JP2002034565A - 細菌ｄｎａを特異的に認識する受容体タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを
特異的に認識する受容体タンパク質や、それをコードす
る遺伝子ＤＮＡや、細菌性伝染病に対する宿主免疫細胞
の応答性を調べる上で有用な実験モデル動物を提供する
こと。 【解決手段】 非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮ
Ａを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤ
ＮＡを、ＢＬＡＳＴサーチによりスクリーニングし、各
種ＴＬＲと高い相似性を有する多くのＥＳＴクローンを
スクリーニングし、これらをプローブにして、マウス・マ
クロファージｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡ
を単離し、ｃＤＮＡの塩基配列を解析してＬＲＲ及びＴ
ＩＲ領域などの保存領域が存在するＴＬＲ９であること
を確認した後、ノックアウトマウスを作製し、ＴＬＲ９
が細菌ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧ配列を含むオリゴヌク
レオチドの受容体タンパク質であることを確認した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、非メチル化ＣｐＧ
配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タン
パク質、該受容体タンパク質の遺伝子及びそれらの利用
に関する。

【０００２】

【従来の技術】トール（Ｔｏｌｌ）遺伝子は、ショウジ
ョウバエの胚発生中の背腹軸の決定（Cell 52, 269-27
9, 1988、Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1
996）、また成体における抗真菌性免疫応答に必要であ
ることが知られている（Cell 86,973-983, 1996）。か
かるＴｏｌｌは、細胞外領域にロイシンリッチリピート
（ＬＲＲ）を有するＩ型膜貫通受容体であり、この細胞
質内領域は、哺乳類インターロイキン−１受容体（ＩＬ
−１Ｒ）の細胞質内領域と相同性が高いことが明らかと
なっている（Nature 351, 355-356, 1991、Annu. Rev.
Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996、J. Leukoc. Bio
l. 63, 650-657, 1998）。

【０００３】近年、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）と呼ば
れるＴｏｌｌの哺乳類のホモログが同定され、ＴＬＲ２
やＴＬＲ４など現在までに６つのファミリーが報告され
ている（Nature 388, 394-397, 1997、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 95, 588-593, 1998、Blood 91, 4020-402
7, 1998、Gene 231, 59-65, 1999）。このＴＬＲファミ
リーは、上記ＩＬ−１Ｒと同様にアダプタータンパク質
であるＭｙＤ８８を介し、ＩＬ−１Ｒ結合キナーゼ（Ｉ
ＲＡＫ）をリクルートし、ＴＲＡＦ６を活性化し、下流
のＮＦ−κＢを活性化することが知られている（J. Ex
p. Med. 187, 2097-2101, 1998、Mol. Cell 2, 253-25
8, 1998、Immunity 11, 115-122, 1999）。また、哺乳
類におけるＴＬＲファミリーの役割は、細菌の共通構造
を認識するパターン認識受容体（ＰＲＲ：pattern reco
gnition receptor）として、先天的な免疫認識に関わっ
ているとも考えられている（Cell 91, 295-298, 199
7）。

【０００４】上記ＰＲＲにより認識される病原体会合分
子パターン（ＰＡＭＰ：pathogen-associated molecula
r pattern）の一つは、グラム陰性菌の外膜の主成分で
あるリポ多糖（ＬＰＳ）であって（Cell 91, 295-298,
1997）、かかるＬＰＳが宿主細胞を刺激して宿主細胞に
ＴＮＦα、ＩＬ−１及びＩＬ−６等の各種炎症性サイト
カインを産生させること（Adv. Immunol. 28, 293-450,
1979、Annu. Rev. Immunol. 13, 437-457, 1995）や、
ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ：LPS-bindingprotein）
により捕獲されたＬＰＳが細胞表面上のＣＤ１４に引き
渡されることが知られている（Science 249, 1431-143
3, 1990、Annu. Rev. Immunol. 13, 437-457, 1995）。
本発明者らは、ＴＬＲ４のノックアウトマウスを作製
し、ＴＬＲ４ノックアウトウスが上記グラム陰性菌の外
膜の主成分であるＬＰＳに不応答性であること（J. Imm
unol. 162, 3749-3752, 1999 ）や、ＴＬＲ２ノックア
ウトマウスを作製し、ＴＬＲ２ノックアウトマウスのマ
クロファージがグラム陽性菌細胞壁やその構成成分であ
るペプチドグリカンに対する反応性が低下すること（Im
munity, 11, 443-451, 1999 ）を報告している。

【０００５】他方、細菌ＤＮＡ（バクテリア由来ＤＮ
Ａ）や非メチル化ＣｐＧ配列を含むオリゴヌクレオチド
が、マウス及びヒトの免疫細胞を刺激すること(Trends
Microbiol. 4, 73-76, 1996、 Trends Microbiol. 6, 49
6-500, 1998)や、ＩＬ−１２及びＩＦＮγの放出に支配
されるＴヘルパー１細胞（Ｔｈ１）様炎症性応答を刺激
すること(EMBO J. 18, 6973-6982, 1999、 J. Immunol.
161, 3042-3049, 1998、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
6, 9305-9310, 1999)から、ＣｐＧ配列を含むオリゴヌ
クレオチドは、癌、アレルギー及び伝染病のワクチンを
含むワクチン戦略のアジュバントとしての使用可能性が
提唱されている(Adv. Immunol. 73, 329-368, 1999、 Cu
rr. Opin. Immunol. 12, 35-43, 2000、 Immunity 11, 1
23-129, 1999)。このように臨床実用において効果が期待
されるにも関わらず、非メチル化ＣｐＧ配列を含む細菌
ＤＮＡが免疫細胞を活性化する分子メカニズムはよくわ
かっていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、メチル
化されていないＣｐＧモチーフを含有するバクテリア由
来ＤＮＡは免疫細胞を非常に活性化し、Ｔｈ１の応答を
誘導するが、その分子レベルでの活動はあまり理解され
ていない。本発明の課題は、細菌ＤＮＡの非メチル化Ｃ
ｐＧ配列を含むオリゴヌクレオチドの分子レベルでの作
用を明らかにすることができる、非メチル化ＣｐＧ配列
を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識するＴＬＲファミリ
ーのメンバー受容体タンパク質ＴＬＲ９や、それをコー
ドするＤＮＡや、細菌性伝染病に対する宿主免疫細胞の
応答性を調べる上で有用な実験モデル動物を提供するこ
とにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】細菌の共通構造を認識す
るパターン認識受容体として、先天的な免疫認識に関わ
っている哺乳類におけるＴＬＲファミリーは、現在まで
に６つのメンバー（ＴＬＲ１−６）が公表されており(N
ature 388, 394-397, 1997、 Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 95, 588-593, 1998、Gene 231, 59-65, 1999)、Ｔ
ＬＲ７及びＴＬＲ８の新たな２つのメンバーがGenBank
に登録されている(登録番号ＡＦ２４０４６７及びＡＦ
２４６９７１)。また、ＴＬＲ９についても完全長ｃＤ
ＮＡが見い出されGenBankに登録されている(登録番号Ａ
Ｆ２４５７０４)が、その機能については知られていな
かった。

