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JP2002262882A - Ｒｎａの増幅法 - Google Patents

Ｒｎａの増幅法

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Publication number
JP2002262882A
JP2002262882A JP2001069130A JP2001069130A JP2002262882A JP 2002262882 A JP2002262882 A JP 2002262882A JP 2001069130 A JP2001069130 A JP 2001069130A JP 2001069130 A JP2001069130 A JP 2001069130A JP 2002262882 A JP2002262882 A JP 2002262882A
Authority
JP
Japan
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rna
primer
cdna
template
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001069130A
Other languages
English (en)
Inventor
Tatsuo Ichihara
竜生 市原
Shiyougo Moriya
彰悟 守屋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nisshinbo Holdings Inc
Original Assignee
Nisshinbo Industries Inc
Nisshin Spinning Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nisshinbo Industries Inc, Nisshin Spinning Co Ltd filed Critical Nisshinbo Industries Inc
Priority to JP2001069130A priority Critical patent/JP2002262882A/ja
Priority to US10/093,781 priority patent/US20020127592A1/en
Priority to EP02251643A priority patent/EP1241268A3/en
Publication of JP2002262882A publication Critical patent/JP2002262882A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]

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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝子の転写産物の量的比率を維持したまま
転写産物を増幅する方法を提供する。 【解決手段】 下記ステップにより、細胞又は組織から
抽出したポリ（Ａ） + ＲＮＡを増幅する。 （ａ）細胞又は組織から抽出したＲＮＡを鋳型として、
オリゴｄＴ及びプロモーター配列を有する第１のプライ
マーを用いてｃＤＮＡ合成を行うステップ、（ｂ）前記
ｃＤＮＡの３’末端に、第二のプライマーがアニールし
得る配列を連結させるステップ、（ｃ）前記ｃＤＮＡを
鋳型として、第二のプライマーを用いてｃＤＮＡ第二鎖
を合成するステップ、及び、（ｄ）ステップ（ｃ）で得
られた二本鎖ｃＤＮＡを用いて、前記プロモーター配列
に対応するＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ合成を行う
ステップ。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＲＮＡ増幅に関す
る方法及びキットに関し、詳しくは遺伝子の発現頻度情
報解析や分子生物学的研究の対象となるＲＮＡ分子の増
幅に用いられる。さらに、同キットに用いられるプライ
マー及びＲＮＡ鋳型及びそれらの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子発現情報、例えば発現頻度を解析
するには、ある特定の遺伝子の転写物であるｍＲＮＡを
測定する必要がある。また、転写物がどの遺伝子の転写
産物であるかを特定するためには、同遺伝子の配列と相
補的な核酸とのハイブリダイゼーションによる解析が行
われる。ＲＮＡは、現在様々な手法で細胞あるいは組織
から抽出されているが、ＤＮＡに比べて分解しやすく、
完全な形で抽出することはどの方法においても困難であ
る。従って、得られるRNAは長さの不均一な同一分子種
のRNA分子集団（RNAポピュレーション）となり、RNAの
解析にはそれに相補的なDNAが対象になっている。さら
に、高等生物では各細胞が高度に分化しているため、各
細胞あるいは組織中の細胞を詳細に分類し、それらの細
胞中のDNA上のどの遺伝子が活性化されているかを調査
する必要性が生じてくる。このような少量の細胞あるい
は組織から得たRNAを解析するためには、RNAの増幅を行
う必要が生じてくる。
【０００３】現在様々な核酸増幅法がある。核酸の増幅
に関して、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣ
Ｒ、文献）やＮＡＳＢＡ法（nucleic acid sequence-
