JP2002112792A

JP2002112792A - 高生産性α−アミラーゼ

Info

Publication number: JP2002112792A
Application number: JP2000310605A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Araki; 裕行荒木; Keiji Endo; 圭二遠藤; Hiroshi Hagiwara; 萩原　　浩; Kazuaki Igarashi; 一暁五十嵐; Yasuhiro Hayashi; 康弘林; Katsuya Ozaki; 克也尾崎
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2000-10-11
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2002-04-16
Anticipated expiration: 2020-10-11
Also published as: US20080026976A1; EP1199356A3; EP1199356B1; JP4426716B2; CN1348000A; US20040265959A1; US20020123124A1; EP1199356A2; US7297527B2; CN100415878C; DE60139238D1; US6743616B2; DK1199356T4; EP1199356B2; DK1199356T3

Abstract

(57)【要約】（修正有）【解決手段】Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＫＳＭ−Ｋ３
８又はＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＫＳＭ−ＡＰ１３７８
由来の特定のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して
６０％以上の相同性を有するα−アミラーゼにおいて、
生産性に関与する特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残
基に置換又は欠失するように構築された高生産性変異α
−アミラーゼ；当該変異α−アミラーゼをコードする遺
伝子、ベクター、形質転換細胞、形質転換細胞を培養す
ることを特徴とする変異α−アミラーゼの製造方法、当
該変異α−アミラーゼを含有する洗浄剤組成物。【効果】組換え微生物より高収率でα-アミラーゼを
得ることができ、工業生産に於ける大幅なコストダウン
が可能。耐熱性、キレート剤耐性及び酸化剤耐性を有
し、洗浄剤用酵素として有益なアルカリ液化型α-アミ
ラーゼの高生産化を図ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、その生産性が向上
した変異α−アミラーゼに関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】α-ア
ミラーゼ[EC.3.2.1.1]は、澱粉産業、醸造産業、繊維産
業、医薬品産業及び食品産業等幅広い産業分野で利用さ
れているが、中でも澱粉を高ランダムに分解できるα-
アミラーゼは、洗剤用として好ましく、従来、Bacillus
licheniformis由来のα-アミラーゼを始めとして、好
アルカリ性Bacillus sp. KSM-AP1378（FERM BP-3048）
株由来のアルカリ液化型α−アミラーゼ（ＷＯ９４／２
６８８１号公報）やその耐熱性及び酸化剤耐性を向上さ
せた改良型酵素（ＷＯ９８／４４１２６号公報）等が知
られている。また最近、本発明者らは、好アルカリ性Ba
cillus sp. KSM-K38（FERM BP-6946）株由来のキレート
剤・酸化剤耐性アルカリ液化型α-アミラーゼ（特願平
１０−３６２４８７、特願平１０−３６２４８８）及び
更に耐熱性を向上させた改良型酵素を見出している（特
願平１１−１６３５６９）。

【０００３】一方、このような洗剤用酵素においては、
工業的生産を考慮すると高生産性を有することも必要で
ある。しかし、これまでの洗剤用α−アミラーゼは、タ
ンパク工学技術を用いて耐熱性や酸化剤耐性等を向上さ
せる改良は種々試みられているものの、生産性という点
においては充分に検討されておらず、構造遺伝子を変異
させて高生産化を図ることについても報告されていな
い。

【０００４】本発明は、優れた生産性を有する変異α-
アミラーゼを提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、部位特異
的変異により構築した変異α-アミラーゼ構造遺伝子
を、微生物に導入し、α-アミラーゼの生産性を評価し
たしたことろ、α-アミラーゼ遺伝子には生産性の向上
に関与する部位が存在し、当該部位を変異させた組換え
遺伝子を微生物に導入すればその生産性が飛躍的に向上
したα-アミラーゼが製造できることを見出した。

【０００６】すなわち本発明は、配列番号１に示される
アミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して６０％以上の
相同性を有するα−アミラーゼにおいて、該アミノ酸配
列の１８番目のＰｒｏ、８６番目のＧｌｎ、１３０番目
のＧｌｕ、１５４番目のＡｓｎ、１７１番目のＡｒｇ、
１８６番目のＡｌａ、２１２番目のＧｌｕ、２２２番目
のＶａｌ、２４３番目のＴｙｒ、２６０番目のＰｒｏ、
２６９番目のＬｙｓ、２７６番目のＧｌｕ、２７７番目
のＡｓｎ、３１０番目のＡｒｇ、３６０番目のＧｌｕ、
３９１番目のＧｌｎ、４３９番目のＴｒｐ、４４４番目
のＬｙｓ、４７１番目のＡｓｎ及び４７６番目のＧｌｙ
のうちのいずれかに相当するアミノ酸残基の１残基以上
を置換又は欠失させてなる変異α-アミラーゼを提供す
るものである。

【０００７】また本発明は、配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して６０％以上の相同
性を有するα−アミラーゼにおいて、該アミノ酸配列の
１２８番目のＡｓｐ、１４０番目のＧｌｙ、１４４番目
のＳｅｒ、１６８番目のＡｒｇ、１８１番目のＡｓｎ、
２０７番目のＧｌｕ、２７２番目のＰｈｅ、３７５番目
のＳｅｒ、４３４番目のＴｒｐ及び４６６番目のＧｌｕ
のうちのいずれかに相当するアミノ酸残基の１残基以上
を置換又は欠失させてなる変異α-アミラーゼを提供す
るものである。

【０００８】また本発明は、この変異α-アミラーゼを
コードする遺伝子、該遺伝子を有するベクター、該ベク
ターで形質転換された細胞、該形質転換細胞を培養する
ことを特徴とする変異α−アミラーゼの製造方法を提供
するものである。

【０００９】更に本発明は、この変異α-アミラーゼを
含有する洗浄剤組成物を提供するものである。

【００１０】

【発明実施の形態】本発明における高生産性変異α-ア
ミラーゼとは、組換え微生物を培養することによりα−
アミラーゼを製造する場合において、その収率が変異前
の酵素に比べて５％以上、好ましくは１０％以上、更に
好ましくは２０％以上向上したα−アミラーゼをいう。

【００１１】本発明の変異α-アミラーゼは、α−アミ
ラーゼを構成するアミノ酸のうち生産性に関与するアミ
ノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換又は欠失するように
構築されたものであるが、ここで用いられるα−アミラ
ーゼとしては、例えば、Bacillus. amyloliquefaciens
由来、Bacillus. licheniformis由来の液化型α−アミ
ラーゼや好アルカリ性Bacillus属細菌由来の液化型アル
カリα−アミラーゼ等が挙げられ、好ましくは配列番号
１又は配列番号２に示したアミノ酸配列又は該アミノ酸
配列に対して６０％以上の相同性を有するα-アミラー
ゼが挙げられる。

【００１２】ここで、配列番号１に示したアミノ酸配列
又は該アミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有す
るα-アミラーゼとしては、具体的にはBacillus sp. KS
M-AP1378（FERM BP-3048）株由来のアルカリ液化型α-
アミラーゼ（特開平８−３３６３９２号公報）、及びタ
ンパク工学技術により構築した当該酵素の耐熱性や酸化
剤耐性を向上させた改良酵素（ＷＯ９８／４４１２６号
公報）が挙げられる。また、配列番号２に示したアミノ
酸配列又は該アミノ酸配列に対して６０％以上の相同性
を有するα-アミラーゼとしては、Bacillus sp.KSM-K38
（FERM BP-6946）株由来のキレート剤・酸化剤耐性アル
カリ液化型α−アミラーゼ（特願平１０−３６２４８
７、特願平１０−３６２４８８）、及びタンパク工学技
術により構築した当該酵素の耐熱性を向上させた改良酵
素（特願平１１−１６３５６９）が挙げられる。

【００１３】尚、アミノ酸配列の相同性はLipman-Pears
on法（Science, 227, 1435, 1985）によって計算され
る。

【００１４】本発明の変異α-アミラーゼの取得は、ま
ずα-アミラーゼを生産する微生物より、当該α-アミラ
ーゼをコードする遺伝子をクローニングするが、その方
法は、一般的な遺伝子組換え技術を用いれば良く、例え
ば、特開平８−３３６３９２号公報に記載の方法を用い
ることができる。ここで、用いられる遺伝子としては、
例えば配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配
列をコードする配列番号３又は配列番号４に示されるも
のが挙げられる。また、得られた遺伝子に変異を与え耐
熱性や酸化剤耐性を向上させた変異遺伝子も挙げられ
る。

【００１５】次に得られた遺伝子に対して変異を与える
が、その方法としても一般的に行われている部位特異的
変異の方法であればいずれも採用でき、例えば宝酒造社
製のSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super E
xpress Kmキット等を用いて行うことができる。