【０００８】本発明者らは、非メチル化ＣｐＧ配列を有
する細菌ＤＮＡを特異的に認識するＴＬＲファミリーの
メンバー受容体タンパク質をコードするＤＮＡを、ＢＬ
ＡＳＴサーチによりスクリーニングし、既に同定されて
いる各種ＴＬＲと高い相似性を有する多くのシークエン
ス・タグ（ＥＳＴ）クローンをスクリーニングし、これ
らの遺伝子フラグメントをプローブにして、マウス・マク
ロファージｃＤＮＡライブラリーから完全な長さを有す
るｃＤＮＡを単離し、これを用いてヒトｃＤＮＡも単離
した。次に、これらｃＤＮＡの塩基配列を解析し、この
ＴＬＲファミリーにＬＲＲ及びＴＩＲ領域などの保存領
域が存在するＴＬＲ９であることを確認した。そこで、こ
のＴＬＲ９ノックアウトマウスを作製し、ＴＬＲ９が細
菌ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧ配列を含むオリゴヌクレオ
チドの受容体タンパク質であることを明らかにし、本発
明を完成するに至った。

【０００９】すなわち本発明は、非メチル化ＣｐＧ配列
を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク
質をコードするＤＮＡ（請求項１）や、非メチル化Ｃｐ
Ｇ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タ
ンパク質が、以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質であるこ
とを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ(ａ)配列番号２に
示されるアミノ酸配列からなるタンパク質(ｂ)配列番号
２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮ
Ａに対して反応性を有するタンパク質（請求項２）や、
配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並び
にこれらの配列の一部または全部を含むことを特徴とす
る請求項１記載のＤＮＡ（請求項３）や、請求項３記載
の遺伝子を構成するＤＮＡとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズすることを特徴とする請求項１記載の
ＤＮＡ（請求項４）や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する
細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質が、以
下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質であることを特徴とする
請求項１記載のＤＮＡ(ａ)配列番号４に示されるアミノ
酸配列からなるタンパク質(ｂ)配列番号４に示されるア
ミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、か
つ非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反
応性を有するタンパク質（請求項５）や、配列番号３に
示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配
列の一部または全部を含むことを特徴とする請求項１記
載のＤＮＡ（請求項６）や、請求項６記載の遺伝子を構
成するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズすることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ（請求
項７）に関する。

【００１０】また本発明は、非メチル化ＣｐＧ配列を有
する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質
（請求項８）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列か
らなることを特徴とする請求項８記載のタンパク質（請
求項９）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項
８記載のタンパク質（請求項１０）や、配列番号４に示
されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項８
記載のタンパク質（請求項１１）や、配列番号４に示さ
れるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸
が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる
ことを特徴とする請求項８記載のタンパク質（請求項１
２）に関する。

【００１１】また本発明は、請求項８〜１２のいずれか
記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペ
プチドタグとを結合させた融合タンパク質（請求項１
３）や、請求項８〜１２のいずれか記載のタンパク質と
特異的に結合する抗体（請求項１４）や、抗体がモノク
ローナル抗体であることを特徴とする請求項１４記載の
抗体（請求項１５）や、請求項８〜１２のいずれか記載
のタンパク質を発現することができる発現系を含んでな
る宿主細胞（請求項１６）に関する。

【００１２】また本発明は、非メチル化ＣｐＧ配列を有
する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を
コードする遺伝子が過剰発現することを特徴とする非ヒ
ト動物（請求項１７）や、非メチル化ＣｐＧ配列を有す
る細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコ
ードする遺伝子機能が染色体上で欠損したことを特徴と
する非ヒト動物（請求項１８）や、非メチル化ＣｐＧ配
列を有する細菌ＤＮＡに対して不反応性であることを特
徴とする請求項１８記載の非ヒト動物（請求項１９）
や、齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求
項１７〜１９のいずれか記載の非ヒト動物（請求項２
０）に関する。

【００１３】また本発明は、非メチル化ＣｐＧ配列を有
する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を
コードする遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞に、請
求項１〜７のいずれか記載のＤＮＡを導入することを特
徴とする非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対
して反応性を有するタンパク質を発現する細胞の調製方
法（請求項２１）や、請求項２１記載の非メチル化Ｃｐ
Ｇ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タ
ンパク質を発現する細胞の調製方法により得られること
を特徴とする非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡ
を特異的に認識する受容体タンパク質を発現する細胞
（請求項２２）に関する。

【００１４】また本発明は、被検物質の存在下、非メチ
ル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する
受容体タンパク質を発現している細胞をインビトロで培
養し、ＴＬＲ９活性を測定・評価することを特徴とする
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認
識する受容体タンパク質のアゴニスト又はアンタゴニス
トのスクリーニング方法（請求項２３）や、非メチル化
ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容
体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損
した非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物から
得られるマクロファージ又は脾臓細胞のＴＬＲ９活性を
測定・評価することを特徴とする非メチル化ＣｐＧ配列
を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク
質のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方
法（請求項２４）や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細
菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコード
する遺伝子が過剰発現した非ヒト動物に被検物質を投与
し、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓
細胞のＴＬＲ９活性を測定・評価することを特徴とする
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認
識する受容体タンパク質のアゴニスト又はアンタゴニス
トのスクリーニング方法（請求項２５）や、非ヒト動物
が、マウスであることを特徴とする請求項２４又は２５
記載の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対し
て反応性を有するタンパク質のアゴニスト又はアンタゴ
ニストのスクリーニング方法（請求項２６）に関する。

【００１５】また本発明は、請求項２３〜２６のいずれ
か記載の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特
異的に認識する受容体タンパク質のアゴニスト又はアン
タゴニストのスクリーニング方法により得られる非メチ
ル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する
受容体タンパク質のアゴニスト又はアンタゴニスト（請
求項２７）や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮ
Ａを特異的に認識する受容体タンパク質の全部又はその
一部を有効成分として含有する医薬組成物（請求項２
８）や、請求項２７記載のアゴニスト又はアンタゴニス
トを有効成分として含有する医薬組成物（請求項２９）
や、検体中の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡ
を特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮ
Ａと、請求項３記載のＤＮＡとの塩基配列を比較するこ
とができる、請求項３記載のＤＮＡを含むことを特徴と
する非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的
に認識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列の
欠失、置換及び／又は付加に関連する疾病の診断キット
（請求項３０）に関する。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明における非メチル化ＣｐＧ
配列を有する細菌ＤＮＡとしては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗
原提示細胞等の免疫細胞を活性化し、免疫応答を誘導す
ることができる、メチル化されていないＣｐＧモチーフ
を有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）等のバ
クテリアに由来するＤＮＡであればどのようなものでも
よく、エセリシア・コリ、クレブシェラ・ニューモニ
エ、シュードモナス・アエルギノサ、サルモネラ・チフ
ィムリウム、セラチア・マルセッセンス、フレクスナー
赤痢菌、ビブリオ・コレレェ、サルモネラ・ミネソタ、
ポルフィロモナス・ジンジバリス、スタフィロコッカス
・アウレウス、コリネバクテリウム・ジフテリア、ノカ
ルジア・コエリアカ、ストレプトコッカス・ニューモニ
アなどのバクテリア由来のＤＮＡを具体的に挙げること
ができる。

