JP2002206000A - Ｏｂ蛋白組成物を用いる非脂肪組織重増加方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】非脂肪組織重増加のためのＯＢ蛋白組成物の使
用方法が提供される。 【解決手段】特定の配列を有するヒトＯＢ蛋白質、その
Ｎ末端に結合した抗体の恒常領域、又はその一部からな
る融合蛋白質を含む医薬組成物が提供される。肥満の治
療、インシュリン感受性向上、並びに、全身活力向上お
よび骨吸収低下のために使用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、非脂肪組織重を増
加させるためのＯＢ蛋白組成物の使用方法に関するもの
である。

【０００２】

【発明の背景】肥満の分子的基礎はかなり不明な部分が
あるが、「ＯＢ遺伝子」およびそれによりコードされた
蛋白（「ＯＢ蛋白」）の特定によって、体が体脂肪蓄積
を調節するのに使用している機序についていくらか理解
が進んだ（Zhang et al., Nature 372: 425-432(1994);
the Correction at Nature 374: 479(1995)も参照）。
ＯＢ蛋白は、ｏｂ／ｏｂ突然変異マウス（ＯＢ遺伝子産
物の産生欠陥故の肥満マウス）ならびに正常な野生型マ
ウスのいずれにおいても、in vivoで活性である。その
生理活性自体は特に、体重減少において発現する（Bari
naga,“Obese” Protein Slims Mice, Science 269: 47
5-476(1995)参照）。

【０００３】ＯＢ蛋白の他の生理効果については十分な
特性決定が行われていない。例えば、ｏｂ／ｏｂ突然変
異マウスにおいて、ＯＢ蛋白を投与することで、血清イ
ンシュリン濃度および血清グルコース濃度が低下するこ
とが知られている。さらに、ＯＢ蛋白投与によって、体
脂肪の低下が生じることも知られている。これはｏｂ／
ｏｂ突然変異マウスおよび非肥満正常マウスのいずれに
おいても認められている（Pelleymounter et al., Scie
nce 269: 540-543(1995); Halaas et al., Science 26
9: 543-546(1995)参照。Campfield et al., Science 26
9: 546-549(1995)も参照（μｇ量の用量のＯＢ蛋白を末
梢および中枢に投与することで、ｏｂ／ｏｂ肥満マウス
および飼料誘発肥満マウスの飼料摂取および体重が低下
したが、ｄｂ／ｄｂ肥満マウスではそれは認められなか
った）。これらの報告のいずれにおいても、最高用量で
あっても毒性は認められていない。

【０００４】特に、体重減少が有益ではないと考えられ
るか、あるいは体重減少の必要がないと考えられる動物
に対するＯＢ蛋白の他の生理効果を解明することは、Ｏ
Ｂ蛋白に別の用途を提供するものとなろう。

【０００５】本発明によって提供されるようなそのよう
な用途は、非脂肪組織（lean tissue）重増加における
ものである。

【０００６】当然のことながら、食事および運動の調節
が、筋肉を大きくする上での一つの方法である。非脂肪
重を増加させるのに使用される組成物もある。非脂肪組
織重を増加させると考えられている現在の組成物には、
テストステロンおよびそれの誘導体などの蛋白同化ステ
ロイドならびにヒト成長ホルモンなどがある。しかしな
がら、これらは望ましくない副作用を有することが認め
られている（以下の概要はレミングトンの著作に詳細に
説明されている（Remington, PharmaceuticalSciences,
18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 1
8042) Chapter50, pp.948-1001））。

【０００７】プロトロピンおよびソマトロピンなどのヒ
ト成長ホルモンは、通常２〜３ヶ月で緩解する高カルシ
ウム尿症を高頻度で起こすことが認められている。高血
糖症および臨床的に明らかな糖尿病が起こることも認め
られている。筋肉痛および早朝頭痛が比較的頻繁である
ことが認められ、甲状腺機能低下および胆汁におけるコ
レステロール過飽和が生じる場合もある。骨端が閉じて
いる場合、指骨および顎骨の成長が継続的に刺激される
が他の骨は刺激されないために身体の均整が異常になる
場合があることから、そのホルモンは使用してはならな
い。

【０００８】蛋白同化ステロイドは運動能力および攻撃
性を高める。それの使用は、米国スポーツ医学協会（Am
erican College of Sports Medicine）によって禁止さ
れている。女性の能力が向上するが、その代償として男
性化およびアクネが生じる。アンドロゲンは男性型多毛
症、深い声もしくは嗄れ声、未成熟男性における思春期
早発症および骨端閉鎖、性欲亢進（男性および女性の両
方）、陰茎強直症、精液減少症および睾丸萎縮、女性に
おける陰核腫脹、潮紅、射精量および精子数の低下、女
性化乳房症、過敏症、アクネ、体重増、浮腫ならびに高
カルシウム血症を引き起こす。長期使用によって攻撃性
がひどく高まる場合があり、多くの暴行がアンドロゲン
の乱用によるものであると言われている。偏執症様行動
および他の精神病的行動が報告されている。胆汁うっ滞
および黄疸が起こる。長期療法後に肝癌が報告された例
が数例ある。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】従って、現在使用可能
な薬剤に見られる副作用のない、非脂肪組織重を増加さ
せる治療用組成物または美容用組成物が得られることが
望ましい。

【００１０】

【課題を解決する手段】本発明は、非肥満動物および肥
満動物へのＯＢ蛋白投与によって非脂肪組織重増加が生
じるという所見に基づくものである。そのようにＯＢ蛋
白は、痩身剤として作用するだけでなく、非脂肪組織重
に影響を与える薬剤として作用する能力を有する。それ
だけでは、体重減が必ずしも有益とは考えられない患者
においてすら、多くの非脂肪組織重増加療法が想到され
る。そこで本発明の１態様は、非脂肪組織重増加のため
のＯＢ蛋白（または該蛋白の類縁体もしくは誘導体）の
使用である。

【００１１】別の態様では本発明は、糖尿病治療方法お
よび糖尿病治療に必要なインシュリンレベル低下方法に
関するものである。脂肪組織重低下と同時に非脂肪組織
重を増加させることで、インシュリンに対する感度が上
昇する。従って本発明の方法は、糖尿病治療に必要なイ
ンシュリン量低下のためのＯＢ蛋白（または該蛋白の類
縁体もしくは誘導体）の使用に関するものである。

【００１２】

【発明の実施の形態】上記のように本発明の方法は、個
体における非脂肪組織重増加方法である。この非脂肪組
織重増加には、脂肪重低下を伴うことが認められてい
る。そこで、ＯＢ蛋白（または該蛋白の類縁体もしくは
誘導体）投与によって所望の体重減が得られない場合で
あっても、非脂肪重を増加させながら体脂肪を減少させ
て体型を変える上で、ＯＢ蛋白投与は有用であると考え
られる。

【００１３】さらに、非脂肪組織重増加により、個体の
インシュリンに対する感受性を高めることができる。従
って本発明のＯＢ蛋白（または該蛋白の類縁体もしくは
誘導体）の使用方法は、糖尿病患者におけるインシュリ
ン感受性向上に関するものでもある。詳細な作用形態は
不明であるが、脂肪組織と比較して非脂肪組織（例：筋
肉）はインシュリンの効果に対する感受性が高いと考え
られる。従って、非脂肪組織増加によって、インシュリ
ン感受性の細胞をより多く利用できるようになると考え
られる。さらに、脂肪（例：脂肪）組織除去は、循環イ
ンシュリンが認められる末梢循環への非脂肪組織の曝露
が多くなるという別の効果も有し得る。従って本発明の
別の態様は、インシュリンに対する感受性向上方法を提
供することである。言い換えれば、糖尿病で必要なイン
シュリンの用量を低下させる方法も提供される。

【００１４】非脂肪組織増加は、筋肉組織増加であると
考えられる。そのような増加は、特定の部分に局在する
ものではなく、全身的増加であることが認められる
（例：後述の実施例１および２）。それ自体で、全身活
力が向上し得る。全身活力向上により、骨吸収低下など
の他の効果が生じる場合があり、骨粗鬆症などの脆弱性
を逆転または改善できる可能性がある。運動能力向上を
望む患者では、全身活力向上がその能力向上に有効であ
ると考えられる。赤血球の産生または有効性上昇、なら
びに酸素化血液の増加があり得る。そうして、精神的・
肉体的能力を向上させることができる。

