JP2002272465A - 外来遺伝子導入用パラミクソウイルスベクター - Google Patents
外来遺伝子導入用パラミクソウイルスベクターInfo
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 外来遺伝子を導入することができる、複製能
を有するパラミクソウイルスベクターを提供することを
課題とする。 【解決手段】 センダイウイルスゲノムcDNAのウイルス
遺伝子の前後に外来遺伝子を挿入して外来遺伝子を持つ
センダイウイルスを構築した。これらのセンダイウイル
スは複製能を有し、導入細胞において外来遺伝子を発現
することが判明した。外来遺伝子の発現量は、ネガティ
ブ鎖RNAの3'に近いほど高く、特にNP遺伝子の前、およ
びNP遺伝子とP遺伝子の間に外来遺伝子を挿入した場合
に高い発現が得られた。逆に、ネガティブ鎖RNAの5'に
近いほど発現は低く、特にL遺伝子の後ろ、HN遺伝子とL
遺伝子の間、およびF遺伝子とHN遺伝子の間に外来遺伝
子を挿入した場合に比較的低い発現が得られた。
を有するパラミクソウイルスベクターを提供することを
課題とする。 【解決手段】 センダイウイルスゲノムcDNAのウイルス
遺伝子の前後に外来遺伝子を挿入して外来遺伝子を持つ
センダイウイルスを構築した。これらのセンダイウイル
スは複製能を有し、導入細胞において外来遺伝子を発現
することが判明した。外来遺伝子の発現量は、ネガティ
ブ鎖RNAの3'に近いほど高く、特にNP遺伝子の前、およ
びNP遺伝子とP遺伝子の間に外来遺伝子を挿入した場合
に高い発現が得られた。逆に、ネガティブ鎖RNAの5'に
近いほど発現は低く、特にL遺伝子の後ろ、HN遺伝子とL
遺伝子の間、およびF遺伝子とHN遺伝子の間に外来遺伝
子を挿入した場合に比較的低い発現が得られた。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、外来遺伝子を導入
することができる、複製能を有するパラミクソウイルス
ベクターに関する。
することができる、複製能を有するパラミクソウイルス
ベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】これまでの遺伝子治療の臨床研究のアプ
ローチの多くはレトロウイルス、アデノウイルス、およ
びアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターが利用さ
れている。これらの遺伝子治療用ベクターは、導入効率
および持続発現に制限があり、ベクター自体に細胞毒性
及び免疫原性があるなど、医学応用上の大きな問題が存
在する（Lamb, R.A. & Kolakofsky, D., Paramyxovirid
ae: the viruses and their replication. in Fields V
irology, 3rd edn, (Edited by B.N. Fields, D.M. Kni
pe & P.P. Howley)pp.1177-1204(Philadelphia, Lippin
cott-Raven. (1996)）。これらの対策として新たなベク
ターがレンチウイルスやHSVをベースに提案されてお
り、また既存ベクターの改良研究が精力的になされてい
る。しかしながら、これらのベクターはいずれも生活環
において、核内でDNAの形態で存在する。従って、患者
の染色体とのランダムな相互作用に関わる安全性への危
惧は完全に回避することは難しい。
ローチの多くはレトロウイルス、アデノウイルス、およ
びアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターが利用さ
れている。これらの遺伝子治療用ベクターは、導入効率
および持続発現に制限があり、ベクター自体に細胞毒性
及び免疫原性があるなど、医学応用上の大きな問題が存
在する（Lamb, R.A. & Kolakofsky, D., Paramyxovirid
ae: the viruses and their replication. in Fields V
irology, 3rd edn, (Edited by B.N. Fields, D.M. Kni
pe & P.P. Howley)pp.1177-1204(Philadelphia, Lippin
cott-Raven. (1996)）。これらの対策として新たなベク
ターがレンチウイルスやHSVをベースに提案されてお
り、また既存ベクターの改良研究が精力的になされてい
る。しかしながら、これらのベクターはいずれも生活環
において、核内でDNAの形態で存在する。従って、患者
の染色体とのランダムな相互作用に関わる安全性への危
惧は完全に回避することは難しい。
【０００３】最近のリバースジェネティクス技術の急速
な進歩により、従来開発が遅れていたRNAウイルスをベ
ースにしたベクターの開発が可能となりつつある。組み
換えRNAウイルスは高い遺伝子導入効率と発現能力を示
し、遺伝子治療用ベクターとしての高いポテンシャリテ
ィが示唆される（Roberts, A. & Rose, J. K., Virolog
y 247,1-6 (1998); Rose, J. K., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 93, 14998-15000 (1996); Palese, P. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11354-11358(199
6))。ネガティブ鎖RNAをゲノムに持つパラミクソウイル
スベクターは、レトロウイルス、DNAウイルス、または
プラス鎖RNAウイルスベクターとは大きく異なる幾つか
の特徴を持っている。そのゲノムまたはアンチゲノムは
直接にmRNAとしては機能せず、ウイルスのタンパク質合
成やゲノム複製を開始させることはできない。ウイルス
のRNAゲノムもアンチゲノムも常にリボ核酸タンパク質
（ribonucleoprotein; RNP）複合体の形で存在し、プラ
ス鎖RNAウイルスに見られるような、mRNAsが相補的な裸
のゲノムRNAにハイブリダイズしてゲノムのRNPへのアセ
ンブリを妨害するといったアンチセンスの問題が殆ど起
きない。これらのウイルスは自身のRNAポリメラーゼを
持っており、RNP複合体を鋳型にしてウイルスmRNAの転
写またはウイルスゲノムの複製を行う。特筆すべきこと
にネガティブ鎖RNA（nsRNA）ウイルスは宿主細胞の細胞
質でのみ増殖し、DNAフェーズを持たないため染色体へ
の組み込み（integration）は起こらない。更にはRNA同
士の相同組み換えも認められていない。これらの性質は
ネガティブ鎖RNAウイルスの遺伝子発現ベクターとして
の安定性と安全性に大きく寄与するものと思われる。
な進歩により、従来開発が遅れていたRNAウイルスをベ
ースにしたベクターの開発が可能となりつつある。組み
換えRNAウイルスは高い遺伝子導入効率と発現能力を示
し、遺伝子治療用ベクターとしての高いポテンシャリテ
ィが示唆される（Roberts, A. & Rose, J. K., Virolog
y 247,1-6 (1998); Rose, J. K., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 93, 14998-15000 (1996); Palese, P. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11354-11358(199
6))。ネガティブ鎖RNAをゲノムに持つパラミクソウイル
スベクターは、レトロウイルス、DNAウイルス、または
プラス鎖RNAウイルスベクターとは大きく異なる幾つか
の特徴を持っている。そのゲノムまたはアンチゲノムは
直接にmRNAとしては機能せず、ウイルスのタンパク質合
成やゲノム複製を開始させることはできない。ウイルス
のRNAゲノムもアンチゲノムも常にリボ核酸タンパク質
（ribonucleoprotein; RNP）複合体の形で存在し、プラ
ス鎖RNAウイルスに見られるような、mRNAsが相補的な裸
のゲノムRNAにハイブリダイズしてゲノムのRNPへのアセ
ンブリを妨害するといったアンチセンスの問題が殆ど起
きない。これらのウイルスは自身のRNAポリメラーゼを
持っており、RNP複合体を鋳型にしてウイルスmRNAの転
写またはウイルスゲノムの複製を行う。特筆すべきこと
にネガティブ鎖RNA（nsRNA）ウイルスは宿主細胞の細胞
質でのみ増殖し、DNAフェーズを持たないため染色体へ
の組み込み（integration）は起こらない。更にはRNA同
士の相同組み換えも認められていない。これらの性質は
ネガティブ鎖RNAウイルスの遺伝子発現ベクターとして
の安定性と安全性に大きく寄与するものと思われる。
【０００４】本発明者らはネガティブ鎖RNAウイルスの
中でもヒトに対して病原性を持たないセンダイウイルス
（Sendai virus; SeV）、中でも特に弱毒であるZ株に注
目してきた。SeVは非分節型ネガティブ鎖 RNAウイルス
で、パラミクソウイルス（paramyxovirus）に属し、mur
ine parainfluenza virusの一種である。このウイルス
は二つのエンベロープ糖タンパク質であるヘマグルチニ
ン-ノイラミニダーゼ（hemagglutinin-neuraminidase;
HN）とフュージョンタンパク質（fusion protein; F）
を介して宿主細胞膜に接着、膜融合を起こし、効率的に
自分のRNAポリメラーゼとリボヌクレオプロテイン（RN
P）複合体の形で存在するRNAゲノムを細胞質に放出し、
そこでウイルスのmRNAの転写及びゲノムの複製を行う
（Bitzer, M. et al., J. Virol. 71(7):5481-5486, 19
97）。ウイルスエンベロープ蛋白質Fは活性の無い前駆
蛋白（F0）として合成され、トリプシンによるタンパク
質分解（proteolytic cleavage）で F1 と F2 に解裂さ
れ（Kido, H. et al., Biopolymers (Peptide Science)
51(1):79-86, 1999）、活性型蛋白質となり膜融合を引
き起こす。このウイルスはヒトに対して病原性がないと
言われている。また、ラボ弱毒株（Z strain）も分離さ
れており、自然宿主であるげっ歯類に対し軽度の肺炎を
誘発する程度である。この株はパラミクソウイルスの転
写複製機構等の分子レベルにおける研究モデルとして広
く用いられており、またハイブリドーマの作製にも使わ
れてきた。このような高い安全性に加えこのウイルス
は、細胞株または鶏卵で109〜11 pfu/mlという高い生産
タイターを示す。最近成功したネガティブ鎖RNAウイル
スベクターのcDNAからの回収システムの中で、センダイ
ウイルスの場合は特に高い再構成効率を示している。外
来遺伝子を導入した組み換え型野生ウイルスでは効率的
且つ安定的に導入外来遺伝子を発現する能力が注目され
ている。
中でもヒトに対して病原性を持たないセンダイウイルス
（Sendai virus; SeV）、中でも特に弱毒であるZ株に注
目してきた。SeVは非分節型ネガティブ鎖 RNAウイルス
で、パラミクソウイルス（paramyxovirus）に属し、mur
ine parainfluenza virusの一種である。このウイルス
は二つのエンベロープ糖タンパク質であるヘマグルチニ
ン-ノイラミニダーゼ（hemagglutinin-neuraminidase;
HN）とフュージョンタンパク質（fusion protein; F）
を介して宿主細胞膜に接着、膜融合を起こし、効率的に
自分のRNAポリメラーゼとリボヌクレオプロテイン（RN
P）複合体の形で存在するRNAゲノムを細胞質に放出し、
そこでウイルスのmRNAの転写及びゲノムの複製を行う
（Bitzer, M. et al., J. Virol. 71(7):5481-5486, 19
97）。ウイルスエンベロープ蛋白質Fは活性の無い前駆
蛋白（F0）として合成され、トリプシンによるタンパク
質分解（proteolytic cleavage）で F1 と F2 に解裂さ
れ（Kido, H. et al., Biopolymers (Peptide Science)
51(1):79-86, 1999）、活性型蛋白質となり膜融合を引
き起こす。このウイルスはヒトに対して病原性がないと
言われている。また、ラボ弱毒株（Z strain）も分離さ
れており、自然宿主であるげっ歯類に対し軽度の肺炎を
誘発する程度である。この株はパラミクソウイルスの転
写複製機構等の分子レベルにおける研究モデルとして広
く用いられており、またハイブリドーマの作製にも使わ
れてきた。このような高い安全性に加えこのウイルス
は、細胞株または鶏卵で109〜11 pfu/mlという高い生産
タイターを示す。最近成功したネガティブ鎖RNAウイル
スベクターのcDNAからの回収システムの中で、センダイ
ウイルスの場合は特に高い再構成効率を示している。外
来遺伝子を導入した組み換え型野生ウイルスでは効率的
且つ安定的に導入外来遺伝子を発現する能力が注目され
ている。
【０００５】これまでに、外来遺伝子をNP遺伝子の上流
に挿入したセンダイウイルスベクターは知られている
が、これ以外の部位に外来遺伝子を挿入した場合に、ウ
イルスの再構成および外来遺伝子の発現にどのような影
響が出るのかについては知られていなかった。
に挿入したセンダイウイルスベクターは知られている
が、これ以外の部位に外来遺伝子を挿入した場合に、ウ
イルスの再構成および外来遺伝子の発現にどのような影
響が出るのかについては知られていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、外来遺伝子
を導入することができる、複製能を有するパラミクソウ
イルスベクターを提供することを課題とする。
を導入することができる、複製能を有するパラミクソウ
イルスベクターを提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、センダイ
ウイルスのウイルス蛋白質をコードする各遺伝子の前後
の部位に外来遺伝子を挿入したウイルスベクターDNAを
構築し、ウイルスの再構成および外来遺伝子の発現量の
検討を行った。すなわち、センダイウイルス（SeV）全
長ゲノムcDNAに、外来遺伝子挿入用に新たな制限酵素部
位をウイルス蛋白質タンパク質をコードする各遺伝子の
スタートシグナルとATG翻訳開始シグナルの間に導入し
た。この制限酵素部位に外来遺伝子（ヒト分泌型アルカ
リフォスファターゼ遺伝子）を挿入し、LLC-MK2細胞を
用いてセンダイウイルスの再構築を行ったところ、複製
能を有するセンダイウイルスが再構築されることが確認
された。これらの各ウイルスを鶏卵で増幅し、ウイルス
のストック溶液を調製した。このウイルスを、タイター
をあわせてLLC-MK2細胞に感染させ、外来遺伝子の発現
量を測定したところ、調べたいずれの位置に外来遺伝子
を挿入した場合でも、外来遺伝子の発現が見られた。外
来遺伝子をゲノムの上流（ネガティブ鎖の3'側）、すな
わちNP遺伝子の前、またはNP遺伝子とP遺伝子との間に
挿入した場合では、外来遺伝子の発現量は比較的高く、
外来遺伝子の挿入位置がゲノムの下流（ネガティブ鎖の
5'側）に近づくに従って、外来遺伝子の発現が低下する
ことが判明した。
ウイルスのウイルス蛋白質をコードする各遺伝子の前後
の部位に外来遺伝子を挿入したウイルスベクターDNAを
構築し、ウイルスの再構成および外来遺伝子の発現量の
検討を行った。すなわち、センダイウイルス（SeV）全
長ゲノムcDNAに、外来遺伝子挿入用に新たな制限酵素部
位をウイルス蛋白質タンパク質をコードする各遺伝子の
スタートシグナルとATG翻訳開始シグナルの間に導入し
た。この制限酵素部位に外来遺伝子（ヒト分泌型アルカ
リフォスファターゼ遺伝子）を挿入し、LLC-MK2細胞を
用いてセンダイウイルスの再構築を行ったところ、複製
能を有するセンダイウイルスが再構築されることが確認
された。これらの各ウイルスを鶏卵で増幅し、ウイルス
のストック溶液を調製した。このウイルスを、タイター
をあわせてLLC-MK2細胞に感染させ、外来遺伝子の発現
量を測定したところ、調べたいずれの位置に外来遺伝子
を挿入した場合でも、外来遺伝子の発現が見られた。外
来遺伝子をゲノムの上流（ネガティブ鎖の3'側）、すな
わちNP遺伝子の前、またはNP遺伝子とP遺伝子との間に
挿入した場合では、外来遺伝子の発現量は比較的高く、
外来遺伝子の挿入位置がゲノムの下流（ネガティブ鎖の
5'側）に近づくに従って、外来遺伝子の発現が低下する
ことが判明した。
【０００８】これらの結果は、外来遺伝子をNP遺伝子の
上流またはNP遺伝子の下流（NP遺伝子とP遺伝子の間）
に位置させれば、比較的高い外来遺伝子の発現を得るこ
とが可能であり、外来遺伝子をゲノムのより下流に位置
させれば、その発現量を減少させることが可能であるこ
とを示している。この知見を基にすれば、外来遺伝子の
高い発現を得るためには、外来遺伝子をゲノムの上流
側、すなわちネガティブ鎖ゲノムの3'側に挿入し、反対
に、細胞毒性を有する遺伝子など高発現が好ましくない
場合には外来遺伝子をゲノムの下流側、すなわちネガテ
ィブ鎖ゲノムの5'側に挿入することによって、ベクター
における外来遺伝子の発現量を制御することが可能とな
る。このように本発明のパラミクソウイルスベクター
は、外来遺伝子を減弱発現させるためのパラミクソウイ
ルスベクターとして極めて有用である。本発明のパラミ
クソウイルスベクターは、in vivo および in vitro に
おける外来遺伝子の発現に有用であり、特にパラミクソ
ウイルスの優れた特徴を生かした遺伝子治療用ベクター
としての応用が期待される。
上流またはNP遺伝子の下流（NP遺伝子とP遺伝子の間）
に位置させれば、比較的高い外来遺伝子の発現を得るこ
とが可能であり、外来遺伝子をゲノムのより下流に位置
させれば、その発現量を減少させることが可能であるこ
とを示している。この知見を基にすれば、外来遺伝子の
高い発現を得るためには、外来遺伝子をゲノムの上流
側、すなわちネガティブ鎖ゲノムの3'側に挿入し、反対
に、細胞毒性を有する遺伝子など高発現が好ましくない
場合には外来遺伝子をゲノムの下流側、すなわちネガテ
ィブ鎖ゲノムの5'側に挿入することによって、ベクター
における外来遺伝子の発現量を制御することが可能とな
る。このように本発明のパラミクソウイルスベクター
は、外来遺伝子を減弱発現させるためのパラミクソウイ
ルスベクターとして極めて有用である。本発明のパラミ
クソウイルスベクターは、in vivo および in vitro に
おける外来遺伝子の発現に有用であり、特にパラミクソ
ウイルスの優れた特徴を生かした遺伝子治療用ベクター
としての応用が期待される。
【０００９】RNAウイルスではゲノムの安定性の問題が
指摘され得るが、SeVベクターによる異種遺伝子発現の
結果ではウイルスを連続多代継代しても殆ど塩基の変異
が認められず、挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に
発現する事が示されている（Yu, D. et al. Genes Cell
s 2, 457-466 (1997)）。このネガティブ鎖RNAウイルス
レプリコンをベースにしたベクターは、既に成功してい
るポジティブ鎖（positive-strand）RNAウイルスである
セムリキ森林ウイルス（Semliki forest virus）または
シンドビスウイルス（Sindbis viruses）のレプリコン
をベースにしたウイルスベクターに比べ、ゲノムの安定
性や、カプシド構造タンパク質を持たないことによる導
入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性（flex
ibility）など性質上幾つかのメリットがある。複製能
を有するセンダイウイルスベクターは、外来DNAを少な
くとも４kbpまで導入可能であり、転写ユニットを付加
することによって２種類以上の遺伝子を同時に発現する
事が可能かもしれない。このセンダイウイルスのレプリ
コンをベースにしたベクターは複製されたウイルスが周
囲の細胞にも再感染し、感染細胞の細胞質で多コピーに
複製されたRNPが細胞の分裂に伴い娘細胞にも分配され
るため持続発現が期待される。さらに、本発明者等は、
センダイウイルスベクターが血球系の細胞、特に顆粒球
系細胞にも高い効率で遺伝子導入され、c-kit陽性のpri
mitive細胞にも導入されることを見出した。このことか
ら、このベクターは非常に広い組織適用範囲を持つ応用
可能性の高いベクターになり得ることが示唆される。
指摘され得るが、SeVベクターによる異種遺伝子発現の
結果ではウイルスを連続多代継代しても殆ど塩基の変異
が認められず、挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に
発現する事が示されている（Yu, D. et al. Genes Cell
s 2, 457-466 (1997)）。このネガティブ鎖RNAウイルス
レプリコンをベースにしたベクターは、既に成功してい
るポジティブ鎖（positive-strand）RNAウイルスである
セムリキ森林ウイルス（Semliki forest virus）または
シンドビスウイルス（Sindbis viruses）のレプリコン
をベースにしたウイルスベクターに比べ、ゲノムの安定
性や、カプシド構造タンパク質を持たないことによる導
入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性（flex
ibility）など性質上幾つかのメリットがある。複製能
を有するセンダイウイルスベクターは、外来DNAを少な
くとも４kbpまで導入可能であり、転写ユニットを付加
することによって２種類以上の遺伝子を同時に発現する
事が可能かもしれない。このセンダイウイルスのレプリ
コンをベースにしたベクターは複製されたウイルスが周
囲の細胞にも再感染し、感染細胞の細胞質で多コピーに
複製されたRNPが細胞の分裂に伴い娘細胞にも分配され
るため持続発現が期待される。さらに、本発明者等は、
センダイウイルスベクターが血球系の細胞、特に顆粒球
系細胞にも高い効率で遺伝子導入され、c-kit陽性のpri
mitive細胞にも導入されることを見出した。このことか
ら、このベクターは非常に広い組織適用範囲を持つ応用
可能性の高いベクターになり得ることが示唆される。
【００１０】即ち本発明は、外来遺伝子を導入すること
ができる、複製能を有するパラミクソウイルスベクター
に関し、より具体的には、（１）外来遺伝子を保持し、
かつ複製能を有するパラミクソウイルスベクターであっ
て、該ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAにお
いて、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子の下流に
外来遺伝子が位置しているベクター、（２）外来遺伝子
を保持し、かつ複製能を有するパラミクソウイルスベク
ターであって、下記（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載
のベクター、（ａ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲ
ノムRNAの3'端から１番目に位置するウイルスタンパク
質をコードする遺伝子と２番目のウイルスタンパク質を
コードする遺伝子の間に外来遺伝子が挿入されているベ
クター、（ｂ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノム
RNAの3'端から２番目に位置するウイルスタンパク質を
コードする遺伝子と３番目のウイルスタンパク質をコー
ドする遺伝子の間に外来遺伝子が挿入されているベクタ
ー、（ｃ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNA
の3'端から３番目に位置するウイルスタンパク質をコー
ドする遺伝子と４番目のウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子の間に外来遺伝子が挿入されているベクター、
（ｄ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から４番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子と５番目のウイルスタンパク質をコードする遺
伝子の間に外来遺伝子が挿入されているベクター、
