JP2002267671A

JP2002267671A - 免疫測定法

Info

Publication number: JP2002267671A
Application number: JP2001072260A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Okada; 研一岡田; Riyouko Morioka; 量子森岡
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2001-03-14
Filing date: 2001-03-14
Publication date: 2002-09-18

Abstract

(57)【要約】【課題】バックグラウンド発色が生じることなく被検物
質を検出できる免疫測定法を提供すること。【解決手段】免疫クロマトグラフ法において、界面活性
剤の存在下、被検試料を、（ａ）吸水性基材上に、被検
物質に特異的に結合しうる第１の特異的結合物質が固定
化された固定相を有する試験片に展開することを特徴と
する、免疫測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、バックグラウンド
発色が抑制されうる免疫測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】大腸菌Ｏ１５７等の感染性病原体の検
査、または感染症をはじめとする種々の疾患の診断分野
において、免疫化学的検査が行なわれている。特に、被
検物質を高感度かつ再現性よく測定するために、酵素免
疫法（ＥＩＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ
法）等の免疫測定法が汎用されている。しかしながら、
かかる方法は、特別な設備が必要である。さらに前記免
疫測定法は、操作時間、または検出時間が長く、洗浄工
程も有するため、結果が出るまでに時間がかかるという
欠点を有する。

【０００３】近年、迅速かつ簡便に免疫化学的検査が行
なえる方法として、免疫クロマトグラフ法が注目されて
いる。当該方法は、例えば以下の工程を経る。被検試料
中に被検物質が存在する場合、試験片上に被検物質と結
合しうる特異的結合物質を固定化した固定相に、該被検
物質に特異的に結合しうる特異的結合物質と標識物質と
を含有した標識複合体と該被検物質との複合体が形成す
る。続いて固定相にて結合した標識物質を検出すること
により、被検試料中に被検物質の存在を確認することが
できる。

【０００４】また、被検物質が細菌由来の物質であり、
その菌体に内在している場合、被検試料中に被検物質が
含まれているにも関わらず検出ができない場合がある。
このような場合、内包されている被検物質を放出させる
ことが有効である。溶菌処理における溶菌剤としては、
一般的に、ポリミキシンＢ等の抗生物質が用いられる。

【０００５】しかしながら、被検試料をポリミキシンＢ
等を溶菌剤として用いて処理し、得られた被検試料を免
疫クロマト測定法に適用した場合、被検試料中の前記溶
菌剤の存在により非特異的なシグナル（発色）が現れた
り、バックグラウンド発色が高くなるため、確実な判定
が妨げられるという欠点を有する。

【０００６】したがって、菌体に内在する被検物質を放
出させて、かつバックグラウンド発色の不具合のない免
疫測定法が求められている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記従来技
術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、バッ
クグラウンド発色が生じることなく被検物質を検出でき
る免疫測定法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、免
疫クロマトグラフ法において、界面活性剤の存在下、被
検試料を、（ａ）吸水性基材上に、被検物質に特異的に
結合しうる第１の特異的結合物質が固定化された固定相
を有する試験片に展開することを特徴とする、免疫測定
法、に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の免疫測定法は、免疫クロ
マトグラフ法において、界面活性剤の存在下、被検試料
を、（ａ）吸水性基材上に、被検物質に特異的に結合し
うる第１の特異的結合物質が固定化された固定相を有す
る試験片、に展開することを１つの特徴とする。本発明
によれば、界面活性剤の存在下、被検試料を展開するた
め、溶菌剤（ポリミキシンＢ等）の影響が抑制されるこ
とにより、免疫クロマトグラフ法においてバックグラウ
ンド発色が生じることなく被検物質を検出することがで
きる。また溶菌作用を持つ界面活性剤を用いることによ
り溶菌剤（ポリミキシンＢ等）の添加が必要となくなる
ため、免疫クロマトグラフ法においてバックグラウンド
発色が生じることなく被検物質を検出することができ
る。

【００１０】本発明の免疫測定法により検出されうる被
検物質としては、免疫化学的反応（すなわち抗原抗体反
応）によりサンドイッチ免疫複合体を形成し得るもので
あれば特に制限されない。例えば、細菌（特に大腸菌Ｏ
１５７、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌等の病原性大腸
菌）、放線菌、酵母、かび、ウィルス（特にＨＩＶ、Ｈ
ＢＶ、ＨＣＶ等）等の微生物またはそれらに対する抗
体、細菌等が産生する毒素などの細菌由来の物質、ある
いは腫瘍マーカー抗原等の生体試料中の抗原性ペプチド
等が挙げられる。本発明の免疫測定法は、特に細菌由来
の物質を被検物質とし、細菌を溶菌して該被検物質を検
出する場合に有利である。

【００１１】前記細菌としては、例えば、大腸菌（具体
的には大腸菌Ｏ１５７等）、腸炎ビブリオ等のグラム陰
性菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌等のグラム陽性菌
等が挙げられる。前記免疫測定法においては、市場での
要求としてグラム陰性菌が好ましい。なかでも、大腸菌
が好ましい。