【００１６】本発明における高生産性α-アミラーゼを
得るための変異としては、例えば配列番号１に示される
アミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して６０％以上の
相同性を有するα−アミラーゼにおいて、該アミノ酸配
列の１８番目のＰｒｏ、８６番目のＧｌｎ、１３０番目
のＧｌｕ、１５４番目のＡｓｎ、１７１番目のＡｒｇ、
１８６番目のＡｌａ、２１２番目のＧｌｕ、２２２番目
のＶａｌ、２４３番目のＴｙｒ、２６０番目のＰｒｏ、
２６９番目のＬｙｓ、２７６番目のＧｌｕ、２７７番目
のＡｓｎ、３１０番目のＡｒｇ、３６０番目のＧｌｕ、
３９１番目のＧｌｎ、４３９番目のＴｒｐ、４４４番目
のＬｙｓ、４７１番目のＡｓｎ及び４７６番目のＧｌｙ
のうちのいずれかに相当するアミノ酸残基の１残基以
上、あるいは配列番号２に示されるアミノ酸配列又は該
アミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するα−
アミラーゼにおいて、該アミノ酸配列の１２８番目のＡ
ｓｐ、１４０番目のＧｌｙ、１４４番目のＳｅｒ、１６
８番目のＡｒｇ、１８１番目のＡｓｎ、２０７番目のＧ
ｌｕ、２７２番目のＰｈｅ、３７５番目のＳｅｒ、４３
４番目のＴｒｐ及び４６６番目のＧｌｕのうちのいずれ
かに相当するアミノ酸残基の１残基以上を置換又は欠失
させることにより達成できるが、好ましくは、アミノ酸
残基の置換が、配列番号１のアミノ酸配列の１８番目の
Ｐｒｏに相当するアミノ酸残基をＳｅｒ若しくはＴｈ
ｒ、８６番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＧｌ
ｕ、１３０番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基をＶａ
ｌ若しくはＧｌｎ、１５４番目のＡｓｎに相当するアミ
ノ酸残基をＡｓｐ、１７１番目のＡｒｇに相当するアミ
ノ酸残基をＣｙｓ若しくはＧｌｎ、１８６番目のＡｌａ
に相当するアミノ酸残基をＶａｌ若しくはＡｓｎ、２１
２番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基をＡｓｐ、２２
２番目のＶａｌに相当するアミノ酸残基をＧｌｕ、２４
３番目のＴｙｒに相当するアミノ酸残基をＣｙｓ若しく
はＳｅｒ、２６０番目のＰｒｏに相当するアミノ酸残基
をＧｌｕ、２６９番目のＬｙｓに相当するアミノ酸残基
をＧｌｎ、２７６番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基
をＨｉｓ、２７７番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基
をＳｅｒ若しくはＰｈｅ、３１０番目のＡｒｇに相当す
るアミノ酸残基をＡｌａ、３６０番目のＧｌｕに相当す
るアミノ酸残基をＧｌｎ、３９１番目のＧｌｎに相当す
るアミノ酸残基をＧｌｕ、４３９番目のＴｒｐに相当す
るアミノ酸残基をＡｒｇ、４４４番目のＬｙｓに相当す
るアミノ酸残基をＡｒｇ、４７１番目のＡｓｎに相当す
るアミノ酸残基をＡｓｐ若しくはＧｌｕ又は４７６番目
のＧｌｙに相当するアミノ酸残基をＡｓｐに置換させる
変異、

【００１７】或いは、配列番号２のアミノ酸配列の１２
８番目のＡｓｐに相当するアミノ酸残基をＶａｌ若しく
はＧｌｎ、１４０番目のＧｌｙに相当するアミノ酸残基
をＳｅｒ、１４４番目のＳｅｒに相当するアミノ酸残基
をＰｒｏ、１６８番目のＡｒｇに相当するアミノ酸残基
をＧｌｎ、１８１番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基
をＶａｌ、２０７番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基
をＡｓｐ、２７２番目のＰｈｅに相当するアミノ酸残基
をＳｅｒ、３７５番目のＳｅｒに相当するアミノ酸残基
をＰｒｏ、４３４番目のＴｒｐに相当するアミノ酸残基
をＡｒｇ、又は４６６番目のＧｌｕに相当するアミノ酸
残基をＡｓｐに置換させる変異が望ましい。

【００１８】ここで、配列番号１のアミノ酸配列におけ
る変異のうち、８６番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残
基をＧｌｕ、１３０番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残
基をＶａｌ若しくはＧｌｎ、１８６番目のＡｌａに相当
するアミノ酸残基をＡｓｎ、２４３番目のＴｙｒに相当
するアミノ酸残基をＳｅｒ、２６０番目のＰｒｏに相当
するアミノ酸残基をＧｌｕ、２６９番目のＬｙｓに相当
するアミノ酸残基をＧｌｎ、２７７番目のＡｓｎに相当
するアミノ酸残基をＰｈｅ又は４７１番目のＡｓｎに相
当するアミノ酸残基をＡｓｐ若しくはＧｌｕに置換させ
る変異は、同時にα−アミラーゼの培養液或いはその濃
縮脱塩液に対する溶解性を向上させることができる。具
体的には、変異前に比べて濃縮脱塩液における４℃、１
週間保存後の上清液の残存活性を５％以上、特に１０％
向上させることができる。従って、斯かるアミノ酸の変
異を含む本発明の変異α−アミラーゼにおいては、高収
率で高い濃度の発酵濃縮液を得ることができ、発酵生産
後の限外濾過等の酵素製剤化処理も効率良く行うことが
できる。

【００１９】斯かるアミノ酸の変異は、各種アミノ酸残
基の置換又は欠失から選ばれる２種以上の置換又は欠失
を組み合わせた変異も有効である。また更に上記の変異
に、酵素特性を改良する変異、例えば、配列番号１に示
されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して６０％
以上の相同性を有するα−アミラーゼにおいて、該アミ
ノ酸配列の１８１番目のＡｒｇと１８２番目のＧｌｙに
相当するアミノ酸残基を欠失させて耐熱性を向上させる
変異、２２２番目のＭｅｔに相当するアミノ酸をＴｈｒ
に置換して酸化剤耐性を向上させる変異、４８４番目の
Ｌｙｓに相当するアミノ酸残基をＧｌｎに置換して溶解
性を向上させる変更、配列番号２に示されるアミノ酸配
列又は該アミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有
するα−アミラーゼにおいて、該アミノ酸配列の１０７
番目のＭｅｔに相当するアミノ酸残基をＬｅｕに置換し
て酸化剤耐性を更に強化する変異、更に１８８番目のＧ
ｌｕに相当するアミノ酸残基をＩｌｅに置換して衣料用
洗剤における洗浄力を増強させる変異等を組み合わせる
ことも可能である。

【００２０】このようにして得られた、変異α−アミラ
ーゼ構造遺伝子を適当な制御遺伝子と適当なプラスミド
ベクターに適切に結合することによって生産用プラスミ
ドが構築され、該プラスミドをプロトプラスト法（Mol.
Gen. Genet., 168, 111, 1979）等により枯草菌、大腸
菌等の微生物、好ましくは枯草菌に導入し、得られた組
換え微生物を培養することにより、高い収率で変異α−
アミラーゼを得ることができる。

【００２１】かくして得られた変異α−アミラーゼは、
後記実施例に示すように、酵素のもつ生化学的性質を保
持したままその生産性が約１０〜約５００％或いはそれ
以上に向上するという優れた性質を有する。従って、耐
熱性、キレート剤耐性及び酸化剤耐性、高溶解性等を有
する洗浄剤組成物に適したアルカリ液化型α−アミラー
ゼについて本発明に示したアミノ酸残基の変異を施せ
ば、これらの性質を保持し且つ組換え微生物に於ける生
産性が大幅に向上した有益な酵素を創製することができ
る。

【００２２】本発明の洗浄剤組成物は、本発明のα−ア
ミラーゼ以外に、更に枝切り酵素（例えばプルラナー
ゼ、イソアミラーゼ、ネオプルラナーゼなど）、α−グ
ルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、セル
ラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、プロトペクチナー
ゼ、ペクチン酸リアーゼ、パーオキシダーゼ、ラッカー
ゼ及びカタラーゼから選ばれる１種又は２種以上の酵素
を配合することができる。

【００２３】また、洗浄剤に通常配合されるアニオン界
面活性剤、両性界面活性剤、ノニオン界面活性剤、カチ
オン界面活性剤等の界面活性剤、キレート剤、アルカリ
剤、無機塩、再汚染防止剤、塩素捕捉剤、還元剤、漂白
剤、蛍光染料可溶化剤、香料、ケーキング防止剤、酵素
の活性化剤、酸化防止剤、防腐剤、色素、青味付け剤、
漂白活性化剤、酵素安定化剤、調節剤等を配合すること
ができる。

【００２４】本発明の洗浄剤組成物は、上記方法で得ら
れる高生産性α−アミラーゼ及び上記公知の洗浄成分を
組み合わせて常法に従い、製造することができる。洗浄
剤の形態は、用途に応じて選択することができ、例え
ば、液体、粉末、顆粒等にすることができる。また、本
発明洗浄剤組成物は、衣料用洗浄剤、漂白洗浄剤、自動
食器洗浄機用洗浄剤、配水管洗浄剤、義歯洗浄剤等とし
て使用できるが、特に衣料用洗浄剤、漂白洗浄剤、自動
食器洗浄機用洗浄剤として好適に使用することができ
る。