【００１７】かかる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌
ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質としては、
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認
識することができるタンパク質であれば特に制限される
ものではなく、例えば、配列表の配列番号２で示される
ヒト由来のＴＬＲ９や、配列番号２で示されるアミノ酸
配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記非
メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識
することができるタンパク質や、これらの組換えタンパ
ク質を具体的に挙げることができる。かかる非メチル化
ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容
体タンパク質は、そのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の
方法で調製することができる。

【００１８】また、本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有
する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を
コードするＤＮＡとしては、配列表の配列番号２で示さ
れるヒト由来のＴＬＲ９をコードするＤＮＡ、例えば配
列番号１で示されるものや、配列番号２で示されるアミ
ノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、
置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上
記非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に
認識することができるタンパク質をコードするＤＮＡ
や、これらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、かつ上記非メチル化ＣｐＧ配列を有する細
菌ＤＮＡを特異的に認識することができるタンパク質を
コードするＤＮＡも包含され、これらはそのＤＮＡ配列
情報等に基づき、例えばマウス由来のＴＬＲ９において
はマウスＲＡＷ２６４．７ｃＤＮＡライブラリーや１２
９／ＳｖＪマウス遺伝子ライブラリーなどから公知の方
法により調製することができる。

【００１９】また、配列番号１に示される塩基配列又は
その相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプ
ローブとして、マウス由来のＤＮＡライブラリーに対し
てストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション
を行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単
離することにより、受容体タンパク質ＴＬＲ９と同効な
目的とする免疫誘導非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌
ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードす
るＤＮＡを得ることもできる。かかるＤＮＡを取得する
ためのハイブリダイゼーションの条件としては、例え
ば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳ
Ｃ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗
浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼ
ーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含
む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げ
ることができる。なお、ハイブリダイゼーションのスト
リンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度
条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の
要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼ
ーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェン
シーを実現することが可能である。

【００２０】本発明の融合タンパク質とは、マウス、ヒ
ト等の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異
的に認識する受容体タンパク質に、マーカータンパク質
及び／又はペプチドタグを結合させたものをいい、マー
カータンパク質としては、従来知られているマーカータ
ンパク質であればどのようなものでもよく、例えば、ア
ルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、Ｇ
ＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明にお
けるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、
ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプ
チドタグを具体的に例示することができる。かかる融合
タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−
ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した非メチル化Ｃｐ
Ｇ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タ
ンパク質の精製や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌
ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質の検出や、
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認
識する受容体タンパク質に対する抗体の定量や、その他
当該分野の研究用試薬としても有用である。

【００２１】本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細
菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に特異的
に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリク
ローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等
の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これ
らは上記非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特
異的に認識する受容体タンパク質を抗原として用いて常
法により作製することができるが、その中でもモノクロ
ーナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモ
ノクローナル抗体等の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細
菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に特異的
に結合する抗体は、例えば、ＴＬＲ９の変異又は欠失に
起因する疾病の診断やＴＬＲ９の制御分子機構を明らか
にする上で有用である。

【００２２】非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡ
を特異的に認識する受容体タンパク質に対する抗体は、
慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以
外）に該非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特
異的に認識する受容体タンパク質若しくはエピトープを
含む断片、又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を
投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗
体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗
体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-49
7, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ
法（ImmunologyToday 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイ
ブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THE
RAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意
の方法を用いることができる。以下に非メチル化ＣｐＧ
配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タン
パク質として、マウス由来のＴＬＲ９を例に挙げてマウ
ス由来のＴＬＲ９に対して特異的に結合するモノクロー
ナル抗体、すなわち抗ｍＴＬＲ９モノクローナル抗体の
作製方法を説明する。

【００２３】上記抗ｍＴＬＲ９モノクローナル抗体は、
抗ｍＴＬＲ９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを
インビボ又はインビトロで常法により培養することによ
り生産することができる。例えば、インビボ系において
は、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で
培養することにより、またインビトロ系においては、動
物細胞培養用培地で培養することにより得ることができ
る。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培
地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生
物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培
地を例示することができる。

【００２４】抗ｍＴＬＲ９モノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマは、例えば、マウス等から得られた受容体タ
ンパク質ＴＬＲ９を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免役
し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスＮＳ−１細胞
（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）とを、常法により細胞融合
させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングする
ことにより、抗ｍＴＬＲ９モノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマを作出することができる。また、かかるモノ
クローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質
の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方
法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液
体クロマトグラフィーを具体的に例示することができ
る。

【００２５】また、本発明の上記非メチル化ＣｐＧ配列
を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク
質に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の
調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することがで
きる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランス
ジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上
記抗体を用いて、その非メチル化ＣｐＧ配列を有する細
菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を発現す
るクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマ
トグラフィーでそのポリペプチドを精製することもでき
る。非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的
に認識する受容体タンパク質に対する抗体は、非メチル
化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受
容体タンパク質の分子機構を明らかにする上で有用であ
る。

【００２６】また上記抗ｍＴＬＲ９モノクローナル抗体
等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシ
アネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート
等の蛍光物質や、¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、³⁵Ｓ又は³Ｈ等のラジオ
アイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシ
ダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等
の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（Ｇ
ＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タ
ンパク質を用いることによって、上記非メチル化ＣｐＧ
配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タン
パク質の機能解析を行うことができる。また免疫学的測
定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体
法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタ
ロニー法等の方法を挙げることができる。

【００２７】本発明はまた、上記非メチル化ＣｐＧ配列
を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク
質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞
に関する。かかる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌Ｄ
ＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする
遺伝子の宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS
IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLEC
ULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold S
pring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor,
N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに
記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフ
ェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェ
クション、トランスベクション(transvection)、マイク
ロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェ
クション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレ
ープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballis
tic introduction)、感染等により行うことができる。
そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセ
ス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス
等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細
胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫
細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細
胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ
葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変
異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂ
ｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞など
を挙げることができる。

【００２８】また、発現系としては、上記非メチル化Ｃ
ｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体
タンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現
系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソー
ム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラス
ミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポ
バウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏
痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来
のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン
由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、
コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリ
オファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることが
できる。これら発現系は、発現を起こさせるだけでな
く、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。

【００２９】上記発現系を含んでなる宿主細胞やかかる
細胞の細胞膜、またかかる細胞を培養して得られる非メ
チル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識す
る受容体タンパク質は、後述するように本発明のスクリ
ーニング方法に用いることができる。例えば、細胞膜を
得る方法としては、F. Pietri-Rouxel（Eur. J. Bioche
m., 247, 1174-1179, 1997）らの方法などを用いること
ができ、また、かかる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細
菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を細胞培
養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたは
エタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換
クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフ
ィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロ
マトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含
めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフ
ィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラ
フィーに用いるカラムとしては、例えば、抗ＴＬＲ９モ
ノクローナル抗体等の抗非メチル化ＣｐＧ配列を有する
細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質抗体を
結合させたカラムや、上記ＴＬＲ９等の非メチル化Ｃｐ
Ｇ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タ
ンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、この
ペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用
いることにより、これらの非メチル化ＣｐＧ配列を有す
る細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を得
ることができる。