【００１５】ＯＢ蛋白は、以下に記載の組換えマウス蛋
白（配列番号２）またはツァンクらの報告（Zhang et a
l., Nature, supra；引用によって本明細書に含まれる
ものとする）に記載の組換えヒト蛋白もしくは位置２８
のグルタミン残基を持たないものから選択することがで
きる（Zhang et al., Nature, supra, p.428参照）。
（１）位置３５のリジンに代えてアルギニンおよび
（２）位置７４のイソロイシンに代えてロイシンを有す
る配列番号４に示した組換えヒトＯＢ蛋白類縁体を用い
ることもできる（この類縁体についての略称を、組換え
ヒトＲ→Ｋ^３５、Ｌ→Ｉ^７４とする）。それらの組換え
ヒト蛋白類縁体および組換えマウス蛋白のアミノ酸配列
を以下に示してあるが、−１の位置にメチオニン残基が
ある。しかし、本発明のＯＢ蛋白およびその類縁体につ
いては、そのメチオニン残基はなくても良い。

【００１６】上記マウス蛋白は、特に成熟蛋白として、
さらには特にＮ末端でヒト蛋白と実質的に相同である。
組換えヒト配列において、マウスの配列と異なるアミノ
酸を変えることで（アミノ酸残基の置換など）、組換え
ヒト蛋白の類縁体を得ることができる。この組換えヒト
蛋白はマウスで生理活性を有することから、そのような
類縁体はヒトにおいて活性である可能性がある。例え
ば、第１のアミノ酸がバリンで位置１４６のアミノ酸が
システインである配列番号４の番号付けによる位置３５
の残基がリジンで位置７４の残基がイソロイシンである
ヒト蛋白を用いた場合、位置３２、３５、５０、６４、
６８、７１、７４、７７、８９、９７、１００、１０
５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３
６、１３８、１４２および１４５の１以上のアミノ酸を
別のアミノ酸で置換することができる。マウス蛋白（配
列番号２）の相当する位置のアミノ酸または別のアミノ
酸を選択することができる。

【００１７】さらに、ラットＯＢ蛋白配列に基づいて、
「コンセンサス」分子を得ることができる（Murakami e
t al., Biochem.Biophys. Res.Comm.209:944-952(199
5)；引用によって本明細書に含まれるものとする）。ラ
ットＯＢ蛋白は、配列番号４の番号割り付けを用いる
と、４、３２、３３、３５、５０、６８、７１、７４、
７７、７８、８９、９７、１００、１０１、１０２、１
０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３
６、１３８および１４５の位置でヒトＯＢ蛋白と異なっ
ている。これらの各種位置のアミノ酸の１以上を別のア
ミノ酸で置換することができる。下線を付した位置は、
マウスＯＢ蛋白とラットＯＢ蛋白がヒトＯＢ蛋白と異な
っていることから、変えるのに特に適した位置である。
これらの位置の１以上で、相当するラットＯＢ蛋白のア
ミノ酸または別のアミノ酸を置換することができる。

【００１８】成熟ヒトＯＢ蛋白と異なるラットおよびマ
ウスの両方のＯＢ蛋白の位置は、４、３２、３３、３
５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、７８、８
９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、
１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２およ
び１４５である。上記のアミノ酸の１以上が欠失してい
るか相当するラットもしくはマウスの配列で認められる
アミノ酸などの別のアミノ酸で置換されている配列番号
４によるヒトＯＢ蛋白（位置３５がリジン、位置７４が
イソロイシン）も有効であると考えられる。

【００１９】さらに、成熟ヒトＯＢ蛋白と異なるアカゲ
ザルＯＢ蛋白で認められるアミノ酸（１文字のアミノ酸
略号で括弧内に示してあるもの）は、８（Ｓ）、３５
（Ｒ）、４８（Ｖ）、５３（Ｑ）、６０（Ｉ）、６６
（Ｉ）、６７（Ｎ）、６８（Ｌ）、８９（Ｌ）、１００
（Ｌ）、１０８（Ｅ）、１１２（Ｄ）および１１８
（Ｌ）である。組換えヒトＯＢ蛋白はカニクイザルで活
性であることから（後述の実施例２に記載）、アカゲザ
ルの各種アミノ酸の１以上が括弧に示したアミノ酸など
の別のアミノ酸で置換された配列番号４（位置３５がリ
ジン、位置７４がイソロイシン）によるヒトＯＢ蛋白は
有効であると考えられる。ある種のアカゲザルの各種ア
ミノ酸は上記のマウスで認められるもの（位置３５、６
８、８９、１００および１１２）でもあることは留意す
べき点である。そこで、位置４、８、３２、３３、３
５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６
８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１
０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１
２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５とい
うアミノ酸の１以上が別のアミノ酸によって置換された
マウス／アカゲザル／ヒトコンセンサス分子を得ること
ができる（位置３５がリジンで位置７４がイソロイシン
である配列番号４の番号割り付けを使用）。

【００２０】この蛋白のアミノ酸配列の一部を欠失させ
ることで、他の類縁体を得ることができる。例えば、成
熟蛋白はリーダー配列を持たない（−２２〜−１）。以
下の切断型ヒトＯＢ蛋白分子を得ることができる（配列
番号４の番号割り付けを使用）： （ａ）アミノ酸９８〜１４６ （ｂ）アミノ酸１〜３２ （ｃ）アミノ酸４０〜１１６ （ｄ）アミノ酸１〜９９および（それに結合した）１１
２〜１４６ （ｅ）アミノ酸９９と１１２の間にアミノ酸１００〜１
１１の１以上があるアミノ酸１〜９９および（それに結
合した）１１２〜１４６。

【００２１】さらにこれら切断型は、ヒトＯＢ蛋白と異
なる（アカゲザル、ラットまたはマウスのＯＢ蛋白で）
アミノ酸の１以上が変わっているものであっても良い。
さらに、変更はペプチド類似物またはＤ−アミノ酸など
の変更アミノ酸の形であっても良い。

【００２２】本発明の蛋白（本明細書において「蛋白」
という用語は、別段の断りがない限り、以下に引用のよ
うな「ペプチド」およびＯＢ類縁体を含むものとして使
用される）は、蛋白部分への１以上の化学部分結合によ
って誘導体化されていても良い。さらに、化学的に修飾
された誘導体を、動脈投与、腹腔内投与、筋肉投与、皮
下投与、静脈投与、経口投与、経鼻投与、肺投与、局所
投与その他の投与経路用に製剤化することもできる。生
理活性蛋白の化学修飾は、一定の環境下で、治療効果の
ある蛋白の安定性向上および循環時間延長ならびに免疫
原性の低下などのさらなる利点をもたらすことが認めら
れている（１９７９年１２月１８日発行の米国特許４１
７９３３７号（Davis et al.）参照；総説については、
Abuchowski et al., Enzymes as Drugs参照（J.S.Holce
rberg and J.Roberts, eds.pp.367-383(1981)）；蛋白
修飾および融合蛋白について記載した総説論文には、Fr
ancis, Focus on Growth Factors 3: 4-10(1992年5月)
がある（Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet
Lane, London N20, OLD, UK出版））。

【００２３】誘導体化に好適な化学部分は、各種水溶性
ポリマーから選択することができる。選択されるポリマ
ーは水溶性であって、それが結合する蛋白が生理環境な
どの水系の環境で沈殿しないようにするものでなければ
ならない。好ましくは、最終製造品を治療に使用する場
合、ポリマーは医薬的に許容されるものとする。当業者
であれば、ポリマー／蛋白接合体が治療に使用可能か否
か、そして使用可能であれば望ましい用量、循環時間、
蛋白分解に対する耐性および他の検討事項などの検討事
項に基づいて望ましいポリマーを選択することができ
る。本発明の蛋白およびペプチドの場合、誘導体化の有
効性は、望ましい剤型で（すなわち、浸透ポンプによ
り、あるいはより好ましくは注射もしくは注入により、
さらには例えば経口投与、肺投与もしくは経鼻投与用に
製剤されたものにより）誘導体を投与し、本明細書に記
載の方法に従ってその有効性を測定することで確認する
ことができる。

