dermati
tis 4, 125-127(1978))およびOXA(De Sausa,M et al; J
Exp Med 130, 671-690 (1969))はTh1型反応を、TDI(Bu
tcher B T et al; J Allergy Clin Immunol 28, 89-100
(1976))およびPA(Dearman et al; Clin Exp Allergy 22
(2) 241-50(1992))はTh2型反応を、それぞれ優位に引き
起こすことが報告されている。
びIL-12p40のmRNA量をそれぞれ以下の通り定量した。ま
ず、耳介リンパ節からIsogen(ニッホ゜ンシ゛ーン)を用い、該試
薬の添付マニュアルに記載の方法に準じてRNAを抽出し
た。抽出されたRNAから、SuperScript Reverse Transcr
iption System(Gibco BRL)を用い、該システムの添付マ
ニュアルに記載の方法に準じてcDNAを作製した。なお、
プライマーには、oligo(dT)12-18 プライマー(Gibco BR
L)を用いた。次いで、得られたcDNAを鋳型とし、Takara
Ex taq DNAホ゜リメラーセ゛(宝酒造)を用いてPCRを行った。IL
-4のcDNAを増幅するためには、配列番号１で示される塩
基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２で
示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライ
マーとし、94℃にて３分間の保温の後、94℃にて30秒間
次いで55℃にて30秒間さらに72℃にて１分間の保温を１
サイクルとしてこれを２４サイクル行い、さらに72℃に
て７分間の保温を行った。IL-12p40のcDNAを増幅するた
めには、配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチドおよび配列番号４で示される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、94℃にて３
分間の保温の後、94℃にて30秒間次いで60℃にて30秒間
さらに72℃にて１分間の保温を１サイクルとしてこれを
２６サイクル行い、さらに72℃にて７分間の保温を行っ
た。また、内部標準とするβactinのcDNAを増幅するた
めには、配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチドおよび配列番号６で示される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、94℃にて３
分間の保温の後、94℃にて30秒間次いで55℃にて30秒間
さらに72℃にて１分間の保温を１サイクルとしてこれを
１７サイクル行い、さらに72℃にて７分間の保温を行っ
た。かかるPCRで得られたDNAをそれぞれ、GelStar(宝酒
造)を添加した２%アガロースゲルに供して電気泳動を行
い、DNAのバンドの蛍光強度をルミノイメージアナライ
ザー(LAS-1000plus, Image Gauge; 富士写真フィルム)
を用いて定量した。各群について定量されたIL-4および
IL-12p40のcDNAの量をそれぞれ、βactinのcDNA量で補
正し、IL-4およびIL-12p40のmRNA量を表す数値とした。
各群について求められたIL-12p40のmRNA量に対してIL-4
のmRNA量をプロットし、Th1型反応誘導の標準物質とす
るDNCBの座標と、Th2型反応誘導の標準物質とするTMAの
座標とを対頂角として四角形を作成した。作成された四
角形においてDNCBの座標およびTMAの座標以外の対頂角
を結ぶ対角線を境界線として、DNCBの座標側をTh1型領
域、TMAの座標側をTh2型領域とし、各被験化合物につい
てプロットされた座標がどちらの領域に位置するかを判
定した（図１）。その結果、DNFBおよびOXAはTh1型、TD
IおよびPAはTh2型と判定された。尚、これらの化合物に
関して、DNFB(Garcia-Perez A et al; Contact Dermati
tis 4, 125-127(1978))およびOXA(De Sausa,M et al; J
Exp Med 130, 671-690 (1969))はTh1型反応を、TDI(Bu
tcher B T et al; J Allergy Clin Immunol 28, 89-100
(1976))およびPA(Dearman et al; Clin Exp Allergy 22
(2) 241-50(1992))はTh2型反応を、それぞれ優位に引き
起こすことが報告されている。
【００１１】
【発明の効果】本発明により、化学物質により誘導され
る免疫反応のタイプを予測する方法が提供可能となる。
る免疫反応のタイプを予測する方法が提供可能となる。
【００１２】［配列表フリーテキスト］ 配列番号１ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号２ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号３ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号４ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号５ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号６ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー
ー 配列番号２ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号３ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号４ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号５ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号６ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー
【００１３】
<110> Sumitomo Chemical Company Limited <120> Method for prediction of immune responses <130> P152463 <160> 6 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 1 gaatgtacca gcagccatat c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 2 ctcagtacta cgagtaatcc a 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 3 cgtgctcatg gctggtgcaa ag 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 4 cttcatctgc aagttcttgg gc 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 5 gatgacgata tcgctgcgct g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 6 gtacgaccag aggcatacag g 21