（ｅ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から５番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子と６番目のウイルスタンパク質をコードする遺
伝子の間に外来遺伝子が挿入されているベクター、
（ｆ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から６番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子とトレイラー配列の間に外来遺伝子が挿入され
ているベクター、（３）ベクターに含まれるネガティブ
鎖ゲノムRNAの3'端から１番目〜６番目に位置するウイ
ルスタンパク質をコードする遺伝子が、順にNP遺伝子、
P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、HN遺伝子、およびL遺伝子
である、（２）に記載のベクター、（４）（１）から
（３）のいずれかに記載のパラミクソウイルスベクター
に含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAまたはその相補鎖を
コードするDNA、（５）複製能を有するパラミクソウイ
ルスベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAまたは
その相補鎖をコードするDNAであって、該ネガティブ鎖
ゲノムRNAまたはその相補鎖において、ウイルスタンパ
ク質をコードする遺伝子の下流に外来遺伝子を挿入する
ためのクローニング部位を保持するDNA、（６）複製能
を有するパラミクソウイルスベクターに含まれるネガテ
ィブ鎖ゲノムRNAまたはその相補鎖をコードするDNAであ
って、下記（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載のDNA、
（ａ）ネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端から１番目に位置
するウイルスタンパク質をコードする遺伝子と２番目の
ウイルスタンパク質をコードする遺伝子の間に外来遺伝
子を挿入するためのクローニング部位を保持するDNA、
（ｂ）ネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端に相当する部位か
ら２番目に位置するウイルスタンパク質をコードする遺
伝子と３番目のウイルスタンパク質をコードする遺伝子
の間に外来遺伝子を挿入するためのクローニング部位を
保持するDNA、（ｃ）ネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端に相
当する部位から３番目に位置するウイルスタンパク質を
コードする遺伝子と４番目のウイルスタンパク質をコー
ドする遺伝子の間に外来遺伝子を挿入するためのクロー
ニング部位を保持するDNA、（ｄ）ネガティブ鎖ゲノムR
NAの3'端に相当する部位から４番目に位置するウイルス
タンパク質をコードする遺伝子と５番目のウイルスタン
パク質をコードする遺伝子の間に外来遺伝子を挿入する
ためのクローニング部位を保持するDNA、（ｅ）ネガテ
ィブ鎖ゲノムRNAの3'端に相当する部位から５番目に位
置するウイルスタンパク質をコードする遺伝子と６番目
のウイルスタンパク質をコードする遺伝子の間に外来遺
伝子を挿入するためのクローニング部位を保持するDN
A、（ｆ）ネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端に相当する部位
から６番目に位置するウイルスタンパク質をコードする
遺伝子とトレイラー配列の間に外来遺伝子を挿入するた
めのクローニング部位を保持するDNA、（７）ネガティ
ブ鎖ゲノムRNAの3'端に相当する部位から１番目〜６番
目に位置するウイルスタンパク質をコードする遺伝子
が、順にNP遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、HN遺
伝子、およびL遺伝子である、（６）に記載のDNA、
（８）（４）から（７）のいずれかに記載のDNAを転写
可能に保持するベクターDNA、（９）ポジティブ鎖ゲノ
ムRNAを転写可能に保持する、（８）に記載のベクターD
NA、（１０）パラミクソウイルスベクターにおける外来
遺伝子の発現レベルを制御する方法であって、（ａ）ベ
クターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端から１
番目に位置するウイルスタンパク質をコードする遺伝子
と２番目のウイルスタンパク質をコードする遺伝子の間
に外来遺伝子を位置させる方法、（ｂ）ベクターに含ま
れるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端から２番目に位置す
るウイルスタンパク質をコードする遺伝子と３番目のウ
イルスタンパク質をコードする遺伝子の間に外来遺伝子
を位置させる方法、（ｃ）ベクターに含まれるネガティ
ブ鎖ゲノムRNAの3'端から３番目に位置するウイルスタ
ンパク質をコードする遺伝子と４番目のウイルスタンパ
ク質をコードする遺伝子の間に外来遺伝子を位置させる
方法、（ｄ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRN
Aの3'端から４番目に位置するウイルスタンパク質をコ
ードする遺伝子と５番目のウイルスタンパク質をコード
する遺伝子の間に外来遺伝子を位置させる方法、（ｅ）
ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端から
５番目に位置するウイルスタンパク質をコードする遺伝
子と６番目のウイルスタンパク質をコードする遺伝子の
間に外来遺伝子を位置させる方法、（ｆ）ベクターに含
まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端から６番目に位置
するウイルスタンパク質をコードする遺伝子とトレイラ
ー配列の間に外来遺伝子を位置させる方法、に関する。
ができる、複製能を有するパラミクソウイルスベクター
に関し、より具体的には、（１）外来遺伝子を保持し、
かつ複製能を有するパラミクソウイルスベクターであっ
て、該ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAにお
いて、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子の下流に
外来遺伝子が位置しているベクター、（２）外来遺伝子
を保持し、かつ複製能を有するパラミクソウイルスベク
ターであって、下記（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載
のベクター、（ａ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲ
ノムRNAの3'端から１番目に位置するウイルスタンパク
質をコードする遺伝子と２番目のウイルスタンパク質を
コードする遺伝子の間に外来遺伝子が挿入されているベ
クター、（ｂ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノム
RNAの3'端から２番目に位置するウイルスタンパク質を
コードする遺伝子と３番目のウイルスタンパク質をコー
ドする遺伝子の間に外来遺伝子が挿入されているベクタ
ー、（ｃ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNA
の3'端から３番目に位置するウイルスタンパク質をコー
ドする遺伝子と４番目のウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子の間に外来遺伝子が挿入されているベクター、
（ｄ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から４番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子と５番目のウイルスタンパク質をコードする遺
伝子の間に外来遺伝子が挿入されているベクター、
（ｅ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から５番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子と６番目のウイルスタンパク質をコードする遺
伝子の間に外来遺伝子が挿入されているベクター、
（ｆ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から６番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子とトレイラー配列の間に外来遺伝子が挿入され
ているベクター、（３）ベクターに含まれるネガティブ
鎖ゲノムRNAの3'端から１番目〜６番目に位置するウイ
ルスタンパク質をコードする遺伝子が、順にNP遺伝子、
P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、HN遺伝子、およびL遺伝子
である、（２）に記載のベクター、（４）（１）から
（３）のいずれかに記載のパラミクソウイルスベクター
に含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAまたはその相補鎖を
コードするDNA、（５）複製能を有するパラミクソウイ
ルスベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAまたは
その相補鎖をコードするDNAであって、該ネガティブ鎖
ゲノムRNAまたはその相補鎖において、ウイルスタンパ
ク質をコードする遺伝子の下流に外来遺伝子を挿入する
ためのクローニング部位を保持するDNA、（６）複製能
を有するパラミクソウイルスベクターに含まれるネガテ
ィブ鎖ゲノムRNAまたはその相補鎖をコードするDNAであ
って、下記（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載のDNA、
（ａ）ネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端から１番目に位置
するウイルスタンパク質をコードする遺伝子と２番目の
ウイルスタンパク質をコードする遺伝子の間に外来遺伝
子を挿入するためのクローニング部位を保持するDNA、
（ｂ）ネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端に相当する部位か
ら２番目に位置するウイルスタンパク質をコードする遺
伝子と３番目のウイルスタンパク質をコードする遺伝子
の間に外来遺伝子を挿入するためのクローニング部位を
保持するDNA、（ｃ）ネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端に相
当する部位から３番目に位置するウイルスタンパク質を
コードする遺伝子と４番目のウイルスタンパク質をコー
ドする遺伝子の間に外来遺伝子を挿入するためのクロー
ニング部位を保持するDNA、（ｄ）ネガティブ鎖ゲノムR
NAの3'端に相当する部位から４番目に位置するウイルス
タンパク質をコードする遺伝子と５番目のウイルスタン
パク質をコードする遺伝子の間に外来遺伝子を挿入する
ためのクローニング部位を保持するDNA、（ｅ）ネガテ
ィブ鎖ゲノムRNAの3'端に相当する部位から５番目に位
置するウイルスタンパク質をコードする遺伝子と６番目
のウイルスタンパク質をコードする遺伝子の間に外来遺
伝子を挿入するためのクローニング部位を保持するDN
A、（ｆ）ネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端に相当する部位
から６番目に位置するウイルスタンパク質をコードする
遺伝子とトレイラー配列の間に外来遺伝子を挿入するた
めのクローニング部位を保持するDNA、（７）ネガティ
ブ鎖ゲノムRNAの3'端に相当する部位から１番目〜６番
目に位置するウイルスタンパク質をコードする遺伝子
が、順にNP遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、HN遺
伝子、およびL遺伝子である、（６）に記載のDNA、
（８）（４）から（７）のいずれかに記載のDNAを転写
可能に保持するベクターDNA、（９）ポジティブ鎖ゲノ
ムRNAを転写可能に保持する、（８）に記載のベクターD
NA、（１０）パラミクソウイルスベクターにおける外来
遺伝子の発現レベルを制御する方法であって、（ａ）ベ
クターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端から１
番目に位置するウイルスタンパク質をコードする遺伝子
と２番目のウイルスタンパク質をコードする遺伝子の間
に外来遺伝子を位置させる方法、（ｂ）ベクターに含ま
れるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端から２番目に位置す
るウイルスタンパク質をコードする遺伝子と３番目のウ
イルスタンパク質をコードする遺伝子の間に外来遺伝子
を位置させる方法、（ｃ）ベクターに含まれるネガティ
ブ鎖ゲノムRNAの3'端から３番目に位置するウイルスタ
ンパク質をコードする遺伝子と４番目のウイルスタンパ
ク質をコードする遺伝子の間に外来遺伝子を位置させる
方法、（ｄ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRN
Aの3'端から４番目に位置するウイルスタンパク質をコ
ードする遺伝子と５番目のウイルスタンパク質をコード
する遺伝子の間に外来遺伝子を位置させる方法、（ｅ）
ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端から
５番目に位置するウイルスタンパク質をコードする遺伝
子と６番目のウイルスタンパク質をコードする遺伝子の
間に外来遺伝子を位置させる方法、（ｆ）ベクターに含
まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端から６番目に位置
するウイルスタンパク質をコードする遺伝子とトレイラ
ー配列の間に外来遺伝子を位置させる方法、に関する。
【００１１】なお、本発明において「ウイルスベクタ
ー」とは、宿主内に核酸分子を導入する能力を有するウ
イルス粒子を指す。また、本発明においてパラミクソウ
イルスとはパラミクソウイルス属（Paramyxovirus）に
属するウイルスまたはその誘導体を指す。本発明を適用
可能なパラミクソウイルスとしては、例えばヒトパライ
ンフルエンザウイルス１型（HPIV-1）、ヒトパラインフ
ルエンザウイルス３型（HPIV-3）、ウシパラインフルエ
ンザウイルス3型（BPIV-3）、センダイウイルス(Sendai
virus; マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼
ばれる)、およびサルパラインフルエンザウイルス10型
（SPIV-10）などが含まれる。本発明のウイルスは、よ
り好ましくはセンダイウイルスである。これらのウイル
スは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人
為的に構築された株などであり得る。DI粒子（J. Viro
l. 68, 8413-8417(1994)）等の不完全ウイルスや、合成
したオリゴヌクレオチド等も、本発明のウイルスベクタ
ーを製造するための材料として使用することができる。
ー」とは、宿主内に核酸分子を導入する能力を有するウ
イルス粒子を指す。また、本発明においてパラミクソウ
イルスとはパラミクソウイルス属（Paramyxovirus）に
属するウイルスまたはその誘導体を指す。本発明を適用
可能なパラミクソウイルスとしては、例えばヒトパライ
ンフルエンザウイルス１型（HPIV-1）、ヒトパラインフ
ルエンザウイルス３型（HPIV-3）、ウシパラインフルエ
ンザウイルス3型（BPIV-3）、センダイウイルス(Sendai
virus; マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼
ばれる)、およびサルパラインフルエンザウイルス10型
（SPIV-10）などが含まれる。本発明のウイルスは、よ
り好ましくはセンダイウイルスである。これらのウイル
スは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人
為的に構築された株などであり得る。DI粒子（J. Viro
l. 68, 8413-8417(1994)）等の不完全ウイルスや、合成
したオリゴヌクレオチド等も、本発明のウイルスベクタ
ーを製造するための材料として使用することができる。
【００１２】パラミクソウイルスのウイルスタンパク質
をコードする遺伝子としては、NP、P、M、F、HN、およ
びL遺伝子が含まれる。「NP、P、M、F、HN、およびL遺
伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マ
トリックス、フュージョン、ヘマグルチニン-ノイラミ
ニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のこ
とを指す。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルス
における各遺伝子は、一般に次のように表記される。一
般に、NP遺伝子は「N遺伝子」と表記されることもあ
る。 パラミクソウイルス属 NP P/C/V M F HN - L ルブラウイルス属 NP P/V M F HN (SH) L モービリウイルス属 NP P/C/V M F H - L
をコードする遺伝子としては、NP、P、M、F、HN、およ
びL遺伝子が含まれる。「NP、P、M、F、HN、およびL遺
伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マ
トリックス、フュージョン、ヘマグルチニン-ノイラミ
ニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のこ
とを指す。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルス
における各遺伝子は、一般に次のように表記される。一
般に、NP遺伝子は「N遺伝子」と表記されることもあ
る。 パラミクソウイルス属 NP P/C/V M F HN - L ルブラウイルス属 NP P/V M F HN (SH) L モービリウイルス属 NP P/C/V M F H - L
【００１３】例えばパラミクソウイルス科（Paramyxovi
ridae）のレスピロウイルス（Respirovirus）属にも分
類されるセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデー
タベースのアクセッション番号は、NP遺伝子については
M29343、M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M
69046, X17218、P遺伝子については M30202, M30203,M3
0204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008、M遺
伝子については D11446, K02742, M30202, M30203, M30
204, M69046, U31956, X00584, X53056、F遺伝子につい
ては D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M3020
3, M30204, M69046, X00152, X02131、HN遺伝子につい
ては D26475, M12397, M30202, M30203,M30204, M6904
6, X00586, X02808, X56131、L遺伝子については D0005
3, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886
を参照のこと。
ridae）のレスピロウイルス（Respirovirus）属にも分
類されるセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデー
タベースのアクセッション番号は、NP遺伝子については
M29343、M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M
69046, X17218、P遺伝子については M30202, M30203,M3
0204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008、M遺
伝子については D11446, K02742, M30202, M30203, M30
204, M69046, U31956, X00584, X53056、F遺伝子につい
ては D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M3020
3, M30204, M69046, X00152, X02131、HN遺伝子につい
ては D26475, M12397, M30202, M30203,M30204, M6904
6, X00586, X02808, X56131、L遺伝子については D0005
3, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886
を参照のこと。
【００１４】「複製能を有する」とは、ウイルスベクタ
ーが LLC-MK2またはCV-1細胞等の宿主細胞に感染した場
合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイル
ス粒子が産生されることを指す。また、本発明において
「DNA」とは、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAを含む。
ーが LLC-MK2またはCV-1細胞等の宿主細胞に感染した場
合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイル
ス粒子が産生されることを指す。また、本発明において
「DNA」とは、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAを含む。
【００１５】本発明において「遺伝子」とは遺伝物質を
指し、RNAおよびDNA等の核酸が含まれる。遺伝子の由来
に制限はなく、天然または人為的に設計された配列に由
来するものであり得る。人工的な蛋白質としては、例え
ば、他の蛋白質との融合蛋白質、ドミナントネガティブ
蛋白質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナント
ネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子およ
び可溶型細胞表面分子などの形態であり得る。あるい
は、感染症に関する細菌またはウイルスの抗原蛋白質の
部分ペプチドをコードする遺伝子であってもよい。ま
た、例えばアンチセンス核酸またはリボザイムなどのタ
ンパク質をコードしない核酸であってもよい。
指し、RNAおよびDNA等の核酸が含まれる。遺伝子の由来
に制限はなく、天然または人為的に設計された配列に由
来するものであり得る。人工的な蛋白質としては、例え
ば、他の蛋白質との融合蛋白質、ドミナントネガティブ
蛋白質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナント
ネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子およ
び可溶型細胞表面分子などの形態であり得る。あるい
は、感染症に関する細菌またはウイルスの抗原蛋白質の
部分ペプチドをコードする遺伝子であってもよい。ま
た、例えばアンチセンス核酸またはリボザイムなどのタ
ンパク質をコードしない核酸であってもよい。
【００１６】
【発明の実施の形態】パラミクソウイルスは、一般に、
エンベロープの内部にRNAとタンパク質からなる複合体
（リボヌクレオプロテイン; RNP）を含んでいる。RNPに
含まれるRNAはパラミクソウイルスのゲノムであるネガ
ティブ鎖（マイナス鎖）の一本鎖RNAであり、NPタンパ
ク質、Pタンパク質、およびLタンパク質がこのRNAに結
合して複合体を形成している。このRNPに含まれるRNAが
ウイルスゲノムの転写および複製のための鋳型となる
（Lamb, R.A., and D. Kolakofsky, 1996, Paramyxovir
idae : The viruses and their replication. pp.1177-
