JP2002191365A - Method for mutation induction to double chromosome using recombination system - Google Patents
Method for mutation induction to double chromosome using recombination systemInfo
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の機能解明
のために有用な、リコンビネースシステム、特にCre/lo
xP、Flp/FRT、又はR/RSシステムを用いた両染色体への
変異導入法および該方法を用いて変異が導入された細胞
または高等生物体モデルの作製方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a recombination system, particularly Cre / lo, which is useful for elucidating the function of a gene.
The present invention relates to a method for introducing a mutation into both chromosomes using an xP, Flp / FRT, or R / RS system, and a method for producing a cell or higher organism model into which a mutation has been introduced using the method.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、遺伝子を破壊し、表現型に異常が
現れるかどうかを見ることで、遺伝子機能を解明する方
法が採られてきた。2. Description of the Related Art Heretofore, a method has been employed for elucidating gene function by destroying a gene and checking whether an abnormal phenotype appears.
【０００３】しかしながら、特定の遺伝子の機能を欠如
させることは困難である。動物細胞または植物細胞の染
色体において、遺伝子の機能を完全に欠如させるには、
１対である遺伝子の一方のみならず両方について、対応
する部位を破壊しなければならないことが多い。従来技
術では、こうした両染色体への変異の導入が困難である
という欠点があり、変異体の獲得率は低かった。[0003] However, it is difficult to eliminate the function of a specific gene. To completely eliminate the function of a gene in the chromosome of an animal or plant cell,
Often, not only one but also both of a pair of genes requires the corresponding site to be destroyed. The prior art has the disadvantage that it is difficult to introduce such mutations into both chromosomes, and the rate of obtaining mutants is low.
【０００４】例えば、動物細胞の染色体に変異を導入す
る方法として一般に行われているのは、化学的あるいは
物理的な突然変異誘発原やウィルスなどを用いるもので
あるが、この方法のみでは１対の染色体の両方に変異を
導入するのは困難である。For example, a commonly used method for introducing a mutation into a chromosome of an animal cell is to use a chemical or physical mutagen or a virus. It is difficult to introduce mutations in both chromosomes.
【０００５】一方、プラスミドやバクテリオファージの
作製に用いる制限酵素等、特異的なDNA配列を認識して
組換えを誘発する酵素とその認識配列を用いて、より精
巧な変異の導入が図られている。On the other hand, enzymes that recognize specific DNA sequences, such as restriction enzymes used for the production of plasmids and bacteriophages, and induce recombination and their recognition sequences have been used to introduce more sophisticated mutations. I have.
【０００６】そのような例として、大腸菌のバクテリオ
ファージP1由来のリコンビネースであるCreとその認識
配列loxPとの組み合わせであるCre/loxPシステムが挙げ
られる（SauerおよびHenderson: 44, 1988）。Cre/loxP
システムとは、リコンビネースCreがloxP配列を認識
し、該部位において特異的DNA組換え反応が起こること
を利用したものである。An example of such is the Cre / loxP system, which is a combination of Cre, a recombinase from bacteriophage P1 of E. coli, and its recognition sequence, loxP (Sauer and Henderson: 44, 1988). Cre / loxP
The system utilizes the fact that the recombinant Cre recognizes the loxP sequence and a specific DNA recombination reaction occurs at the site.
【０００７】従来技術では、Cre／loxPシステムを用い
て家族性アルツハイマー病原因遺伝子presenilin-1（PS
1）にミスセンス突然変異を導入したモデルマウスを作
製した例が報告されている（Y. Nakano et al, Europea
n Journal of Neuroscience:vol.11, 2577-2581, 199
9）。[0007] In the prior art, the Cre / loxP system was used to express the familial Alzheimer's disease causing gene presenilin-1 (PS
In 1), a model mouse in which a missense mutation has been introduced has been reported (Y. Nakano et al, Europea).
n Journal of Neuroscience: vol.11, 2577-2581, 199
9).
【０００８】[0008]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子機能
の解明のために両染色体への変異導入法を提供するこ
と、および該方法を用いて変異が導入された細胞または
高等生物体モデルを提供することを目的とする。更に、
該細胞又は高等生物体を用いた遺伝子の機能解明方法を
提供することを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a method for introducing mutations into both chromosomes for elucidating gene function, and provides a cell or higher organism model into which mutations have been introduced using the method. The purpose is to provide. Furthermore,
An object of the present invention is to provide a method for elucidating the function of a gene using the cells or higher organisms.
【０００９】[0009]
【課題を解決するための手段】本発明者は上述した如き
課題に鑑みて、鋭意研究を重ねた結果、例えばCre/loxP
システム等のリコンビネースとその認識配列の組み合わ
せを用いることにより、遺伝子の機能解明のために有用
な両染色体への変異導入法および該方法を用いて変異が
導入された細胞または高等生物体モデルを提供すること
を見出し、ここに本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems In view of the above-mentioned problems, the present inventors have made intensive studies and found that, for example, Cre / loxP
Use of a combination of a recombination system such as a system and its recognition sequence to provide a method for introducing mutation into both chromosomes useful for elucidating the function of a gene and a cell or higher organism model into which a mutation has been introduced using the method. To complete the present invention.
【００１０】項１．リコンビネース認識配列を有する両
染色体に変異を有する細胞または高等生物体モデル。Item 1. A cell or higher organism model having mutations in both chromosomes having a recombination recognition sequence.
【００１１】項２．リコンビネース認識配列がloxP、FR
T、又はRSである請求項１に記載の細胞または高等生物
体モデル。Item 2. Recombinase recognition sequence is loxP, FR
The cell or higher organism model according to claim 1, which is T or RS.
【００１２】項３． （１）リコンビネース認識配
列を有する一対の染色体を有し、かつ少なくとも一方の
染色体に変異が導入された増殖可能な細胞に、リコンビ
ネースの供給源を導入する工程； （２）得られた細胞について細胞分裂を誘発するか或い
は該細胞を培養して、細胞分裂時のリコンビネース認識
配列間の組換えにより両染色体に変異を有する細胞ない
し高等生物体モデルを得る工程；を含む、両染色体に変
異を有する細胞ないし高等生物体モデルの作製方法。Item 3. (1) a step of introducing a recombinase source into a proliferable cell having a pair of chromosomes having a recombination recognition sequence and having mutation introduced into at least one chromosome; (2) cells obtained from the cell Inducing division or culturing the cells to obtain a cell having a mutation in both chromosomes or a higher organism model by recombination between the recombination recognition sequences at the time of cell division. A method for producing a cell or higher organism model.
【００１３】項４． （１）リコンビネース認識配
列を有する一対の染色体を有し、かつ少なくとも一方の
染色体に変異が導入された増殖可能な細胞について、必
要に応じて細胞分裂を誘発するか或いは該細胞を培養し
て、細胞分裂を行う工程； （２）得られた細胞分裂時の細胞にリコンビネースの供
給源を導入し、リコンビネース認識配列間の組換えによ
り両染色体に変異を有する細胞ないし高等生物体モデル
を得る工程；を含む、両染色体に変異を有する細胞ない
し高等生物体モデルの作製方法。Item 4. (1) a proliferating cell having a pair of chromosomes having a recombination recognition sequence and having a mutation introduced into at least one chromosome, if necessary, induces cell division or cultures the cell, Performing a cell division; (2) introducing a source of recombination into the obtained cell at the time of cell division, and obtaining a cell or higher organism model having mutations in both chromosomes by recombination between the recombination recognition sequences; A method for producing a cell or higher organism model having mutations in both chromosomes, comprising:
【００１４】項５．リコンビネースの供給源が、リコン
ビネース蛋白質、リコンビネースDNA、リコンビネースR
NA、リコンビネース遺伝子を含むプラスミド、リコンビ
ネース遺伝子を含むアデノウィルスベクター或いはリコ
ンビネース遺伝子を含むレトロウィルスベクターのうち
のいずれかである、請求項３又は４に記載の方法。Item 5. Recombinase sources are Recombinase protein, Recombinase DNA, Recombinase R
The method according to claim 3 or 4, wherein the method is any one of NA, a plasmid containing a recombinase gene, an adenovirus vector containing a recombinase gene, and a retrovirus vector containing a recombinase gene.
【００１５】項６．該リコンビネースとその認識配列と
の組み合わせが、リコンビネースCreと認識配列loxP、
リコンビネースFlpと認識配列FRT、又はリコンビネース
Rと認識配列RSからなる群から選ばれるいずれかであ
る、請求項３又は４に記載の方法。Item 6. The combination of the recombinase and its recognition sequence is recombinase Cre and recognition sequence loxP,
Recombinase Flp and recognition sequence FRT or recombinase
The method according to claim 3, wherein the method is any one selected from the group consisting of R and a recognition sequence RS.
【００１６】項７．請求項１または２に記載の両染色体
に変異を有する増殖可能な細胞ないし高等生物体モデル
の表現型を調べ、該表現型と変異との関係から、遺伝子
の機能を調べる方法。Item 7. A method for examining the phenotype of a proliferable cell or a higher organism model having mutations in both chromosomes according to claim 1 or 2, and examining the function of the gene from the relationship between the phenotype and the mutation.
【００１７】[0017]
【発明の実施の形態】本発明において用いるリコンビネ
ース認識配列は、組換えを起こすリコンビネースにより
認識される配列であればよい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The recombination recognition sequence used in the present invention may be any sequence recognized by the recombination causing recombination.
【００１８】リコンビネースにCreを用いる場合の認識
配列は特に限定されるものではなく、loxP配列及びCre
の認識配列となり得る変異を有するバリアントloxP配列
も含まれ、特に好ましくはloxP配列である（Sauerおよ
びHenderson: Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.; 85(14)
5166; 1988）。The recognition sequence when Cre is used for recombination is not particularly limited, and the loxP sequence and Cre
A variant loxP sequence having a mutation that can be a recognition sequence for L.a. is also included, and particularly preferably a loxP sequence (Sauer and Henderson: Proc. Natl. Acad. Sci. US A .; 85 (14)
5166; 1988).
【００１９】リコンビネースにFlpを用いる場合の認識
配列は特に限定されるものではなく、FRT配列及びFlpの
認識配列となり得る変異を有するバリアントFRT配列も
含まれ、特に好ましくはFRT配列である（XuおよびRubi
n: Development 117, 1223; 1993）。The recognition sequence when Flp is used for recombination is not particularly limited, and includes an FRT sequence and a variant FRT sequence having a mutation that can be a recognition sequence of Flp, and particularly preferably an FRT sequence (Xu and Xu). Rubi
n: Development 117, 1223; 1993).
【００２０】リコンビネースにRを用いる場合の認識配
列は特に限定されるものではなく、RS配列及びRの認識
配列となり得る変異を有するバリアントRS配列も含ま
れ、特に好ましくはRS配列である（Arakiら: J of Mol.
Biol. 225, 25; 1992）。The recognition sequence when R is used for recombination is not particularly limited, and includes an RS sequence and a variant RS sequence having a mutation that can be an R recognition sequence, and particularly preferably an RS sequence (Araki et al.). : J of Mol.
Biol. 225, 25; 1992).
【００２１】本発明において用いられる細胞として、胚
性幹細胞（ES細胞）または受精卵、好ましくは全組織分
化能をもつマウス等の高等生物のES細胞が例示される。
本発明において植物なお、受精卵として核移植された受
精卵を利用してもよい。更に、個体中で増殖可能な細胞
であれば体細胞（例えば造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚
（表皮、真皮等）、臓器（肝臓等））でも用いることが
できる。Examples of the cells used in the present invention include embryonic stem cells (ES cells) or fertilized eggs, preferably ES cells of higher organisms such as mice having the ability to differentiate all tissues.