【００２４】水溶性ポリマーは例えば、ポリエチレング
リコール、エチレングリコール／プロピレングリコール
の共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストリ
ン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポ
リ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオ
キソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリア
ミノ酸類（ホモポリマーまたはランダム共重合体もしく
は非ランダム共重合体）、ならびにデキストリンもしく
はポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコー
ル、プロピレングリコールホモポリマー類、ポリプロピ
レンオキサイド／エチレンオキサイド共重合体、ポリオ
キシエチル化多価アルコール類、ポリスチレンマレエー
トならびにポリビニルアルコールから成る群から選択す
ることができる。ポリエチレングリコールプロピオンア
ルデヒドは、水中で安定であることから、製造において
有利であると考えられる。

【００２５】融合蛋白は、ＯＢ蛋白（または類縁体）部
分にポリアミノ酸を結合させることで得ることができ
る。例えば、ポリアミノ酸は、蛋白の循環半減期を延長
する上で役立つ担体蛋白であることができる。本発明の
治療上または美容上の目的に関しては、そのようなポリ
アミノ酸は、中和抗原反応その他の有害応答を起こさな
いものでなければならない。そのようなポリアミノ酸
は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、抗体
もしくはそれの部分（「Ｆ_ｃ」と称される場合もある抗
体の恒常領域など）その他のポリアミノ酸からなる群か
ら選択することができる。以下に示すように、ポリアミ
ノ酸の結合位置は、ＯＢ蛋白部分のＮ末端その他の箇所
であることができ、ＯＢ蛋白への化学的「リンカー」部
分によって結合していても良い。

【００２６】ポリマーの分子量に制限はなく、分岐であ
っても直鎖であっても良い。ポリエチレングリコールの
場合、好ましい分子量は、取り扱いやすさおよび製造し
やすさから、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲である
（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの製造
において、一部の分子の分子量が指定の分子量より大き
く、一部の分子ではそれより小さかったりすることを示
している）。所望の治療プロファイルに応じて（例：所
望の徐放期間、生理活性がある場合はその生理活性に対
する効果、取り扱いやすさ、抗原性の程度もしくはその
欠如、ならびに治療効果のある蛋白もしくは類縁体に対
するポリエチレングリコールの他の既知の効果）、それ
以外の大きさのものを用いることができる。

【００２７】このようにして結合したポリマー分子の数
は多様であることができ、当業者であれば、機能に対す
る効果を確認することができる。モノ誘導体化を行うこ
とができたり、あるいは同一もしくは異なる化学部分に
よって、ジ、トリ、テトラまたは数個の組み合わせの誘
導体化を行うことが可能である（例：分子量の異なるポ
リエチレングリコール類などのポリマー）。蛋白（もし
くはペプチド）分子に対するポリマー分子の割合は、そ
れらの反応混合物中での濃度同様に多様である。一般
に、所望の誘導体化程度（例：モノ、ジ、トリなど）、
選択されるポリマーの分子量、そのポリマーが分岐であ
るか直鎖であるか、反応条件などの因子によって、至適
比率（過剰の未反応の蛋白やポリマーがない反応の効率
に関して）を決定する。

【００２８】上記化学部分は、蛋白の機能性または抗原
性ドメインに対する効果を考慮して蛋白に結合させなけ
ればならない。当業者が使用可能な結合方法が多くあ
る。例えば、ＥＰ０４０１３８４号（引用によって本明
細書に含まれるものとする）（ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへの
結合）、マリクらの報告（Malik et al., Exp.Hemato
l., 20:1028-1035, 1992；塩化トレシルを用いるＧＭ−
ＣＳＦのＰＥＧ化について報告）などがある。例えばポ
リエチレングリコールは、遊離のアミノ基またはカルボ
キシル基などの反応性基を介してアミノ酸残基によって
共有結合的に結合することができる。反応性基とは、活
性化ポリエチレングリコール分子が結合し得る基であ
る。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基には、リジン残
基およびＮ末端アミノ酸残基などがあり得る。遊離カル
ボキシル基を有するものには、アスパラギン酸残基、グ
ルタミン酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基などがあり得る。
ポリエチレングリコール分子を付着させるための反応性
基として、メルカプト基を使用することもできる。治療
のためには、Ｎ末端またはリジン基での結合などのアミ
ノ基での結合が好ましい。受容体結合が望ましい場合、
受容体結合にとって重要な残基での結合は避けるべきで
ある。

【００２９】特にＮ末端で化学修飾された蛋白が望まし
い場合がある。ポリエチレングリコールを用いて本発明
の組成物を説明すると、各種のポリエチレン分子（分子
量、分岐などによって）、反応混合物中の蛋白分子に対
するポリエチレングリコール分子の割合、実施するＰＥ
Ｇ化反応の種類、選択されたＮ末端ＰＥＧ化蛋白を得る
方法を選択することができる。Ｎ末端ＰＥＧ化品を得る
方法は（すなわち、必要に応じてこの部分を他のモノＰ
ＥＧ化部分と分離する方法）、ＰＥＧ化蛋白分子群から
のＮ末端ＰＥＧ化品の精製による。選択的Ｎ末端化学修
飾は、特定蛋白における誘導体化に使用可能な各種１級
アミノ基の反応性差（リジンとＮ末端）を利用する還元
的アルキル化によって行うことができる。適切な反応条
件下で、含カルボニル基ポリマーによるＮ末端での蛋白
の実質的に選択的な誘導体化を行う。例えば、リジン残
基のε−アミノ基と蛋白のＮ末端残基のα−アミノ基と
の間のｐＫａ差を利用できるｐＨで反応を行うことで、
蛋白をＮ末端で選択的にＰＥＧ化することができる。そ
のような選択的誘導体化によって、蛋白への水溶性ポリ
マーの付着が抑制され、ポリマーとの接合が蛋白のＮ末
端で支配的に起こり、リジン側鎖アミノ基などの他の反
応性基にはほとんど変化が起こらない。還元的アルキル
化を用いる場合、水溶性ポリマーは上記の種類のものと
することができ、蛋白への結合のための１個の反応性ア
ルデヒドがなければならない。１個の反応性アルデヒド
を有するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド
を使用することができる。

【００３０】治療薬製造を容易にするには、Ｎ末端モノ
ＰＥＧ化誘導体が好ましい。Ｎ末端ＰＥＧ化により、生
成物の特性決定がジ、トリその他の複数ＰＥＧ化生成物
の場合と比較して簡単である均質な生成物が得られる。
上記のＮ末端生成物製造のための還元的アルキル化方法
を用いることが、商業的製造を容易にする上で好まし
い。

【００３１】本発明のさらに別の態様では、蛋白および
誘導体の医薬組成物を用いる方法が提供される。そのよ
うな医薬組成物は、注射用、あるいは経口投与、肺投
与、経鼻投与、経皮投与その他の投与形態用のものであ
ることができる。有効量の本発明の蛋白もしくは誘導体
と医薬的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化
剤、補助剤および／または担体とを含む医薬組成物が本
発明に含まれる。そのような組成物は、各種緩衝剤含有
量（例：トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨお
よびイオン強度の希釈剤；洗剤および可溶化剤（例：Ｔ
ｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤
（例：アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保
存剤（例：チメルゾル（Thimersol）、ベンジルアルコ
ール）および増量剤（例：乳糖、マンニトール）などの
添加物を含み、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリ
マー化合物の粒子状物あるいはリポソームへの材料の取
り込みが行われる。ヒアルロン酸も使用することがで
き、それは循環系における持続期間を延長する効果を有
する場合がある。そのような組成物は、本発明の蛋白お
よび誘導体の物理的状態、安定性、in vivoでの放出速
度、in vivoでのクリアランス速度に影響を与え得るも
のである（例えばRemington's Pharmaceutical Science
s, 18th Ed.(1990, Mack Publishing Co.,Easton, PA 1
8042), pp.1435-1712参照；引用によって本明細書に含
まれるものとする）。この組成物は、液体製剤で製造す
ることができるか、あるいは凍結乾燥品などの乾燥粉末
とすることができる。経皮製剤のような植え込み可能な
徐放製剤も想到される。

【００３２】経口固体製剤（Remington's Pharmaceutic
al Sciences, 18th Ed.(1990, MackPublishing Co.,Eas
ton, PA 18042), Chapter 89（引用によって本明細書に
含まれるものとする）に記載のもの）が本発明での使用
で想到される。固体製剤には、錠剤、カプセル、丸薬、
トローチもしくはロゼンジ、カシェ剤またはペレットな
どがある。さらに、リポソームカプセル封入またはプロ
テイノイドカプセル封入を用いて、本発明の組成物を製
剤することもできる（例えば、米国特許４９２５６７３
号に記載のプロテイノイドミクロスフェアなど）。リポ
ソームカプセル封入を用いることができ、リポソームは
各種ポリマーで誘導体化できる（例：米国特許５０１３
５５６号）。治療薬用に使用可能な固体製剤についての
記載がマーシャルの著作にある（Marshall,K., Modern
Pharmaceutics, ed. by G.S.Banker and C.T.Rhodes, C
hapter 10, 1979；引用によって本明細書に含まれるも
のとする）。製剤には、その蛋白（またはそれの類縁体
もしくは誘導体）ならびに胃環境に対する保護および腸
での生理活性物質の放出を可能とするための不活性成分
を含有させる。