【００１２】また、前記細菌等が産生する毒素として
は、具体的には病原性微生物が産生する毒素、菌体内の
核酸等が挙げられる。かかる毒素としては、例えば、ベ
ロ毒素、志賀毒素等が挙げられる。前記免疫測定法にお
いては、毒素が細菌体内に内包されやすく、溶菌処理が
必要であるという観点から、ベロ毒素および志賀毒素が
好ましい。

【００１３】本発明の免疫測定法において、被検試料と
しては、前記被検物質を含有する疑いがある試料が挙げ
られる。具体的には、培養液および血液成分等が挙げら
れる。また、前記被検試料は液体試料であってもよく、
固体試料であってもよい。固体試料の場合、該固体試料
を、例えば、緩衝液、生理的食塩水等の溶媒に、溶解ま
たは希釈して得られた溶液として用いてもよい。

【００１４】前記界面活性剤は、標識複合体に作用する
ことなく良好な検出が得られる観点から、ノニオン系ま
たはノニオン−アニオン系の界面活性剤が好ましい。ま
た、界面活性剤は、被検物質を変性させにくいものが望
ましく、例えば、被検物質がタンパク質である場合に
は、好ましくはタンパク質変性作用の少ない界面活性剤
が望ましい。前記界面活性剤は、バックグラウンド発色
の抑制効果を十分に発揮し、かつ免疫反応を行ない得る
ものであればよく、免疫反応を阻害しにくい観点から、
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅ
ｅｎ^TM２０）、ポリオキシエチレンモノパルミタート
（Ｔｗｅｅｎ^TM４０）、ポリオキシエチレンソルビタン
モノステアレート（Ｔｗｅｅｎ^TM６０）、ポリオキシエ
チレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ^TM８
０）、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート
（Ｔｗｅｅｎ^TM８５）、ポリオキシエチレンオクチルフ
ェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ^TMＸ−１００）、ドデシ
ルベンゼンスルホン酸ナトリウム等が好ましい。また、
被検物質が細菌菌体内に存在する物質である場合、界面
活性剤は、溶菌作用を有するものが好ましい。

【００１５】界面活性剤は、溶媒に溶解させて用いても
よい。前記溶媒は、バックグラウンド発色の抑制効果を
十分に発揮し、かつ免疫反応を行ない得るものであれば
よく、例えば、蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が挙げら
れる。

【００１６】本発明の免疫測定法においては、前記被検
試料と界面活性剤とを、あらかじめ混合して、得られた
混合物を試験片に滴下して、展開してもよい（態様
１）。

【００１７】被検試料と界面活性剤とをあらかじめ混合
しておく場合、得られた混合物における界面活性剤の終
濃度は、効果を十分に発揮する観点から、０．０１重量
％以上が好ましく、０．１重量％以上がさらに好まし
く、良好な検出の観点から、３重量％以下が好ましく、
１重量％以下がさらに好ましい。

【００１８】被検物質が細菌内に存在する物質である場
合、混合時に振盪することが好ましい。さらに、得られ
た混合物を遠心分離し、得られた上清を被検試料として
もよい。この場合、混合物中の界面活性剤の量は、溶菌
作用を十分に発揮させる観点から、用いる界面活性剤の
臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以上となる量であり、また、
免疫測定法を十分に行なう観点から、０．０１〜３重量
％が好ましく、０．１〜１重量％がさらに好ましい。

【００１９】前記態様１の方法の具体例としては、
（１）被検試料と界面活性剤とを混合して、混合物を得
るステップ、および（２）前記（１）で得られた混合物
を、試験片に滴下して、展開するステップ、を含み、被
検試料中における被検物質の有無を、下記（ｂ）と
（ｃ）：（ｂ）試験片の固定相における第１の特異的結
合物質に捕捉された被検物質、（ｃ）金属コロイド粒
子、水分散型高分子粒子、シリコーンおよびガラスケイ
ソウ土粒子からなる群より選ばれた１種の粒子を担体と
し、該担体に、被検物質に特異的に結合しうる第２の特
異的結合物質と標識物質とを固定化した標識複合体、と
の複合体の有無により検出する方法が挙げられる。

【００２０】また、本発明の免疫測定法においては、被
検試料にポリミキシンＢ等の溶菌剤を含む場合は、被検
試料と界面活性剤とを、それぞれ別に試験片に滴下し
て、展開し、試験片上で被検試料と界面活性剤とが共存
するようにしてもよい（態様２）。

【００２１】前記態様２の方法の具体例としては、被検
試料を含有した溶液（但し、溶菌剤を含む）と界面活性
剤とを、それぞれ別に試験片に滴下して、展開するステ
ップ、を含み、被検試料中における被検物質の有無を、
下記（ｂ）と（ｃ）：（ｂ）試験片の固定相における第
１の特異的結合物質に捕捉された被検物質、（ｃ）金属
コロイド粒子、水分散型高分子粒子、シリコーンおよび
ガラスケイソウ土粒子からなる群より選ばれた１種の粒
子を担体とし、該担体に、被検物質に特異的に結合しう
る第２の特異的結合物質と標識物質とを固定化した標識
複合体、との複合体の有無により検出する方法が挙げら
れる。

