JP2002173500A

JP2002173500A - ガン抑制因子、ガン抑制因子を発現増強させる方法、哺乳動物のガン抑制方法

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Publication number: JP2002173500A
Application number: JP2001072026A
Authority: JP
Inventors: Fumiyoshi Okano; 文義岡野
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2000-09-29
Filing date: 2001-03-14
Publication date: 2002-06-21
Anticipated expiration: 2021-03-14
Also published as: JP4734739B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】ガン細胞による抗腫瘍免疫からのエスケープを
解除し、ガン細胞の増殖を抑制する。【解決手段】イヌ由来の特定のアミノ酸配列もしくはそ
の一部であるアミノ酸配列を有するガン抑制因子を、イ
ンターロイキン１８及びインターロイキン１２によって
ガン細胞上に過剰発現させ、ガン細胞自身を死滅させ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ガン細胞上のガン
抑制因子をガン細胞自身に作用させ、生体に発生したガ
ンを縮小させることを目的とした、ガン抑制因子および
ガンの抑制方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＦａｓとＦａｓリガンド（以下ＦａｓＬ
と略記する）の相互作用は、免疫システムの制御、生体
組織のホメオスタシスの維持に必要である。ＦａｓＬは
活性化された免疫細胞上に存在し、ターゲットであるウ
イルス感染細胞などにアポトーシスを誘導して死滅させ
る能力を有する（文献１，２）。免疫細胞上のＦａｓＬ
はインターロイキン１８（以下ＩＬ１８と略記する）に
より、その発現が増強されることが知られている（文献
３）。また、ＩＬ１８は様々な生理活性において、イン
ターロイキン１２（以下ＩＬ１２と略記する）と相乗作
用を示すことが報告されている（文献４）。

【０００３】元来ＦａｓＬはＴ細胞、ＮＫ細胞およびＢ
細胞などリンパ球系の細胞にのみ発現していると考えら
れていたが、最近、ガン細胞など非リンパ球系の細胞に
も発現していることが報告されている（文献５）。

【０００４】ガン細胞表面上に発現するＦａｓＬは、ガ
ン細胞を攻撃する能力を持つ種々の免疫細胞がガン細胞
に接着する際、免疫細胞上のＦａｓに結合して、免疫細
胞を殺し、免疫からの攻撃をエスケープすることが知ら
れている（文献６）。従って、ガン細胞表面上のＦａｓ
Ｌの存在は、生体での抗腫瘍免疫にとって、不利益にな
ると考えられている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】遺伝子操作技術の進歩
により、抗腫瘍作用を有する様々なサイトカインの遺伝
子がクローニングされ、ガンに対する治療への応用が試
みられている。

【０００６】しかしながら、免疫からの攻撃をエスケー
プする作用を有するガン細胞は、サイトカインなどによ
って生体での抗腫瘍免疫を高めても、ガン抑制効果は期
待できない。また、ヒトと同様ペット、特にイヌにも、
乳腺腫瘍など多数の腫瘍が知られており、その治療薬お
よび治療方法の開発が求められている。

【０００７】従って、ガン細胞の免疫からの攻撃のエス
ケープ作用を解除する方法を見出すことができれば、ヒ
トをはじめ、動物のガン免疫治療の可能性が開かれるこ
とが期待される。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、かかる状況
に鑑み、イヌＦａｓＬのｃＤＮＡのクローニングおよび
それを用いたガン細胞の免疫細胞の攻撃からのエスケー
プ解除を目的とし、創意工夫を成し、イヌのｃＤＮＡか
らイヌＦａｓＬをコードする遺伝子をクローニングする
ことに成功し、またイヌＩＬ１８およびイヌＩＬ１２を
イヌ乳ガン細胞株に作用させることによって、ガン細胞
上のイヌＦａｓＬの発現が増強されることを見出し、更
にその発現増強が、ガン細胞自身にアポトーシスを引き
起こしてガン細胞を死滅させる現象を見出し、かくして
本発明を完成させるに至った。

【０００９】本発明は、イヌガン抑制因子、ＩＬ１８お
よびＩＬ１２を用いた、ガン細胞上のガン抑制因子の発
現増強方法、およびＩＬ１８およびＩＬ１２を用いて、
ガン細胞上のガン抑制因子の発現を増強することによ
る、哺乳動物に発生したガンの抑制方法に関する。

