JP2002281981A - ＲｅｃＡタンパク質を用いて標識が導入された核酸を製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高い部位選択性をもって、且つ簡便に、二本
鎖核酸の所望する部位に対して選択的に標識を導入する
方法を提供する。 【解決手段】 標識が導入された核酸を製造する方法で
あって、前記標識を導入すべき標的核酸を含む試料に、
ＲｅｃＡタンパク質と、前記標的核酸の末端領域と相同
な第一の核酸プローブとを添加することにより、前記第
一の核酸プローブの一部が前記標的核酸から突出するよ
うに、前記ＲｅｃＡタンパク質を介して前記第一の核酸
プローブを前記標的核酸に結合せしめる工程と；前記標
的核酸に結合した前記ＲｅｃＡタンパク質を前記標的核
酸から解離させる工程と；前記第一の核酸プローブの突
出部分に、標識された第二の核酸プローブをハイブリダ
イズさせることにより、標識が導入された核酸を製造す
る工程とを備えた方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、標識が導入された
核酸を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子の発現や変異および多型性等の解
析における、また、臨床的な遺伝子病の診断および治療
におけるＤＮＡの検出および／または分離に、標識され
た核酸を使用することは非常に有益である。例えば、Ｄ
ＮＡチップ（一般的にＤＮＡマイクロアレイとも称され
る）上のＤＮＡプローブとして、ＰＣＲ時のプライマー
として、また、インサイチュウハイブリダイゼーション
におけるＤＮＡプローブとして使用されている。

【０００３】このような標識された核酸は、ポリメラー
ゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと称す）により合成し、それと
同時若しくは逐次標識すること、または大腸菌等を用い
たクローニングによって生成し、更に修飾を行うことに
よって製造される。

【０００４】ＰＣＲで合成する場合、一般的に、標識物
質を具備するプライマーを用いたり、標識物質を具備す
るｄＮＴＰを用いて通常のＰＣＲの処理工程を行うこと
によって、合成と同時に標識物質を付加する。或いはＰ
ＣＲやクローニングにより合成された核酸を化学的に修
飾することによって標識物質を付加した核酸を得ること
が可能である。

【０００５】しかしながら、ＰＣＲでは、特に、目的と
する核酸の塩基配列が長い場合、充分な増幅を得られな
いことがある。また、非特異的分子が増幅されてしまう
こと可能性もある。そのような場合、得られた核酸の同
定や精製を行うことが必要であるが、このような操作は
時間も労力も大きい。また、一般的に、ＰＣＲは大過剰
のプライマーを使用するものである。従って、例えば、
ＤＮＡチップのためのプローブとして使用する場合に
は、バックグラウンドを低くするために残留するプロー
ブを除去することが必要である。

【０００６】また、合成された核酸に、化学的または生
化学的に標識物質を付加する場合には以下のことが問題
となる。例えば、酵素を用いたニックトランスレーショ
ン法により修飾を行う場合、配列中に生じた全てのニッ
クに対して修飾が行われることになるため、特定の部位
を選択的に修飾することが困難である。

【０００７】また、ポリヌクレオチドキナーゼやターミ
ナルトランスフェラーゼを使用し何れか一方の末端のみ
に標識したい場合には、当該酵素により標識物質を二本
鎖の末端に付与した後に、不要な末端の標識物質を制限
酵素によって除去する必要がある。更に、ライゲーショ
ンによる平滑末端に対してアダプターを連結することに
よって一方の末端のみに標識を付与する場合には、付与
工程に先駆けて対象となる一方の末端を平滑末端とし、
他方を付着末端とするか、或いは付与した後に不要な末
端の標識部分を酵素により切除することが必要である。
しかしながら、酵素の部位選択性には限りがあることか
ら、このような酵素による従来の方法によって核酸の特
定部位に選択的に標識を付与することは困難である。ま
た、二本鎖の核酸の場合、その末端は等価であるので、
どちらか一方の末端のみを平滑末端（または付着末端）
とすることは、従来の技術では煩雑な操作と長い時間が
必要である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上記の状況に鑑み、本
発明の目的は、高い部位選択性をもって、且つ簡便に、
二本鎖核酸の所望する部位に対して選択的に標識を導入
する方法を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決するため
に、本発明は、核酸に標識を導入する方法であって、前
記標識を導入すべき標的核酸を含む試料に、ＲｅｃＡタ
ンパク質と、前記標的核酸の末端領域と相同な第一の核
酸プローブとを添加することにより、前記第一の核酸プ
ローブの一部が前記標的核酸から突出するように、前記
ＲｅｃＡタンパク質を介して前記第一の核酸プローブを
前記標的核酸に結合せしめる工程と；前記標的核酸に結
合した前記ＲｅｃＡタンパク質を前記標的核酸から解離
させる工程と；前記第一の核酸プローブの突出部分に、
標識された第二の核酸プローブをハイブリダイズさせる
ことにより、核酸に標識を導入する工程とを備えた方法
を提供する。

【００１０】ここで、以下の発明の詳細な説明の理解を
助けるために、図１を参照しながら、本発明の方法の概
略を説明する。

【００１１】本発明の方法の第一の工程では、標識を導
入すべき標的核酸、一般的には標的ＤＮＡ１に、該ＤＮ
Ａの一方の末端領域と相同な配列を有する第一のプロー
ブＤＮＡ２とＲｅｃＡタンパク質３とを添加する。Ｒｅ
ｃＡタンパク質３は、第一のプローブＤＮＡ２に結合し
てプローブＤＮＡ・ＲｅｃＡタンパク質複合体４を形成
する。続いて、ＲｅｃＡタンパク質は、標的ＤＮＡ１の
末端領域に存在する第一のプローブＤＮＡ２と相同な領
域を検索することにより、第一のプローブＤＮＡ２を前
記相同な領域に結合させる。後の工程で、第一のプロー
ブＤＮＡ２には、標識された第二のプローブＤＮＡ６が
ハイブリダイズされるので、第一のプローブＤＮＡ２
は、標的ＤＮＡ１の終末端から突出するように標的ＤＮ
Ａ１に結合している。

【００１２】ＲｅｃＡタンパク質の作用により、第一の
工程では、標的ＤＮＡ１の一方の末端領域に、ＲｅｃＡ
タンパク質３を介して第一のプローブＤＮＡ２が結合
し、標的ＤＮＡ１の末端領域に三本鎖ＤＮＡ構造５が形
成される。