basedamplification、文献）がある。これら増幅法の分
子生物学研究における意義は、少量のDNAあるいはRNAの
分子数を増やすことにある。増やされたDNAあるいはRNA
は、研究対象として様々な手法によって検出することが
可能になる。従って、微量DNAあるいはRNAを増幅する事
によって得られる利益は大きい。
【０００４】PCR増幅法は、増幅する遺伝子中または両
末端の配列に存在する特異的な配列を２箇所選択し、こ
れらの特異的配列に関して一方は同じ配列で、他方は相
補的な配列を有するオリゴマーDNAを用意する。用意し
たオリゴマーをプライマーに用い、鋳型DNAと反応させ
た後に相補鎖の合成が開始される。PCR反応は、鋳型DNA
の解離、解離した鋳型一本鎖DNAへのプライマーのアニ
ール、相補鎖の合成、の３つのステップから構成され、
これらのステップからなるサイクルを繰り返し行うこと
で、DNAが増幅される。サイクルをｎ回繰り返すと、最
終的にDNAは２ｎ倍に増幅される。通常、各サイクルでD
NA合成酵素が不活化されないように、耐熱性の酵素が用
いられる。
【０００５】しかしながら、PCR法では、RNAは直接の鋳
型とすることはできないため、一旦RNAを鋳型にして二
本鎖DNA鎖を合成し、これを鋳型としてPCR増幅に供しな
くてはならない（逆転写PCR）。そして、増幅されるDNA
は、プライマーの設定位置に応じたある一定の長さのDN
Aに限定されるため、さまざまな長さのRNAに対応したDN
Aを合成することは出来ない。
【０００６】またNASBA法は、RNAに対して、T7プロモー
ター配列を有する特異的なプライマーをアニールさせ、
逆転写酵素によって第一の相補的DNAを合成する。RNAを
RNaseHで分解した後、第一の相補的DNAを鋳型にして第
二のプライマーを用いて第二のDNAを合成する。得られ
た第一鎖と第二鎖との２本鎖DNAを鋳型にしてRNAポリメ
ラーゼを用いてRNAを転写させることにより増幅する。
さらに増幅したRNAに第二のプライマーを結合させ、逆
転写反応、RNA分解、第一のプライマーを用いた相補鎖
の合成、RNAポリメラーゼによる転写のサイクルを繰り
返す。この方法によってRNAを増幅することは可能であ
るが、PCRと同様に、第二のプライマーを増幅配列中に
設定する必要があり、増幅されるRNAの長さは制限され
ることになる。したがって、鋳型となるRNA分子種集団
において、第一及び第二のプライマーが結合できない長
さのRNA分子は増幅されないため、遺伝子の発現頻度の
解析には不適当である。さらに、逆転写PCR法及びNASBA
法のいずれにおいても、増幅されるのは特定の塩基配列
を有するRNAに限れられる。したがって、増幅されたRNA
を用いると、特定の遺伝子の発現情報しか得られない。
【０００７】以上のように、従来の方法では、増幅前の
RNA分子種集団を、その中の各々のRNA分子種の存在比を
維持したまま増幅させることは不可能である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】遺伝子発現頻度情報解
析を行うにおいて、それぞれの遺伝子の活性状況を正確
に把握することが重要である。微量の発現頻度から高い
発現頻度の遺伝子までを検出するには、遺伝子の転写物
であるｍRNAを増幅する必要があるが、前述のとおり、
現在用いられている核酸増幅方法では、RNAのポピュレ
ーションを反映させた状態でmRNAを増幅することはでき
ない。
【０００９】本発明では、このような問題を解決するた
めに、mRNA集団のポピュレーションを実質的に維持した
まま集団内のmRNA分子を増幅する方法及びキットを提供
することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ
を鋳型とし、プロモーター配列を有する第一のプライマ
ーを用いて合成されたｃＤＮＡの３’末端に、第二のプ
ライマーがアニールし得る配列を連結させ、そのｃＤＮ
Ａに第二のプライマーをアニールさせてｃＤＮＡ第二鎖
を合成し、得られた二本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ
ポリメラーゼ反応を行うことにより、ポリ（Ａ）+ ＲＮ
Ａ分子種の量的比率を維持したまま増幅することができ
ることを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわ
ち本発明は、以下のとおりである。
【００１１】（１）細胞又は組織から抽出したポリ
（Ａ）+ ＲＮＡの増幅法であって、下記ステップを含む
方法。 （ａ）細胞又は組織から抽出したＲＮＡを鋳型として、
オリゴｄＴ及びプロモーター配列を有する第１のプライ
マーを用いてｃＤＮＡ合成を行うステップ、（ｂ）前記
ｃＤＮＡの３’末端に、第二のプライマーがアニールし
得る配列を連結させるステップ、（ｃ）前記ｃＤＮＡを
鋳型として、第二のプライマーを用いてｃＤＮＡ第二鎖
を合成するステップ、及び、（ｄ）ステップ（ｃ）で得
られた二本鎖ｃＤＮＡを用いて、前記プロモーター配列
に対応するＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ合成を行う
ステップ。 （２）前記（ａ）のステップの後に鋳型ＲＮＡを分解す
るステップをさらに含む（１）記載のＲＮＡの増幅法。 （３）前記（ｂ）のステップにおいて、第二のプライマ
ーがホモポリマーであり、このホモポリマーとアニール
し得るホモポリマーをｃＤＮＡの３’末端にターミナル
トランスフェラーゼを用いて付加する（１）記載のＲＮ