【００２５】また、本発明における高生産性を有する変
異α−アミラーゼは、澱粉液化・糖化用組成物として用
いることができ、更にグルコアミラーゼ、マルターゼ、
プルラナーゼ、イソアミラーゼ、ネオプルラナーゼ、な
どから選ばれる１種又は２種以上の酵素を配合し、変異
α−アミラーゼとともに澱粉に作用させることもでき
る。

【００２６】更に、本発明の変異α−アミラーゼは、繊
維の糊抜き剤組成物として用いることができ、プルラナ
ーゼ、イソアミラーゼ若しくはネオプルラナーゼ等の酵
素を共に配合することもできる。

【００２７】

【実施例】アミラーゼ活性及びタンパク質量の測定組換え枯草菌により生産させた各酵素のアミラーゼ活性
及びタンパク質量は以下に示す方法で行った。アミラー
ゼ活性測定は、3,5-ジニトロサリチル酸法（DNS法）で
測定した。40mMグリシン-水酸化ナトリウム緩衝液（pH
10）中に可溶性澱粉を含む反応液中、50℃で15分間の反
応を行った後、生成した還元糖をDNS法で定量すること
によって測定した。酵素の力価は１分間に１μmolのグ
ルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位と
した。蛋白量の測定は、牛血清アルブミンを標準とし
て、Bio-Rad社製のProtein Assay Kitを用いて定量し
た。

【００２８】参考例１アルカリ液化型アミラーゼのス
クリーニング土壌約０．５ｇを滅菌水に懸濁し、８０℃で１５分間加
熱処理した。この熱処理液の上清を適当に滅菌水で希釈
して、分離用寒天培地（培地Ａ）に塗布した。次いで、
これを３０℃で２日間培養し、集落を形成させた。集落
の周に澱粉溶解に基づく透明帯を形成するものを選出
し、これをアミラーゼ生産菌として分離した。更に、分
離菌を培地Ｂに接種し、３０℃で２日間好気的に振盪培
養した。培養後、遠心分離した上清液について、キレー
ト剤（ＥＤＴＡ）耐性能を測定し、更に最適作用pHを測
定して、Bacillus sp.KSM-K38（FERM BP-6946）株を取
得した。

【００２９】

【００３０】

【００３１】ＫＳＭ−Ｋ３８株の菌学的性質を表１に示
す。

【００３２】

【表１】

【００３３】参考例２ＫＳＭ−Ｋ３８株の培養参考例１の液体培地Ｂに、ＫＳＭ−Ｋ３８株を接種し、
３０℃で２日間好気的に振盪培養した。遠心分離上清に
ついてアミラーゼ活性（ｐＨ８．５）を測定した結果、
培養液１Ｌ当たり、それぞれ１１７７Ｕの活性を有して
いた。

【００３４】参考例３アルカリ液化型アミラーゼの精
製参考例２で得られたＫＳＭ−Ｋ３８株の培養上清液に８
０％飽和濃度になるように硫酸アンモニウムを加えて撹
拌後、生成した沈殿を回収し、２ｍＭＣａＣｌ₂ を含
む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、
同緩衝液に対して一晩透析した。得られた透析内液を同
緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラ
ムに添着し、同緩衝液を用いて０−１Ｍの食塩の濃度勾
配によりタンパクを溶出した。活性画分を同緩衝液にて
透析後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより得た
活性画分を上記緩衝液にて透析することによってポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１０％）及びソデ
ィウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気泳動で単一のバンド
を与える精製酵素を得ることができた。

【００３５】参考例４酵素特性精製酵素の特性は以下の通りである。（１）作用澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分
解物のα−１，４グルコシド結合を分解し、アミロース
からはグルコース（Ｇ１）、マルトース（Ｇ２）、マル
トトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、
マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ
６）及びマルトヘプタオース（Ｇ７）を生成する。ただ
しプルランには作用しない。（２）pH安定性（ブリットン−ロビンソン緩衝液）４０℃、３０分間処理条件下で、ｐＨ６．５〜１１．０
の範囲で７０％以上の残存活性を示す。（３）作用温度範囲及び最適作用温度２０〜８０℃の広範囲で作用し、最適作用温度は５０〜
６０℃である。（４）温度安定性５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）中
にて温度を変化させ、各温度で３０分間処理することに
より失活の条件を調べると、４０℃で８０％以上の残存
活性を示し、４５℃でも約６０％の残存活性を示した。（５）分子量ソディウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により測定した分子量は５５，０００±５，０００
である。（６）等電点等電点電気泳動法により測定した等電点は４．２付近で
ある。（７）界面活性剤の影響直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル
硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアルキ
ル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルホン
酸ナトリウム、α−スルホン化脂肪酸エステルナトリウ
ム、アルキルスルホン酸ナトリウム、ＳＤＳ、石鹸及び
ソフタノール等の各種界面活性剤０．１％溶液中で、ｐ
Ｈ１０、３０℃で３０分間処理しても、殆ど活性阻害を
受けない（活性残存率９０％以上）。（８）金属塩の影響各種金属塩と共存させて、ｐＨ１０、３０℃で３０分間
処理してその影響を調べたことろ、１ｍＭのＭｎ²⁺によ
り阻害され（阻害率約７５％）、１ｍＭのＳｒ ²⁺及びＣ
ｄ²⁺により若干阻害される（阻害率約３０％）。

【００３６】実施例１ α-アミラーゼ遺伝子を結合し
た各種組換えプラスミドの調製ＷＯ９８／４４１２６号公報に記載された方法を用い
て、Bacillus sp. KSM-AP1378 (FERM BP-3048) 株由来
であり、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するα
−アミラーゼ（以下、ＬＡＭＹと記載）の１８１番目の
Ａｒｇと１８２番目のＧｌｙを欠失させることによって
耐熱性が向上した変異α−アミラーゼ（以下、ΔＲＧと
記載）及びこの欠失変異に加えて配列番号１のアミノ酸
配列の２０２番目のＭｅｔをＴｈｒに置換させることに
よって、耐熱性に加えて酸化剤耐性が向上した変異α−
アミラーゼ（以下、ΔＲＧ／Ｍ２０２Ｔと記載）をそれ
ぞれコードする遺伝子を構築した。それぞれの遺伝子を
鋳型とし、プライマーＬＡＵＳ（配列番号５）とＬＡＤ
Ｈ（配列番号６）を用いたＰＣＲ反応によって、各変異
α−アミラーゼをコードする遺伝子断片（約１．５ｋ
ｂ）をそれぞれ増幅した。これらを制限酵素ＳａｌＩに
よって切断後、発現ベクターｐＨＳＰ６４（特開平６−
２１７７８１号公報）のＳａｌＩ−ＳｍａＩ部位に挿入
することによって、Bacillus sp. KSM-64(FERM P-1048
2)株のアルカリセルラーゼ遺伝子に由来する強力プロモ
ーターの下流に、各変異α−アミラーゼの構造遺伝子が
結合した組換えプラスミドを構築した。