【００２２】特異的結合物質としては、被検物質に特異
的に結合し得る物質であればよく、例えば、抗原、ハプ
テン、抗体、オリゴヌクレオチド、エフェクター、レセ
プター、酵素、酵素補助因子、酵素阻害剤等が挙げられ
る。前記特異的結合物質は、被検物質に応じて、サンド
イッチ法等の通常の検出方法で用いられる公知の物質を
少なくとも１種選択すればよい。

【００２３】前記特異的結合物質が抗原またはハプテン
の場合、当該抗原およびハプテンとしてはクラミジア・
トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・
ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキ
ソプラズマ・ゴンディ、ボレリア等の各種微生物抗原、
マイコプラズマ脂質抗原、ＨＡ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＢ
ｅ抗原、ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原および前
記抗原に由来するハプテン等が挙げられる。

【００２４】前記特異的結合物質が抗体の場合、当該抗
体としてはモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を
使用することができる。

【００２５】本発明においては、被検物質の検出に際し
て、抗原、ハプテンまたは抗体からなる群より選ばれた
特異的結合物質を有し、かつ標識物質による標識を有す
る担体からなる標識複合体を用いることが望ましい。

【００２６】なお、本明細書において、「特異的結合物
質」には、被検物質の検出の際に用いられる標識複合体
に用いられる特異的結合物質（以下、第２の特異的結合
物質という）、および展開した被検物質を試験片上で捕
捉するための固定相に用いられる特異的結合物質（以
下、第１の特異的結合物質という）のいずれをも包含さ
れる。したがって、単に「特異的結合物質」と記載する
場合、第１または第２のいずれか、あるいは第１および
第２の特異的結合物質を総称することを意図する。

【００２７】標識複合体に用いられる担体としては、そ
の表面上に、特異的結合物質および標識物質を固定する
ことができる担体であればよく、金属コロイド粒子、水
分散型高分子粒子、シリコーン、ガラスケイソウ土粒子
等が挙げられる。

【００２８】水分散型高分子粒子としては、粒径コント
ロール、分散安定性、結合容易性の観点から、ラテック
ス粒子が好ましい。前記水分散型高分子粒子は、例え
ば、不飽和二重結合を有する少なくとも１種の単量体の
乳化重合によって調製される。かかる単量体としては、
例えば、エチレン、プロピレン等のオレフィン系単量
体、酢酸ビニル、塩化ビニル等のビニル系単量体、スチ
レン、メチルスチレン、クロロスチレン等のスチレン系
単量体、メタアクリル酸メチル等のメタクリル酸エステ
ル系単量体、ブタジエン等のジエン系単量体等が挙げら
れる。

【００２９】担体の粒子径は、分散性、ならびに酵素、
特異的結合物質等の固定化量の調整を良好にする観点か
ら、好ましくは３μｍ以下、さらに好ましくは２μｍ以
下であり、得られた標識複合体の精製の容易性の観点か
ら、好ましくは０．０１μｍ以上、さらに好ましくは
０．１μｍ以上であることが望ましい。

【００３０】標識複合体に用いられる標識物質として
は、着色粒子、酵素、蛍光物質等が挙げられる。かかる
標識物質は、単独でまたは２種以上を混合して用いるこ
とができる。

【００３１】前記着色粒子としては、肉眼で色が検出可
能なものであればよく、例えば、金コロイド粒子等の金
属コロイド粒子；スダンブルー、スダンレッドIV、スダ
ンIII 、オイルオレンジ、キニザリングリーン等に代表
される染料、顔料等でラテックス粒子を着色した着色ラ
テックス粒子等が挙げられる。前記着色粒子の平均粒子
径は、発色の良好性の観点から、約０．０１μｍ以上、
好ましくは０．０５μｍ以上であり、着色粒子の僅かな
凝集に起因する吸水性基材の目詰まりを防ぐ観点から、
約３μｍ以下、好ましくは、約０．０５μｍ以下である
ことが望ましい。具体的には、約０．０１〜３μｍ、好
ましくは、約０．０５〜０．５μｍの範囲であることが
望ましい。

【００３２】前記酵素としては、公知の標識に用いられ
る酵素を用いることができる。具体的にはペルオキシダ
ーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、エス
テラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ等が挙げられる。
より高感度で安定な検出を達成することが可能なペルオ
キシダーゼまたはアルカリホスファターゼが好ましい。

【００３３】前記蛍光物質としては、フルオレセインイ
ソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシ
アネート等が挙げられる。

【００３４】担体に、特異的結合物質および標識物質を
固定させる方法としては、疎水結合（物理的吸着）、イ
オン結合、共有結合等が利用できる。安定性の観点か
ら、共有結合を介して結合させる際に、必要に応じて、
特異的結合物質等の当該高分子粒子上での自由度を高め
るために、スペーサー基を介在させることができる。