Ａの増幅法。 （４）前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター、Ｔ
３プロモーター又はＳＰ６プロモーターである（１）記
載のＲＮＡの増幅法。 （５）さらに、下記ステップを含む（１）記載のＲＮＡ
の増幅法。 （ｅ）ステップ（ｄ）で合成されたＲＮＡを鋳型とし、
第一のプライマーを鋳型としてｃＤＮＡ合成を行うステ
ップ、及び（ｆ）ステップ（ｅ）で得られたＲＮＡ−Ｄ
ＮＡ二本鎖を用いて、前記プロモーター配列に対応する
ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ合成を行うステップ。 （６）細胞又は組織から抽出したポリ（Ａ）+ ＲＮＡを
増幅するための鋳型の製造法であって、下記ステップを
含む方法。 （ａ）細胞又は組織から抽出したＲＮＡを鋳型として、
オリゴｄＴ及びプロモーター配列を有する第一のプライ
マーを用いてｃＤＮＡ合成を行うステップ、（ｂ）前記
ｃＤＮＡの３’末端に、第二のプライマーがアニールし
得る配列を連結させるステップ、及び、（ｃ）前記ｃＤ
ＮＡを鋳型として、第二のプライマーを用いてｃＤＮＡ
第二鎖を合成するステップ。 （７）遺伝子の転写産物の量的比率を維持したまま転写
産物を増幅するためのキットであって、オリゴｄＴ及び
プロモーター配列を有する第一のプライマーと、この第
一のプライマーを用いて細胞又は組織から抽出したＲＮ
Ａを鋳型として合成されるｃＤＮＡの３’末端に連結し
得る配列にアニールし、ｃＤＮＡ第二鎖合成のプライマ
ーとなり得る第２のプライマーとを含むキット。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法は、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ、すなわち３’末
端にポリ（Ａ）テールを有する遺伝子転写産物（ｍＲＮ
Ａ）を増幅する方法であり、下記のステップを含む。
【００１３】（ａ）細胞又は組織から抽出したＲＮＡを
鋳型として、オリゴｄＴ及びプロモーター配列を有する
第１のプライマーを用いてｃＤＮＡ合成を行うステッ
プ、（ｂ）前記ｃＤＮＡの３’末端に、第二のプライマ
ーがアニールし得る配列を連結させるステップ、（ｃ）
前記ｃＤＮＡを鋳型として、第二のプライマーを用いて
ｃＤＮＡ第二鎖を合成するステップ、及び、（ｄ）ステ
ップ（ｃ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを用いて、前記プ
ロモーター配列に対応するＲＮＡポリメラーゼによりＲ
ＮＡ合成を行うステップ。 以下、各ステップを説明する。
【００１４】（１）ステップ（ａ） 遺伝子の発現情報を得ようとする対象の細胞又は組織か
ら、ＲＮＡ画分を抽出する。ＲＮＡ画分としては、ポリ
（Ａ）+ ＲＮＡが好ましい。ポリ（Ａ）+ ＲＮＡの抽出
は、通常、ｃＤＮＡクローニング等におけるｍＲＮＡの
抽出法としてよく知られた方法、例えばフェノール又は
チオシアン酸グアニジン等のタンパク質変性剤を用いた
除タンパク、オリゴｄＴセルロース又はポリＡセファロ
ース（アマシャム・ファルマシア）を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィー等により、行うことができる。
また、市販のｍＲＮＡの抽出・精製用キットを用いるこ
ともできる。
【００１５】上記のようにして抽出されるＲＮＡを鋳型
として、オリゴｄＴ及びプロモーター配列を有する第１
のプライマーを用いてｃＤＮＡ合成を行う。このプライ
マーは、５’末端側にプロモーター配列を、３’末端側
にオリゴｄＴ配列を有する。オリゴｄＴ配列のＴの数
は、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ中のポリＡ領域にアニールし、
ｃＤＮＡ合成が可能であれば特に制限されないが、通常
１８〜２１程度でよい。プロモーター配列としては、無
細胞系で転写反応を行うことができるものであれば特に
制限されないが、例えば、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロ
モーター、Ｓｐ６プロモーター等、インビトロ転写に通
常用いられているプロモーター配列が挙げられる。第一
のプライマーは、第一のプライマーから合成されるＤＮ
Ａを鋳型とする前記プロモーター配列からの転写が妨げ
られない限り、他の配列を有していてもよい。第一のプ
ライマーは、通常ＤＮＡ合成に用いられている合成法に
よって、合成することができる。第一のプライマーの具
体的配列の一例を、配列番号１に示す。
【００１６】ポリ（Ａ）+ ＲＮＡと第一のプライマーを
溶液中に混合し、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡのポリ（Ａ）テー
ルと第一プライマーのオリゴｄＴをアニールさせる。こ
れは例えば、前記溶液を６０〜７０℃程度に加熱した後
に、急冷することにより行なわれる。次に、逆転写酵素
を用いて逆転写反応を行う。この反応は、ＤＮＡ合成の
基質（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）の存在下で行われる。
【００１７】通常、このステップの後に、鋳型ＲＮＡを
分解する。本発明においてこの工程は必須ではないが、
以下の工程に先立って鋳型ＲＮＡを分解しておくことが
好ましい。ＲＮＡの分解は、アルカリ加水分解、又はRN
aseH等を用いた酵素法によって行うことができるが、最
終的な増幅産物がＲＮＡであるため、アルカリによる分
解が好ましい。
