JP2002112773A - Ｄｎａマーカーを用いるパパイアの性識別方法 - Google Patents
Ｄｎａマーカーを用いるパパイアの性識別方法Info
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 パパイアの性識別方法の提供。（パパイアは
雄、雌、両性の３つの性表現型を持つ果樹で、果実とし
て商品価値が高いのは両性果実である。） 【解決手段】 パパイア由来の特定の２種類の塩基配列
のいずれかからなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの多型物を含む
パパイアの性識別マーカー、ＤＮＡの一部を含むパパイ
アの性識別マーカー増幅用プライマーで、下記配列番号
４〜７のいずれかで表されるもの。 ｇｇｔａａｇａｇｔｔ ｔｔｔｃｃｃａａｇｃ ４ ｔｇｃａｃｇａｔｔｔ ａｇａｔｔａｇａｔｇ ５ ｇｇａｔａｇｃｔｔｇ ｃｃｃａｇｇｔｃａｃ ６ ｇｔｔｇｔｇｃｔｇｃ ｇｃｔａｔｃｔｔｇｃ ７ 上記いずれかの性識別マーカー増幅用プライマーを構成
要素として含む、パパイアの性識別用キッット。前記Ｄ
ＮＡの一部又は全部を含むパパイアの性識別マーカー検
出用プローブ、及びこれを構成要素として含む、パパイ
アの性識別用キット。被検体パパイアにおける、前記パ
パイアの性識別マーカーの有無を解析するパパイアの性
識別方法。
雄、雌、両性の３つの性表現型を持つ果樹で、果実とし
て商品価値が高いのは両性果実である。） 【解決手段】 パパイア由来の特定の２種類の塩基配列
のいずれかからなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの多型物を含む
パパイアの性識別マーカー、ＤＮＡの一部を含むパパイ
アの性識別マーカー増幅用プライマーで、下記配列番号
４〜７のいずれかで表されるもの。 ｇｇｔａａｇａｇｔｔ ｔｔｔｃｃｃａａｇｃ ４ ｔｇｃａｃｇａｔｔｔ ａｇａｔｔａｇａｔｇ ５ ｇｇａｔａｇｃｔｔｇ ｃｃｃａｇｇｔｃａｃ ６ ｇｔｔｇｔｇｃｔｇｃ ｇｃｔａｔｃｔｔｇｃ ７ 上記いずれかの性識別マーカー増幅用プライマーを構成
要素として含む、パパイアの性識別用キッット。前記Ｄ
ＮＡの一部又は全部を含むパパイアの性識別マーカー検
出用プローブ、及びこれを構成要素として含む、パパイ
アの性識別用キット。被検体パパイアにおける、前記パ
パイアの性識別マーカーの有無を解析するパパイアの性
識別方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、パパイアの雄及び
両性に特異的に存在するDNA、該DNAを含むパパイアの性
識別マーカー、該性識別マーカーの増幅用プライマー、
該性識別マーカーの検出用プローブ、該プライマー若し
くは該プローブを構成要素として含むパパイアの性識別
用キット、及び該性識別マーカーの存在の有無を指標と
するパパイアの性識別方法に関する。
両性に特異的に存在するDNA、該DNAを含むパパイアの性
識別マーカー、該性識別マーカーの増幅用プライマー、
該性識別マーカーの検出用プローブ、該プライマー若し
くは該プローブを構成要素として含むパパイアの性識別
用キット、及び該性識別マーカーの存在の有無を指標と
するパパイアの性識別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】パパイア（Carica papaya）は雄、雌、
両性の３つの性表現型を持つ果樹で、果実として商品価
値が高いのは両性果実である。沖縄県において栽培され
ているパパイアの主力品種であるサンライズは、両性自
殖の品種で、その苗には雌と両性とが１対２の割合で存
在している。従って、サンライズの苗の性識別において
は、雌と両性とを識別することが重要となる。従来、パ
パイアの性識別は、花が咲くまで形態による判断ができ
ない為、１箇所に複数本仮定植し、花型による性識別に
より必要な株を残す栽培法により行われてきた。しかし
ながら、この方法では、種苗会社における育苗コスト
（肥料、水、鉢、人件費、土地占有等）や現場での栽培
コスト（肥料、水、人件費、計画栽培が困難）がかさむ
ため、育苗段階（開花前）でのパパイアの性識別法の開
発が急務となっていた。
両性の３つの性表現型を持つ果樹で、果実として商品価
値が高いのは両性果実である。沖縄県において栽培され
ているパパイアの主力品種であるサンライズは、両性自
殖の品種で、その苗には雌と両性とが１対２の割合で存
在している。従って、サンライズの苗の性識別において
は、雌と両性とを識別することが重要となる。従来、パ
パイアの性識別は、花が咲くまで形態による判断ができ
ない為、１箇所に複数本仮定植し、花型による性識別に
より必要な株を残す栽培法により行われてきた。しかし
ながら、この方法では、種苗会社における育苗コスト
（肥料、水、鉢、人件費、土地占有等）や現場での栽培
コスト（肥料、水、人件費、計画栽培が困難）がかさむ
ため、育苗段階（開花前）でのパパイアの性識別法の開
発が急務となっていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、パパイアの
雄及び両性に特異的に存在するDNA、該DNAを含むパパイ
アの性識別マーカー、該性識別マーカーの増幅用プライ
マー、該性識別マーカーの検出用プローブ、該プライマ
ー若しくは該プローブを構成要素として含むパパイアの
性識別用キット、及び該性識別マーカーの存在の有無を
指標とするパパイアの性識別方法を提供することを目的
とする。
雄及び両性に特異的に存在するDNA、該DNAを含むパパイ
アの性識別マーカー、該性識別マーカーの増幅用プライ
マー、該性識別マーカーの検出用プローブ、該プライマ
ー若しくは該プローブを構成要素として含むパパイアの
性識別用キット、及び該性識別マーカーの存在の有無を
指標とするパパイアの性識別方法を提供することを目的
とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】発明者らは、上記の課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、RAPD法によっ
て、パパイアの雄及び両性に特異的に存在するDNAマー
カーを取得することに成功し、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、配列番号１又は２で表される
塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むDNAであ
る。
を解決するために鋭意研究を行った結果、RAPD法によっ
て、パパイアの雄及び両性に特異的に存在するDNAマー
カーを取得することに成功し、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、配列番号１又は２で表される
塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むDNAであ
る。
【０００５】さらに、本発明は、配列番号１又は２で表
される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むパ
パイアの性識別マーカーである。さらに、本発明は、上
記DNAの一部（例えば17〜30merの長さを有するもの、よ
り具体的には、例えば配列番号４〜７のいずれかで表さ
れるもの等）を含むパパイアの性識別マーカー増幅用プ
ライマーである。
される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むパ
パイアの性識別マーカーである。さらに、本発明は、上
記DNAの一部（例えば17〜30merの長さを有するもの、よ
り具体的には、例えば配列番号４〜７のいずれかで表さ
れるもの等）を含むパパイアの性識別マーカー増幅用プ
ライマーである。
【０００６】さらに、本発明は、上記性識別マーカー増
幅用プライマーを構成要素として含む、パパイアの性識
別用キットである。さらに、本発明は、上記DNAの一部
（例えば、20〜450merの長さを有するもの）又は全部を
含むパパイアの性識別マーカー検出用プローブである。
さらに、本発明は、上記性識別マーカー検出用プローブ
を構成要素として含む、パパイアの性識別用キットであ
る。
幅用プライマーを構成要素として含む、パパイアの性識
別用キットである。さらに、本発明は、上記DNAの一部
（例えば、20〜450merの長さを有するもの）又は全部を
含むパパイアの性識別マーカー検出用プローブである。
さらに、本発明は、上記性識別マーカー検出用プローブ
を構成要素として含む、パパイアの性識別用キットであ
る。
【０００７】さらに、本発明は、被検体パパイアにおけ
る、上記パパイアの性識別マーカーの有無を解析するこ
とを特徴とするパパイアの性識別方法である。ここで、
パパイアの性識別マーカーの有無の解析は、ポリメラー
ゼ連鎖反応により得られる該性識別マーカー由来の増幅
産物を検出することにより行われ得る。該ポリメラーゼ
連鎖反応は、鋳型として被検体パパイア由来のDNAを、
プライマーとして上記のいずれかの性識別マーカー増幅
用プライマーを用いて行われ得る。また、パパイアの性
識別マーカーの有無の解析は、プローブハイブリダイゼ
ーション反応により得られるハイブリダイズ物を検出す
ることによっても行われ得る。該プローブハイブリダイ
ゼーション反応は、被検体パパイア由来のDNAに、該性
識別マーカー検出用プローブをハイブリダイズすること
により行われ得る。以下、本発明を詳細に説明する。
る、上記パパイアの性識別マーカーの有無を解析するこ
とを特徴とするパパイアの性識別方法である。ここで、
パパイアの性識別マーカーの有無の解析は、ポリメラー
ゼ連鎖反応により得られる該性識別マーカー由来の増幅
産物を検出することにより行われ得る。該ポリメラーゼ
連鎖反応は、鋳型として被検体パパイア由来のDNAを、
プライマーとして上記のいずれかの性識別マーカー増幅
用プライマーを用いて行われ得る。また、パパイアの性
識別マーカーの有無の解析は、プローブハイブリダイゼ
ーション反応により得られるハイブリダイズ物を検出す
ることによっても行われ得る。該プローブハイブリダイ
ゼーション反応は、被検体パパイア由来のDNAに、該性
識別マーカー検出用プローブをハイブリダイズすること
により行われ得る。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明のパパイアの性識別方法
は、従来の性識別方法とは異なり、性の違いに伴って生
じるパパイア間のDNA配列の差異に基づいて性の識別を
