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JP2002291469A - 胚性幹細胞からの神経幹細胞、運動ニューロン及びｇａｂａ作動性ニューロンの製造法 - Google Patents

胚性幹細胞からの神経幹細胞、運動ニューロン及びｇａｂａ作動性ニューロンの製造法

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JP2002291469A
JP2002291469A JP2001099074A JP2001099074A JP2002291469A JP 2002291469 A JP2002291469 A JP 2002291469A JP 2001099074 A JP2001099074 A JP 2001099074A JP 2001099074 A JP2001099074 A JP 2001099074A JP 2002291469 A JP2002291469 A JP 2002291469A
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stem cells
neurons
neural stem
cultured
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栄之 岡野
Takuya Shimazaki
琢也 島崎
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Japan Science and Technology Corp
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 胚性幹細胞をノギン蛋白質の存在下又は
非存在下で浮遊培養して胚様体を形成させ、これを繊維
芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ蛋白質の存在
下で浮遊培養して神経幹細胞に誘導し、次いでこれを分
化させることを特徴とする運動ニューロン及びＧＡＢＡ
作動性ニューロンの製造法。 【効果】 本発明方法によればＥＳ細胞より少なくとも
運動ニューロンとＧＡＢＡ作動性ニューロンがシステマ
チックかつ効率的に生産できることが分かった。選択的
にニューロンが得られれば筋萎縮性側索硬化症、ハンチ
ントン舞踏病、そしてアルツハイマー病などの移植治療
に適用できる可能性がある。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は胚性幹細胞（ＥＳ細
胞）から選択的に神経幹細胞、さらには選択的かつ効率
的に運動ニューロン及びＧＡＢＡ作動性ニューロンを製
造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】哺乳類の中枢神経系において神経幹細胞
は個体の一生を通して存在し続け、多様なニューロンや
グリアを生産することによって、中枢神経系の発生及び
維持に寄与していると考えられている。最近、ヒトを含
めた哺乳動物の脳より神経幹細胞を分離・培養する技術
が開発され、様々な神経変性疾患や損傷に対する細胞移
植治療への応用が期待されている。しかしながら、発生
過程において、様々な内的及び外的因子による制御によ
って幹細胞から産生され分化する様々なタイプのニュー
ロン、特に胚発生初期に特異的に産生される運動ニュー
ロンなどを、in vitroで培養増幅させた神経幹細胞から
生産する試みは確たる成果を上げていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、個
体の全ての細胞に分化する能力を持つＥＳ細胞から発生
初期の性質を保持する神経幹細胞への効率的な分化誘導
手段、及びそこから運動ニューロン等の特定のニューロ
ンを選択的に生産する技術を提供することを課題とす
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者はＥＳ細
胞から胚様体の形成、神経幹細胞への分化誘導及びニュ