【００３０】本発明において、上記非メチル化ＣｐＧ配
列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパ
ク質をコードする遺伝子が過剰発現する非ヒト動物と
は、野生型非ヒト動物に比べてかかる非メチル化ＣｐＧ
配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タン
パク質を大量に産生する非ヒト動物をいい、また、非メ
チル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識す
る受容体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上
で欠損した非ヒト動物とは、染色体上の非メチル化Ｃｐ
Ｇ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タ
ンパク質をコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊
・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、非メ
チル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識す
る受容体タンパク質を発現する機能を失なった非ヒト動
物をいう。そして、本発明における非ヒト動物として
は、ウサギや、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非
ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限
定されるものではない。

【００３１】また、本発明において非メチル化ＣｐＧ配
列を有する細菌ＤＮＡに対して不反応性とは、細菌ＤＮ
Ａによる刺激に対する生体又は生体を構成する細胞、組
織若しくは器官の反応性が低下しているか、あるいはほ
ぼ失われていることを意味する。したがって、本発明に
おいて非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対し
て不反応性の非ヒト動物とは、細菌ＤＮＡによる刺激に
対して、生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器
官の反応性が低下しているか、あるいはほぼ失われてい
るマウス、ラット、ウサギ等のヒト以外の動物をいう。
また、細菌ＤＮＡによる刺激としては、細菌ＤＮＡを生
体に投与するインビボでの刺激や、生体から分離された
細胞に細菌ＤＮＡを接触させるインビトロでの刺激等を
挙げることができ、具体的には、ＴＬＲ９ノックアウト
マウス等のＴＬＲ９遺伝子機能が染色体上で欠損した非
ヒト動物を挙げることができる。

【００３２】ところで、メンデルの法則に従い出生して
くるホモ接合体非ヒト動物には、非メチル化ＣｐＧ配列
を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク
質欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含ま
れ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過
剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによっ
て個体レベルで正確な比較実験をすることができること
から、野生型の非ヒト動物、すなわち非メチル化ＣｐＧ
配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タン
パク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過
剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動
物を、例えば下記に記載する本発明のスクリーニングに
際して併用することが好ましい。かかる非メチル化Ｃｐ
Ｇ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タ
ンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は
過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、非メチル化Ｃｐ
Ｇ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タ
ンパク質のノックアウトマウスやトランスジェニックマ
ウスを例にとって以下説明する。

【００３３】例えば、ＴＬＲ９等の非メチル化ＣｐＧ配
列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパ
ク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したマウ
ス、すなわち非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡ
を特異的に認識する受容体タンパク質ノックアウトマウ
スは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法に
より得られた遺伝子断片を用いて、上記非メチル化Ｃｐ
Ｇ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タ
ンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングし、スク
リーニングされた非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌Ｄ
ＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする
遺伝子をウイルスベクター等を用いてサブクローンし、
ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクローンの
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認
識する受容体タンパク質をコードする遺伝子の全部又は
一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３′末
端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）
遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（Ｈ
ＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによっ
て、ターゲットベクターを作製する。

【００３４】この作製されたターゲティングベクターを
線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等に
よってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相
同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（Ｇ
ＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥ
Ｓ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目
的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により
確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のク
ローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクション
し、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウス
を作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとイン
タークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることが
でき、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロス
させることによって、本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を
有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質
ノックアウトマウスを作製することができる。また、非
メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識
する受容体タンパク質ノックアウトマウスが生起してい
るかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方
法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザン
ブロット法等により調べたり、またこのマウスの発現を
ウエスタンブロット法等により調べる方法がある。

【００３５】また、作出されたＴＬＲ９ノックアウトマ
ウスが非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対し
て不応答性であることは、例えば、ＣｐＧ ＯＤＮをＴ
ＬＲ９ノックアウトマウスのマクロファージ、単核細
胞、樹状細胞などの免疫細胞にインビトロ又はインビボ
で接触せしめ、かかる細胞におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−
６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ等の産生量や、脾臓Ｂ細胞
の増殖応答や、脾臓Ｂ細胞表面でのＣＤ４０、ＣＤ８
０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスII等の抗原の発現量や、Ｎ
Ｆ−κＢ、ＪＮＫ、ＩＲＡＫ等のＴＬＲ９のシグナル伝
達経路における分子の活性化を測定することにより確認
することができる。そして、本発明のＴＬＲ９ノックア
ウトマウスは、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮ
Ａ等の作用機序の解明や細菌感染に対するワクチン開発
に有用なモデルとすることができる。

【００３６】非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡ
を特異的に認識する受容体タンパク質のトランスジェニ
ックマウスは、ＴＬＲ９等の非メチル化ＣｐＧ配列を有
する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を
コードするｃＤＮＡにチキンβ−アクチン、マウスニュ
ーロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラ
ビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロ
ンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマ
ウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得ら
れた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植
し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから
前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することによりか
かるトランスジェニックマウスを創製することができ
る。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウス
の尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入した非メチル化Ｃ
ｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体
タンパク質をコードする遺伝子をプローブとするドット
ハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用い
たＰＣＲ法等により行うことができる。

【００３７】また、本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有
する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を
コードするＤＮＡの全部あるいは一部を用いると、非メ
チル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識す
る受容体タンパク質の欠失又は異常に起因する疾病等の
遺伝子治療に有効な細胞を調製することができる。本発
明におけるこれら細胞の調製方法としては、非メチル化
ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容
体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損
した細胞に、上記本発明のＤＮＡの全部あるいは一部を
トランスフェクション等により導入し、非メチル化Ｃｐ
Ｇ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タ
ンパク質を発現する細胞を得る方法を挙げることがで
き、特に、かかる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌Ｄ
ＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を発現する細
胞としては、上記ＤＮＡ等が染色体にインテグレイトさ
れ、ステイブルにＴＬＲ９活性を示す細胞を用いること
が好ましい。

【００３８】そしてまた、上記非メチル化ＣｐＧ配列を
有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質
をコードするＤＮＡ、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細
菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質とマーカ
ータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融
合非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に
認識する受容体タンパク質に対する抗体、非メチル化Ｃ
ｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体
タンパク質を発現することができる発現系を含んでなる
宿主細胞、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを
特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子
が過剰発現する非ヒト動物、非メチル化ＣｐＧ配列を有
する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を
コードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動
物、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的
に認識する受容体タンパク質を発現する細胞等を用いる
と、本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡ
を特異的に認識する受容体タンパク質のアゴニスト又は
アンタゴニストや、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌
ＤＮＡに対する反応性の抑制物質又は促進物質をスクリ
ーニングすることができる。これらのスクリーニングに
より得られたものは、細菌感染症に対する抑制物質又は
促進物質や、アレルギー性疾患若しくは癌に対する抑制
剤、予防剤又は治療薬や、遺伝子治療等において副作用
を抑制剤又は阻害剤や、ＴＬＲ９活性の欠失又は異常に
起因する疾病等の診断・治療に有用な物質である可能性
がある。