In the present invention, a plant may be a fertilized egg which has been nuclear-transplanted as a fertilized egg. Furthermore, any cell that can proliferate in an individual can be used for somatic cells (for example, hematopoietic stem cells, neural stem cells, skin (epidermal, dermis, etc.), and organs (liver, etc.)).
【００２２】本発明において用いられる高等生物体と
は、高等生物体モデルとなり得るものでもよいし、未分
化細胞が分化して臓器又は組織を形成した高等生物体モ
デルの一部であってもよい。The higher organism used in the present invention may be a higher organism model, or may be a part of a higher organism model in which undifferentiated cells are differentiated to form an organ or tissue. .
【００２３】本発明項１に記載の「両染色体に変異を有
する」とは、２本で１対の相同染色体上において同じ表
現型をコードする、対応する塩基配列部位に変異を有す
ることを示す。The phrase "having a mutation in both chromosomes" according to the item (1) of the present invention means that two chromosomes encode the same phenotype on a pair of homologous chromosomes and have a mutation in a corresponding nucleotide sequence site. .
【００２４】本発明項２の工程（１）に記載の「増殖可
能な細胞」とは、細胞増殖を誘発又は培養することによ
って細胞分裂を行ない増殖することのできる細胞であれ
ば、特に限定されない。The “proliferable cell” described in the step (1) of the second aspect of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell that can undergo cell division and proliferate by inducing or culturing cell proliferation. .
【００２５】本発明項３の工程（２）及び項４の工程
（１）に「得られた細胞について細胞分裂を誘発する
（体細胞等の場合）」と記載のように、本発明において
用いる細胞が、既に分化して細胞の増殖回数が減少して
いる組織や臓器の体細胞等の場合は、定法に従って「細
胞分裂を誘発する」ことにより細胞分裂を行えばよく、
例えばマイトジェン刺激等の方法がある。The present invention is used in the present invention as described in the step (2) of the item 3 and the step (1) of the item 4 "inducing cell division in the obtained cells (in case of somatic cells)". In the case of somatic cells of tissues or organs in which cells have already differentiated and the number of cell proliferation has decreased, cell division can be performed by `` inducing cell division '' according to a standard method,
For example, there is a method such as mitogen stimulation.
【００２６】一方、本発明項３の工程（２）及び項４の
工程（１）に「該細胞を培養して（ES細胞及び受精卵等
の場合）」と記載のように、本発明において用いる細胞
が、ES細胞や受精卵のような未分化の細胞であれば、細
胞分裂を誘発せずとも通常の条件で「該細胞を培養」す
ればよい。On the other hand, in step (2) of item 3 and step (1) of item 4 of the present invention, as described in “Cultivating the cells (for ES cells and fertilized eggs, etc.)”, If the cell to be used is an undifferentiated cell such as an ES cell or a fertilized egg, "the cell may be cultured" under ordinary conditions without inducing cell division.
【００２７】本発明項３の工程（２）及び項４の工程
（２）に記載の「高等生物体モデルの作製方法」とは、
例えばNeo耐性遺伝子を両アレルにもつ細胞の場合であ
ればNeoの添加等により、両染色体に変異を有する細胞
を選抜し、該細胞を定法に従って培養して高等生物体モ
デルを作製すればよく、公知の方法を用い得る。The “method for preparing a higher organism model” described in the step (2) of the item 3 of the present invention and the step (2) of the item 4 includes:
For example, in the case of cells having Neo resistance genes in both alleles, cells having mutations in both chromosomes are selected by addition of Neo, etc., and the cells may be cultured according to a standard method to prepare a higher organism model, Known methods can be used.
【００２８】本発明項７に記載の「表現型」とは、外観
的なもの（大小、長短、色等）、生化学的なもの（蛋白
質の異常等）、形態学的なもの（臓器の形態）、疾患に
関係するもの（発ガン性、糖尿病等）などを含み、遺伝
子の作用によって細胞ないし個体に表れる性質である。
項７の「遺伝子の機能を調べる方法」とは、遺伝子の一
部を破壊した遺伝子組換え体と野生型との表現型の違い
を調べることにより、特定の遺伝子と表現型との対応関
係を見出すことを示す。The term “phenotype” according to the seventh aspect of the present invention refers to an appearance (large or small, long or short, color, etc.), a biochemical (protein abnormality, etc.), a morphological (organ, etc.). Morphology), those related to diseases (carcinogenicity, diabetes, etc.), and the like, which are manifested in cells or individuals by the action of genes.
The term “method for examining the function of a gene” in item 7 means that the correspondence between a specific gene and a phenotype is determined by examining the phenotypic difference between a genetically-modified recombinant and a wild-type. Indicates to find.
【００２９】本発明で導入する変異は、１ヵ所でも複数
箇所でもよく、変異導入の数を変えることにより、表現
型に関与する遺伝子の数が分かる。The number of mutations to be introduced in the present invention may be one or more. By changing the number of mutations, the number of genes involved in the phenotype can be determined.
【００３０】本発明において用いられる高等生物体には
動物あるいは植物が包含され、例えば動物としては、ヒ
ト、ブタ、サル、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イ
ヌ、ウサギ、マウス、ラット、またはハムスター等、よ
り好ましくは、マウスまたはラットであり、目的および
必要に応じて適宜選択し得る。The higher organism used in the present invention includes an animal or a plant. Examples of the animal include human, pig, monkey, cow, horse, goat, sheep, cat, dog, rabbit, mouse, rat, or Hamsters and the like are more preferably mice or rats, and can be appropriately selected according to the purpose and need.
【００３１】また、本発明において用いられる植物は、
例えばコメ、コムギ、ダイズ、トウモロコシ等であり、
目的および必要に応じて適宜選択し得る。The plant used in the present invention is
For example, rice, wheat, soybean, corn, etc.
It can be appropriately selected according to the purpose and need.
【００３２】本発明において用いられる高等生物体に
は、トランスジェニック個体が包含される。[0032] Higher organisms used in the present invention include transgenic individuals.
【００３３】本発明において用いるリコンビネースの供
給源は、リコンビネースそれ自体すなわちリコンビネー
ス蛋白質であってもよいし、リコンビネースDNA、リコ
ンビネースmRNA、リコンビネース遺伝子を含むプラスミ
ド、リコンビネース遺伝子を含むアデノウィルスベクタ
ー或いはリコンビネース遺伝子を含むレトロウィルスベ
クターであってもよい。The source of the recombinant used in the present invention may be the recombinant itself, that is, a recombinant protein, a recombinant DNA, a recombinant mRNA, a plasmid containing the recombinant gene, an adenovirus vector containing the recombinant gene, or a retrovirus containing the recombinant gene. It may be a viral vector.
【００３４】リコンビネース供給源としてリコンビネー
ス蛋白質或いはリコンビネースmRNAを細胞に導入する場
合には、DNAを用いる場合に比べてリコンビネース発現
のための遺伝子の転写ないし翻訳の時間を要しないこと
ことが多く有効な可能性がある。また、作用後には細胞
内で分解され後の世代まで影響が残らないため、一世代
のストレイン（strain）につき、一過性にリコンビネー
スを用いて組換えを起こしたい場合に有効である。When a recombinant protein or a recombinant mRNA is introduced into a cell as a source of the recombinant, it is often effective that the time for transcription or translation of the gene for the expression of the recombinant is not required as compared with the case where DNA is used. There is. In addition, since it is degraded in the cell after the action and has no effect until the next generation, it is effective when it is desired to transiently use recombination for recombination for one generation of strain.
【００３５】リコンビネース供給源としてリコンビネー
スDNAを細胞に導入する場合には、リコンビネース蛋白
質を用いる場合に比べ、次の世代にもリコンビネース遺
伝子が受け継がれ、長期間に渡り恒常的に組換えを起こ
すことができるため、細胞分裂或いは世代を経るにつれ
て変異を起こす効率が高まっていくという利点がある。When recombinase DNA is introduced into cells as a recombinase source, the recombinase gene is inherited in the next generation as compared with the case where a recombinase protein is used, and recombination occurs constantly for a long period of time. This has the advantage that the efficiency of mutagenesis increases as cells undergo cell division or generations.
【００３６】リコンビネース供給源としてリコンビネー
ス遺伝子を含むプラスミド、リコンビネース遺伝子を含
むアデノウィルスベクター或いはリコンビネース遺伝子
を含むレトロウィルスベクターを細胞に導入する場合に
は、導入先の細胞質においてリコンビネースを発現させ
るようにコンストラクトを調製しても、リコンビネース
遺伝子が導入先の細胞質から核の中に入り込みゲノムに
直接組み込まれるようにコンストラクトを調製してもよ
い。また、プラスミド或いはベクターのコンストラクト
中にリコンビネース遺伝子の発現を調節し得る成分を組
み込むことにより、リコンビネースを必要な時だけ時期
特異的に発現させることができる、プロモーターを所望
のタイミングで所望のものに変えることができる等の利
点がある。When a plasmid containing a recombinase gene, an adenovirus vector containing a recombinase gene, or a retrovirus vector containing a recombinase gene is introduced into cells as a source of the recombinase, the construct is prepared so that the recombinase is expressed in the cytoplasm of the transfection destination. Alternatively, the construct may be prepared such that the recombinant gene enters the nucleus from the cytoplasm to which the gene is introduced and is directly integrated into the genome. In addition, by incorporating a component capable of regulating the expression of a recombinase gene into a plasmid or vector construct, the recombinase can be expressed only in a specific time only when necessary. There are advantages such as being able to.
【００３７】本発明において、高等生物体になり得る細
胞（ES細胞、受精卵等）へのプラスミド導入のために用
いる方法としては公知の方法が使用できる。好ましく
は、例えばES細胞への導入法としてエレクトロポーレー
ション又はレトロウィルスベクターを用いた導入、受精
卵への導入法としてマイクロインジェクションなどが挙
げられる。また、実施例１の［３］のようにリポフェク
ションのキットを用いてもよい。In the present invention, known methods can be used for introducing a plasmid into cells (ES cells, fertilized eggs, etc.) that can become higher organisms. Preferably, for example, introduction into ES cells includes electroporation or introduction using a retrovirus vector, and introduction into fertilized eggs includes microinjection. Alternatively, a lipofection kit may be used as in [3] of Example 1.
【００３８】本発明において用いられる、染色体への外
来DNA導入法としては、遺伝子ターゲッティング法或い
は遺伝子トラップ法が例示される。As a method for introducing foreign DNA into a chromosome used in the present invention, a gene targeting method or a gene trap method is exemplified.
【００３９】遺伝子ターゲッティング法とは、細胞及び
個体レベルで、特定遺伝子座のみに目的とした変異を導
入するものであり、相同的組換えを細胞レベルで起こさ
せ、標的遺伝子組換え体を選別する方法である。染色体
上に変異を導入する標的部位を事前に決めておき、該部
位の塩基配列と相同性を有する塩基配列を含むベクター
すなわちターゲッティングコンストラクトを構築し、こ
れを細胞に導入し、標的部位に所望の変異を挿入する。
このため、この方法は、ターゲッティングコンストラク
トを導入したい特定の表現型をコードする遺伝子座につ
いて塩基配列が明らかであり、計画的に特定遺伝子を破
壊したい場合に有効である。The gene targeting method is a method in which a target mutation is introduced only at a specific locus at a cell or individual level, and homologous recombination is caused at a cell level to select a target gene recombinant. Is the way. A target site for introducing a mutation on the chromosome is determined in advance, a vector containing a nucleotide sequence having homology to the nucleotide sequence of the site, that is, a targeting construct is constructed, and this is introduced into a cell, and the desired Insert the mutation.
Therefore, this method is effective when the nucleotide sequence of a locus encoding a specific phenotype into which a targeting construct is to be introduced is clear, and the specific gene is to be intentionally disrupted.