【００１０】すなわち、本発明は、「ガン細胞上に発現し、ガン細胞上のＦａｓに結合し
て、ガン細胞にアポトーシスを誘導するガン抑制因
子。」「以下の（ａ）または（ｂ）のガン抑制因子。（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含有するガ
ン抑制因子。（ｂ）（ａ）に記載されたアミノ酸配列において、１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された
アミノ酸配列を含有するガン抑制因子。」「上記のガン抑制因子をコードする遺伝子。」「インターロイキン１８をガン細胞に作用させることに
よる、ガン細胞上の上記ガン抑制因子を発現増強させる
方法。」「ガン細胞表面上に発現する上記ガン抑制因子を発現増
強することによる哺乳動物の生体に発生したガンの抑制
方法。」である。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のガン抑制因子は、ガン細
胞上に発現し、ガン細胞上のＦａｓに結合して、ガン細
胞にアポトーシスを誘導するものであり、好ましくは、
以下の（ａ）または（ｂ）のものである。（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含有するガ
ン抑制因子。（ｂ）（ａ）に記載されたアミノ酸配列において、１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された
アミノ酸配列を含有するガン抑制因子。

【００１２】本発明では、インターロイキン１８をガン
細胞に作用させることにより、ガン細胞上のガン抑制因
子を発現増強させることができる。このときに、インタ
ーロイキン１２を同時にガン細胞に作用させることによ
り、よりガン抑制因子を発現増強させることができる。

【００１３】この作用は、ガン細胞が、女性ホルモン依
存的に増殖するものである場合に、特に好ましく適応で
き、ガン細胞が乳ガン由来である場合に特に効果があ
る。インターロイキン１８およびインターロイキン１２
の処理は１０⁵個のガン細胞あたり、それぞれ１ｎｇか
ら１ｍｇ、１ｐｇから１００μｇの量で、１から２４時
間処理することで十分な効果が得られる。

【００１４】ガン細胞表面上に発現しているガン細胞上
のＦａｓに結合してガン細胞にアポトーシスを誘導する
ガン抑制因子を発現増強することにより、哺乳動物の生
体に発生したガンを抑制することができる。ガン抑制因
子を発現増強させるためには、好ましくは、インターロ
イキン１８をガン細胞に作用させる。さらに好ましく
は、インターロイキン１２を同時にガン細胞に作用させ
る。インターロイキン１８およびインターロイキン１２
の生体に発生したガン細胞への作用方法としては特に限
定はないが、好ましくは局所注射投与、手術による直接
投与、およびこれら遺伝子の腫瘍内導入などにより、特
に効果が期待される。

【００１５】本発明のガンの抑制方法は哺乳動物がイヌ
である場合に特に効果があり、その他、ウシ、ブタ、ネ
コにも適用できる。また、ガン細胞が女性ホルモン依存
的に増殖するものである場合に特に効果がある。さら
に、ガン細胞が乳ガン由来である場合に特に効果があ
る。

【００１６】本発明のイヌＦａｓＬをコードするＤＮＡ
は例えば次のようにして製造することができる。すなわ
ち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃ
ＤＮＡを合成し、マウスのＦａｓＬをコードする遺伝子
配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反
応（以下ＰＣＲと略す）を行うことにより、イヌＦａｓ
ＬｃＤＮＡをクローニングすることができる。さらに合
成したｃＤＮＡよりファージライブラリーを作製し、Ｐ
ＣＲによって得られた遺伝子断片とプラークハイブリダ
イゼーションを行うことにより、イヌＦａｓＬｃＤＮＡ
の全長をクローニングすることができる。

【００１７】イヌの細胞からＲＮＡを得る方法として
は、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖密
度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられ
る。上記イヌ細胞からＲＮＡを抽出する方法としては、
グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠
心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法
（文献８）バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼ
インヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノ
ール抽出を行う方法（文献９），グアニジン・チオシア
ネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシア
ネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネー
ト−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシ
アネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡ
を沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行う
ことができる。

【００１８】マイトージェンなどで刺激されたイヌ単核
球やリンパ球より通常の方法、例えば、塩化リチウム／
尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄ
Ｔセルロースカラム法等によりｍＲＮＡを単離し、得ら
れたｍＲＮＡから通常の方法、例えば、Ｇｕｂｌｅｒら
の方法（文献１０），Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（文
献１１）等によりｃＤＮＡを合成する。得られたｍＲＮ
ＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的にはトリ骨芽球
ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いるほか
１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用い
る方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクロ
ーニング用キットを用いるのが便利である。