【００３７】一方、Bacillus sp. KSM-K38(FERM BP-694
6)株の菌体からSaitoとMiuraの方法(Biochim. Biophys.
Acta, 72, 619, 1961)の方法によって抽出した染色体
ＤＮＡを鋳型とし、表２に示したプライマーＫ３８ＵＳ
（配列番号７）及びＫ３８ＤＨ（配列番号８）を用いて
ＰＣＲ反応を行うことによって、配列番号２に示される
アミノ酸配列を有するα−アミラーゼ（以下、Ｋ３８Ａ
ＭＹと記載）をコードする構造遺伝子断片（約1.5kb）
を増幅した。これを制限酵素ＳａｌＩによって切断後、
発現ベクターｐＨＳＰ６４のＳａｌＩ−ＳｍａＩ部位に
挿入することによって、ｐＨＳＰ６４に含まれるBacill
us sp. KSM-64(FERM P-10482)株のアルカリセルラーゼ
遺伝子に由来する強力プロモーターの下流に、Ｋ３８Ａ
ＭＹの構造遺伝子が結合した組換えプラスミドを構築し
た（図１）。本組換えプラスミドを鋳型とし、表２に示
したプライマーＣＬＵＢＧ（配列番号９）とＫ３８ＤＨ
（配列番号８）を用いたＰＣＲ反応を行うことよって、
強力プロモーターとＫ３８ＡＭＹが結合した遺伝子断片
（約2.1kb）を増幅した。また、以下に示す組換えＰＣ
Ｒ法によって、Ｋ３８ＡＭＹとＬＡＭＹとの間のキメラ
α−アミラーゼをコードする遺伝子を構築した。即ち、
KSM-K38(FERM BP-6946)株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
表２に示したプライマーＫ３８ＤＨ（配列番号８）及び
ＬＡ−Ｋ３８（配列番号１０）を用いてＰＣＲ反応を行
うことによって、配列番号２に示されるＫ３８ＡＭＹの
アミノ酸配列のＧｌｎ２０からＣ末下流までの配列をコ
ードする断片を増幅した。また、ＬＡＭＹ遺伝子と強力
プロモーターを含む前述の組換えプラスミドを鋳型と
し、表２に示したプライマーＣＬＵＢＧ（配列番号９）
とＬＡ−Ｋ３８Ｒ（配列番号１１）を用いたＰＣＲ反応
によって、強力プロモーターの上流から、配列番号１の
ＬＡＭＹのアミノ酸配列のＧｌｙ２１までをコードする
遺伝子断片を増幅させた。次に、得られた両ＤＮＡ断片
と表２に示したプライマーＣＬＵＢＧ（配列番号９）と
Ｋ３８ＤＨ（配列番号８）を用いた２回目のＰＣＲ反応
を行うことによって、末端にＬＡ−Ｋ３８（配列番号１
０）及びＬＡ−Ｋ３８Ｒ（配列番号１１）プライマーに
由来する相補的な配列を持つ両断片が結合し、強力プロ
モーターの下流にＬＡＭＹのＨｉｓ１からＧｌｙ２１ま
でをコードする領域に続いてＫ３８ＡＭＹのＧｌｎ２０
以降Ｃ末までをコードする領域が結合したキメラα−ア
ミラーゼ（以下、ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹと記載）をコード
する遺伝子断片（約2.1kb）を増幅した。更に、宝酒造
社のSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super E
xpress Kmキットを用いて、Ｋ３８ＡＭＹ及びＬＡ−Ｋ
３８ＡＭＹに以下の変異を導入した。まず、上述のＫ３
８ＡＭＹ及びＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ遺伝子断片（約2.1k
b）を同キットに付属のプラスミドベクターｐＫＦ１９
ｋのＳｍａＩ部位に挿入し、変異導入用組換えプラスミ
ドを構築した（図２）。次に、表２に示した部位特異的
変異導入用オリゴヌクレオチドプライマーＮ１９０Ｆ
（配列番号５０）をＴ４ＤＮＡキナーゼによって５′リ
ン酸化した後、これと上記の変異導入用組換えプラスミ
ドを用いて、キットの方法に従って変異導入反応を行
い、反応産物によって大腸菌MV1184株（コンピテントセ
ルMV1184、宝酒造社製）の形質転換を行った。この結果
から得られた形質転換体から組換えプラスミドを抽出
し、塩基配列の解析を行って１９０番目のＡｓｎがＰｈ
ｅに置換した変異の確認を行った。また、変異導入した
遺伝子に対して、上記と同様にして、Ａ２０９Ｖプライ
マー（配列番号５１）、次いで、ＱＥＹＫプライマー
（配列番号４９）を用いて繰り返し変異導入反応を行う
ことによって、配列番号２に示されるＫ３８ＡＭＹのア
ミノ酸配列の１９０番目のＡｓｎをＰｈｅ、２０９番目
のＧｌｎをＶａｌに置換し、更に１番目のＡｓｐから１
９番目のＧｌｙまでの配列を配列番号１に示されるＬＡ
ＭＹのアミノ酸配列の１番目のＨｉｓから２１番目のＧ
ｌｙまでの配列に置換することによって耐熱性が向上し
た変異α−アミラーゼ（以下、ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／Ｎ
ＦＱＶと記載）、Ｋ３８ＡＭＹのアミノ酸配列の１６７
番目のＧｌｎをＧｌｕ、１６９番目のＴｙｒをＬｙｓ、
１９０番目のＡｓｎをＰｈｅ、２０９番目のＧｌｎをＶ
ａｌに置換し、更に１番目のＡｓｐから１９番目のＧｌ
ｙまでの配列をＬＡＭＹのアミノ酸配列の１番目のＨｉ
ｓから２１番目のＧｌｙまでの配列に置換することによ
って耐熱性が飛躍的に向上した変異α−アミラーゼ（以
下、ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶと記
載）、及びＫ３８ＡＭＹのアミノ酸配列の１６７番目の
ＧｌｎをＧｌｕ、１６９番目のＴｙｒをＬｙｓ、１９０
番目のＡｓｎをＰｈｅ、２０９番目のＧｌｎをＶａｌに
置換することによって耐熱性が向上した変異α−アミラ
ーゼ（以下、ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶと記載）をそれぞれコ
ードする遺伝子を構築した。それぞれの遺伝子を鋳型と
し、プライマーＫ３８ＵＳ（配列番号７）とＫ３８ＤＨ
（配列番号８）を用いたＰＣＲ反応によって、各変異α
−アミラーゼをコードする構造遺伝子断片（約1.5kb）
を増幅した。これを上記と同様に発現ベクターｐＨＳＰ
６４のＳａｌＩ−ＳｍａＩ部位に挿入することによっ
て、各変異α−アミラーゼの構造遺伝子が結合した組換
えプラスミドを構築した（図１）。

【００３８】実施例２ α−アミラーゼ生産性向上変異
の導入組換え枯草菌に於けるアミラーゼ生産性を向上させるた
めの部位特異的変異導入には宝酒造社製のSite-Directe
d Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット
を用いた。まず、実施例１で得られた各種組換えプラス
ミドを鋳型とし、ΔＲＧ及びΔＲＧ／Ｍ２０２Ｔの場合
はプライマーＣＬＵＢＧ（配列番号９）及びＬＡＤＨ
（配列番号６）を、一方、Ｋ３８ＡＭＹ、ＬＡ−Ｋ３８
ＡＭＹ／ＮＦＱＶ、ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／ＱＥＹＫ／Ｎ
ＦＱＶ及びＱＥＹＫ／ＮＦＱＶの場合はプライマーＣＬ
ＵＢＧ（配列番号９）及びＫ３８ＤＨ（配列番号８）を
用いてそれぞれ、ＰＣＲ反応を行うことによって、ＫＳ
Ｍ−６４株由来の強力プロモーターの上流から各種α−
アミラーゼ遺伝子の下流までの約２．１ｋｂの断片を増
幅させ、これを上記キットに付属のプラスミドベクター
ｐＫＦ１９ｋのＳｍａＩ部位に挿入し、各種の変異導入
用組換えプラスミドを構築した（図２）。

【００３９】次に、表２（配列番号１２〜５１）に示し
た各種の部位特異的変異導入用オリゴヌクレオチドプラ
イマーをＴ４ＤＮＡキナーゼによって５'リン酸化した
後、これと上記の変異導入用組換えプラスミドを用い
て、キットに記載の方法に従って変異導入反応を行い、
反応産物によって大腸菌ＭＶ１１８４株（コンピテント
セルＭＶ１１８４、宝酒造社製）の形質転換を行った。
この結果得られた形質転換体から組換えプラスミドを抽
出し、塩基配列の解析を行って変異の確認を行った。

【００４０】

【表２】

【００４１】また、変異導入した遺伝子は、上記と同様
にして、発現プロモーター領域と変異α−アミラーゼ遺
伝子部分を再度ｐＫＦ１９ｋのＳｍａＩ部位に挿入する
ことにより、異なる変異を導入する際の鋳型プラスミド
となり、上記と同様の方法によって更に別の変異を導入
した。得られた各変異組換えプラスミドを鋳型とし、プ
ライマーＣＬＵＢＧ（配列番号９）及びＬＡＤＨ（配列
番号６）、或いはプライマーＣＬＵＢＧ（配列番号９）
及びＫ３８ＤＨ（配列番号８）を用いてＰＣＲ反応を行
うことによって、各変異遺伝子断片を増幅させ、これを
ＳａｌＩによって切断した後、発現ベクターｐＨＳＰ６
４のＳａｌＩ−ＳｍａＩ部位に挿入して、各種の変異α
−アミラーゼ生産用プラスミドを構築した（図１）。

【００４２】実施例３変異α−アミラーゼの生産実施例２で得られた各種変異α−アミラーゼ生産用プラ
スミドをプロトプラスト法（Mol. Gen. Genet., 168, 1
11, 1979）により枯草菌ＩＳＷ１２１４株（leuA metB5
hsdM1）に導入し、得られた組換え枯草菌を液体培地
（コーンスティープリカー、４％；トリプトース、１
％；肉エキス、１％；リン酸１カリウム、０．１％；硫
酸マグネシウム、０．０１％；マルトース、２％；塩化
カルシウム、０．１％；テトラサイクリン、１５μｇ／
ｍＬ）で３０℃で４日間培養した。各種変異α−アミラ
ーゼの活性は、培養上清液を用いて測定した。