行う方法である。より具体的には、性識別マーカーの存
在の有無を指標として、被検体パパイアの性を識別する
方法である。ここで、「性識別マーカー」とは、特定の
性に特異的に見出される塩基配列を有するDNAであっ
て、性の識別に使用することがでDNAをいう。パパイア
の性識別マーカーは、以下のようにして分離することが
できる。
は、従来の性識別方法とは異なり、性の違いに伴って生
じるパパイア間のDNA配列の差異に基づいて性の識別を
行う方法である。より具体的には、性識別マーカーの存
在の有無を指標として、被検体パパイアの性を識別する
方法である。ここで、「性識別マーカー」とは、特定の
性に特異的に見出される塩基配列を有するDNAであっ
て、性の識別に使用することがでDNAをいう。パパイア
の性識別マーカーは、以下のようにして分離することが
できる。
【０００９】１．性識別マーカーの探索 性識別マーカーの探索は、生物個体間の遺伝的多型を検
出する方法、例えば増幅断片多型（random amplified p
olymorphic DNA；RAPD）法[Williamら:NucleicAcids Re
s. 18:6531-6535(1990)]等によって行うことができる。
すなわち、まず、パパイアから常法、例えばCTAB法[Mur
rayら:Nucleic Acids Res. 8:4321-4325 (1980)]等によ
りDNAを抽出する。この際、抽出に使用する植物組織に
限定はないが、好ましくは葉を用いる。さらに、これら
の葉は、DNA抽出を効率良く行うことができるるように
粉砕しておくことが好ましく、例えば、液体窒素により
凍結し、乳鉢内で粉砕することができる。
出する方法、例えば増幅断片多型（random amplified p
olymorphic DNA；RAPD）法[Williamら:NucleicAcids Re
s. 18:6531-6535(1990)]等によって行うことができる。
すなわち、まず、パパイアから常法、例えばCTAB法[Mur
rayら:Nucleic Acids Res. 8:4321-4325 (1980)]等によ
りDNAを抽出する。この際、抽出に使用する植物組織に
限定はないが、好ましくは葉を用いる。さらに、これら
の葉は、DNA抽出を効率良く行うことができるるように
粉砕しておくことが好ましく、例えば、液体窒素により
凍結し、乳鉢内で粉砕することができる。
【００１０】次に、該パパイアDNAを鋳型として、１種
又は２種のランダムな配列からなるプライマー（ランダ
ムプライマーともいう）を用いてポリメラーゼ連鎖反応
（plymerase chain reaction；PCR）を行う。ここで使
用することができるランダムプライマーとしては、10〜
12merの塩基長のものが挙げられる。本発明において
は、ランダムプライマーとして、独自に設計・合成した
5'-ttggcacggg-3'（配列番号３）の塩基配列からなる10
merのプライマーを用いた。PCRの反応条件は、特に限
定はしないが、好ましくは92〜96℃で１〜２分間（二本
鎖DNAの解離）、37〜42℃で１〜２分間（プライマーの
アニーリング）、70〜74℃で１〜２分間（相補鎖の合
成）で順次反応させ、好ましくはこれを30〜40サイクル
行う。PCRは、ヒートブロック式のプログラム温度制御
装置（例えば、PCR Thermal Cycler（宝酒造社製））を
用いて行うことができる。
又は２種のランダムな配列からなるプライマー（ランダ
ムプライマーともいう）を用いてポリメラーゼ連鎖反応
（plymerase chain reaction；PCR）を行う。ここで使
用することができるランダムプライマーとしては、10〜
12merの塩基長のものが挙げられる。本発明において
は、ランダムプライマーとして、独自に設計・合成した
5'-ttggcacggg-3'（配列番号３）の塩基配列からなる10
merのプライマーを用いた。PCRの反応条件は、特に限
定はしないが、好ましくは92〜96℃で１〜２分間（二本
鎖DNAの解離）、37〜42℃で１〜２分間（プライマーの
アニーリング）、70〜74℃で１〜２分間（相補鎖の合
成）で順次反応させ、好ましくはこれを30〜40サイクル
行う。PCRは、ヒートブロック式のプログラム温度制御
装置（例えば、PCR Thermal Cycler（宝酒造社製））を
用いて行うことができる。
【００１１】PCRの後、PCR増幅産物を検出する。検出方
法としては、ゲル電気泳動（例えば、アガロースゲル電
気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等）及びそれ
に続くゲル染色（例えば、エチジウムブロミド染色等）
による方法が挙げられるが、これに限定されない。例え
ば、アガガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロミ
ドでゲルを染色し紫外光下で観察すると、バーコード様
のバンドパターンが得られる。このバンドパターンを、
雌のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合、雄
のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合及び両
性のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合とで
比較し、それぞれの性に特異的に見出されるPCR増幅産
物をパパイアの性識別マーカーとすることができる。
法としては、ゲル電気泳動（例えば、アガロースゲル電
気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等）及びそれ
に続くゲル染色（例えば、エチジウムブロミド染色等）
による方法が挙げられるが、これに限定されない。例え
ば、アガガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロミ
ドでゲルを染色し紫外光下で観察すると、バーコード様
のバンドパターンが得られる。このバンドパターンを、
雌のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合、雄
のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合及び両
性のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合とで
比較し、それぞれの性に特異的に見出されるPCR増幅産
物をパパイアの性識別マーカーとすることができる。
【００１２】ところで、パパイア間の交配により子孫に
出現する性表現型とその出現割合は表１のとおりであ
る。沖縄県で生産されるパパイアの主力品種であるサン
ライズは、両性自殖の品種で、その苗（幼植物ともい
う）には表１のように雌と両性が１対２の割合で存在す
る。よって、サンライズの苗の性識別においては、雌と
両性とを識別する方法が所望される。雌のパパイア由来
DNAを鋳型としてPCRを行った場合には見られず、両性の
パパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合にのみ、
あるいは両性及び雄のパパイア由来DNAを鋳型としてPCR
を行った場合にのみ見られるPCR増幅産物は、雌のパパ
イアから両性又は雄のパパイアを識別するための性識別
マーカーとして使用することができる。
出現する性表現型とその出現割合は表１のとおりであ
る。沖縄県で生産されるパパイアの主力品種であるサン
ライズは、両性自殖の品種で、その苗（幼植物ともい
う）には表１のように雌と両性が１対２の割合で存在す
る。よって、サンライズの苗の性識別においては、雌と
両性とを識別する方法が所望される。雌のパパイア由来
DNAを鋳型としてPCRを行った場合には見られず、両性の
パパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合にのみ、
あるいは両性及び雄のパパイア由来DNAを鋳型としてPCR
を行った場合にのみ見られるPCR増幅産物は、雌のパパ
イアから両性又は雄のパパイアを識別するための性識別
マーカーとして使用することができる。
【００１３】
【表１】
【００１４】２．性識別マーカーの塩基配列決定 上記１において得られたパパイアの性識別マーカーの塩
基配列は、当該技術分野で周知の塩基配列決定法により
決定することができる。すなわち、例えば、上記１にお
けるPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動後のゲルか
ら性識別マーカーのバンドを抽出し、塩基配列決定用プ
ラスミド（例えば、pT7Blue(NOVAGEN社製)）に連結す
る。次いで、連結物を大腸菌に形質転換後、コロニーPC
R法によって、性識別マーカーの挿入されたプラスミド
を含有する大腸菌をスクリーニングする。得られた大腸
菌からプラスミドを調製し、ジデオキシ法等の公知の手
法によって挿入DNA断片の塩基配列を決定する。本発明
において性識別マーカーとして取得されたDNA断片の塩
基配列を配列番号１に、その相補鎖の配列を配列番号２
に示す。配列番号１及び２で表される塩基配列からなる
DNAは、両性及び雄のパパイア中で互いに２本鎖を形成
しに存在し、共にパパイアの性識別マーカーとして有用
である。
基配列は、当該技術分野で周知の塩基配列決定法により
決定することができる。すなわち、例えば、上記１にお
けるPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動後のゲルか
ら性識別マーカーのバンドを抽出し、塩基配列決定用プ
ラスミド（例えば、pT7Blue(NOVAGEN社製)）に連結す
る。次いで、連結物を大腸菌に形質転換後、コロニーPC
R法によって、性識別マーカーの挿入されたプラスミド
を含有する大腸菌をスクリーニングする。得られた大腸
菌からプラスミドを調製し、ジデオキシ法等の公知の手
法によって挿入DNA断片の塩基配列を決定する。本発明
において性識別マーカーとして取得されたDNA断片の塩
基配列を配列番号１に、その相補鎖の配列を配列番号２
に示す。配列番号１及び２で表される塩基配列からなる
DNAは、両性及び雄のパパイア中で互いに２本鎖を形成
しに存在し、共にパパイアの性識別マーカーとして有用
である。
【００１５】なお、本発明の性識別マーカーは配列番号
１及び２に示されるものに限定されるものではなく、雌
のパパイアから両性又は雄のパアイアを識別することが
できるものであれば、配列番号１及び２において１若し