1204. In Fields Virology, 3rd edn. Fields, B. N.,
D. M. Knipe, and P. M. Howley et al. (ed.), Raven
Press, New York, N. Y.）。RNP複合体は、細胞内で自
立的にRNP複合体を複製し、遺伝子（複合体に含まれるR
NA）のコピー数を増やす。これにより、外来遺伝子を持
つベクターからの外来遺伝子の高い発現がもたらされ
る。
エンベロープの内部にRNAとタンパク質からなる複合体
（リボヌクレオプロテイン; RNP）を含んでいる。RNPに
含まれるRNAはパラミクソウイルスのゲノムであるネガ
ティブ鎖（マイナス鎖）の一本鎖RNAであり、NPタンパ
ク質、Pタンパク質、およびLタンパク質がこのRNAに結
合して複合体を形成している。このRNPに含まれるRNAが
ウイルスゲノムの転写および複製のための鋳型となる
（Lamb, R.A., and D. Kolakofsky, 1996, Paramyxovir
idae : The viruses and their replication. pp.1177-
1204. In Fields Virology, 3rd edn. Fields, B. N.,
D. M. Knipe, and P. M. Howley et al. (ed.), Raven
Press, New York, N. Y.）。RNP複合体は、細胞内で自
立的にRNP複合体を複製し、遺伝子（複合体に含まれるR
NA）のコピー数を増やす。これにより、外来遺伝子を持
つベクターからの外来遺伝子の高い発現がもたらされ
る。
【００１７】本発明のウイルスベクターは、通常、
（ａ）パラミクソウイルスに由来するネガティブ鎖一本
鎖RNAまたはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードする
ベクターDNAを、NP、P、およびL蛋白質を発現する細胞
（ヘルパー細胞）で転写させ、（ｂ）該細胞を培養し、
その培養上清からウイルス粒子を回収することにより調
製することができる。ベクターDNAから転写されたRNAは
NP、L、およびPタンパク質とRNP複合体を形成し、さら
にエンベロープ蛋白質を含む外殻に包まれたウイルス粒
子が形成する。
（ａ）パラミクソウイルスに由来するネガティブ鎖一本
鎖RNAまたはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードする
ベクターDNAを、NP、P、およびL蛋白質を発現する細胞
（ヘルパー細胞）で転写させ、（ｂ）該細胞を培養し、
その培養上清からウイルス粒子を回収することにより調
製することができる。ベクターDNAから転写されたRNAは
NP、L、およびPタンパク質とRNP複合体を形成し、さら
にエンベロープ蛋白質を含む外殻に包まれたウイルス粒
子が形成する。
【００１８】ヘルパー細胞で発現させる、ウイルスゲノ
ムをコードするDNA（ベクターDNA）は、ゲノムのマイナ
ス鎖（ネガティブ鎖RNA）またはその相補鎖（ポジティ
ブ鎖RNA）をコードしている。例えば、ネガティブ鎖一
本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNAをT7プロモー
ターの下流に連結させ、T7 RNA ポリメラーゼによりRNA
に転写させる。プロモータとしては、T7ポリメラーゼの
認識配列を含むもの以外にも所望のプロモーターを利用
することができる。あるいは、インビトロで転写させた
RNAをヘルパー細胞にトランスフェクトしてもよい。細
胞内で転写させる鎖は、ウイルスゲノムのポジティブ鎖
でもネガティブ鎖でもよいが、ポジティブ鎖が転写され
るようにすることが再構成の効率を上げるためには好ま
しい。
ムをコードするDNA（ベクターDNA）は、ゲノムのマイナ
ス鎖（ネガティブ鎖RNA）またはその相補鎖（ポジティ
ブ鎖RNA）をコードしている。例えば、ネガティブ鎖一
本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするDNAをT7プロモー
ターの下流に連結させ、T7 RNA ポリメラーゼによりRNA
に転写させる。プロモータとしては、T7ポリメラーゼの
認識配列を含むもの以外にも所望のプロモーターを利用
することができる。あるいは、インビトロで転写させた
RNAをヘルパー細胞にトランスフェクトしてもよい。細
胞内で転写させる鎖は、ウイルスゲノムのポジティブ鎖
でもネガティブ鎖でもよいが、ポジティブ鎖が転写され
るようにすることが再構成の効率を上げるためには好ま
しい。
【００１９】センダイウイルス（Sendai virus; SeV）
の場合、天然のウイルスのゲノムサイズは約15,000塩基
で、ネガティブ鎖においては 3'の短いリーダー領域に
続き、NP（ヌクレオキャプシド）、P（ホスホ）、M（マ
トリックス）、F（フュージョン）、HN（ヘマグルチニ
ン-ノイラミニダーゼ）、およびL（ラージ）蛋白質をコ
ードする６つの遺伝子が並んでおり、短い5'トレイラー
領域を他端に有する。本発明においては、複製能を有す
る限り、一部の遺伝子が欠損していてもよく、ウイルス
ゲノム上におけるこれらの遺伝子の配置は野生型と同じ
でなくてもよい。RNPの形成には M、HN、およびF蛋白質
は必要ないため、NP、P、およびLタンパク質の存在下で
このゲノムRNA（ポジティブ鎖またはネガティブ鎖）を
転写させることによりRNPが構築され、さらにこのRNPか
ら感染性のウイルス粒子が構築される。ベクターの再構
築は、例えばLLC-MK2細胞などで行わせることができ
る。NP、P、およびLタンパク質の供給は、各遺伝子をコ
ードする発現ベクターを細胞に導入することにより行わ
れ得る。また、各遺伝子は宿主細胞の染色体に組み込ま
れていてもよい。RNPを形成させるために発現させる N
P、P、およびL遺伝子は、ベクターのゲノムにコードさ
れる NP、P、およびL遺伝子と完全に同一である必要は
ない。すなわち、これらの遺伝子がコードする蛋白質の
アミノ酸配列は、RNPゲノムがコードするタンパク質の
アミノ酸配列そのままでなくとも、ゲノムRNAと共にRNP
を形成し、このRNPからの遺伝子発現を誘導する活性を
有する限り、変異を導入したり、あるいは他のウイルス
の相同遺伝子で代用してもよい。RNPが形成されれば、
このRNPから NP、P、およびL遺伝子が発現され、細胞内
で自立的にRNPが複製し、エンベロープタンパク質と共
にウイルスベクターが生産される。
の場合、天然のウイルスのゲノムサイズは約15,000塩基
で、ネガティブ鎖においては 3'の短いリーダー領域に
続き、NP（ヌクレオキャプシド）、P（ホスホ）、M（マ
トリックス）、F（フュージョン）、HN（ヘマグルチニ
ン-ノイラミニダーゼ）、およびL（ラージ）蛋白質をコ
ードする６つの遺伝子が並んでおり、短い5'トレイラー
領域を他端に有する。本発明においては、複製能を有す
る限り、一部の遺伝子が欠損していてもよく、ウイルス
ゲノム上におけるこれらの遺伝子の配置は野生型と同じ
でなくてもよい。RNPの形成には M、HN、およびF蛋白質
は必要ないため、NP、P、およびLタンパク質の存在下で
このゲノムRNA（ポジティブ鎖またはネガティブ鎖）を
転写させることによりRNPが構築され、さらにこのRNPか
ら感染性のウイルス粒子が構築される。ベクターの再構
築は、例えばLLC-MK2細胞などで行わせることができ
る。NP、P、およびLタンパク質の供給は、各遺伝子をコ
ードする発現ベクターを細胞に導入することにより行わ
れ得る。また、各遺伝子は宿主細胞の染色体に組み込ま
れていてもよい。RNPを形成させるために発現させる N
P、P、およびL遺伝子は、ベクターのゲノムにコードさ
れる NP、P、およびL遺伝子と完全に同一である必要は
ない。すなわち、これらの遺伝子がコードする蛋白質の
アミノ酸配列は、RNPゲノムがコードするタンパク質の
アミノ酸配列そのままでなくとも、ゲノムRNAと共にRNP
を形成し、このRNPからの遺伝子発現を誘導する活性を
有する限り、変異を導入したり、あるいは他のウイルス
の相同遺伝子で代用してもよい。RNPが形成されれば、
このRNPから NP、P、およびL遺伝子が発現され、細胞内
で自立的にRNPが複製し、エンベロープタンパク質と共
にウイルスベクターが生産される。
【００２０】産生されたウイルスは、培養細胞、鶏卵、
個体（例えばマウスなどの哺乳動物）などに再感染させ
て増幅または継代することができる。また、ウイルスベ
クターの再構成で形成されるRNPをLLC-MK2細胞などの宿
主細胞に再度導入して培養することにより、本発明のウ
イルスベクターを増幅することもできる。この過程は、
（ａ）パラミクソウイルスに由来するネガティブ鎖一本
鎖RNA、並びに NP、P/C、および L 蛋白質からなる複合
体を細胞に導入する工程、および（ｂ）該細胞を培養
し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程、を
含む。
個体（例えばマウスなどの哺乳動物）などに再感染させ
て増幅または継代することができる。また、ウイルスベ
クターの再構成で形成されるRNPをLLC-MK2細胞などの宿
主細胞に再度導入して培養することにより、本発明のウ
イルスベクターを増幅することもできる。この過程は、
（ａ）パラミクソウイルスに由来するネガティブ鎖一本
鎖RNA、並びに NP、P/C、および L 蛋白質からなる複合
体を細胞に導入する工程、および（ｂ）該細胞を培養
し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程、を
含む。
【００２１】RNPを細胞に導入するには、例えばリポフ
ェクトアミンやポリカチオニックリポソームなどと共に
複合体を形成させて導入することが可能である。具体的
には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。
例えば、DOTMA（Boehringer）、Superfect（QIAGEN #30
1305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Boehringer #1811169）
などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐた
め、クロロキンを加えることもできる（Calos, M.P., 1
983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。
ェクトアミンやポリカチオニックリポソームなどと共に
複合体を形成させて導入することが可能である。具体的
には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。
例えば、DOTMA（Boehringer）、Superfect（QIAGEN #30
1305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Boehringer #1811169）
などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐた
め、クロロキンを加えることもできる（Calos, M.P., 1
983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。
【００２２】ウイルス再構成の際に、ゲノムRNAがコー
ドするエンベロープタンパク質以外のエンベロープ蛋白
質を細胞で発現させてもよい。このようなタンパク質と
しては、他のウイルスのエンベロープタンパク質、例え
ば水疱性口内炎ウイルス（VSV）のGタンパク質（VSV-
G）を挙げることができる。本発明のパラミクソウイル
スベクターは、VSV-Gタンパク質などのように、ゲノム
が由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロ
ープタンパク質を含むベクターであってもよい。また、
ウイルスのエンベロープタンパク質以外にも、例えば、
特定の細胞に接着しうるような、接着因子、リガンド、
受容体等由来のポリペプチドを細胞外領域に有し、ウイ
ルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有
するキメラタンパク質などを用いることが可能である。
これにより、特定の組織を標的とするベクターを作り出
すこともできる。これらはウイルスゲノムにコードされ
ていてもよいし、ウイルスベクターの再構成時に、ゲノ
ム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染
色体上の遺伝子など）の発現により供給されてもよい。
ドするエンベロープタンパク質以外のエンベロープ蛋白
質を細胞で発現させてもよい。このようなタンパク質と
しては、他のウイルスのエンベロープタンパク質、例え
ば水疱性口内炎ウイルス（VSV）のGタンパク質（VSV-
G）を挙げることができる。本発明のパラミクソウイル
スベクターは、VSV-Gタンパク質などのように、ゲノム
が由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロ
ープタンパク質を含むベクターであってもよい。また、
ウイルスのエンベロープタンパク質以外にも、例えば、
特定の細胞に接着しうるような、接着因子、リガンド、
受容体等由来のポリペプチドを細胞外領域に有し、ウイ
ルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有
するキメラタンパク質などを用いることが可能である。
これにより、特定の組織を標的とするベクターを作り出
すこともできる。これらはウイルスゲノムにコードされ
ていてもよいし、ウイルスベクターの再構成時に、ゲノ
ム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染
色体上の遺伝子など）の発現により供給されてもよい。
【００２３】また、本発明のウイルスベクターは、例え
ば、SeV蛋白質による免疫原性を低下させるために、ま
たは、RNAの転写効率や複製効率を高めるために、ベク
ターに含まれるウイルス遺伝子が改変されたものであっ
てもよい。具体的には、例えば複製因子であるNP遺伝
子、P/C遺伝子およびL遺伝子の少なくとも一つを改変
し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。
また、構造体蛋白質の１つであるHN蛋白質は、赤血球凝
集素であるヘマグルチニン（hemagglutinin）活性とノ
イラミニダーゼ（neuraminidase）活性との両者の活性
を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれ
ば、血液中でのウイルスの安定性を向上させることが可
能であろうし、例えば後者の活性を改変することによ
り、感染能を調節することも可能である。また、膜融合
に関わるF蛋白質を改変することにより、膜融合リポソ
ームの融合能を調節することもできる。また、例えば、
細胞表面の抗原分子となりうるF蛋白質やHN蛋白質の抗
原提示エピトープ等を解析することが再構成系の確立に
より可能となったため、これを利用してこれらの蛋白質
に関する抗原提示能を弱めたセンダイウイルスを作製す
ることもできる。
ば、SeV蛋白質による免疫原性を低下させるために、ま
たは、RNAの転写効率や複製効率を高めるために、ベク
ターに含まれるウイルス遺伝子が改変されたものであっ
てもよい。具体的には、例えば複製因子であるNP遺伝
子、P/C遺伝子およびL遺伝子の少なくとも一つを改変
し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。
また、構造体蛋白質の１つであるHN蛋白質は、赤血球凝
集素であるヘマグルチニン（hemagglutinin）活性とノ
イラミニダーゼ（neuraminidase）活性との両者の活性
を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれ
ば、血液中でのウイルスの安定性を向上させることが可
能であろうし、例えば後者の活性を改変することによ
り、感染能を調節することも可能である。また、膜融合
に関わるF蛋白質を改変することにより、膜融合リポソ
ームの融合能を調節することもできる。また、例えば、
細胞表面の抗原分子となりうるF蛋白質やHN蛋白質の抗
原提示エピトープ等を解析することが再構成系の確立に
より可能となったため、これを利用してこれらの蛋白質
に関する抗原提示能を弱めたセンダイウイルスを作製す
ることもできる。
【００２４】本発明のウイルスベクターは、ネガティブ
鎖一本鎖RNA中に外来遺伝子をコードしているか、また
は外来遺伝子を挿入するための部位を有する。外来遺伝
子としては、標的細胞中で発現させたい所望の遺伝子を
用いることが可能である。例えば、遺伝子治療などを目
的とする場合には、該ウイルスベクターDNAに対象とな
る疾患の治療用遺伝子を挿入する。外来遺伝子は、ウイ
ルスの各遺伝子（NP、P、M、F、HN、およびL遺伝子）の
下流に挿入することができる（実施例参照）。ここで
「下流」とは、タンパク質をコードするセンス鎖におい
て3'側に隣接する部位をさす。すなわち、ネガティブ鎖
RNA（またはDNA）であれば、遺伝子の下流とは該遺伝子
の5'側隣接部位であり、ポジティブ鎖RNA（またはDNA）
であれば、該遺伝子の3'側隣接部位を言う。
鎖一本鎖RNA中に外来遺伝子をコードしているか、また
は外来遺伝子を挿入するための部位を有する。外来遺伝
子としては、標的細胞中で発現させたい所望の遺伝子を
用いることが可能である。例えば、遺伝子治療などを目
的とする場合には、該ウイルスベクターDNAに対象とな
る疾患の治療用遺伝子を挿入する。外来遺伝子は、ウイ
ルスの各遺伝子（NP、P、M、F、HN、およびL遺伝子）の
下流に挿入することができる（実施例参照）。ここで
「下流」とは、タンパク質をコードするセンス鎖におい
て3'側に隣接する部位をさす。すなわち、ネガティブ鎖
RNA（またはDNA）であれば、遺伝子の下流とは該遺伝子
の5'側隣接部位であり、ポジティブ鎖RNA（またはDNA）
であれば、該遺伝子の3'側隣接部位を言う。
【００２５】本発明は、特に外来遺伝子の発現を制限し
たい場合に有用である。外来遺伝子をネガティブ鎖ゲノ
ムの下流に挿入するほど、外来遺伝子の発現レベルを減
弱させることができる。この場合、本発明のベクターと
しては、外来遺伝子を保持し、かつ複製能を有するパラ
ミクソウイルスベクターであって、該ベクターに含まれ
るネガティブ鎖ゲノムRNAにおいて、3'端から２番目に
位置するウイルスタンパク質をコードする遺伝子より少
なくとも下流に外来遺伝子が位置しているベクターが好
ましい。より好ましくは、外来遺伝子は、ネガティブ鎖
ゲノムRNAにおいて、3'端から３番目、さらに好ましく
は４番目、さらに好ましくは５番目、さらに好ましくは
６番目に位置するウイルスタンパク質をコードする遺伝
子より少なくとも下流に位置している。また本発明は、
これら本発明のパラミクソウイルスベクターにより外来
遺伝子の発現レベルを制御する方法に関する。外来遺伝
子を、ネガティブ鎖ゲノムの3'側に位置させる程、その
発現レベルを相対的に上昇させることができ、逆に5'側
に位置させる程、発現レベルを低下させることができ
る。発現レベルを相対的に低下させたい場合は、例え
ば、外来遺伝子をパラミクソウイルスベクターに含まれ
るネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端から１番目に位置する
ウイルスタンパク質をコードする遺伝子と２番目のウイ
ルスタンパク質をコードする遺伝子の間に、より好まし
くは同２番目と３番目の間に、さらに好ましくは同３番
目と４番目の間に、さらに好ましくは同４番目と５番目
の間に、さらに好ましくは同５番目と６番目の間に、さ
らに好ましくは同６番目とトレイラー配列の間に位置さ
せる。これにより、外来遺伝子の発現を所望のレベルに
制御することが可能である。
たい場合に有用である。外来遺伝子をネガティブ鎖ゲノ
ムの下流に挿入するほど、外来遺伝子の発現レベルを減
弱させることができる。この場合、本発明のベクターと
しては、外来遺伝子を保持し、かつ複製能を有するパラ
ミクソウイルスベクターであって、該ベクターに含まれ
るネガティブ鎖ゲノムRNAにおいて、3'端から２番目に
位置するウイルスタンパク質をコードする遺伝子より少
なくとも下流に外来遺伝子が位置しているベクターが好
ましい。より好ましくは、外来遺伝子は、ネガティブ鎖
ゲノムRNAにおいて、3'端から３番目、さらに好ましく
は４番目、さらに好ましくは５番目、さらに好ましくは
６番目に位置するウイルスタンパク質をコードする遺伝
子より少なくとも下流に位置している。また本発明は、
これら本発明のパラミクソウイルスベクターにより外来
遺伝子の発現レベルを制御する方法に関する。外来遺伝
子を、ネガティブ鎖ゲノムの3'側に位置させる程、その
発現レベルを相対的に上昇させることができ、逆に5'側
に位置させる程、発現レベルを低下させることができ
る。発現レベルを相対的に低下させたい場合は、例え
ば、外来遺伝子をパラミクソウイルスベクターに含まれ
るネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端から１番目に位置する
ウイルスタンパク質をコードする遺伝子と２番目のウイ
ルスタンパク質をコードする遺伝子の間に、より好まし
くは同２番目と３番目の間に、さらに好ましくは同３番
目と４番目の間に、さらに好ましくは同４番目と５番目
の間に、さらに好ましくは同５番目と６番目の間に、さ
らに好ましくは同６番目とトレイラー配列の間に位置さ
せる。これにより、外来遺伝子の発現を所望のレベルに
制御することが可能である。
【００２６】例えば野生型パラミクソウイルスにおいて
は、ウイルス遺伝子は、ネガティブゲノムの3'から順に
NP、P、M、F、HN、およびLの順で配置しているが、本発
明のベクターにおいてはこれ以外の配置であってもよ
い。前後の遺伝子の発現を妨げないようにするため、外
来遺伝子の前および/または後ろに適宜 E-I-S配列（転
写終結配列−介在配列−転写開始配列）またはその部分
を挿入する。例えば、センダイウイルスゲノムをコード
するDNAにおいて外来遺伝子を導入する場合には、ウイ
ルスタンパク質をコードする遺伝子間に6の倍数の塩基
数を有する配列を挿入することが望ましい（Journal of
Virology,Vol.67,No.8,1993,p.4822-4830）。挿入した
外来性遺伝子の発現量は、外来遺伝子の5'側（先頭）に
付加する転写開始配列の種類により調節することができ
る。また、遺伝子挿入の位置、また遺伝子の前後の塩基
配列により調節しうる。
は、ウイルス遺伝子は、ネガティブゲノムの3'から順に
NP、P、M、F、HN、およびLの順で配置しているが、本発
明のベクターにおいてはこれ以外の配置であってもよ
い。前後の遺伝子の発現を妨げないようにするため、外
来遺伝子の前および/または後ろに適宜 E-I-S配列（転
写終結配列−介在配列−転写開始配列）またはその部分
を挿入する。例えば、センダイウイルスゲノムをコード
するDNAにおいて外来遺伝子を導入する場合には、ウイ
ルスタンパク質をコードする遺伝子間に6の倍数の塩基
数を有する配列を挿入することが望ましい（Journal of
Virology,Vol.67,No.8,1993,p.4822-4830）。挿入した
外来性遺伝子の発現量は、外来遺伝子の5'側（先頭）に
付加する転写開始配列の種類により調節することができ
る。また、遺伝子挿入の位置、また遺伝子の前後の塩基
配列により調節しうる。
【００２７】実施例に示すように、センダイウイルスに
おいては、挿入位置がネガティブ鎖RNAの3'端に近いほ
ど（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置において
は、NP遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量
が高い。外来遺伝子の高い発現を得るためには、ウイル
スタンパク質をコードする遺伝子のうち最も上流（ネガ
ティブ鎖の3'側）の遺伝子の下流（すなわち１番目の遺
伝子と２番目の遺伝子の間）に外来遺伝子を挿入する。
具体的には、野生型ゲノムの遺伝子配置においてはNP遺
伝子の下流（ネガティブ鎖においてはNP遺伝子の5'隣接
部位）、つまりNP遺伝子とP遺伝子の間に外来遺伝子を
挿入する。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子のう
ち上流（ネガティブ鎖の3'側）から２番目と３番目の間
に外来遺伝子を挿入すると、１番目と２番目の間に挿入