【００１３】第二の工程では、除タンパク反応を行うこ
とにより、第一のプローブＤＮＡ２に結合したＲｅｃＡ
タンパク質３を除去する。第一のプローブＤＮＡ２が末
端領域に結合している場合には、ＲｅｃＡタンパク質３
を除去した後でも三本鎖ＤＮＡ構造５が維持される。第
二の工程において、三本鎖ＤＮＡ構造５からＲｅｃＡタ
ンパク質３を除去することにより、第一のプローブＤＮ
Ａ２の突出部分に第二のプローブ６を容易にハイブリダ
イズさせることが可能となる。

【００１４】第三の工程では、第一のプローブＤＮＡ２
の突出部分に、標識された第二のプローブ６をハイブリ
ダイズさせることにより、標的核酸の末端領域に標識を
導入する。標識を強固に結合するために、第二のプロー
ブ６は、必要に応じて、標的核酸の末端領域にライゲー
トさせることが好ましい。第二のプローブ６をライゲー
トさせた後には、第一のプローブＤＮＡ２は不要となる
ので、標的ＤＮＡ１から解離させてもよい。

【００１５】以上が本発明の方法の概略であるが、図１
に示されている具体的な反応や構造等は、あくまでも理
解を容易にする目的で記載されているにすぎないので、
実際には、それらの細部が図面と一致しない場合があり
得る。すなわち、本発明者らは、いかなる特定の理論に
も拘泥しない。

【００１６】

【発明の実施の形態】＜序論＞本発明は、ＲｅｃＡタン
パク質を用いて、標識が導入された核酸を製造する方法
を提供する。

【００１７】本発明は、ＲｅｃＡタンパク質を介して形
成される三本鎖構造が特定の条件下、即ち、標的核酸の
末端領域に形成される場合である場合では、前記三本鎖
構造からＲｅｃＡタンパク質を解離させた後にも前記三
本鎖構造が維持されるという本発明者らの発見に基づい
てなされたものである。尚、ＲｅｃＡタンパク質、及び
ＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構造が形成されるこ
とは公知である。しかしながら従来使用の方法では、６
０マー程度の短いプローブを用いた場合、形成された三
本鎖からはじき出されてしまう問題があった。従って、
本発明はこの問題点を解決する手段を見出したことによ
って達成されたものである。

【００１８】以下、本発明の実施の態様について詳述す
る。

【００１９】＜第一の工程＞本発明の方法を実施するに
は、まず、標識を導入すべき標的核酸を含む試料に、Ｒ
ｅｃＡタンパク質と、前記標識を導入すべき標的核酸中
の末端領域と相同な第一の核酸プローブとを添加する。

【００２０】本明細書において、「標的核酸」は、任意
の単純ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドからな
るポリヌクレオチドであり得る。標的核酸は、本方法の
実施者が自由に選択することができる。標的核酸は、典
型的には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡ等
のＤＮＡ、並びにｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、及
び合成ＲＮＡ等のＲＮＡである。「単純ヌクレオチド」
には、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウ
ラシルが含まれる。「修飾ヌクレオチド」には、例え
ば、イノシン、アセチルシチジン、メチルアデノシン、
メチルグアノシンを含むリン酸エステル等が含まれる。

【００２１】「標的核酸を含む試料」は、生物から採取
した未処置の試料、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、
プラスミドを含む生物試料であり得る。また、「標的核
酸を含む試料」は、前記未処置の試料に対して様々な操
作又は処理を行った試料であり得る。このような操作又
は処理は、核酸抽出操作、増幅操作、制限酵素、リガー
ゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼを含む酵素による処
理、及び遺伝子工学の領域において周知であるその他の
処理、並びにこれらの組み合わせであり得る。

【００２２】「核酸抽出操作」は、フェノール抽出、エ
タノール沈殿であり得るが、これらに限定されない。

【００２３】「増幅操作」は、典型的にはＰＣＲ、又は
その変法、例えば、逆転写ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、５‘ＲＡ
ＣＥ、３’ＲＡＣＥであり得る。

【００２４】あるいは、「標的核酸を含む試料」は、人
工的に調製した核酸を含有する試料、又は該試料に前記
各処理を施すことによって調製された試料であってもよ
い。

【００２５】より具体的には、前記「標的核酸を含む試
料」は、遺伝子のクローニングの各段階で得られる試
料、例えば、ＤＮＡライブラリー、標的ｍＲＮＡを含む
試料、１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを含む試料、ア
ダプターが付加された１ｓｔｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを
含む試料、ＰＣＲ産物がその中にサブクローニングされ
たプラスミドを含む試料であり得る。

【００２６】本明細書において、「ＲｅｃＡタンパク
質」とは、二本鎖核酸の一方のストランド中に存在する
領域に、該領域と相同な一本鎖核酸を結合させることに
より、前記領域に三本鎖構造を形成させ得るタンパク質
を意味する。ＲｅｃＡタンパク質は、相同的組換え、Ｄ
ＮＡの修復、又は大腸菌のＳＯＳ遺伝子の発現等に関与
することが知られている。ＲｅｃＡタンパク質の中で
は、大腸菌やλファージのＲｅｃＡタンパク質が最も有
名である。しかしながら、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質
に類似した構造及び機能を有するタンパク質は、大腸菌
以外の生物にも広く分布していることが知られており、
これらのタンパク質は、一般に、ＲｅｃＡ類似タンパク
質と呼称されている。本明細書において、「ＲｅｃＡタ
ンパク質」には、大腸菌やλファージのＲｅｃＡタンパ
ク質のみならず、ＲｅｃＡ類似タンパク質も含まれる。
また、ＲｅｃＡ活性を有するＲｅｃＡタンパク質の一部
の断片であってもよい。

【００２７】前述のように、ＲｅｃＡタンパク質は、一
本鎖核酸を二本鎖核酸にランダムに結合させるのではな
く、二本鎖核酸の一方のストランド中に存在する相同な
領域に結合させる。二つの核酸が「相同」であるという
ことは、ＲｅｃＡタンパク質を介して特異的な三本鎖構
造を形成し得る程度に、両核酸が同一であるか、又は類
似していることを意味する。「類似」とは、例えば、二
つの塩基配列が少なくとも６０％、好ましくは８０％、
より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の
同一性であり得る。

【００２８】ＲｅｃＡタンパク質は上記のごとき機能を
有しているので、前記試料に、ＲｅｃＡタンパク質及び
相同な第一の核酸プローブを添加すると、該第一の核酸
プローブは、標的核酸の一方のストランド中に存在する
相同な部分に結合する。

【００２９】標識を導入すべき領域が、末端領域に位置
していないときには、該領域が末端領域に位置するよう
に標的核酸の一部を切除してから、本発明の方法を適用
すればよい。あるいは、一度環状の核酸にしてから、特
定領域が末端領域にくるように再び切断してもよい。ま
た、標的核酸が、環状の核酸であるときには、三本鎖核
酸を形成させる前に、又は形成させた後に、所望の処理
を施すべき領域が末端領域に位置するように環状の標的
核酸を切断すればよい。