【００１９】このｃＤＮＡを鋳型としてマウスやヒトの
塩基配列をもとにしたプライマーを用いてＰＣＲを行
い、さらに合成したｃＤＮＡをλファージベクターに連
結した後、インビトロでλファージのコート蛋白質など
と混合することによりパッケージングし、その生成され
たファージ粒子を宿主となる大腸菌に感染させる。この
際、λファージの感染した大腸菌は溶菌し、１個１個の
クローンがプラークとして回収される。このプラークを
ニトロセルロースなどのフィルターに移し、放射標識し
たＰＣＲで得た遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼ
ーションにより、イヌＦａｓＬｃＤＮＡをクローニング
することができる。

【００２０】イヌＦａｓＬは、以下の実施例で示すよう
に、イヌ乳ガン細胞に発現し、ＩＬ１８の処理によりそ
の発現が増強され、細胞にアポトーシスを誘導すること
によって特性化される。ＩＬ１８に加え、ＩＬ１２を処
理することによって、さらにその発現が増強される。

【００２１】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。

【００２２】実施例１イヌＦａｓＬのクローニング（１）イヌｃＤＮＡの調製イヌ末梢血由来リンパ球および種々のイヌ細胞株よりＩ
ＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて総ＲＮＡを
調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭエチレンジアミン
四酢酸（以下ＥＤＴＡと略記する）を含む１０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略記する）
に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１ＭＬｉＣｌ
を含むＴＥを同量加えた。０．５ＭＬｉＣｌを含むＴ
Ｅで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶
液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３
ＭＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％ドデ
シル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略記する）を含む２
ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを
用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した
０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）
ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１
８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌
水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベ
ートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭＫＣｌ溶液を
２μｌ，２５ｍＭＭｇＣｌ₂ を２μｌ，１０ｍＭｄ
ＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍジチオスレイトール
（以下ＤＴＴと略記する）を２μｌそれぞれ加え、４２
℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットの
ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ
ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベ
ートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１
５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間
置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉＲＮａｓ
ｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間
インキュベートした。

【００２３】（２）イヌＦａｓＬのｃＤＮＡクローニン
グヒトＦａｓＬの塩基配列（文献４）をもとに、５´ｃｃｔｔｇｇｔａｇｇａｔｔｇｇｇｃｃｔｇｇｇｇ
ａｔｇｔｔｔｃ３´（配列番号：２）と５´ａａｇａｃｔｃｔｃａｔｔｃａａｇａｃｃａｔｇｔ
ｔｃｔｃａｇｔ３´（配列番号：３）の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成
した。上記（１）のイヌ末梢血由来リンパ球から得られ
たｃＤＮＡを０．２ｍｌのマイクロ遠心チューブに２μ
ｌ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、
２５ｍＭＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌゼラチン、５０
μＭ各ｄＮＴＰ、４単位ＥｘＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼ（宝酒造（株）製）となるように各試薬を加え、
全量２０μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１
分、プライマーのアニーリング条件を６０℃、２分、プ
ライマーの伸長条件を７２℃、２分の各条件でＭＪＲ
ＥＳＥＲＣＨ社のＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＴｈｅｒ
ｍａｌＣｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用い、４０サイクル反
応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、
約５３０ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献１３）に従って
調製した。

【００２４】このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡＬｉｇａ
ｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２を用いて連結した。これ
を用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質
転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次
にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを
前述と同じ条件のＰＣＲによって確認し、蛍光ＤＮＡシ
ーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー
３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パ
ーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケ
ンシングキットを用いて、挿入したＤＮＡの塩基配列を
決定した。このイヌＦａｓＬをコードする配列を配列番
号：１に示す。

【００２５】実施例２イヌ乳ガン細胞株の樹立イヌ生体に発生した乳ガン組織を無菌的に切除し、３〜
５ｍｍの断片に刻み、ワイヤーメッシュに通した後、
０．１％コラゲナーゼ（シグマ社製）と０．００１％デ
オキシリボヌクレアーゼＩ（シグマ社製）を含むＭＥＭ
-Ｈａｎｋｓ培地（大日本製薬（株）製）で、３７℃、
２時間懸濁した。懸濁液を１０００ｒｐｍで１５分間遠
心後、上清を取り除き、ＥＲＤＦ培地（極東製薬（株）
製）で３回洗浄後、１０％牛胎児血清（ギブコ社製、以
下ＦＢＳと略記する）を含むＥＲＤＦ培地１０ｍｌで懸
濁し、９６穴マイクロプレートに１穴あたり１００μｌ
づつ添加して、５％ＣＯ₂、３７℃の条件で培養した。
２日おきに培地交換をし続けたところ、約２週間後、１
穴で無限に増殖する不死化細胞株を得た。本イヌ乳ガン
細胞株の倍化時間は約２０時間であった。本細胞株をＦ
ＣＢＲ１と名付けた。