【００３５】このようにして得られた標識複合体中に含
まれる特異的結合物質および標識物質の総固定量は、担
体の乾燥重量１ｇあたり好ましくは５〜２００ｍｇであ
り、その量は上記の範囲内で、使用する特異的結合物
質、標識物質の種類等によって適宜変更し得る。例え
ば、担体が水分散型高分子粒子の場合、当該粒子の表面
積に鑑みると、前記総固定量は、水分散型高分子粒子の
乾燥重量１ｇあたり、好ましくは２００ｍｇ以下であ
り、さらに好ましくは１５０ｍｇ以下であり、被検物質
の検出の迅速性、感度、再現性の観点から、好ましくは
５ｍｇ以上であり、さらに好ましくは１０ｍｇ以上であ
ることが望ましい。

【００３６】ここで、担体の「乾燥重量」とは、一定量
の担体を１２０℃で２時間乾燥した後の重量をいう。

【００３７】本発明において、標識物質として、酵素を
用いる場合は、標識量はその活性としても表すことがで
きる。勿論、用いる酵素の種類、その基質、温度等種々
の条件によって異なる。用いる酵素がペルオキシダーゼ
である場合には、活性を以下の方法で測定する：基質で
あるＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジ
ジン）０．２ｍｇ／ｍｌと過酸化水素０．０１％とを含
む０．１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）３．３ｍｌ
に、標識複合体０．０１２５％懸濁液を１００μｌ混合
して、２５℃で反応、５８０ｎｍの波長での吸光度を経
時的に測定し、１分間に当該吸光度を１増加させる酵素
活性を１Ｕ（ユニット）として換算する。

【００３８】例えば、ペルオキシダーゼの場合、標識複
合体が、水分散型高分子粒子の乾燥重量１ｇあたり、
５，０００〜３００，０００Ｕ、好ましくは１０，００
０〜３００，０００Ｕ、より好ましくは５０，０００〜
３００，０００Ｕの酵素活性を有するように該ペルオキ
シダーゼが固定されていることが望ましい。

【００３９】特異的結合物質が、ペプチドを有する物
質、例えば、抗体、抗原もしくはハプテンである場合、
または標識物質が酵素である場合、その固定量の測定
は、色素結合法等の慣用のタンパク質定量法により測定
し、タンパク質の量として算出する。特異的結合物質が
オリゴヌクレオチドの場合は、固定後の遊離のオリゴヌ
クレオチドを２６０ｎｍの吸光度を測定することにより
算出する。

【００４０】このように担体に特異的結合物質および標
識物質を固定させた後、例えば膜分離法や濾過、遠心分
離法等の慣用の分離法によって、標識複合体を分離精製
することができる。標識複合体は、水中に浸漬して保存
してもよく、または凍結乾燥して保存してもよい。

【００４１】本発明において試験片としては、吸水性基
材上に、被検物質に特異的に結合し得る第１の特異的結
合物質が固定化された固定相を有する試験片が挙げられ
る。試験片に用いられる吸水性基材は、被検試料を吸収
できる基材、またはこれらを緩衝液によって希釈した希
釈液を吸収する基材であればよい。本発明においては、
被検試料中の被検物質と標識複合体中の第２の特異的結
合物質や固定相の第１の特異的結合物質との充分な反応
を行なうための時間を確保できるような吸水性基材が用
いられる。好ましい具体例としては、適度な吸水速度を
有する観点から、例えば、不織布、濾紙、ガラス繊維
布、ガラスフィルター、ニトロセルロース、多孔質材料
等が挙げられる。

【００４２】吸水性基材の吸水性の程度は、５ｍｍ幅の
短冊状に裁断した吸水性基材の片端部に水を浸漬し、１
分間経過後の吸水距離が０．５〜５ｃｍ程度のものが望
ましい。親水性重合体を使用して吸水性基材の吸水性を
調整することもできる。

【００４３】本発明において、吸水性基材の形状は、被
検試料を展開できる形状であれば特に限定されるもので
はなく、例えば、矩形のシート状（片状）やロッド状等
が好ましい。

【００４４】前記試験片の固定相に用いられる第１の特
異的結合物質は、前記標識複合体に用いられる第２の特
異的結合物質と同様である。例えば、標識複合体に用い
られる第２の特異的結合物質が抗体の場合、固定相に
は、同じ抗体または同一抗原の別のエピトープを認識す
る抗体を使用することができる。標識複合体に用いられ
る第２の特異的結合物質が抗原やハプテンの場合、固定
相には、同一の抗原、ハプテンあるいは第２の特異的結
合物質とは異なるが被検物質と特異的に結合する抗原、
抗体、ハプテン等が用いられる。

【００４５】固定相は、公知の物理吸着法、共有結合法
等により作製されうる。また、固定相に使用する第１の
特異的結合物質と親水性重合体とを含む溶液を吸水性基
材に塗布した後、該親水性重合体を凝固させる凝固溶剤
に浸漬することで固定相を作製することもできる。親水
性重合体としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロー
ス、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロー
ス等が挙げられる。凝固溶剤としては、アセトン、エタ
ノール、メタノール、エーテル等が挙げられる。