くは数個の塩基が置換、欠失、付加または挿入された
「多型物」も本発明の性識別マーカーに含まれる。ここ
で、「多型物」とは、より詳細には、同じ性のパパイア
個体間において、１若しくは数個のレベルで対応する塩
基配列間に差異の生じたDNA多型物をいう。
１及び２に示されるものに限定されるものではなく、雌
のパパイアから両性又は雄のパアイアを識別することが
できるものであれば、配列番号１及び２において１若し
くは数個の塩基が置換、欠失、付加または挿入された
「多型物」も本発明の性識別マーカーに含まれる。ここ
で、「多型物」とは、より詳細には、同じ性のパパイア
個体間において、１若しくは数個のレベルで対応する塩
基配列間に差異の生じたDNA多型物をいう。
【００１６】配列番号１又は２で表される塩基配列から
なるDNA又は該DNAの多型物を含む本発明のDNAは、上記
１の方法により調製されるが、その他にも、決定された
塩基配列に基づいてプライマーを設計・合成し、このプ
ライマーを用い、パパイアの雄および両性株から抽出し
たDNAを鋳型としてPCRを行うことにより調製することも
できる。
なるDNA又は該DNAの多型物を含む本発明のDNAは、上記
１の方法により調製されるが、その他にも、決定された
塩基配列に基づいてプライマーを設計・合成し、このプ
ライマーを用い、パパイアの雄および両性株から抽出し
たDNAを鋳型としてPCRを行うことにより調製することも
できる。
【００１７】３.本発明の性識別マーカーの解析による
パパイアの性識別 被検パパイア中の本発明の性識別マーカーの有無を解析
することにより、当該被検パパイアの性を識別すること
ができる。性識別マーカーの有無の解析は、PCR法及び
プローブ法等により行うことができる。
パパイアの性識別 被検パパイア中の本発明の性識別マーカーの有無を解析
することにより、当該被検パパイアの性を識別すること
ができる。性識別マーカーの有無の解析は、PCR法及び
プローブ法等により行うことができる。
【００１８】(1) PCR法による性識別マーカーの解析 PCR法による性識別マーカーの解析に基づいたパパイア
の性識別は、以下のようにして行うことができる。ま
ず、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA
又は該DNAの多型物の塩基配列に基づいて、当該塩基配
列の一部を含む性識別マーカー増幅用プライマーを設計
・合成する。ここで、「当該塩基配列の一部」とは、配
列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該D
NAの多型物中の17〜30mer、好ましくは20〜30mer、最も
好ましくは20〜25merの塩基長からなる連続したヌクレ
オチド鎖をいう。より詳細には、配列番号１又は２で表
される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物に特異的
にハイブリダイズし且つプライマーとして機能するヌク
レオチド鎖である。ここで、「プライマーとして機能す
る」とは、PCRの相補鎖合成反応においてDNAポリメラー
ゼに3'末端OH基を提供し、当該酵素によるヌクレオヂド
鎖合成反応を開始させるように機能することをいう。プ
ライマーの合成は、オリゴヌクレオチドの合成方法とし
て知られる公知の方法を用いることができるが、より簡
便には、DNAシンセサイザー(例えばApplied Biosystem
社製)を用いて行うことができる。
の性識別は、以下のようにして行うことができる。ま
ず、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA
又は該DNAの多型物の塩基配列に基づいて、当該塩基配
列の一部を含む性識別マーカー増幅用プライマーを設計
・合成する。ここで、「当該塩基配列の一部」とは、配
列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該D
NAの多型物中の17〜30mer、好ましくは20〜30mer、最も
好ましくは20〜25merの塩基長からなる連続したヌクレ
オチド鎖をいう。より詳細には、配列番号１又は２で表
される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物に特異的
にハイブリダイズし且つプライマーとして機能するヌク
レオチド鎖である。ここで、「プライマーとして機能す
る」とは、PCRの相補鎖合成反応においてDNAポリメラー
ゼに3'末端OH基を提供し、当該酵素によるヌクレオヂド
鎖合成反応を開始させるように機能することをいう。プ
ライマーの合成は、オリゴヌクレオチドの合成方法とし
て知られる公知の方法を用いることができるが、より簡
便には、DNAシンセサイザー(例えばApplied Biosystem
社製)を用いて行うことができる。
【００１９】より詳細には、PCR法による性識別マーカ
ーの解析には、性識別マーカーの一部又は全部の領域を
増幅し得るような5’側プライマーと3’側プライマーと
からなる性識別マーカー増幅用プライマーのペアが必要
である。例えば、性識別マーカー増幅用プライマーの
5’側プライマーとしては、5'-ggtaagagtttttcccaagc-
3'（配列番号４）や5'-tgcacgatttagattagatg-3'（配列
番号５）が挙げられる。また、3’側プライマーとして
は、5'-ggatagcttgcccaggtcac-3'（配列番号６）、5'-g
ttgtgctgcgctatcttgc-3' （配列番号７）が挙げられる
が、当業者であれば配列番号１又は２の塩基配列に基づ
いて、他の適切な配列を容易に設計・合成することがで
き、これらのプライマーに限定されない。なお、配列番
号１における上記各プライマーの対応位置を図１に示
す。図１中において、矢印の向きは配列の向きを示す。
これらのプライマーは、5’側プライマーと3’側プライ
マーとを適当に組み合わせて、性識別マーカー領域を増
幅用のプライマーペアとして使用することができるが、
その適当な組み合わせは、当業者であれば適宜選択する
ことができる。すなわち、5’側プライマーが、3’側プ
ライマーよりも上流（5’から3’への向きにおいて）に
存在するようにプライマーペアを選択することが必須の
条件となる。このようなプライマーの組み合わせとして
は、好ましくは、配列番号４と配列番号６、配列番号４
と配列番号７、配列番号５と配列番号６、配列番号５と
配列番号７の組み合わせが挙げられるが、プライマーの
組み合わせは任意である。
ーの解析には、性識別マーカーの一部又は全部の領域を
増幅し得るような5’側プライマーと3’側プライマーと
からなる性識別マーカー増幅用プライマーのペアが必要
である。例えば、性識別マーカー増幅用プライマーの
5’側プライマーとしては、5'-ggtaagagtttttcccaagc-
3'（配列番号４）や5'-tgcacgatttagattagatg-3'（配列
番号５）が挙げられる。また、3’側プライマーとして
は、5'-ggatagcttgcccaggtcac-3'（配列番号６）、5'-g
ttgtgctgcgctatcttgc-3' （配列番号７）が挙げられる
が、当業者であれば配列番号１又は２の塩基配列に基づ
いて、他の適切な配列を容易に設計・合成することがで
き、これらのプライマーに限定されない。なお、配列番
号１における上記各プライマーの対応位置を図１に示
す。図１中において、矢印の向きは配列の向きを示す。
これらのプライマーは、5’側プライマーと3’側プライ
マーとを適当に組み合わせて、性識別マーカー領域を増
幅用のプライマーペアとして使用することができるが、
その適当な組み合わせは、当業者であれば適宜選択する
ことができる。すなわち、5’側プライマーが、3’側プ
ライマーよりも上流（5’から3’への向きにおいて）に
存在するようにプライマーペアを選択することが必須の
条件となる。このようなプライマーの組み合わせとして
は、好ましくは、配列番号４と配列番号６、配列番号４
と配列番号７、配列番号５と配列番号６、配列番号５と
配列番号７の組み合わせが挙げられるが、プライマーの
組み合わせは任意である。
【００２０】配列番号４〜７のプライマーを用いてパパ
イア幼植物の性識別を行うことができる。より詳細に
は、「雌×雄」、「雌×両性」、「雄×雄」及び「両性
×両性」の交配組み合わせにより得られる、雌、両性及
び雄のパパイア幼植物の中から両性及び雄を識別するこ
とができる。
イア幼植物の性識別を行うことができる。より詳細に
は、「雌×雄」、「雌×両性」、「雄×雄」及び「両性
×両性」の交配組み合わせにより得られる、雌、両性及
び雄のパパイア幼植物の中から両性及び雄を識別するこ
とができる。
【００２１】具体的手順を例示すると以下のようにな
る。すなわち、まず、パパイア幼植物の組織から常法に
従ってDNAを抽出する。DNA抽出に用いる植物体の組織は
特に限定されないが、好ましくは葉を用いる。さらに、
これらの葉は、核酸抽出を効率良く行うことができるよ
うに粉砕しておくことが好ましく、例えば、液体窒素を
用いて粉砕することができる。DNAの抽出は公知の方法
を用いて行うことができるが、好ましくはCTAB法[Murra
yら, Nucleic Acids Res. 8, 4321-4325 (1980)]により
抽出することができる。
る。すなわち、まず、パパイア幼植物の組織から常法に
従ってDNAを抽出する。DNA抽出に用いる植物体の組織は
特に限定されないが、好ましくは葉を用いる。さらに、
これらの葉は、核酸抽出を効率良く行うことができるよ
うに粉砕しておくことが好ましく、例えば、液体窒素を
用いて粉砕することができる。DNAの抽出は公知の方法
を用いて行うことができるが、好ましくはCTAB法[Murra
yら, Nucleic Acids Res. 8, 4321-4325 (1980)]により
抽出することができる。
【００２２】次いで、抽出したDNAを鋳型とし、上記の
性識別マーカー領域増幅用のプライマーペアを加えてPC
Rを行い、目的のDNA断片を増幅させる。PCRの温度条件
は、当業者であれば経験に基づいて適切に決定すること
ができ、特に限定はしないが、好ましくは92〜96℃で１
〜２分間（二本鎖DNAの解離）、50〜55℃で１〜２分間
（プライマーのアニーリング）、70〜74℃で１〜２分間
（相補鎖の合成）で順次反応させ、好ましくはこれを25
〜30サイクル行う。上述の反応の温度設定にはヒートブ
ロック式のプログラム温度制御装置を用いることができ
る。このような装置の例としては、PCR Thermal Cycler