【００２６】実施例３イヌＩＬ１８の調製特開2000-78975の配列番号：１の、活性型イヌＩＬ１８
タンパクをコードするＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−５Ｘ（フ
ァルマシアバイオテク社製）のＢａｍＨＩ切断部位に連
結した。これを用いて常法に従い大腸菌ＨＢ１０１を形
質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ
Ｂプレート上に生育するコロニーのうち１５個を１００
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ培地中で
８時間培養し、集めた菌体からプラスミドを抽出、精製
後、定法に従い、大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。得ら
れた形質転換体のシングルコロニーを１００μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地に植菌した。Ｏ
Ｄ６００が約０．７になるまで３７℃で培養し、終濃度
０．５ｍＭのイソプロピルーβ−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（ファルマシアバイオテク社製）を加えて、さら
に１．５時間培養した。培養液１．５ｍｌを１．５ｍｌ
のマイクロ遠心チューブに取り、１２０００ｒｐｍで５
分間遠心後、上清を捨て、１．５ｍｌの１０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ７．５）に懸濁し、氷上にてハンディーソニ
ックを用いて菌体を破砕した。２００００ｒｐｍで３０
分間遠心し、可溶性画分（上清）を得、０．２２μｍの
フィルターでろ過滅菌後、イヌＩＬ１８が生産された溶
液を得た。この画分をグルタチオンセファロースカラム
（ファルマシア社製）にアプライした。その溶出画分を
ファルマシア社製のＦａｃｔｏｒＸａを用いて切断
し、さらに同じカラムにアプライした。カラムに結合し
ない活性型イヌＩＬ１８タンパクを含む画分を回収し
た。こうして精製された活性型イヌＩＬ１８タンパクは
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によると、純度が９５％以上であ
った。また、ワコー社のリムルステストキットを用いた
解析によると、このタンパク１ｍｇ中にエンドトキシン
は全く検出されなかった。

【００２７】実施例４イヌＩＬ１２の調製特開平11-106350の配列番号：１、１１，２，１２に記
載の、イヌＩＬ１２を構成する、Ｐ４０およびＰ３５サ
ブユニットｃＤＮＡをバキュロウイルストランスファ
ーベクターｐＡｃＡＢ３（ファーミンジェン社製）のプ
ロモーター下流の制限酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩ切断
部位にそれぞれ常法に従って連結し、組換えトランスフ
ァーベクターを得た。さらにファーミンジェン社のバキ
ュロウイルストランスフェクションキットを用いてその
添付マニュアルに従って、組換えバキュロウイルスを作
製した。

【００２８】得られた組換えバキュロウイルスを、ファ
ーミンジェン社のバキュロゴールドＰｒｏｔｅｉｎ−Ｆ
ｒｅｅＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍで７５ｃｍ²のフ
ラスコでコンフルエントまで平面培養したＳｆ２１細胞
（ＳｐｏｎｄｏｐｔｅｒａＦｌｕｇｉｐｅｒｄａ由来、
ファーミンジェン社より入手）に感染させ、４日間培養
した後、イヌＩＬ１２が生産された培養上清を得た。培
養上清を、スルホプロピル担体（ファルマシアバイオテ
ク社製）を充填したカラムにアプライした後、十分量の
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：７）でカラムを洗浄し
た。３５０〜５５０ｍＭのＮａＣｌで溶出した画分を、
さらにブルーセファロース担体（ファルマシアバイオテ
ク社製）を充填したカラムにそれぞれアプライし、十分
量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：７）でカラムを洗浄
後、１．１〜１．２ＭのＮａＣｌで溶出した精製イヌＩ
Ｌ１２を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によると、イヌＩ
Ｌ１２の純度は、９５％以上であった。

【００２９】実施例５イヌガン細胞株におけるＦａｓ
Ｌ発現の検出種々のイヌガン細胞株におけるイヌＦａｓＬの発現を、
ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロッティングによって調べ
た。