【００３０】なお、本明細書において、標的核酸の「末
端領域」とは、標的核酸の終末端と標的核酸の終末端か
ら４００番目、より好ましくは２００番目、より好まし
くは１５０番目、より好ましくは１００番目、より好ま
しくは８０番目、さらに好ましくは６０番目、さらに好
ましくは５０番目、さらに好ましくは４０番目、さらに
好ましくは２０番目、さらに好ましくは１０番目の塩基
との間に位置する領域（各終末端を含む）を意味する。

【００３１】末端領域の終末端の形状は、平滑末端と突
出末端（一般的に、付着末端とう称す）のうち何れでも
よい。

【００３２】標的核酸の末端領域に結合させるべき第一
の核酸プローブは、少なくとも２０塩基以上、より好ま
しくは３０塩基以上、さらに好ましくは４０塩基以上、
最も好ましくは５０塩基以上の長さを有する。以下の実
験例に詳述されているように、第一の核酸プローブが短
すぎると、三本鎖構造が安定に形成されないので、標的
核酸の長さに応じた適切な長さを有する第一の核酸プロ
ーブを使用しなければならない。

【００３３】第一の核酸プローブには、後段の工程にお
いて、標識された第二の核酸プローブがハイブリダイズ
される。それ故、第一の核酸プローブの一部が、標的核
酸から、好ましくは５ヌクレオチド以上、より好ましく
は１０ヌクレオチド以上突出するように、標的核酸に結
合しなければならない。第一の核酸プローブの一部は、
該プローブの中間部分であってもよく、末端部分であっ
てもよい。ここで、中間部分とは、終末端を含まないプ
ローブの一部であり、末端部分とは、終末端を含むプロ
ーブの一部である。

【００３４】第一の核酸プローブの突出部分の塩基配列
は、所望に応じて、任意の配列であり得る。

【００３５】下記の実験例に詳述されているように、前
記第一の核酸プローブが、ＲｅｃＡタンパク質を介して
標的核酸に結合する場合、第一の核酸プローブの方向性
によっては三本鎖構造が形成されないことがある。従っ
て、本発明の方法を実施するには、適切な方向性を有す
る核酸プローブを使用する必要がある。典型的には、三
本鎖構造を形成させるべき末端領域において５’末端を
有するストランドと相同な配列を有する核酸プローブを
使用すれば、三本鎖構造が形成される。

【００３６】安定な三本鎖構造を得るためには、三本鎖
構造の両末端のうち外側（すなわち、標的核酸の終末端
側）に存在する末端が、標的核酸の終末端から１００番
目の塩基、より好ましくは５０番目の塩基、さらに好ま
しくは２０番目の塩基、さらに好ましくは１０番目の塩
基よりも外側に位置することが好ましい。

【００３７】ＲｅｃＡタンパク質は、本来、ＡＴＰの存
在下において、相同的な組換えを触媒するタンパク質な
ので、前記試料中にＡＴＰが存在すると相同的組換えが
進行して、三本鎖構造は直ぐに消滅してしまう。従っ
て、本発明の方法を実施する場合には、少なくとも三本
鎖核酸を形成させているときと、三本鎖核酸を形成させ
た後には、試料中にＡＴＰが４．８ｍＭ以上存在しては
ならならない。好ましくは、ＡＴＰの濃度は、０．４８
ｍＭ以下であり、ＡＴＰが試料中に存在しないことが最
も好ましい。

【００３８】ＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構造を
形成させるためには、ＡＴＰの機能を代替し得る物質、
例えば、ＡＴＰ−γＳのようなＡＴＰ類似体を添加しな
ければならない。

【００３９】＜第二の工程＞前工程に続いて、前記標的
核酸に結合したＲｅｃＡタンパク質を解離させる工程を
実施する。本工程において、標的核酸からＲｅｃＡタン
パク質を解離させることによって、続く最後の工程で、
標識された第二の核酸プローブの第一のプローブへのハ
イブリダイゼーションが容易になる。

【００４０】標的核酸の末端領域に形成された三本鎖構
造は、ＲｅｃＡタンパク質が該領域から解離しても維持
される。それ故、本工程において、前記標的核酸からＲ
ｅｃＡタンパク質を解離させれば、ＲｅｃＡタンパク質
を介さずに形成された三本鎖構造が得られる。

【００４１】標的核酸からのＲｅｃＡタンパク質の解離
は、フェニール／クロロホルムまたはフェノール単独を
添加する等の除タンパク操作、ＳＤＳのような界面活性
剤の添加、タンパク質分解酵素の添加、またはＳＤＳ＋
分解酵素の添加のような簡易な操作によって行い得る。

【００４２】＜第三の工程＞続いて、第一の核酸プロー
ブの前記突出部分に、標識された第二の核酸プローブを
ハイブリダイズさせれば、標識が導入された核酸が得ら
れる。

【００４３】第二の核酸プローブ中の標識は、一般的に
使用される検出可能な標識および特異的に分離すること
が可能な標識であればよい。例えば、検出可能な標識
は、検出可能であればどのような標識であってもよく、
例えば、蛍光物質や化学発光物質等の発光物質、放射性
同位体、酵素、ハプテン、抗原及び抗体等を使用でき
る。また、「特異的に分離することが可能な標識」と
は、互いに高親和性を有し特異的に結合する結合対の一
方であればよく、例えば、アビジン若しくはストレプト
アビジンとビオチンの何れか一方、抗原と抗体のどちら
か一方等である。標識は、第二の核酸プローブ中の何れ
の部分に存在してもよく、例えば、プローブの末端、又
はプローブの内部に標識することができる。

【００４４】第二の核酸プローブは、必要に応じて、１
つのプローブにおいて複数の標識、即ち、２以上の標識
を具備させてもよい。

【００４５】第二の核酸プローブは、典型的には、第一
の核酸プローブの突出部分と相補的な塩基配列を有す
る。しかしながら、前記突出部分とハイブリダイズする
ことができれば、第一の核酸プローブの突出部分と完全
に相補的な塩基配列でなくてもよい。また、第二の核酸
プローブは、前記突出部分より短くてもよく、あるいは
長くてもよい。

【００４６】以上が、本発明の方法の基本的な操作であ
るが、以下に示すように、これらの各操作を改変した操
作を行ってもよく、さらに、上記各操作に新たな操作を
適宜付加してもよい。