【００４３】実施例４アミラーゼ生産性の評価−１実施例１、２及び３に記載の方法により、ΔＲＧにおけ
る１８番目のＰｒｏをＳｅｒに置換した酵素（Ｐ１８Ｓ
／ΔＲＧと略する）、８６番目のＧｌｎをＧｌｕに置換
した酵素（Ｑ８６Ｅ／ΔＲＧと略する）、１３０番目の
ＧｌｕをＶａｌに置換した酵素（Ｅ１３０Ｖ／ΔＲＧと
略する）、１５４番目のＡｓｎをＡｓｐに置換した酵素
（Ｎ１５４Ｄ／ΔＲＧと略する）、１７１番目のＡｒｇ
をＣｙｓに置換した酵素（Ｒ１７１Ｃ／ΔＲＧと略す
る）、１８６番目のＡｌａをＶａｌに置換した酵素（Ａ
１８６Ｖ／ΔＲＧと略する）、２１２番目のＧｌｕをＡ
ｓｐに置換した酵素（Ｅ２１２Ｄ／ΔＲＧと略する）、
２２２番目のＶａｌをＧｌｕに置換した酵素（Ｖ２２２
Ｅ／ΔＲＧと略する）、２４３番目のＴｙｒをＣｙｓに
置換した酵素（Ｙ２４３Ｃ／ΔＲＧと略する）、２６０
番目のＰｒｏをＧｌｕに置換した酵素（Ｐ２６０Ｅ／Δ
ＲＧと略する）、２６９番目のＬｙｓをＧｌｎに置換し
た酵素（Ｋ２６９Ｅ／ΔＲＧと略する）、２７６番目の
ＧｌｕをＨｉｓに置換した酵素（Ｅ２７６Ｈ／ΔＲＧと
略する）、２７７番目のＡｓｎをＳｅｒに置換した酵素
（Ｎ２７７Ｓ／ΔＲＧと略する）、３１０番目のＡｒｇ
をＡｌａに置換した酵素（Ｒ３１０Ａ／ΔＲＧと略す
る）、３６０番目のＧｌｕをＧｌｎに置換した酵素（Ｅ
３６０Ｑ／ΔＲＧと略する）、３９１番目のＧｌｎをＧ
ｌｕに置換した酵素（Ｑ３９１Ｅ／ΔＲＧと略する）、
４３９番目のＴｒｐをＡｒｇに置換した酵素（Ｗ４３９
Ｒ／ΔＲＧと略する）、４４４番目のＬｙｓをＡｒｇに
置換した酵素（Ｋ４４４Ｒ／ΔＲＧと略する）、４７１
番目のＡｓｎをＡｓｐに置換した酵素（Ｎ４７１Ｄ／Δ
ＲＧと略する）、及び４７６番目のＧｌｙをＡｓｐに置
換した酵素（Ｇ４７６Ｄ／ΔＲＧと略する）それぞれの
アミラーゼ生産性を検定した。対照としてΔＲＧを用い
た。ΔＲＧのアミラーゼ生産性を１００％としてアミラ
ーゼ生産性相対値（％）を求めた。結果を表３に示す。

【００４４】

【表３】

【００４５】いずれの変異酵素もΔＲＧに比べて高いア
ミラーゼ生産性を示し、変異によって組換え枯草菌に於
けるα−アミラーゼの高生産化が明らかになった。特
に、Ｅ１３０Ｖ／ΔＲＧ、Ａ１８６Ｖ／ΔＲＧ、Ｅ２１
２Ｄ／ΔＲＧ、Ｙ２４３Ｃ／ΔＲＧ、Ｎ２７７Ｓ／ΔＲ
Ｇ及びＷ４３９Ｒ／ΔＲＧでは、ΔＲＧの３倍以上の
高生産性が認められ、Ａ１８６Ｖ／ΔＲＧにおいてはΔ
ＲＧの５倍近い飛躍的な高生産化が認められた。

【００４６】実施例５アミラーゼ生産性の評価−２実施例１、２及び３に記載の方法により、ΔＲＧ／ＭＴ
における１８番目のＰｒｏをＴｈｒに置換した酵素（Ｐ
１８Ｔ／ΔＲＧ／ＭＴと略する）、８６番目のＧｌｎを
Ｇｌｕに置換した酵素（Ｑ８６Ｅ／ΔＲＧ／ＭＴと略す
る）、１３０番目のＧｌｕをＶａｌに置換した酵素（Ｅ
１３０Ｖ／ΔＲＧ／ＭＴと略する）、１８６番目のＡｌ
ａをＡｓｎに置換した酵素（Ａ１８６Ｎ／ΔＲＧ／ＭＴ
と略する）、２４３番目のＴｙｒをＳｅｒに置換した酵
素（Ｙ２４３Ｓ／ΔＲＧ／ＭＴと略する）、２７７番目
のＡｓｎをＰｈｅに置換した酵素（Ｎ２７７Ｆ／ΔＲＧ
／ＭＴと略する）、及び４７１番目のＡｓｎをＧｌｕに
置換した酵素（Ｎ４７１Ｅ／ΔＲＧ／ＭＴと略する）そ
れぞれのアミラーゼ生産性を検定した。対照としてΔＲ
Ｇ／ＭＴを用いた。結果を表４に示す。

【００４７】

【表４】

【００４８】いずれの変異酵素もΔＲＧ／ＭＴに比べて
高いアミラーゼ生産性を示し、特に、Ｅ１３０Ｖ／ΔＲ
Ｇ／ＭＴ及びＡ１８６Ｎ／ΔＲＧ／ＭＴでは、ΔＲＧ／
ＭＴの３倍以上の高生産性が認められた。

【００４９】実施例６アミラーゼ生産性の評価−３実施例１、２及び３に記載の方法により、Ｋ３８ＡＭＹ
における１２８番目のＡｓｐをＶａｌに置換した酵素
（Ｄ１２８Ｖと略する）、１４０番目のＧｌｙをＳｅｒ
に置換した酵素（Ｇ１４０Ｓと略する）、１４４番目の
ＳｅｒをＰｒｏに置換した酵素（Ｓ１４４Ｐと略す
る）、１６８番目のＡｒｇをＧｌｎに置換した酵素（Ｒ
１６８Ｑと略する）、１８１番目のＡｓｎをＶａｌに置
換した酵素（Ｎ１８１Ｖと略する）、２０７番目のＧｌ
ｕをＡｓｐに置換した酵素（Ｅ２０７Ｄと略する）、２
７２番目のＰｈｅをＳｅｒに置換した酵素（Ｆ２７２Ｓ
と略する）、３７５番目のＳｅｒをＰｒｏに置換した酵
素（Ｓ３７５Ｐと略する）、４３４番目のＴｒｐをＡｒ
ｇに置換した酵素（Ｗ４３４Ｒと略する）、及び４６６
番目のＧｌｕをＡｓｐに置換した酵素（Ｅ４６６Ｄと略
する）それぞれのアミラーゼ生産性を検定した。対照と
してＫ３８ＡＭＹを用いた。結果を表５に示す。

【００５０】

【表５】

【００５１】いずれの変異酵素も野生型Ｋ３８ＡＭＹに
比べて高いアミラーゼ生産性を示し、特にＤ１２８Ｖで
は３倍以上の高生産性が認められた。

【００５２】実施例７アミラーゼ生産性の評価−４実施例６に示した変異のうち、Ｓ１４４Ｐ及びＮ１８１
Ｖを組み合わせた変異酵素Ｓ１４４Ｐ／Ｎ１８１Ｖ
（ＳＰＮＶと略する）のアミラーゼ生産性を、実施例３
に記載の方法により検定した。対照として、Ｋ３８ＡＭ
Ｙ、Ｓ１４４Ｐ及びＮ１８１Ｖを用いた。結果を表６に
示す。

【００５３】

【表６】

【００５４】この結果、表５に示した様に、組み合わせ
によるアミラーゼ生産性の更なる向上が認められた。

【００５５】実施例８アミラーゼ生産性の評価−５実施例１、２及び３に記載の方法により、耐熱性改良酵
素ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／ＮＦＱＶの遺伝子における１
６８番目のＡｒｇをＧｌｎに置換した酵素（Ｒ１６８Ｑ
／ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／ＮＦＱＶと略する）、４６６番
目のＧｌｕをＡｓｐに置換した酵素（Ｅ４６６Ｄ／ＬＡ
−Ｋ３８ＡＭＹ／ＮＦＱＶと略する）、及び実施例６に
示した二重変異を導入した酵素（ＳＰＮＶ／ＬＡ−Ｋ３
８ＡＭＹ／ＮＦＱＶと略する）それぞれのアミラーゼ生
産性を検定した。対照として、ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／Ｎ
ＦＱＶを用いた。結果を表７に示す。

【００５６】

【表７】

【００５７】この結果、いずれの変異酵素もＬＡ−Ｋ３
８ＡＭＹ／ＮＦＱＶに比べて約１．５倍以上の高いアミ
ラーゼ生産性を示し、特にＲ１６８Ｑ／ＬＡ−Ｋ３８Ａ
ＭＹ／ＮＦＱＶでは約３倍の高生産性が認められた。

【００５８】実施例９アミラーゼ生産性の評価−６実施例１、２及び３に記載の方法により、耐熱性改良酵
素ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶの遺伝子
における１２８番目のＡｓｐをＶａｌに置換する変異
（Ｄ１２８Ｖ／ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱ
Ｖと略する）、及び実施例６に示した二重変異を導入し
た酵素（ＳＰＮＶ／ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／ＱＥＹＫ／Ｎ
ＦＱＶと略する）それぞれのアミラーゼ生産性を検定し
た。対照として、ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／ＱＥＹＫ／ＮＦ
ＱＶを用いた。結果を表８に示す。