【００４０】遺伝子ターゲッティング法に用いる選択マ
ーカーとしては、ポジティブマーカーとネガティブマー
カーがある。As a selection marker used in the gene targeting method, there are a positive marker and a negative marker.
【００４１】遺伝子ターゲッティング法においては、染
色体へターゲッティングベクターが遺伝子導入される確
率が非常に低いことから、遺伝子導入の指標にポジティ
ブマーカーによるポジティブセレクションを行い、組換
え体をスクリーニングする。また、遺伝子導入された組
換え体のうち、相同組換え体は非相同組換え体に比べ頻
度が非常に低いため、相同組換え体を選別するための工
夫としてネガティブマーカーによるネガティブセレクシ
ョンを行い、非相同組換え体をある程度選択的に死滅さ
せ、相同組換え体を濃縮する方法が知られる。In the gene targeting method, since the probability of introduction of a targeting vector into a chromosome is extremely low, a recombinant is screened by performing positive selection using a positive marker as an index of gene introduction. In addition, among the transfected recombinants, homologous recombinants are much less frequent than non-homologous recombinants, so a negative marker negative selection was performed as a device for selecting homologous recombinants, There is known a method of selectively killing non-homologous recombinants to some extent and enriching homologous recombinants.
【００４２】本発明で用いられるターゲッティングコン
ストラクトは、ポジティブマーカーとして、ネオマイシ
ン耐性遺伝子（Neo）、ピューロマイシン耐性遺伝子（P
uro）、ハイグロマイシン耐性遺伝子、グリーン蛍光蛋
白質遺伝子（GFP）等を含み得る。The targeting construct used in the present invention includes neomycin resistance gene (Neo) and puromycin resistance gene (P
uro), a hygromycin resistance gene, a green fluorescent protein gene (GFP) and the like.
【００４３】本発明で用いられるターゲッティングコン
ストラクトは、相同性組換えが起こらなかった細胞を除
外する（ネガティブセレクション）ためのネガティブマ
ーカーとして、ヘルペスウィルスチミジンカイネース遺
伝子（HSV-tk）、ジフテリアトキシンＡフラグメント遺
伝子（DT-A）等を、適宜選択して用いることができる。
このようなネガティブセレクションを行なうことによ
り、相同組換え体を得る効率を高くすることができる。
HSV-tkを含む細胞の場合、培養液中に抗ウィルス薬剤で
あるガンシクロビルを添加すると、チミジンカイネース
がこの薬剤をリン酸化し細胞が死滅する。DTAを用いる
場合は、この遺伝子が発現するだけで、これを含んだ細
胞は死滅する。The targeting construct used in the present invention is a herpesvirus thymidine kinase gene (HSV-tk), a diphtheria toxin A fragment as a negative marker for excluding cells in which homologous recombination has not occurred (negative selection). Gene (DT-A) and the like can be appropriately selected and used.
By performing such a negative selection, the efficiency of obtaining a homologous recombinant can be increased.
In the case of cells containing HSV-tk, when the antiviral drug ganciclovir is added to the culture solution, thymidine kinase phosphorylates the drug and kills the cells. When DTA is used, only the expression of this gene causes the cell containing it to die.
【００４４】遺伝子トラップ法とは、レポーター遺伝子
を含むトラップベクターを細胞に導入したとき、染色体
上の内在性遺伝子座内にランダムに組み込まれることを
利用して未知の遺伝子を探索する方法である。この方法
は、変異を導入したい染色体上の特定の表現型をコード
する遺伝子座についてあらかじめ塩基配列が明らかでな
い場合や、未知の遺伝子の機能及びその発現パターンを
調査したい場合に有効である。The gene trap method is a method for searching for an unknown gene by utilizing the fact that when a trap vector containing a reporter gene is introduced into cells, the gene is randomly integrated into an endogenous locus on a chromosome. This method is effective when the nucleotide sequence of a locus encoding a specific phenotype on a chromosome to which a mutation is to be introduced is not known in advance, or when it is desired to investigate the function of an unknown gene and its expression pattern.
【００４５】また、本発明において、変異を導入する手
段として遺伝子トラップ法を用いてES細胞に変異を導入
する場合、該細胞からランダムに変異を有する細胞を得
て、リコンビネースにより両染色体に変異を導入後、そ
れらの細胞から個体を作製することにより、両染色体上
の対応する特定部位に変異を有する個体、すなわち特定
の遺伝子機能が破壊された個体を得ることができ、さら
に細胞レベルでも遺伝子機能が破壊されている変異株を
得ることができる。In the present invention, when a mutation is introduced into ES cells using a gene trapping method as a means for introducing a mutation, cells having the mutation are randomly obtained from the cells, and the mutation is introduced into both chromosomes by recombination. After the introduction, by producing individuals from those cells, it is possible to obtain individuals having mutations at the corresponding specific sites on both chromosomes, that is, individuals in which specific gene functions have been disrupted. Can be obtained.
【００４６】本発明において用いられるトラップベクタ
ーは、その構成要素として、大腸菌lacZ遺伝子等のレポ
ーター遺伝子、プラスミド配列、Neo遺伝子等の選択マ
ーカー遺伝子、スプライスアクセプター、スプライスド
ナー、プロモーターなどを適宜含み得る。The trap vector used in the present invention may appropriately contain, as its components, a reporter gene such as the E. coli lacZ gene, a plasmid sequence, a selection marker gene such as the Neo gene, a splice acceptor, a splice donor, and a promoter.
【００４７】本発明において用いられる選択マーカー遺
伝子としては、相同染色体の一方の染色体上に挿入され
たマーカー遺伝子が細胞分裂及びリコンビネースによる
組換えを経て両染色体に導入されたことを識別できるも
のであればよく、例えば抗生物質耐性を付与するもので
はピューロマイシン耐性遺伝子（Puro）、ハイグロマイ
シン耐性遺伝子、好ましくはNeomycin耐性遺伝子等があ
り、目的および必要に応じて適宜選択し得る。The selectable marker gene used in the present invention is one which can identify that the marker gene inserted on one chromosome of the homologous chromosome has been introduced into both chromosomes through cell division and recombination by recombination. For example, those that impart antibiotic resistance include a puromycin resistance gene (Puro), a hygromycin resistance gene, and preferably a Neomycin resistance gene, which can be appropriately selected depending on the purpose and need.
【００４８】以下、本発明で用いられる遺伝子導入法に
ついて、リコンビネースシステムがCre/loxPである場合
を例にとり、各々についての説明を加える。尚、以下の
説明においてCre/loxPシステムを同等の機能をもつ別の
リコンビネースシステムに置き換えて実施することは、
当業者にとって容易である。Hereinafter, the gene transfer method used in the present invention will be described with reference to the case where the recombination system is Cre / loxP, as an example. In the following description, replacing the Cre / loxP system with another recombination system having the same function
Easy for those skilled in the art.
【００４９】（１）loxP配列（を含むベクター）の挿入 本発明における変異の導入とは別に、両染色体上へのlo
xP配列（本発明実施例１においてはloxP配列及びNeoを
含むベクター）の挿入の際、その挿入部位によっては、
それ自体が原因で内在性遺伝子を破壊することがあり得
る。また、loxPの挿入部位次第ではCreによる組換えが
原因で内在性遺伝子を破壊することもあり得る。こうし
た場合、後に野生型と相同組換え体との表現型を比較す
る際に、その差異がloxP挿入に起因するものなのか、変
異の導入に起因するものなのか、原因の特定が困難にな
る場合がある。(1) Insertion of loxP sequence (including vector) Apart from introduction of the mutation in the present invention, lo
Upon insertion of an xP sequence (a vector containing a loxP sequence and Neo in Example 1 of the present invention), depending on the insertion site,
It is possible for the endogenous gene to be disrupted by itself. Also, depending on the loxP insertion site, recombination by Cre may disrupt the endogenous gene. In such cases, when comparing the phenotypes of the wild-type and homologous recombinants later, it is difficult to determine whether the difference is due to the loxP insertion or the introduction of the mutation. There are cases.
【００５０】従って、本発明における細胞へのloxP配列
の挿入法としては、ターゲッティング法を用いて内在性
遺伝子を傷つけないような部位を標的とすることが望ま
しい。好ましくは、発現に影響のないようにターゲッテ
ィングベクターを遺伝子の外側或いはイントロンに挿入
することが望ましい。更に、本発明実施例１に例示のよ
うに、遺伝子の発現低下の原因となるNeo遺伝子を除去
可能なように、Neo遺伝子をloxP配列で挟んでおき、Cre
リコンビネース発現依存性にNeo遺伝子を除去すること
も可能である。Therefore, as a method for inserting the loxP sequence into cells in the present invention, it is desirable to use a targeting method to target a site that does not damage the endogenous gene. Preferably, it is desirable to insert the targeting vector outside the gene or in an intron so as not to affect the expression. Further, as exemplified in Example 1 of the present invention, the Neo gene was sandwiched between loxP sequences so that the Neo gene causing the decrease in the expression of the gene could be removed.
It is also possible to remove the Neo gene depending on the expression of the recombinant.
【００５１】しかしながら、標的とする遺伝子やその塩
基配列についての情報が未知であるような場合には、野
生型と未知遺伝子完全欠損体について表現型の変化が何
に起因するのかを証明さえできれば、プラスミドもしく
はウィルスを用いた遺伝子トラップ法を用いてランダム
にloxP配列を挿入してもよい。However, when the information on the target gene or its base sequence is unknown, it is only necessary to prove what causes the phenotypic change between the wild type and the completely unknown unknown gene. The loxP sequence may be inserted at random using a gene trap method using a plasmid or a virus.
【００５２】本発明においてloxP配列を挿入するターゲ
ット部位としては、染色体上であれば遺伝子内であって
も遺伝子外でもよいが、好ましくは内在性遺伝子に影響
を与えないよう予め配列が分かっている遺伝子外の部位
がよい。In the present invention, the target site for inserting the loxP sequence may be within the gene or outside the gene as long as it is on the chromosome, but preferably the sequence is known in advance so as not to affect the endogenous gene. A site outside the gene is better.
【００５３】本発明においてloxP配列を挿入し得る遺伝
子座としてはどのような遺伝子座でもよい。実施例１の
Kappa-opioid receptor遺伝子座のように、既にloxP配
列が組み込まれている遺伝子座を含む細胞及び動物を用
いることもできる。In the present invention, any loci into which the loxP sequence can be inserted may be used. Example 1
Cells and animals containing a locus in which the loxP sequence is already incorporated, such as the Kappa-opioid receptor locus, can also be used.
【００５４】（２）変異の導入 本発明における変異の導入法としては、ターゲッティン
グ法に限らず、プラスミドもしくはウィルスを用いた遺
伝子トラップ法を用いることもでき、その他、化学物質
等による変異導入法も含まれる。(2) Mutation Introduction The mutation introduction method of the present invention is not limited to the targeting method, and a gene trap method using a plasmid or a virus may be used. included.
【００５５】本発明の実施例１においては、両染色体に
変異が挿入されたことを確認するための選択マーカーと
して変異型Neo耐性遺伝子を用いているが、所望の変異
が両染色体に得られたことを確認できる遺伝子であれ
ば、マーカー遺伝子は特に限定されない。In Example 1 of the present invention, a mutant Neo resistance gene was used as a selectable marker to confirm that a mutation was inserted into both chromosomes, but the desired mutation was obtained in both chromosomes. The marker gene is not particularly limited as long as the gene can be confirmed.
【００５６】また、変異を起こすことができるものであ
れば、変異を導入するための遺伝子は特に限定されず、
変異導入部位は１ヵ所でも複数でもよい。変異導入部位
が複数の場合、例えば、１つの疾患が複数の遺伝子座に
関係するものである場合等に、一度に多くの遺伝子機能
を解析できる可能性がある。The gene for introducing the mutation is not particularly limited as long as it can cause the mutation.