【００３０】樹立したイヌ乳ガン細胞株ＦＣＢＲ１、イ
ヌ上皮系腫瘍由来細胞株Ａ-７２（ＡＴＣＣＣＲＬ-１
５４２）、イヌ骨芽肉腫由来細胞株Ｄ-１７（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ-１８３）、イヌ胸膜由来細胞株Ｃｆ２Ｔｈ（Ａ
ＴＣＣＣＲＬ-１４３０）およびイヌ腎由来細胞株ＭＤ
ＣＫ（ＡＴＣＣＣＣＬ-３４）から、実施例１（１）に
記載した方法により、ｍＲＮＡを抽出し、０．１μｇの
各ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。各イヌ細胞株由来
のｃＤＮＡを０．２ｍｌのマイクロ遠心チューブに２μ
ｌづつ取り、実施例１（２）で得られたイヌＦａｓＬの
遺伝子配列を元にして合成した、５´ａｇｃｔｃｔｔｔｃａｔｃｔａｃａｇａａｇｇａｇ
ｃｔｇｇｃｔｇ３´（配列番号：４）と５´ｇｃｔｔｇｔａａｃａａｇｇａａｃｃａｔａｔｇｇ
ａｇａｇａａｔ３´（配列番号：５）の２種のプライマーを各２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、
２５ｍＭＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌゼラチン、５０
μＭ各ｄＮＴＰ、２単位ＥｘｔａｑＤＮＡポリメ
ラーゼ（宝酒造（株）製）となるように各試薬を加え、
全量２０μｌとし、ＤＮＡの変性条件を９４℃，３０
秒、プライマーのアニーリング条件を６０℃、３０秒、
プライマーの伸長条件を７２℃、１分の各条件でＭＪ
ＲＥＳＥＲＣＨ社のＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＴｈｅ
ｒｍａｌＣｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用い、４０サイクル
反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動
後、アマシャム社のＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋に常法に従って
転写した。Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋は、５×ＳＳＰＥ（０．
９ＭＮａＣｌ，５０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄，５ｍＭＥ
ＤＴＡ，ｐＨ７．４），５×デンハルト溶液（０．１％
フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％
ウシ血清アルブミン）、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／
ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、６５℃で２時間インキュベート
し、実施例１（２）で得られた、５４０ｂｐのイヌＦａ
ｓＬｃＤＮＡ断片に宝酒造（株）のＲａｎｄｏｍＰｒ
ｉｍｅｒＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔを用いて
³²Ｐで標識し作製したプローブ１×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌ
とハイブリダイズした。６５℃で１晩インキュベートし
た後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋を０．２×ＳＳＣ（３０ｍＭ
ＮａＣｌ，３ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％Ｓ
ＤＳ中１５分、３回洗浄し、富士写真フィルム（株）の
富士イメージングプレートに１２時間露出し、富士写真
フィルム（株）のバイオイメージングアナライザーにて
解析した。

【００３１】また、各細胞におけるイヌβアクチンの発
現を上記と同様にして解析した。なお、ＲＴ−ＰＣＲ用
のプライマーは、５´ａｔｇｇｃｃｇａｃａａｇｇｔｃｃｔｇａａｇｇａ
ｃ３´（配列番号：６）と５´ｔａｃａｔｔｇｃｃａｇｇｇａａｇａｇａｔａｇａ
ａ３´（配列番号：７）を用いた。その結果、イヌβアクチンについては、すべ
ての細胞株で同等の発現が認められたのに対し、イヌＦ
ａｓＬについては、ＦＣＢＲ１に強い発現が認められ、
一方、その他のイヌ細胞株においては、弱い発現が認め
られた。従って、イヌＦａｓＬはイヌ乳ガンに特異的に
発現していると推定された。

【００３２】実施例６イヌＩＬ１８およびイヌＩＬ１
２のイヌ乳ガン細胞株に対するＦａｓＬ発現増強活性の
測定ＦａｓＬを発現している、イヌ乳ガン細胞株ＦＣＢＲ１
に対するＩＬ１８およびＩＬ１２のＦａｓＬ発現増強活
性を、実施例３および実施例４で調製した精製イヌＩＬ
１８およびイヌＩＬ１２を用いて調べた。ＦＣＢＲ１の
培養上清に、イヌＩＬ１２（１００ｎｇ／ｍｌ）、イヌ
ＩＬ１８（１μｇ／ｍｌ）およびイヌＩＬ１２（１００
ｎｇ／ｍｌ）とイヌＩＬ１８（１μｇ／ｍｌ）をそれぞ
れ添加し、６時間培養した。培養後、それぞれの細胞か
ら実施例１と同様にしてｍＲＮＡを抽出し、０．１μｇ
の各ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。さらに、実施例
４と同様にして、イヌＦａｓＬおよびイヌβアクチンの
ＤＮＡを、ＰＣＲでそれぞれ２５および４０サイクル増
幅し、１％アガロースゲルにて電気泳動後、定法に従
い、エチジウムブロマイドで染色し、ＵＶ照射下で各Ｄ
ＮＡを検出した。その結果、イヌＦａｓＬｍＲＮＡは、
イヌＩＬ１８の単独処理により発現増強され、イヌＩＬ
１８とイヌＩＬ１２両方の処理により、その発現がさら
に増強されていることが判明した。一方、イヌＩＬ１２
の単独処理では発現増強が認められなかった。従ってＩ
Ｌ１８が、腫瘍細胞上のＦａｓＬの発現を増強する活性
を有することが明らかになり、またＩＬ１２がＩＬ１８
の本活性において相乗活性を有することが判明した。