【００５９】

【表８】

【００６０】この結果、いずれの変異酵素もＬＡ−Ｋ３
８ＡＭＹ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶに比べて非常に高いアミ
ラーゼ生産性を示し、特にＤ１２８Ｖ／ＬＡ−Ｋ３８Ａ
ＭＹ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶでは約６倍の飛躍的な高生産
化が認められた。

【００６１】実施例１０アミラーゼ生産性の評価−７実施例８に示した変異のうち、飛躍的な高生産化が認め
られたＤ１２８Ｖ／ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／ＱＥＹＫ／Ｎ
ＦＱＶに、酸化剤耐性をより強化する変異、即ち１０７
番目のＭｅｔをＬｅｕに置換する変異（Ｍ１０７Ｌと略
する）を実施例１及び２に記載の方法により導入した
（ＭＬ／ＤＶ／ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱ
Ｖと略する）。

【００６２】次に、変異酵素ＭＬ／ＤＶ／ＬＡ−Ｋ３８
ＡＭＹ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶの遺伝子を用いて実施例４
の方法によりアミラーゼ生産性を検定した。対照とし
て、Ｄ１２８Ｖ／ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／ＱＥＹＫ／ＮＦ
ＱＶを用いた。結果を表９に示す。

【００６３】

【表９】

【００６４】変異酵素ＭＬ／ＤＶ／ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ
／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶのアミラーゼ生産性相対値は１１
５％となり、酸化剤耐性をより強化するＭ１０７Ｌ変異
を導入しても、組換え枯草菌に於けるアミラーゼの高生
産性には影響を与えないことが明らかとなった。

【００６５】実施例１１アミラーゼ生産性の評価−８実施例１、２及び３に記載の方法により、耐熱性改良酵
素ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶの遺伝子における１２８番目のＡ
ｓｐをＧｌｎに置換した酵素（Ｄ１２８Ｑ／ＱＥＹＫ／
ＮＦＱＶと略する）のアミラーゼ生産性を検定した。対
照として、ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶを用いた。結果を表１０
に示す。

【００６６】

【表１０】

【００６７】変異酵素はＱＥＹＫ／ＮＦＱＶに比べて２
倍以上の高生産性が認められた。

【００６８】実施例１２溶解性の検定表１１に示す各変異酵素標品を４℃で１週間保存した
後、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分、４℃）によ
って生じた沈殿を分離した。沈殿は遠心分離前と同容量
の２mMＣａＣｌ₂を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH7.
0）に懸濁させた後、同緩衝液液で約５００倍に希釈す
ることによって溶解させ、酵素活性を測定した。また、
上清液も同様に希釈して酵素活性を測定した。求められ
た沈殿及び上清液の活性値を、４℃保存前の標品の酵素
活性を比較することによって各変異酵素の溶解性を評価
した。結果を表１１に併せて示す。

【００６９】

【表１１】

【００７０】この結果、１８１番目のＡｒｇと１８２番
目のＧｌｙを欠失させることによって耐熱性が向上した
改良α−アミラーゼ（ΔＲＧ）は、４℃で１週間保存す
ることによって、酵素の沈殿が認められ、上清液中には
活性の約半分が残存したのみであることに対して、ΔＲ
Ｇ−ＬＡＭＹに更なる変異を導入した各変異酵素では、
上清液への活性残存率が高く、変異によって溶解率が向
上したことが明らかになった。特に、８６番目のＧｌｎ
をＧｌｕに置換した酵素の溶解率は最も高く、本条件で
上清液に８割の酵素が残存した。実施例１３自動食器洗浄機用洗浄剤組成物表１２に示す配合で自動食器洗浄機用洗浄剤組成物を製
造し、本洗浄剤に高生産化方法により得られた各種の変
異酵素を配合して洗浄試験を行った。この結果、同一活
性値の酵素を添加した場合、高生産化変異酵素は対照酵
素と比較して同等あるいは優れた洗浄効果を示した。

【００７１】

【表１２】

【００７２】

【発明の効果】本発明の変異α-アミラーゼを用いれ
ば、組換え微生物より高収率でα-アミラーゼを得るこ
とができ、工業生産に於ける大幅なコストダウンが可能
である。また、本発明における高生産化のための変異
は、酵素の生化学的性質は影響を与えないことから、耐
熱性、キレート剤耐性及び酸化剤耐性を有し、洗浄剤用
酵素として有益なアルカリ液化型α-アミラーゼの高生
産化を図ることができる。

【００７３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> Highly productive alpha-amylases <130> P04831210 <160> 51 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. KSM-AP1378 <400> 1 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala 20 25 30 Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Ser Gln Leu Gln Gly Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Gly Thr Glu Met Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Ile Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Ile Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Tyr Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr 245 250 255 Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Ala Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gly Tyr Phe Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys 305 310 315 320 His Pro Ile His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ser Met Lys Ser 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Tyr Ala Tyr Gly Thr 385 390 395 400 Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asp Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys His Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Thr Val Asn Gly Gly Ala Val Ser 465 470 475 480 Val Trp Val Lys Gln 485

【００７４】 <210> 2 <211> 480 <212> PRT <213> Bacillus sp. KSM-K38 <400> 2 Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp Asp Ala Ala Ala Leu 20 25 30 Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Met Gly Ala Asp Phe Thr 100 105 110 Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Thr Asn Arg Trp Gln Asp 115 120 125 Ile Ser Gly Ala Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr Gly Phe Asp Phe Ser 130 135 140 Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Phe His Phe 145 150 155 160 Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu Asn His Ile Phe Arg 165 170 175 Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn 180 185 190 Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe Ser His Pro Glu Val 195 200 205 Gln Asp Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe Thr Asp Glu Leu Asp 210 215 220 Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His Ile Pro Phe Trp Tyr 225 230 235 240 Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Asn Glu Ala Asp Gln Asp Leu 245 250 255 Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val Gly Ala Leu Glu Phe 260 265 270 Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met 290 295 300 Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala His Pro Met His Ala 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu 325 330 335 Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly 355 360 365 Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp Met Ile Asp Glu Leu 370 375 380 Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe 385 390 395 400 Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Ser Ser Ser Arg 405 410 415 Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser 420 425 430 Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp 435 440 445 Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp 450 455 460 Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Tyr Val Asn Gln 465 470 475 480

【００７５】 <210> 3 <211> 1786 <212> DNA <213> Bacillus sp. KSM-AP1378 <220> <221> sig#peptide <222> (155)..(247) <220> <221> mat#peptide <222> (248)..(1702) <220> <221> CDS <222> (155)..(1702) <400> 3 cagcgtgata atataaattt gaaatgaaca cctatgaaaa tatggtagcg attgcgcgac 60 gagaaaaaac ttgggagtta ggaagtgata ttaaaggatt ttttttgact tgttgtgaaa 120 acgcttgcat aaattgaagg agagggtgct tttt atg aaa ctt cat aac cgt ata 175 att agc gta cta tta aca cta ttg tta gct gta gct gtt ttg ttt cca 223 tat atg acg gaa cca gca caa gcc cat cat aat ggg acg aat ggg acc 271 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr 1 5 atg atg cag tat ttt gaa tgg cat ttg cca aat gac ggg aac cac tgg 319 Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp 10 15 20 aac agg tta cga gat gac gca gct aac tta aag agt aaa ggg att acc 367 Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr 25 30 35 40 gct gtt tgg att cct cct gca tgg aag ggg act tcg caa aat gat gtt 415 Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val 45 50 55 ggg tat ggt gcc tat gat ttg tac gat ctt ggt gag ttt aac caa aag 463 Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys 60 65 70 gga acc gtc cgt aca aaa tat ggc aca agg agt cag ttg caa ggt gcc 511 Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Arg Ser Gln Leu Gln Gly Ala 75 80 85 gtg aca tct ttg aaa aat aac ggg att caa gtt tat ggg gat gtc gtg 559 Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val 90 95 100 atg aat cat aaa ggt gga gca gac ggg aca gag atg gta aat gcg gtg 607 Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Gly Thr Glu Met Val Asn Ala Val 105 110 115 120 gaa gtg aac cga agc aac cga aac caa gaa ata tca ggt gaa tac acc 655 Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn Gln Glu Ile Ser Gly Glu Tyr Thr 125 130 135 att gaa gca tgg acg aaa ttt gat ttc cct gga aga gga aat acc cat 703 Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His 140 145 150 tcc aac ttt aaa tgg cgc tgg tat cat ttt gat ggg aca gat tgg gat 751 Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp 155 160 165 cag tca cgt cag ctt cag aac aaa ata tat aaa ttc aga ggt acc gga 799 Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly 170 175 180 aag gca tgg gac tgg gaa gta gat ata gag aac ggc aac tat gat tac 847 Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Ile Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr 185 190 195 200 ctt atg tat gca gac att gat atg gat cat cca gaa gta atc aat gaa 895 Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His Pro Glu Val Ile Asn Glu 205 210 215 ctt aga aat tgg gga gtt tgg tat aca aat aca ctt aat cta gat gga 943 Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly 220 225 230 ttt aga atc gat gct gtg aaa cat att aaa tac agc tat acg aga gat 991 Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys Tyr Ser Tyr Thr Arg Asp 235 240 245 tgg cta aca cat gtg cgt aac acc aca ggt aaa cca atg ttt gca gtt 1039 Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val 250 255 260 gca gaa ttt tgg aaa aat gac ctt gct gca atc gaa aac tat tta aat 1087 Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Ala Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn 265 270 275 280 aaa aca agt tgg aat cac tcc gtg ttc gat gtt cct ctt cat tat aat 1135 Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn 285 290 295 ttg tac aat gca tct aat agt ggt ggc tat ttt gat atg aga aat att 1183 Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly Gly Tyr Phe Asp Met Arg Asn Ile 300 305 310 tta aat ggt tct gtc gta caa aaa cac cct ata cat gca gtc aca ttt 1231 Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys His Pro Ile His Ala Val Thr Phe 315 320 325 gtt gat aac cat gac tct cag cca gga gaa gca ttg gaa tcc ttt gtt 1279 Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val 330 335 340 caa tcg tgg ttc aaa cca ctg gca tat gca ttg att ctg aca agg gag 1327 Gln Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu 345 350 355 360 caa ggt tac cct tcc gta ttt tac ggt gat tac tac ggt ata cca act 1375 Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr 365 370 375 cat ggt gtt cct tcg atg aaa tct aaa att gat cca ctt ctg cag gca 1423 His Gly Val Pro Ser Met Lys Ser Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala 380 385 390 cgt caa acg tat gcc tac gga acc caa cat gat tat ttt gat cat cat 1471 Arg Gln Thr Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe Asp His His 395 400 405 gat att atc ggc tgg acg aga gaa ggg gac agc tcc cac cca aat tca 1519 Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser His Pro Asn Ser 410 415 420 gga ctt gca act att atg tcc gat ggg cca ggg ggt aat aaa tgg atg 1567 Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met 425 430 435 440 tat gtc ggg aaa cat aaa gct ggc caa gta tgg aga gat atc acc gga 1615 Tyr Val Gly Lys His Lys Ala Gly Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly 445 450 455 aat agg tct ggt acc gtc acc att aat gca gat ggt tgg ggg aat ttc 1663 Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe 460 465 470 act gta aac gga ggg gca gtt tcg gtt tgg gtg aag caa taaataagga 1712 Thr Val Asn Gly Gly Ala Val Ser Val Trp Val Lys Gln 475 480 485 acaagaggcg aaaattactt tcctacatgc agagctttcc gatcactcat acacccaata 1772 taaattggaa gctt 1786