（宝酒造社製）を挙げることができる。
性識別マーカー領域増幅用のプライマーペアを加えてPC
Rを行い、目的のDNA断片を増幅させる。PCRの温度条件
は、当業者であれば経験に基づいて適切に決定すること
ができ、特に限定はしないが、好ましくは92〜96℃で１
〜２分間（二本鎖DNAの解離）、50〜55℃で１〜２分間
（プライマーのアニーリング）、70〜74℃で１〜２分間
（相補鎖の合成）で順次反応させ、好ましくはこれを25
〜30サイクル行う。上述の反応の温度設定にはヒートブ
ロック式のプログラム温度制御装置を用いることができ
る。このような装置の例としては、PCR Thermal Cycler
（宝酒造社製）を挙げることができる。
【００２３】最後に、以上のようにして得られる反応混
合物から、増幅された核酸を検出する。検出の方法とし
ては、当技術分野で通常用いられる方法を用いることが
できるが、好ましくは上述したアガロースゲル電気泳動
およびそれに続くエチジウムブロミドによるゲル染色を
行う方法を用いることができる。これにより、雄および
両性の被検体パパイアにのみPCR増幅断片が検出される
が、雌には検出されない。PCR増幅断片が検出されれ
ば、被検体パパイア中には本発明の性識別マーカーが存
在し、当該被検体パパイアは雌ではないと評価すること
ができる。PCR増幅断片が検出されなければ、被検体パ
パイアは雌であると評価することができる。
合物から、増幅された核酸を検出する。検出の方法とし
ては、当技術分野で通常用いられる方法を用いることが
できるが、好ましくは上述したアガロースゲル電気泳動
およびそれに続くエチジウムブロミドによるゲル染色を
行う方法を用いることができる。これにより、雄および
両性の被検体パパイアにのみPCR増幅断片が検出される
が、雌には検出されない。PCR増幅断片が検出されれ
ば、被検体パパイア中には本発明の性識別マーカーが存
在し、当該被検体パパイアは雌ではないと評価すること
ができる。PCR増幅断片が検出されなければ、被検体パ
パイアは雌であると評価することができる。
【００２４】さらに、被検体パパイア幼植物の両親の性
が特定されている場合には、PCR増幅断片の有無により
被検パパイア幼植物の性を特定することも可能である。
すなわち、「雌×雄」の交配組み合わせにより得られる
パパイア幼植物において、PCR増幅断片が検出されれ
ば、被検体パパイアは雄であると評価することができ、
検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価す
ることができる。また、「雌×両性」の交配組み合わせ
により得られるパパイア幼植物において、PCR増幅断片
が検出されれば、被検体パパイアは両性であると評価す
ることができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌
であると評価することができる。さらに、「雄×雄」の
交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物におい
て、PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイアは雄
であると評価することができ、検出されなければ、被検
体パパイアは雌であると評価することができる。同様に
「両性×両性」の交配組み合わせにより得られるパパイ
ア幼植物において、PCR増幅断片が検出されれば、被検
体パパイアは両性であると評価することができ、検出さ
れなければ、被検体パパイアは雌であると評価すること
ができる。
が特定されている場合には、PCR増幅断片の有無により
被検パパイア幼植物の性を特定することも可能である。
すなわち、「雌×雄」の交配組み合わせにより得られる
パパイア幼植物において、PCR増幅断片が検出されれ
ば、被検体パパイアは雄であると評価することができ、
検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価す
ることができる。また、「雌×両性」の交配組み合わせ
により得られるパパイア幼植物において、PCR増幅断片
が検出されれば、被検体パパイアは両性であると評価す
ることができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌
であると評価することができる。さらに、「雄×雄」の
交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物におい
て、PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイアは雄
であると評価することができ、検出されなければ、被検
体パパイアは雌であると評価することができる。同様に
「両性×両性」の交配組み合わせにより得られるパパイ
ア幼植物において、PCR増幅断片が検出されれば、被検
体パパイアは両性であると評価することができ、検出さ
れなければ、被検体パパイアは雌であると評価すること
ができる。
【００２５】(2) プローブ法による性識別マーカーの解
析 プローブ法による性識別マーカーの解析に基づいたパパ
イアの性識別は、以下のようにして行うことができる。
まず、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDN
A又は該DNAの多型物の塩基配列に基づいて、当該塩基配
列の一部又は全部を含む性識別マーカー検出用プローブ
を調製する。ここで、「当該塩基配列の一部」とは、配
列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該D
NAの多型物中の20〜450mer、好ましくは50〜450mer、最
も好ましくは100〜450merの塩基長からなる連続したヌ
クレオチド鎖をいう。当該ヌクレオチド鎖の塩基配列
は、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA
又は該DNAの多型物に特異的にハイブリダイズする限
り、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加または挿
入されている塩基配列であり得る。例えば、配列番号1
に示される塩基配列に対して1以上の塩基が置換、欠
失、付加または挿入されている塩基配列を有するDNA
は、部位特異的変異誘発法[Zollerら：Nucleic Acids R
es. 10(20):6487-6500 (1982)]によって、当業者であれ
ば容易に調製することができる。
析 プローブ法による性識別マーカーの解析に基づいたパパ
イアの性識別は、以下のようにして行うことができる。
まず、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDN
A又は該DNAの多型物の塩基配列に基づいて、当該塩基配
列の一部又は全部を含む性識別マーカー検出用プローブ
を調製する。ここで、「当該塩基配列の一部」とは、配
列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該D
NAの多型物中の20〜450mer、好ましくは50〜450mer、最
も好ましくは100〜450merの塩基長からなる連続したヌ
クレオチド鎖をいう。当該ヌクレオチド鎖の塩基配列
は、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA
又は該DNAの多型物に特異的にハイブリダイズする限
り、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加または挿
入されている塩基配列であり得る。例えば、配列番号1
に示される塩基配列に対して1以上の塩基が置換、欠
失、付加または挿入されている塩基配列を有するDNA
は、部位特異的変異誘発法[Zollerら：Nucleic Acids R
es. 10(20):6487-6500 (1982)]によって、当業者であれ
ば容易に調製することができる。
【００２６】性識別マーカー検出用プローブは、クロー
ン化された配列番号１又は２で表される塩基配列からな
るDNA又は該DNAの多型物を含むプラスミドから、適当な
制限酵素で所望のDNA断片を切り出したり、該プラスミ
ド又は両性若しくは雄パパイアから調製したDNAを鋳型
とするPCRによって調製することができる。配列番号１
又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型
物に特異的にハイブリダイズする限り、１若しくは数個
の塩基がが置換、欠失、付加または挿入されている塩基
配列を有するDNAは、部位特異的変異誘発法[Zollerら：
Nucleic Acids Res. 10(20):6487-6500(1982)]によっ
て、当業者であれば容易に調製することができる。な
お、プローブDNA断片の標識は、放射性標識（例えば、
32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ）、非放射性標識（例えばビオチン、デ
ィゴキシゲニン）等によって行うことができ、具体的に
は、プローブDNAの5'末端のリン酸をホスファターゼで
除去後、ポリヌクレオチドキナーゼで[γ-32Ｐ]ATPのγ
-リン酸基を前記DNAの5'末端に転移する方法や、
[32Ｐ]、[35Ｓ]、[3Ｈ]、ビオチン等で標識されたヌクレ
オチド基質を、ニックトランスレーション法等によって
プローブDNAの合成とともに取り込ませる方法等が挙げ
られる。より簡便には、32ＰによるプローブDNAの標識
は、rediprimeTMII（アマシャム ファルマシアバイオテ
ク社製）などの市販のキットを用いて行うことができ
る。
ン化された配列番号１又は２で表される塩基配列からな
るDNA又は該DNAの多型物を含むプラスミドから、適当な
制限酵素で所望のDNA断片を切り出したり、該プラスミ
ド又は両性若しくは雄パパイアから調製したDNAを鋳型
とするPCRによって調製することができる。配列番号１
又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型
物に特異的にハイブリダイズする限り、１若しくは数個
の塩基がが置換、欠失、付加または挿入されている塩基
配列を有するDNAは、部位特異的変異誘発法[Zollerら：
Nucleic Acids Res. 10(20):6487-6500(1982)]によっ
て、当業者であれば容易に調製することができる。な
お、プローブDNA断片の標識は、放射性標識（例えば、