【００３３】実施例７イヌＩＬ１８およびイヌＩＬ１
２のイヌ腫瘍細胞株に対するアポトーシス誘導活性の測
定４８穴の細胞培養プレート（コーニング社製）に１穴あ
たり、１０⁵個のＦＣＢＲ１を接着させ、１穴あたり、
０．５ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＥＲＤＦ培地を添加し
た。これに０μｇ、１０μｇ、１００μｇおよび１００
０μｇのイヌＩＬ１８をそれぞれ添加し、５％ＣＯ₂、
３７℃の条件で２４時間培養した。培養後、細胞をトリ
プシンを用いてプレートから剥離し、ワコー（株）製の
アポトーシスラダー検出キットを用いて、その添付マニ
ュアルに従って、各ＤＮＡを抽出した。各々２０μｌの
ＤＮＡ溶液から４μｌづつを取り、それぞれ１μｌのｌ
ｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（アポトーシスラダー検出
キットに備え付け）を含む６μｌの滅菌蒸留水と混合
し、アガロースゲル（アポトーシスラダー検出キットに
備え付け）にアプライし、電気泳動した。泳動後のゲル
を、１０μｌのＳＹＢＲ^TM ＧｒｅｅｎＩ（ワコー
（株）製）を含む１００ｍｌのＴＡＥバッファー中で、
３０分間インキュベート後、ＵＶ照射によって各ＤＮＡ
を検出した。その結果、イヌＩＬ１８で処理されたＦＣ
ＢＲ１のＤＮＡはすべて断片化を起こしていた。一方、
イヌＩＬ１８未処理の細胞のＤＮＡにおいては、断片化
が認められなかった。従って、イヌＩＬ１８はイヌ乳ガ
ン細胞株ＦＣＢＲ１に作用して、アポトーシスを誘導す
る活性を有することが明らかになった。

【００３４】次に、アポトーシス誘導における、イヌＩ
Ｌ１８とイヌＩＬ１２の相乗作用について検討した。２
４穴の細胞培養プレート（コーニング社製）に１穴あた
り、５×１０⁵個のＦＣＢＲ１を接着させ、１穴あた
り、１ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＥＲＤＦ培地を添加し
た。これに１μｇのイヌＩＬ１８、および１μｇのイヌ
ＩＬ１８と１００ｎｇのイヌＩＬ１２をそれぞれ添加
し、５％ＣＯ₂、３７℃の条件で２４時間培養した。培
養後、細胞をプレートから剥離し、生理食塩水で１回洗
浄後、ＭＢＬ社製のｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｎｅ
で１５分間暗所で細胞を染色した。その後、各細胞をベ
クトンディッキンソン社製のＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ
ＳＥで解析し、アポトーシスを起こした細胞の核酸量を
定量した。その結果、アポトーシスを起こした細胞の核
酸量は、イヌＩＬ１８およびイヌＩＬ１２未処理細胞の
ものに比べ、イヌＩＬ１８を単独処理した細胞で約１０
％、イヌＩＬ１８とイヌＩＬ１２両方を処理した細胞で
約１５％増加していた。これらのことから、ＩＬ１８と
ＩＬ１２は相乗的に、乳ガン細胞に対してアポトーシス
を誘導することが判明した。

【００３５】実施例８イヌＩＬ１８によるｉｎｖｉ
ｖｏでの抗腫瘍活性の測定イヌＩＬ１８のイヌ腫瘍細胞株に対するｉｎｖｉｖｏ
での直接的抗腫瘍活性の有無を検討した。ＦＣＢＲ１を
４週齢のスキットマウス（日本クレア社由来）の背部皮
下に移植したところ、腫瘤を形成した４匹の担ガンマウ
スが作成できた。腫瘍重量を次の式にて算出した。腫瘍重量＝長径 X 短径²／２移植から２ヶ月後、腫瘍の大きさが平均３２ｍｍ X １
９ｍｍ、腫瘍重量で５．８ｇになったところで、実施例
３に記載の１０μｇの精製イヌＩＬ１８を２日間隔で２
回、尾静脈より投与した。また同時にコントロールとし
て生理食塩水を１匹のマウスに投与した。コントロール
のマウスの腫瘍重量は投与後さらに増加し、投与後１０
日目には１．３倍になった。一方、イヌＩＬ１８を投与
したマウスの腫瘍重量は投与後減少し、コントロールを
１とした相対腫瘍重量で０．０５から０．１になった。
イヌＩＬ１８のこの腫瘍退縮効果は抗マウスインターフ
ェロンγ抗体と抗アシアロＧＭ１抗体の同時投与によっ
て阻害されなかった。イヌＩＬ１８はｉｎｖｉｖｏに
おいてもイヌ腫瘍細胞に対して抗腫瘍活性を示すことが
判明した。