【００４７】新たな操作としては、最後の工程に続い
て、第二の核酸プローブを標的核酸にライゲートする操
作を挙げることができる。第二の核酸プローブを標的核
酸の一方のストランドの終末端にライゲートすれば、標
識が強固に導入された核酸を得ることができる。ライゲ
ーションは、典型的には、リガーゼ等の酵素によってな
し得る。

【００４８】このような操作を行った後には、標的核酸
に結合している第一の核酸プローブを標的核酸から解離
させて三本鎖構造を解消させる操作を行ってもよい。三
本鎖構造を解消させるためには、例えば、熱処理、アル
カリ処理、酵素処理（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ処理
等）を使用し得る。あるいは、三本鎖構造を解消しやす
くするために、予め第一の核酸プローブに変異を導入し
ておくことも有用である。変異が導入された核酸プロー
ブは、標的核酸への結合性が弱いために三本鎖構造を解
消させやすい。

【００４９】さらに、本発明の基本的な操作が終了した
後に、標的核酸を一本鎖にする操作を行ってもよい。標
的核酸を一本鎖にするためには、例えば、アルカリ処
理、熱処理等の周知の方法を使用することができる。

【００５０】また更に、本発明の方法を１つの核酸に対
して複数回繰り返して行い、１つの核酸に複数の標識を
導入することも可能である。複数回繰り返して行う場
合、好ましくは、第１の実施の後に得られた核酸におけ
る三本鎖構造を解消し、その後で第２の実施をする。こ
れにより、所望する複数の部位に所望する標識を導入す
ることが可能である。これらの各操作によって得られる
何れの核酸も本発明の範囲に属する。本発明の態様にお
いて得られた核酸は、例えば、サザンハイブリダイゼー
ション法のプローブおよびＤＮＡチップのプローブ等と
して使用することができる。また、本核酸は、遺伝子の
直接クローニングに使用してもよい。

【００５１】得られた核酸は、一部三本鎖構造を有した
二本鎖ＤＮＡ分子として使用してもよい。または、一部
三本鎖構造を有した二本鎖ＤＮＡ分子若しくは二本鎖Ｄ
ＮＡ分子として使用し、使用工程の途中で、通常のＤＮ
Ａ変性条件下で変性することにより一本鎖ＤＮＡ分子と
してもよい。或いは、同様に変性することにより、標識
された一本鎖ＤＮＡ分子、未標識一本鎖ＤＮＡ分子、ま
たはそれらの混合物として使用してもよい。使用者の所
望に応じて自由に使用することが可能である。一部三本
鎖構造を有した二本鎖ＤＮＡ分子または二本鎖ＤＮＡ分
子として扱えば、標識されたストランドに蓋がされてい
る状態なので、他の核酸との不要なハイブリダイゼーシ
ョンや、一本鎖ＤＮＡにおける相補的配列による不要な
結合を防ぐことができて扱いやすい。

【００５２】例えば、一部三本鎖構造を有した二本鎖Ｄ
ＮＡ分子または二本鎖ＤＮＡ分子の標識物質を利用して
ＤＮＡチップを製造した場合、従来のものに比較して非
常に高密度にＤＮＡプローブを具備するＤＮＡを容易に
製造することが可能である。それにより、ハイブリダイ
ゼーションの効率は向上する。また、上記の分子からな
るプローブを標識物質を利用して支持体に固定した後
で、未標識のストランドを取り除くことによって得られ
るＤＮＡチップは、相手鎖による立体障害を受けずに、
効率よくハイブリダイゼーションが実施できる。

【００５３】また、本発明の態様に従えば、任意の長さ
のＤＮＡに標識を入れることが可能であり、且つその標
識は、ＤＮＡ片側鎖の末端付近または非末端領域に限定
して入れることができる。従って、当該標識を指標とし
て、直接的に、特定のＤＮＡ分子の存否を検出すること
も可能だある。そのような標識プローブも本発明の範囲
に含まれるものである。

【００５４】本発明の更なる態様に従うと、上述の方法
によって作成された標識核酸、標識核酸が固定化された
担体も提供される。

【００５５】従来の一般的なＤＮＡチップの製造方法
は、固体担体上で直接にＤＮＡを合成する方法や、点着
により静電気的に固体担体上にＤＮＡを固定化する方法
である。しかしながら、前記の直接に合成する方法で
は、多くて１０ｂｐのＤＮＡを固相化できるに過ぎな
い。また、静電気的によって固体担体上にＤＮＡを固定
化する方法は、固定されるＤＮＡの密度を高めることが
困難である。更に、こうして得られたＤＮＡチップは、
固体担体に対するＤＮＡの結合力が弱く、反復使用する
ことは難しい。更にまた、ＤＮＡチップ上でとることの
できるＤＮＡの構造に起因して、安定なハイブリダイゼ
ーションが達成され難い。

【００５６】本発明により提供される標識核酸を用いて
製造された核酸が固定化された担体は、上記のような従
来の方法で生じた問題を解決する。即ち、長い塩基配列
を有する核酸を固定化することが可能であり、固定され
るＤＮＡの密度を高くすることが可能であり、且つ安定
したハイブリダイゼーションが達成される。

【００５７】標識核酸を担体に固定化する方法として
は、担体表面にアミノ基を形成する方法、または核酸に
導入された標識と特異的に結合する物質を担体表面に配
置する方法等が挙げられる。

【００５８】固体表面にアミノ基を形成する方法は、そ
れ自身公知の方法であり、例えば、シラン処理によりア
ミノ基を形成し、必要な箇所にマスクを施した後、光反
応によって標識核酸を固定化することが可能である。