【００３９】上記ＴＬＲ９活性とは、非メチル化ＣｐＧ
配列を有する細菌ＤＮＡと特異的に反応し、細胞内にシ
グナルを伝達する機能をいい、シグナル伝達機能として
は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ等
のサイトカインを産生する機能や、亜硝酸イオンを産生
する機能や、細胞を増殖する機能や、細胞表面において
ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスII等の抗
原を発現する機能や、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ＩＲＡＫ等
のＴＬＲ９のシグナル伝達経路における分子を活性化さ
せる機能などを具体的に例示することができるが、これ
らに限定されるものではない。

【００４０】本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細
菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質のアゴニ
スト又はアンタゴニストのスクリーニング方法として
は、被検物質の存在下、マクロファージ、脾臓細胞又は
樹状細胞などの免疫細胞、非メチル化ＣｐＧ配列を有す
る細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を発
現している細胞、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌Ｄ
ＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を発現する細
胞等の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対し
て反応性を有するタンパク質を発現している細胞をイン
ビトロで培養し、ＴＬＲ９活性を測定・評価する方法
や、野生型非ヒト動物、非メチル化ＣｐＧ配列を有する
細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコー
ドする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物、又
は、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的
に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子が過剰
発現した非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物
から得られるマクロファージ、脾臓細胞、又は樹状細胞
などの免疫細胞のＴＬＲ９活性を測定・評価する方法等
を具体的に挙げることができる。

【００４１】また、マクロファージ活性又は脾臓細胞活
性の程度を測定・評価するに際し、対照として野生型非
ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物の測定値と比較
・評価することが個体差によるバラツキをなくすること
ができるので好ましい。このことは、以下に示す非メチ
ル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対する反応性の抑
制物質又は促進物質のスクリーニングにおいても同様で
ある。

【００４２】また、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌
ＤＮＡに対する反応性の抑制物質又は促進物質のスクリ
ーニング方法としては、被検物質と非メチル化ＣｐＧ配
列を有する細菌ＤＮＡとの存在下、非メチル化ＣｐＧ配
列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク
質、又は該タンパク質を発現している細胞膜をインビト
ロでインキュベーションし、該タンパク質との反応性を
測定・評価する方法や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する
細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質をコード
する遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物から得
られるマクロファージ又は脾臓細胞と被検物質とをあら
かじめインビトロで接触せしめた後、該マクロファージ
又は脾臓細胞を非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮ
Ａの存在下で培養し、該マクロファージ若しくは脾臓細
胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定
・評価する方法や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌
ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質をコードする
遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物から得られ
るマクロファージ又は脾臓細胞と非メチル化ＣｐＧ配列
を有する細菌ＤＮＡとをあらかじめインビトロで接触せ
しめた後、該マクロファージ又は脾臓細胞を被検物質の
存在下で培養し、該マクロファージ若しくは脾臓細胞の
マクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評
価する方法や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮ
Ａに対して反応性を有するタンパク質をコードする遺伝
子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物にあらかじめ被
検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られるマクロ
ファージ又は脾臓細胞を非メチル化ＣｐＧ配列を有する
細菌ＤＮＡの存在下で培養し、該マクロファージ若しく
は脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程
度を測定・評価する方法や、非メチル化ＣｐＧ配列を有
する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質をコ
ードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に
あらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物を細菌
により感染させ、該非ヒト動物から得られるマクロファ
ージ若しくは脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細
胞活性の程度を測定・評価する方法や、非メチル化Ｃｐ
Ｇ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタン
パク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非
ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒ
ト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞を被検
物質の存在下で培養し、該マクロファージ若しくは脾臓
細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測
定・評価する方法や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細
菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質をコードす
る遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物をあらか
じめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物に被検物質
を投与し、該非ヒト動物から得られるマクロファージ若
しくは脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性
の程度を測定・評価する方法や、非メチル化ＣｐＧ配列
を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質
をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動
物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物を
細菌により感染させ、該非ヒト動物におけるマクロファ
ージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定・評価する方法
や、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して
反応性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染
色体上で欠損した非ヒト動物をあらかじめ細菌により感
染させた後、該非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒ
ト動物におけるマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の
程度を測定・評価する方法などを具体的に挙げることが
できる。また、これらのスクリーニング方法に用いる非
メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡとしては、Ｃｐ
Ｇ ＯＤＮ（ＴＣＣ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＴＴＣ−ＣＴＧ
−ＡＴＧ−ＣＴ：配列番号５）を用いることが好ましい
が、これに限定されるのもではない。

【００４３】本発明はまた、検体中の非メチル化ＣｐＧ
配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タン
パク質をコードするＤＮＡ配列を、本発明の非メチル化
ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容
体タンパク質をコードするＤＮＡ配列と比較することか
らなる、非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特
異的に認識する受容体タンパク質の活性又は発現と関連
する疾病の診断に用いられる診断キットに関する。非メ
チル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識す
る受容体タンパク質をコードするＤＮＡの変異型の検出
は、遺伝子に変異がある個体をＤＮＡレベルで見い出す
ことにより行うことができ、非メチル化ＣｐＧ配列を有
する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質の
過少発現、過剰発現又は変異発現により生ずる疾病の診
断に有効である。かかる検出に用いられる検体として
は、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織等の生
検から得ることができるゲノムＤＮＡや、ＲＮＡ又はｃ
ＤＮＡを具体的に挙げることができるがこれらに限定さ
れるものではなく、かかる検体を使用する場合、ＰＣＲ
等により増幅したものを用いることもできる。そして、
塩基配列の欠失や挿入変異は、正常な遺伝子型と比較し
たときの増幅産物のサイズの変化により検出でき、また
点突然変異は増幅ＤＮＡを標識非メチル化ＣｐＧ配列を
有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質
をコードする遺伝子とハイブリダイズさせることで同定
することができる。このように、非メチル化ＣｐＧ配列
を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク
質をコードする遺伝子の変異を検出することで、非メチ
ル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する
受容体タンパク質の活性又は発現と関連する疾病の診断
又は判定をすることができる。

【００４４】本発明はまた、非メチル化ＣｐＧ配列を有
する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質を
コードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又
は一部からなる非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮ
Ａを特異的に認識する受容体タンパク質の活性又は発現
と関連する疾患の診断用プローブ、及び当該プローブ及
び／又は本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌Ｄ
ＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に特異的に結
合する抗体を含有してなる非メチル化ＣｐＧ配列を有す
る細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質の活
性又は発現と関連する疾患の診断キットに関する。前記
診断用プローブとしては、非メチル化ＣｐＧ配列を有す
る細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコ
ードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の
アンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして
成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有
するものであれば特に制限されるものではない。かかる
プローブ及び／又は本発明の非メチル化ＣｐＧ配列を有
する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質に
特異的に結合する抗体を細菌感染症等のような症状の疾
患の診断薬の有効成分とするためには、プローブが分解
されないような適当なバッファー類や滅菌水に溶解する
ことが好ましい。また、これらの診断薬を用いた、免疫
染色法（Dev.Biol. 170, 207-222, 1995、J. Neurobio
l. 29, 1-17, 1996）や、In situハイブリダイゼーシ
ョン法（J. Neurobiol. 29, 1-17, 1996）や、in si
tu PCR法等の方法により細菌感染症等のような症状の疾
患を診断することもできる。