した場合よりも減弱した発現が得られる。この場合、野
生型ゲノムの遺伝子配置においてはP遺伝子の下流（ネ
ガティブ鎖においてはP遺伝子の5'隣接部位）、つまりP
遺伝子とM遺伝子の間に外来遺伝子を挿入することが好
ましい。挿入位置がネガティブ鎖RNAの5'端に近いほど
（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置においては、
L遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が低
い。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子のうち上流
（ネガティブ鎖の3'側）から３番目と４番目の間に外来
遺伝子を挿入すると、より減弱した発現が得られ、４番
目と５番目の間に外来遺伝子を挿入すると、さらに発現
量が低く抑えられる。３番目と４番目の間に外来遺伝子
を挿入する場合、野生型ゲノムの遺伝子配置においては
M遺伝子の下流（ネガティブ鎖においてはM遺伝子の5'隣
接部位）、つまりM遺伝子とF遺伝子の間に外来遺伝子を
挿入することが好ましい。４番目と５番目の間に外来遺
伝子を挿入する場合、野生型ゲノムの遺伝子配置におい
てはF遺伝子の下流（ネガティブ鎖においてはF遺伝子の
5'隣接部位）、つまりF遺伝子とHN遺伝子の間に外来遺
伝子を挿入することが好ましい。さらに外来遺伝子の発
現を低く抑えるためには、ウイルスタンパク質をコード
する遺伝子のうち最も下流（ネガティブ鎖の5'側）にあ
るウイルスタンパク質をコードする遺伝子の上流（すな
わち5'側から１番目の遺伝子と２番目の遺伝子の間；野
生型ウイルスゲノムにおいては、3'側から５番目の遺伝
子と６番目に遺伝子の間）、より低い発現を得るには下
流（すなわちネガティブ鎖の5'端から１番目の遺伝子と
トレイラー配列の間、野生型ゲノムにおいては3'側から
６番目の遺伝子とトレイラー配列の間）に外来遺伝子を
挿入する。具体的には、野生型ゲノムの遺伝子配置にお
いてはL遺伝子の上流（ネガティブ鎖においてはL遺伝子
の3'隣接部位）または下流（ネガティブ鎖においてはL
遺伝子の5'隣接部位）、すなわち、それぞれHN遺伝子と
L遺伝子の間またはL遺伝子とトレイラー配列の間に外来
遺伝子を挿入する。本発明のベクターは、このように挿
入した以外に位置に他の外来遺伝子を保持していてもよ
い。外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量
を得るために、また前後のウイルスタンパク質をコード
する遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節す
ることができる。
おいては、挿入位置がネガティブ鎖RNAの3'端に近いほ
ど（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置において
は、NP遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量
が高い。外来遺伝子の高い発現を得るためには、ウイル
スタンパク質をコードする遺伝子のうち最も上流（ネガ
ティブ鎖の3'側）の遺伝子の下流（すなわち１番目の遺
伝子と２番目の遺伝子の間）に外来遺伝子を挿入する。
具体的には、野生型ゲノムの遺伝子配置においてはNP遺
伝子の下流（ネガティブ鎖においてはNP遺伝子の5'隣接
部位）、つまりNP遺伝子とP遺伝子の間に外来遺伝子を
挿入する。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子のう
ち上流（ネガティブ鎖の3'側）から２番目と３番目の間
に外来遺伝子を挿入すると、１番目と２番目の間に挿入
した場合よりも減弱した発現が得られる。この場合、野
生型ゲノムの遺伝子配置においてはP遺伝子の下流（ネ
ガティブ鎖においてはP遺伝子の5'隣接部位）、つまりP
遺伝子とM遺伝子の間に外来遺伝子を挿入することが好
ましい。挿入位置がネガティブ鎖RNAの5'端に近いほど
（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置においては、
L遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が低
い。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子のうち上流
（ネガティブ鎖の3'側）から３番目と４番目の間に外来
遺伝子を挿入すると、より減弱した発現が得られ、４番
目と５番目の間に外来遺伝子を挿入すると、さらに発現
量が低く抑えられる。３番目と４番目の間に外来遺伝子
を挿入する場合、野生型ゲノムの遺伝子配置においては
M遺伝子の下流（ネガティブ鎖においてはM遺伝子の5'隣
接部位）、つまりM遺伝子とF遺伝子の間に外来遺伝子を
挿入することが好ましい。４番目と５番目の間に外来遺
伝子を挿入する場合、野生型ゲノムの遺伝子配置におい
てはF遺伝子の下流（ネガティブ鎖においてはF遺伝子の
5'隣接部位）、つまりF遺伝子とHN遺伝子の間に外来遺
伝子を挿入することが好ましい。さらに外来遺伝子の発
現を低く抑えるためには、ウイルスタンパク質をコード
する遺伝子のうち最も下流（ネガティブ鎖の5'側）にあ
るウイルスタンパク質をコードする遺伝子の上流（すな
わち5'側から１番目の遺伝子と２番目の遺伝子の間；野
生型ウイルスゲノムにおいては、3'側から５番目の遺伝
子と６番目に遺伝子の間）、より低い発現を得るには下
流（すなわちネガティブ鎖の5'端から１番目の遺伝子と
トレイラー配列の間、野生型ゲノムにおいては3'側から
６番目の遺伝子とトレイラー配列の間）に外来遺伝子を
挿入する。具体的には、野生型ゲノムの遺伝子配置にお
いてはL遺伝子の上流（ネガティブ鎖においてはL遺伝子
の3'隣接部位）または下流（ネガティブ鎖においてはL
遺伝子の5'隣接部位）、すなわち、それぞれHN遺伝子と
L遺伝子の間またはL遺伝子とトレイラー配列の間に外来
遺伝子を挿入する。本発明のベクターは、このように挿
入した以外に位置に他の外来遺伝子を保持していてもよ
い。外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量
を得るために、また前後のウイルスタンパク質をコード
する遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節す
ることができる。
【００２８】外来遺伝子を容易に挿入できるようにする
ために、挿入部位にクローニングサイトを設計すること
ができる。クローニングサイトは、典型的には制限酵素
の認識配列とすることができる。好ましくは、挿入した
い外来遺伝子中にその部位が存在しそうにない制限酵素
部位を設計する。このような制限酵素としては、8bp認
識の制限酵素など、長い認識配列を有するものが好まし
い。8bp認識の制限酵素としては、例えば Asc I（GG↓C
GCGCC）、Fse I（GGCCGG↓CC）、Not I（GC↓GGCCG
C）、Pac I（TTAAT↓TAA）、Pme I（GTTT↓AAAC）、Sfi
I（GGCCNNNN↓NGGCC）、Sgf I（GCGAT↓CGC）、Srf I
（GCCC↓GGGC）、Sse232 I（CG↓CCGGCG）、Sse8387 I
（CCTGCA↓GG）、および Swa I（ATTT↓AAAT）などが挙
げられるがこれらに制限されない。クローニングサイト
は、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチ
クローニングサイトとしてもよい。また、制限酵素以外
のエンドヌクレアーゼにより切断される配列であっても
よい。また、クローニングサイトを組換え酵素の認識配
列として、組換えにより外来遺伝子を挿入することも考
えられる。ウイルスゲノムをコードするDNA中にこれら
の配列を設計することは、公知の変異導入法により行い
得る。さらに、外来遺伝子挿入部位を予め分断しておき
クローニングサイトとすることも考えられる。分断した
ベクターDNAの5'末端を脱リン酸化しておけば、外来遺
伝子が挿入されたクローンを優先的に生じさせることが
できる。また、分断したベクターDNAの3'末端をTの一塩
基突出末端にしておけば、PCRにより増幅した外来遺伝
子（末端がAの突出末端になっている）を簡便にクロー
ニングすることも可能である。ベクターDNAがプラスミ
ドのように環状DNAであれば、クローニングサイトを分
断しておいても両端が遊離しないため、高いライゲーシ
ョン効率を得ることができる。
ために、挿入部位にクローニングサイトを設計すること
ができる。クローニングサイトは、典型的には制限酵素
の認識配列とすることができる。好ましくは、挿入した
い外来遺伝子中にその部位が存在しそうにない制限酵素
部位を設計する。このような制限酵素としては、8bp認
識の制限酵素など、長い認識配列を有するものが好まし
い。8bp認識の制限酵素としては、例えば Asc I（GG↓C
GCGCC）、Fse I（GGCCGG↓CC）、Not I（GC↓GGCCG
C）、Pac I（TTAAT↓TAA）、Pme I（GTTT↓AAAC）、Sfi
I（GGCCNNNN↓NGGCC）、Sgf I（GCGAT↓CGC）、Srf I
（GCCC↓GGGC）、Sse232 I（CG↓CCGGCG）、Sse8387 I
（CCTGCA↓GG）、および Swa I（ATTT↓AAAT）などが挙
げられるがこれらに制限されない。クローニングサイト
は、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチ
クローニングサイトとしてもよい。また、制限酵素以外
のエンドヌクレアーゼにより切断される配列であっても
よい。また、クローニングサイトを組換え酵素の認識配
列として、組換えにより外来遺伝子を挿入することも考
えられる。ウイルスゲノムをコードするDNA中にこれら
の配列を設計することは、公知の変異導入法により行い
得る。さらに、外来遺伝子挿入部位を予め分断しておき
クローニングサイトとすることも考えられる。分断した
ベクターDNAの5'末端を脱リン酸化しておけば、外来遺
伝子が挿入されたクローンを優先的に生じさせることが
できる。また、分断したベクターDNAの3'末端をTの一塩
基突出末端にしておけば、PCRにより増幅した外来遺伝
子（末端がAの突出末端になっている）を簡便にクロー
ニングすることも可能である。ベクターDNAがプラスミ
ドのように環状DNAであれば、クローニングサイトを分
断しておいても両端が遊離しないため、高いライゲーシ
ョン効率を得ることができる。
【００２９】ウイルスゲノムをコードするDNA（ベクタ
ーDNA）への外来遺伝子の挿入は、例えば、Hasan, M.
K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-282
0、Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587及びY
u, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466の記載に
準じて、次のようにして構築することができる。
ーDNA）への外来遺伝子の挿入は、例えば、Hasan, M.
K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-282
0、Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587及びY
u, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466の記載に
準じて、次のようにして構築することができる。
【００３０】まず、所望の外来遺伝子のcDNA塩基配列を
含むDNA試料を用意する。DNA試料は、25ng/μl以上の濃
度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが
好ましい。以下、外来遺伝子をNotI部位を利用してウイ
ルスゲノムをコードするDNAに挿入する場合を例にとっ
て説明する。目的とするcDNA塩基配列の中にNotI認識部
位が含まれる場合は、部位特異的変異挿入法などを用い
て、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基
配列を改変し、NotI部位を予め除去しておくことが好ま
しい。この試料から所望の遺伝子断片をPCRにより増幅
回収する。増幅された断片の両端がNotI部位とし、さら
に一端にセンダイウイルスの転写終結配列（Ｅ）、介在
配列（Ｉ）及び転写開始配列（Ｓ）（ＥＩＳ配列）のコ
ピーを付加するために、NotI制限酵素切断部位配列及び
転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）及び転写開始配列
（Ｓ）と目的遺伝子の一部の配列を含むプライマー対と
して、フォワード側合成DNA配列及びリバース側合成DNA
配列(アンチセンス鎖)を作成する。
含むDNA試料を用意する。DNA試料は、25ng/μl以上の濃
度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが
好ましい。以下、外来遺伝子をNotI部位を利用してウイ
ルスゲノムをコードするDNAに挿入する場合を例にとっ
て説明する。目的とするcDNA塩基配列の中にNotI認識部
位が含まれる場合は、部位特異的変異挿入法などを用い
て、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基
配列を改変し、NotI部位を予め除去しておくことが好ま
しい。この試料から所望の遺伝子断片をPCRにより増幅
回収する。増幅された断片の両端がNotI部位とし、さら
に一端にセンダイウイルスの転写終結配列（Ｅ）、介在
配列（Ｉ）及び転写開始配列（Ｓ）（ＥＩＳ配列）のコ
ピーを付加するために、NotI制限酵素切断部位配列及び
転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）及び転写開始配列
（Ｓ）と目的遺伝子の一部の配列を含むプライマー対と
して、フォワード側合成DNA配列及びリバース側合成DNA
配列(アンチセンス鎖)を作成する。
【００３１】例えば、フォワード側合成DNA配列は、Not
Iによる切断を保証するために 5'側に任意の２以上のヌ
クレオチド（好ましくはGCGおよびGCCなどのNotI認識部
位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはACT
T）を選択し、その3'側にNotI認識部位gcggccgcを付加
し、さらにその3'側にスペーサー配列として任意の９塩
基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加し、さら
にその3'側に所望のcDNAの開始コドンATGからこれを含
めてORFの約25塩基相当の配列を付加した形態とする。
最後の塩基はGまたはCとなるように該所望のcDNAから約
25塩基を選択してフォワード側合成オリゴDNAの3'の末
端とすることが好ましい。
Iによる切断を保証するために 5'側に任意の２以上のヌ
クレオチド（好ましくはGCGおよびGCCなどのNotI認識部
位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはACT
T）を選択し、その3'側にNotI認識部位gcggccgcを付加
し、さらにその3'側にスペーサー配列として任意の９塩
基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加し、さら
にその3'側に所望のcDNAの開始コドンATGからこれを含
めてORFの約25塩基相当の配列を付加した形態とする。
最後の塩基はGまたはCとなるように該所望のcDNAから約
25塩基を選択してフォワード側合成オリゴDNAの3'の末
端とすることが好ましい。
【００３２】リバース側合成DNA配列は5'側から任意の
２以上のヌクレオチド（好ましくはGCGおよびGCCなどの
NotI認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ま
しくはACTT）を選択し、その3'側にNotI認識部位gcggcc
gcを付加し、さらにその3'側に長さを調節するための挿
入断片のオリゴDNAを付加する。このオリゴDNAの長さ
は、NotI認識部位gcggccgcを含め、cDNAの相補鎖塩基配
列と後述するセンダイウイルスに由来するセンダイウイ
ルスゲノムのＥＩＳ塩基配列の合計が６の倍数になるよ
うに塩基数を設計する（いわゆる「6のルール（rule of
six）」；Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72:891-
899, 1998）。さらに挿入断片の3'側にセンダイウイル
スのＳ配列の相補鎖配列、好ましくは5'-CTTTCACCCT-3'
(配列番号：１）、Ｉ配列、好ましくは5'-AAG-3'、Ｅ配
列の相補鎖配列、好ましくは5'-TTTTTCTTACTACGG-3'(配
列番号：２）、さらにその3'側に所望のcDNA配列の終始
コドンから逆に数えて約25塩基相当の相補鎖の最後の塩
基がＧまたはＣになるように長さを選択して配列を付加
し、リバース側合成オリゴDNAの3'の末端とする。
２以上のヌクレオチド（好ましくはGCGおよびGCCなどの
NotI認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ま
しくはACTT）を選択し、その3'側にNotI認識部位gcggcc
gcを付加し、さらにその3'側に長さを調節するための挿
入断片のオリゴDNAを付加する。このオリゴDNAの長さ
は、NotI認識部位gcggccgcを含め、cDNAの相補鎖塩基配
列と後述するセンダイウイルスに由来するセンダイウイ
ルスゲノムのＥＩＳ塩基配列の合計が６の倍数になるよ
うに塩基数を設計する（いわゆる「6のルール（rule of
six）」；Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72:891-
899, 1998）。さらに挿入断片の3'側にセンダイウイル
スのＳ配列の相補鎖配列、好ましくは5'-CTTTCACCCT-3'
(配列番号：１）、Ｉ配列、好ましくは5'-AAG-3'、Ｅ配
列の相補鎖配列、好ましくは5'-TTTTTCTTACTACGG-3'(配
列番号：２）、さらにその3'側に所望のcDNA配列の終始
コドンから逆に数えて約25塩基相当の相補鎖の最後の塩
基がＧまたはＣになるように長さを選択して配列を付加
し、リバース側合成オリゴDNAの3'の末端とする。
【００３３】PCRは、例えば、ExTaqポリメラーゼ（宝酒
造）を用いる通常の方法を用いることができる。好まし
くはVentポリメラーゼ（NEB）を用いて行い、増幅した
目的断片はNotIで消化した後、プラスミドベクターpBlu
escriptのNotI部位に挿入する。得られたPCR産物の塩基
配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミ
ドを選択する。このプラスミドから挿入断片をNotIで切
り出し、ゲノムcDNAを含むプラスミドのNotI部位にクロ
ーニングする。またプラスミドベクターpBluescriptを
介さずにNotI部位に直接挿入し、組換えセンダイウイル
スcDNAを得ることも可能である。
造）を用いる通常の方法を用いることができる。好まし
くはVentポリメラーゼ（NEB）を用いて行い、増幅した
目的断片はNotIで消化した後、プラスミドベクターpBlu
escriptのNotI部位に挿入する。得られたPCR産物の塩基
配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミ
ドを選択する。このプラスミドから挿入断片をNotIで切
り出し、ゲノムcDNAを含むプラスミドのNotI部位にクロ
ーニングする。またプラスミドベクターpBluescriptを
介さずにNotI部位に直接挿入し、組換えセンダイウイル
スcDNAを得ることも可能である。
【００３４】ウイルスゲノムをコードするDNAは、適当
な転写プロモーターを連結してベクターDNAを構築し、
これを試験管内または細胞内で転写させ、ウイルスの
L、P、およびNPタンパク質の共存下でRNPを再構成さ
せ、このRNPを含むウイルスベクターを生成させること
ができる。本発明は、パラミクソウイルスのL、P、およ
びNPタンパク質の共存下で本発明のパラミクソウイルス
ベクターのゲノムをコードするDNAを転写させる工程を
含む、該ベクターの製造方法を提供する。また本発明
は、該DNAからなる、本発明のパラミクソウイルスベク
ター製造用DNAを提供する。また本発明は、本発明のパ
ラミクソウイルスベクターを製造するための、該ベクタ
ーのゲノムをコードするDNAの使用に関する。ウイルス
ベクターDNAからのウイルスの再構成は公知の方法に従
って行うことができる（国際公開97/16539号;国際公開9
7/16538号; Durbin, A.P. et al., 1997, Virology 23
5: 323-332; Whelan, S.P. et al., 1995, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M.J. et a
l., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et a
l., 1995,EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N.D. et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garc
in, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato,
A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M.
D. and Barrett, T., 1997,J. Virol. 71: 1265-1271;
Bridgen, A. and Elliott, R.M., 1996, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 93: 15400-15404）。これらの方法によ
り、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬
病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、
センダイウイルスなどを含むパラミクソウイルス科のウ
イルスベクターをDNAからウイルスを再構成させること
ができる。
な転写プロモーターを連結してベクターDNAを構築し、
これを試験管内または細胞内で転写させ、ウイルスの
L、P、およびNPタンパク質の共存下でRNPを再構成さ
せ、このRNPを含むウイルスベクターを生成させること
ができる。本発明は、パラミクソウイルスのL、P、およ
びNPタンパク質の共存下で本発明のパラミクソウイルス
ベクターのゲノムをコードするDNAを転写させる工程を
含む、該ベクターの製造方法を提供する。また本発明
は、該DNAからなる、本発明のパラミクソウイルスベク
ター製造用DNAを提供する。また本発明は、本発明のパ
ラミクソウイルスベクターを製造するための、該ベクタ
ーのゲノムをコードするDNAの使用に関する。ウイルス
ベクターDNAからのウイルスの再構成は公知の方法に従
って行うことができる（国際公開97/16539号;国際公開9
7/16538号; Durbin, A.P. et al., 1997, Virology 23
5: 323-332; Whelan, S.P. et al., 1995, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M.J. et a
l., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et a
l., 1995,EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N.D. et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garc
in, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato,
A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M.