【００３３】具体的には、上記の誘導体化蛋白の経口製
剤も想到される。蛋白を化学修飾して、誘導体の経口投
与を有効に行えるようにすることができる。一般に、想
到される化学修飾は、（ａ）蛋白分解の阻害および
（ｂ）胃または腸からの血流への取り込みを可能とする
１以上の部分の蛋白（もしくはペプチド）分子自体への
付加である。さらに、蛋白の全体的安定性の向上および
体内での循環時間の延長も望ましい。そのような部分の
例としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコ
ールとプロピレングリコールの共重合体、カルボキシメ
チルセルロース、デキストリン、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンなどがあ
る（Abuchowski and Davis, Soluble Polymer-Enzyme A
dducts, in "Enzymes as Drugs", Hocenberg and Rober
ts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, (198
1), pp.367-383; Newmark, et al., J.Appl.Biochem.
4:185-189(1982)）。使用可能な他のポリマーには、ポ
リ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−ト
リオキソランがある。

【００３４】蛋白（または誘導体）の場合、放出箇所は
胃、小腸（十二指腸、空腸または回腸）または大腸であ
ることができる。当業者であれば、胃では溶けないが十
二指腸や腸の他の箇所でその物質を放出する製剤を使用
することができる。好ましくはその放出は、蛋白（また
は誘導体）の保護あるいは腸などの胃環境を過ぎてから
の生理活性物質の放出によって、胃環境の悪影響を回避
するものである。

【００３５】胃での十分な耐性を確保するには、少なく
ともｐＨ５．０まで不透過性のコーティングが必須であ
る。腸溶コーティングとして使用されるより一般的な不
活性成分の例としては、セルロース酢酸トリメリテート
（ＣＡＴ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５
５、ポリビニル酢酸フタレート（ＰＶＡＰ）、ユードラ
ジット（Eudragit）Ｌ３０Ｄ、アクアテリック（Aquate
ric）、セルロース酢酸フタレート（ＣＡＰ）、ユード
ラジットＬ、ユードラジットＳおよびシェラック（shel
lac）がある。これらのコーティングは、混合フィルム
として使用することができる。

【００３６】コーティングまたはコーティング混合物
は、胃に対する保護を目的としない錠剤にも使用するこ
とができる、それには、糖衣または錠剤を嚥下しやすく
するためのコーティングなどがあり得る。カプセルは、
粉剤などの乾燥治療薬投与用の硬殻（ゼラチンなど）か
ら成ることができ、液剤用には軟ゼラチン殻を使用する
ことができる。カシェ剤の殻材料としては、厚いデンプ
ンその他の食用紙があり得る。丸薬、ロゼンジ、成型錠
剤または湿製錠剤の場合、湿式塊化法（moist massing
techniques）を用いることができる。

【００３７】治療薬は、粒径約１ｍｍの顆粒またはペレ
ットの形態での微小複合粒子（multiparticulates）と
しての製剤で含有させることができる。カプセル投与用
の材料の製剤は、粉末で軽く加圧したプラグ（plug）ま
たは錠剤であることもできる。治療薬は圧縮によって製
造することが可能である。

【００３８】着色剤および芳香剤はいずれも含有させる
ことができる。例えば、蛋白（または誘導体）を製剤し
（例えばリポソームカプセル封入またはミクロスフェア
カプセル封入によって）、さらに着色剤および芳香剤を
含む冷蔵飲料などの食用製品中に含有させることもでき
る。

【００３９】不活性材料によって治療薬を希釈したり、
増量させることができる。その希釈剤には、特にマンニ
トール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロー
ス、ショ糖、修飾デキストリン類およびデンプンのよう
な炭水化物などがあり得る。トリリン酸カルシウム、炭
酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムなどのある種の無
機塩類も充填剤として使用することができる。市販の希
釈剤を数例挙げると、ファスト−フロ（Fast-Fro）、エ
ムデックス（Emdex）、ＳＴＡ−Ｒｘ １５００、エンコ
ンプレス（Emcompress）およびアビセル（Avicell）な
どがあり得る。

【００４０】治療薬の製剤では、固体製剤に崩壊剤を含
有させることができる。崩壊剤として使用される材料に
は、デンプンに基づく市販の崩壊剤であるエクスプロタ
ブ（Explotab）のようなデンプンなどがあるが、それに
限定されるものではない。グリコール酸デンプンナトリ
ウム、アンバーライト、カルボキシメチルセルロースナ
トリウム、ウルトラミロペクチン（ultramylopecti
n）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、橙皮、酸カル
ボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナ
イトはいずれも使用可能である。別の形の崩壊剤には、
不溶性カチオン交換樹脂がある。粉末ガムを崩壊剤およ
び結合剤として用いることができ、それには寒天、カラ
ヤガムまたはトラガカントガムなどの粉末ガムなどがあ
り得る。アルギン酸およびそれのナトリウム塩も崩壊剤
として有用である。

【００４１】結合剤を用いて治療薬を保持して硬錠剤を
形成することができ、その結合剤には、アカシアガム、
トラガカントガム、デンプンおよびゼラチンなどの天然
物からの材料などがある。他には、メチルセルロース
（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシ
メチルセルロース（ＣＭＣ）などがある。ポリビニルピ
ロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセ
ルロース（ＨＰＭＣ）をいずれもアルコール溶液で使用
して、治療薬の造粒を行うことができる。

【００４２】減摩剤を治療薬製剤に含有させて、製剤工
程中の粘着を防止することができる。治療薬と金型壁と
の間の層として潤滑剤を用いることができ、それにはス
テアリン酸（それのマグネシウム塩およびカルシウム塩
を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、
流動パラフィン、植物油およびロウなどがあるが、これ
らに限定されるものではない。ラウリル硫酸ナトリウ
ム、ラウリル硫酸マグネシウム、各種分子量のポリエチ
レングリコール、カーボワックス（Carbowax）４０００
および６０００などの可溶性潤滑剤を使用することもで
きる。

【００４３】製剤時の薬剤の流動性を改善したり、圧縮
時の再配列を容易にする滑剤を加えることも可能である
と考えられる。滑剤には、デンプン、タルク、焼成シリ
カおよび水和シリコアルミネートなどがあり得る。

【００４４】治療薬の水系環境への溶解を助けるため、
湿展剤として界面活性剤を加えることも考えられる。界
面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク
酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナ
トリウムなどのアニオン系洗剤などがあり得る。カチオ
ン系洗剤を使用することが可能であり、それには塩化ベ
ンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムなどがある。
界面活性剤として製剤に含有させることができると考え
られるノニオン系洗剤を挙げると、ラウロマクロゴール
４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエ
チレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステア
リン酸グリセリン、ポリソルベート４０、６０、６５お
よび８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロースな
らびにカルボキシメチルセルロースがある。これらの界
面活性剤は、単独であるいは各種比率での混合物とし
て、蛋白もしくは誘導体の製剤に存在させることができ
ると考えられる。

【００４５】蛋白（または誘導体）の取り込みを促進す
る可能性のある添加剤としては例えば、オレイン酸、リ
ノール酸およびリノレン酸などの脂肪酸がある。

【００４６】徐放製剤が望ましい場合がある。拡散機構
または浸出機構による放出を可能とする不活性基剤（す
なわちガム）に薬剤を取り込ませることができる。徐々
に分解する基剤を製剤に組み入れることもできる。この
治療薬の別の形態の徐放は、オロス（Oros）治療薬系
（Alza Corp.）に基づく方法によるものである。すなわ
ち、水を浸入させ、浸透圧効果によって１個の小さい開
口から薬剤を押し出すことができる半透膜中に、薬剤を
封入するものである。一部の腸溶コーティングも遅延性
放出効果を有するものである。