【００３６】実施例９イヌＩＬ１８製剤の製造実施例４で得られた精製イヌＩＬ１８溶液に、注射用生
理食塩水、注射用低分子ゼラチン（新田ゼラチン
（株））を加えて、ゼラチンの終濃度０．５％に調製し
た。さらに、ポジダイン（ポール（株））で処理してパ
イロジェンを除去した後、２５０℃で２時間乾熱滅菌し
たガラスバイアルに１ｍｌづつ分注した。その後、無菌
的に凍結乾燥することによって、１バイアル中に１μｇ
から１０μｇのイヌＩＬ１８を含むイヌＩＬ１８製剤を
得た。このイヌＩＬ１８製剤は、室温条件下で安定であ
り、また、蒸留水または生理食塩水によって良好に溶解
した。

【００３７】実施例１０担癌イヌに対するイヌＩＬ１
８の抗腫瘍効果表皮に腫瘤を持つ患犬、計５頭に対してイヌＩＬ１８製
剤を局所注射投与した。どの患犬にもさまざまな大きさ
の腫瘤が複数個存在していた。腫瘤１個につき、１μｇ
のイヌＩＬ１８を１ー２日間隔で３ー１０回、腫瘍局所
に直接、注射投与した。その結果、イヌＩＬ１８製剤を
投与した腫瘤の８割が完全に消失し、残りの腫瘤も全て
半分以下に縮小した。消失した腫瘍は、以後６ヵ月間観
察したが、再発は全くみられなかった。

【００３８】

【発明の効果】本発明によれば、ガン細胞上のガン抑制
因子を発現増強することができる。また、イヌのガン治
療に有効なイヌガン抑制因子を提供できる。さらに、哺
乳動物の生体に発生したガンを抑制する方法を提供でき
る。

【００３９】参考文献１．Ｎａｇａｔａ：Ｃｅｌｌ８８，３５５−３６５
（１９９７）．２．Ｎａｇａｔａら：Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７，１４４
９−１４５５（１９９５）．３．Ｏｋａｍｕｒａら：Ｎ
ａｔｕｒｅ３７８，８８−９１（１９９５）．４．Ｍｉｃａｌｌｅｆら：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．２６，１６４７−１５１（１９９６）５．Ｎｉｅｈａｎｓら：ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５７，
１００７−１０１２（１９９７）．６．Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８
４，１０５７−１０８２（１９９６）．７．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１８，５２９４（１９７９）．８．Ｂｅｒｇｅｒら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１
８，５１４３（１９７９）．９．Ｇｕｂｌｅｒら：Ｇｅｎｅ２５，２３６−２６９
（１９８３）．１０．Ｏｋａｙａｍａら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２，１６１，（１９８２）＆３，２８０，
（１９８３）．