D. and Barrett, T., 1997,J. Virol. 71: 1265-1271;
Bridgen, A. and Elliott, R.M., 1996, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 93: 15400-15404）。これらの方法によ
り、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬
病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、
センダイウイルスなどを含むパラミクソウイルス科のウ
イルスベクターをDNAからウイルスを再構成させること
ができる。
【００３５】例えば、ベクターDNAを細胞内に導入する
方法には、次のような方法、目的の細胞が取り込める
ようなDNA沈殿物を作る方法、目的の細胞による取り
こみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つ、
DNAを含む複合体を作る方法、目的の細胞膜に、DNA分
子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによっ
て瞬間的に開ける方法などがある。
方法には、次のような方法、目的の細胞が取り込める
ようなDNA沈殿物を作る方法、目的の細胞による取り
こみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つ、
DNAを含む複合体を作る方法、目的の細胞膜に、DNA分
子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによっ
て瞬間的に開ける方法などがある。
【００３６】としては、種々のトランスフェクション
試薬が利用できる。例えば、DOTMA（Boehringer）、Sup
erfect（QIAGEN #301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Boe
hringer #1811169）などが挙げられる。としては例え
ばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が
挙げられ、この方法によって細胞内に入ったDNAは貧食
小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のDNAが入る
ことが知られている（Graham, F.L. and Van Der Eb,
J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silvers
tein, S., 1977, Cell 11: 223）。ChenおよびOkayama
はトランスファー技術の最適化を検討し、1) 細胞を共
沈殿物のインキュベーション条件を 2〜4％ CO2 、35
℃、15〜24時間、2) DNAは直鎖状より環状のものが活性
が高く、3)沈殿混液中のDNA濃度が 20〜30μg/mlのとき
最適な沈殿が得られると報告している（Chen, C. and O
kayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745）。の
方法は、一過的なトランスフェクションに適している。
古くはDEAE-デキストラン（Sigma #D-9885 M.W. 5×105
）混液を所望のDNA濃度比で調製し、トランスフェクシ
ョンを行う方法が知られている。複合体の多くはエンド
ソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるため
にクロロキンを加えることもできる（Calos, M.P., 198
3, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。の方法
は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないとい
う点でやの方法に比べて汎用性が高い。効率はパル
ス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャッ
プ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、DNA濃度、細
胞密度の最適条件下で良いとされている。
試薬が利用できる。例えば、DOTMA（Boehringer）、Sup
erfect（QIAGEN #301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Boe
hringer #1811169）などが挙げられる。としては例え
ばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が
挙げられ、この方法によって細胞内に入ったDNAは貧食
小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のDNAが入る
ことが知られている（Graham, F.L. and Van Der Eb,
J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silvers
tein, S., 1977, Cell 11: 223）。ChenおよびOkayama
はトランスファー技術の最適化を検討し、1) 細胞を共
沈殿物のインキュベーション条件を 2〜4％ CO2 、35
℃、15〜24時間、2) DNAは直鎖状より環状のものが活性
が高く、3)沈殿混液中のDNA濃度が 20〜30μg/mlのとき
最適な沈殿が得られると報告している（Chen, C. and O
kayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745）。の
方法は、一過的なトランスフェクションに適している。
古くはDEAE-デキストラン（Sigma #D-9885 M.W. 5×105
）混液を所望のDNA濃度比で調製し、トランスフェクシ
ョンを行う方法が知られている。複合体の多くはエンド
ソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるため
にクロロキンを加えることもできる（Calos, M.P., 198
3, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。の方法
は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないとい
う点でやの方法に比べて汎用性が高い。効率はパル
ス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャッ
プ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、DNA濃度、細
胞密度の最適条件下で良いとされている。
【００３７】以上、３つのカテゴリーの中での方法は
操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討する
ことができるので、本発明においては、トランスフェク
ション試薬が適している。好適には Superfect Transfe
ction Ragent（QIAGEN, CatNo. 301305）、または DOSP
ER Liposomal Transfection Reagent（Boehringer Mann
heim, Cat No. 1811169）が用いられる。
操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討する
ことができるので、本発明においては、トランスフェク
ション試薬が適している。好適には Superfect Transfe
ction Ragent（QIAGEN, CatNo. 301305）、または DOSP
ER Liposomal Transfection Reagent（Boehringer Mann
heim, Cat No. 1811169）が用いられる。
【００３８】cDNAからの再構成は具体的には次のように
して行うことができる。24穴から６穴程度のプラスチッ
クプレートまたは100mmペトリ皿等で、10％ウシ胎児血
清(FCS)および抗生物質（100 units/ml ペニシリンGお
よび100μg/mlストレプトマイシン）を含む最少必須培
地（MEM)を用いてサル腎臓由来細胞株LLC-MK2を70〜80
％コンフルエント（1×106 細胞）になるまで培養し、
例えば 1μg/ml psoralen（ソラレン）存在下 UV照射処
理を20分処理で不活化した、T7ポリメラーゼを発現する
組換えワクシニアウイルスvTF7-3（Fuerst, T.R. et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126,198
6、Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996）
を2 PFU/細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびUV
照射時間は適宜調整することができる。感染1時間後、2
〜60μg、より好ましくは 3〜5μgの上記の組換えセン
ダイウイルスcDNAを、全長センダイウイルスゲノムの生
成に必須なトランスに作用するウイルスタンパク質を発
現するプラスミド（24-0.5μgのpGEM-N、12-0.25μgのp
GEM-P、および24-0.5μgのpGEM-L、より好ましくは1μg
のpGEM-N、0.5μgのpGEM-P、および1μgのpGEM-L)（Kat
o, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996）と共に
Superfect（QIAGEN社）を用いたリポフェクション法等
によりトランスフェクションする。トランスフェクショ
ンを行った細胞は、所望により100μg/mlのリファンピ
シン（Sigma）及びシトシンアラビノシド（AraC）、よ
り好ましくは40μg/mlのシトシンアラビノシド（AraC）
（Sigma）のみを含む血清不含のMEMで培養し、ワクシニ
アウイルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウイルスの
回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する
（Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-57
9）。トランスフェクションから48〜72時間程度培養
後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破
砕した後、LLC-MK2細胞にトランスフェクションして培
養する。または、培養上清を回収し、LLC-MK2細胞の培
養液に添加して感染させ培養する。培養３〜７日後に培
養液を回収する。あるいは、回収した細胞を別の細胞に
重層するなどして共培養してもよい。あるいは、上記の
凍結融解による細胞破砕物を10日齢の発育鶏卵の尿膜内
へ接種し、約３日後、尿液を回収してもよい。培養上清
または尿液に含まれるウイルス力価は赤血球凝集活性(H
A)を測定することにより決定することができる。HAは
「endo-point 希釈法」（Kato, A. et al., 1996, Gene
sCells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hem
aggulutinating virus ofJapan-liposome-mediated gen
e delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Mol
ecular Biology of Vascular Diseases. Method in Mol
ecular Medicine:Humana Press: pp. 295-306, 1999）
により決定することができる。混入し得るワクシニアウ
イルスvTF7-3を除去するために、得られた尿液試料を適
宜希釈（例えば106 倍）して、鶏卵で再増幅させること
ができる。再増幅は、例えば３回上繰り返すことができ
る。得られたウイルスストックは-80℃で保存すること
ができる。
して行うことができる。24穴から６穴程度のプラスチッ
クプレートまたは100mmペトリ皿等で、10％ウシ胎児血
清(FCS)および抗生物質（100 units/ml ペニシリンGお
よび100μg/mlストレプトマイシン）を含む最少必須培
地（MEM)を用いてサル腎臓由来細胞株LLC-MK2を70〜80
％コンフルエント（1×106 細胞）になるまで培養し、
例えば 1μg/ml psoralen（ソラレン）存在下 UV照射処
理を20分処理で不活化した、T7ポリメラーゼを発現する
組換えワクシニアウイルスvTF7-3（Fuerst, T.R. et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126,198
6、Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996）
を2 PFU/細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびUV
照射時間は適宜調整することができる。感染1時間後、2
〜60μg、より好ましくは 3〜5μgの上記の組換えセン
ダイウイルスcDNAを、全長センダイウイルスゲノムの生
成に必須なトランスに作用するウイルスタンパク質を発
現するプラスミド（24-0.5μgのpGEM-N、12-0.25μgのp
GEM-P、および24-0.5μgのpGEM-L、より好ましくは1μg
のpGEM-N、0.5μgのpGEM-P、および1μgのpGEM-L)（Kat
o, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996）と共に
Superfect（QIAGEN社）を用いたリポフェクション法等
によりトランスフェクションする。トランスフェクショ
ンを行った細胞は、所望により100μg/mlのリファンピ
シン（Sigma）及びシトシンアラビノシド（AraC）、よ
り好ましくは40μg/mlのシトシンアラビノシド（AraC）
（Sigma）のみを含む血清不含のMEMで培養し、ワクシニ
アウイルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウイルスの
回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する
（Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-57
9）。トランスフェクションから48〜72時間程度培養
後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破
砕した後、LLC-MK2細胞にトランスフェクションして培
養する。または、培養上清を回収し、LLC-MK2細胞の培
養液に添加して感染させ培養する。培養３〜７日後に培
養液を回収する。あるいは、回収した細胞を別の細胞に
重層するなどして共培養してもよい。あるいは、上記の
凍結融解による細胞破砕物を10日齢の発育鶏卵の尿膜内
へ接種し、約３日後、尿液を回収してもよい。培養上清
または尿液に含まれるウイルス力価は赤血球凝集活性(H
A)を測定することにより決定することができる。HAは
「endo-point 希釈法」（Kato, A. et al., 1996, Gene
sCells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hem
aggulutinating virus ofJapan-liposome-mediated gen
e delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Mol
ecular Biology of Vascular Diseases. Method in Mol
ecular Medicine:Humana Press: pp. 295-306, 1999）
により決定することができる。混入し得るワクシニアウ
イルスvTF7-3を除去するために、得られた尿液試料を適
宜希釈（例えば106 倍）して、鶏卵で再増幅させること
ができる。再増幅は、例えば３回上繰り返すことができ
る。得られたウイルスストックは-80℃で保存すること
ができる。
【００３９】回収したパラミクソウイルスは実質的に純
粋になるよう精製することができる。精製方法はフィル
トレーション、遠心分離、およびカラム精製等を含む公
知の精製・分離方法により行うことができる。「実質的
に純粋」とは、単離した物質（化合物、ポリペプチド、
またはウイルス等）が、それが存在する試料中の成分と
して主要な割合を占めることを言う。典型的には、試料
中に存在する実質的に純粋な成分は、試料中の他の成分
を合わせた全体の50％以上、好ましくは70％以上、より
好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上を占め
る。割合は当業者に公知の手順により、例えば重量比率
［w/w］等で算出される。当然溶媒、塩、添加化合物な
どを除いて算出されるべきである。パラミクソウイルス
の具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エ
ステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用い
る方法（特公昭62-30752号公報、特公昭62-33879号公
報、および特公昭62-30753号公報）、およびフコース硫
酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法
（WO97/32010）等を例示することができる。
粋になるよう精製することができる。精製方法はフィル
トレーション、遠心分離、およびカラム精製等を含む公
知の精製・分離方法により行うことができる。「実質的
に純粋」とは、単離した物質（化合物、ポリペプチド、
またはウイルス等）が、それが存在する試料中の成分と
して主要な割合を占めることを言う。典型的には、試料
中に存在する実質的に純粋な成分は、試料中の他の成分
を合わせた全体の50％以上、好ましくは70％以上、より
好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上を占め
る。割合は当業者に公知の手順により、例えば重量比率
［w/w］等で算出される。当然溶媒、塩、添加化合物な
どを除いて算出されるべきである。パラミクソウイルス
の具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エ
ステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用い
る方法（特公昭62-30752号公報、特公昭62-33879号公
報、および特公昭62-30753号公報）、およびフコース硫
酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法
（WO97/32010）等を例示することができる。
【００４０】本発明の組換えセンダイウイルスベクター
は、例えば生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（PBS）
などで適宜希釈して組成物とすることができる。本発明
の組換えセンダイウイルスベクターを鶏卵で増殖させた
場合等においては尿液を含むこともできる。本発明の組
換えセンダイウイルスベクター含有組成物には、脱イオ
ン水、5%デキストロース水溶液等の生理学的に許容しう
る担体または媒体を含んでいてもよい。「生理学的に許
容される担体または媒体」とは、ベクターと共に投与す
ることが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意
に阻害しない材料である。さらに、その他にも、植物
油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有さ
れていてもよい。また保存剤やその他の添加剤を添加す
ることができる。
は、例えば生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（PBS）
などで適宜希釈して組成物とすることができる。本発明
の組換えセンダイウイルスベクターを鶏卵で増殖させた
場合等においては尿液を含むこともできる。本発明の組
換えセンダイウイルスベクター含有組成物には、脱イオ
ン水、5%デキストロース水溶液等の生理学的に許容しう
る担体または媒体を含んでいてもよい。「生理学的に許
容される担体または媒体」とは、ベクターと共に投与す
ることが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意
に阻害しない材料である。さらに、その他にも、植物
油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有さ
れていてもよい。また保存剤やその他の添加剤を添加す
ることができる。
【００４１】ウイルスベクターが再構成する限り、再構
成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、セン
ダイウイルスベクターの再構成においては、サル腎由来
のCV-I細胞やLLC-MK2細胞、ハムスター腎由来のBHK細胞
などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。
これらの細胞に適当なエンベロープタンパク質を発現さ
せることで、そのエンベロープを有する感染性ウイルス
粒子を得ることもできる。また、大量にセンダイウイル
スベクターを得るために、上記の宿主から得られたウイ
ルスベクターを発育鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅
することができる。鶏卵を使ったウイルスベクターの製
造方法は既に開発されている（中西ら編,(1993),「神経
科学研究の先端技術プロトコールIII, 分子神経細胞生
理学」,厚生社, 大阪, pp.153-172）。具体的には、例
えば、受精卵を培養器に入れ9〜12日間 37〜38℃で培養
し、胚を成長させる。センダイウイルスベクターを尿膜
腔へ接種し、数日間卵を培養してウイルスベクターを増
殖させる。培養期間等の条件は、使用する組換えセンダ
イウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含ん
だ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスベクタ
ーの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代
眞人,「ウイルス実験プロトコール」, 永井、石浜監修,
メジカルビュー社, pp.68-73,(1995)）。
成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、セン
ダイウイルスベクターの再構成においては、サル腎由来
のCV-I細胞やLLC-MK2細胞、ハムスター腎由来のBHK細胞
などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。
これらの細胞に適当なエンベロープタンパク質を発現さ
せることで、そのエンベロープを有する感染性ウイルス
粒子を得ることもできる。また、大量にセンダイウイル
スベクターを得るために、上記の宿主から得られたウイ
ルスベクターを発育鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅
することができる。鶏卵を使ったウイルスベクターの製
造方法は既に開発されている（中西ら編,(1993),「神経
科学研究の先端技術プロトコールIII, 分子神経細胞生
理学」,厚生社, 大阪, pp.153-172）。具体的には、例
えば、受精卵を培養器に入れ9〜12日間 37〜38℃で培養
し、胚を成長させる。センダイウイルスベクターを尿膜
腔へ接種し、数日間卵を培養してウイルスベクターを増
殖させる。培養期間等の条件は、使用する組換えセンダ
イウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含ん
だ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスベクタ
ーの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代
眞人,「ウイルス実験プロトコール」, 永井、石浜監修,
メジカルビュー社, pp.68-73,(1995)）。
【００４２】外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用
いてウイルスベクターを調製すれば、このベクターを投
与して遺伝子治療を行うことが可能となる。本発明のウ
イルスベクターの遺伝子治療への応用としては、直接投
与による遺伝子発現、間接（ex vivo）投与による遺伝
子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待でき
る外来遺伝子もしくは患者の体内で供給が不足している
内在遺伝子等を発現させることが可能である。本発明の
ウイルスベクターは安全性が高く、さらに外来遺伝子の
発現量を制御することができるため、幅広い臨床応用に
対応できると期待される。外来遺伝子としては特に制限
はなく、蛋白質をコードする核酸に加え、例えば、アン
チセンスまたはリボザイムなどのタンパク質をコードし
ない核酸であってもよい。また、外来遺伝子として、感
染症に関する細菌またはウイルスの抗原をコードする遺
伝子を用いれば、これを動物に投与することにより、該
動物において免疫を誘導することができる。即ち、ワク
チンとして利用することができる。病原性のパラミクソ
ウイルス、例えば、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイル
スのようなワクチンの必要性の高いウイルスに本発明を
適用することもできる。
いてウイルスベクターを調製すれば、このベクターを投
与して遺伝子治療を行うことが可能となる。本発明のウ
イルスベクターの遺伝子治療への応用としては、直接投
与による遺伝子発現、間接（ex vivo）投与による遺伝
子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待でき