【００４７】製剤には他のコーティングを使用すること
ができる。それには、糖衣器で使用することができる各
種糖などがある。治療薬はさらに、フィルムコーティン
グ剤で投与することも可能であり、その場合に使用され
る材料は２つの群に分けられる。第１の群は、非腸溶性
材料であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒ
ドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ
プロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチ
ルセルロース、プロビドン（providone）およびポリエ
チレングリコール類などがある。第２の群は腸溶性材料
からなり、一般的にはフタル酸のエステルである。

【００４８】材料を混合することで最適なフィルムコー
ティングを得ることも考えられる。フィルムコーティン
グは糖衣器もしくは流動床で、あるいは圧縮コーティン
グによって行うことができる。

【００４９】本発明においては、本発明の蛋白またはそ
れの誘導体を肺投与することも想到される。蛋白（誘導
体）は、吸入しながら哺乳動物の肺に投与され、肺上皮
内層を通過して血流に入る（これについての他の報告に
は次のものがある；Adjei etal., Pharmaceutical Rese
arch 7:565-569(1990); Adjei et al., International
Journal of Pharmaceutics 63: 135-144(1990)（酢酸ロ
イプロリド）; Braquet et al., Journal of Cardiovas
cular Pharmacology 13(suppl.5): s.143-146(1989)
（エンドテリン−１）; Hubbard et al., Annals of In
ternal Medicine3:206-212(1989)（α１−抗トリプシ
ン）;Smith et al., J.Clin.Invest.84:1145-1146(198
9)（α−１−プロテイナーゼ）; Oswein et al., "Aero
solization of Proteins", Proceedings of Symposium
on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorad
o, March, 1990（組換えヒト成長ホルモン）; Debs et
al., The Journal of Immunology 140:3482-3488(1988)
（インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子α）; Plat
z et al., 米国特許５２８４６５６号（顆粒球コロニー
刺激因子））。

【００５０】本発明の実施においては、治療薬の肺投与
用の多種の装置を使用することが想到され、それには噴
霧吸入器、用量計量吸入器および粉剤吸入器などの当業
者には周知のものなどがあるが、これらに限定されるも
のではない。

【００５１】本発明の実施に好適な市販装置の具体例を
いくつか挙げると、ウルトラベント（Ultravent）噴霧
吸入器（製造者：Mallinckrodt, Inc., St.Louis, Miss
ouri）、エーコーン（Acorn）ＩＩ噴霧吸入器（製造
者：Marquest Medical Products, Englewood, Colorad
o）、ベントリン（Ventolin）用量計量吸入器（製造
者：Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Caro
lina）およびスピンヘイラー（Spinhaler）粉剤吸入器
（製造者：Fisons Corp., Bedford, Massachusetts）が
ある。

【００５２】そのような装置のいずれにおいても、蛋白
（または類縁体もしくは誘導体）の投薬に好適な製剤を
使用する必要がある。通常、各製剤は使用される装置の
種類に固有のものであり、治療に有用な希釈剤、補助剤
および／または担体に加えて、適切な墳射剤を使用する
場合がある。

【００５３】蛋白（または誘導体）は最も有利には、遠
位肺への最も有効な投与を行うために、平均粒径１０μ
ｍ未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの粒子状に製剤
しなければならない。

【００５４】担体には、トレハロース、マンニトール、
キシリトール、ショ糖、乳糖、ソルビトールのような炭
水化物などがある。製剤で使用する他の成分には、ＤＰ
ＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣなどがあり得
る。天然または合成の界面活性剤を使用することができ
る。ポリエチレングリコールを使用することができる
（蛋白または類縁体の誘導体化での使用以外であって
も）。シクロデキストリンなどのデキストリン類を使用
することができる。胆汁酸塩および他の関連する相乗剤
を使用することができる。セルロースおよびセルロース
誘導体を使用することができる。緩衝剤製剤での使用な
どで、アミノ酸を使用することができる。

【００５５】さらに、リポソーム、マイクロカプセルも
しくはミクロスフェア、包接錯体その他の種類の担体の
使用も想到される。

【００５６】噴射式または超音波式のいずれかの噴霧吸
入器での使用に好適な製剤は代表的には、液剤１ｍＬ当
たり生理活性蛋白約０．１〜２５ｍｇの濃度となるよう
に水に溶かした蛋白（または誘導体）を含有するもので
ある。その製剤には、緩衝剤および単糖を含有させるこ
ともできる（例えば、蛋白の安定化および浸透圧の調節
のため）。噴霧吸入器用製剤には界面活性剤を含有させ
て、エアロゾル形成時の液剤霧化によって生じる蛋白の
表面誘発凝集を低減もしくは防止することもできる。

【００５７】用量計量吸入器で使用する製剤は通常、界
面活性剤を用いて噴射剤中に懸濁させた蛋白（または誘
導体）を含む微細粉末を含有する。噴射剤は、クロロフ
ルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒド
ロフルオロカーボンまたは炭化水素などのその目的に使
用される従来の材料とすることができ、それには具体的
にはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメ
タン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，
１，１，２−テトラフルオロエタンあるいはそれらの組
み合わせなどがある。好適な界面活性剤には、トリオレ
イン酸ソルビタンおよび大豆レシチンなどがある。オレ
イン酸も、界面活性剤として有用であると考えられる。

【００５８】粉剤吸入器からの投薬用の製剤は、蛋白
（または誘導体）を含有する微細乾燥粉末を含むもので
あり、乳糖、ソルビトール、ショ糖、マンニトール、ト
レハロースまたはキシリトールのような増量剤を、例え
ば製剤の５０〜９０重量％のように装置からの粉剤の分
散を容易にするような量で含有することもできる。

【００５９】蛋白（または類縁体もしくは誘導体）の経
鼻投与も想到される。経鼻投与によって、治療薬を鼻に
投与した直後に蛋白の血流への通過を行うことができ、
薬剤を肺に堆積させる必要がない。経鼻投与用の製剤に
は、デキストリンまたはシクロデキストリンを含むもの
などがある。他の粘膜を通っての輸送を介した投与も想
到される。

【００６０】当業者であれば、投与と所望の治療効果を
観察することで、有効用量を確認することができる。好
ましくは、その分子の製剤は、約０．１０μｇ／ｋｇ／
日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日で所望の治療効果が得られるよ
うなものとする。有効用量は、経時的診断手段を用いて
決定することができる。例えば、血中（または血漿もし
くは血清中）のＯＢ蛋白の量を測定する診断を最初に行
って、ＯＢ蛋白の内因性レベルを求めることができる。
そのような診断手段は、抗体サンドイッチアッセイなど
の抗体アッセイの形態であることができる。内因性ＯＢ
蛋白の量を最初に定量し、基底線値を求める。治療中に
内因性および外因性のＯＢ蛋白（すなわち、自己産生ま
たは投与された体内で認められる蛋白、類縁体または誘
導体）の定量を継続することで、治療用量を求める。従
って、用量は治療中に変動し得るものであり、治療効果
が認められるまで最初は比較的高用量を用い、治療効果
の維持には比較的低用量を用いる。

【００６１】理想的には、非脂肪体重増加のみが望まれ
る場合は、体重減を行うにはその用量は不十分である。
そこで、肥満者の治療の初期では、体重減と同時に脂肪
組織減／非脂肪体重増が得られるような用量を投与する
ことができる。十分な体重減が得られたら、体重の再増
加を防止するが所望の非脂肪重増加（あるいは非脂肪重
低下の防止）を維持するだけの用量を投与することがで
きる。ＯＢ蛋白の効果は可逆的であることから、これら
の用量は経験的に決定することができる（例：Campfiel
d et al., Science 269:546-549(1995),p.547）。そこ
で、体重減少が望ましくない場合に体重減が認められる
場合、それより低い用量を投与することで、非脂肪組織
重の所望の増加を得て、しかも所望の体重を維持するこ
とになろう。

【００６２】対象者のインシュリンに対する感受性を高
めるには、同様の用量検討を考慮することになると考え
られる。体重減を伴わない非脂肪重増加が得られれば、
対象者に対して糖尿病治療向けに投与されるインシュリ
ン（あるいはアミリンその他の糖尿病治療薬）の量を低
下させることができると考えられる。

【００６３】全身活力を高めるため、同様の用量検討を
行うことができる。全身活力の同時向上を伴う非脂肪重
増加は、体重減を得るには不十分な用量で得ることがで
きる。赤血球数（および血液における酸素化）増加およ
び骨吸収の低下もしくは骨粗鬆症の軽減などの他の効果
も、体重減なく得ることができる。