【００５９】また、前記特異的に結合する物質を担体表
面に配置する方法では、例えば、標識核酸に含まれる標
識としてビオチンを用い、且つ担体表面にアビジンまた
はストレプトアビジンを配置し、それらを特異的に結合
させることにより達成できる。本発明の標識された核酸
を使用することによって、高集積率で標識核酸を固定化
することが可能である。このような効果は、核酸の末端
に導入された標識部分のみによってプローブが担体に固
定されているために得られる効果である。従って、本発
明の担体を使用すれば、検出試料中の標的核酸とプロー
ブとを安定してハイブリダイズすることが可能である。
また、前述ではビオチンとアビジンとを用いた例を示し
たが、これに限定されるものではない。ここで使用する
「結合対」の語は、相互に結合を形成しうる構成員を意
味し、本発明のプローブを固体支持体に固定化しうるも
のであれば、互いに高親和性で結合する物質の何れかで
あっても、官能基であっても、分子の一部若しくは残基
であってもよい。一般的には、結合対は、生物学的な特
異的結合を相互に形成しうる可能基または分子の一部若
しくは残基、或いは化学的に共有結合を形成しうる官能
基または分子の一部若しくは残基であってもよい。かよ
うな共有結合は、例えば、二官能性の有機化合物由来の
スペーサーを介して形成されるようなものであってもよ
い。生物学的な特異的結合を形成する結合対としては、
これに限定するものではないが、例えば、ビオチン類と
アビジン類、抗原（または抗原決定基）と抗体、オリゴ
糖とレクチン、等の組み合わせを使用することが可能で
ある。本発明の態様に従って製作されるＤＮＡの固定化
された固体支持体をＤＮＡチップとして使用する場合に
は、ビオチン類とアビジン類を選択することが好まし
い。即ち、ビオチン類とアビジン類を使用すると、ハイ
ブリダイゼーション操作において精度よく反復使用が可
能であり、更に、固定化したＤＮＡを剥がして回収する
ことが容易である。従って、固体支持体の再利用が可能
である。ビオチン類としては、例えば、ビオチン、ビオ
シチン、デスチオビオチン、オキシビオチン、およびア
ビジンと安定な複合体を形成しうるこれらの誘導体等か
ら選択して使用してよい。一方、アビジン類としては、
例えば、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチ
ンと安定な複合体を形成しうるこれらの改変体から選択
して使用してよい。ここで、「安定な複合体を形成しう
る」とは、ビオチン−アビジン複合体の解離定数（１０
^−１５Ｍ）に近似する解離定数を有する複合体を形成す
ることができることを意味する。また、「改変体」と
は、天然由来のアビジンまたはストレプトアビジンの修
飾体若しくは断片、またはそれらの組換え体を意味す
る。また、結合対のどちらを標識として使用してよく、
従って、どちらを担体表面に配置してもよい。化学的に
共有結合を形成しうる官能基または分子の一部若しくは
残基も、タンパク質や核酸を固相に共有結合を介して固
定化するのに使用できる。本発明において、使用できる
化学的に共有結合を形成しうる官能基または分子の一部
若しくは残基は、当該固定に一般的に使用されるもので
あればよい。例えば、アミノ基、水酸基、スルフヒドリ
ル基、カルボキシル基、イソシアネート基およびチオイ
ソシアネート基等、並びにこれらの基を含む原子団等で
ある。アミノ基を担持するＤＮＡを提供する場合、例え
ば、置換反応における基質として、ｄＮＴＰの一部にＮ
^６−（６−アミノヘキシル）ｄＡＴＰを用いることもで
きる。上記の結合対のうち、核酸プローブ中の標識とし
て使用するのに好ましいものは、相同的組換えに悪影響
を及ぼさないものである。例えば、ビオチン類、結合対
の一員、例えば、イソシアネート若しくはチオイソシア
ネート基またはこれらを官能基として有する原子団（例
えば、Ｃ１−１６の酸素原子で中断されてもよいアルキ
レン鎖等）を挙げることができる。また、イソシアネー
ト若しくはチオイソシアネート基またはこれらを官能基
として有する原子団は、アミノ基を表面に担持する固体
支持体を容易に得ることが可能である。標識核酸を固定
化すべき担体は特に限定されず、例えば、シリコン基
板、ニトロセルロース製やナイロン製等のフィルター、
ポリプロピレンやポリエチレン製等のマイクロタイター
プレート、スライドガラス等のガラス板を挙げることが
できるが、これらに限定されない。従って、標識核酸が
固定化された担体には、いわゆるＤＮＡチップやマイク
ロアレイと称される核酸固定化担体が含まれるが、これ
らに限定されるものではない。また、結合対間の相互の
結合形成に悪影響を及ぼさないものであれば、天然物質
または合成樹脂等を問わずどの様な材質であってもよ
く、どのような形状であってもよい。また、固体支持体
の取りうる形状は、上記の例に限るものではなく、例え
ば、平板、マイクロウェル、ビーズおよびスティック等
であってもよい。

【００６０】固体支持体の表面の性状は、一般的に非孔
質であることが好ましい。また、操作の便宜上、固体支
持体は磁性体や電極の形態に加工されてもよい。

【００６１】以下、実験例及び実施例に従って、本発明
をさらに詳細に説明するが、いかなる意味においても本
発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【００６２】実施例１ 三本鎖形成の、各反応成分の依存性 ターゲットＤＮＡとしてＭ１３ｍｐ１８ＲＦ ＤＮＡを
制限酵素ＳｎａＢＩで直鎖状にしたものと、そのターゲ
ットＤＮＡの末端部位の配列を持つ６０ｍｅｒのオリゴ
ヌクレオチド１を用意した。オリゴヌクレオチドは、Ｔ
４Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅと［γ
−^３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、^３２Ｐで５′末端を標識し
た。ターゲットＤＮＡと標識オリゴヌクレオチド１との
間の三本鎖形成反応は、１ｐｍｏｌの標識オリゴヌクレ
オチド１、３．０μｇのＲｅｃＡタンパク質、４．８ｍ
Ｍ ＡＴＰ−γＳ、２００ｎｇのターゲットＤＮＡを、
２０ｍＭ酢酸マグネシウム、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ
７．２）中で、３７℃で３０分間保温した。反応後に、
０．５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、０．７ｍｇ／ｍｌプロ
ティナーゼＫを加え、３７℃で３０分間保温することに
より、除タンパクを行った。その半分量について、１％
アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後にゲルをエチ
ジウムブロミド染色し、ＤＮＡの写真を記録した。その
結果を図２（Ｂ）に示す。ゲルをろ紙の上に載せてゲル
乾燥器で乾燥させた後、ゲルのオートラジオグラムをと
り、標識プローブからのシグナルをＸ線フィルム上に記
録した。その結果を図２（Ａ）のレーン１に示す。

【００６３】レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーで、図
面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカーは、
λＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断し、Ｔ４Ｐｏｌ
ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅと［γ−
^３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、^３２Ｐで５′末端標識したも
のである。レーン２は、ＲｅｃＡを加えないで反応を行
った以外は、レーン１と同じである。レーン３は、ＡＴ
Ｐ−γＳを加えないで反応を行った以外は、レーン１と
同じである。レーン４は、ＲｅｃＡとＡＴＰ−γＳを加
えないで反応を行った以外はレーン１と同じである。レ
ーン５は、^３２Ｐ標識オリゴヌクレオチド２を用いて反
応を行った以外はレーン１と同じである。レーン６は、
^３２Ｐ標識オリゴヌクレオチド３を用いて反応を行った
以外はレーン１と同じである。レーン７は、ターゲット
ＤＮＡとして、ｐＢＲ^３２２ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩ
で切断したものを用いたことと、その末端部位の配列を
もつ^３２Ｐ標識オリゴヌクレオチド３を用いたこと以外
は、レーン１と同じ反応を行ったものである。