【００１８】（２）ステップ（ｂ） 上記ステップ（ａ）で得られたｃＤＮＡの３’末端に、
第二のプライマーがアニールし得る配列を連結させる。
第二のプライマーは、ｃＤＮＡの３’末端に連結され、
同プライマーがアニールし得る配列にアニールし、ｃＤ
ＮＡ第二鎖の合成のプライマーとして機能することがで
きる限り、得に制限されない。この第二のプライマーと
しては、ホモポリマーが挙げられる。ホモポリマーを構
成する塩基はアデニン、チミン、グアニン、シトシンの
うちどれでもよい。ホモポリマーの塩基数は、通常５〜
４０塩基程度である。
【００１９】一方、第二のプライマーがアニールし得る
配列としては、第二のプライマーと相補的な配列が挙げ
られる。第二のプライマーがホモポリマーである場合に
は、それにアニールし得る配列としては、第二のプライ
マーであるホモポリマーを構成するヌクレオチドに対合
するヌクレオチドからなるをホモポリマーが挙げられ
る。例えば、第二のプライマーがオリゴｄＴである場合
には、それにアニールし得る配列はオリゴｄＡである。
第二のプライマーがアニールし得るホモポリマーは通
常、第二のプライマーと同程度の長さである。
【００２０】ｃＤＮＡへのホモポリマーの付加は、ター
ミナルトランスフェラーゼを用いて行うことができる。
【００２１】（３）ステップ（ｃ） 次に、ステップ（ｂ）で３’末端に第二のプライマーが
アニールし得る配列が連結したｃＤＮＡを鋳型として、
第二のプライマーを用いてｃＤＮＡ第二鎖を合成する。
この反応は、一本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ合成酵
素、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ又は同酵素のクレノー
フラグメント、又はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写
酵素等を用いて行うことができる。
【００２２】以上のステップによって得られる二本鎖ｃ
ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼを用いたポリ（Ａ）+ Ｒ
ＮＡ増幅のための鋳型として用いることができる。
【００２３】（４）ステップ（ｄ） 前記ステップ（ｃ）で合成された二本鎖ｃＤＮＡを用い
て、前記プロモーター配列に対応するＲＮＡポリメラー
ゼによりＲＮＡ合成を行う。例えばプロモーター配列が
Ｔ７プロモーターである場合には、Ｔ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼを用いる。この反応によって、ポリ（Ａ）+ ＲＮ
Ａが増幅される。
【００２４】（５）ステップ（ｅ） このステップ及び後記ステップ（ｆ）は、任意的なステ
ップである。前記ステップ（ｄ）で合成されたＲＮＡを
鋳型とし、第一のプライマーを鋳型としてｃＤＮＡ合成
を行う。増幅されたｃＲＮＡと第一のプライマーをアニ
ールさせ、逆転写反応により一本鎖ｃＤＮＡを合成す
る。この反応は、ステップ（ａ）における反応と同様に
して行うことができる。
【００２５】（６）ステップ（ｆ） 次に、ステップ（ｅ）で得られたＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖
を用いて、前記プロモーター配列に対応するＲＮＡポリ
メラーゼによりＲＮＡ合成を行う。この反応は、ステッ
プ（ｆ）ステップ（ｄ）における反応と同様にして行う
ことができる。
【００２６】上記の各ステップにおいて、ＲＮＡｓｅに
よるＲＮＡの分解を抑制するために、各種ＲＮａｓｅ阻
害剤を添加しておくことが好ましい。また、逆転写酵
素、ターミナルトランスフェラーゼ及びＤＮＡ合成酵素
によるそれぞれの反応における反応生成物と反応基質を
分離するために、膜ろ過やエタノール沈殿などの分離操
作を行ってもよい。また、各反応の後に、加熱などによ
る酵素の不活化を行ってもよい。
【００２７】本発明のキットは、オリゴｄＴ及びプロモ
ーター配列を有する第一のプライマーと、この第一のプ
ライマーを用いて細胞又は組織から抽出したＲＮＡを鋳
型として合成されるｃＤＮＡの３’末端に連結し得る配
列にアニールし、ｃＤＮＡ第二鎖合成のプライマーとな
り得る第２のプライマーとを含むキットである。また、
本発明のキットは、逆転写酵素、ターミナルトランフェ
ラーゼ、ＤＮＡ合成酵素、ＲＮＡポリメラーゼ等の酵素
類、ＤＮＡ合成及びＲＮＡ合成の基質、緩衝液、ＲＮＡ
阻害剤、酵素反応生成物と基質を分離するための精製装
置を含めることができる。
【００２８】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
【００２９】
【実施例１】ＲＮＡ増幅用鋳型の合成及び、ＲＮＡ増幅
用鋳型を用いたｃＲＮＡの増幅 （１）逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成（図１(a) ） シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ｍＲＮＡ 2.0
μｇを1.5mLマイクロチューブに加え、500μg/mLの第一
のプライマー（配列番号１）を1μL加え、ジエチルピロ
カーボネートで処理した蒸留水で全量を12μLにした。
前記第一のプライマーは、T7プロモーターの配列がオリ
ゴdTの5'端に結合した構造を有している。
【００３０】上記のチューブを70℃で10分間加熱した
後、氷中で急冷した。チューブ壁についた水分をスピン
ダウンした後、４μＬの緩衝液（25mMトリス塩酸（pH8.