【図１】化学物質が投与されたTh1優位マウスの組織に
おけるTh1サイトカインの発現量とTh2サイトカインの発
現量との比率を比較するためのグラフを示す。縦軸はIL
-4の発現量を示し、横軸はIL-12p40の発現量を示す。黒
丸；OXA投与マウス、黒三角；DNFB投与マウス、黒四
角；TDI投与マウス、白丸；PA投与マウス、白三角；DNC
B投与マウス、白四角；TMA投与マウス。
おけるTh1サイトカインの発現量とTh2サイトカインの発
現量との比率を比較するためのグラフを示す。縦軸はIL
-4の発現量を示し、横軸はIL-12p40の発現量を示す。黒
丸；OXA投与マウス、黒三角；DNFB投与マウス、黒四
角；TDI投与マウス、白丸；PA投与マウス、白三角；DNC
B投与マウス、白四角；TMA投与マウス。
フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 FB05 FB12 GC15 JA01 4B024 AA11 CA04 CA12 HA11 4B063 QA01 QA05 QQ02 QQ53 QQ61 QR32 QR62 QR72 QS16 QS25 QX02
Claims (7)
- 【請求項１】被験物質が投与されたTh1優位マウスの組
織におけるTh1サイトカインの発現量とTh2サイトカイン
の発現量との比率に基づいて、該被験物質により誘導さ
れる免疫反応のタイプを予測することを特徴とする被験
物質により誘導される免疫型の予測方法。 - 【請求項２】（１）被験物質が投与されたTh1優位マウ
スの組織におけるTh1サイトカインの発現量とTh2サイト
カインの発現量とを測定し、前記２種のサイトカインの
発現量の比率を求める工程、および（２）標準物質が投
与されたTh1優位マウスの組織におけるTh1サイトカイン
の発現量とTh2サイトカインの発現量との比率と、工程
（１）で求められた比率とを比較し、前記被験物質によ
り誘導される免疫反応のタイプを予測する工程を含むこ
とを特徴とする被験物質により誘導される免疫型の予測
方法。 - 【請求項３】発現量がｍＲＮＡ量である請求項１または
２に記載の予測方法。 - 【請求項４】組織が局所リンパ節である請求項１〜３の
いずれかに記載の予測方法。 - 【請求項５】被験物質が投与されたTh1優位マウスが、
陰性対照群のTh1優位マウスと比較して局所リンパ節重
量が２倍以上に増加したマウスである請求項１〜４のい
ずれかに記載の予測方法。 - 【請求項６】Th1サイトカインがIL-12p40であり、Th2サ
イトカインがIL-4である請求項１〜５のいずれかに記載
の予測方法。 - 【請求項７】被験物質が投与されたTh1優位マウスの組
織におけるTh1サイトカインの発現量とTh2サイトカイン
の発現量との比率に基づいて、該被験物質により誘導さ
れる免疫反応のタイプを予測することを特徴とする被験
物質により誘導される免疫型の予測システム。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001019851A JP2002221520A (ja) | 2001-01-29 | 2001-01-29 | 免疫型の予測方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001019851A JP2002221520A (ja) | 2001-01-29 | 2001-01-29 | 免疫型の予測方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002221520A true JP2002221520A (ja) | 2002-08-09 |
Family
ID=18885654
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001019851A Pending JP2002221520A (ja) | 2001-01-29 | 2001-01-29 | 免疫型の予測方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002221520A (ja) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05504886A (ja) * | 1989-08-21 | 1993-07-29 | エフ．ホフマンーラ ロシュ アーゲー | ポリメラーゼ連鎖反応を利用する核酸の定量 |
| WO1998017799A1 (en) * | 1996-10-23 | 1998-04-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Immunotherapy and improved vaccines |
| JPH10505896A (ja) * | 1994-07-22 | 1998-06-09 | アメリカ合衆国 | 変化した免疫状態を有する患者を同定する方法 |
| JPH10304880A (ja) * | 1997-03-07 | 1998-11-17 | Shiseido Co Ltd | 核酸の測定方法及びそのための試薬 |
| WO2000063241A2 (en) * | 1999-04-15 | 2000-10-26 | Children's Medical Center Corporation | Methods and compositions for modulating an immune response |
-
2001
- 2001-01-29 JP JP2001019851A patent/JP2002221520A/ja active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05504886A (ja) * | 1989-08-21 | 1993-07-29 | エフ．ホフマンーラ ロシュ アーゲー | ポリメラーゼ連鎖反応を利用する核酸の定量 |
| JPH10505896A (ja) * | 1994-07-22 | 1998-06-09 | アメリカ合衆国 | 変化した免疫状態を有する患者を同定する方法 |
| WO1998017799A1 (en) * | 1996-10-23 | 1998-04-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Immunotherapy and improved vaccines |
| JPH10304880A (ja) * | 1997-03-07 | 1998-11-17 | Shiseido Co Ltd | 核酸の測定方法及びそのための試薬 |
| WO2000063241A2 (en) * | 1999-04-15 | 2000-10-26 | Children's Medical Center Corporation | Methods and compositions for modulating an immune response |
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