【００７６】 <210> 4 <211> 1753 <212> DNA <213> Bacillus sp. KSM-K38 <220> <221> sig#peptide <222> (162)..(224) <220> <221> mat#peptide <222> (225)..(1664) <220> <221> CDS <222> (162)..(1664) <400> 4 gtatgcgaaa cgatgcgcaa aactgcgcaa ctactagcac tcttcaggga ctaaaccacc 60 ttttttccaa aaatgacatc atataaacaa atttgtctac caatcactat ttaaagctgt 120 ttatgatata tgtaagcgtt atcattaaaa ggaggtattt g atg aga aga tgg gta 176 gta gca atg ttg gca gtg tta ttt tta ttt cct tcg gta gta gtt gca 224 gat gga ttg aac ggt acg atg atg cag tat tat gag tgg cat ttg gaa 272 Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu 1 5 10 15 aac gac ggg cag cat tgg aat cgg ttg cac gat gat gcc gca gct ttg 320 Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp Asp Ala Ala Ala Leu 20 25 30 agt gat gct ggt att aca gct att tgg att ccg cca gcc tac aaa ggt 368 Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 aat agt cag gcg gat gtt ggg tac ggt gca tac gat ctt tat gat tta 416 Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 gga gag ttc aat caa aag ggt act gtt cga acg aaa tac gga act aag 464 Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 gca cag ctt gaa cga gct att ggg tcc ctt aaa tct aat gat atc aat 512 Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn 85 90 95 gta tac gga gat gtc gtg atg aat cat aaa atg gga gct gat ttt acg 560 Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Met Gly Ala Asp Phe Thr 100 105 110 gag gca gtg caa gct gtt caa gta aat cca acg aat cgt tgg cag gat 608 Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Thr Asn Arg Trp Gln Asp 115 120 125 att tca ggt gcc tac acg att gat gcg tgg acg ggt ttc gac ttt tca 656 Ile Ser Gly Ala Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr Gly Phe Asp Phe Ser 130 135 140 ggg cgt aac aac gcc tat tca gat ttt aag tgg aga tgg ttc cat ttt 704 Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Phe His Phe 145 150 155 160 aat ggt gtt gac tgg gat cag cgc tat caa gaa aat cat att ttc cgc 752 Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu Asn His Ile Phe Arg 165 170 175 ttt gca aat acg aac tgg aac tgg cga gtg gat gaa gag aac ggt aat 800 Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn 180 185 190 tat gat tac ctg tta gga tcg aat atc gac ttt agt cat cca gaa gta 848 Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe Ser His Pro Glu Val 195 200 205 caa gat gag ttg aag gat tgg ggt agc tgg ttt acc gat gag tta gat 896 Gln Asp Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe Thr Asp Glu Leu Asp 210 215 220 ttg gat ggt tat cgt tta gat gct att aaa cat att cca ttc tgg tat 944 Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His Ile Pro Phe Trp Tyr 225 230 235 240 aca tct gat tgg gtt cgg cat cag cgc aac gaa gca gat caa gat tta 992 Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Asn Glu Ala Asp Gln Asp Leu 245 250 255 ttt gtc gta ggg gaa tat tgg aag gat gac gta ggt gct ctc gaa ttt 1040 Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val Gly Ala Leu Glu Phe 260 265 270 tat tta gat gaa atg aat tgg gag atg tct cta ttc gat gtt cca ctt 1088 Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 aat tat aat ttt tac cgg gct tca caa caa ggt gga agc tat gat atg 1136 Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met 290 295 300 cgt aat att tta cga gga tct tta gta gaa gcg cat ccg atg cat gca 1184 Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala His Pro Met His Ala 305 310 315 320 gtt acg ttt gtt gat aat cat gat act cag cca ggg gag tca tta gag 1232 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu 325 330 335 tca tgg gtt gct gat tgg ttt aag cca ctt gct tat gcg aca att ttg 1280 Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu 340 345 350 acg cgt gaa ggt ggt tat cca aat gta ttt tac ggt gat tac tat ggg 1328 Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly 355 360 365 att cct aac gat aac att tca gct aaa aaa gat atg att gat gag ctg 1376 Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp Met Ile Asp Glu Leu 370 375 380 ctt gat gca cgt caa aat tac gca tat ggc acg cag cat gac tat ttt 1424 Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe 385 390 395 400 gat cat tgg gat gtt gta gga tgg act agg gaa gga tct tcc tcc aga 1472 Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Ser Ser Ser Arg 405 410 415 cct aat tca ggc ctt gcg act att atg tcg aat gga cct ggt ggt tcc 1520 Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser 420 425 430 aag tgg atg tat gta gga cgt cag aat gca gga caa aca tgg aca gat 1568 Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp 435 440 445 tta act ggt aat aac gga gcg tcc gtt aca att aat ggc gat gga tgg 1616 Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp 450 455 460 ggc gaa ttc ttt acg aat gga gga tct gta tcc gtg tac gtg aac caa 1664 Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Tyr Val Asn Gln 465 470 475 480 taacaaaaag ccttgagaag ggattcctcc ctaactcaag gctttcttta tgtcgcttag 1724 cttaacgctt ctacgacttt gaagcttta 1753

【００７７】 <210>5 <211>30 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>5 gagtcgacca gcacaagccc atcataatgg 30

【００７８】 <210>6 <211>21 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>6 taaagcttca atttatattg g 21

【００７９】 <210>7 <211>40 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>7 gggtcgacca gcacaagccg atggattgaa cggtacgatg 40

【００８０】 <210>8 <211>29 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>8 taaagctttt gttattggtt cacgtacac 29

【００８１】 <210>9 <211>27 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>9 ccagatctac ttaccatttt agagtca 27

【００８２】 <210>10 <211>34 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>10 atttgccaaa tgacgggcag cattggaatc ggtt 34

【００８３】 <210>11 <211>34 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>11 aaccgattcc aatgctgccc gtcatttggc aaat 34

【００８４】 <210>12 <211>34 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>12 tttgaatggc atttgtcaaa tgacggggaa ccac 34

【００８５】 <210>13 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>13 acaaggagtc agttggaagg tgccgtgaca tct 33

【００８６】 <210>14 <211>21 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>14 cgaaaccaag taatatcagg t 21

【００８７】 <210>15 <211>27 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>15 aatacccatt ccgattttaa atggcgc 27

【００８８】 <210>16 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>16 gattgggatc agtcatgyca gcttcagaac aaa 33

【００８９】 <210>17 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>17 aaattcaccg gaaaggtatg ggactgggaa gta 33

【００９０】 <210>18 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>18 tcatccagat gtaatcaatg 20

【００９１】 <210>19 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>19 cttagaaatt ggggagaatg gtatacaaat aca 33

【００９２】 <210>20 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>20 gtgaaacata ttaaatgcag ctatacgaga gat 33