【００４６】固定相は、被検試料の吸液によって展開し
移動してきた複合体を捕捉するために、吸水性基材上に
特異的結合物質を０．００５〜５ｍｇ／ｃｍ²塗布する
ことが望ましい。

【００４７】固定後の吸水性基材は、被検対象でないタ
ンパク質の基材への非特異的吸着の防止、展開の容易
性、固定した第１の特異的結合物質の保存安定性の観点
から、ブロッキング剤、界面活性剤および糖を含有する
溶液（処理液という）で処理されることが好ましい。こ
こで使用するブロッキング剤としては、ウシ血清アルブ
ミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク等が挙げられ
る。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン（１０）
オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルアリ
ルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキ
ルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキ
ルフェニルエーテル等が挙げられる。前記処理液中のブ
ロッキング剤の含有量は、好ましくは０．１〜１０重量
％である。前記処理液中の界面活性剤の含有量は、好ま
しくは０．０１〜１重量％である。前記処理液中の糖の
含有量は、０．１〜１０重量％である。

【００４８】本発明に用いられる試験片には、滴下パッ
ド部、すなわち、試料受領部（試料を供するための部
分）と、展開組成物受領部（展開組成物を供給するため
の部分）または発色基質溶液受領部（発色基質溶液を供
給するための部分）とを設けてもよい。また、被検試料
等に含まれる液体成分の接触により前記標識複合体を展
開できるように、該標識複合体を試験片に固定させても
よい。

【００４９】また本発明に用いられる試験片において、
展開移動距離は、固定相での発色の均一性および発色感
度の観点から、０．５ｃｍ以上、好ましくは１ｃｍ以上
となり、固定相までの被検試料の到達性、発色感度およ
び測定時間の観点から、８ｃｍ以下、好ましくは６ｃｍ
以下となるように設定されていることが望ましい。

【００５０】本発明においては、前記展開移動距離を得
るように、試料受領部、固定相等を配置した試験片を用
いることができる。

【００５１】被検試料、試薬等の展開方法としては、試
験片の一端側から、上記の方法で調製した複合体の溶液
を加え、毛細管現象によって自然展開させる。また、試
料受領部の反対端に吸水パッドを設けてもよく、これに
より、試験片を展開する液体部分を吸収するので展開が
容易に進行する。

【００５２】ついで、固定相上で〔被検物質−標識複合
体〕の複合体の形成の有無を検出する。〔被検物質−標
識複合体〕の複合体の検出は、標識複合体中の標識物質
を測定することにより検出することができ、色を有する
担体を有する標識複合体を用いた場合、固定相における
呈色の有無により検出できる。固定相上で前記複合体が
検出された場合（例えば、固定相における呈色等）、被
検試料中に被検物質が存在することの指標となる。

【００５３】

【実施例】以下、実施例および比較例を挙げ、さらに具
体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定
されるものではない。

【００５４】調製例１：標識複合体溶液の作製１）ラテックス粒子懸濁液の作製スチレン５０ｇと、アクリル酸０．５ｇと、トリエチレ
ングリコールメタクリレート０．２ｇと、蒸留水４４０
ｇとからなる混合液を窒素ガス雰囲気下で７５℃に維持
し、攪拌しながら、重合開始剤として過硫酸カリウム
０．２５ｇを蒸留水１０ｇに溶解した水溶液を加え、１
０時間重合を行なった。その結果、カルボキシル化され
た水分散性粒子としてカルボキシル化ポリスチレンラテ
ックス粒子（平均粒子径：０．２μｍ）を得た。

【００５５】得られたカルボキシル化ポリスチレンラテ
ックス粒子を緩衝液（０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液、ｐＨ
８．２）に固形分濃度が５重量％になるよう分散し、ラ
テックス粒子分散液を得た。

【００５６】２）固定化本実施例では、特異的結合物質として抗体（抗ベロ毒素
１型抗体）および標識物質として酵素（西洋ワサビペル
オキシダーゼ）を用いた。前記抗体および酵素を上記
１）で作製したラテックス粒子に以下のようにして固定
した。

【００５７】前記１）で得られたラテックス粒子懸濁液
３ｍｌに、水溶性カルボジイミド〔同仁化学研究所製、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ
酸緩衝液（ｐＨ８．２）〕０．６ｍｌと、抗ベロ毒素１
型抗体〔以下、抗ＶＴ１抗体と略す；トキシンテクノロ
ジー社製、２ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．２）〕２．１ｍｌとを加えて１０℃で３時間
反応させた。次いで、得られた反応物について、洗浄液
として０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）を用い
て遠心分離洗浄を行い、前記０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液
で固形分濃度５重量％に調製し、抗体固定化ラテックス
粒子懸濁液を得た。