32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ）、非放射性標識（例えばビオチン、デ
ィゴキシゲニン）等によって行うことができ、具体的に
は、プローブDNAの5'末端のリン酸をホスファターゼで
除去後、ポリヌクレオチドキナーゼで[γ-32Ｐ]ATPのγ
-リン酸基を前記DNAの5'末端に転移する方法や、
[32Ｐ]、[35Ｓ]、[3Ｈ]、ビオチン等で標識されたヌクレ
オチド基質を、ニックトランスレーション法等によって
プローブDNAの合成とともに取り込ませる方法等が挙げ
られる。より簡便には、32ＰによるプローブDNAの標識
は、rediprimeTMII（アマシャム ファルマシアバイオテ
ク社製）などの市販のキットを用いて行うことができ
る。
【００２７】具体的手順として、サザンハイブリダイゼ
ーションを利用する方法を例示すると以下のようにな
る。すなわち、まずパパイアよりDNAを上記と同様の方
法により抽出し、適当な制限酵素で消化する。使用する
制限酵素は特に限定しないが、好ましくはEcoRＩを用い
る。
ーションを利用する方法を例示すると以下のようにな
る。すなわち、まずパパイアよりDNAを上記と同様の方
法により抽出し、適当な制限酵素で消化する。使用する
制限酵素は特に限定しないが、好ましくはEcoRＩを用い
る。
【００２８】次いで、制限酵素消化したDNAを上述のと
おりアガロースゲル電気泳動し、常法に従いDNAを膜に
にブロッティングする。膜は特に限定はしないが、好ま
しくはHybond N+（アマシャム ファルマシアバイオテク
社製）等のナイロンメンブレンが好ましい。
おりアガロースゲル電気泳動し、常法に従いDNAを膜に
にブロッティングする。膜は特に限定はしないが、好ま
しくはHybond N+（アマシャム ファルマシアバイオテク
社製）等のナイロンメンブレンが好ましい。
【００２９】さらに、ブロッティング後の膜に、常法に
従って前記の性識別マーカー検出用プローブをハイブリ
ズさせる。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイ
ゼーションは65℃で、それぞれ4時間、16時間行う。こ
の条件は、当業者であれば経験に基づいて適切に設定す
ることができるので、特に限定しない。ハイブリダイゼ
ーションを終えたナイロンメンブレンを65℃のSSC溶液
（0.1％SDS含有）で洗浄する。洗浄の条件は、当業者で
あれば経験に基づいて適切に設定することができるので
限定しないが、2×SSC溶液（0.1％SDS含有）を2回、0.1
×SSC溶液（0.1％SDS含有）を2回で行うことができる。
なお、それぞれの洗浄時間は20分程度で行うことができ
る。
従って前記の性識別マーカー検出用プローブをハイブリ
ズさせる。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイ
ゼーションは65℃で、それぞれ4時間、16時間行う。こ
の条件は、当業者であれば経験に基づいて適切に設定す
ることができるので、特に限定しない。ハイブリダイゼ
ーションを終えたナイロンメンブレンを65℃のSSC溶液
（0.1％SDS含有）で洗浄する。洗浄の条件は、当業者で
あれば経験に基づいて適切に設定することができるので
限定しないが、2×SSC溶液（0.1％SDS含有）を2回、0.1
×SSC溶液（0.1％SDS含有）を2回で行うことができる。
なお、それぞれの洗浄時間は20分程度で行うことができ
る。
【００３０】最後に、洗浄したブロットを用い、オート
ラジオグラフィーまたはBAS2000（富士写真フイルム株
式会社製）により解析することができる。これにより、
雄および両性の被検植物にのみバンド（陽性バンド）が
検出されるが、雌には検出されない。
ラジオグラフィーまたはBAS2000（富士写真フイルム株
式会社製）により解析することができる。これにより、
雄および両性の被検植物にのみバンド（陽性バンド）が
検出されるが、雌には検出されない。
【００３１】PCR法による性識別マーカーの解析の場合
と同様に、被検体パパイア幼植物の両親の性が特定され
ている場合には、陽性バンドの有無により被検パパイア
幼植物の性を特定することも可能である。すなわち、
「雌×雄」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼
植物において、陽性バンドが検出されれば、被検体パパ
イアは雄であると評価することができ、検出されなけれ
ば、被検体パパイアは雌であると評価することができ
る。また、「雌×両性」の交配組み合わせにより得られ
るパパイア幼植物において、陽性バンドが検出されれ
ば、被検体パパイアは両性であると評価することがで
き、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評
価することができる。さらに、「雄×雄」の交配組み合
わせにより得られるパパイア幼植物において、陽性バン
ドが検出されれば、被検体パパイアは雄であると評価す
ることができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌
であると評価することができる。同様に「両性×両性」
の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物におい
て、陽性バンドが検出されれば、被検体パパイアは両性
であると評価することができ、検出されなければ、被検
体パパイアは雌であると評価することができる。
と同様に、被検体パパイア幼植物の両親の性が特定され
ている場合には、陽性バンドの有無により被検パパイア
幼植物の性を特定することも可能である。すなわち、
「雌×雄」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼
植物において、陽性バンドが検出されれば、被検体パパ
イアは雄であると評価することができ、検出されなけれ
ば、被検体パパイアは雌であると評価することができ
る。また、「雌×両性」の交配組み合わせにより得られ
るパパイア幼植物において、陽性バンドが検出されれ
ば、被検体パパイアは両性であると評価することがで
き、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評
価することができる。さらに、「雄×雄」の交配組み合
わせにより得られるパパイア幼植物において、陽性バン
ドが検出されれば、被検体パパイアは雄であると評価す
ることができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌
であると評価することができる。同様に「両性×両性」
の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物におい
て、陽性バンドが検出されれば、被検体パパイアは両性
であると評価することができ、検出されなければ、被検
体パパイアは雌であると評価することができる。
【００３２】４.パパイアの性識別用キット 本発明のパパイアの性識別方法に基づき、当該識別方法
の実施に必要な試薬類を、パッケージングし、キットと
して供給することが可能である。より具体的には、例え
ば、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA
又は該DNAの多型物を含むDNAのDNAの一部（例えば、17
〜30merの長さを有するもの、より具体的には、例えば
配列番号４〜７のいずれかで表されるもの）を含むパパ
イアの性識別マーカー増幅用プライマー、及び／又は配
列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該D
NAの多型物を含むDNAの一部（例えば、20〜450merの長
さを有するもの）の一部又は全部を含むパパイアの性識
別マーカー検出用プローブを必須構成要素とするものが
挙げられる。上記キットの構成要素は、必要に応じて変
化し得る。例えば、PCR反応又はハイブリダイゼーショ
ン反応に好適な条件を与える緩衝液、合成反応生成物の
検出のために必要な試薬類が加えられ得る。当該キット
を用い、上記３の手順に従ってパパイアの性を識別する
ことが可能である。
の実施に必要な試薬類を、パッケージングし、キットと
して供給することが可能である。より具体的には、例え
ば、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA
又は該DNAの多型物を含むDNAのDNAの一部（例えば、17
〜30merの長さを有するもの、より具体的には、例えば
配列番号４〜７のいずれかで表されるもの）を含むパパ
イアの性識別マーカー増幅用プライマー、及び／又は配
列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該D
NAの多型物を含むDNAの一部（例えば、20〜450merの長
さを有するもの）の一部又は全部を含むパパイアの性識
別マーカー検出用プローブを必須構成要素とするものが
挙げられる。上記キットの構成要素は、必要に応じて変
化し得る。例えば、PCR反応又はハイブリダイゼーショ
ン反応に好適な条件を与える緩衝液、合成反応生成物の
検出のために必要な試薬類が加えられ得る。当該キット
を用い、上記３の手順に従ってパパイアの性を識別する
ことが可能である。
【００３３】
【実施例】以下に、本発明の実施例を示して具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものでは
ない。 〔実施例１〕 性識別マーカーの探索 （1）パパイアの葉からのDNA抽出 パパイアの葉5gからCTAB法を用いてDNAを抽出した。抽
出に用いたパパイアは、サンライズ、ワイマナーロおよ
び沖縄県農業試験場育種系統等、性既知の合計33個体
（雄13個体、雌16、両性4個体）を用いた。
明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものでは
ない。 〔実施例１〕 性識別マーカーの探索 （1）パパイアの葉からのDNA抽出 パパイアの葉5gからCTAB法を用いてDNAを抽出した。抽
出に用いたパパイアは、サンライズ、ワイマナーロおよ
び沖縄県農業試験場育種系統等、性既知の合計33個体
（雄13個体、雌16、両性4個体）を用いた。
【００３４】（2）RAPD法による性識別マーカーの探索 上記により抽出したDNA100ngを鋳型とし、発明者らによ
り設計、合成されたランダムプライマーのIBRC-RP07 5'
-ttggcacggg-3'（配列番号３）を用いてPCRを行った。
すなわち、DNA溶液 10μl(10ng/μl)、滅菌蒸留水4μ