る外来遺伝子もしくは患者の体内で供給が不足している
内在遺伝子等を発現させることが可能である。本発明の
ウイルスベクターは安全性が高く、さらに外来遺伝子の
発現量を制御することができるため、幅広い臨床応用に
対応できると期待される。外来遺伝子としては特に制限
はなく、蛋白質をコードする核酸に加え、例えば、アン
チセンスまたはリボザイムなどのタンパク質をコードし
ない核酸であってもよい。また、外来遺伝子として、感
染症に関する細菌またはウイルスの抗原をコードする遺
伝子を用いれば、これを動物に投与することにより、該
動物において免疫を誘導することができる。即ち、ワク
チンとして利用することができる。病原性のパラミクソ
ウイルス、例えば、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイル
スのようなワクチンの必要性の高いウイルスに本発明を
適用することもできる。
【００４３】ワクチンとして用いる場合、例えば腫瘍、
感染症、およびその他の一般的な疾患に対し本発明のウ
イルスベクターを適用することが考えられる。例えば腫
瘍治療としては、腫瘍細胞、またはDC細胞などの抗原提
示細胞（APC）に本発明のベクターを用いて治療効果を
有する遺伝子を発現させることができる。このような遺
伝子としては、癌抗原 Muc-1 または Muc-1様ムチンタ
ンデムリピートペプチド（米国特許第 5,744,144号）、
メラノーマ gp100抗原などが挙げられる。このような遺
伝子による治療は、乳癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、
肺癌等、幅広い応用が示されている。また、アジュバン
ト効果を高めるサイトカイン類を組み合わせることも有
効である。このような遺伝子としては、例えば i）IL-2
と一本鎖IL-12 との組み合わせ（Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 96 (15): 8591-8596, 1999）、ii）IL-2とイン
ターフェロン-γ（米国特許第 5,798,100号）、iii）単
独で用いられる顆粒球コロニー刺激因子（GM-CSF）、i
v）脳腫瘍を治療対象としたGM-CSF と IL-4 の組み合わ
せ（J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124 (1999)）など
が挙げられる。
感染症、およびその他の一般的な疾患に対し本発明のウ
イルスベクターを適用することが考えられる。例えば腫
瘍治療としては、腫瘍細胞、またはDC細胞などの抗原提
示細胞（APC）に本発明のベクターを用いて治療効果を
有する遺伝子を発現させることができる。このような遺
伝子としては、癌抗原 Muc-1 または Muc-1様ムチンタ
ンデムリピートペプチド（米国特許第 5,744,144号）、
メラノーマ gp100抗原などが挙げられる。このような遺
伝子による治療は、乳癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、
肺癌等、幅広い応用が示されている。また、アジュバン
ト効果を高めるサイトカイン類を組み合わせることも有
効である。このような遺伝子としては、例えば i）IL-2
と一本鎖IL-12 との組み合わせ（Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 96 (15): 8591-8596, 1999）、ii）IL-2とイン
ターフェロン-γ（米国特許第 5,798,100号）、iii）単
独で用いられる顆粒球コロニー刺激因子（GM-CSF）、i
v）脳腫瘍を治療対象としたGM-CSF と IL-4 の組み合わ
せ（J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124 (1999)）など
が挙げられる。
【００４４】感染症の治療としては、インフルエンザに
おいては、例えば強毒株 H5N1 型エンベロープ、日本脳
炎においては、例えばエンベロープキメラ（Vaccine, v
ol.17, No. 15-16, 1869-1882 (1999)）、エイズにおい
ては、例えばHIV gagまたはSIV gag タンパク質（J. Im
munology (2000) vol. 164, 4968-4978）、HIVエンベロ
ープタンパク質の経口投与によるワクチン治療、ポリ乳
酸-グリコール共重合体に包んでの投与（Kaneko, H. et
al., Virology 267: 8-16 (2000)）、コレラにおいて
は、例えばコレラ毒素のBサブユニット（CTB）（Arakaw
a, T., et al., Nature Biotechnology (1998) 16(10):
934-8、Arakawa, T., et al., Nature Biotechnology
(1998) 16(3): 292-7）、狂犬病においては、例えば狂
犬病ウイルスの糖タンパク（Lodmell, D. L. et al., 1
998, Nature Medicine 4(8):949-52）、子宮頚癌におい
ては、ヒトパピローマウイルス6型のカプシドタンパクL
1（J. Med. Virol, 60, 200-204 (2000)）などが挙げら
れる。
おいては、例えば強毒株 H5N1 型エンベロープ、日本脳
炎においては、例えばエンベロープキメラ（Vaccine, v
ol.17, No. 15-16, 1869-1882 (1999)）、エイズにおい
ては、例えばHIV gagまたはSIV gag タンパク質（J. Im
munology (2000) vol. 164, 4968-4978）、HIVエンベロ
ープタンパク質の経口投与によるワクチン治療、ポリ乳
酸-グリコール共重合体に包んでの投与（Kaneko, H. et
al., Virology 267: 8-16 (2000)）、コレラにおいて
は、例えばコレラ毒素のBサブユニット（CTB）（Arakaw
a, T., et al., Nature Biotechnology (1998) 16(10):
934-8、Arakawa, T., et al., Nature Biotechnology
(1998) 16(3): 292-7）、狂犬病においては、例えば狂
犬病ウイルスの糖タンパク（Lodmell, D. L. et al., 1
998, Nature Medicine 4(8):949-52）、子宮頚癌におい
ては、ヒトパピローマウイルス6型のカプシドタンパクL
1（J. Med. Virol, 60, 200-204 (2000)）などが挙げら
れる。
【００４５】本発明のベクターをワクチンとして用いる
場合には、免疫原性を高めるために、サイトカイン、コ
レラ毒素、サルモネラ毒素等の免疫促進剤を組み合わせ
ることもできる。またワクチンには、ミョウバン、不完
全Freund'sアジュバント、MF59 (オイルエマルジョ
ン)、MTP-PE (マイコバクテリア細胞壁由来の muramyl
tripeptide)、および QS-21 (soapbark tree Quilaja s
aponaria 由来）などのアジュバントを組み合わせるこ
ともできる。
場合には、免疫原性を高めるために、サイトカイン、コ
レラ毒素、サルモネラ毒素等の免疫促進剤を組み合わせ
ることもできる。またワクチンには、ミョウバン、不完
全Freund'sアジュバント、MF59 (オイルエマルジョ
ン)、MTP-PE (マイコバクテリア細胞壁由来の muramyl
tripeptide)、および QS-21 (soapbark tree Quilaja s
aponaria 由来）などのアジュバントを組み合わせるこ
ともできる。
【００４６】また、一般病への適用も考えられる。糖尿
病におては、例えばI型糖尿病モデル動物におて、イン
シュリン断片のペプチドの発現が行われている（Coon,
B. et al., J. Clin. Invest., 1999, 104(2):189-9
4）。
病におては、例えばI型糖尿病モデル動物におて、イン
シュリン断片のペプチドの発現が行われている（Coon,
B. et al., J. Clin. Invest., 1999, 104(2):189-9
4）。
【００４７】ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、
年齢、性別、症状、投与目的、投与形態、および投与方
法等により異なるが、当業者であれば適宜決定すること
が可能である。好ましくは、投与組成物に含有されるベ
クター量は約105 pfu/mlから約1011 pfu/mlの範囲内で
あるとよい。より好ましくは、投与組成物に含有される
ベクターの量は約107 pfu/mlから約109 pfu/mlの範囲内
であるとよい。最も好ましくは、約1×108 pfu/mlから
約5×108 pfu/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な担体
中で投与することが好ましい。
年齢、性別、症状、投与目的、投与形態、および投与方
法等により異なるが、当業者であれば適宜決定すること
が可能である。好ましくは、投与組成物に含有されるベ
クター量は約105 pfu/mlから約1011 pfu/mlの範囲内で
あるとよい。より好ましくは、投与組成物に含有される
ベクターの量は約107 pfu/mlから約109 pfu/mlの範囲内
であるとよい。最も好ましくは、約1×108 pfu/mlから
約5×108 pfu/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な担体
中で投与することが好ましい。
【００４８】なお、治療が完了しウイルスベクターの増
殖を抑止する必要が生じた際または治療中に、RNA依存
性RNAポリメラーゼ阻害剤を投与すれば、宿主に障害を
与えずにウイルスベクターの増殖だけを特異的に抑止す
ることができる。
殖を抑止する必要が生じた際または治療中に、RNA依存
性RNAポリメラーゼ阻害剤を投与すれば、宿主に障害を
与えずにウイルスベクターの増殖だけを特異的に抑止す
ることができる。
【００４９】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明は、これら実施例に制限されるもので
はない。 [実施例１] センダイウイルスにおける極性効果を利用
した遺伝子発現量の制御 I ＜SeVゲノムcDNAの構築＞センダイウイルス（SeV）全長
ゲノムcDNA、pSeV(+)（Kato, A. et al., Genesto Cell
s 1: 569-579, 1996）のcDNAに新たな Not I サイトを
各遺伝子のスタート(S)シグナルとATG翻訳開始シグナル
の間に導入した。導入方法としてはまず、図１(A)のよ
うにpSeV(+)をSph I/Sal Iで消化した断片（2645bp）、
Cla Iで消化した断片（3246bp）、及びCla I/Eco RIで
消化した断片（5146bp）をそれぞれアガロース電気泳動
で分離、該当するバンドを切り出し、QIAEXII Gel Extr
action System（QIAGEN社製）で回収・精製した。Sph I
/Sal Iで消化した断片はLITMUS38（NEW ENGLAND BIOLAB
S社製）、Cla Iで消化した断片とCla I/Eco RIで消化し
た断片は pBluescriptII KS+（STRATAGENE社製）にライ
ゲーションし、サブクローニングした。続いてNot Iサ
イトの導入にはQuickchange Site-Directed Mutagenesi
s kit（STRATAGENE社製）を使った。それぞれの導入に
用いたプライマーはNP-P間ではセンス鎖：5'-ccaccgacc
acacccagcggccgcgacagccacggcttcgg-3'（配列番号：
３）、アンチセンス鎖：5'-ccgaagccgtggctgtcgcggccgc
tgggtgtggtcggtgg-3'（配列番号：４）、P-M間ではセン
ス鎖：5'-gaaatttcacctaagcggccgcaatggcagatatctatag-
3'（配列番号：５）、アンチセンス鎖：5'-ctatagatatc
tgccattgcggccgcttaggtgaaatttc-3'（配列番号：６）、
M-F間ではセンス鎖：5'-gggataaagtcccttgcggccgcttggt
tgcaaaactctcccc-3'（配列番号：７）、アンチセンス
鎖：5'-ggggagagttttgcaaccaagcggccgcaagggactttatccc
-3'（配列番号：８）、F-HN間ではセンス鎖：5'-ggtcgc
gcggtactttagcggccgcctcaaacaagcacagatcatgg-3'（配列
番号：９）、アンチセンス鎖：5'-ccatgatctgtgcttgttt
gaggcggccgctaaagtaccgcgcgacc-3'（配列番号：１
０）、HN-L間ではセンス鎖：5'-cctgcccatccatgacctagc
ggccgcttcccattcaccctggg-3'（配列番号：１１）、アン
チセンス鎖：5'-cccagggtgaatgggaagcggccgctaggtcatgg
atgggcagg-3'（配列番号：１２）をそれぞれ合成し、用
いた。
明するが、本発明は、これら実施例に制限されるもので
はない。 [実施例１] センダイウイルスにおける極性効果を利用
した遺伝子発現量の制御 I ＜SeVゲノムcDNAの構築＞センダイウイルス（SeV）全長
ゲノムcDNA、pSeV(+)（Kato, A. et al., Genesto Cell
s 1: 569-579, 1996）のcDNAに新たな Not I サイトを
各遺伝子のスタート(S)シグナルとATG翻訳開始シグナル
の間に導入した。導入方法としてはまず、図１(A)のよ
うにpSeV(+)をSph I/Sal Iで消化した断片（2645bp）、
Cla Iで消化した断片（3246bp）、及びCla I/Eco RIで
消化した断片（5146bp）をそれぞれアガロース電気泳動
で分離、該当するバンドを切り出し、QIAEXII Gel Extr
action System（QIAGEN社製）で回収・精製した。Sph I
/Sal Iで消化した断片はLITMUS38（NEW ENGLAND BIOLAB
S社製）、Cla Iで消化した断片とCla I/Eco RIで消化し
た断片は pBluescriptII KS+（STRATAGENE社製）にライ
ゲーションし、サブクローニングした。続いてNot Iサ
イトの導入にはQuickchange Site-Directed Mutagenesi
s kit（STRATAGENE社製）を使った。それぞれの導入に
用いたプライマーはNP-P間ではセンス鎖：5'-ccaccgacc
acacccagcggccgcgacagccacggcttcgg-3'（配列番号：
３）、アンチセンス鎖：5'-ccgaagccgtggctgtcgcggccgc
tgggtgtggtcggtgg-3'（配列番号：４）、P-M間ではセン
ス鎖：5'-gaaatttcacctaagcggccgcaatggcagatatctatag-
3'（配列番号：５）、アンチセンス鎖：5'-ctatagatatc
tgccattgcggccgcttaggtgaaatttc-3'（配列番号：６）、
M-F間ではセンス鎖：5'-gggataaagtcccttgcggccgcttggt
tgcaaaactctcccc-3'（配列番号：７）、アンチセンス
鎖：5'-ggggagagttttgcaaccaagcggccgcaagggactttatccc
-3'（配列番号：８）、F-HN間ではセンス鎖：5'-ggtcgc
gcggtactttagcggccgcctcaaacaagcacagatcatgg-3'（配列
番号：９）、アンチセンス鎖：5'-ccatgatctgtgcttgttt
gaggcggccgctaaagtaccgcgcgacc-3'（配列番号：１
０）、HN-L間ではセンス鎖：5'-cctgcccatccatgacctagc
ggccgcttcccattcaccctggg-3'（配列番号：１１）、アン
チセンス鎖：5'-cccagggtgaatgggaagcggccgctaggtcatgg
atgggcagg-3'（配列番号：１２）をそれぞれ合成し、用
いた。
【００５０】鋳型としてNP-P間はSalI/SphI断片、P-M
間、M-F間はClaI断片、F-HN間、HN-L間はCla I/Eco RI
断片をそれぞれ上記でサブクローニングしたものを用い
てQuickchange Site-Directed Mutagenesis kitのプロ
トコルに従い、導入を行った。導入したものを再びサブ
クローニングした酵素で消化して同様に回収・精製し、
元のセンダイゲノムcDNAへアセンブリした。その結果、
図１(B)のように各遺伝子間に新たにNotIを導入した5種
類（pSeV(+)NPP、pSeV(+)PM、pSeV(+)MF、pSeV(+)FHNお
よびpSeV(+)HNL）のセンダイウイルスゲノムcDNAを構築
した。外来遺伝子を挿入するには、外来遺伝子の下流に
終結シグナル-介在配列-開始シグナル（E-I-S）が付加
されたDNA断片を上記ゲノム cDNA のNotIサイトに挿入
する。このためには、例えば、マルチクローニングサイ
トと終結シグナル-介在配列-開始シグナルが２つのNotI
サイトに挟まれた配列（図２参照）を予め用意してお
き、外来遺伝子をマルチクローニングサイトに挿入する
のが簡便である。
間、M-F間はClaI断片、F-HN間、HN-L間はCla I/Eco RI
断片をそれぞれ上記でサブクローニングしたものを用い
てQuickchange Site-Directed Mutagenesis kitのプロ
トコルに従い、導入を行った。導入したものを再びサブ
クローニングした酵素で消化して同様に回収・精製し、
元のセンダイゲノムcDNAへアセンブリした。その結果、
図１(B)のように各遺伝子間に新たにNotIを導入した5種
類（pSeV(+)NPP、pSeV(+)PM、pSeV(+)MF、pSeV(+)FHNお
よびpSeV(+)HNL）のセンダイウイルスゲノムcDNAを構築
した。外来遺伝子を挿入するには、外来遺伝子の下流に
終結シグナル-介在配列-開始シグナル（E-I-S）が付加
されたDNA断片を上記ゲノム cDNA のNotIサイトに挿入
する。このためには、例えば、マルチクローニングサイ
トと終結シグナル-介在配列-開始シグナルが２つのNotI
サイトに挟まれた配列（図２参照）を予め用意してお
き、外来遺伝子をマルチクローニングサイトに挿入する
のが簡便である。
【００５１】L遺伝子の下流に外来遺伝子を挿入するに
は、例えば pSeV(+)もしくは上記の所望のSeV cDNA（pS
eV18+、pSeV(+)NPP、pSeV(+)PM、pSeV(+)MF、pSeV(+)FH
NおよびpSeV(+)HNL）等においてL遺伝子の終止コドンと
転写終結シグナルとの間に存在する制限酵素 Kpn I サ
イトに遺伝子を挿入することができる（図３(A)）。そ
の場合、挿入する外来遺伝子には、両端側に KpnI サイ
ト、5'側に終結シグナル-介在配列-開始シグナルをPCR
等で付加させる（図３(B)）。付加させたDNAをSeV cDNA
へ組み込み、L遺伝子の下流に外来遺伝子が挿入された
cDNAを得る。
は、例えば pSeV(+)もしくは上記の所望のSeV cDNA（pS
eV18+、pSeV(+)NPP、pSeV(+)PM、pSeV(+)MF、pSeV(+)FH
NおよびpSeV(+)HNL）等においてL遺伝子の終止コドンと
転写終結シグナルとの間に存在する制限酵素 Kpn I サ
イトに遺伝子を挿入することができる（図３(A)）。そ
の場合、挿入する外来遺伝子には、両端側に KpnI サイ
ト、5'側に終結シグナル-介在配列-開始シグナルをPCR
等で付加させる（図３(B)）。付加させたDNAをSeV cDNA
へ組み込み、L遺伝子の下流に外来遺伝子が挿入された
cDNAを得る。
【００５２】遺伝子発現量を見るためのレポータ遺伝子
としてヒト分泌型アルカリフォスファターゼ（SEAP）を
PCRでサブクローニングした。プライマーにはAsc I 制
限酵素サイトを付加した5'プライマー：5'-gcggcgcgcca
tgctgctgctgctgctgctgctgggcctg-3'（配列番号：１
３）、3'プライマー：5'-gcggcgcgcccttatcatgtctgctcg
aagcggccggccg-3'（配列番号：１４）を合成し、PCRを
行った。鋳型にはpSEAP-Basic（CLONTECH社製）、酵素
にはPfu tourbo DNAポリメラーゼ（STRATAGENE社製）を
用いた。PCR後、産物をAsc Iで消化し、電気泳動により
精製・回収した。サブクローニングするプラスミドとし
てpBluescriptII KS+のNot Iサイトにマルチクローニン
グサイト（Pme I-Asc I-Swa I）と終結シグナル-介在配
列-開始シグナル含む合成二本鎖DNA［センス鎖：5'-gcg
gccgcgtttaaacggcgcgccatttaaatccgtag taagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccgc-3'（配列番号：１５）、アンチセンス 鎖：5'-gcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacgga
tttaaatggcgcgccgtttaaacgcggccgc-3'（配列番号：１
６）］を組み込んだものを作製した（図２）。このプラ
スミドのAsc Iサイトに精製・回収したPCR産物をライゲ
ーションし、クローニングした。これをNot Iで消化し
てSEAP遺伝子断片を電気泳動で回収・精製し、上記の5
種類のセンダイウイルスゲノムcDNAとpSeV18+のNot Iサ
イトにそれぞれライゲーションし組み込んだ。それぞれ
のウイルスベクターをpSeV(+)NPP/SEAP、pSeV(+)PM/SEA
P、pSeV(+)MF/SEAP、pSeV(+)FHN/SEAP、pSeV(+)HNL/SEA
PおよびpSeV18(+)/SEAPとした。
としてヒト分泌型アルカリフォスファターゼ（SEAP）を
PCRでサブクローニングした。プライマーにはAsc I 制
限酵素サイトを付加した5'プライマー：5'-gcggcgcgcca
tgctgctgctgctgctgctgctgggcctg-3'（配列番号：１
３）、3'プライマー：5'-gcggcgcgcccttatcatgtctgctcg
aagcggccggccg-3'（配列番号：１４）を合成し、PCRを
行った。鋳型にはpSEAP-Basic（CLONTECH社製）、酵素
にはPfu tourbo DNAポリメラーゼ（STRATAGENE社製）を
用いた。PCR後、産物をAsc Iで消化し、電気泳動により
精製・回収した。サブクローニングするプラスミドとし
てpBluescriptII KS+のNot Iサイトにマルチクローニン
グサイト（Pme I-Asc I-Swa I）と終結シグナル-介在配
列-開始シグナル含む合成二本鎖DNA［センス鎖：5'-gcg
gccgcgtttaaacggcgcgccatttaaatccgtag taagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccgc-3'（配列番号：１５）、アンチセンス 鎖：5'-gcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacgga
tttaaatggcgcgccgtttaaacgcggccgc-3'（配列番号：１
６）］を組み込んだものを作製した（図２）。このプラ
スミドのAsc Iサイトに精製・回収したPCR産物をライゲ
ーションし、クローニングした。これをNot Iで消化し
てSEAP遺伝子断片を電気泳動で回収・精製し、上記の5
種類のセンダイウイルスゲノムcDNAとpSeV18+のNot Iサ
イトにそれぞれライゲーションし組み込んだ。それぞれ
のウイルスベクターをpSeV(+)NPP/SEAP、pSeV(+)PM/SEA
P、pSeV(+)MF/SEAP、pSeV(+)FHN/SEAP、pSeV(+)HNL/SEA
PおよびpSeV18(+)/SEAPとした。
【００５３】＜ウイルスの再構築＞LLC-MK2細胞を2×10
6 cells/dish で100mmシャーレに蒔き、24時間後培養
後、ソラレンとUV処理したT7ポリメラーゼを発現するリ
コンビナントワクシニアウイルス（PLWUV-VacT7）（Fue
rst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:81
22-8126,1986、Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-
579, 1996）に室温でmoi=2で１時間感染させた。細胞を
洗浄してからSEAPを組み込んだ各センダイウイルスcDN
A、pGEM/NP、pGEM/P、およびpGEM/Lをそれぞれ12μg、4
μg、2μg、及び4μg/dishの量比でOptiMEM（GIBOCO BR
L社製）に懸濁し、110μl のSuperFecttransfection re
agent （QIAGEN社製）を入れて混合し、室温で15分放置
後、最終的に3％FBSを含むOptiMEM 3mlを加え、細胞に
添加して3〜5時間培養した。培養後、細胞を血清を含ま
ないMEMで2回洗浄し、シトシンβ-D-アラビノフラノシ
ド（AraC）を含むMEMで72時間培養した。これらの細胞
を回収し、ペレットを1mlのPBSで懸濁し、凍結融解を3
回繰り返した。これらを10日間孵卵させた鶏卵に100μl
接種し、35℃で3日間孵卵させたのち、尿液を回収し
た。ワクシニアウイルスフリーにするため、これら回収
した尿液をさらに10-5 〜10-7 に希釈して鶏卵に再接種
し、同様に回収し、分注して-80℃にストックした。そ
れぞれのウイルスベクター名をSeVNPP/SEAP、SeVPM/SEA
P、SeVMF/SEAP、SeVFHN/SEAP、SeVHNL/SEAPおよびSeV18
/SEAPとする。
6 cells/dish で100mmシャーレに蒔き、24時間後培養
後、ソラレンとUV処理したT7ポリメラーゼを発現するリ
コンビナントワクシニアウイルス（PLWUV-VacT7）（Fue
rst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:81
22-8126,1986、Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-