The number of mutation sites may be one or more. When there are a plurality of mutation introduction sites, for example, when one disease is related to a plurality of loci, many gene functions may be analyzed at once.
【００５７】（３）Neo遺伝子の導入 本発明におけるNeo遺伝子の導入法としては、ターゲッ
ティング法に限らず、プラスミドもしくはウィルスを用
いた遺伝子トラップ法を用いることもできる。(3) Introduction of Neo gene The Neo gene in the present invention is not limited to the targeting method, but may be a gene trap method using a plasmid or a virus.
【００５８】本発明において、Neo遺伝子を該細胞ある
いは動物に導入するための発現ベクターとしては、プラ
スミドまたはアデノウィルスベクターを選択し得る。In the present invention, a plasmid or an adenovirus vector can be selected as an expression vector for introducing the Neo gene into the cell or animal.
【００５９】本発明においてNeo遺伝子を挿入し得る遺
伝子座としてはloxP配列の導入された染色体上でかつlo
xP配列よりテロメア側であればどの遺伝子座でもよい。
実施例１で、loxPが挿入されたkappa-opioid receptor
遺伝子座に対して、よりテロメア側のFas ligand遺伝子
座にNeoを導入しているように、染色体間での組換えを
検討するのに適した遺伝子座を適宜用いることができ
る。In the present invention, the locus into which the Neo gene can be inserted includes a locus on the chromosome in which the loxP sequence is introduced and
Any locus may be used as long as it is on the telomere side of the xP sequence.
In Example 1, kappa-opioid receptor into which loxP was inserted
A gene locus suitable for examining recombination between chromosomes can be used as appropriate, such as introducing Neo into the Fas ligand locus on the telomere side with respect to the locus.
【００６０】本発明の実施例では、変異をFas ligand遺
伝子座へ挿入し、その変異が両染色体へ高効率に誘導さ
れていることを示しているが、Fas ligand遺伝子座に限
らず、loxP配列が挿入された部位よりもセントロメアに
対して遠位端すなわちテロメア側に変異を挿入されうる
ものであれば、どのようなターゲッティングコンストラ
クトを用いてもよい。In the examples of the present invention, a mutation was inserted into the Fas ligand locus, indicating that the mutation was highly efficiently induced in both chromosomes. Any targeting construct may be used as long as the mutation can be inserted at the distal end, that is, at the telomere side of the centromere from the site where the is inserted.
【００６１】本発明の概念を、Cre/loxPを用いた一実施
態様を例にとり以下に説明する。 （a）loxP配列の挿入 Creリコンビネースによって認識される34bpからなるlox
P配列を、マウスES細胞の１番染色体のセントロメア近
傍に相同性組換えを利用して挿入する。挿入時にはloxP
配列が２ヵ所存在し、そのloxP間にNeo耐性遺伝子が組
み込まれている（図２ａ; Targeted）。Neo耐性遺伝子
の存在により、相同組換えを起こしたES細胞をNeomycin
を用いた薬剤選択で得ることができる。これらのES細胞
について、Creリコンビネースを一過性に発現させ、lox
P間の組換えによってNeo耐性遺伝子が除去された細胞を
得る。その結果、マウス一番染色体のセントロメア近傍
にloxP部位が１ヵ所のみ存在するES細胞が得られる（図
２ａ; Single loxP）。相同染色体のもう一方の染色体
にも同様の手法でloxP配列を挿入し、相同染色体の対応
する両位置にloxP配列を有するES細胞を得る（図１、第
１図）。The concept of the present invention will be described below by taking an embodiment using Cre / loxP as an example. (A) Insertion of loxP sequence lox consisting of 34 bp recognized by Cre recombinase
The P sequence is inserted using homologous recombination near the centromere of chromosome 1 of mouse ES cells. LoxP when inserted
There are two sequences, and the Neo resistance gene is integrated between the loxPs (FIG. 2a; Targeted). ES cells that have undergone homologous recombination due to the presence of the Neo resistance gene
Can be obtained by drug selection using For these ES cells, Cre recombinase was transiently expressed and lox
A cell from which the Neo resistance gene has been removed by recombination between P is obtained. As a result, ES cells having only one loxP site near the centromere of the mouse's first chromosome are obtained (FIG. 2a; Single loxP). The loxP sequence is inserted into the other chromosome of the homologous chromosome in the same manner, and ES cells having the loxP sequence at both corresponding positions of the homologous chromosome are obtained (FIG. 1, FIG. 1).
【００６２】（b）loxP配列が挿入されたES細胞へのNeo
耐性遺伝子挿入 両染色体に変異が導入されたことを確認する一手段とし
て、選択マーカー遺伝子であるNeo耐性遺伝子を、loxP
配列を挿入したのと同じ手法で１番染色体の特定部位に
挿入する（図１、第２図）。この時、Neo耐性遺伝子はl
oxP配列を有していないものを用いる。レトロウィルス
ベクターを利用してNeo耐性遺伝子をES細胞へ挿入する
方法も存在する。(B) Neo to ES cell into which loxP sequence was inserted
One way to confirm that mutations have been introduced into both chromosomes is to insert the Neo resistance gene, a selectable marker gene, into loxP
It is inserted into a specific site of chromosome 1 in the same manner as the sequence was inserted (FIGS. 1 and 2). At this time, the Neo resistance gene is l
Use those without the oxP sequence. There is also a method of inserting a Neo resistance gene into ES cells using a retroviral vector.
【００６３】（c）loxP配列及びNeo耐性遺伝子が挿入さ
れたES細胞へのCre遺伝子の挿入 リポフェクション法により、ES細胞の染色体上の任意の
箇所へCre遺伝子を挿入し、その中からCreリコンビネー
スを持続的に発現している細胞株を選択する（図１、第
３〜５図）。(C) Insertion of Cre gene into ES cell into which loxP sequence and Neo resistance gene were inserted The Cre gene was inserted into an arbitrary position on the chromosome of the ES cell by the lipofection method, and Cre recombinase was inserted therein. A cell line that is persistently expressed is selected (FIG. 1, FIGS. 3-5).
【００６４】以下、本発明で用いる各種発現ベクターの
作製方法を具体例を挙げて説明する。なお、この実施例
で用いられる出発プラスミド、プロモーター等の構成要
素を同等のもので置き換えて実施することは当業者にと
って容易である。Hereinafter, methods for preparing various expression vectors used in the present invention will be described with reference to specific examples. It is easy for those skilled in the art to replace the starting plasmid, promoter, and other components used in this example with equivalent components.
【００６５】[0065]
【実施例】以下、本発明の内容を実施例を用いて具体的
に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるもので
はない。EXAMPLES The contents of the present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
【００６６】実施例１ loxP配列をマウス第一染色体上の両アレルに持つマウス
ES細胞を樹立した。loxP配列はkappa-opioid receptor
遺伝子座のイントロン１に、遣伝子の発現に影響しない
ように挿入されている。Kappa-opioid receptorの遺伝
子座は第一番染色体のセントロメア近傍の遺伝子であ
り、この遺伝子座に挿入することでloxP間の組換えに伴
う染色体間の変異が広範囲におこることが予想できる。 Example 1 Mouse having loxP sequence in both alleles on mouse first chromosome
ES cells were established. loxP sequence is kappa-opioid receptor
It has been inserted into intron 1 of the locus so as not to affect the expression of the gene. The Kappa-opioid receptor locus is a gene near the centromere of the first chromosome, and insertion into this locus can be expected to cause a wide range of interchromosomal mutations associated with loxP recombination.
【００６７】図３〜図８は、実施例１において用いられ
たプラスミドの作製フローを示す説明図である。それぞ
れの作製方法を以下に示す。FIGS. 3 to 8 are explanatory diagrams showing the flow of preparing the plasmid used in Example 1. The respective manufacturing methods are described below.
【００６８】［１−１：Kappa-opioid receptor遺伝子
座へloxP配列を挿入するためのターゲッティングコンス
トラクトの作製（図３）］ （１）pPGKneo-OpiRの作製 ・pOpiR kappa-opioid receptor遺伝子のエクソン１とイントロ
ン１を含むゲノムDNA断片をMORG17クローン（Nishi et
al., Biochem. Biophys. RES. Commun., 205, 1353-135
7, 1994）から制限酵素Spe Iで切り出し、それを前もっ
てBamH Iサイトを欠損させておいたpBluescript II（pB
S II KS+: Stratagen社）のプラスミドのSpe Iサイトへ
サブクローニングし、これをpOpiRとした。 ・pPGKneo ２つのloxP配列で挟まれたPGK-neo遺伝子をコードするD
NA（Nakano et al., Euro. Neurosci. Associ., 11, 25
77-2581, 1999）をEcoR I（平滑化）とNot Iで切り出し
pBS IIのEcoR I（末端平滑化）、Not Iサイトにクロー
ニングし、これをpPGKneoとした。 ・pPGKneo-OpiR pPGKneoをAsp718、Not Iで切断、平滑化後、pOpiRのBam
H I（末端平滑化）サイトにクローニングし、これをpPG
Kneo-OpiRとした。[1-1: Preparation of targeting construct for inserting loxP sequence into Kappa-opioid receptor locus (FIG. 3)] (1) Preparation of pPGKneo-OpiR • Exon 1 of pOpiR kappa-opioid receptor gene A genomic DNA fragment containing intron 1 was cloned into a MORG17 clone (Nishi et.
al., Biochem. Biophys. RES.Commun., 205, 1353-135
7, 1994) with the restriction enzyme Spe I, which was excised from pBluescript II (pB
(SII KS +: Stratagen) was subcloned into the Spe I site, and this was designated as pOpiR.・PPGKneo D encoding the PGK-neo gene flanked by two loxP sequences
NA (Nakano et al., Euro. Neurosci. Associ., 11, 25
77-2581, 1999) with EcoR I (smoothing) and Not I
It was cloned into the EcoR I (end blunt end) and Not I sites of pBSII, and this was designated as pPGKneo.・PPGKneo-OpiR After cutting pPGKneo with Asp718 and NotI, smoothing, and then pOpiR Bam
Cloned into the HI (end blunt end) site and
Kneo-OpiR.
【００６９】（２）pPGKneo-OpiRへのtk遺伝子の挿入 ・pPNT EcoR I‐ 次に相同性組換えが起こらなかったものを除外するため
に、チミジンカイネース遺伝子（以下tkとする）をpPGK
neo-OpiRのkappa-opioid receptor遺伝子のゲノムDNA配
列の外側へ挿入した。tk遺伝子を有するpPNTプラスミド
（Tybulewiczet al., 1991, Cell, 65, 1153-1163）を
あらかじめEcoR Iサイトを欠損させておき、これをpPNT
EcoR I‐とした。 ・pTKBS このpPNT EcoR I‐からAsp718とHind IIIで切り出した
フラグメントを、pBluescript IIのAsp718とHind IIIで
切断したプラスミドへ挿入し、これをpTKBSとした。さ
らにpTKBSからEcoR IとAsp718でtk遺伝子を切り出してp
PGKneo-OpiRのEcoR I、Asp718サイトにクローニング
し、ターゲッティングコンストラクトを完成させた。(2) Insertion of tk gene into pPGKneo-OpiR pPNT EcoR I-In order to exclude those in which no homologous recombination has occurred, the thymidine kinase gene (hereinafter referred to as tk) was replaced with pPGK EcoR I.