ーロンへの分化誘導の条件について種々検討した結果、
ＥＳ細胞から胚様体の形成にはＮｏｇｇｉｎ（ノギン）
蛋白質の添加が特に優れており、胚様体中に出現する神
経幹細胞の増幅には繊維芽細胞増殖因子(fibroblast gr
owth factor :FGF)に加えてソニックヘッジホッグ蛋白
質を添加した培地の利用が極めて効率的であり、さらに
このようにして誘導された神経幹細胞を分化させれば運
動ニューロン及びＧＡＢＡ作動性ニューロンが選択的か
つ効率良く生産されることを見出し、本発明を完成する
に至った。
【０００５】すなわち、本発明は、ＥＳ細胞をノギン蛋
白質存在下に浮遊培養することを特徴とする胚様体の形
成方法を提供するものである。
【０００６】また、本発明は、ＥＳ細胞をノギン蛋白質
の存在下又は非存在下で浮遊培養して胚様体を形成さ
せ、次いでこれを繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッ
ジホッグ蛋白質の存在下で浮遊培養することを特徴とす
る神経幹細胞の製造法を提供するものである。
【０００７】さらに本発明は、ＥＳ細胞をノギン蛋白質
の存在下又は非存在下で浮遊培養して胚様体を形成さ
せ、これを繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッ
グ蛋白質の存在下で浮遊して神経幹細胞に誘導し、次い
でこれを分化させることを特徴とする運動ニューロン及
びＧＡＢＡ作動性ニューロンの製造法を提供するもので
ある。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明に用いられるＥＳ細胞とし
ては、既に培養細胞として確立されているＥＳ細胞を使
用することができる。例えば、マウス、ハムスター、ブ
タ、ヒト等のＥＳ細胞株を使用することができる。具体
例としては、１２９／Ｏｌａ系マウス由来のＥＳ細胞、
ＥＢ３、Ｅ１４ｔｇ２等が挙げられる。当該ＥＳ細胞
は、血清を含むＧＭＥＭ培地等にて培養継代しておくの
が好ましい。
【０００９】ＥＳ細胞から胚様体の形成には、ノギン蛋
白質を添加した培地で浮遊培養すると、ＥＳ細胞から神
経幹細胞への分化誘導効率が向上する。ノギン蛋白質
は、例えばアメリカツメガエルノギンを使用することが
できるが、アメリカツメガエルノギンの全長ｃＤＮＡを
ＣＯＳ７細胞に導入し、一過性にノギン蛋白質を発現さ
せた培養上清をそのまま使用してもよい。ノギン蛋白質
の培地中の濃度は、この培養上清換算で１〜５０％（v/
v）程度が好ましい。ＥＳ細胞の浮遊培養は、例えばＥ
Ｓ細胞を血清含有α−ＭＥＭ培地にて１×１０5 cells
／mL程度の濃度で４〜８日間行えばよい。ここで血清と
してはウシ血清、ブタ血清などが挙げられ、その濃度は
５〜１５％、特に８〜１２％が好ましい。またα−ＭＥ
Ｍ培地には２−メルカプトエタノールを０．０１〜０．
５mM、特に０．０５〜０．２mMとなるように添加するの
が好ましい。培養は５％ＣＯ2条件下、３５〜４０℃で
行うのが好ましい。なお、ノギン蛋白質の添加は胚様体
形成時、すなわち培養１〜６日目に添加しておくのが特
に好ましい。
【００１０】前記のように形成された胚様体を経由して
ＥＳ細胞から得られた神経幹細胞を増幅するには、繊維
芽細胞増殖因子に加えてソニックヘッジホッグ蛋白質を
含有する神経幹細胞増殖培地で浮遊培養する。ソニック
ヘッジホッグ蛋白質の添加により、神経幹細胞の運動ニ
ューロン前駆細胞への分化誘導効率及び増殖効率が向上
し、その後の分化培養により運動ニューロン及びＧＡＢ
Ａ作動性ニューロンへ実際に分化する。
【００１１】繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）としては、
ＦＧＦ−２が好ましい。培地中のＦＧＦの含有量は５〜
５０ng／mL、特に１０〜４０ng／mLが好ましい。また、
ソニックヘッジホッグ蛋白質としては、例えばマウスソ
ニックヘッジホッグ蛋白質が好ましい。培地中のソニッ
クヘッジホッグ蛋白質の含有量は１〜２０nM、特に１〜
１０nMが好ましい。
【００１２】培地としては、上記成分の他にグルコー
ス、グルタミン、インスリン、トランスフェリン、プロ