【００４５】本発明の医薬組成物としては、ＴＬＲ９等
の非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に
認識する受容体タンパク質の全部又はその一部や、上記
受容体タンパク質のアゴニストやアンタゴニストを含む
ものであれば、どのようなものでもよい。具体的には、
細菌感染症に対するワクチンや、癌に対するワクチン
や、気管支喘息をはじめとするアレルギー疾患の治療薬
や、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた治療や遺
伝子治療において障害となるＣｐＧモチーフの存在によ
る副作用の克服剤・抑制剤・阻害剤などを挙げることが
できる。

【００４６】前記のように、本発明の非メチル化ＣｐＧ
配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タン
パク質をコードするＤＮＡ配列の欠失、置換及び／又は
付加に関連する疾病の診断キットとしては、ＴＬＲ９を
コードするＤＮＡを含むものであればどのようなもので
もよく、かかるＴＬＲ９をコードするＤＮＡと検体中の
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認
識する受容体タンパク質をコードするＤＮＡとの塩基配
列を比較することにより、非メチル化ＣｐＧ配列を有す
る細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列の欠失、置換及び／又は付加に関連
する疾病、例えば、癌、アレルギー、伝染病等の診断が
可能となる。

【００４７】

【実施例】以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体
的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれら実施例
により限定されるものではない。 実施例１（ＴＬＲ９のクローニング） ヒトＴＬＲ４のＤＮＡ配列情報を用いて、GenBankをサ
ーチした結果、相同性がきわめて高いマウスＥＳＴ（登
録番号ＡＡ２７３７３１；マウス）を見い出した。この
マウスＥＳＴのＰＣＲ増幅産物をプローブとして、マウ
スＲＡＷ２６４．７ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングし、完全なＴＬＲ９オープンリーディングフレーム
を含む配列番号３に示される完全長のｃＤＮＡクローン
を単離した。このマウスＴＬＲ９のＤＮＡ配列情報を用
いてGenBankをサーチし、高い相同性を有するヒトゲノ
ム配列を見い出した。このヒトゲノム配列に基づいて、
ｃＤＮＡ端部を増幅し、Ｕ９３７細胞（J. Immunol. 16
3, 5039-5048, 1999）から、配列番号１に示される塩基
配列を有する完全長のヒトＴＬＲ９のｃＤＮＡを単離し
た。

【００４８】実施例２（ＴＬＲ９ノックアウトマウスの
作製） １２９／ＳｖＪマウス遺伝子ライブラリー（ストラタジ
ーン社製）からＴＬＲ９ゲノムＤＮＡを単離し、pBlues
cript II SK(+)ベクター（ストラタジーン社製）中でサ
ブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定
により特定した。ターゲッティングベクターは、ＬＲＲ
（ロイシンリッチリピート）領域の一部分をコードする
１．０ｋｂのフラグメントを、ネオマイシン耐性遺伝子
カセット（pMC1-neo；ストラタジーン社製）に置換し、
負の選択マーカーとして単純ヘルペスウィルスチミジン
キナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を挿入することにより構築し
た（図１）。このターゲッティングベクターを線状化
し、胎生１４．１日目の胚幹細胞（ＥＳ細胞）にエレク
トポレーションし、Ｇ４１８及びガンシクロビアに抵抗
性を示す２９２個のクローンを選択し、ＰＣＲ法及びサ
ザンブロット法により１４個のクローンをスクリーニン
グした。

【００４９】突然変異ＴＬＲ９対立遺伝子を含有してい
た３個の標的ＥＳクローンを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの
胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを
作製した。この雄のキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６雌マ
ウスと交配させ、ヘテロ接合体Ｆ１マウスを作製し、か
かるヘテロ接合体Ｆ１マウスをインタークロスすること
によってホモ接合体マウス（ＴＬＲ９ノックアウトマウ
ス：ＴＬＲ９^-/-）を得た（図２）。なお、ホモ接合体
マウスの確認は、マウスの尾から抽出した各ゲノムＤＮ
ＡをＳｃａＩでダイジェストし、図１に示すプローブを
用いたサザンブロット法により行った。本発明のＴＬＲ
９ノックアウトマウス（ＴＬＲ９^-/-）はメンデルの法
則に従い作製することができ、１２週目までは顕著な異
常を示さなかった。

【００５０】突然変異によりＴＬＲ９遺伝子の不活性化
が生起していることを確認するため、野生型マウス（＋
／＋）及びＴＬＲ９ノックアウトマウス（−／−）の脾
臓細胞から抽出した全ＲＮＡ（１０μｇ）を電気泳動に
かけナイロン膜に移して、［ ³²Ｐ］で標識したＴＬＲ９
のＣ−末端フラグメント若しくはＮ−末端フラグメン
ト、又はβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）に特異的なｃ
ＤＮＡを用いてノーザンブロット分析を行った（図
３）。これらの結果から、ＴＬＲ９ｍＲＮＡのＮ−末端
フラグメントはＴＬＲ９ノックアウトマウスの脾臓細胞
からは検出されなかった。また、Ｃ−末端フラグメント
をプローブとした場合、変異マウス由来のＴｌｒ９の転
写は野生型マウス由来のものとほぼ同じサイズのものが
検出されたが、生産量においては少ないことがわかっ
た。そこで、変異マウスから得られた脾臓細胞のｍＲＮ
Ａを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、得られた生成物の配
列分析を行った。この結果、転写されたＴｌｒ９遺伝子
にはｎｅｏ遺伝子が含まれており、このｎｅｏの挿入に
よって、ＴＬＲ９のＮ−末端部位にストップコドンが出
現し、変異マウスにおいて機能的なＴＬＲ９タンパク質
が発現しないことがわかった（図４）。なお、ＴＬＲ９
ノックアウトマウスのリンパ細胞をフローサイトメトリ
ーで測定した結果、異常成分は見られなかった。

【００５１】実施例３（腹腔マクロファージの調製） 野生型マウス（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）及びＴＬＲ９ノッ
クアウトマウス（ＴＬＲ９^-/-）のそれぞれの腹腔内に
４％のチオグリコール酸培地（ＤＩＦＣＯ社製）を２ｍ
ｌずつ注入し、３日後に各マウスの腹腔内から腹膜滲出
細胞を単離し、これらの細胞を１０％のウシ胎仔血清
（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地
（ＧＩＢＣＯ社製）中で３７℃にて２時間培養し、氷温
のハンクス緩衝液（Hank's buffered salt solution：
ＨＢＳＳ；ＧＩＢＣＯ社製）で洗浄することにより非付
着細胞を取り除き、付着細胞を腹膜マクロファージとし
て以下の実験に使用した。

【００５２】実施例４（ＴＬＲ９ノックアウトマウスの
非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対する応答
性） 最近、ＣｐＧ ＯＤＮ（oligodeoxynucleotide）の応答
性は、ＴＬＲを介するシグナル伝達経路の中のアダプタ
ータンパク質であるＭｙＤ８８に依存していることが明
らかになった。このＭｙＤ８８ノックアウトマウスはＣ
ｐＧ ＯＤＮに対して応答しないが、ＴＬＲ２ノックア
ウトマウスやＴＬＲ４ノックアウトマウスは正常にＣｐ
Ｇ ＯＤＮに対して応答する。これらのことは、ＣｐＧ
ＯＤＮがＴＬＲ２及びＴＬＲ４以外のＴＬＲによって
認識されることを示している。そこで、ＴＬＲ９ノックア
ウトマウスのＣｐＧ ＯＤＮに対する応答性を調べてみ
た。まず、腹腔マクロファージにおける炎症性サイトカ
インの産生量を以下のように測定した。