It was inserted outside the genomic DNA sequence of the kappa-opioid receptor gene of neo-OpiR. The tk gene-containing pPNT plasmid (Tybulewiczet al., 1991, Cell, 65, 1153-1163) was previously deleted from the EcoRI site, and this was replaced with pPNT
EcoR I-. -PTKBS A fragment cut out from this pPNT EcoR I- with Asp718 and HindIII was inserted into a plasmid cut with Asp718 and HindIII of pBluescript II, and this was called pTKBS. Furthermore, the tk gene was cut out from pTKBS with EcoR I and Asp718, and p
It was cloned into EcoRI of PGKneo-OpiR at Asp718 site to complete the targeting construct.
【００７０】［１−２：ES細胞の培養およびターゲッテ
ィングコンストラクトの導入］前述のターゲッティング
コンストラクトをNot Iで切断したものを10μg使用し、
ES細胞（R1 ES細胞, Nagy et al., 1993, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 90,8424-8428）ヘエレクトロポーレー
ション法により導入した。ES細胞は1×107個の細胞を使
用し、エレクトロポーレーションの条件は240V、500μF
で行った。エレクトロポーレーションの翌日から150μg
/mlのG418で７日間薬剤選択を行った。さらにエレクト
ロポーレーションの３日後から３日間ガンシクロビルを
1μMの濃度で培養液中に加えた。薬剤選択後、耐性のク
ローンを個々に拾い、それぞれについてPCR法（polymer
ase chain reaction; primer／5'-GTTACTAAGGTTCCTGTGT
CTGCATGACCT-3'；（配列番号１） 5'-TAGTGAGACGTGCTAC
TTCCATTTGTCACG-3'；（配列番号２）、 条件／93℃1
分、60℃1分、72℃3分を35サイクル）にて相同性組換え
が起こっているかを検定した。268個の得られたクロー
ンのうち８個が相向性組換えによるクローンであった。
そのうち#161のクローンをもちいて以下の実験を行っ
た。[1-2: Culture of ES Cell and Introduction of Targeting Construct] 10 μg of the above-described targeting construct cut with Not I was used.
ES cells (R1 ES cells, Nagy et al., 1993, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 90, 8424-8428). ES cells use 1 × 10 7 cells, electroporation conditions are 240 V, 500 μF
I went in. 150 μg from the day after electroporation
Drug selection was performed for 7 days with G / ml of G418. Ganciclovir for 3 days from 3 days after electroporation
It was added to the culture at a concentration of 1 μM. After drug selection, resistant clones were individually picked, and the PCR method (polymer
ase chain reaction; primer / 5'-GTTACTAAGGTTCCTGTGT
CTGCATGACCT-3 '; (SEQ ID NO: 1) 5'-TAGTGAGACGTGCTAC
TTCCATTTGTCACG-3 '; (SEQ ID NO: 2), conditions / 93 ° C1
Min, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 3 minutes for 35 cycles) to determine whether homologous recombination has occurred. Eight of the 268 obtained clones were clones obtained by phasic recombination.
The following experiment was performed using the # 161 clone among them.
【００７１】［１−３：Creリコンビネースの一過性発
現によるPGK-neo遺伝子の除去］前述のクローンに対しC
reリコンビネース蛋白質（以下Cre蛋白質とする）を細
胞内に一過性に発現させ、loxP配列で挟まれたPGK-neo
遺伝子を除去することにより、kappa-opioid receptor
遺伝子座内にloxP配列を１つのみにした。 ・pPMC-Cre puro Cre蛋白質を一過性に発現させるためにpPMC-Cre puroプ
ラスミドを作製した。pPMC-Cre puroはプラスミドが細
胞内に導入されたもののみ選択できるようにpuromycin
に対する薬剤耐性遺伝子であるpuromycin-N-acetyl-tra
nsferase（以下puroとする）を持つベクターである。こ
のプラスミドはpPGK puroプラスミド（Taniguchi et a
l., 1998, Nuc. Acid. Res., 26, 679-680）をSal Iで
切断し得られた1703bpのフラグメントを、Sal Iで切断
し脱リン酸化処理したpPMC-Cre（Gu etal., Cell, 199
3, 73, 1155-1164）プラスミドへ挿入して作製した。 ・クローン#161A このプラスミドを用いて、#161の細胞1×107に対し前述
の条件にてエレクトロポーレーションを行った。そして
その翌日よりpuromycinによる薬剤選択を1μg/mlの濃度
で２日間行い、薬剤の入っていない培養液に置き換え８
日目に個々のクローンを単離し、PCR法（primer／5'-CC
AGGTCTTCAGATTTATTGTGCTTTTGTC-3'；（配列番号３）,
5'-AGGGTCAGTTACAGAGTGGAGATTTTGAGC-3'；（配列番号
４）、条件／94℃1分、60℃1分、68℃1分を35サイク
ル）にてPGK-neoが欠除しているクローン#161Aを同定し
た。 ・クローン#161A-1 #161Aに対し、さらにもう一度同じターゲッティングコ
ンストラクトをエレクトロポーレーションにて導入し、
もう一方の染色体へ挿入されたクローン#161A-1を選択
した。 ・クロ一ン#161A-1-1 このクローンについてさらにCre蛋白質の一過性発現に
よりPGK-neoを除去し、両方の染色体上にloxPを１つず
つもつクロ一ン#161A-1-1を得た。[1-3: Removal of PGK-neo gene by transient expression of Cre recombinase]
re-recombinase protein (hereinafter referred to as Cre protein) is transiently expressed in cells, and PGK-neo sandwiched between loxP sequences
By removing the gene, kappa-opioid receptor
There was only one loxP sequence in the locus. -A pPMC-Cre puro plasmid was prepared to transiently express the pPMC-Cre puro Cre protein. pPMC-Cre puro is puromycin so that only the plasmid introduced into the cell can be selected.
Puromycin-N-acetyl-tra, a drug resistance gene against
This vector has nsferase (hereinafter referred to as puro). This plasmid is the pPGK puro plasmid (Taniguchi et a
l., 1998, Nuc. Acid. Res., 26, 679-680), and a 1703 bp fragment obtained by cutting with SalI was used. pPMC-Cre (Gu et al., Cell, 199
3, 73, 1155-1164). Clone # 161A Using this plasmid, 1 × 10 7 # 161 cells were subjected to electroporation under the above conditions. From the next day, drug selection using puromycin was performed at a concentration of 1 μg / ml for 2 days, and replaced with a culture solution containing no drug.
On the day, individual clones were isolated and PCR (primer / 5'-CC
AGGTCTTCAGATTTATTGTGCTTTTGTC-3 ′; (SEQ ID NO: 3),
5′-AGGGTCAGTTACAGAGTGGAGATTTTGAGC-3 ′; (SEQ ID NO: 4), clone # 161A lacking PGK-neo identified under the conditions (35 cycles of 1 minute at 94 ° C., 1 minute at 60 ° C., and 1 minute at 68 ° C.) did.・ For clone # 161A-1 # 161A, the same targeting construct was introduced again by electroporation,
The clone # 161A-1 inserted into the other chromosome was selected.・ Clone # 161A-1-1 The PGK-neo was further removed from this clone by transient expression of Cre protein, and clone # 161A-1-1 having one loxP on both chromosomes was obtained. Obtained.
【００７２】［２：変異型PGK-neo遺伝子のFas ligand
遺伝子座への導入］Fas ligand遺伝子は第一染色体上に
あり、kappa-opioid receptor遺伝子よりもテロメア側
にある。そのため染色体間での組換えを検討するのに適
した遺伝子座であり、loxP配列をkappa-opioid recepto
rにもつ細胞に対し、この遺伝子座へ１コピーの変異型n
eo遺伝子を導入した。図４ないし図７に、変異型PGK-ne
o遺伝子をFas ligand遺伝子座へ挿入するためのターゲ
ッティングコンストラクトの作製方法を示す。[2: Fas ligand of mutant PGK-neo gene
Introduction to gene locus] The Fas ligand gene is on the first chromosome and is located on the telomere side of the kappa-opioid receptor gene. Therefore, it is a locus suitable for studying recombination between chromosomes, and the loxP sequence is kappa-opioid recepto
For cells with r, one copy of the mutant n
The eo gene was introduced. FIGS. 4 to 7 show the mutant PGK-ne
o Shows a method for preparing a targeting construct for inserting a gene into the Fas ligand locus.
【００７３】（１）pE/S-DTA neoの作製（図４） マウスゲノムライブラリーから論文（Takahashi et a
l., 1994, Cell, 76, 969-976）と同様の方法にて得ら
れたクローン（λMFL17）を、Sal Iで切り出しpBSIIのS
al Iサイトへサブクローニングした（pMFL17）。このプ
ラスミドをSal IとSac Iで切り出し断片化したものを精
製しておき、そのDNAをEcoR Iで部分切断して得た約9.1
Kbの断片をEcoR IとSal Iで切断したpBS IIへ挿入した
（pE/S）。pBL-DTA（Adachi et al., 1995, Nat.Gene
t., 11, 294-300）からXho I、Sal Iで切り出してDTA遺
伝子を断片化したものを、Sal Iで切断後脱リン酸化処
理したpE/Sへ挿入し、これをpE/S-DTAとした。(1) Preparation of pE / S-DTA neo (FIG. 4) A paper (Takahashi et a
l., 1994, Cell, 76, 969-976), a clone (λMFL17) obtained in the same manner as described above was cut out with Sal I, and pBSII S
It was subcloned into the alI site (pMFL17). This plasmid was excised and fragmented with Sal I and Sac I, purified, and the DNA was partially digested with EcoR I to obtain about 9.1.
The Kb fragment was inserted into pBSII cut with EcoR I and Sal I (pE / S). pBL-DTA (Adachi et al., 1995, Nat.Gene
t., 11, 294-300), the fragment of the DTA gene cut out with Xho I and Sal I was inserted into pE / S, which had been cut with Sal I and dephosphorylated, and then inserted into pE / S-. DTA was used.
【００７４】pE/S-DTAのゲノムDNAに対してDTA遺伝子と
は逆側にあるSma Iサイトへ、pPNT（Tybulewicz et a
l., 1991, Cell, 65, 1153-1163）からXho I、BamH Iで
切り出し平滑化した変異型PGKneo遺伝子を挿入し、これ
をpE/S-DTA neoとした。pPNTベクター内のPGKneo遺伝子
に変異があることはシークエンスにて確認した（Yenofs
ky et al., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87, 3435-
3439）。The pPNT (Tybulewicz et a) was transferred to the SmaI site on the opposite side of the genomic DNA of pE / S-DTA from the DTA gene.
l., 1991, Cell, 65, 1153-1163), and inserted a mutant PGKneo gene which was excised and smoothed with XhoI and BamHI and used as pE / S-DTA neo. It was confirmed by sequencing that the PGKneo gene in the pPNT vector had a mutation (Yenofs
ky et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3435-
3439).