【００６４】オリゴヌクレオチド1の配列 5'-agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt
ccattaaacg ggtaaaatac-3' オリゴヌクレオチド２の配列 5'-gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctt
tagtcct caaagcctct-3' オリゴヌクレオチド３の配列 5'-cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg ctt
ttctgtg actggtgagt-3'。

【００６５】この結果から言えるとは、レーン１に示す
ように、三本鎖形成には、全ての反応成分が反応に加え
る必要がある。また、そのとき用いるオレゴヌクレオチ
ドは、オリゴヌクレオチド１のような配列方向性を持っ
た配列を持ったものを用いる必要がある。

【００６６】実施例２ 三本鎖形成反応における、用いるオリゴヌクレオチドの
配列方向性 図３（Ａ）のレーン１は、図２（Ａ）のレーン１と同じ
反応を行ったものである。レーン２は、^３２Ｐ標識オリ
ゴヌクレオチド２を用いた以外は、レーン１と同じ反応
を行ったものである。レーン３は、標識オリゴヌクレオ
チド４を用いた以外は、レーン１と同じ反応を行ったも
のである。レーン４は、標識オリゴヌクレオチド５を用
いた以外は、レーン１と同じ反応を行ったものである。
（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色
写真を示す。

【００６７】この結果から言えるとは、直鎖状ターゲッ
トＤＮＡの両末端部位で三本鎖形成が可能であり、その
とき用いるオリゴヌクレオチドは、ターゲットの両末端
配列の一方の方向を持った配列でなければならない。

【００６８】オリゴヌクレオチド4の配列 5'-tgttttagtg tattctttcg cctctttcgt tttaggttgg tgc
cttcgta gtggcattac-3' オリゴヌクレオチド５の配列 5'-gtaatgccac tacgaaggca ccaacctaaa acgaaagagg cga
aagaata cactaaaaca-3' 。

【００６９】実施例３ 三本鎖形成反応に必要とされる、オリゴヌクレオチドの
長さ 図４（Ａ）のレーン１は、オリゴヌクレオチド６を用い
たこと以外は、図２（Ａ）のレーン１と同じ反応を行っ
た結果を示す。レーン２は、図２（Ａ）のレーン１と同
じ反応を行った結果を示す。レーン３は、レーン１で用
いたオリゴヌクレオチドの５′末端部位を３０ｍｅｒ削
った標識オリゴヌクレオチド７を用いた以外は、レーン
１と同じ反応を行ったものである。レーン４は、レーン
１で用いたオリゴヌクレオチドの５′末端部位を４０ｍ
ｅｒ削った標識オリゴヌクレオチド８を用いた以外は、
レーン１と同じ反応を行ったものである。レーン５は、
レーン１で用いたオリゴヌクレオチドの５′末端部位を
５０ｍｅｒ削った標識オリゴヌクレオチド９を用いた以
外は、レーン１と同じ反応を行ったものである。レーン
６は、レーン１で用いたオリゴヌクレオチドの５′末端
部位を６０ｍｅｒ削った標識オリゴヌクレオチド１０を
用いた以外は、レーン１と同じ反応を行ったものであ
る。レーン７は、レーン１で用いたオリゴヌクレオチド
の５′末端部位を７０ｍｅｒ削った標識オリゴヌクレオ
チド１１を用いた以外は、レーン１と同じ反応を行った
ものである。図４（Ｂ）は、泳動後にゲルをエチジウム
ブロミド染色し、ＤＮＡの写真を記録した結果を示す。

【００７０】オリゴヌクレオチド6の配列 5'- acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag ac
tttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac -3' オリゴヌクレオチド7の配列 5'- aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg gg
taaaatac -3' オリゴヌクレオチド8の配列 5'- actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac -
3' オリゴヌクレオチド9の配列 5'- gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac -3' オリゴヌクレオチド10の配列 5'- ccattaaacg ggtaaaatac -3’ オリゴヌクレオチド11の配列 5'-ggtaaaatac -3’。

【００７１】この結果から言えるとは、三本形成に必要
なオリゴヌクレオチドの長さは、望むべくは、４０ｍｅ
ｒ以上が必要であることがわかる。

【００７２】実施例４ 三本鎖形成反応に必要とされる、オリゴヌクレオチド配
列の位置関係 図５（Ａ）のレーン１は、図２（Ａ）のレーン１と同じ
反応を行ったものである。レーン２は、ターゲットＤＮ
Ａの末端１０塩基を残した末端部位の配列をもつオリゴ
ヌクレオチド１２を用いた以外は、レーン１と同じ反応
を行ったものである。レーン３は、ターゲットＤＮＡの
末端２０塩基を残した末端部位の配列をもつオリゴヌク
レオチド１３を用いた以外は、レーン１と同じ反応を行
ったものである。レーン４は、ターゲットＤＮＡの末端
３０塩基を残した末端部位の配列をもつオリゴヌクレオ
チド１４を用いた以外は、レーン１と同じ反応を行った
ものである。図５（Ｂ）は、泳動後にゲルをエチジウム
ブロミド染色し、ＤＮＡの写真を記録した結果を示す。

【００７３】オリゴヌクレオチド12の配列 5’- caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat g
aggaagttt ccattaaacg -3' オリゴヌクレオチド13の配列 5'- acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag ac
tttttcat gaggaagttt -3’ オリゴヌクレオチド14の配列 5'-cagcatcgga acgagggtag caacggctac agaggctttg agg
actaaag actttttcat -3’。

【００７４】この結果から言えるとは、三本形成に必要
なオリゴヌクレオチド配列は、望むべくは、ターゲット
ＤＮＡ末端から２０ベースまでＤＮＡ鎖の内部に入った
配列からはじまるターゲットＤＮＡの配列をもつものが
望ましいことがわかる。