【００５８】次いで、上記で作製した抗体固定化ラテッ
クス粒子懸濁液３ｍｌに、水溶性カルボジイミド〔同仁
化学研究所製、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍｌ、
０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）〕１ｍｌと、
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ〔以下、ＨＲＰと略
す；和光純薬社製、１２ｍｇ／ｍｌ（比活性２５０〜３
５０Ｕ／ｍｇ）、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
２）〕２ｍｌとを加えて１０℃で３時間反応させた。次
いで、得られた反応物について、洗浄液として０．０１
Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）を用いて遠心分離洗浄
を行い、前記０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液で固形分濃度
２．５重量％に調製し、抗ＶＴ１抗体とＨＲＰとを固定
化したラテックス粒子の懸濁液（標識複合体懸濁液とい
う）を作製した。

【００５９】得られた標識複合体において、標識複合体
乾燥重量１ｇあたりの抗体（分子量約１．６×１０⁵）
固定化量は２５．０ｍｇ、酵素（分子量約４×１０⁴）
の固定化量は２０．０ｍｇ、および酵素活性は４３３０
０Ｕであった。

【００６０】３）標識複合体溶液の調製前記標識複合体懸濁液を緩衝溶液（組成：０．０１Ｍ−
ホウ酸緩衝液、ｐＨ８．２）で希釈して標識複合体溶液
を調製した。希釈比は、標識複合体懸濁液：緩衝液＝
１：１５０とした。

【００６１】調製例２：標識複合体溶液の調製調製例１の２）で得られた標識複合体懸濁液１００μｌ
を、緩衝溶液（組成：０．２Ｍ−塩化アンモニウム／
０．９重量％ＮａＣｌ／０．１重量％ウシ血清アルブミ
ン、ｐＨ８．２）１５ｍｌに混合し、標識複合体溶液を
調製した。

【００６２】調製例３：免疫クロマトグラフィー用試験
片の作製抗ＶＴ１抗体（トキシンテクノロジー社製、１ｍｇ／ｍ
ｌ、０．０１Ｍ−リン酸緩衝液、０．９重量％ＮａＣｌ
含有、ｐＨ７．２）をニトロセルロースメンブレン（ワ
ットマン社製、孔径約１２μｍ、ＰＥＴ（ポリエチレン
テレフタレート）サポート付、６ｍｍ×６０ｍｍ）の一
端から３０ｍｍの箇所に、ディスペンサーを用いてライ
ン状（幅１ｍｍ）に塗布し、固定相を配置したメンブレ
ンを得た。

【００６３】得られたメンブレンを、ウシ血清アルブミ
ン（オリエンタル酵母社製、１重量％）と、プライサー
フＡ２１２Ｅ（第一工業製薬社製、０．１重量％）と、
サッカロース（和光純薬工業社製、１重量％）とを含む
水溶液中に２０分浸漬させた。ついで、得られたメンブ
レンを、室温で１６時間乾燥させた。

【００６４】次に、終濃度１重量％となるようにＴＭＢ
をトルエンで溶解して得られた発色基質溶液１．２μｌ
を、前記ニトロセルロースメンブレン上の固定相から５
ｍｍ離れた箇所に塗布した。その後、得られたメンブレ
ンを乾燥させて発色基質相とした。

【００６５】固定相から発色基質相と同じ方向に１０〜
２２ｍｍの箇所にポリエステル製不織布（７×１２ｍ
ｍ、厚さ１ｍｍ）を貼り合わせ、試料受領部を作製し
た。また、固定相から試料受領部と同じ方向に２７〜３
９ｍｍの箇所にポリエステル不織布（７×１２ｍｍ、厚
さ１ｍｍ）を貼り合せ、展開組成物受領部を作製した。

【００６６】さらに固定相から試料受領部と逆の方向に
２０〜５０ｍｍの箇所に吸水剤基材としてガラス繊維製
不織布（ワットマン社製、ＧＦ／Ｂ、１５×３０ｍｍ、
厚さ１ｍｍ）を貼り合せた。前記のようにして得られた
試験片は一例であり、かかる試験片にのみ限定されるも
のではない。

【００６７】調製例４：免疫クロマトグラフィー用試験
片の作製抗ＶＴ１抗体（トキシンテクノロジー社製、１ｍｇ／ｍ
ｌ、０．０１Ｍ−リン酸緩衝液、０．９重量％ＮａＣｌ
含有、ｐＨ７．２）をニトロセルロースメンブレン（ワ
ットマン社製、孔径約１２μｍ、ＰＥＴ（ポリエチレン
テレフタレート）サポート付、６ｍｍ×６０ｍｍ）の一
端から３０ｍｍの箇所に、ディスペンサーを用いてライ
ン状（幅１ｍｍ）に塗布し、固定相を配置したメンブレ
ンを得た。

【００６８】得られたメンブレンをウシ血清アルブミン
（オリエンタル酵母社製、１重量％）およびプライサー
フＡ２１２Ｅ（第一工業製薬社製、０．１重量％）、サ
ッカロース（和光純薬工業社製、１重量％）とを含む水
溶液中に２０分浸漬させた。次いで、得られたメンブレ
ンを、室温で１６時間乾燥させた。

【００６９】固定相から７〜１４ｍｍの箇所にポリエス
テル製不織布（７×７ｍｍ、厚さ１ｍｍ）を貼り合せ、
試料受領部を作製した。また固定相から試料受領部と同
じ方向に２６〜３８ｍｍの箇所にポリエステル不織布
（７×１２ｍｍ、厚さ１ｍｍ）を貼り合せ発色基質溶液
受領部を作製した。