ジェステロン、プトレシン、塩化セレン、ヘパリン等を
添加したＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。ＤＭＥ
Ｍ：Ｆ１２培地を用いるのが特に好ましい。培養は５％
ＣＯ2条件下、３５〜４０℃で行うのが好ましい。培養
時間は７〜９日間が好ましい。
【００１３】上記の浮遊培養により、ニューロスフェア
（neurosphere）と呼ばれる単一細胞由来の細胞凝集塊
が形成する。
【００１４】得られたニューロスフェアは、神経幹細胞
のみに由来するものであり、前記培養法による分化誘導
効率は極めて高いことがわかる。
【００１５】このようにして得られた神経幹細胞を、通
常の分化培地で培養すれば、運動ニューロン及びＧＡＢ
Ａ作動性ニューロンのみが分化誘導される。ここで分化
誘導培地としては、グルコース、グルタミン、インスリ
ン、トランスフェリン、プロジェステロン、プトレシ
ン、塩化セレンを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地、（すなわ
ち、神経幹細胞増殖用培地からＦＧＦとヘパリンを除い
た培地）を用いるのが好ましい。このとき、ソニックヘ
ッジホッグ蛋白質は存在しても、なくてもよい。培養は
５％ＣＯ2条件下、３５〜４０℃で５〜７日間行うのが
好ましい。
【００１６】従来のＥＳ細胞から分化誘導された神経系
細胞は、ニューロンだけでなく、多量のグリア細胞など
を含んでおり、その利用価値は極めて制限されていた。
これに対し、本発明により得られたニューロンは、ほと
んど運動ニューロンとＧＡＢＡ作動性ニューロンのみで
ある。
【００１７】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではな
い。
【００１８】Ａ．材料及び方法 （１）マウスＥＳ細胞の培養継代と胚様体の形成 １２９／Ｏｌａ系マウス由来のＥＳ細胞、Ｅ１４ｔｇ２
ａ及びそのＯｃｔ３／４遺伝子座にブラストシジン耐性
遺伝子を挿入し未分化ＥＳ細胞を選択できるＥＢ３は、
１０％仔牛胎児血清、非必須アミノ酸、１mMピルビン酸
ナトリウム、０．１mM２−メルカプトエタノール及び１
０００Ｕ／mL白血病抑制因子（Leukemiainhibitory fac
tor、LIF）を含むGlasgow minimum essential medium(G
MEM)培地にて定法（５％ＣＯ2，３７℃、以下、単に
「培養」というときは、この条件）によって培養継代し
た。ＥＳ細胞からの胚様体（Embryoid body：EB）の形
成は以下のようにして行った。ＥＳ細胞をＰＢＳで洗浄
後、０．２５％トリプシン−１mM ＥＤＴＡ処理及びそ
の停止を行い、ピペッティングによって分散させた細胞
を、１０％仔牛胎児血清及び０．１mM２−メルカプトエ
タノールを含むα−ＭＥＭ培地で満たしたバクテリア用
培養皿中に１×１０5 cells／mLの濃度で播種し、ノギ
ン蛋白質（アフリカツメガエルNogginの全長cDNAをCOS7
細胞に導入し、一過性に発現させた培養上清）存在下及
び非存在下で４〜８日間浮遊培養してＥＢを形成させ
た。
【００１９】（２）ＥＢからの神経幹細胞の選択的培養
による分離 上記のようにして形成されたＥＢは培養液とともに遠心
チューブに移し、１０分間静置することによってチュー
ブ底に集め上清を除去しＰＢＳ中に再懸濁し、再び１０
分間静置する。上清を除去した後、ＥＢは０．２５％ト
リプシン−１mMＥＤＴＡ溶液中に再懸濁し３７℃で５分
間インキュベートし、１０％仔牛胎児血清を含むα−Ｍ
ＥＭ培地で蛋白質分解反応を停止させた後、ピペットで
細胞を分散させた。分散させた細胞はα−ＭＥＭ培地に
て遠心操作により２回洗浄し、グルコース（０．６
％）、グルタミン（２mM）、インスリン（２５μｇ／m
L）、トランスフェリン（１００μｇ／mL）、プロジェ
ステロン（２０nM）、プトレシン（６０μＭ）、塩化セ
レン（３０nM）、ＦＧＦ−２（２０ng／mL）、ヘパリン
（２μｇ／mL）を添加したDulbecco's modified Eagle'
s medium（DMEM）：Ｆ１２（１：１）培地中（神経幹細