l、10×PCR buffer 2μl、dNTP mixture 2μl(各2.5m
M)、TaKaRa Ex Taq 1μl(0.5 U/μl)、発明者らにより
設計、合成された 10-Mer プライマー1μl(20μM)を混
合し、PCR反応を行った。反応は、94℃で1分間（DNA変
性）、37℃で1分間（プライマーの会合）、72℃で2分間
（DNA鎖の伸長）で順次反応させ、これを30サイクル行
った。なお、温度設定にはヒートブロック式のプログラ
ム温度制御装置PCR Thermal Cycler（宝酒造社製）を用
いた。次に、PCR反応液10μlを2％アガロースゲル電気
泳動後、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、紫外光下
で観察して増幅断片を検出した。結果を図２及び３に示
した。
り設計、合成されたランダムプライマーのIBRC-RP07 5'
-ttggcacggg-3'（配列番号３）を用いてPCRを行った。
すなわち、DNA溶液 10μl(10ng/μl)、滅菌蒸留水4μ
l、10×PCR buffer 2μl、dNTP mixture 2μl(各2.5m
M)、TaKaRa Ex Taq 1μl(0.5 U/μl)、発明者らにより
設計、合成された 10-Mer プライマー1μl(20μM)を混
合し、PCR反応を行った。反応は、94℃で1分間（DNA変
性）、37℃で1分間（プライマーの会合）、72℃で2分間
（DNA鎖の伸長）で順次反応させ、これを30サイクル行
った。なお、温度設定にはヒートブロック式のプログラ
ム温度制御装置PCR Thermal Cycler（宝酒造社製）を用
いた。次に、PCR反応液10μlを2％アガロースゲル電気
泳動後、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、紫外光下
で観察して増幅断片を検出した。結果を図２及び３に示
した。
【００３５】図２は、性が既知のパパイア17個体（雄6
個体、雌7個体、両性4個体）の葉から抽出したDNAを鋳
型とし、IBRC-RP07プライマーを用いてPCRを行い、増幅
産物を2％アガロースゲル電気泳動で解析した結果であ
る。Mは分子量マーカー100bpDNA Ladder（Bio Labs）、
CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照
区である。雄は左より順に、沖縄県野生種A、メキシコ
導入種M1、沖縄県野生種IK2、沖縄県野生種IK7、沖縄県
野生種D、メキシコ導入種M5である。雌は左より順に、
沖縄県野生種A、メキシコ導入種M1、沖縄県野生種IK2、
ワイマナーロ、オレンジクイーン、沖縄県野生種2、サ
ンライズである。両性は左より順に、ワイマナーロ、サ
ンライズ、メキシコ導入種M1、ワイマナーロ×メキシコ
導入種M1のF1である。
個体、雌7個体、両性4個体）の葉から抽出したDNAを鋳
型とし、IBRC-RP07プライマーを用いてPCRを行い、増幅
産物を2％アガロースゲル電気泳動で解析した結果であ
る。Mは分子量マーカー100bpDNA Ladder（Bio Labs）、
CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照
区である。雄は左より順に、沖縄県野生種A、メキシコ
導入種M1、沖縄県野生種IK2、沖縄県野生種IK7、沖縄県
野生種D、メキシコ導入種M5である。雌は左より順に、
沖縄県野生種A、メキシコ導入種M1、沖縄県野生種IK2、
ワイマナーロ、オレンジクイーン、沖縄県野生種2、サ
ンライズである。両性は左より順に、ワイマナーロ、サ
ンライズ、メキシコ導入種M1、ワイマナーロ×メキシコ
導入種M1のF1である。
【００３６】また図３は、 性が既知のパパイア16個体
（交配親とそのF1集団、雄7個体、雌9個体）の葉から抽
出したDNAを鋳型とし、IBRC-RP07プライマーを用いてPC
Rを行い、増幅産物を2％アガロースゲル電気泳動で解析
した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder
（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPC
Rを行った対照区である。交配に用いた雄は沖縄県農業
試験場育種系統ON-7、雌は沖縄県農業試験場ON-36であ
る。図２及び３の結果から明らかなように、400bpと500
bpとの間に雄および両性特異的な増幅断片（性識別マー
カー）が検出された。
（交配親とそのF1集団、雄7個体、雌9個体）の葉から抽
出したDNAを鋳型とし、IBRC-RP07プライマーを用いてPC
Rを行い、増幅産物を2％アガロースゲル電気泳動で解析
した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder
（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPC
Rを行った対照区である。交配に用いた雄は沖縄県農業
試験場育種系統ON-7、雌は沖縄県農業試験場ON-36であ
る。図２及び３の結果から明らかなように、400bpと500
bpとの間に雄および両性特異的な増幅断片（性識別マー
カー）が検出された。
【００３７】〔実施例２〕 性識別マーカーの塩基配列
決定 （1）性識別マーカーのクローニング 実施例１において検出された性識別マーカーをQIAquick
Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いてアガロース
ゲルより抽出し、プラスミドpT7Blue(NOVAGEN)にクロー
ニングし、大腸菌を形質転換した。
決定 （1）性識別マーカーのクローニング 実施例１において検出された性識別マーカーをQIAquick
Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いてアガロース
ゲルより抽出し、プラスミドpT7Blue(NOVAGEN)にクロー
ニングし、大腸菌を形質転換した。
【００３８】（2）性識別マーカーの塩基配列決定 次に、性識別マーカーを有するクローンを培養し、QIAp
rep Spin Miniprep Kitを用いて組換えプラスミドを抽
出した。抽出した組換えプラスミドを鋳型としてBigDye
Terminator Cycle Sequencing,FS キット（PEバイオシ
ステムズジャパン社）を用いて反応を行い、ABI PRISMT
M 377 DNA Sequencer（PEバイオシステムズジャパン
社）により塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配
列番号１に示した。
rep Spin Miniprep Kitを用いて組換えプラスミドを抽
出した。抽出した組換えプラスミドを鋳型としてBigDye
Terminator Cycle Sequencing,FS キット（PEバイオシ
ステムズジャパン社）を用いて反応を行い、ABI PRISMT
M 377 DNA Sequencer（PEバイオシステムズジャパン
社）により塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配
列番号１に示した。
【００３９】〔実施例３〕 PCR法によるパパイアの性識
別 得られた性識別マーカーを用い、PCR法によりパパイア
の性識別を行った。まず、実施例２において決定された
塩基配列に基づいて、性識別マーカー増幅用プライマー
を設計および合成した。すなわち、5’側プライマーと
して、5'-ggtaagagtttttcccaagc-3'（配列番号４）及び
5'-tgcacgatttagattagatg-3'（配列番号５）を、3’側
プライマーとして5'-ggatagcttgcccaggtcac-3'（配列番
号６）及び5'-gttgtgctgcgctatcttgc-3'（配列番号７）
を合成した。一方、被検パパイアの葉５ｇを乳鉢に移
し、少量の液体窒素を加えて磨砕した後、CTAB法により
DNAを抽出した。抽出に用いたパパイアは、上記の33個
体（雄13個体、雌16、両性4個体）、交配親（雌、両
性）とそのF1集団（幼植物14個体）を用いた。抽出した
DNAを鋳型として、5’側相同プライマーと3’側相補プ
ライマーを用いたPCRにより目的DNA断片を増幅した。す
なわち、DNA溶液1μl(10ng/μl)、10×PCR buffer2μ
l、dNTP mixture 2μl(各2.5mM)、TaKaRa Ex Taq 1μl
(0.5 U/μl)、滅菌蒸留水12μl、性識別マーカー5’側
相同プライマー1μl(20μM)および3’側相補プライマー
1μl(20μM)を混合し、PCR反応を行った。プライマー
は、配列番号５と配列番号６の組み合わせを使用した。
反応は、94℃で1分間（二本鎖DNAの解離）、55℃で1分
間（プライマーのアニーリング）、72℃で1分間（相補
鎖の合成）で順次反応させ、これを30サイクル行った。
なお、温度設定にはヒートブロック式のプログラム温度
制御装置PCR Thermal Cycler（宝酒造社製）を用いた。
次に、PCR反応液10μlを2％アガロースゲル電気泳動
後、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、紫外光下で観
察して増幅断片を検出した。
別 得られた性識別マーカーを用い、PCR法によりパパイア
の性識別を行った。まず、実施例２において決定された
塩基配列に基づいて、性識別マーカー増幅用プライマー
を設計および合成した。すなわち、5’側プライマーと
して、5'-ggtaagagtttttcccaagc-3'（配列番号４）及び
5'-tgcacgatttagattagatg-3'（配列番号５）を、3’側
プライマーとして5'-ggatagcttgcccaggtcac-3'（配列番
号６）及び5'-gttgtgctgcgctatcttgc-3'（配列番号７）
を合成した。一方、被検パパイアの葉５ｇを乳鉢に移
し、少量の液体窒素を加えて磨砕した後、CTAB法により
DNAを抽出した。抽出に用いたパパイアは、上記の33個
体（雄13個体、雌16、両性4個体）、交配親（雌、両
性）とそのF1集団（幼植物14個体）を用いた。抽出した
DNAを鋳型として、5’側相同プライマーと3’側相補プ
ライマーを用いたPCRにより目的DNA断片を増幅した。す
なわち、DNA溶液1μl(10ng/μl)、10×PCR buffer2μ