【００７５】実施例５ ターゲットＤＮＡの標識における、各反応成分の依存性 ターゲットＤＮＡとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ
＋ＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで直鎖状にしたものと、そ
のターゲットＤＮＡの末端部位の配列を持つオリゴヌク
レオチド１５を用意した。ターゲットＤＮＡとオリゴヌ
クレオチド１５との間の三本鎖形成反応は、５０ｐｍｏ
ｌのオリゴヌクレオチド１５、５．０μｇのＲｅｃＡタ
ンパク質、４．８ｍＭ ＡＴＰ−γＳ、２００ｎｇのタ
ーゲットＤＮＡを、２０ｍＭ酢酸マグネシウム、３０ｍ
Ｍ酢酸トリス（ｐＨ７．２）中で、３７℃で３０分間保
温した。反応後に、０．５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、
０．７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で３
０分間保温することにより、除タンパクを行った。その
後、４０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、６０μｌとして、フェ
ノール・クロロフォルム抽出を１回行った後、Ｓ−４０
０スピンカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社
製）の操作を１回行い、未反応のオリゴヌクレオチド１
５を除去を行った。エタノール沈殿を行い、濃縮させた
ＤＮＡを１０μｌの蒸留水に溶かした後、１ｐｍｏｌの
^３２Ｐ標識オリゴヌクレオチド１６、２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＮＡＤ、０．０１％Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００、５ｕｎｉｔ Ａｍｐｌｉｇａｓｅ
ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを加え、５０度６０分間反応させ
ることによりライゲーション反応を行った。ライゲーシ
ョン反応後に、フェノール・クロロフォルム抽出を１
回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈
殿を行った。乾燥させたＤＮＡペレットを、８μｌの蒸
留水に溶かした後、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｄ
ｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ｐＨ７．４）、１０ｕｎ
ｉｔ ＳｃａＩを加えて、３７℃で１２０分間保温し
た。その半分量について、１％アガロースゲル電気泳動
行い、残り半分については、常法に従って０．７％アル
カリアガロースゲル電気泳動を行った。アガロースゲル
電気泳動後のゲルについては、泳動後にゲルをエチジウ
ムブロミド染色しＤＮＡの写真を記録した。ゲルをろ紙
の上に載せてゲル乾燥器で乾燥させた後、ゲルのオート
ラジオグラムをとり、標識プローブからのシグナルをＸ
線フィルム上に記録した。その結果を図６（Ａ）のレー
ン１に示す。レーン２は、ＡＴＰ−γＳを加えないで、
レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、
Ｌｉｇａｓｅを加えないで、レーン１と同じ反応を行っ
た結果を示す。レーン４は、オリゴヌクレオチド１５を
加えないでレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レ
ーン５は、オリゴヌクレオチド１５のかわりに、オリゴ
ヌクレオチド１７を加えてレーン１と同じ反応を行った
結果を示す。レーン６は、^３２Ｐ標識オリゴヌクレオチ
ド１６を三本鎖形成反応時に加えたことと、ライゲーシ
ョンの反応を６０度６０分間行ったこと以外は、レーン
１と同じ反応を行った結果を示す。図６（Ｂ）は、泳動
後にゲルをエチジウムブロミド染色し、ＤＮＡの写真を
記録した結果を示す。

【００７６】この結果から言えるとは、すべての反応成
分が反応液に含まれる時のみ、もっとも高いターゲット
ＤＮＡの標識効率が得られる。また、標識化の方法は、
２つの方法が考えられる。

【００７７】オリゴヌクレオチド15の配列 5'-GCCAAGCGCG CAATTAACCC TCACTAAAGG GAACAAAAGC TGG
AGCTCCA CCGCGGTGGCGGCCgc ggc cgc gg -3’ オリゴヌクレオチド16の配列 5'- c cgc ggc cgc-3' オリゴヌクレオチド17の配列 5'-GCCAAGCGCG CAATTAACCC TCACTAAAGG GAACAAAAGC TGG
AGCTCCA CCGCGGTGGCGGCC-3’。

【００７８】実施例６ ターゲットＤＮＡの標識における、ライゲーションの確
認 図７（Ａ）は、図６と同じサンプルを、０．７％アルカ
リアガロースゲル電気泳動した結果を示す。図７（Ｂ）
は、実施例５でライゲーション反応後の制限酵素処理
を、ＳｃａＩのかわりに、５０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕ
ｍ ａｃｅｔａｔｅ、２０ｍＭ ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａ
ｔｅ、１０ｍＭ ｍａｇｎｅｓｓｉｕｍｕａｃｅｔａｔ
ｅ、１ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ｐＨ７．
９）、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｕｎｉｔ Ｎｌ
ａIVで３７度１２０分間反応させたサンプルを、４．５
％変性ゲル電気泳動した結果を示す。

【００７９】この結果から言えるとは、すべての反応成
分が反応液に含まれる時のみ、もっとも高いターゲット
ＤＮＡの標識効率が得られ、かつ、ターゲットＤＮＡに
標識プローブが共有結合していることがわかる。

【００８０】実施例７ 三本鎖形成による、ターゲットＤＮＡの標識化 図８（Ａ）のレーン１は、図６のレーン１と同じ反応を
行った結果を示す。レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカー
で、図面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカ
ーは、λＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断し、Ｔ４
Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅと［γ−
^３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、^３２Ｐで５′末端標識したも
のである。レーン２は、ＲｅｃＡを加えないで反応を行
った以外は、レーン１と同じである。レーン３は、ＡＴ
Ｐ−γＳを加えないで反応を行った以外は、レーン１と
同じである。レーン４は、ＲｅｃＡとＡＴＰ−γＳを加
えないで反応を行った以外はレーン１と同じである。図
８（Ｃ）は、図８（Ａ）と同じサンプルを、０．７％ア
ルカリアガロースゲル電気泳動した結果を示す。

【００８１】実施例８ 図９（Ａ）のレーン１は、図８のレーン１と同じ反応を
行った結果を示す。レーン２は、オリゴヌクレオチド１
５を加えないでレーン１と同じ反応を行った結果を示
す。レーン３は、オリゴヌクレオチド１５のかわりに、
オリゴヌクレオチド１７を加えてレーン１と同じ反応を
行った結果を示す。レーン４は、ｐＢＲ^{３ ２}２ＤＮＡを
制限酵素ＳｃａＩ断片の末端配列をもつ^３２Ｐ標識オリ
ゴヌクレオチド３を用いたこと以外は、レーン１と同じ
反応を行ったものである。図９（Ｂ）は、泳動後にゲル
をエチジウムブロミド染色し、ＤＮＡの写真を記録した
結果を示す。図９（Ｃ）は、図９（Ａ）と同じサンプル
を、０．７％アルカリアガロースゲル電気泳動した結果
を示す。