【００６４】本発明の方法を、糖尿病治療に有用な薬剤
（例：インシュリンおよび可能性としてアミリン）、コ
レステロールおよび降圧剤（血液脂質濃度を低下させる
薬剤その他の心血管薬）ならびに活動性向上薬（例：ア
ンフェタミン類）などの他の薬剤と併用することができ
る。食欲抑制薬も使用することができる。そのような投
与は同時に、または連続的に行うことができる。

【００６５】さらに本発明の方法を、身体の全体的容貌
を変えるための美容手術などの外科手術（例：体重減少
のための脂肪吸引またはレーザ手術あるいは身体の見か
けを増加させるための移植術）と併用することができ
る。動脈プラークなどの脂肪沈着物による血管閉塞によ
って起こる有害な状態を緩和するためのバイパス術その
他の手術のような心臓手術の医療上の効果を、本発明の
組成物および方法を併用することで高めることができ
る。超音波法またはレーザ法などの胆石除去方法を、本
発明の治療方法の前、途中または後に行うこともでき
る。さらに、本発明の方法を、骨折、筋肉損傷の手術ま
たは治療その他の非脂肪組織重の増加によって改善され
る可能性のある療法に対する補助手段として行うことが
できる。

【００６６】従って本発明の方法は、非脂肪組織重増加
方法において、 （ａ）配列番号２（下記）または配列番号４（下記）に
示したアミノ酸配列１〜１４６； （ｂ）位置３５にリジン残基と位置７４にイソロイシン
残基を有する配列番号４（下記）に示したアミノ酸配列
群１〜１４６； （ｃ）位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５
３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７
７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０
６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３
６、１３８、１４２および１４５（配列番号４による番
号割り付けを用い、位置２８におけるグルタミン残基が
なくとも同じ番号割り付けを維持して）のうちの１以上
において異なるアミノ酸による置換がある上記下位項目
（ｂ）のアミノ酸配列； （ｄ）位置２８のグルタミン残基が欠失していても良い
上記下位項目（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配
列； （ｅ）Ｎ末端にメチオニン残基を有する上記下位項目
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列； （ｆ）（位置３５にリジン残基と位置７４にイソロイシ
ン残基を有する配列番号４の番号割り付けを用いて） （ｉ）アミノ酸９８〜１４６ （ｉｉ）アミノ酸１〜３２ （ｉｉｉ）アミノ酸４０〜１１６ （ｉｖ）アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６ （ｖ）アミノ酸９９と１１２の間にアミノ酸１００〜１
１１の１以上がその順序で存在するアミノ酸１〜９９お
よび１１２〜１４６； （ｖｉ）アミノ酸１００、１０２、１０５、１０６、１
０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３
８、１４２および１４５のうちの１以上が別のアミノ酸
によって置換されている上記下位項目（ｉ）の切断ＯＢ
類縁体； （ｖｉｉ）アミノ酸４、８および３２のうちの１以上が
別のアミノ酸によって置換されている上記下位項目（ｉ
ｉ）の切断類縁体； （ｖｉｉｉ）アミノ酸５０、５３、６０、６４、６６、
６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１
００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１
１および１１２のうちの１以上が別のアミノ酸によって
置換されている上記下位項目（ｉｉｉ）の切断類縁体； （ｖｉｘ）アミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、
５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７
４、７７、７８、８９、９７、１１２、１１８、１３
６、１３８、１４２および１４５のうちの１以上が別の
アミノ酸によって置換されている上記下位項目（ｉｖ）
の切断類縁体； （ｘ）アミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、５
０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７
４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０
５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１
８、１３６、１３８、１４２および１４５のうちの１以
上が別のアミノ酸によって置換されている上記下位項目
（ｖ）の切断類縁体； （ｘｉ）Ｎ末端メチオニン残基を有する上記下位項目
（ｉ）〜（ｘ）のいずれかの切断類縁体から選択される
切断ＯＢ蛋白類縁体； （ｇ）蛋白部分に連結した化学部分を有してなる上記下
位項目（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＯＢ蛋白もしくは類
縁誘導体； （ｈ）前記化学部分が水溶性ポリマー部分である上記下
位項目（ｇ）の誘導体； （ｉ）前記水溶性ポリマー部分がポリエチレングリコー
ルである上記下位項目（ｈ）の誘導体； （ｊ）前記水溶性ポリマー部分がポリアミノ酸部分であ
る上記下位項目（ｈ）の誘導体； （ｋ）前記水溶性ポリマー部分が前記蛋白部分のＮ末端
のみに結合している上記下位項目（ｈ）の誘導体； （ｌ）上記下位項目（ａ）〜（ｋ）のいずれかのＯＢ蛋
白、類縁体もしくは誘導体から選択される有効量のＯＢ
蛋白、該蛋白の類縁体もしくは誘導体が医薬的に許容さ
れる担体に入ったものを投与する段階を有してなる方法
を提供するものである。

【００６７】

【実施例】以下の実施例は、本発明をより詳細に説明す
るためのものであって、本発明の範囲を限定するものと
解釈すべきではない。実施例１は、ＯＢ蛋白が非肥満動
物における非脂肪重増加に有効であることを示すもので
ある。実施例２は、ＯＢ蛋白が肥満霊長動物における非
脂肪重増加に有効であることを示すものである。実施例
３〜５は、ヒトでの使用の予想実施例である。材料およ
び方法がそれに続く。

【００６８】実施例１ 以下のデータは、ＯＢ蛋白またはそれの類縁体もしくは
誘導体が非脂肪重増加に対して有効であることを示して
いる。組換えメチオニンマウスＯＢ蛋白（以下に説明）
を４週間にわたって浸透ポンプ注入によって連続投与し
た。表１のデータは、表に示した用量での平均体重組成
（ＣＤ１マウスで）を示している。

【００６９】

【表１】 非肥満ＣＤ１マウスでは、０．３または１ｍｇ／ｋｇ／
日の用量で組換えメチオニンマウスＯＢ蛋白を連続投与
することで、ＰＢＳを投与した対照動物と比較して、非
脂肪重の増加を生じることが明らかになった。

【００７０】実施例２ 本実施例は、組換えメチオニンヒトＯＢ蛋白によって、
霊長動物で非脂肪組織重増加が生じることを示すもので
ある。体脂肪率が２０％を超える肥満カニクイザルに、
１日用量１ｍｇ蛋白／ｋｇ／日で組換えメチオニンヒト
ＯＢ蛋白を皮下投与した（以下の材料および方法の欄参
照）。対照動物には、リン酸緩衝生理食塩水を投与し
た。二重エネルギーＸ線吸光光度分析（「ＤＥＸＡ」）
を用いて身体組成検査を行った。身体組成の測定は７日
間間隔で行った。表２Ａおよび２Ｂには、脂肪組織また
は非脂肪組織に関する身体組成分析の結果を示してあ
る。データはグラム単位で表してある。２匹の対照動物
についての結果を表２Ａに示してある。４匹の試験動物
についてのデータを表２Ｂに示してある（骨質量データ
も示してある）。表からわかる通り、第２８日で、試験
動物は約２６４ｇの脂肪を失い、約１３８ｇの非脂肪重
を獲得した。第２８日で、対照動物は３６ｇの脂肪組織
を失い、約２５ｇの非脂肪重を獲得した。これは、ＯＢ
蛋白が非脂肪組織重の増加を起こすことを示している。

【００７１】

【表２】

【００７２】実施例３ 非肥満ヒト患者は、非脂肪組織重が減少した病気からの
回復などの治療目的で、非脂肪組織重増加を望む。患者
に対して有効量のＯＢ蛋白、それの類縁体または誘導体
を投与することで、非脂肪組織重に所望の増加が得られ
る。非組織重増加は、ＤＥＸＡ走査を用いてモニタリン
グする。ＯＢ蛋白（または利用可能な場合は他の抗原性
源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いて、
循環ＯＢ蛋白または類縁体もしくは誘導体の濃度をモニ
タリングすることができる。

【００７３】実施例４ ヒト対象者は、非脂肪組織増加による容貌向上などの美
容上または運動上の目的で、非脂肪組織重増加を望む。
対象者に対して有効量のＯＢ蛋白、それの類縁体または
誘導体を投与することで、非脂肪組織重に所望の増加が
得られる。非脂肪組織重増加は、ＤＥＸＡ走査を用いて
モニタリングする。血中酸素濃度が上昇する。ＯＢ蛋白
（または利用可能な場合は他の抗原性源）に対する抗体
アッセイなどの診断キットを用いて、循環ＯＢ蛋白また
は類縁体もしくは誘導体の濃度をモニタリングすること
ができる。