【００４０】

【配列表】＜110＞東レ株式会社＜120＞ガン抑制因子、ガン抑制因子を発現増強させる方法、哺乳動物のガン抑制方法＜130＞51E15971 ＜160＞7 ＜210＞1 ＜211＞540 ＜212＞nucleic acid ＜213＞dog ＜220＞＜221＞peptide ＜222＞1..537 ＜400＞ cag ctc ttt cat cta cag aag gag ctg gct gaa ctc cga gag tct acc 48 Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Ser Thr agc gaa agg cat gta gca cca tct ttg gag aag caa ata ggt caa ccc 96 Ser Glu Arg His Val Ala Pro Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly Gln Pro aat cca cct tct gaa aaa agg gag ctg agg aaa gtg gcc cat tta aca 144 Asn Pro Pro Ser Glu Lys Arg Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr ggc aag ccc aac tca aga tcc atc cct ctg gaa tgg gaa gac aca tac 192 Gly Lys Pro Asn Ser Arg Ser Ile Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr gga att gcc ctt gtc tct ggg gtg aag tat aag aag ggt ggc ctt gtg 240 Gly Ile Ala Leu Val Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val atc aat gat act ggg ttg tac ttt gtg tat tcc aaa gtg tac ttc agg 288 Ile Asn Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg ggt cag tcc tgc aac aac aag ccc ctg aac cac aag gtc tat atg agg 336 Gly Gln Ser Cys Asn Asn Lys Pro Leu Asn His Lys Val Tyr Met Arg aac tct aaa tat ccc cag gac ctg atg ctg atg gag ggg aag atc atg 384 Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Met Leu Met Glu Gly Lys Ile Met aac tac tgc act aca ggc cag atg tgg gct cgt agc agc tac ttg ggg 432 Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly gca gta ttc aat ctc acc agt gct gac cat ttg tat gtc aat gta tct 480 Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser gaa cta tct ctg gtc agt ttt gaa gaa tct aag aca ttt ttt ggc tta 528 Glu Leu Ser Leu Val Ser Phe Glu Glu Ser Lys Thr Phe Phe Gly Leu tat aag ctc taa 540 Tyr Lys Leu *** ＜210＞2 ＜211＞30 ＜212＞nucleic acid ＜213＞Artificial Sequence ＜400＞ ccttggtagg attgggcctg gggatgtttc ＜210＞3 ＜211＞30 ＜212＞nucleic acid ＜213＞Artificial Sequence ＜400＞ aagactctca ttcaagacca tgttctcagt ＜210＞4 ＜211＞30 ＜212＞nucleic acid ＜213＞Artificial Sequence ＜400＞ agctctttca tctacagaag gagctggctg ＜210＞5 ＜211＞30 ＜212＞nucleic acid ＜213＞Artificial Sequence ＜400＞ gcttgtaaca aggaaccata tggagagaat ＜210＞6 ＜211＞24 ＜212＞nucleic acid ＜213＞Artificial Sequence ＜400＞ atggccgaca aggtcctgaa ggac ＜210＞7 ＜211＞24 ＜212＞nucleic acid ＜213＞Artificial Sequence ＜400＞ tacattgcca gggaagagat agaa

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 14/54 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 5/06 5/00 ＥＣ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 BA26 BA80 CA04 CA09 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 4B065 AA26X AA90X AA90Y AA95X AB01 BA02 BA06 CA24 CA44 4C084 AA02 BA01 BA08 BA22 BA23 BA44 DA12 DA27 DC50 ZB212 ZB262 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA42 DA02 EA28 FA72

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ガン細胞上に発現し、ガン細胞上のＦａｓ
に結合して、ガン細胞中のＤＮＡを断片化させ、ガン細
胞にアポトーシスを誘導するガン抑制因子。
【請求項２】以下の（ａ）または（ｂ）のガン抑制因
子。（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含有するガ
ン抑制因子。（ｂ）（ａ）に記載されたアミノ酸配列において、１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された
アミノ酸配列を含有するガン抑制因子。
【請求項３】請求項２に記載されたガン抑制因子をコー
ドする遺伝子。
【請求項４】インターロイキン１８をガン細胞に作用さ
せることによる、ガン細胞上の請求項１から３のいずれ
かに記載のガン抑制因子を発現増強させる方法。
【請求項５】インターロイキン１２を同時にガン細胞に
作用させることによる、請求項４に記載のガン細胞上の
ガン抑制因子を発現増強させる方法。
【請求項６】ガン細胞が女性ホルモン依存的に増殖する
ものであることを特徴とする請求項１から３のいずれか
に記載のガン抑制因子。
【請求項７】ガン細胞が乳ガン由来であることを特徴と
する請求項の６に記載のガン抑制因子。
【請求項８】ガン細胞表面上に発現する請求項１から３
のいずれかに記載のガン抑制因子を発現増強することに
よる哺乳動物の生体に発生したガンの抑制方法。
【請求項９】インターロイキン１８をガン細胞に作用さ
せることによる、請求項８に記載の哺乳動物の生体に発
生したガンの抑制方法。
【請求項１０】インターロイキン１２を同時にガン細胞
に作用させることによる、請求項９に記載の哺乳動物の
生体に発生したガンの抑制方法。
【請求項１１】哺乳動物がイヌであることを特徴とする
請求項８から１０のいずれかに記載の哺乳動物の生体に
発生したガンの抑制方法。
【請求項１２】ガン細胞が女性ホルモン依存的に増殖す
るものであることを特徴とする請求項８から１１のいず
れかに記載の哺乳動物の生体に発生したガンの抑制方
法。
【請求項１３】ガン細胞が乳ガン由来であることを特徴
とする請求項８から１２のいずれかに記載の哺乳動物の
生体に発生したガンの抑制方法。