【００７０】さらに固定相から試料受領部と逆の方向に
１７〜４７ｍｍの箇所に吸水パッドとしてガラス繊維製
不織布（ワットマン社製、ＧＦ／Ｂ、１５×３０ｍｍ、
厚さ１ｍｍ）を貼り合せた。前記のようにして得られた
試験片は一例であり、かかる試験片にのみ限定されるも
のではない。

【００７１】調製例５：試料の調製１．０×１０⁴Ｕ／ｍｌのポリミキシンＢを含む生理食
塩水中、最終濃度が０ｎｇ／ｍｌ（対照）、１ｎｇ／ｍ
ｌ、２ｎｇ／ｍｌまたは４ｎｇ／ｍｌになるようにベロ
毒素１型（以下、ＶＴ１と略す）を添加して試料を調製
した。

【００７２】試験例１前記調製例５で得られた試料５００μｌを、０．４重量
％Ｔｗｅｅｎ２０／蒸留水５００μｌに添加し、混合物
（実施例１）とした。

【００７３】前記混合物７０μｌを調製例３で作製した
各試験片の試料受領部に供し、直ちに混合物を展開させ
た。ついで、前記試験片の前記試料受領部に標識複合体
溶液２５μｌを供し、次いで展開組成物受領部に展開組
成物〔組成：０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）、２０ｍＭイミダゾール、０．０１重量％Ｈ₂Ｏ
₂、０．１２重量％硫酸デキストランナトリウム、１
０重量％ヘキサントリオール〕１５０μｌを供し、展開
させた。

【００７４】展開後、試験片の固定相における１０〜２
０分後の発色の有無を目視確認した。その結果を表１に
示す。

【００７５】前記調製例５で得られた試料５００μｌ
を、生理食塩水５００μｌに添加し、混合物（比較例
１）とした。以下、実施例１と同様に展開し、展開後、
試験片の固定相における１０〜２０分後の発色の有無を
目視確認した。その結果を表１に示す。

【００７６】なお、判定基準は以下の通りである。＋：固定相に発色が見られる ±：固定相に弱い発色が見られる −：固定相に発色が見られない

【００７７】

【表１】

【００７８】表１より、比較例１のように界面活性剤を
含まない混合物（界面活性剤の非存在下）を用いた場
合、バックグラウンド発色が生じ、判定性が悪いことが
わかる。また、実施例１のように界面活性剤を含む混合
物（界面活性剤の存在下）を用いた場合、バックグラウ
ンド発色は認められず、良好に判定できることがわか
る。なお、実施例１の方法の感度は、比較例１の方法の
ものと同等であった。したがって、界面活性剤を含む混
合物を用いることで、バックグラウンド発色が改善さ
れ、判定の確実性が向上することが示される。

【００７９】調製例６：試料１の調製ｍＥＣ培地（ニッスイ製、ｍＥＣ培地）（２０ｍｇ／Ｌ
ノボビオシン添加）２５０ｍＬに大腸菌Ｏ１５７〔ＡＴ
ＣＣ７００３７６；ベロ毒素１型（以下、ＶＴ１と略
す）産生株〕を９７ＣＦＵ接種し、４２℃にて１８時
間、静置培養して、試料１を調製した。

【００８０】調製例７：試料２の調製ｍＥＣ培地（２０ｍｇ／Ｌノボビオシン添加）２５０ｍ
Ｌに大腸菌Ｏ１５７〔ＡＴＣＣ３５１５０；ＶＴ１、ベ
ロ毒素２型（以下、ＶＴ２と略す）産生株〕を１０１Ｃ
ＦＵ接種し、４２℃にて１８時間、静置培養して、試料
２を調製した。

【００８１】試験例２調製例６で調製した試料１（５００μｌ）と０．６重量
％Ｔｗｅｅｎ２０溶液（５００μｌ）とを混合し、３７
℃で振盪を加えながら溶菌処理を行なった。この溶液を
遠心分離処理（１００００ｇ×１０分）し、得られた上
清を処理試料（実施例２）とした。また、調製例７で調
製した試料２（５００μｌ）を用い、同様に処理試料
（実施例３）を得た。

【００８２】一方、調製例６で調製した試料１（５００
μｌ）と１００００Ｕ硫酸ポリミキシンＢ（ファイザー
製薬製）溶液（５００μｌ）とを混合し、３７℃で振盪
を加えながら溶菌処理を行なった。この溶液を遠心分離
処理（１００００ｇ×１０分）し、得られた上清を処理
試料（比較例２）とした。また、調製例７で調製した試
料２（５００μｌ）を用い、同様に処理試料（比較例
３）を得た。

【００８３】さらに、調製例６で調製した試料１（５０
０μｌ）を遠心分離処理（１００００ｇ×１０分）し、
得られた上清を処理試料（比較例４）とした。同様に、
調製例７で調製した試料２（５００μｌ）を用い、同様
に処理試料（比較例５）を得た。