3）、375mM塩化カリウム、15mM塩化マグネシウム）と2
μLの0.1Mジチオスレイトール溶液、及び1μLの10mM dN
TP溶液（10mM dATP、10mMdGTP、10mMdCTP、10mM dTTPの
混合溶液）をそれぞれ加えた。軽く混合した後、42℃で
２分間加熱した。200U/μLのSUPERScriptII(Gibco BRL
社）を1μL加え、軽く混合した。42℃で50分間置いた
後、70℃で15分間置いた。
【００３１】（２）鋳型ＲＮＡの分解（図１(b)） 逆転写酵素による反応溶液に1.5μLのアルカリバッファ
ー（1N NaOH、20mM EDTA）を加え、６５℃で１０分間放
置した。270μLの10mMトリス塩酸（pH8.0）、及び1.5μ
Lの1N塩酸を加えた。この溶液を遠心濃縮器（microcon
‐YM‐30、Millipore社）に移した。microcon‐YM‐30
を遠心機にセットして、10000rpmでカップ内の溶液が10
μLになるまで遠心した。溶液が10μL程度に濃縮された
後、新しい1.5mLチューブにカップを上下逆にセット
し、3000rpmで５分間遠心し、溶液を回収した。
【００３２】（３）ｃＤＮＡへのホモポリマーの付加
（図１(c)） 前記（２）で得られたｃＤＮＡ溶液10μLに、4μLの緩
衝液（500mMカコジル酸ナトリウム（pH7.2）、5mM塩化
コバルト、0.5mMジチオスレイトール）、5μLの100mM d
ATP溶液（Gibco BRL社）、及び1μLの10U/μLターミナ
ルトランスフェラーゼ（Gibco BRL社）を加え、３７℃
で１時間放置し、ｃＤＮＡの３’末端にオリゴｄＡ（５
〜３５塩基）を付加した。
【００３３】（４）第二鎖（ＲＮＡ増幅用鋳型）の合成
（図１(d)） 前記（３）のターミナルトランスフェラーゼ反応溶液20
μLに、100pmol/μLのオリゴｄＴ（（Ｔ）n：n＝5〜3
5）を1μL加え、95℃で３分間加熱した後、氷中で５分
間置き、ターミナルトランスフェラーゼを失活させた。
この溶液に、4μLの緩衝液（100mMトリス塩酸（pH7.
5）、70mM塩化マグネシウム、1mMジチオスレイトール）
と、4μLの0.2mM dNTP（0.2mM dATP、10mMdGTP、10mM d
CTP、10mM dTTPの混合溶液）と、2μLの2U/μLクレノー
フラグメント（宝酒造(株)）と、9μLの蒸留水を加え、
37℃で２時間反応させた。その後、65℃で５分間置き、
クレノーフラグメントを失活させた。
【００３４】（５）二本鎖ｃＤＮＡ末端の平滑化 前記（４）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ溶液40μLに、4μ
Lの3U/μL T4 DNAポリメラーゼ（Gibco BRL社）を加
え、16℃で５分間放置し、ｃＤＮＡの末端を平滑化し
た。この反応液に10μLの0.5M EDTAを加え、さらに約40
μLのフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコ
ール＝25:24:1溶液を加え、激しく撹拌し、タンパク質
を変性させた。この混合液を15000rpmで２分間遠心し、
上層を新しい1.5mLマイクロチューブに移し、等量のク
ロロフォルムを加え、激しく撹拌した。15000rpmで２分
間遠心し、上層を別の1.5mLマイクロチューブに移し
た。このチューブに1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH5.