【００７５】（２）EGFP遺伝子のエクソン１への挿入 pE/S-DTA neoベクターを用いてターゲッティングベクタ
ーを作製するが本来の目的とは無関係に、FasL蛋白に外
来性のEGFP蛋白が融合するようにFasL遺伝子を改変し
た。FasL遺伝子のエクソン１に蛋白をコードする配列を
変化させないようにEGFP遺伝子が挿入されているものを
使用しており、以下にそのEGFP遺伝子の挿入方法を記載
する。 ・Age I-fragmentの作製（図５） マウスFasL遺伝子のcDNAがプラスミドに挿入されている
pEFW4F（Suda et al.,Journal of Immunology, 1996, 1
57, 3918-3924）を用い、翻訳開始コドン（ATG）から終
止コドンまでが切り出されるようにBau I（Takara）で
切り出し平滑化した断片を作製した。FasL遺伝子がコー
ドする蛋白とEGFP遺伝子がコードする蛋白が３塩基の倍
数でつながるように、pEGFP-C3（Clonetech）をSma Iで
切断後脱リン酸化処理したプラスミドへcDNAの断片を挿
入した（pEGFP FasL）。そしてその後のコンストラクト
の作製で邪魔になるマルチクローニングサイト（MCS）
を削除するため、pEGFP FasLをMCS内にあるSca IとKpn
Iで切断後、平滑断端にし、ライゲーションをした（pEG
FP FasL δMCS）。このベクターをAge Iで切断すればFa
sLのエクソン１の5'側にEGFPがつながれた配列が切り出
される（Age I-fragment）。 ・p17-5GFPの作製（図６） pMFL17をSac I、EcoR Iで切断した断片を、Sac I、EcoR
Iで切断したpPB IIへ挿入しpMFL17-5を得た。pMFL17-5
をSac I、Age Iで切断しベクター側を精製したものに
（pMFL17-5S/A vector）、pMFL17に対してPCR反応をし
た産物（S/A-PCR-product）をSac IとAge Iで切断し挿
入した（p17δATGmut）。このp17δATGmutは翻訳開始コ
ドン（ATG）からその下流のAge Iサイトまでを欠損させ
てあり、EGFPを結合させたエクソン１の5'側（Age I-fr
agment）を挿入すると、EGFPの翻訳開始コドンが代わり
に用いられることになる。PCRのプライマーはpMFL17のS
ac Iサイトからエクソン１内のATGの１塩基手前までの
配列にAge Iの配列をつないだものに設計した。ところ
が、S/A-PCR-fragmentにはEcoR IからAge Iまでの間にP
CR反応に伴う予想外の変異が導入されていたため、p17
δATGmut作製後にその周囲を入れ替えた。p17δATGをSa
c I、EcoR Vで切断し断片化させ、再度S/A-PCR-product
（wt）をEcoR V、Age Iで切断し断片化したものをpMFL1
7-5S/A vectorにもう一度挿入した（p17-5δATG）。p17
-5δATGをAge Iで切断後脱リン酸化処理したものに、Ag
e I-fragmentを挿入した（p17-5GFP）。(2) Insertion of EGFP gene into exon 1 A targeting vector is prepared using the pE / S-DTA neo vector, but regardless of the original purpose, the exogenous EGFP protein is fused to the FasL protein. The FasL gene was modified. An EGFP gene inserted into the exon 1 of the FasL gene so as not to change the sequence encoding the protein is used. The method of inserting the EGFP gene is described below. -Preparation of Age I-fragment (Fig. 5) cDNA of mouse FasL gene is inserted into plasmid
pEFW4F (Suda et al., Journal of Immunology, 1996, 1
57, 3918-3924), and a fragment cut out and smoothed with Bau I (Takara) so as to cut out from the translation initiation codon (ATG) to the termination codon was prepared. In order that the protein encoded by the FasL gene and the protein encoded by the EGFP gene would be linked by a multiple of 3 bases, the cDNA fragment was inserted into a plasmid that had been digested with pEGFP-C3 (Clonetech) and then dephosphorylated (pEGFP). FasL). And the multiple cloning site (MCS) that gets in the way of subsequent construction
To remove pEGFP FasL from Sca I and Kpn in MCS
After cutting with I, the ends were blunted and ligated (pEG
FP FasL δMCS). If this vector is cut with Age I, Fa
A sequence in which EGFP is linked to the 5 'end of exon 1 of sL is cut out (Age I-fragment). Preparation of p17-5GFP (FIG. 6) A fragment obtained by cutting pMFL17 with Sac I and EcoR I was converted into Sac I and EcoR.
It was inserted into pPBII cut with I to obtain pMFL17-5. pMFL17-5
Was digested with Sac I and Age I, the vector side was purified (pMFL17-5S / A vector), and the product obtained by PCR reaction with pMFL17 (S / A-PCR-product) was digested with Sac I and Age I. It was cut and inserted (p17δATGmut). This p17δATGmut is deleted from the translation initiation codon (ATG) to the downstream Age I site, and is 5 ′ side of exon 1 (Age I-fr
Insertion of an E. agment would cause the translation initiation codon of EGFP to be used instead. PCR primers are pMFL17 S
The sequence was designed so that the sequence of Age I was linked to the sequence from the ac I site to one base before ATG in exon 1. However, S / A-PCR-fragment contains P between EcoR I and Age I.
P17 because of unexpected mutation introduced by CR reaction
After the production of δATGmut, the surrounding area was replaced. p17δATG to Sa
c Cut with I, EcoR V to fragment, and re-perform S / A-PCR-product
(Wt) was cut with EcoR V and Age I and fragmented to obtain pMFL1
It was inserted again into the 7-5S / A vector (p17-5δATG). p17
-5δATG was digested with Age I and then dephosphorylated,
eI-fragment was inserted (p17-5GFP).
【００７６】（３）Fas ligand遺伝子座へのターゲッテ
ィングコンストラクトの作製及び細胞内への導入（図
７） この結果、p17-5GFPはEGFPをFas ligand（FasL蛋白）の
5'側に融合蛋白としてもつ。p17-5GFPをEcoR Iで切断後
平滑化しSac Iで切断した断片をpE/S-DTA neoをNot Iで
切断後平滑化し、Sac Iで切断したものに挿入し、ター
ゲッティングベクターを作製した。(3) Preparation of targeting construct to Fas ligand gene locus and introduction into cells (FIG. 7) As a result, p17-5GFP converted EGFP from Fas ligand (FasL protein).
It has a fusion protein on the 5 'side. p17-5GFP was digested with EcoRI, blunted, and the fragment digested with SacI was cut into pE / S-DTA neo with NotI, blunted, and inserted into the fragment digested with SacI to prepare a targeting vector.
【００７７】前述［１−３］で得られたloxPを持つ細胞
とloxPを持たない細胞に対して、このターゲッティング
コンストラクトをSac Iで切断したものを導入しFas lig
and遺伝子内に変異型PGK-neoをもつ細胞を得た。このと
きのクローンを（loxP+／PGK-neo+）、（loxP−／PGK-n
eo+）とする。以下の実験はこのクローンを用いて行っ
た。To the cells having loxP and the cells not having loxP obtained in the above [1-3], the targeting construct cut with SacI was introduced, and Faslig was obtained.
And cells with mutant PGK-neo in the gene were obtained. The clones at this time were (loxP + / PGK-neo +) and (loxP− / PGK-n
eo +). The following experiments were performed using this clone.
【００７８】［３：Cre蛋白質を恒常的に発現する細胞
の単離］さらに染色体間組換えを起こすために、作製し
たクローンにCre蛋白質を恒常的に発現させた。PGKプロ
モーターの下流にCre遺伝子をつなぎ、その下流にIRES
（internal ribosome entry site）-puro遺伝子をつな
いだベクター（PGK-Cre-IRES-Puro）を作製した。この
プラスミドを細胞へトランスフェクション法にて導入
し、長期間のPuromycin耐性のあるクローンを選択する
と、恒常的にCre蛋白を発現するクローンが得られる。
以下にPGK-Cre-IRES-Puroの作製方法を記述する（図
８）。[3: Isolation of Cells Constitutively Expressing Cre Protein] To further cause interchromosomal recombination, the clones thus produced were made to express the Cre protein constantly. The Cre gene is connected downstream of the PGK promoter, and the IRES
A vector (PGK-Cre-IRES-Puro) linked to (internal ribosome entry site) -puro gene was prepared. When this plasmid is introduced into cells by a transfection method and a clone having long-term Puromycin resistance is selected, a clone that constantly expresses the Cre protein can be obtained.
The method of preparing PGK-Cre-IRES-Puro is described below (FIG. 8).
【００７９】プロモーターとポリA付加シグナルの欠如
したCre遺伝子がpBS IIのサイトに挿入されているプラ
スミド（Tarutani et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1
997, 94, 7400-7405）のXho IサイトにpPGK-puro（前
述）ベクターからSal IとXho Iで切り出したPGKプロモ
ーターを挿入した（PGK-Cre in pBS II）。pIRES-puro
ベクター（Clonetech）をXho Iで切断後平滑化し、Not
Iで切り出した断片を、Sac IIで切断後平滑化しNot Iで
切り出したPGK-Cre in PBS IIへ挿入した（PGK-Cre-IRE
S-Puro）。A plasmid in which the Cre gene lacking the promoter and the polyA addition signal is inserted into the pBS II site (Tarutani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1
997, 94, 7400-7405), the PGK promoter cut out from the pPGK-puro (described above) vector with Sal I and Xho I was inserted into the Xho I site (PGK-Cre in pBS II). pIRES-puro
Vector (Clonetech) was cut with XhoI, blunted, and Not
The fragment cut out with I was inserted into PGK-Cre in PBS II cut out with Not I, blunted after cutting with Sac II (PGK-Cre-IRE).
S-Puro).
【００８０】このプラスミドを（loxP+／PGK-neo+）、
（loxP−／PGK-neo+）の細胞へリポフェクション法にて
導入（TransFast:Promega）し、8~10日後にpuromycin耐
性（1μg/ml）のクローンを得、レポータープラスミド
（Kawamoto et al., FEBS Letter, 2000, 470, 263-26
8）を導入することによりCre蛋白の発現を確認した。こ
れを（loxP+／Cre+）、（loxP−／Cre+）とする。この
時pPGK-Puroベクターも同時に導入しCre蛋白を発現しな
いクローンを得、コントロールとした（loxP+／Cre
−）。This plasmid was replaced with (loxP + / PGK-neo +)
(LoxP- / PGK-neo +) was introduced into cells by lipofection method (TransFast: Promega), and after 8 to 10 days, a puromycin-resistant (1 μg / ml) clone was obtained, and a reporter plasmid (Kawamoto et al., FEBS Letter) was obtained. , 2000, 470, 263-26
The expression of Cre protein was confirmed by introducing 8). These are (loxP + / Cre +) and (loxP− / Cre +). At this time, a pPGK-Puro vector was also introduced at the same time, and a clone that did not express the Cre protein was obtained and used as a control (loxP + / Cre
-).
【００８１】［４：結果］上述のクローン（loxP+／Cre
+）5個、（loxP+／Cre−）4個、（loxP−／Cre+）2個を
数回の継代後、2×106/100mm dishの細胞濃度で播種
し、高濃度薬剤選択（G418 750μg/ml）を行った。9か
ら10日目に固定、染色を行い耐性クローン数を数えた
（図９a）。一部のクローンについてはコロニーを単離
し、PGK-neo遺伝子が両アレルに存在するかをPCR法及び
サザンブロット法にて確認を行った（図９b）。結果と
してCre蛋白が発現しかつloxP配列を持つクローン群
は、Cre蛋白質の発現していないクローン群とloxPを持
たないクローン群に対し高濃度耐性クローンが高効率で
獲得できることが示され、Cre／loxPに依存して両アレ
ルへの変異が誘導されていると考えられる。[4: Result] The above clone (loxP + / Cre
+) 5, (loxP + / Cre-) 4 pieces, (oxP-/ Cre +) after several passages two were seeded at a cell concentration of 2 × 10 6 / 100mm dish, high concentration drug selection (G418 750 μg / ml). On days 9 to 10, the cells were fixed and stained, and the number of resistant clones was counted (FIG. 9a). For some clones, colonies were isolated and the presence of the PGK-neo gene in both alleles was confirmed by PCR and Southern blotting (FIG. 9b). As a result, the clone group expressing the Cre protein and having the loxP sequence showed that high-concentration resistant clones could be obtained with high efficiency relative to the clone group not expressing the Cre protein and the clone group not having the loxP. Mutations to both alleles are considered to be induced depending on loxP.
【００８２】[0082]
【発明の効果】本発明によれば、遺伝子の機能解明のた
めに有用な両染色体への変異導入法を提供することがで
きる。According to the present invention, a method for introducing mutation into both chromosomes, which is useful for elucidating the function of a gene, can be provided.