579, 1996）に室温でmoi=2で１時間感染させた。細胞を
洗浄してからSEAPを組み込んだ各センダイウイルスcDN
A、pGEM/NP、pGEM/P、およびpGEM/Lをそれぞれ12μg、4
μg、2μg、及び4μg/dishの量比でOptiMEM（GIBOCO BR
L社製）に懸濁し、110μl のSuperFecttransfection re
agent （QIAGEN社製）を入れて混合し、室温で15分放置
後、最終的に3％FBSを含むOptiMEM 3mlを加え、細胞に
添加して3〜5時間培養した。培養後、細胞を血清を含ま
ないMEMで2回洗浄し、シトシンβ-D-アラビノフラノシ
ド（AraC）を含むMEMで72時間培養した。これらの細胞
を回収し、ペレットを1mlのPBSで懸濁し、凍結融解を3
回繰り返した。これらを10日間孵卵させた鶏卵に100μl
接種し、35℃で3日間孵卵させたのち、尿液を回収し
た。ワクシニアウイルスフリーにするため、これら回収
した尿液をさらに10-5 〜10-7 に希釈して鶏卵に再接種
し、同様に回収し、分注して-80℃にストックした。そ
れぞれのウイルスベクター名をSeVNPP/SEAP、SeVPM/SEA
P、SeVMF/SEAP、SeVFHN/SEAP、SeVHNL/SEAPおよびSeV18
/SEAPとする。
【００５４】＜プラークアッセイによるタイターの測定
＞CV-1細胞を6well プレートに1wellあたり5×105 cell
sずつ蒔き、24時間培養した。PBS洗浄後、BSA/PBS（1%
BSA in PBS）で10-3、10-4、10-5、10-6、10-7に希釈し
た組換えSeVを1時間インキュベーションした後、PBSで
洗浄、BSA/MEM/アガロース（0.2% BSA+2×MEMと等量の2
%アガロースを混合したもの）をwellあたり3mlずつ重層
し、６日間37℃、5% CO2 で培養した。培養後、3mlのエ
タノール/酢酸（エタノール：酢酸=1:5）を加え、3時間
放置し、アガロースとともに除去した。PBSで三回洗浄
後、100倍希釈したウサギ抗センダイウイルス抗体で室
温で1時間インキュベーションした。PBSで三回洗浄後、
200倍希釈したAlexa Flour TM 標識ヤギ抗ウサギIg(G+H)
（Molecular Probe社）を加えて室温で1時間インキュベ
ーションした。PBSで三回洗浄後、ルミノイメージアナ
ライザーLAS1000（富士フィルム）で蛍光画像を取り込
み、プラークを測定した。結果を図４に示す。またこれ
から得られたタイターの結果を表１に示す。
＞CV-1細胞を6well プレートに1wellあたり5×105 cell
sずつ蒔き、24時間培養した。PBS洗浄後、BSA/PBS（1%
BSA in PBS）で10-3、10-4、10-5、10-6、10-7に希釈し
た組換えSeVを1時間インキュベーションした後、PBSで
洗浄、BSA/MEM/アガロース（0.2% BSA+2×MEMと等量の2
%アガロースを混合したもの）をwellあたり3mlずつ重層
し、６日間37℃、5% CO2 で培養した。培養後、3mlのエ
タノール/酢酸（エタノール：酢酸=1:5）を加え、3時間
放置し、アガロースとともに除去した。PBSで三回洗浄
後、100倍希釈したウサギ抗センダイウイルス抗体で室
温で1時間インキュベーションした。PBSで三回洗浄後、
200倍希釈したAlexa Flour TM 標識ヤギ抗ウサギIg(G+H)
（Molecular Probe社）を加えて室温で1時間インキュベ
ーションした。PBSで三回洗浄後、ルミノイメージアナ
ライザーLAS1000（富士フィルム）で蛍光画像を取り込
み、プラークを測定した。結果を図４に示す。またこれ
から得られたタイターの結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】 プラークアッセイの結果から測定した各組換
えセンダイウイルスのタイターの結果
えセンダイウイルスのタイターの結果
【００５６】＜レポーター遺伝子発現の比較＞LLC-MK2
細胞を6well プレートに1wellあたり1〜5×105 cellsず
つ蒔き、24時間培養した後、各ウイルスベクターをmoi=
2で感染させ、24時間後培養上清を100μl 回収し、SEAP
アッセイを行った。アッセイはReporter Assay Kit -SE
AP-（東洋紡）で行い、ルミノイメージアナライザーLAS
1000（富士フィルム）で測定した。測定値はSeV18+/SEA
Pの値を100としてそれぞれ相対値として表した。その結
果、図５に示したいずれの位置にSEAP遺伝子を挿入した
場合でもSEAP活性が検出された。SEAP活性はゲノムの下
流に位置するに従って下がり、すなわち発現量が下がっ
ていることがわかった。SEAP遺伝子の発現量は、挿入位
置がゲノムの上流（NP側）から下流（L側）に行くに従
い単調減少した。例えば、NP遺伝子とP遺伝子の間にSEA
P遺伝子を挿入した場合には、NP遺伝子の上流にSEAP遺
伝子を挿入したベクターと、P遺伝子とM遺伝子の間にSE
AP遺伝子を挿入したベクターの中間の発現量が検出され
た。
細胞を6well プレートに1wellあたり1〜5×105 cellsず
つ蒔き、24時間培養した後、各ウイルスベクターをmoi=
2で感染させ、24時間後培養上清を100μl 回収し、SEAP
アッセイを行った。アッセイはReporter Assay Kit -SE
AP-（東洋紡）で行い、ルミノイメージアナライザーLAS
1000（富士フィルム）で測定した。測定値はSeV18+/SEA
Pの値を100としてそれぞれ相対値として表した。その結
果、図５に示したいずれの位置にSEAP遺伝子を挿入した
場合でもSEAP活性が検出された。SEAP活性はゲノムの下
流に位置するに従って下がり、すなわち発現量が下がっ
ていることがわかった。SEAP遺伝子の発現量は、挿入位
置がゲノムの上流（NP側）から下流（L側）に行くに従
い単調減少した。例えば、NP遺伝子とP遺伝子の間にSEA
P遺伝子を挿入した場合には、NP遺伝子の上流にSEAP遺
伝子を挿入したベクターと、P遺伝子とM遺伝子の間にSE
AP遺伝子を挿入したベクターの中間の発現量が検出され
た。
【００５７】＜マルチクローニングサイトの作製＞ マルチクローニングサイトをSeVベクターに付加させ
た。方法は以下の二種類。 1）センダイウイルス（SeV）全長ゲノムcDNA、pSeV18+
b(+)（Hasan, M. K. etal., 1997, J. General Virolog
y 78: 2813-2820）（「pSeV18+ b(+)」は「pSeV18+」と
もいう）cDNAのゲノム中のいくつかの制限酵素サイトを
壊し、つぶした制限酵素サイトを含む新たな制限酵素サ
イトを各遺伝子のスタートシグナルとATG翻訳開始シグ
ナルの間に導入した（図６）。 2）すでに構築したSeVベクターcDNAにマルチクローニン
グサイト配列と転写開始シグナル-介在配列-終結シグナ
ルを付加させてNotIサイトへ組み込む（図７）。
た。方法は以下の二種類。 1）センダイウイルス（SeV）全長ゲノムcDNA、pSeV18+
b(+)（Hasan, M. K. etal., 1997, J. General Virolog
y 78: 2813-2820）（「pSeV18+ b(+)」は「pSeV18+」と
もいう）cDNAのゲノム中のいくつかの制限酵素サイトを
壊し、つぶした制限酵素サイトを含む新たな制限酵素サ
イトを各遺伝子のスタートシグナルとATG翻訳開始シグ
ナルの間に導入した（図６）。 2）すでに構築したSeVベクターcDNAにマルチクローニン
グサイト配列と転写開始シグナル-介在配列-終結シグナ
ルを付加させてNotIサイトへ組み込む（図７）。
【００５８】1）の場合、導入方法としてはまず、図６
(A)のように pSeV18+ をEag Iで消化した断片（2644b
p）、Cla Iで消化した断片（3246bp）、ClaI/Eco RIで
消化した断片（5146bp）、及びEco RIで消化した断片
（5010bp）をそれぞれアガロース電気泳動で分離、該当
するバンドを切り出し、QIAEXII Gel Extraction Syste
m（QIAGEN社製）で回収・精製した。Eag Iで消化した断
片はLITMUS38（NEW ENGLANDBIOLABS社製）、Cla Iで消
化した断片、ClaI/Eco RIで消化した断片、及びEco RI
で消化した断片はpBluescriptII KS+（STRATAGENE社
製）にライゲーションし、サブクローニングした。続い
て制限酵素サイトの破壊、導入にはQuickchange Site-D
irected Mutagenesis kit（STRATAGENE社製）を使っ
た。
(A)のように pSeV18+ をEag Iで消化した断片（2644b
p）、Cla Iで消化した断片（3246bp）、ClaI/Eco RIで
消化した断片（5146bp）、及びEco RIで消化した断片
（5010bp）をそれぞれアガロース電気泳動で分離、該当
するバンドを切り出し、QIAEXII Gel Extraction Syste
m（QIAGEN社製）で回収・精製した。Eag Iで消化した断
片はLITMUS38（NEW ENGLANDBIOLABS社製）、Cla Iで消
化した断片、ClaI/Eco RIで消化した断片、及びEco RI
で消化した断片はpBluescriptII KS+（STRATAGENE社
製）にライゲーションし、サブクローニングした。続い
て制限酵素サイトの破壊、導入にはQuickchange Site-D
irected Mutagenesis kit（STRATAGENE社製）を使っ
た。
【００５９】制限酵素サイトの破壊にはSal I:（センス
鎖）5'-ggagaagtctcaacaccgtccacccaagataatcgatcag-3'
（配列番号：１７）、（アンチセンス鎖）5'-ctgatcgat
tatcttgggtggacggtgttgagacttctcc-3'（配列番号：１
８）、Nhe I:（センス鎖）5'-gtatatgtgttcagttgagcttg
ctgtcggtctaaggc-3'（配列番号：１９）、（アンチセン
ス鎖）5'-gccttagaccgacagcaagctcaactgaacacatatac-3'
（配列番号：２０）、Xho I: （センス鎖）5'-caatgaac
tctctagagaggctggagtcactaaagagttacctgg-3'（配列番
号：２１）、（アンチセンス鎖）5'-ccaggtaactctttagt
gactccagcctctctagagagttcattg-3'（配列番号：２
２）、また制限酵素導入にはNP-P間：（センス鎖）5'-g
tgaaagttcatccaccgatcggctcactcgaggccacacccaaccccacc
g-3'（配列番号：２３）、（アンチセンス鎖）5'-cggtg
gggttgggtgtggcctcgagtgagccgatcggtggatgaactttcac-3'
（配列番号：２４）、P-M間：（センス鎖）5'-cttagggt
gaaagaaatttcagctagcacggcgcaatggcagatatc-3'（配列番
号：２５）、（アンチセンス鎖）5'-gatatctgccattgcgc
cgtgctagctgaaatttctttcaccctaag-3'（配列番号：２
６）、M-F間：（センス鎖）5'-cttagggataaagtcccttgtg
cgcgcttggttgcaaaactctcccc-3'（配列番号：２７）、
（アンチセンス鎖）5'-ggggagagttttgcaaccaagcgcgcaca
agggactttatccctaag-3'（配列番号：２８）、F-HN間：
（センス鎖）5'-ggtcgcgcggtactttagtcgacacctcaaacaag
cacagatcatgg-3'（配列番号：２９）、（アンチセンス
鎖）5'-ccatgatctgtgcttgtttgaggtgtcgactaaagtaccgcgc
gacc-3'（配列番号：３０）、HN-L間：（センス鎖）5'-
cccagggtgaatgggaagggccggccaggtcatggatgggcaggagtcc-
3'（配列番号：３１）、（アンチセンス鎖）5'-ggactcc
tgcccatccatgacctggccggcccttcccattcaccctggg-3'（配
列番号：３２）をそれぞれ合成し反応に用いた。導入
後、それぞれの断片を上記同様に回収・精製し、cDNAを
アセンブリした（図６(B)）。
鎖）5'-ggagaagtctcaacaccgtccacccaagataatcgatcag-3'
（配列番号：１７）、（アンチセンス鎖）5'-ctgatcgat
tatcttgggtggacggtgttgagacttctcc-3'（配列番号：１
８）、Nhe I:（センス鎖）5'-gtatatgtgttcagttgagcttg
ctgtcggtctaaggc-3'（配列番号：１９）、（アンチセン
ス鎖）5'-gccttagaccgacagcaagctcaactgaacacatatac-3'
（配列番号：２０）、Xho I: （センス鎖）5'-caatgaac
tctctagagaggctggagtcactaaagagttacctgg-3'（配列番
号：２１）、（アンチセンス鎖）5'-ccaggtaactctttagt
gactccagcctctctagagagttcattg-3'（配列番号：２
２）、また制限酵素導入にはNP-P間：（センス鎖）5'-g
tgaaagttcatccaccgatcggctcactcgaggccacacccaaccccacc
g-3'（配列番号：２３）、（アンチセンス鎖）5'-cggtg
gggttgggtgtggcctcgagtgagccgatcggtggatgaactttcac-3'
（配列番号：２４）、P-M間：（センス鎖）5'-cttagggt
gaaagaaatttcagctagcacggcgcaatggcagatatc-3'（配列番
号：２５）、（アンチセンス鎖）5'-gatatctgccattgcgc
cgtgctagctgaaatttctttcaccctaag-3'（配列番号：２
６）、M-F間：（センス鎖）5'-cttagggataaagtcccttgtg
cgcgcttggttgcaaaactctcccc-3'（配列番号：２７）、
（アンチセンス鎖）5'-ggggagagttttgcaaccaagcgcgcaca
agggactttatccctaag-3'（配列番号：２８）、F-HN間：
（センス鎖）5'-ggtcgcgcggtactttagtcgacacctcaaacaag
cacagatcatgg-3'（配列番号：２９）、（アンチセンス
鎖）5'-ccatgatctgtgcttgtttgaggtgtcgactaaagtaccgcgc
gacc-3'（配列番号：３０）、HN-L間：（センス鎖）5'-
cccagggtgaatgggaagggccggccaggtcatggatgggcaggagtcc-
3'（配列番号：３１）、（アンチセンス鎖）5'-ggactcc
tgcccatccatgacctggccggcccttcccattcaccctggg-3'（配
列番号：３２）をそれぞれ合成し反応に用いた。導入
後、それぞれの断片を上記同様に回収・精製し、cDNAを
アセンブリした（図６(B)）。
【００６０】2）の場合、（センス鎖）5'-ggccgcttaatt
aacggtttaaacgcgcgccaacagtgttgataagaaaaacttagggtgaa
agttcatcac-3'（配列番号：３３）、（アンチセンス
鎖）5'-ggccgtgatgaactttcaccctaagtttttcttatcaacactg
ttggcgcgcgtttaaaccgttaattaagc-3'（配列番号：３４）
を合成し、それぞれの合成DNAをリン酸化し、85℃ 2
分、65℃ 15分、37℃ 15分、室温 15分でアニーリング
させ、SeV cDNAへ組み込む。あるいはpUC18またはpBlue
scriptII等のマルチクローニングサイトを終結シグナル
-介在配列-開始シグナル含むプライマーでPCRしてサブ
クローニングし、これをSeV cDNAへ組み込む。得られた
cDNAでのウイルス再構成は上記の通り行う。
aacggtttaaacgcgcgccaacagtgttgataagaaaaacttagggtgaa
agttcatcac-3'（配列番号：３３）、（アンチセンス
鎖）5'-ggccgtgatgaactttcaccctaagtttttcttatcaacactg
ttggcgcgcgtttaaaccgttaattaagc-3'（配列番号：３４）
を合成し、それぞれの合成DNAをリン酸化し、85℃ 2
分、65℃ 15分、37℃ 15分、室温 15分でアニーリング
させ、SeV cDNAへ組み込む。あるいはpUC18またはpBlue
scriptII等のマルチクローニングサイトを終結シグナル
-介在配列-開始シグナル含むプライマーでPCRしてサブ
クローニングし、これをSeV cDNAへ組み込む。得られた
cDNAでのウイルス再構成は上記の通り行う。
【００６１】[実施例２] センダイウイルスにおける極
性効果を利用した遺伝子発現量の制御 II ＜SeVゲノムcDNAの構築とウイルスの回収＞センダイウ
イルス（SeV）全長ゲノムcDNA、pSeV(+)のcDNAにNot I
サイトをL遺伝子の翻訳終止コドンと転写終結シグナル
の間に導入した。導入方法としてはまず、図８のよう
に、pSeV(+)をEco RIで消化した断片（5010bp）をアガ
ロース電気泳動で分離、該当するバンドを切り出し、QI
AEXII Gel Extraction System（QIAGEN社製）で回収・
精製した。回収した断片はpBluescriptII SK+（STRATAG
ENE社製）にライゲーションし、サブクローニングし
た。続いて制限酵素 Not I サイトの導入にはQuickchan
ge Site-Directed Mutagenesis kit（STRATAGENE社製）
を使った。プライマーはセンス側：5'-cgtgcagaacgatcg
aagctccgcggccgctggaagtcttggacttgtcc-3'（配列番号：
３５）、アンチセンス側：5'-ggacaagtccaagacttccagcg
gccgcggagcttcgatcgttctgcacg-3'（配列番号：３６）を
それぞれ合成し反応に用いた。導入後、Xho I-Mlu Iで
消化した断片（2010bp）を上記同様に回収・精製し、cD
NAをアセンブリした（図８）。
性効果を利用した遺伝子発現量の制御 II ＜SeVゲノムcDNAの構築とウイルスの回収＞センダイウ
イルス（SeV）全長ゲノムcDNA、pSeV(+)のcDNAにNot I
サイトをL遺伝子の翻訳終止コドンと転写終結シグナル
の間に導入した。導入方法としてはまず、図８のよう
に、pSeV(+)をEco RIで消化した断片（5010bp）をアガ
ロース電気泳動で分離、該当するバンドを切り出し、QI
AEXII Gel Extraction System（QIAGEN社製）で回収・
精製した。回収した断片はpBluescriptII SK+（STRATAG
ENE社製）にライゲーションし、サブクローニングし
た。続いて制限酵素 Not I サイトの導入にはQuickchan
ge Site-Directed Mutagenesis kit（STRATAGENE社製）
を使った。プライマーはセンス側：5'-cgtgcagaacgatcg
aagctccgcggccgctggaagtcttggacttgtcc-3'（配列番号：
３５）、アンチセンス側：5'-ggacaagtccaagacttccagcg
gccgcggagcttcgatcgttctgcacg-3'（配列番号：３６）を
それぞれ合成し反応に用いた。導入後、Xho I-Mlu Iで
消化した断片（2010bp）を上記同様に回収・精製し、cD
NAをアセンブリした（図８）。
【００６２】遺伝子発現量を見るための遺伝子としてヒ
トVascular Endothelial Growth Factor (VEGF)をPCRで
サブクローニングした。プライマーには 制限酵素Asc I
サイトを付加した5'プライマー：5'-gcggcgcgccaaccatg
aactttctgctgtcttgggtgcattgg-3'（配列番号：３７）、
3'プライマー：5'-gcggcgcgcctcaccgcctcggcttgtcacatc
tgcaagt-3'（配列番号：３８）を合成し、PCRを行っ
た。酵素にはKOD - plus- DNAポリメラーゼ（TOYOBO社
製）を用いた。PCR後、産物をAsc Iで消化し、電気泳動
により精製・回収した。これにセンダイウイルスの転写
終結シグナル-介在配列-転写開始シグナルを付加させる
ためのプラスミドを構築した（図９）。pSeV18+のMlu I
- Sph I断片（3317bp）を組み込んだLITMUS38（pAC114
とする）に終結シグナル-介在配列-開始シグナルとクロ
ーニングサイト（Asc I - Pme I）含む合成二本鎖DNA
（センス鎖：5'-ggccgctaagaaaaacttagggtgaaagttcactt
cacgagggcgcgccgtttaaactgc-3'（配列番号：３９）、ア
ンチセンス鎖：5'-ggccgcagtttaaacggcgcgccctcgtgaagt
gaactttcaccctaagtttttcttagc-3'（配列番号：４０））
を組み込んだものであるpAG180を作製した（図９）。こ
のプラスミドのAscIサイトに、精製・回収したVEGF PCR
産物をライゲーションし、クローニングした。これをNo
t Iで消化してVEGF遺伝子断片を電気泳動で回収・精製
し、センダイウイルスゲノムcDNAのNot Iサイトにライ
ゲーションし組み込んだ。ウイルスベクターcDNAをpSeV
+L/VEGFとした。また実施例１記載の方法で作成した終
結シグナル-介在配列-開始シグナル（図２参照）を、VE
GF cDNAの下流につなぎ、pSeV18+、pSeV(+)HNLに組み込
んだもの（それぞれをpSeV18+/VEGF、pSeV(+)HNL/VEGF
とする）も発現量の比較のため構築した。それぞれのcD
NAからウイルスを従来の方法通り回収し、それぞれSeV1
8+/VEGF、SeVHNL/VEGF、SeVL/VEGFとした。
トVascular Endothelial Growth Factor (VEGF)をPCRで
サブクローニングした。プライマーには 制限酵素Asc I
サイトを付加した5'プライマー：5'-gcggcgcgccaaccatg
aactttctgctgtcttgggtgcattgg-3'（配列番号：３７）、
3'プライマー：5'-gcggcgcgcctcaccgcctcggcttgtcacatc
tgcaagt-3'（配列番号：３８）を合成し、PCRを行っ
た。酵素にはKOD - plus- DNAポリメラーゼ（TOYOBO社
製）を用いた。PCR後、産物をAsc Iで消化し、電気泳動
により精製・回収した。これにセンダイウイルスの転写
終結シグナル-介在配列-転写開始シグナルを付加させる
ためのプラスミドを構築した（図９）。pSeV18+のMlu I
- Sph I断片（3317bp）を組み込んだLITMUS38（pAC114
とする）に終結シグナル-介在配列-開始シグナルとクロ
ーニングサイト（Asc I - Pme I）含む合成二本鎖DNA
（センス鎖：5'-ggccgctaagaaaaacttagggtgaaagttcactt
cacgagggcgcgccgtttaaactgc-3'（配列番号：３９）、ア
ンチセンス鎖：5'-ggccgcagtttaaacggcgcgccctcgtgaagt
gaactttcaccctaagtttttcttagc-3'（配列番号：４０））
を組み込んだものであるpAG180を作製した（図９）。こ
のプラスミドのAscIサイトに、精製・回収したVEGF PCR
産物をライゲーションし、クローニングした。これをNo
t Iで消化してVEGF遺伝子断片を電気泳動で回収・精製
し、センダイウイルスゲノムcDNAのNot Iサイトにライ
ゲーションし組み込んだ。ウイルスベクターcDNAをpSeV
+L/VEGFとした。また実施例１記載の方法で作成した終
結シグナル-介在配列-開始シグナル（図２参照）を、VE
GF cDNAの下流につなぎ、pSeV18+、pSeV(+)HNLに組み込
んだもの（それぞれをpSeV18+/VEGF、pSeV(+)HNL/VEGF
とする）も発現量の比較のため構築した。それぞれのcD
NAからウイルスを従来の方法通り回収し、それぞれSeV1
8+/VEGF、SeVHNL/VEGF、SeVL/VEGFとした。
【００６３】＜発現量の比較＞LLC-MK2細胞を6well プ
レートに1wellあたり5×105cellsずつ蒔き、24時間培養
した後、各ウイルスベクターをmoi=5で感染させ、24時
間後培養上清を200μl回収し、ELISAにより培養上清中
のVEGFの定量を行った。その結果を図１０に示す。これ
によりL遺伝子の下流に組み込むことでVEGFの発現量がN
P遺伝子の上流に組み込んだときより1/10ほど低下する
ことがわかった。本発明者らは、転写開始シグナルを変
更することで発現量を変化させることができることを開
示（WO01/18223）しており、これを組み合わせることに
よりさらに発現量の制御の幅が広がることが予想され
る。
レートに1wellあたり5×105cellsずつ蒔き、24時間培養
した後、各ウイルスベクターをmoi=5で感染させ、24時
間後培養上清を200μl回収し、ELISAにより培養上清中
のVEGFの定量を行った。その結果を図１０に示す。これ
によりL遺伝子の下流に組み込むことでVEGFの発現量がN
P遺伝子の上流に組み込んだときより1/10ほど低下する
ことがわかった。本発明者らは、転写開始シグナルを変
更することで発現量を変化させることができることを開
示（WO01/18223）しており、これを組み合わせることに
よりさらに発現量の制御の幅が広がることが予想され
る。
【００６４】
【発明の効果】本発明により、外来遺伝子を導入するこ
とができる、複製能を有するパラミクソウイルスベクタ
ーが提供された。本発明のベクターは、外来遺伝子の挿
入位置を調節することにより、発現レベルを制御するこ
とが可能である。特に、外来遺伝子をネガティブ鎖ゲノ
ムに挿入することにより、外来遺伝子の発現レベルを低
く抑えることができる。また、２種類以上の部位に外来
遺伝子が挿入されたウイルスベクターの作製も考えられ
る。特にセンダイウイルスベクターは遺伝子導入効率も
広範な細胞種に対して極めて高く、さらに本発明により
外来遺伝子の発現レベルを制御することができるため、
遺伝子治療などの生体における遺伝子導入への利用が期
待される。
とができる、複製能を有するパラミクソウイルスベクタ