2）、0.5μLグリコーゲン（ロシュ・ダイアグノスティッ
クス）、2.5倍量の100%エタノールを加え、-80℃で20分
間放置した。その後、15000rpmで20分間遠心し、上清を
捨て、500μLの70%エタノールを加え、15000rpmで20分
間遠心し、上清を捨てた。沈殿を蒸留水20μLに溶か
し、ＲＮＡ増幅用鋳型溶液を得た。
【００３５】（６）ＲＮＡ増幅用鋳型を用いたｃＲＮＡ
の増幅（図１(e)） 前記（５）のＲＮＡ増幅用鋳型溶液に、6μLの緩衝液
（200mMトリス塩酸（pH7.9）、30mM塩化マグネシウム、
10mMスペルミジン塩酸塩、10mMジチオスレイトール）を
加え、蒸留水で総量42μLにした。さらに6μLのrNTP溶
液（75mM ATP、75mM CTP、75mM GTP、15mM UTP、15mM
フルオロセイン標識UTP（Fluorescein-UTP、ロシュ・ダ
イアグノスティックス）の混合溶液）、6μLのRNAポリ
メラーゼ（Ambion社）、1μLのRNaseインヒビター（Amb
ion社）を加え、37℃で２時間反応させた。反応後、一
部を取り電気泳動を行った。その結果を図２に示す。
【００３６】
【実施例２】ｃＲＮＡの増幅及び増幅ｃＲＮＡを用いた
ハイブリダイゼーション （１）ｃＲＮＡの増幅及び精製 オゾン照射０時間及び、１日のシロイヌナズナのｍＲＮ
Ａを、それぞれ実施例１で用いた方法により、増幅し
た。ここで、オゾン照射０時間のｍＲＮＡの増幅にはフ
ルオロセイン標識-UTP（Fluorescein-UTP）を、オゾン
照射１日のｍＲＮＡにはビオチン標識UTP（Biotin-UT
P、ロシュダイアグノスティックス社）を用いて、増幅
ＲＮＡを標識した。
【００３７】これらの溶液を、１本ずつのmicrocon‐YM
‐30に移した。microcon‐YM‐30を遠心機にセットし
て、10000rpmでカップ内の溶液が2μLになるまで濃縮し
た。2μL程度に濃縮された後、新しい1.5mLチューブに
カップを上下逆にセットし、3000rpmで５分間遠心し、
溶液を回収した。
【００３８】（２）シロイヌナズナの遺伝子が固定され
ているスライドガラスの作製 図３に示す遺伝子をそれぞれ1pmol/μLとなるようにTE
緩衝液（10mMトリス塩酸(pH7.2), 1mM EDTA）に溶解
し、DNA溶液とした。スポッター（pixsys5000、Cartesi
an社製）を用い、カルボジイミド樹脂をコートしたスラ
イドガラス上に上記DNA溶液をスポットした。これを乾
燥機に入れ、37℃で15分間乾燥させた。次いで、3% BSA
（ウシ血清アルブミン）を含む緩衝液Ａ（0.2M塩化ナト
リウム、0.1Mトリス塩酸（pH7.5）、0.05%トライトンX-
100）に浸し、37℃で15分乾燥させた。次に、このスラ
イドラガラスをTE緩衝液で洗浄後、37℃で15分間乾燥さ
せた。 （３）ｃＲＮＡを用いたハイブリダイゼーション （１）で得られたｃＲＮＡ溶液2μLと、ハイブリダイゼ
ーション溶液（ExpressHyb、Clontech社）８μＬを混
ぜ、（２）で作製したシロイヌナズナの遺伝子が固定さ
れているスライドガラス上に滴下した。その上にカバー
ガラスをのせ、65℃で１2時間ハイブリダイゼーション
を行った。カバーガラスをはずし、スライドガラスを10
0mLの緩衝液（33.3mM塩化ナトリウム、33.3mMクエン酸
三ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム）中に沈
め、室温下で５分間振とうした。この操作を２回繰り返
した後、スライドガラスを、40℃に加熱した100mLの緩
衝液（3.3mM塩化ナトリウム、3.3mMクエン酸三ナトリウ
ム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム）中に沈め、40℃で５
分間振とうした。この操作を２回繰り返した後、100mL
の緩衝液（3.3mM塩化ナトリウム、3.3mMクエン酸三ナト
リウム）中でリンスした。
【００３９】（４）ハイブリダイゼーションシグナルの
検出 1mLのブロックエース溶液〔1.24g/Lトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン、6.27g/Lトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン塩酸塩、8.77g/L塩化ナトリウム、4
0g/Lブロックエース（雪印乳業(株)）〕をスライドガラ
スに滴下し、室温下で30分間放置した。ブロックエース
溶液を捨て、500μLのブロックエース溶液を滴下した。
【００４０】次に、ビオチン標識ｃＲＮＡを用いたスラ
イドガラスには、200μg/μLストレプトアビジン（フナ
コシ株式会社）を滴下し、室温下で３０分間放置した。
前記溶液を捨て、ブロックエース溶液で洗浄した。次
に、500μLのブロックエース溶液、25μg/mLビオチン化
抗ストレプトアビジン（フナコシ株式会社）をスライド
ガラス上に滴下し、室温下で３０分間放置した。前記溶