【００８４】前記処理試料７０μｌを調製例４で作製し
た試験片の試料受領部に供し、直ちに処理試料を展開さ
せた。次いで、前記試験片の試料受領部に調製例２の標
識複合体溶液２５μｌを供し、発色基質溶液受領部に前
記発色基質溶液〔組成：０．２Ｍ−塩化アンモニウム
（ｐＨ８．０）、１．０ｍＭ−イミダゾール、０．２重
量％３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、１
重量％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、０．０１重
量％Ｈ₂Ｏ₂、０．１２重量％硫酸デキストランナトリ
ウム〕１００μｌを供し、展開させた。展開後、試験片
の固定相における２０分後の発色の有無を目視確認し
て、ＶＴ１の検出を行なった。

【００８５】実施例２〜３および比較例２〜５の処理試
料を用いてＶＴ１の検出を行なった結果を表２に示す。

【００８６】なお、判定基準は以下の通りである。＋：固定相に発色が見られる −：固定相に発色が見られない

【００８７】

【表２】

【００８８】表２より、実施例２の大腸菌Ｏ１５７（Ｖ
Ｔ１産生株）の培養液をＴｗｅｅｎ２０（界面活性剤）
で溶菌処理して得られた処理試料、または実施例３の大
腸菌Ｏ１５７（ＶＴ１／ＶＴ２産生株）の培養液をＴｗ
ｅｅｎ２０（界面活性剤）で溶菌処理して得られた処理
試料を用いて測定した場合、バックグラウンド発色等が
ほとんどなく、処理試料からＶＴ１が検出されることが
わかる。

【００８９】なお、比較例２の大腸菌Ｏ１５７（ＶＴ１
産生株）の培養液を硫酸ポリミキシンＢで溶菌処理して
得られた処理試料、または比較例３の大腸菌Ｏ１５７
（ＶＴ１／ＶＴ２産生株）の培養液を硫酸ポリミキシン
Ｂで溶菌処理して得られた処理試料を用いて測定した場
合、バックグラウンド発色が大きく判定不可能であるこ
とがわかる。

【００９０】また、比較例４の大腸菌Ｏ１５７（ＶＴ１
産生株）の培養液を遠心分離して得られた処理試料、ま
たは比較例５の大腸菌Ｏ１５７（ＶＴ１／ＶＴ２産生
株）の培養液を遠心分離して得られた処理試料を用いて
測定した場合、バックグラウンド発色等はほとんどなか
ったが、ＶＴ１は検出されないことがわかる。

【００９１】したがって、実施例２〜３のように、大腸
菌Ｏ１５７の培養液を界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）で
溶菌処理した処理試料を免疫クロマトグラフ法において
用いた場合、菌体内のＶＴ１が溶菌により放出されてい
るため検出感度が高くなり、かつバックグラウンド発色
がなく良好に検出が可能となることが示される。

【００９２】

【発明の効果】本発明の免疫測定法によれば、界面活性
剤の存在下に被検試料を展開するためバックグラウンド
発色を抑制することができるという優れた効果を奏す
る。したがって、本発明の免疫測定法は、確実な判定が
望まれる分野で幅広く使用することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】免疫クロマトグラフ法において、界面活
性剤の存在下、被検試料を、（ａ）吸水性基材上に、被
検物質に特異的に結合しうる第１の特異的結合物質が固
定化された固定相を有する試験片に展開することを特徴
とする、免疫測定法。
【請求項２】（１）被検試料と界面活性剤とを混合し
て、混合物を得るステップ、および（２）前記（１）で
得られた混合物を、試験片に滴下して、展開するステッ
プ、を含み、被検試料中における被検物質の有無を、下
記（ｂ）と（ｃ）：（ｂ）試験片の固定相における第１
の特異的結合物質に捕捉された被検物質、（ｃ）金属コ
ロイド粒子、水分散型高分子粒子、シリコーンおよびガ
ラスケイソウ土粒子からなる群より選ばれた１種の粒子
を担体とし、該担体に、被検物質に特異的に結合しうる
第２の特異的結合物質と標識物質とを固定化した標識複
合体、との複合体の有無により検出する、請求項１記載
の免疫測定法。
【請求項３】ステップ（１）において、得られた混合
物中における界面活性剤濃度が０．０１〜３重量％であ
る、請求項１または２記載の免疫測定法。
【請求項４】被検物質が細菌由来の物質である、請求
項２または３記載の免疫測定法。
【請求項５】細菌がグラム陰性菌である、請求項４記
載の免疫測定法。
【請求項６】グラム陰性菌が大腸菌である、請求項５
記載の免疫測定法。
【請求項７】細菌由来の物質が、ベロ毒素または志賀
毒素である、請求項４〜６いずれかに記載の免疫測定
法。
【請求項８】担体として使用する粒子が、金コロイド
粒子またはラテックス粒子である、請求項２〜７いずれ
かに記載の免疫測定法。
【請求項９】標識物質が、着色粒子、酵素または蛍光
物質である、請求項２〜８いずれかに記載の免疫測定
法。