ーが提供された。本発明のベクターは、外来遺伝子の挿
入位置を調節することにより、発現レベルを制御するこ
とが可能である。特に、外来遺伝子をネガティブ鎖ゲノ
ムに挿入することにより、外来遺伝子の発現レベルを低
く抑えることができる。また、２種類以上の部位に外来
遺伝子が挿入されたウイルスベクターの作製も考えられ
る。特にセンダイウイルスベクターは遺伝子導入効率も
広範な細胞種に対して極めて高く、さらに本発明により
外来遺伝子の発現レベルを制御することができるため、
遺伝子治療などの生体における遺伝子導入への利用が期
待される。
【００６５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> DNAVEC Research INC. <120> Paramyxovirus vectors used for transduction of foreign genes <130> D3-X0002Y1 <140> <141> <150> JP 2000-152726 <151> 2000-05-18 <150> CA 2322057 <151> 2000-10-27 <160> 40 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 1 ctttcaccct 10 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 2 tttttcttac tacgg 15 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 3 ccaccgacca cacccagcgg ccgcgacagc cacggcttcg g 41 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 4 ccgaagccgt ggctgtcgcg gccgctgggt gtggtcggtg g 41 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 5 gaaatttcac ctaagcggcc gcaatggcag atatctatag 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 6 ctatagatat ctgccattgc ggccgcttag gtgaaatttc 40 <210> 7 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 7 gggataaagt cccttgcggc cgcttggttg caaaactctc ccc 43 <210> 8 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 8 ggggagagtt ttgcaaccaa gcggccgcaa gggactttat ccc 43 <210> 9 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 9 ggtcgcgcgg tactttagcg gccgcctcaa acaagcacag atcatgg 47 <210> 10 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 10 ccatgatctg tgcttgtttg aggcggccgc taaagtaccg cgcgacc 47 <210> 11 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 11 cctgcccatc catgacctag cggccgcttc ccattcaccc tggg 44 <210> 12 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 12 cccagggtga atgggaagcg gccgctaggt catggatggg cagg 44 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 13 gcggcgcgcc atgctgctgc tgctgctgct gctgggcctg 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 14 gcggcgcgcc cttatcatgt ctgctcgaag cggccggccg 40 <210> 15 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 15 gcggccgcgt ttaaacggcg cgccatttaa atccgtagta agaaaaactt agggtgaaag 60 ttcatcgcgg ccgc 74 <210> 16 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 16 gcggccgcga tgaactttca ccctaagttt ttcttactac ggatttaaat ggcgcgccgt 60 ttaaacgcgg ccgc 74 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 17 ggagaagtct caacaccgtc cacccaagat aatcgatcag 40 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 18 ctgatcgatt atcttgggtg gacggtgttg agacttctcc 40 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 19 gtatatgtgt tcagttgagc ttgctgtcgg tctaaggc 38 <210> 20 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 20 gccttagacc gacagcaagc tcaactgaac acatatac 38 <210> 21 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 21 caatgaactc tctagagagg ctggagtcac taaagagtta cctgg 45 <210> 22 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 22 ccaggtaact ctttagtgac tccagcctct ctagagagtt cattg 45 <210> 23 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 23 gtgaaagttc atccaccgat cggctcactc gaggccacac ccaaccccac cg 52 <210> 24 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 24 cggtggggtt gggtgtggcc tcgagtgagc cgatcggtgg atgaactttc ac 52 <210> 25 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 25 cttagggtga aagaaatttc agctagcacg gcgcaatggc agatatc 47 <210> 26 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 26 gatatctgcc attgcgccgt gctagctgaa atttctttca ccctaag 47 <210> 27 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 27 cttagggata aagtcccttg tgcgcgcttg gttgcaaaac tctcccc 47 <210> 28 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 28 ggggagagtt ttgcaaccaa gcgcgcacaa gggactttat ccctaag 47 <210> 29 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 29 ggtcgcgcgg tactttagtc gacacctcaa acaagcacag atcatgg 47 <210> 30 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 30 ccatgatctg tgcttgtttg aggtgtcgac taaagtaccg cgcgacc 47 <210> 31 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 31 cccagggtga atgggaaggg ccggccaggt catggatggg caggagtcc 49 <210> 32 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 32 ggactcctgc ccatccatga cctggccggc ccttcccatt caccctggg 49 <210> 33 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 33 ggccgcttaa ttaacggttt aaacgcgcgc caacagtgtt gataagaaaa acttagggtg 60 aaagttcatc ac 72 <210> 34 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 34 ggccgtgatg aactttcacc ctaagttttt cttatcaaca ctgttggcgc gcgtttaaac 60 cgttaattaa gc 72 <210> 35 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 35 cgtgcagaac gatcgaagct ccgcggccgc tggaagtctt ggacttgtcc 50 <210> 36 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 36 ggacaagtcc aagacttcca gcggccgcgg agcttcgatc gttctgcacg 50 <210> 37 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 37 gcggcgcgcc aaccatgaac tttctgctgt cttgggtgca ttgg 44 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 38 gcggcgcgcc tcaccgcctc ggcttgtcac atctgcaagt 40 <210> 39 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 39 ggccgctaag aaaaacttag ggtgaaagtt cacttcacga gggcgcgccg tttaaactgc 60 <210> 40 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 40 ggccgcagtt taaacggcgc gccctcgtga agtgaacttt caccctaagt ttttcttagc 60
【図１】センダイウイルスゲノムcDNA断片のサブクロー
ニング（A）と新たにNotIサイトを導入し構築した5種類
のセンダイウイルスゲノムcDNAの構造（B）を示す図で
ある。
ニング（A）と新たにNotIサイトを導入し構築した5種類
のセンダイウイルスゲノムcDNAの構造（B）を示す図で
ある。
【図２】SEAPにNotIサイト、転写開始シグナル、介在配
列、転写終結シグナルを付加するためのクローニング用
プラスミドの構造を示す図である。
列、転写終結シグナルを付加するためのクローニング用
プラスミドの構造を示す図である。
【図３】L遺伝子の下流のセンダイウイルスゲノムの構
造（A）、およびL遺伝子の下流へ外来遺伝子を挿入する
ためのクローニング用DNAの構造（B）を示す図である。
造（A）、およびL遺伝子の下流へ外来遺伝子を挿入する
ためのクローニング用DNAの構造（B）を示す図である。
【図４】各センダイウイルスベクターのプラークアッセ
イの結果を示す図である。LAS1000で取り込んだプラー
クアッセイの蛍光画像の一部を示す。
イの結果を示す図である。LAS1000で取り込んだプラー
クアッセイの蛍光画像の一部を示す。
【図５】各センダイウイルスベクター間におけるレポー
ター遺伝子（SEAP）の発現量の違いを比較した結果を示
す図である。SeV18+/SEAPのデータを100としてそれぞれ
相対値を表した。SEAP遺伝子が下流に位置するに従って
その活性すなわち発現量が低下していくことがわかっ
た。
ター遺伝子（SEAP）の発現量の違いを比較した結果を示
す図である。SeV18+/SEAPのデータを100としてそれぞれ
相対値を表した。SEAP遺伝子が下流に位置するに従って
その活性すなわち発現量が低下していくことがわかっ
た。
【図６】センダイウイルスゲノムcDNAに構築したマルチ
クローニングサイトの構造を示す図である。
クローニングサイトの構造を示す図である。
【図７】マルチクローニングサイトの構造を示す図であ
る。塩基配列は、PacI-PmeI-BssHII-TspRIの制限酵素サ
イトとE/I/S配列を有するマルチクローニングサイトの
例を示す。
る。塩基配列は、PacI-PmeI-BssHII-TspRIの制限酵素サ
イトとE/I/S配列を有するマルチクローニングサイトの
例を示す。
【図８】センダイウイルスゲノムcDNA断片のサブクロー
ニングと新たにNot Iサイトを導入し構築したセンダイ
ウイルスゲノムcDNAの構造を示す図である。
ニングと新たにNot Iサイトを導入し構築したセンダイ
ウイルスゲノムcDNAの構造を示す図である。
【図９】VEGFにNot Iサイト、転写開始シグナル、介在
配列、転写終結シグナルを付加するためのクローニング
用プラスミドの構造および付加後のVEGFの構造を示す図
である。
配列、転写終結シグナルを付加するためのクローニング
用プラスミドの構造および付加後のVEGFの構造を示す図
である。
【図１０】ELISAによるVEGF搭載のSeVベクターの発現量
の比較を示す図である。L遺伝子の後にVEGFを搭載した
ものが最も発現量が低かった。
の比較を示す図である。L遺伝子の後にVEGFを搭載した
ものが最も発現量が低かった。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 長谷川 護 茨城県つくば市観音台１丁目25番11号 株 式会社ディナベック研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA08 BA21 BA80 CA04 CA11 CA20 DA03 EA02 FA20 GA11 GA18 HA17 HA20 4C084 AA13 NA14 ZB262 ZB312 ZB332 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 MA02 NA05 NA13 NA14 ZB21 ZB26 ZB31 ZB33
Claims (10)
- 【請求項１】 外来遺伝子を保持し、かつ複製能を有す
るパラミクソウイルスベクターであって、該ベクターに
含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAにおいて、ウイルスタ
ンパク質をコードする遺伝子の下流に外来遺伝子が位置
しているベクター。 - 【請求項２】 外来遺伝子を保持し、かつ複製能を有す
るパラミクソウイルスベクターであって、下記（ａ）か
ら（ｆ）のいずれかに記載のベクター。 （ａ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から１番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子と２番目のウイルスタンパク質をコードする遺
伝子の間に外来遺伝子が挿入されているベクター。 （ｂ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から２番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子と３番目のウイルスタンパク質をコードする遺
伝子の間に外来遺伝子が挿入されているベクター。 （ｃ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から３番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子と４番目のウイルスタンパク質をコードする遺
伝子の間に外来遺伝子が挿入されているベクター。 （ｄ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から４番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子と５番目のウイルスタンパク質をコードする遺
伝子の間に外来遺伝子が挿入されているベクター。 （ｅ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から５番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子と６番目のウイルスタンパク質をコードする遺
伝子の間に外来遺伝子が挿入されているベクター。 （ｆ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から６番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子とトレイラー配列の間に外来遺伝子が挿入され
ているベクター。 - 【請求項３】 ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノム
RNAの3'端から１番目〜６番目に位置するウイルスタン
パク質をコードする遺伝子が、順にNP遺伝子、P遺伝
子、M遺伝子、F遺伝子、HN遺伝子、およびL遺伝子であ
る、請求項２に記載のベクター。 - 【請求項４】 請求項１から３のいずれかに記載のパラ
ミクソウイルスベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノム
RNAまたはその相補鎖をコードするDNA。 - 【請求項５】 複製能を有するパラミクソウイルスベク
ターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAまたはその相補
鎖をコードするDNAであって、該ネガティブ鎖ゲノムRNA
またはその相補鎖において、ウイルスタンパク質をコー
ドする遺伝子の下流に外来遺伝子を挿入するためのクロ
ーニング部位を保持するDNA。 - 【請求項６】 複製能を有するパラミクソウイルスベク
ターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAまたはその相補
鎖をコードするDNAであって、下記（ａ）から（ｆ）の
いずれかに記載のDNA。 （ａ）ネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端から１番目に位置
するウイルスタンパク質をコードする遺伝子と２番目の
ウイルスタンパク質をコードする遺伝子の間に外来遺伝
子を挿入するためのクローニング部位を保持するDNA。 （ｂ）ネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端に相当する部位か
ら２番目に位置するウイルスタンパク質をコードする遺
伝子と３番目のウイルスタンパク質をコードする遺伝子
の間に外来遺伝子を挿入するためのクローニング部位を
保持するDNA。 （ｃ）ネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端に相当する部位か
ら３番目に位置するウイルスタンパク質をコードする遺
伝子と４番目のウイルスタンパク質をコードする遺伝子
の間に外来遺伝子を挿入するためのクローニング部位を
保持するDNA。 （ｄ）ネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端に相当する部位か
ら４番目に位置するウイルスタンパク質をコードする遺
伝子と５番目のウイルスタンパク質をコードする遺伝子
の間に外来遺伝子を挿入するためのクローニング部位を
保持するDNA。 （ｅ）ネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端に相当する部位か
ら５番目に位置するウイルスタンパク質をコードする遺
伝子と６番目のウイルスタンパク質をコードする遺伝子
の間に外来遺伝子を挿入するためのクローニング部位を
保持するDNA。 （ｆ）ネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端に相当する部位か
ら６番目に位置するウイルスタンパク質をコードする遺
伝子とトレイラー配列の間に外来遺伝子を挿入するため
のクローニング部位を保持するDNA。 - 【請求項７】 ネガティブ鎖ゲノムRNAの3'端に相当す
る部位から１番目〜６番目に位置するウイルスタンパク
質をコードする遺伝子が、順にNP遺伝子、P遺伝子、M遺
伝子、F遺伝子、HN遺伝子、およびL遺伝子である、請求
項６に記載のDNA。 - 【請求項８】 請求項４から７のいずれかに記載のDNA
を転写可能に保持するベクターDNA。 - 【請求項９】 ポジティブ鎖ゲノムRNAを転写可能に保
持する、請求項８に記載のベクターDNA。 - 【請求項１０】 パラミクソウイルスベクターにおける
外来遺伝子の発現レベルを制御する方法であって、 （ａ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から１番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子と２番目のウイルスタンパク質をコードする遺
伝子の間に外来遺伝子を位置させる方法。 （ｂ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から２番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子と３番目のウイルスタンパク質をコードする遺
伝子の間に外来遺伝子を位置させる方法。 （ｃ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から３番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子と４番目のウイルスタンパク質をコードする遺
伝子の間に外来遺伝子を位置させる方法。 （ｄ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から４番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子と５番目のウイルスタンパク質をコードする遺
伝子の間に外来遺伝子を位置させる方法。 （ｅ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から５番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子と６番目のウイルスタンパク質をコードする遺
伝子の間に外来遺伝子を位置させる方法。 （ｆ）ベクターに含まれるネガティブ鎖ゲノムRNAの3'
端から６番目に位置するウイルスタンパク質をコードす
る遺伝子とトレイラー配列の間に外来遺伝子を位置させ
る方法。
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|---|---|---|---|
| JP2001145935A JP4791651B2 (ja) | 2000-05-18 | 2001-05-16 | 外来遺伝子導入用パラミクソウイルスベクター |
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000152726 | 2000-05-18 | ||
| JP2000-152726 | 2000-05-18 | ||
| JP2322057 | 2000-05-18 | ||
| JP2000152726 | 2000-05-18 | ||
| CA2322057 | 2000-10-27 | ||
| CA002322057A CA2322057A1 (en) | 2000-05-18 | 2000-10-27 | Paramyxovirus vectors used for transfer of foreign genes |
| JP2001145935A JP4791651B2 (ja) | 2000-05-18 | 2001-05-16 | 外来遺伝子導入用パラミクソウイルスベクター |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002272465A true JP2002272465A (ja) | 2002-09-24 |
| JP4791651B2 JP4791651B2 (ja) | 2011-10-12 |
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| EP2434020A2 (en) | 2004-01-22 | 2012-03-28 | Dnavec Research Inc. | Method of producing minus strand RNA virus vector with the use of hybrid promoter containing cytomegalovirus enhancer and avian beta-actin promoter |
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-
2001
- 2001-05-16 JP JP2001145935A patent/JP4791651B2/ja not_active Expired - Fee Related
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