【００９３】 <210>21 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>21 aacaccacag gtaaagaaat gtttgcagtt gca 33

【００９４】 <210>22 <211>21 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>22 agaattttgg caaaatgacc t 21

【００９５】 <210>23 <211>26 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>23 ttgctgcaat ccataactat ttaaat 26

【００９６】 <210>24 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>24 cttgctgcaa tcgaaagyta tttaaataaa aca 33

【００９７】 <210>25 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>25 ggctattttg atatggcaaa tattttaaat ggt 33

【００９８】 <210>26 <211>21 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>26 tctgacaagg cagcaaggtt a 21

【００９９】 <210>27 <211>27 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>27 gatccacttc tggaagcacg tcaaacg 27

【０１００】 <210>28 <211>27 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>28 gggggtaata aaagaatgta tgtcggg 27

【０１０１】 <210>29 <211>26 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>29 atgtatgtcg ggcgacataa agctgg 26

【０１０２】 <210>30 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>30 gatggttggg gggatttcac tgtaa 25

【０１０３】 <210>31 <211>27 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>31 ttcactgtaa acgatggggc agtttcg 27

【０１０４】 <210>32 <211>21 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>32 ggtttgggtg cagcaataaa t

【０１０５】 <210>33 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>33 tttgaatggc atttgnnnaa tgacgggaac cac 33

【０１０６】 <210>34 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>34 aaattcaccg gaaagnnntg ggactgggaa gta 33

【０１０７】 <210>35 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>35 gtgaaacata ttaaannnag ctatacgaga gat 33

【０１０８】 <210>36 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>36 cttgctgcaa tcgaannnta tttaaataaa aca 33

【０１０９】 <210>37 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>37 gatggttggg gggaattcac tgtaa 25

【０１１０】 <210>38 <211>39 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>38 ccaacgaatc gttggcaggt aatttcaggt gcctacacg 39

【０１１１】 <210>39 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>39 attgatgcgt ggacgagttt cgacttttca ggg 33

【０１１２】 <210>40 <211>21 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>40 tttcgacttt ccagggcgta a 21

【０１１３】 <210>41 <211>43 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>41 ggtgttgact gggatcagca atatcaagaa aatcatattt tcc 43

【０１１４】 <210>42 <211>42 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>42 catattttcc gctttgcaaa tacggtntgg aacaggcgag tg 42

【０１１５】 <210>43 <211>44 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>43 aatatcgact ttagtcatcc agatgtacaa gatgagttga agga 44

【０１１６】 <210>44 <211>43 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>44 gacgtaggtg ctctcgaatc ttatttagat gaaatgaatt ggg 43

【０１１７】 <210>45 <211>21 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>45 cgataacatt ccagctaaaa a 21

【０１１８】 <210>46 <211>38 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>46 gacctggtgg ttccaagaga atgtatgtag gacgtcag 38

【０１１９】 <210>47 <211>42 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>47 aatggcgatg gatggggcga tttctttacg aatggaggat ct 42

【０１２０】 <210>48 <211>39 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>48 ccaacgaatc gttggcagnn natttcaggt gcctacacg 39

【０１２１】 <210>49 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>49 gttgactggg atgagcgcaa acaagaaaat cat 33

【０１２２】 <210>50 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>50 tggatgaaga gttcggtaat tatga 25

【０１２３】 <210>51 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>51 agtcatccag aggtcgtaga tgagttgaag gat 33

【図面の簡単な説明】

【図１】ＫＳＭ−１３７８株或いはＫＳＭ−Ｋ３８株由
来のα−アミラーゼ生産用組換えプラスミドの構築方法
を示す図である。

【図２】ＫＳＭ−１３７８株或いはＫＳＭ−Ｋ３８株由
来のα−アミラーゼ遺伝子への変異導入方法を示す模式
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:07） 9/28 (Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/28 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/28 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者萩原浩栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者五十嵐一暁栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者林康弘栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者尾崎克也栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA13 CA03 DA07 EA04 GA11 GA25 4B050 CC03 DD02 LL04 4B065 AA15X AA15Y AB01 AC14 BA02 CA32 CA57 4H003 AC23 DA01 DA13 DA19 EA15 EA16 EA20 EB08 EB30 EB34 EB37 EC03 EE05 FA47

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１に示されるアミノ酸配列又は
該アミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するα
−アミラーゼにおいて、該アミノ酸配列の１８番目のＰ
ｒｏ、８６番目のＧｌｎ、１３０番目のＧｌｕ、１５４
番目のＡｓｎ、１７１番目のＡｒｇ、１８６番目のＡｌ
ａ、２１２番目のＧｌｕ、２２２番目のＶａｌ、２４３
番目のＴｙｒ、２６０番目のＰｒｏ、２６９番目のＬｙ
ｓ、２７６番目のＧｌｕ、２７７番目のＡｓｎ、３１０
番目のＡｒｇ、３６０番目のＧｌｕ、３９１番目のＧｌ
ｎ、４３９番目のＴｒｐ、４４４番目のＬｙｓ、４７１
番目のＡｓｎ及び４７６番目のＧｌｙのうちのいずれか
に相当するアミノ酸残基の１残基以上を置換又は欠失さ
せてなる変異α-アミラーゼ。
【請求項２】配列番号２に示されるアミノ酸配列又は
該アミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するα
−アミラーゼにおいて、該アミノ酸配列の１２８番目の
Ａｓｐ、１４０番目のＧｌｙ、１６８番目のＡｒｇ、１
８１番目のＡｓｎ、２０７番目のＧｌｕ、２７２番目の
Ｐｈｅ、３７５番目のＳｅｒ、４３４番目のＴｒｐ及び
４６６番目のＧｌｕのうちのいずれかに相当するアミノ
酸残基の１残基以上を置換又は欠失させてなる変異α-
アミラーゼ。
【請求項３】アミノ酸残基の置換が、配列番号１のア
ミノ酸配列の１８番目のＰｒｏに相当するアミノ酸残基
をＳｅｒ若しくはＴｈｒ、８６番目のＧｌｎに相当する
アミノ酸残基をＧｌｕ、１３０番目のＧｌｕに相当する
アミノ酸残基をＶａｌ若しくはＧｌｎ、１５４番目のＡ
ｓｎに相当するアミノ酸残基をＡｓｐ、１７１番目のＡ
ｒｇに相当するアミノ酸残基をＣｙｓ若しくはＧｌｎ、
１８６番目のＡｌａに相当するアミノ酸残基をＶａｌ若
しくはＡｓｎ、２１２番目のＧｌｕに相当するアミノ酸
残基をＡｓｐ、２２２番目のＶａｌに相当するアミノ酸
残基をＧｌｕ、２４３番目のＴｙｒに相当するアミノ酸
残基をＣｙｓ若しくはＳｅｒ、２６０番目のＰｒｏに相
当するアミノ酸残基をＧｌｕ、２６９番目のＬｙｓに相
当するアミノ酸残基をＧｌｎ、２７６番目のＧｌｕに相
当するアミノ酸残基をＨｉｓ、２７７番目のＡｓｎに相
当するアミノ酸残基をＳｅｒ若しくはＰｈｅ、３１０番
目のＡｒｇに相当するアミノ酸残基をＡｌａ、３６０番
目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基をＧｌｎ、３９１番
目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＧｌｕ、４３９番
目のＴｒｐに相当するアミノ酸残基をＡｒｇ、４４４番
目のＬｙｓに相当するアミノ酸残基をＡｒｇ、４７１番
目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＡｓｐ若しくはＧ
ｌｕ又は４７６番目のＧｌｙに相当するアミノ酸残基を
Ａｓｐに置換させるものである請求項１記載の変異α−
アミラーゼ。
【請求項４】アミノ酸残基の置換が、配列番号２のア
ミノ酸配列の１２８番目のＡｓｐに相当するアミノ酸残
基をＶａｌ若しくはＧｌｎ、１４０番目のＧｌｙに相当
するアミノ酸残基をＳｅｒ、１６８番目のＡｒｇに相当
するアミノ酸残基をＧｌｎ、１８１番目のＧｌｎに相当
するアミノ酸残基をＶａｌ、２０７番目のＧｌｕに相当
するアミノ酸残基をＡｓｐ、２７２番目のＰｈｅに相当
するアミノ酸残基をＳｅｒ、３７５番目のＳｅｒに相当
するアミノ酸残基をＰｒｏ、４３４番目のＴｒｐに相当
するアミノ酸残基をＡｒｇ又は４６６番目のＧｌｕに相
当するアミノ酸残基をＡｓｐに置換させるものである請
求項２記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項５】請求項１〜４のいずれか１項記載の変異
α−アミラーゼをコードする遺伝子又は当該遺伝子を含
有するベクター。
【請求項６】請求項５に記載のベクターで形質転換さ
れた細胞。
【請求項７】請求項６に記載の形質転換細胞を培養す
ることを特徴とする変異α−アミラーゼの製造方法。
【請求項８】請求項１〜４のいずれか１項記載の変異
α−アミラーゼを含有する洗浄剤組成物。