液を捨て、ブロックエース溶液で洗浄した後、500μLの
ブロックエース溶液、2.5μg/mL Cy5標識ストレプトア
ビジン（アマシャム・ファルマシア）を滴下し、室温化
で３０分間放置した。
【００４１】一方、フルオロセイン標識ｃＲＮＡを用い
たスライドガラスには、4μg/mL抗フルオレセイン（mou
se IgG）（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を滴下
し、室温下で３０分間放置した。前記溶液を捨て、ブロ
ックエース溶液で洗浄した。次に、500μLのブロックエ
ース溶液、25μg/mL Cy3標識抗マウスIgG（Cy3 anti-mo
use IgG、アマシャム・ファルマシア）をスライドガラ
ス上に滴下し、室温下で３０分間放置した。
【００４２】それぞれのスライドガラスから溶液をす
て、100mLの1.24g/Lトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン、6.27g/Lトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン塩酸塩、8.77g/L塩化ナトリウム中で、スライドガ
ラスを洗浄した。この溶液からスライドガラスを取り出
し、1000rpmで２分間遠心した。次いで、スキャナー（S
canarray4000、GSI Lumonics社）を用いてスライドガラ
ス上の蛍光を検出した。
【００４３】上記の結果を図３に示す。また、図３の結
果から算出される各遺伝子の発現量の比、及び後述のノ
ーザンハイブリダイゼーション法を用いて測定した発現
量の比を図４に示す。 （５）ノーザンハイブリダイゼーション プローブの標識 プローブは、Megaprime DNA Labelling System（アマシ
ャム社）を用いて標識した。図３に示す遺伝子それぞれ
50ngに純水を加え、14μLにした。2.5μLのプライマー
溶液を加え、100℃で５分間熱変性を行った。室温に戻
し、5μLラベリングバッファー、2.5μLの[32P]dCTP、
及び1μLのクレノー酵素を加え、37℃で10分間インキュ
ベートした。75μLのTE緩衝液を加え、反応を停止させ
た後、セファデックスG-50（ファルマシア社製）を用い
て、標識化プローブを精製した。。 ハイブリダイゼーション用メンブレンの作製 トータルRNA 10μL、１×MOPS泳動緩衝液（20mM MOPS、
5mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA）、ホルムアルデヒド3.5
μL、ホルムアミド10.0μLに純水を混合し、20μLとし
た。この溶液を65℃で15分間加熱した後、急冷した。こ
のRNAを、1%アガロースゲル（アガロース1%(W/V)）、20
mM MOPS、5mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA、18%ホルムア
ルデヒド）を用いて電気泳動した。電気泳動したアガロ
ースゲルをHybond N+（アマシャム社製）に転写し、80
℃で２時間乾燥させた後、UV Stratalinker（Stratagen
e社製）を用いて、紫外線を120mMJ照射した。 ハイブリダイゼーション 上記の方法で作製したメンプレンをハイブリパック（Gi
bco社製）に入れた後、5mLのプレハイブリダイゼーショ
ン溶液（750mM塩化ナトリウム、6.3mM EDTA、43mMリン
酸二水素ナトリウム、50%(V/V)ホルムアミド、0.1%(V/
V)ウシ血清アルブミン、0.1%(V/V)フィコール、0.1%(V/
V)ポリビニルピロリドン、0.5% SDS(W/V)）を加え、密
封した。65℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行
った。で作製した標識化プローブを加え、65℃で12時
間ハイブリダイゼーションを行った。 ポストハイブリダイゼーション メンブレンをハイブリパックから取り出し、室温下で10
分間一次洗浄液（0.3M塩化ナトリウム、17.3mMリン酸二
水素ナトリウム、2.5mM EDTA、0.1%(W/V) SDS）を用い
て洗浄した。再度、室温で10分間一次洗浄液で洗浄し
た。次に、メンブレンを65℃で20分間二次洗浄液（0.15
M塩化ナトリウム、8.7mMリン酸二水素ナトリウム、1.25
mM EDTA、0.1%(W/V) SDS）を用いて洗浄した。再度、65
℃で20分間二次洗浄液で洗浄した。洗浄したメンブレン
を用いてオートラジオグラフィーを行った。結果を図３
に示す。
【００４４】
【発明の効果】本発明の方法は、遺伝子の転写産物の量
的比率を維持したまま転写産物を増幅することができ
る。したがって、同方法によって増幅されたＲＮＡは、
遺伝子発現頻度情報解析等に有用である。