胞増殖培地）に、あるいはそこへさらにマウスソニック
ヘッジホッグ蛋白質mouse sonic hedgehog1(5nM)を加え
た培地に５×１０4cells/mLの濃度で播種し、７〜９日
間浮遊培養することによって、ニューロスフェア（neur
osphere）と呼ばれる単一細胞由来の細胞凝集塊を形成
させた（neurosphere法）。これらニューロスフェアは
上記の神経幹細胞増殖培地よりＦＧＦ−２とヘパリンを
除いた分化培地で遠心洗浄した後、そのままあるいはピ
ペッティングにより分散させた細胞を、分化培地で満た
したポリ−Ｌ−オルニチン（poly-L-ornithin）でコー
トした培養皿に播種し、ソニックヘッジホッグ蛋白質
（５nM）存在下あるいは非存在下で５〜７日間培養する
ことによって分化させた。また上記のようにして得たニ
ューロスフェアを再び単一細胞に分散し、神経幹細胞増
殖培地で７日間継代培養し２次ニューロスフェアを形成
させ、これらも上記と同様に分化させる。
【００２０】（３）免疫染色による分化ニューロン及び
グリア細胞の同定 上記のようにして分化させたニューロンやグリア細胞は
蛍光抗体を使った免疫染色の定法によって同定した。運
動ニューロンはマウス抗Ｉｓｌ−１モノクローナル抗
体、ヤギ抗ＣｈＡＴポリクローナル抗体及びマウス抗β
−III tubulinモノクローナル抗体を使って、ＧＡＢＡ
作動性ニューロンはウサギ抗ＧＡＤ６７ポリクローナル
抗体を使って同定した。グリア細胞は、アストロサイト
をウサギ抗ＧＦＡＰポリクローナル抗体で、オリゴデン
ドロサイトをマウス抗０４モノクローナル抗体を使って
同定した。
【００２１】Ｂ．実験結果 （１）ＥＢからの神経幹細胞の選択的培養法による分離
精製 まずＥＢの形成によるＥＳ細胞の初期分化において、神
経幹細胞が培養のどの時期に出現してくるのかを検討し
た。具体的には、培養４〜８日のＥＢを単一細胞に分散
し、神経幹細胞培地にて７日間培養し、ニューロスフェ
アを形成させた。これらニューロスフェアは分化培地に
移し分化させ、その分化能を検定するとともに、継代す
ることによって自己複製能も検定した。
【００２２】図１には、浮遊培養によるＥＢの形成開始
後６及び８日後、ＥＢを単一細胞に分散し、神経幹細胞
の選択的培養（neurosphere法）を行った結果を示し
た。なお得られたニューロスフェアの数はＥＢ中に出現
した神経幹細胞の数とした。その結果、本方法で同定さ
れる（ニューロスフェアを形成できる）神経幹細胞は、
ＥＢの培養４日目まではほとんど検出できず、培養６日
目で全細胞中０．２５％、８日目で１．１％と次第に増
加していくことが分かった。
【００２３】図１に示したように６日目のＥＢから得た
ニューロスフェアを、分化条件で７日間培養し、その分
化能を免疫染色によって検定した。その結果を図２〜４
に示す。ニューロンのマーカーであるβ−III−tubulin
とグリア細胞のマーカーであるＧＦＡＰ及び０４の抗体
による３重免疫染色を行ったところ、全てのニューロス
フェアがほぼβ−III−tubulinを発現するニューロンの
みで構成されており、グリア細胞は検出されなかった
（図２）。そして、それらのニューロンは少なくともＩ
ｓｌ−１及びＣｈＡＴを発現する運動ニューロン（図３
の丸い部分及び繊維状部分）とＧＡＤ６７を発現するＧ
ＡＢＡ作動性ニューロン（図４の繊維状部分）を含んで
いた。
【００２４】また、得られたニューロスフェアを、継代
培養することによって２次ニューロスフェアを得、それ
らを分化条件で７日間培養し、分化能を免疫染色によっ
て検定した。その結果、全てのニューロスフェアはグリ
ア細胞を含んでおり（図５）、そのうち８４．２％はニ
ューロンとグリア細胞の両方を含んでいた（図６）。図
５は、β−III−tubulin（細く明確な繊維状）、ＧＦＡ
Ｐ（β−III−tubulinのまわりの部分）及び０４（GFAP
のさらに外側の部分）の３重免疫染色結果である。
【００２５】その結果、これらのneurosphereを単一細
胞に分散、継代培養し新たなニューロスフェアを形成さ
せ分化させると、それらのクローンの多くはニューロン