【００８３】また、本発明の方法を用いることにより、
両染色体へ変異が導入された細胞または高等生物体モデ
ルの供給が容易になる。Further, by using the method of the present invention,
It becomes easy to supply a cell or a higher organism model in which mutations have been introduced into both chromosomes.
【００８４】更に、本発明の方法を用いて変異が導入さ
れた細胞または高等生物体モデルは、遺伝子の機能の解
明を効率よく行うためのツールとしてきわめて有用であ
る。Furthermore, a cell or higher organism model into which a mutation has been introduced using the method of the present invention is extremely useful as a tool for efficiently elucidating the function of a gene.
【００８５】本発明によれば、遺伝子解明上有用な、特
定遺伝子の機能を欠損した細胞または高等生物体を得る
ことが可能である。こうした細胞または高等生物体につ
いて、変異が導入された遺伝子座と欠損した機能とを調
べることにより、特定の遺伝子が特定の機能に関与して
いたかどうかを確認することができる。According to the present invention, it is possible to obtain cells or higher organisms deficient in the function of a specific gene, which are useful in elucidating genes. By examining such cells or higher organisms for the locus in which the mutation has been introduced and the defective function, it can be determined whether or not a specific gene is involved in a specific function.
【００８６】本発明においてloxP配列を導入する際に遺
伝子ターゲッティング法を用いた場合、該部位から組換
えが起こることが分かっているため、組換え後の染色体
についてどの部位から組換えが起こったかを調べる必要
がない。In the present invention, when the gene targeting method is used to introduce the loxP sequence, it is known that recombination occurs from the site. No need to check.
【００８７】本発明の一実施態様によれば、マウスES細
胞第１番染色体のセントロメアの一番近傍にloxP配列を
挿入し、変異を任意に導入することにより、組換えの結
果、広範囲な領域内に変異をもつ染色体を得られる。変
異の範囲が広範囲である程、両染色体に変異をもつ変異
体が多数得られる可能性が高いため、結果として、変異
の原因となっている未知遺伝子の機能を解明する可能性
が広がる。According to one embodiment of the present invention, the loxP sequence is inserted into the nearest neighbor of the centromere of mouse ES cell chromosome 1, and a mutation is arbitrarily introduced, whereby a wide region is obtained as a result of recombination. Chromosomes with mutations within can be obtained. The wider the range of mutation, the greater the possibility of obtaining a large number of mutants having mutations on both chromosomes, and as a result, the possibility of elucidating the function of the unknown gene causing the mutation is expanded.
【００８８】本発明の一実施態様によると、loxPをもち
Creを発現しないクローン或いはloxPをもたないCre発現
クローンと比較して、loxPをもつCre発現クローンにつ
いては高濃度薬剤耐性コロニーを10〜50倍の高効率で獲
得できるので、従来およそ10万分の1であった両染色体
変異導入の効率をおよそ100倍の1000分の1近くに向上さ
せる効果が見出される。According to one embodiment of the present invention,
Compared to a clone that does not express Cre or a Cre expression clone that does not have loxP, a high concentration of drug-resistant colonies can be obtained with a 10-50-fold higher efficiency for Cre-expressing clones that have loxP. The effect is found to improve the efficiency of mutagenesis of both chromosomes, which was 1, to nearly one-hundredth, a factor of 100.
【００８９】本発明によれば、用いる高等生物体の病原
性に関わる蛋白質をコードする遺伝子に変異を導入で
き、かつ変異が両染色体へ導入できる。遺伝子の機能が
同定されれば、該遺伝子或いは該遺伝子がコードする蛋
白質を用いて、遺伝子発現やタンパク質機能を調節でき
る治療薬をスクリーニングすることができる。According to the present invention, a mutation can be introduced into a gene encoding a protein involved in the pathogenicity of a higher organism used, and the mutation can be introduced into both chromosomes. If the function of a gene is identified, a therapeutic agent capable of regulating gene expression or protein function can be screened using the gene or the protein encoded by the gene.
【００９０】さらに、本発明によれば、特定の遺伝子機
能が喪失ないし低下しておりその結果表現型が変化した
疾患動物モデルを容易に得ることができ、医学、薬学な
どの分野における実験動物として極めて有用である。Further, according to the present invention, a disease animal model in which a specific gene function has been lost or reduced and the phenotype has changed as a result can be easily obtained, and it can be used as an experimental animal in the fields of medicine, pharmacy and the like. Extremely useful.
【００９１】本発明の一実施態様として、Creリコンビ
ネースの発現を制御することにより、標的遺伝子の変異
を任意な場所および時間において両染色体へ導入するこ
とが可能である。As one embodiment of the present invention, by controlling the expression of Cre recombinase, it is possible to introduce a mutation in a target gene into both chromosomes at any location and at any time.
【００９２】本発明の一実施態様として、高等生物体に
おいて臓器或いは組織特異的にCreリコンビネースを発
現できるよう制御すれば、挿入された変異を臓器或いは
組織特異的に両染色体へ導入するシステムを構築し得
る。As an embodiment of the present invention, a system for introducing the inserted mutation into both chromosomes in an organ or tissue-specific manner is constructed by controlling the expression of Cre recombinase in an organ or tissue in a higher organism. I can do it.
【００９３】[0093]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KANSAI TLO Co., ltd. <120> Method for insertion of mutation in both alleles applying recombin ase system and a method for clarifying gene function. <130> 25F00JP <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 1 gttactaagg ttcctgtgtc tgcatgacct 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 2 tagtgagacg tgctacttcc atttgtcacg 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 3 ccaggtcttc agatttattg tgcttttgtc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 4 agggtcagtt acagagtgga gattttgagc 30[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> KANSAI TLO Co., ltd. <120> Method for insertion of mutation in both alleles applying recombinase system and a method for clarifying gene function. <130> 25F00JP <140> <141> < 160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 1 gttactaagg ttcctgtgtc tgcatgacct 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 2 tagtgagacg tgctacttcc atttgtcacg 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 3 ccaggtcttc agatttattg tgcttttgtc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 4 agggtcagtt acagagtgga gattttgagc 30
【図１】本発明の１実施態様として、loxP（黒いバンド
で表わされる）と Creを組み合わせた両染色体への変異
導入フローを示す概略図である。相同染色体の対応する
両位置にloxP配列を有するES細胞（ES cell）を得る。
得られた細胞について変異を誘発し（mutagenesis）、
一方の染色体上に変異（mutation）を導入する。これら
の細胞にCre蛋白質を導入すると、DNAの複製（DNArepli
cation）時にCre蛋白質が働いた場合、loxP導入部位を
起点に組換えを起こす。染色体分離及び細胞分裂（chro
mosomal segregation and cell division）の結果、変
異なし（no mutation）の細胞及び両アレルに変異を有
する細胞（mutation in both alleles）が得られる。FIG. 1 is a schematic diagram showing a flow of mutagenesis into both chromosomes by combining loxP (represented by a black band) and Cre as one embodiment of the present invention. An ES cell having a loxP sequence at both corresponding positions of a homologous chromosome is obtained.
Mutagenesis is induced in the obtained cells,
A mutation is introduced on one chromosome. When Cre protein is introduced into these cells, DNA replication (DNArepli
If the Cre protein works during cation), recombination occurs from the loxP introduction site. Chromosome segregation and cell division (chro
As a result of mosomal segregation and cell division, cells without mutation (no mutation) and cells having mutations in both alleles (mutation in both alleles) are obtained.
【図２】実施例１において用いられたターゲッティング
コンストラクト及びその導入を示す説明図である。図２
ａは、kappa-opioid receptor遺伝子座へのloxP配列の
挿入を示す説明図である。２つのloxP配列で挟まれたPG
K-neo遺伝子を含むターゲッティングベクター（Vecto
r）を相同性組換えにより野生型（Wt）のKappa-opioid
receptor遺伝子座のイントロン１に挿入した（Targete
d）。Cre蛋白質の一過性発現によりPGK-neo遺伝子を欠
損させ、１つのloxP配列のみにした（Single loxP）。
同様の方法を繰り返すことにより、もう一方の染色体に
もloxP配列を１つ挿入した（Double loxP）。両染色体
にloxPが挿入されたことはサザンブロット法により確認
された（右写真）。左から２番目のTargetedレーンにお
いては、２つのloxP配列で挟まれたPGK-neo遺伝子が導
入されたことを示す13.5kbのバンドが見られる。Single
loxPレーンにおいては、Creの作用により組換えが起こ
りPGK-neo遺伝子が除去され、左図Single loxPのように
loxP配列が１つになったことを示す11.5kbのバンドがみ
られる。Second targetedレーンにおいては、一方の染
色体上には１つのloxPが導入され（11.5kb）、もう一方
には２つのloxP配列が導入されていることを示す（13.5
kb）２つのバンドが確認される。また、５番目のDouble
loxPレーンには、11.5kbのシングルバンドが見られる
ことから、loxP配列が両染色体上に１つずつ挿入された
ことが確認される。図２ｂは、変異型neo遺伝子（＊印
で示す）の相同組換えによるFas ligand遺伝子座への導
入を示す説明図である。両染色体にneoが挿入されたこ
とはサザンブロット法により確認された（右写真）。左
のWtレーンには7.0kbのバンドのみが見られるが、右のT
argetedレーンには、GFP及びPGK-neo遺伝子が挿入され
たことを示す9.2kbのバンドが確認される。（Wt, 野生
型; Ex, エクソン; B, 制限酵素BamHI; E, 制限酵素
EcoRI; S,制限酵素SpeI; Sc, 制限酵素SacI; SI, 制
限酵素SalI; HSV-tk, チミジンカイネース遺伝子; DT
-A, ジフテリアトキシン遺伝子）FIG. 2 is an explanatory diagram showing the targeting construct used in Example 1 and its introduction. FIG.
a is an explanatory diagram showing insertion of a loxP sequence into the kappa-opioid receptor locus. PG sandwiched between two loxP sequences
A targeting vector containing the K-neo gene (Vecto
r) by homologous recombination to wild-type (Wt) Kappa-opioid
inserted into intron 1 of the receptor locus (Targete
d). The PGK-neo gene was deleted by transient expression of the Cre protein, leaving only one loxP sequence (Single loxP).
By repeating the same method, one loxP sequence was inserted into the other chromosome (Double loxP). The insertion of loxP into both chromosomes was confirmed by Southern blotting (right photo). In the second Targeted lane from the left, a 13.5 kb band indicating that the PGK-neo gene sandwiched by the two loxP sequences has been introduced is seen. Single
In the loxP lane, recombination occurs due to the action of Cre, and the PGK-neo gene is removed, as shown in the left figure Single loxP.
There is a 11.5 kb band indicating that the loxP sequence has become one. In the second targeted lane, one loxP was introduced on one chromosome (11.5 kb), and two loxP sequences were introduced on the other chromosome (13.5 kb).
kb) Two bands are confirmed. The fifth Double
Since a single band of 11.5 kb is observed in the loxP lane, it is confirmed that the loxP sequence was inserted one by one on both chromosomes. FIG. 2b is an explanatory diagram showing the introduction of a mutant neo gene (indicated by an asterisk) into the Fas ligand locus by homologous recombination. Neo insertion into both chromosomes was confirmed by Southern blotting (right photo). Only the 7.0 kb band can be seen in the left Wt lane, while the right T
A 9.2 kb band indicating that the GFP and PGK-neo genes have been inserted is confirmed in the argeted lane. (Wt, wild type; Ex, exon; B, restriction enzyme BamHI; E, restriction enzyme
EcoRI; S, restriction enzyme SpeI; Sc, restriction enzyme SacI; SI, restriction enzyme SalI; HSV-tk, thymidine kinase gene; DT
-A, diphtheria toxin gene)
【図３】Kappa-opioid receptor遺伝子座へloxP配列を
挿入するためのターゲッティングコンストラクトの作製
方法を示す。図３において、Kappa-opioid receptorの
ターゲッティングコンストラクトは、Creタンパク質を
利用して染色体の組換えを誘発するためのloxP配列（順
向きの２つの三角で示される）、マーカー遺伝子neo発
現を制御するPGKプロモーター(PGK)、細胞レベルでloxP
配列を導入する際の薬剤耐性マーカーNeo（ネオマイシ
ン耐性遺伝子）、及び相同性組換えが起こらなかったも
のを除外するためのチミジンカイネース（Tk）遺伝子を
含む。FIG. 3 shows a method for preparing a targeting construct for inserting a loxP sequence into a Kappa-opioid receptor locus. In FIG. 3, the targeting construct of the Kappa-opioid receptor is a loxP sequence (indicated by two forward triangles) for inducing chromosome recombination using the Cre protein, and a PGK that controls the expression of the marker gene neo. Promoter (PGK), loxP at the cellular level
Includes a drug resistance marker Neo (neomycin resistance gene) when introducing a sequence, and a thymidine kinase (Tk) gene to exclude those in which homologous recombination has not occurred.