l、dNTP mixture 2μl(各2.5mM)、TaKaRa Ex Taq 1μl
(0.5 U/μl)、滅菌蒸留水12μl、性識別マーカー5’側
相同プライマー1μl(20μM)および3’側相補プライマー
1μl(20μM)を混合し、PCR反応を行った。プライマー
は、配列番号５と配列番号６の組み合わせを使用した。
反応は、94℃で1分間（二本鎖DNAの解離）、55℃で1分
間（プライマーのアニーリング）、72℃で1分間（相補
鎖の合成）で順次反応させ、これを30サイクル行った。
なお、温度設定にはヒートブロック式のプログラム温度
制御装置PCR Thermal Cycler（宝酒造社製）を用いた。
次に、PCR反応液10μlを2％アガロースゲル電気泳動
後、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、紫外光下で観
察して増幅断片を検出した。
【００４０】結果を図４に示した。(1)は性が既知のパ
パイア17個体（雄6個体、雌7個体、両性4個体）を解析
した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder
（BioLabs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCR
を行った対照区である。雄は左より順に、沖縄県野生種
A、メキシコ導入種M1、沖縄県野生種IK2、沖縄県野生種
IK7、沖縄県野生種D、メキシコ導入種M5である。雌は左
より順に、沖縄県野生種A、メキシコ導入種M1、沖縄県
野生種IK2、ワイマナーロ、オレンジクイーン、沖縄県
野生種2、サンライズである。両性は左より順に、ワイ
マナーロ、サンライズ、メキシコ導入種M1、ワイマナー
ロ×メキシコ導入種M1のF1である。(2)は性が既知のパ
パイア16個体（交配親とそのF1集団、雄7個体、雌9個
体）を解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp D
NA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水
を加えてPCRを行った対照区である。交配に用いた雄は
沖縄県農業試験場育種系統ON-7、雌は沖縄県農業試験場
ON-36である。(3)は交配親（雌、両性）とそのF1集団
（幼植物14個体）を解析した結果である。Mは分子量マ
ーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わり
に滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。交配
に用いた両性はサンライズ、雌は沖縄県農業試験場ON-3
4である。図４から明らかなように、雄および両性の試
料にのみ目的の増幅断片が検出された（図４）。なお、
F1集団（幼植物14個体）については、開花後に上記の結
果と照合した。また、他の組のプライマーを用いた場合
でも、同様に良好な識別結果が得られた。以上のことか
ら、PCR法による本発明の性識別マーカーの解析に基づ
いて、パパイアの性識別を行うことができることが判明
した。
パイア17個体（雄6個体、雌7個体、両性4個体）を解析
した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder
（BioLabs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCR
を行った対照区である。雄は左より順に、沖縄県野生種
A、メキシコ導入種M1、沖縄県野生種IK2、沖縄県野生種
IK7、沖縄県野生種D、メキシコ導入種M5である。雌は左
より順に、沖縄県野生種A、メキシコ導入種M1、沖縄県
野生種IK2、ワイマナーロ、オレンジクイーン、沖縄県
野生種2、サンライズである。両性は左より順に、ワイ
マナーロ、サンライズ、メキシコ導入種M1、ワイマナー
ロ×メキシコ導入種M1のF1である。(2)は性が既知のパ
パイア16個体（交配親とそのF1集団、雄7個体、雌9個
体）を解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp D
NA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水
を加えてPCRを行った対照区である。交配に用いた雄は
沖縄県農業試験場育種系統ON-7、雌は沖縄県農業試験場
ON-36である。(3)は交配親（雌、両性）とそのF1集団
（幼植物14個体）を解析した結果である。Mは分子量マ
ーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わり
に滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。交配
に用いた両性はサンライズ、雌は沖縄県農業試験場ON-3
4である。図４から明らかなように、雄および両性の試
料にのみ目的の増幅断片が検出された（図４）。なお、
F1集団（幼植物14個体）については、開花後に上記の結
果と照合した。また、他の組のプライマーを用いた場合
でも、同様に良好な識別結果が得られた。以上のことか
ら、PCR法による本発明の性識別マーカーの解析に基づ
いて、パパイアの性識別を行うことができることが判明
した。
【００４１】〔実施例４〕 プローブ法によるパパイア
の性識別 また、得られた性識別マーカーを用いプローブ法によ
り、パパイアの性識別を行った。まず、制限酵素EcoRＩ
により消化した雄、雌、両性のDNA10μｇを0.8％アガロ
ースゲル電気泳動後、常法に従いDNAをHybond N+（アマ
シャム ファルマシアバイオテク社製）にアルカリブロ
ッティングした。一方、実施例３において得られた増幅
断片を32Ｐにより標識した。すなわち、増幅断片20ngを
rediprimeTMII（アマシャム ファルマシアバイオテク社
製）を用いて32Pにより標識後、ProbeQuantTM G-50 Mic
ro Column（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）
により精製したものをプローブとした。次いで、上記に
より作製したブロットを65℃で4時間プレハイブリダイ
ゼーション後、熱変性させた上記プローブを加えて、65
℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。次に、ブ
ロットを65℃の2×SSC溶液（0.1％SDS含有）で20分間、
2回、続いて65℃の0.1×SSC溶液（0.1％SDS含有）で20
分間、2回洗浄した。最後に、洗浄したブロットをBAS20
00（富士写真フイルム株式会社製）により解析した。
の性識別 また、得られた性識別マーカーを用いプローブ法によ
り、パパイアの性識別を行った。まず、制限酵素EcoRＩ
により消化した雄、雌、両性のDNA10μｇを0.8％アガロ
ースゲル電気泳動後、常法に従いDNAをHybond N+（アマ
シャム ファルマシアバイオテク社製）にアルカリブロ
ッティングした。一方、実施例３において得られた増幅
断片を32Ｐにより標識した。すなわち、増幅断片20ngを
rediprimeTMII（アマシャム ファルマシアバイオテク社
製）を用いて32Pにより標識後、ProbeQuantTM G-50 Mic
ro Column（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）
により精製したものをプローブとした。次いで、上記に
より作製したブロットを65℃で4時間プレハイブリダイ
ゼーション後、熱変性させた上記プローブを加えて、65
℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。次に、ブ
ロットを65℃の2×SSC溶液（0.1％SDS含有）で20分間、
2回、続いて65℃の0.1×SSC溶液（0.1％SDS含有）で20
分間、2回洗浄した。最後に、洗浄したブロットをBAS20
00（富士写真フイルム株式会社製）により解析した。
【００４２】結果を図５に示した。雄は沖縄県野生種IK
7、雌はワイナマーロ、両性はサンライズである。図５
から明らかなように、雄および両性の被検植物にのみバ
ンドが検出されるが、雌には検出されなかった。以上の
ことから、プローブ法による本発明の性識別マーカーの
解析に基づいて、パパイアの性識別を行うことができる
ことが判明した。
7、雌はワイナマーロ、両性はサンライズである。図５
から明らかなように、雄および両性の被検植物にのみバ
ンドが検出されるが、雌には検出されなかった。以上の
ことから、プローブ法による本発明の性識別マーカーの
解析に基づいて、パパイアの性識別を行うことができる
ことが判明した。
【００４３】
【発明の効果】本発明によれば、DNAマーカーを用いて
パパイアの性識別を行うことができる。従って、本発明
の方法を利用すれば育苗段階でのパパイアの迅速かつ高
感度な性識別が可能となる。
パパイアの性識別を行うことができる。従って、本発明
の方法を利用すれば育苗段階でのパパイアの迅速かつ高
感度な性識別が可能となる。