【００８２】実施例９ 図１０（Ａ）のレーン１は、図８のレーン１と同じ反応
を行った結果を示す。レーン２は、次の反応を行った結
果を示す。ターゲットＤＮＡとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔIIＳＫ＋ＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで直鎖状にした
ものと、そのターゲットＤＮＡの末端部位の配列を持つ
オリゴヌクレオチド１５とオリゴヌクレオチド１５の末
端から１０ｍｅｒの配列に相補的な配列を持つオリゴヌ
クレオチド１６を用意した。オリゴヌクレオチド１６
は、Ｔ４Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ
と［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、^３２Ｐで５′末端を
標識した。ターゲットＤＮＡとオリゴヌクレオチド１５
との間の三本鎖形成反応は、５ｐｍｏｌのオリゴヌクレ
オチド１５、３．０μｇのＲｅｃＡタンパク質、４．８
ｍＭ ＡＴＰ−γＳ、２００ｎｇのターゲットＤＮＡ
を、２０ｍＭ酢酸マグネシウム、３０ｍＭ酢酸トリス
（ｐＨ７．２）中で、３７℃で３０分間保温した。さら
に、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２５
ｍＭ ＫＣｌ １０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．５ｍＭ Ｎ
ＡＤ、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｕｎｉ
ｔｓ Ａｍｐｌｉｇａｓｅ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ、１
ｐｍｏｌオリゴヌクレオチド１６を加え、６０℃で６０
分間保温した。反応後に、０．５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤ
Ｓ、０．７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃
で３０分間保温することにより、除タンパクを行った。
その半分量について、１％アガロースゲル電気泳動を行
い、ゲルをろ紙の上に載せてゲル乾燥器で乾燥させた
後、ゲルのオートラジオグラムをとり、標識プローブか
らのシグナルをＸ線フィルム上に記録した。図１０
（Ｂ）は、泳動後にゲルをエチジウムブロミド染色し、
ＤＮＡの写真を記録した結果を示す。図１０１（Ｃ）
は、図１０（Ａ）と同じサンプルを、０．７％アルカリ
アガロースゲル電気泳動した結果を示す。

【００８３】実施例１０ ターゲットＤＮＡの標識における、ライゲーションの確
認 図１１は、実施例９でライゲーション反応後の制限酵素
処理を、ＳｃａＩのかわりに、５０ｍＭ ｐｏｔａｓｓ
ｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ、２０ｍＭ ｔｒｉｓ−ａｃｅ
ｔａｔｅ、１０ｍＭ ｍａｇｎｅｓｓｉｕｍｕ ａｃｅ
ｔａｔｅ、１ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ｐ
Ｈ７．９）、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｕｎｉｔ
ＮｌａIVで３７度１２０分間反応させたサンプルを、
４．５％変性ゲル電気泳動した結果を示す。

【００８４】

【発明の効果】本発明の方法によれば、高い部位選択制
をもって、簡便に且つ短い時間で、二本鎖核酸の所望す
る部位に対して選択的に標識を導入することが可能であ
る。詳しくは、核酸の末端が互いに等価であっても、所
望する末端のみに標識を導入することが可能である。

【００８５】本発明の方法を用いれば、従来のＰＣＲ法
において必須とされている更なる工程、例えば、得られ
た核酸の同定や目的とする核酸の精製等の工程を行う必
要がない。

【００８６】また、本発明により得られる担体は、ＤＮ
Ａプローブが高密度に固定されて提供される。

【００８７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Aisin Cosmos R&D Co., LTD. <120> Method of a preparation of a nucleic acid introduced a label with RecA protein <130> A000007765 <140> <141> <160> 17 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 1 agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 2 gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct caaagcctct 60 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 3 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 4 tgttttagtg tattctttcg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta gtggcattac 60 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 5 gtaatgccac tacgaaggca ccaacctaaa acgaaagagg cgaaagaata cactaaaaca 60 <210> 6 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 6 acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt 60 ccattaaacg ggtaaaatac 80 <210> 7 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 7 aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac 50 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 8 actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac 40 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 9 gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac 30 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 10 ccattaaacg ggtaaaatac 20 <210> 11 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 11 ggtaaaatac 10 <210> 12 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 12 caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg 60 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 13 acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt 60 <210> 14 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 14 cagcatcgga acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat 60 <210> 15 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 15 gccaagcgcg caattaaccc tcactaaagg gaacaaaagc tggagctcca ccgcggtggc 60 ggccgcggcc gcgg 74 <210> 16 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 16 ccgcggccgc 10 <210> 17 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: <400> 17 gccaagcgcg caattaaccc tcactaaagg gaacaaaagc tggagctcca ccgcggtggc 60 ggcc 64

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の態様において進行すると想定される反
応を示すスキーム。

【図２】実験例１の結果を示す電気泳動の写真。

【図３】実験例２の結果を示す電気泳動の写真。

【図４】実施例３の結果を示す電気泳動の写真。

【図５】実験例４の結果を示す電気泳動の写真。

【図６】実験例５の結果を示す電気泳動の写真。

【図７】実験例６の結果を示す電気泳動の写真。

【図８】実験例７の結果を示す電気泳動の写真。

【図９】実験例８の結果を示す電気泳動の写真。

【図１０】実験例９の結果を示す電気泳動の写真。

【図１１】実験例１０の結果を示す電気泳動の写真。

【符号の説明】

１．標的ＤＮＡ ２．第一のプローブＤＮＡ
３．ＲｅｃＡタンパク質 ４．プローブＤＮＡ・ＲｅｃＡタンパク質複合体
５．三本鎖ＤＮＡ構造 ６．第二のプローブＤＮＡ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大石 道夫 千葉県木更津市矢那1532番３号 財団法人 かずさディー・エヌ・エー研究所内 (72)発明者 小原 收 千葉県木更津市矢那1532番３号 財団法人 かずさディー・エヌ・エー研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 HA08 HA12 HA19 4B029 AA23 BB20 CC03 4B063 QA01 QA05 QA11 QA17 QA18 QA19 QQ42 QR32 QR82 QS14 QS25 QS34 QX02

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標識が導入された核酸を製造する方法で
   あって、 前記標識を導入すべき標的核酸を含む試料に、ＲｅｃＡ
   タンパク質と、前記標的核酸の末端領域と相同な第一の
   核酸プローブとを添加することにより、前記第一の核酸
   プローブの一部が前記標的核酸から突出するように、前
   記ＲｅｃＡタンパク質を介して前記第一の核酸プローブ
   を前記標的核酸に結合せしめる工程と；前記標的核酸に
   結合した前記ＲｅｃＡタンパク質を前記標的核酸から解
   離させる工程と；前記第一の核酸プローブの突出部分
   に、標識された第二の核酸プローブをハイブリダイズさ
   せることにより、標識が導入された核酸を製造する工程
   とを備えた方法。
2. 【請求項２】 標識が導入された核酸を製造する方法で
   あって、請求項１に記載の各工程に、前記第二の核酸プ
   ローブを前記標的核酸にライゲートする工程をさらに備
   えた方法。
3. 【請求項３】 標識が導入された核酸を製造する方法で
   あって、請求項１及び請求項２に記載の各工程に、前記
   標的核酸に結合した前記第一の核酸プローブを、前記標
   的核酸から解離させる工程をさらに備えた方法。
4. 【請求項４】 請求項１〜３の何れか１項に記載の方法
   によって製造された核酸を固定化した担体。