【図４】pE/S-DTA neoの作製方法を示す。図４におい
て、pE/S-DTA neoは、変異型PGKneo遺伝子およびDTA遺
伝子フラグメントを含む。FIG. 4 shows a method for producing pE / S-DTA neo. In FIG. 4, pE / S-DTA neo contains a mutant PGKneo gene and a DTA gene fragment.
【図５】EGFP遺伝子のエクソン１への挿入に関して、Ag
e I-fragmentの作製方法を示す。FIG. 5: Ag insertion for exon 1 of EGFP gene.
The method for producing eI-fragment is shown.
【図６】EGFP遺伝子のエクソン１への挿入に関して、p1
7-5GFPの作製方法を示す。FIG. 6: p1 for insertion of EGFP gene into exon 1.
The method for producing 7-5GFP will be described.
【図７】Fas ligand遺伝子座への最終ターゲッティング
コンストラクトの作製方法を示す。FIG. 7 shows a method for preparing a final targeting construct for the Fas ligand locus.
【図８】PGK-Cre-IRES-Puroベクターの作製方法を示
す。図３においてPGK-Cre-IRES-Puroベクターは、PGKプ
ロモーター(PGK)、Cre遺伝子、puromycinに対する薬剤
耐性遺伝子puromycin-N-acetyl-transferase（puro）を
持つベクターを含む。このプラスミドをFas ligand遺伝
子内に変異型PGK-neoをもつ細胞へトランスフェクショ
ン法にて導入し、長期間のPuromycin耐性のあるクロー
ンを選択すると、恒常的にCre蛋白を発現するクローン
が得られる。FIG. 8 shows a method for preparing a PGK-Cre-IRES-Puro vector. In FIG. 3, the PGK-Cre-IRES-Puro vector includes a vector having a PGK promoter (PGK), a Cre gene, and a drug resistance gene puromycin-N-acetyl-transferase (puro) for puromycin. When this plasmid is introduced into a cell having a mutant PGK-neo in the Fas ligand gene by a transfection method, and a clone having long-term Puromycin resistance is selected, a clone that constantly expresses the Cre protein is obtained.
【図９】Cre/loxPによる両染色体変異誘導の結果を示す
図である。図９ａの結果から、Cre/loxP両存在下（loxP
+/Cre+）では、高濃度G418耐性コロニーの獲得数が、lo
xP+/Cre- もしくはloxP-/Cre+ の場合に比べて10〜50
倍増加することが明らかとなった。100mm径dishに200万
個の細胞を播種し10日間750μg/mlのG418で選択した。l
oxPもしくはCreの存在は図の下に示される。Creの発現
はレポータープラスミドにて確認した。このレポーター
プラスミドは、プロモーターとGFP遺伝子の間に２つのl
oxP配列が介在してあり、Cre蛋白質によりloxP配列が欠
損しGFP遺伝子が発現するようになる。※印で示すES細
胞クローンは他のクローンに比べてCre蛋白の発現が弱
いものでありG418耐性コロニー数も減少していることが
示される。この実験は２回の独立した実験（exp1、2）
により検証された。図９ｂは、高濃度耐性クローンのFa
s ligand遺伝子座を、サザンブロット法により検証した
結果である。A-1からA-10のクローンとB-1からB-10のク
ローンはそれぞれ図９ａに示すAとBの耐性コロニーから
のものであり、サザンブロット法の条件は図２ｂと同様
の方法を用いた（Wt, 野生型ES細胞; +/-, Fas ligand
遺伝子座において一方の染色体のみに変異型neo遺伝子
が挿入されているヘテロ細胞）。上下写真の一番左のWt
レーンには7.0kbのバンドのみが見られるが、A-1ないし
A-10レーンには、GFP及びPGK-neo遺伝子が挿入されたこ
と（Targeted）を示す9.2kbのバンドをもつクローンがB
群に比してより高効率にみられた。また、B-1ないしB-1
0レーンには、+/-と同様に7.0kb及び9.2kbの両方のバン
ドが多く確認された。Cre蛋白が発現しかつloxP配列を
持つクローン群は、Cre蛋白質の発現していないかloxP
配列を持たないクローン群に対し、高濃度耐性クローン
が高効率で獲得できることが示され、Cre／loxPに依存
して両アレルへの変異が誘導されていると考えられる。FIG. 9 is a view showing the results of induction of both chromosomes by Cre / loxP. From the results of FIG. 9a, it can be seen that both Cre / loxP (loxP
+ / Cre +), the number of high concentration G418 resistant colonies
10 to 50 compared to xP + / Cre- or loxP- / Cre +
It was found to increase twice. Two million cells were seeded on a 100 mm diameter dish, and selected with 750 μg / ml G418 for 10 days. l
The presence of oxP or Cre is shown below the figure. Cre expression was confirmed using a reporter plasmid. This reporter plasmid contains two ligations between the promoter and the GFP gene.
The oxP sequence is interposed, and the LoxP sequence is deleted by the Cre protein, resulting in the expression of the GFP gene. The ES cell clones indicated by * have weaker Cre protein expression than other clones, indicating that the number of G418-resistant colonies is also reduced. This experiment consists of two independent experiments (exp1,2)
Verified by FIG. 9b shows the high concentration resistant clone Fa.
This is the result of verifying the s ligand locus by Southern blotting. The clones A-1 to A-10 and the clones B-1 to B-10 were obtained from the resistant colonies A and B shown in FIG. 9a, respectively. Used (Wt, wild-type ES cells; +/-, Fas ligand
Heterocells in which a mutant neo gene is inserted into only one chromosome at the locus). The leftmost Wt of the top and bottom photos
Only a 7.0 kb band can be seen in the lane, but A-1 to
In the A-10 lane, a clone having a 9.2 kb band indicating that the GFP and PGK-neo genes were inserted (Targeted)
The efficiency was higher than that of the group. Also, B-1 to B-1
In lane 0, many bands of both 7.0 kb and 9.2 kb were confirmed similarly to +/-. The clones expressing the Cre protein and having the loxP sequence are those that do not express the Cre protein.
It was shown that high-concentration resistant clones could be obtained with high efficiency relative to a group of clones having no sequence, suggesting that mutations to both alleles were induced depending on Cre / loxP.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 1/25 Ｂ 15/00 Ｘ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 4B024 AA11 CA03 CA20 DA02 EA04 GA14 GA25 GA27 4B063 QA08 QQ07 QQ08 QQ09 QR01 QR76 QR77 QR78 QR80 4B065 AA90X AA90Y AA91X AB01 AC14 AC20 BA02 BA03 BA16 BA25 CA46 ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12Q 1/02 C12N 5/00 A 1/25 B 15/00 X F term (Reference) 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 4B024 AA11 CA03 CA20 DA02 EA04 GA14 GA25 GA27 4B063 QA08 QQ07 QQ08 QQ09 QR01 QR76 QR77 QR78 QR80 4B065 AA90X AA90Y AA91X AB01 AC14 AC20 BA02 BA03 BA16 BA25 CA46
Claims (7)
に変異を有する細胞または高等生物体モデル。1. A cell or higher organism model having a mutation in both chromosomes having a recombination recognition sequence.
はRSである請求項１に記載の細胞または高等生物体モデ
ル。2. The cell or higher organism model according to claim 1, wherein the recombination recognition sequence is loxP, FRT, or RS.
対の染色体を有し、かつ少なくとも一方の染色体に変異
が導入された増殖可能な細胞に、リコンビネースの供給
源を導入する工程； （２）得られた細胞について必要に応じて細胞分裂を誘
発するか或いは該細胞を培養して、細胞分裂時のリコン
ビネース認識配列間の組換えにより両染色体に変異を有
する細胞ないし高等生物体モデルを得る工程；を含む、
両染色体に変異を有する細胞ないし高等生物体モデルの
作製方法。3. A step of (1) introducing a source of recombinase into a proliferable cell having a pair of chromosomes having a recombinase recognition sequence and having at least one chromosome mutated therein; Inducing cell division or culturing the cells as necessary to obtain a cell or a higher organism model having mutations in both chromosomes by recombination between the recombination recognition sequences during cell division; including,
A method for producing a cell or higher organism model having mutations in both chromosomes.
対の染色体を有し、かつ少なくとも一方の染色体に変異
が導入された増殖可能な細胞について、必要に応じて細
胞分裂を誘発するか或いは該細胞を培養して、細胞分裂
を行う工程； （２）得られた細胞分裂時の細胞にリコンビネースの供
給源を導入し、リコンビネース認識配列間の組換えによ
り両染色体に変異を有する細胞ないし高等生物体モデル
を得る工程；を含む、両染色体に変異を有する細胞ない
し高等生物体モデルの作製方法。4. A proliferating cell having a pair of chromosomes having a recombination recognition sequence and having a mutation introduced into at least one chromosome, if necessary, induces cell division or, if necessary, induces cell division. (2) introducing a source of recombinase into the obtained cell at the time of cell division, and cells or higher organisms having mutations in both chromosomes due to recombination between the recombination recognition sequences. Obtaining a model; a method for producing a cell or higher organism model having mutations in both chromosomes.
ス蛋白質、リコンビネースDNA、リコンビネースRNA、リ
コンビネース遺伝子を含むプラスミド、リコンビネース
遺伝子を含むアデノウィルスベクター或いはリコンビネ
ース遺伝子を含むレトロウィルスベクターのうちのいず
れかである、請求項３又は４に記載の方法。5. The recombinase source is any one of a recombinase protein, a recombinase DNA, a recombinase RNA, a plasmid containing the recombinase gene, an adenovirus vector containing the recombinase gene, or a retrovirus vector containing the recombinase gene. 5. The method according to 3 or 4.
合わせが、リコンビネースCreと認識配列loxP、リコン
ビネースFlpと認識配列FRT、又はリコンビネースRと認
識配列RSからなる群から選ばれるいずれかである、請求
項３又は４に記載の方法。6. The combination of said recombinase and its recognition sequence is any one selected from the group consisting of recombinase Cre and recognition sequence loxP, recombinase Flp and recognition sequence FRT, or recombinase R and recognition sequence RS. 5. The method according to 3 or 4.
を有する増殖可能な細胞ないし高等生物体モデルの表現
型を調べ、該表現型と変異との関係から、遺伝子の機能
を調べる方法。7. A method for examining the phenotype of a proliferable cell or a higher organism model having mutations in both chromosomes according to claim 1 or 2, and examining the function of the gene from the relationship between the phenotype and the mutation. .
Priority Applications (1)
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| JP2000397404A JP2002191365A (en) | 2000-12-27 | 2000-12-27 | Method for mutation induction to double chromosome using recombination system |
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