【００７４】実施例５ ヒト糖尿病患者は、糖尿病治療のために使用するインシ
ュリン用量の低減を望む。患者に対して有効量のＯＢ蛋
白、それの類縁体または誘導体を投与することで、非脂
肪組織重に増加が得られる。インシュリンに対する患者
の感受性が上昇し、糖尿病の症状を緩和するのに必要な
インシュリンの用量が、必要なインシュリンの単位数低
下または１日当たり必要なインシュリン注射回数の低下
のいずれかで低下する。ＯＢ蛋白（または利用可能な場
合は他の抗原性源）に対する抗体アッセイなどの診断キ
ットを用いて、循環ＯＢ蛋白または類縁体もしくは誘導
体の濃度をモニタリングすることができる。

【００７５】実施例６ 非肥満高齢ヒト対象者は、全身活力の向上を望む。対象
者に対して有効量のＯＢ蛋白、それの類縁体または誘導
体を投与することで、非脂肪組織重に増加を得て、全身
活力を向上させる。骨吸収も低下し、骨粗鬆症状態が改
善される。ＯＢ蛋白（または利用可能な場合は他の抗原
性源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用い
て、循環ＯＢ蛋白または類縁体もしくは誘導体の濃度を
モニタリングすることができる。

【００７６】材料および方法 動物 ：齧歯類 実施例１には、野生型ＣＤ１マウスを用いた（表１のデ
ータ）。動物は、愛護的条件下に維持した。霊長動物： 計６匹のカニクイザルを用いた。サルはいずれも、試験
開始時には脂肪率２０％以上であった。動物は体重につ
いて無作為化し、動物４匹についてＯＢ蛋白による試験
を行い、２匹は対照とした。

【００７７】蛋白または媒体の投与 齧歯類の場合 実施例１の場合（表１のデータ）、組換えマウス蛋白
（以下に記載）または媒体（リン酸緩衝生理食塩水、
「ＰＢＳ」、ｐＨ７．４）を、浸透ポンプ注入によって
投与した。浸透小型ポンプ（Alzet, Alza, Palo Alto,
CA、２００２型）を、各マウスの肩甲下領域の皮下嚢部
に手術によって植え込み、２週間後に交換した。ポンプ
の較正を行って、表１に示した用量で、１時間当たり
０．５μ蛋白の溶液を投与するようにした。霊長動物の場合 実施例２の場合、１ｍｇ／ｍＬＰＢＳで調製した組換え
メチオニンヒトＯＢ蛋白（位置３５にリジン、位置７４
にイソロイシンを有する配列番号４のもの）を、用量１
ｍｇ蛋白／ｋｇ／日で皮下投与した。対照動物には、同
じやり方でＰＢＳを投与した。齧歯類屠体分析 レシュナーらの方法に従って屠体分析を行った（A.I.Le
shner, V.A.Litwin and R.L.Squibb, Brain Res. 9:281
(1972)）。４日間の脱水期間の前後での屠体重量差に
よって、水分組成を求めた。粉砕・乾燥した屠体の予め
秤量した一部から、エチルエーテルおよびエチルアルコ
ールで脂肪の抽出を行って、抽出法後に残ったものの量
から脂肪パーセントを計算できた。非脂肪重は、脱水お
よびエーテル抽出後に残った粉砕屠体の割合と定義し
た。

【００７８】霊長動物二重エネルギーＸ線吸光光度分析
走査 実施例２では、表２Ａおよび２Ｂに示した時点で、「Ｄ
ＥＸＡ」走査を行った。蛋白 配列番号１および２はマウス組換えＯＢ ＤＮＡおよび
蛋白を示し、配列番号３および４は類縁の組換えヒトＯ
Ｂ ＤＮＡおよび蛋白を示している。実施例１では、配
列番号２のマウス組換え蛋白を使用した。実施例２で
は、位置３５にリジン残基と位置７４にイソロイシン残
基を有する配列番号４に示した組換えヒトＯＢ蛋白を用
いた。上記のように、以下のマウスおよびヒト類縁の組
換え蛋白は、本発明の医薬品の投与方法および製造方法
で使用できるＯＢ蛋白を例示するものであって、他のＯ
Ｂ蛋白またはそれの類縁体もしくは誘導体を使用するこ
とは可能である。

【００７９】本明細書において、組換え蛋白のアミノ酸
配列の最初のアミノ酸を＋１とし、それはバリンであっ
て、位置−１のアミノ酸はメチオニンである。Ｃ末端ア
ミノ酸は番号１４６である（システイン）。

【００８０】組換えマウスメチオニンＯＢ（二本鎖）Ｄ
ＮＡおよびアミノ酸配列（配列番号１および２）

【００８１】

【化１】

【００８２】組換えヒトメチオニンＯＢ類縁（二本鎖）
ＤＮＡおよびアミノ酸配列（配列番号３および４）

【００８３】

【化２】

【００８４】

【製造方法】以下の製造方法を用いて、生理活性の組換
えメチオニンマウスまたはヒト類縁ＯＢ蛋白を製造し
た。同様の方法を用いて、生理活性組換えメチオニンヒ
トＯＢ蛋白を製造することができる。

【００８５】発現ベクターおよび宿主株 使用したプラスミド発現ベクターはｐＣＦＭ１６５６
（ＡＴＣＣ寄託番号６９５７６）である。上記のＤＮＡ
をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩによって直線とした発現ベ
クターｐＣＦＭ１６５６に連結し、大腸菌宿主株ＦＭ５
に形質転換した。大腸菌ＦＭ５細胞は、大腸菌Ｋ−１２
株（Bachmann et al., Bacteriol.Rev.40:116-167(197
6)）からアムジェン（Amgen Inc., Thousand Oaks, C
A）で誘導したものであり、組み込みλファージ抑制遺
伝子ｃＩ_８５７を有する（Sussmanet al., C.R.Acad.Sc
i. 254:1517-1579(1962)）。ベクター製造、細胞形質転
換およびコロニー選択は、標準的方法によって行った
（例：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labora
tory Manual, 2d Edition, Cold Spring Harbor Labora
tory Press, Cold Spring Harbor, NY）。宿主細胞はＬ
Ｂ培地で成長させた。

【００８６】発酵工程 フェド−バッチ培養法として知られる３段階発酵プロト
コールを用いた。培地組成は以下の通りである。

【００８７】バッチ：窒素・リン酸源を発酵槽（Biolaf
itte、容量１２リットル）で滅菌した（昇温して１２２
℃で３５分間、１８〜２０ｐｓｉ）。冷却時に、炭素
源、マグネシウム源、ビタミン源および微量金属源を無
菌的に加えた。５００ｍＬの上記組換えマウス蛋白産生
菌（ＬＢ肉汁で成長させたもの）の終夜培養物（１６時
間以上）を発酵槽に入れた。

【００８８】供給液Ｉ：ＯＤ_６００が４．０〜６．０に
達した時点で、培地に供給液Ｉを加えた。グルコースの
供給は速度を制限しながら行って、成長速度（μ）を制
御した。自動システム（分配制御システムと称する）を
設定して、成長速度を１時間当たり０．１５世代に制御
した。

【００８９】供給液ＩＩ：ＯＤ_６００が３０に達した時
点で、培養温度を徐々に上げて４２℃とし、供給液を下
記の供給液ＩＩに変えた。２時間ごとにサンプリングを
行いながら、発酵を１０時間継続した。１０時間後、発
酵槽の内容物を冷却して２０℃以下とし、遠心によって
回収した。

【００９０】培地組成 バッチ： １０ｇ／Ｌ 酵母抽出物 ５．２５ｇ／Ｌ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ３．５ｇ／Ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４ ４．０ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４ ５．０ｇ／Ｌ グルコース １．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２．０ｍＬ／Ｌ ビタミン溶液 ２．０ｍＬ／Ｌ 微量金属溶液 １．０ｍＬ／Ｌ Ｐ２０００消泡剤 供給液Ｉ： ５０ｇ／Ｌ バクトトリプトン ５０ｇ／Ｌ 酵母抽出物 ４５０ｇ／Ｌ グルコース ８．７５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １０ｍＬ／Ｌ ビタミン溶液 １０ｍＬ／Ｌ 微量金属溶液 供給液ＩＩ： ２００ｇ／Ｌ バクトトリプトン １００ｇ／Ｌ 酵母抽出物 １１０ｇ／Ｌ グルコース。