【００４４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Okinawa prefecture <120> A method of identifying of papaya sex using a DNA marker <130> P00-0757 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 450 <212> DNA <213> Carica papaya <400> 1 ttggcacggg ctctgagcca gggtcgtggt aagagttttt cccaagccat ttttttcatt 60 gcttcttctc ttgaaatttt agtaaactca ataaaacttt ggaaaaacta attaaaataa 120 aagggctaat aattctacat gaaaaatttt gcacgattta gattagatgt attgtaattt 180 taaattcgtt aagtaccaaa aagttagagt attacaacac taaactgggc cgaacctagt 240 tggggtccag agaattaggc aagatctcgc gggggtcaat taaactggat tagaccatca 300 acctctatac agacgtgcta agtagctgca cagcgcgaca cgccatggga gcaatgtgac 360 ctgggcaagc tatcccgcac gtgcacatcg cgcgtatata aacctgcgca ctcagcaaga 420 tagcgcagca caacatgctg cccgtgccaa 450 <210> 2 <211> 450 <212> DNA <213> Carica papaya <400> 2 ttggcacggg cagcatgttg tgctgcgcta tcttgctgag tgcgcaggtt tatatacgcg 60 cgatgtgcac gtgcgggata gcttgcccag gtcacattgc tcccatggcg tgtcgcgctg 120 tgcagctact tagcacgtct gtatagaggt tgatggtcta atccagttta attgaccccc 180 gcgagatctt gcctaattct ctggacccca actaggttcg gcccagttta gtgttgtaat 240 actctaactt tttggtactt aacgaattta aaattacaat acatctaatc taaatcgtgc 300 aaaatttttc atgtagaatt attagccctt ttattttaat tagtttttcc aaagttttat 360 tgagtttact aaaatttcaa gagaagaagc aatgaaaaaa atggcttggg aaaaactctt 420 accacgaccc tggctcagag cccgtgccaa 450 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 3 ttggcacggg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 4 ggtaagagtt tttcccaagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 5 tgcacgattt agattagatg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 6 ggatagcttg cccaggtcac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 7 gttgtgctgc gctatcttgc 20
【００４５】
【配列表フリーテキスト】配列番号３：合成DNA 配列番号４：合成DNA 配列番号５：合成DNA 配列番号６：合成DNA 配列番号７：合成DNA
【図１】パパイア性識別マーカーの全塩基配列におけ
る、配列番号４〜７の配列の存在位置を示す概略図であ
る。
る、配列番号４〜７の配列の存在位置を示す概略図であ
る。
【図２】性が既知のパパイア17個体の葉から抽出したDN
Aを鋳型として用いたときのPCRの結果を示す電気泳動写
真である。
Aを鋳型として用いたときのPCRの結果を示す電気泳動写
真である。
【図３】性が既知のパパイア16個体の葉から抽出したDN
Aを鋳型として用いたときのPCRの結果を示す電気泳動写
真である。
Aを鋳型として用いたときのPCRの結果を示す電気泳動写
真である。
【図４】PCR法による性識別マーカーの解析に基づくパ
パイアの性識別の結果を示す電気泳動写真である。
パイアの性識別の結果を示す電気泳動写真である。
【図５】プローブ法による性識別マーカーの解析に基づ
くパパイアの性識別の結果を示す電気泳動写真である。
くパパイアの性識別の結果を示す電気泳動写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA08 AA11 BA80 CA09 HA12 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ04 QQ42 QQ52 QR08 QR55 QR62 QS02 QS25 QS34
Claims (14)
- 【請求項１】 配列番号１又は２で表される塩基配列か
らなるDNA又は該DNAの多型物を含むDNA。 - 【請求項２】 配列番号１又は２で表される塩基配列か
らなるDNA又は該DNAの多型物を含むパパイアの性識別マ
ーカー。 - 【請求項３】 請求項１記載のDNAの一部を含むパパイ
アの性識別マーカー増幅用プライマー。 - 【請求項４】 DNAの一部が、17〜30merの長さを有する
ものである請求項３記載のパパイアの性識別マーカー増
幅用プライマー。 - 【請求項５】 DNAの一部が、配列番号４〜７のいずれ
かで表されるものである請求項３記載のパパイアの性識
別マーカー増幅用プライマー。 - 【請求項６】 請求項３〜５記載のいずれかの性識別マ
ーカー増幅用プライマーを構成要素として含む、パパイ
アの性識別用キット。 - 【請求項７】 請求項１記載のDNAの一部又は全部を含
むパパイアの性識別マーカー検出用プローブ。 - 【請求項８】 DNAの一部が、20〜450merの長さを有す
るものである請求項７記載のパパイアの性識別マーカー
検出用プローブ。 - 【請求項９】 請求項７又は８の性識別マーカー検出用
プローブを構成要素として含む、パパイアの性識別用キ
ット。 - 【請求項１０】 被検体パパイアにおける、請求項２記
載のパパイアの性識別マーカーの有無を解析することを
特徴とするパパイアの性識別方法。 - 【請求項１１】 パパイアの性識別マーカーの有無の解
析が、ポリメラーゼ連鎖反応により得られる該性識別マ
ーカー由来の増幅産物を検出することにより行われるこ
とを特徴とする請求項１０記載のパパイアの性識別方
法。 - 【請求項１２】 ポリメラーゼ連鎖反応が、鋳型として
被検体パパイア由来のDNAを、プライマーとして請求項
３〜５記載のいずれかの性識別マーカー増幅用プライマ
ーを用いて行われることを特徴とする請求項１１記載の
パパイアの性識別方法。 - 【請求項１３】 パパイアの性識別マーカーの有無の解
析が、プローブハイブリダイゼーション反応により得ら
れるハイブリダイズ物を検出することにより行われるこ
とを特徴とする請求項１０記載のパパイアの性識別方
法。 - 【請求項１４】 プローブハイブリダイゼーション反応
が、被検体パパイア由来のDNAに、請求項７又は８記載
の性識別マーカー検出用プローブをハイブリダイズする
ことにより行われることを特徴とする請求項１３記載の
パパイアの性識別方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000303268A JP4581101B2 (ja) | 2000-10-03 | 2000-10-03 | Ｄｎａマーカーを用いるパパイアの性識別方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000303268A JP4581101B2 (ja) | 2000-10-03 | 2000-10-03 | Ｄｎａマーカーを用いるパパイアの性識別方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002112773A true JP2002112773A (ja) | 2002-04-16 |
| JP2002112773A5 JP2002112773A5 (ja) | 2007-11-08 |
| JP4581101B2 JP4581101B2 (ja) | 2010-11-17 |
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|---|---|---|---|
| JP2000303268A Expired - Fee Related JP4581101B2 (ja) | 2000-10-03 | 2000-10-03 | Ｄｎａマーカーを用いるパパイアの性識別方法 |
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| JP (1) | JP4581101B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN111088385A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-05-01 | 广州普邦园林股份有限公司 | 一种雌雄异株植物生长早期性别鉴定的方法 |
| CN112029893A (zh) * | 2020-09-23 | 2020-12-04 | 国家林业和草原局泡桐研究开发中心 | 鉴别柿树性别的分子标记引物及鉴别方法 |
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| CN114574629A (zh) * | 2022-05-06 | 2022-06-03 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 与番木瓜果实重量相关的snp分子标记及应用 |
| CN114672588A (zh) * | 2022-05-26 | 2022-06-28 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 一种SNP分子标记Cpa03g017250：8及其扩增引物、检测试剂盒和应用 |
| CN120060550A (zh) * | 2025-03-18 | 2025-05-30 | 广州市绿化有限公司 | 早期鉴定引鸟植物铁冬青性别的分子标记的引物组合及其应用 |
-
2000
- 2000-10-03 JP JP2000303268A patent/JP4581101B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6010025688, Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １９９９， Ｖｏｌ．９９， ｐ．１０４７−１０５２ * |
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| CN120060550A (zh) * | 2025-03-18 | 2025-05-30 | 广州市绿化有限公司 | 早期鉴定引鸟植物铁冬青性别的分子标记的引物组合及其应用 |
| CN120060550B (zh) * | 2025-03-18 | 2025-11-25 | 广州市绿化有限公司 | 早期鉴定引鸟植物铁冬青性别的分子标记的引物组合及其应用 |
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