【００５３】実施例３により調製した各腹膜マクロファ
ージをＩＮＦγ（３０ｕｎｉｔ／ｍｌ）の存在下又は非
存在下において、図５に示された各種濃度のＣｐＧ Ｏ
ＤＮ（０．１又は１．０μＭ；TIB MOLBIOL社製；ＴＣ
Ｃ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＴＴＣ−ＣＴＧ−ＡＴＧ−Ｃ
Ｔ）、ＰＧＮ（１０μｇ／ｍｌ；Sigma and Fluka社
製；スタフィロコッカス・アウレウス由来）、ＬＰＳ
（１．０μｇ／ｍｌ；Sigma社製；サルモネラ・ミネソ
タＲｅ−５９５由来）といっしょに２４時間培養した。
培養後、培養上清中のＴＮＦα、ＩＬ−６及びＩＬ−１
２ ｐ４０の各濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。こ
の結果を図５に示す。これらの結果から、野生型マウス
（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）のマクロファージはＣｐＧ Ｏ
ＤＮに応答してＴＮＦα、ＩＬ−６及びＩＬ−１２を産
生し、さらにＩＦＮγ及びＣｐＧ ＯＤＮで刺激する
と、ＴＮＦα、ＩＬ−６及びＩＬ−１２の産生量が増加
することがわかった。しかし、ＴＬＲ９ノックアウトマ
ウス（ＴＬＲ９^-/-）由来のマクロファージは、ＩＦＮ
γの存在下でさえ、ＣｐＧ ＯＤＮに対する応答におい
て検出可能なレベルの炎症性サイトカインを産生してい
なかった。また、野生型マウス及びＴＬＲ９ノックアウ
トマウス由来のマクロファージは、ＬＰＳ又はＰＧＮに
対する応答によりＴＮＦα、ＩＬ−６及びＩＬ−１２を
ほぼ同程度産生することがわかった（図５）。なお、そ
れぞれの実験結果はｎ＝３の平均値を示す。図中のＮ．
Ｄ．は検出できなかったことを示す。

【００５４】また、ＣｐＧ ＯＤＮ又はＬＰＳに対する
野生型マウス（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）及びＴＬＲ９ノッ
クアウトマウス（ＴＬＲ９^-/-）の脾臓細胞の応答性に
ついて調べてみた。それぞれのマウスの脾臓細胞（１×
１０⁵）を単離し、図６に示す各種濃度のＣｐＧ ＯＤ
Ｎ又はＬＰＳにより９６ウェルプレート内で培養して脾
臓細胞を刺激した。培養から４０時間後に１μＣｉの［
³Ｈ］−チミジン（デュポント社製）を添加して更に８
時間培養し、［³Ｈ］の摂取量をβシンチレーションカ
ウンター（パッカード社製）で測定した（図６）。この
結果から、野生型マウスの脾臓細胞では、ＣｐＧ ＯＤ
ＮやＬＰＳの投与量に依存して細胞増殖反応を促進して
いたが、ＴＬＲ９ノックアウトマウスの脾臓細胞では、
いかなる濃度のＣｐＧ ＯＤＮ刺激においてもＣｐＧ
ＯＤＮによる細胞増殖反応は見られなかった。また、Ｃ
ｐＧ ＯＤＮに応答して、野生型マウス由来のＢ細胞表
面の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスIIの発
現が増加した。しかし、ＴＬＲ９ノックアウトマウス由
来のＢ細胞ではＣｐＧ ＯＤＮに誘導されたＭＨＣクラ
スIIの発現の増加は見られなかった。以上のことから、
ＴＬＲ９ノックアウトマウスのマクロファージやＢ細胞
は、ＣｐＧ ＯＤＮに対する応答性を特異的に欠如して
いることがわかった。

【００５５】次に、ＣｐＧ ＯＤＮを含有するバクテリ
ア由来ＤＮＡは樹状細胞を潜在的に刺激し、Ｔｈ１細胞
の発達をサポートすることが知られている（EMBO J. 1
8, 6973-6982, 1999、J. Immunol. 161, 3042-3049, 19
98、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9305-9310, 199
9）。そこでＣｐＧ ＯＤＮ誘導サイトカインの産生
と、骨髄由来の樹状細胞の表面分子のアップレギュレー
ションを分析した。野生型マウス（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐ
ｅ）又はＴＬＲ９ノックアウトマウス（ＴＬＲ９^-/-）
の骨髄細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのマウス顆粒球マクロフ
ァージ−コロニー刺激因子（Peprotech社製）を含む１
０％のウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で
培養し（J. Exp. Med. 176, 1693-1702, 1992）、培養
後６日目に未成熟の樹状細胞を回収し、０．１μＭのＣ
ｐＧ ＯＤＮ又は０．１μｇ／ｍｌのＬＰＳの存在下若
しくは非存在下において、１０％のウシ胎仔血清を添加
したＲＰＭＩ１６４０培地中で２日間培養した。培養
後、上清中のＩＬ−１２ ｐ４０の濃度をＥＬＩＳＡ法
で測定した（図７）。この結果から、野生型マウス由来
の樹状細胞はＣｐＧ ＯＤＮに応答してＩＬ−１２を産
生したが、ＴＬＲ９ノックアウトマウス由来の樹状細胞
においては、ＣｐＧ ＯＤＮはＩＬ−１２の産生を誘導
しなかった。

【００５６】上記１０ｎｇ／ｍｌのマウス顆粒球マクロ
ファージ−コロニー刺激因子（Peprotech社製）を含む
１０％のウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地
で培養し、６日目に回収された樹状細胞を、ＣＤ４０、
ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＭＨＣクラスIIに対する、それ
ぞれのビオチン化抗体により染色し、フィコエリトリン
（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：ＰＥ；ファーミンジェ
ン社製）で標識したストレプトアビジンで発展させ、こ
れらの細胞をセルクエストソフトウェア（ベクトンディ
ッキンソン社製）により蛍光活性化セルソーターキャリ
バー（FACS Calibur）で分析した（図８）。この結果か
ら、ＣｐＧ ＯＤＮで刺激すると、野生型マウス由来の
樹状細胞表面においては、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８
６及びＭＨＣクラスIIの発現を促進していたが、ＴＬＲ
９ノックアウトマウス由来の樹状細胞表面では、ＣｐＧ
ＯＤＮに対する応答によりこれらの分子の発現を促進
しなかった（図８）。ＬＰＳによる刺激では、野生型マ
ウス由来の樹状細胞もＴＬＲ９ノックアウトマウス由来
の樹状細胞も同様の応答がみられた。以上の結果から、
ＴＬＲ９はＣｐＧ ＯＤＮの細胞応答に不可欠な受容体
であることがわかった。