【００９１】ビタミン溶液（バッチおよび供給液Ｉ）：
ビオチン０．５ｇ、葉酸０．４ｇおよびリボフラビン
４．２ｇをＨ_２Ｏ ４５０ｍＬおよび１０Ｎ ＮａＯＨ
３ｍＬに溶かし、Ｈ_２Ｏを加えて５００ｍＬとした。ピ
リドキシン−ＨＣｌ １４ｇおよびナイアシン６１ｇを
Ｈ_２Ｏ １５０ｍＬおよび１０Ｎ ＮａＯＨ ５０ｍＬに
溶かし、Ｈ_２Ｏで２５０ｍＬとした。パントテン酸５４
ｇをＨ_２Ｏ ２００ｍＬに溶かし、２５０ｍＬとした。
これら３種類の溶液を混合し、総量１０リットルとし
た。

【００９２】微量金属溶液（バッチおよび供給液Ｉ）： 塩化第ＩＩ鉄（ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）：２７ｇ／Ｌ 塩化亜鉛（ＺｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ）：２ｇ／Ｌ 塩化コバルト（ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ）：２ｇ／Ｌ モリブデン酸ナトリウム（ＮａＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ）：
２ｇ／Ｌ 塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ）：１ｇ／Ｌ 硫酸第ＩＩ銅（ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ）：１．９ｇ／Ｌ ホウ酸（Ｈ_３ＢＯ_３）：０．５ｇ／Ｌ 塩化マンガン（ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ）：１．６ｇ／Ｌ クエン酸ナトリウム・２水和物：７３．５ｇ／Ｌ。

【００９３】マウスＯＢ蛋白の精製方法 以下の段階によって精製を行った（別断の断りがない限
り、以下の段階は４℃で行った）。

【００９４】１．細胞ペースト 大腸菌細胞ペーストを５倍容量の７ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ７．０）に懸濁した。ＥＤＴＡ中の細胞をミクロ流動
装置に２回通してさらに粉砕した。粉砕細胞をベックマ
ン（Beckman）Ｊ６−Ｂ遠心管中、ＪＳ−４．２ロータ
ーを用いて４．２Ｋｒｐｍで１時間遠心した。 ２．封入体洗浄１ 上記からの上清を除去し、ペレットを５倍容量の７ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に再懸濁し、均質化した。こ
の混合物を段階１の方法で遠心した。 ３．封入体洗浄２ 上記からの上清を除去し、ペレットを１０倍容量の２０
ｍＭトリス（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ＤＴＴおよび１
％デオキシコレートに再懸濁し、均質化した。この混合
物を段階１の方法で遠心した。 ４．封入体洗浄３ 上記からの上清を除去し、ペレットを１０倍容量の蒸留
水に再懸濁し、均質化した。この混合物を段階１の方法
で遠心した。 ５．巻き戻し ペレットについて室温で、１５倍容量の１０ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ（ｐＨ ８．５）、１％サルコシンナトリウム
（Ｎ−ラウロイルサルコシン）で巻き戻しを行った。６
０分後、溶液を６０μＭ硫酸銅液とし、終夜攪拌した。 ６．サルコシンの除去 巻き戻し混合物を、５倍容量の１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．５）で希釈し、段階１の方法に従って遠心し
た。上清を回収し、希釈巻き戻し混合物の総容量の０．
０６６％で、２０〜５０メッシュで塩素型のダウエック
ス（Dowex）（登録商標）１−Ｘ４樹脂（Dow Chemical
Co., Midland MI）と、攪拌下に１時間混合した（ダウ
エックス（登録商標）の詳細についてはＷＯ ８９／１
０９３２の２６頁参照）。この混合物をカラムに注ぎ入
れ、溶出液を回収した。サルコシンの除去を、逆相ＨＰ
ＬＣによって確認した。 ７．酸沈殿 前段階からの溶出液を回収し、ｐＨを調節してｐＨ５．
５とし、室温で３０分間インキュベーションした。この
混合物を段階１の方法に従って遠心した。 ８．カチオン交換クロマトグラフィー 前段階からの上清のｐＨを調節してｐＨ４．２とし、Ｃ
Ｍセファロース・ファスト・フロー（Sepharose Fast F
low）に負荷した（７％容量）。２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、
ｐＨ ４．２で、２０倍カラム容量にて０Ｍから１．０
ＭＮａＣｌの塩勾配溶離を行った。 ９．疎水性相互作用クロマトグラフィー 前段階からのピーク分画のＣＭセファロース蓄積液（紫
外線吸光度から確認）を０．２Ｍ硫酸アンモニウム液と
した。５ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ ４．２で、２０倍カラ
ム容量にて０．４Ｍから０Ｍ硫酸アンモニウムの逆相勾
配溶離を行った。この材料を濃縮し、ＰＢＳに透析濾過
した。

【００９５】組換えヒトＯＢ蛋白類縁体の発酵 上記の宿主細胞の発酵による組換えヒトＯＢ蛋白類縁体
（配列番号４）の製造は、組換えマウス材料について前
述した条件および組成物を用いて行うことができる。

【００９６】組換えヒトＯＢ蛋白類縁体の精製 組換えヒト蛋白類縁体の精製は、上記の実施例１に記載
の方法に従って、組換えマウス蛋白の精製に用いた方法
と同様の方法を用いて行うことができる。組換えヒトＯ
Ｂ蛋白類縁体を得るには、段階７からの上清のｐＨをｐ
Ｈ５．０に調節し、それをＣＭセファロース・ファスト
・フローカラムに負荷することで、段階８を行わなけれ
ばならない。２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ ５．５で、２
０倍カラム容量にて０Ｍから０．５Ｍ ＮａＣｌの塩勾
配溶離を行わなければならない。段階９は、ＣＭセファ
ロース蓄積液を水で４倍に希釈し、ｐＨを７．５に調節
することで行わなければならない。この混合物を０．７
Ｍ硫酸アンモニウム液としなければならない。５ｍＭ
ＮａＯＡｃ、ｐＨ ５．５で、２０倍カラム容量にて
０．２Ｍから０Ｍ硫酸アンモニウムの逆相勾配溶離を行
わなければならない。それ以外は上記の段階と同じであ
る。実施例２の材料については、位置３５にリジンおよ
び位置７４にイソロイシンを有する配列番号４の組換え
ヒトＯＢ蛋白を、１０ｍＭヒスチジン、４．３％アルギ
ニンを含む緩衝液でｐＨ６．０にて製剤した。

【００９７】以上、好ましい実施態様によって本発明に
ついて説明したが、当業者が変更および修正を行ない得
ることは明らかである。従って請求の範囲が、特許請求
される発明の範囲に含まれるそのような均等な変更全て
を含むものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 クリストフアー・フランシス・トウームス アメリカ合衆国、カリフオルニア・93012、 カマリロ、ラデーラ・ビスタ・ドライブ・ 5076 (72)発明者 マイケル・ベンジヤミン・マン アメリカ合衆国、カリフオルニア・91360、 サウザンド・オークス、ラグビー・サーク ル・1506 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA07 BA41 DC50 MA01 NA14 ZA701 ZC032 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 EA20 EA27 FA73

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＯＢ蛋白のＮ末端に結合した抗体の
   恒常領域またはその一部分を含み、場合によりＮ末端メ
   チオニンを含有していてもよい融合蛋白。
2. 【請求項２】 前記ＯＢ蛋白が、 （ａ）配列番号４に示したアミノ酸配列１〜１４６； （ｂ）位置３５にリジン残基と位置７４にイソロイシン
   残基を有する配列番号４に示したアミノ酸配列１〜１４
   ６； （ｃ）位置２８のグルタミン残基が欠失している上記
   （ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列；ならびに （ｄ）位置３２、３５、５０、６４、６８、７１、７
   ４、７７、８９、９７、１００、１０５、１０６、１０
   ７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２
   および１４５のアミノ酸から成る群から選択される１以
   上のアミノ酸が配列番号２中に存在する対応するアミノ
   酸または保存アミノ酸で置換されている上記（ａ）、
   （ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列から成る群から選択
   される請求項１に記載の融合蛋白。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の融合蛋白およ
   び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
4. 【請求項４】 肥満の治療またはインシュリン感受性の
   向上に使用する請求項３に記載の医薬組成物。