とグリア細胞の両方を含むようになり、実際の中枢神経
系の発生においてグリア細胞が後期に出現するように、
ＥＢから分離した神経幹細胞も継代培養によって多分化
能を示すようになることが分かった。
【００２６】（２）ノギン蛋白質による神経幹細胞の分
化誘導の効率化 ノギン蛋白質をＥＢ形成時（６日間）に添加することに
よって神経幹細胞の分化誘導の効率化を試みた。ノギン
は、アフリカツメガエルノギンの全長ｃＤＮＡをｐＥＦ
−ＢＯＳ発現ベクターに組み込みＣＯＳ７細胞に導入
し、一過性に発現させた培養上清をノギン溶液とし、発
現ベクターのみを導入したＣＯＳ７細胞の培養上清を対
照とした。図７に示すように、ノギン培養上清の量に依
存してＥＢ中で分化誘導されるニューロスフェアを形成
する神経幹細胞の数は増加し、１／１０倍容でピークに
達した。
【００２７】（３）ソニックヘッジホッグ蛋白質による
運動ニューロン分化の効率化 ＥＢ由来神経幹細胞からの運動ニューロン産生及び分化
の効率化をめざし、ソニックヘッジホッグ蛋白質を神経
幹細胞増殖時、すなわちＥＢ由来の初代培養ニューロス
フェアの形成時に添加し、その効果を検討した。運動ニ
ューロンは、ニューロスフェアを単一細胞に分散し、分
化培地で５日間培養後、Ｉｓｌ−１及びβ−III−tubul
inの二重免疫染色を行うことによって同定し、その数を
定量化した。その結果図８に示したように、５nMのソニ
ックヘッジホッグによって運動ニューロンの産生は倍増
した。なお、神経分化時に分化培地にソニックヘッジホ
ッグを加えてもその効果は認められなかった。
【００２８】
【発明の効果】本発明方法によればＥＳ細胞より少なく
とも運動ニューロンとＧＡＢＡ作動性ニューロンがシス
テマチックかつ効率的に生産できることが分かった。選
択的にニューロンが得られれば筋萎縮性側索硬化症、ハ
ンチントン舞踏病、そしてアルツハイマー病などの移植
治療に適用できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】胚様体の培養日数とニューロスフェア形成との
関係を示す図である。
【図２】ニューロスフェアを免疫染色した結果を示す図
である。染色部はβ−III−tubulinを発現し、ニューロ
ンであることを示す。
【図３】ニューロスフェアを免疫染色した結果を示す図
である。
【図４】ニューロスフェアを免疫染色した結果を示す図
である。
【図５】ニューロスフェア継代培養後の免疫染色結果を
示す図である。
【図６】ニューロスフェア継代培養後のニューロンとグ
リア細胞の比率を示す図である。
【図７】ノギン蛋白質の添加効果を示す図である。
【図８】ソニックヘッジホッグ蛋白質の添加効果を示す
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B065 AA90X AC12 BC01 CA44

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 胚性幹細胞をノギン蛋白質存在下に浮遊
    培養することを特徴とする胚様体の形成方法。
  2. 【請求項２】 胚性幹細胞をノギン蛋白質の存在下又は
    非存在下で浮遊培養して胚様体を形成させ、次いでこれ
    を繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ蛋白質
    の存在下で浮遊培養することを特徴とする神経幹細胞の
    製造法。
  3. 【請求項３】 胚性幹細胞をノギン蛋白質の存在下又は
    非存在下で浮遊培養して胚様体を形成させ、これを繊維
    芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ蛋白質の存在
    下で浮遊培養して神経幹細胞に誘導し、次いでこれを分
    化させることを特徴とする運動ニューロン及びＧＡＢＡ
    作動性ニューロンの製造法。
  4. 【請求項４】 胚様体の形成が、ノギン蛋白質の存在下
    に浮遊培養するものである請求項３記載の製造法。
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