【００４５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> NISSHINBO INDUSTRIES. INC <120> ＲＮＡの増幅法 <130> P-7429 <140> <141> 2001-03-12 <160> 447 <170> PatentIn Ver. 2.1
【００４６】 <210> 1 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 1 tctagtcgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggcgttttt tttttttttt 60 tttttt 66
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の方法の概略を示す図。
【図２】 本発明の方法により増幅されたｃＲＮＡの電
気泳動の結果を示す写真。
【図３】 増幅ｃＲＮＡを用いたシロイヌナズナ遺伝子
固定スライドガラスに対するハイブリダイゼーションの
結果を示す図。
【図４】 図３の結果から算出される遺伝子の発現量の
比、及び増幅ｃＲＮＡをプローブとするノーザンハイブ
リダイゼーション法を用いて測定した発現量の比を示す
図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA04 CA09 CA11 CA12 CA20 HA08 HA11 HA13 HA14 4B063 QA01 QQ53 QR06 QR08 QR35 QR38 QR42 QR56 QS25 QS34 QS35 QX02

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞又は組織から抽出したポリ（Ａ）+
    ＲＮＡの増幅法であって、下記ステップを含む方法。
    （ａ）細胞又は組織から抽出したＲＮＡを鋳型として、
    オリゴｄＴ及びプロモーター配列を有する第１のプライ
    マーを用いてｃＤＮＡ合成を行うステップ、（ｂ）前記
    ｃＤＮＡの３’末端に、第二のプライマーがアニールし
    得る配列を連結させるステップ、（ｃ）前記ｃＤＮＡを
    鋳型として、第二のプライマーを用いてｃＤＮＡ第二鎖
    を合成するステップ、及び、（ｄ）ステップ（ｃ）で得
    られた二本鎖ｃＤＮＡを用いて、前記プロモーター配列
    に対応するＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ合成を行う
    ステップ。
  2. 【請求項２】 前記（ａ）のステップの後に鋳型ＲＮＡ
    を分解するステップをさらに含む請求項１記載のＲＮＡ
    の増幅法。
  3. 【請求項３】 前記（ｂ）のステップにおいて、第二の
    プライマーがホモポリマーであり、このホモポリマーと
    アニールし得るホモポリマーをｃＤＮＡの３’末端にタ
    ーミナルトランスフェラーゼを用いて付加する請求項１
    記載のＲＮＡの増幅法。
  4. 【請求項４】 前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモー
    ター、Ｔ３プロモーター又はＳＰ６プロモーターである
    請求項１記載のＲＮＡの増幅法。
  5. 【請求項５】 さらに、下記ステップを含む請求項１記
    載のＲＮＡの増幅法。（ｅ）ステップ（ｄ）で合成され
    たＲＮＡを鋳型とし、第一のプライマーを鋳型としてｃ
    ＤＮＡ合成を行うステップ、及び（ｆ）ステップ（ｅ）
    で得られたＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖を用いて、前記プロモ
    ーター配列に対応するＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ
    合成を行うステップ。
  6. 【請求項６】 細胞又は組織から抽出したポリ（Ａ）+
    ＲＮＡを増幅するための鋳型の製造法であって、下記ス
    テップを含む方法。（ａ）細胞又は組織から抽出したＲ
    ＮＡを鋳型として、オリゴｄＴ及びプロモーター配列を
    有する第一のプライマーを用いてｃＤＮＡ合成を行うス
    テップ、（ｂ）前記ｃＤＮＡの３’末端に、第二のプラ
    イマーがアニールし得る配列を連結させるステップ、及
    び、（ｃ）前記ｃＤＮＡを鋳型として、第二のプライマ
    ーを用いてｃＤＮＡ第二鎖を合成するステップ。
  7. 【請求項７】 遺伝子の転写産物の量的比率を維持した
    まま転写産物を増幅するためのキットであって、オリゴ
    ｄＴ及びプロモーター配列を有する第一のプライマー
    と、この第一のプライマーを用いて細胞又は組織から抽
    出したＲＮＡを鋳型として合成されるｃＤＮＡの３’末
    端に連結し得る配列にアニールし、ｃＤＮＡ第二鎖合成
    のプライマーとなり得る第２のプライマーとを含むキッ
    ト。
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