【００５７】実施例５（ＴＬＲ９ノックアウトマウス由
来のマクロファージのＣｐＧ ＯＤＮに対する応答によ
るＮＦ−κＢ、ＪＮＫ及びＩＲＡＫの活性化） ＴＬＲのシグナルは、アダプター分子であるＭｙＤ８８
を介してセリン／トレオニンキナーゼであるＩＲＡＫを
活性化し、次いでＭＡＰキナーゼ及びＮＦ−κＢを活性
化することが知られている（Immunity 11, 115-122, 19
99）。そこでＣｐＧ ＯＤＮが、かかる細胞内シグナル
伝達分子を活性化するかどうかを調べてみた。実施例３
により調製した野生型マウス及びＴＬＲ９ノックアウト
マウスの腹腔マクロファージ（１×１０⁶cells）を、
１．０μＭのＣｐＧ ＯＤＮ又は１．０μｇ／ｍｌのサ
ルモネラ・ミネソタＲｅ−５９５のＬＰＳで図９に示さ
れた時間刺激し、各マウスのマクロファージから核蛋白
質を抽出し、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合部位を含む特異的
プローブといっしょにインキュベートし、電気泳動を行
い、オートラジオグラフィーにより視覚化した（図
９）。

【００５８】この結果から、ＣｐＧ ＯＤＮで刺激する
と、野生型マウス由来のマクロファージではＮＦ−κＢ
のＤＮＡ結合活性が増加するのに対し、ＴＬＲ９ノック
アウトマウス由来のマクロファージではＮＦ−κＢのＤ
ＮＡ結合活性は増加しなかった。ＴＬＲ９ノックアウト
マウス由来のマクロファージをＬＰＳで刺激したもの
は、野生型マウス由来のマクロファージをＬＰＳで刺激
したものと同様のＮＦ−κＢの活性化が見られた。以上
の結果から、ＣｐＧ ＯＤＮの誘導によるＮＦ−κＢの
活性がＴＬＲ９ノックアウトマウス由来のマクロファー
ジにおいて特異的に欠損していることがわかる。なお、
図中の矢印はＮＦ−κＢと特異的プローブとの複合物の
位置を示し、矢頭は特異的プローブのみの位置を示して
いる。

【００５９】上記と同様に図１０又は図１１で示された
時間、ＣｐＧ ＯＤＮ又はＬＰＳで刺激した野生型マウ
ス及びＴＬＲ９ノックアウトマウスのマクロファージ
を、溶解緩衝液（最終濃度で１．０％のトリトンＸ−１
００、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣ
ｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール、１ｍＭ
のＰＭＳＦ、２０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２０μｇ
／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのＮａ₃ＶＯ₄及び１０ｍ
Ｍのβ−グリセロリン酸を含有する緩衝液；ｐＨ８．
０）中にて溶解し、この細胞溶解物を抗ＪＮＫ抗体（サ
ンタクルス社製）又は抗ＩＲＡＫ抗体（林原生化学研究
所株式会社製）で免疫沈降して、文献（Immunity 11, 1
15-122, 1999）記載のように、インビトロキナーゼアッ
セイを行い、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ溶解蛋白質（ＧＳＴ−
ｃ−Ｊｕｎ）を基質としたＪＮＫ活性及びＩＲＡＫの活
性を測定した（図１０，１１における上段；ＧＳＴ−ｃ
−Ｊｕｎ，Ａｕｔｏ）。

【００６０】また、上記細胞溶解物を、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分離させ、ニトロセル
ロース膜に移し、この膜を抗ＪＮＫ抗体（サンタクルス
社製）又は抗ＩＲＡＫ抗体（Transduction Laboratorie
s社製）でブロットして、エンハンスド・ケミルミネッ
センス装置（デュポント社製）を使用して視覚化した
（図１０，１１における下段；ＷＢ）。以上の結果か
ら、ＣｐＧ ＯＤＮは野生型マウス由来のマクロファー
ジのＪＮＫ及びＩＲＡＫを活性化するが、ＴＬＲ９ノッ
クアウトマウス由来のマクロファージでは全く活性化し
ないことがわかった（図１０，１１）。したがって、Ｃ
ｐＧ ＯＤＮを介する情報伝達はＴＬＲ９に依存してい
ることがわかった。

【００６１】

【発明の効果】メチル化されていないＣｐＧモチーフを
含有するバクテリア由来ＤＮＡは免疫細胞を非常に活性
化し、Ｔｈ１の応答を誘導するが、そのバクテリア由来
ＤＮＡを認識する受容体は知られていなかった。本発明
により、細菌ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧ配列を含むオリ
ゴヌクレオチドの受容体が明らかとなったことから、非
メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識
するＴＬＲファミリーのメンバー受容体タンパク質ＴＬ
Ｒ９や、それをコードする遺伝子ＤＮＡ等は、細菌性疾
病等の診断や、治療に用いることができ、またＴＬＲ９
ノックアウト動物を用いると、バクテリア由来ＤＮＡの
分子レベルにおける作用機作を明らかにすることが可能
となる。

【００６２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION <120> Specific receptor that recognizes bacterial DNA <130> A031P63 <140> <141> <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 3257 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (107)..(3205) <400> 1 ccgctgctgc ccctgtggga agggacctcg agtgtgaagc atccttccct gtagctgctg 60 tccagtctgc ccgccagacc ctctggagaa gcccctgccc cccagc atg ggt ttc 115 Met Gly Phe 1 tgc cgc agc gcc ctg cac ccg ctg tct ctc ctg gtg cag gcc atc atg 163 Cys Arg Ser Ala Leu His Pro Leu Ser Leu Leu Val Gln Ala Ile Met 5 10 15 ctg gcc atg acc ctg gcc ctg ggt acc ttg cct gcc ttc cta ccc tgt 211 Leu Ala Met Thr Leu Ala Leu Gly Thr Leu Pro Ala Phe Leu Pro Cys 20 25 30 35 gag ctc cag ccc cac ggc ctg gtg aac tgc aac tgg ctg ttc ctg aag 259 Glu Leu Gln Pro His Gly Leu Val Asn Cys Asn Trp Leu Phe Leu Lys 40 45 50 tct gtg ccc cac ttc tcc atg gca gca ccc cgt ggc aat gtc acc agc 307 Ser Val Pro His Phe Ser Met Ala Ala Pro Arg Gly Asn Val Thr Ser 55 60 65 ctt tcc ttg tcc tcc aac cgc atc cac cac ctc cat gat tct gac ttt 355 Leu Ser Leu Ser Ser Asn Arg Ile His His Leu His Asp Ser Asp Phe 70 75 80 gcc cac ctg ccc agc ctg cgg cat ctc aac ctc aag tgg aac tgc ccg 403 Ala His Leu Pro Ser Leu Arg His Leu Asn Leu Lys Trp Asn Cys Pro 85 90 95 ccg gtt ggc ctc agc ccc atg cac ttc ccc tgc cac atg acc atc gag 451 Pro Val Gly Leu Ser Pro Met His Phe Pro Cys His Met Thr Ile Glu 100 105 110 115 ccc agc acc ttc ttg gct gtg ccc acc ctg gaa gag cta aac ctg agc 499 Pro Ser Thr Phe Leu Ala Val Pro Thr Leu Glu Glu Leu Asn Leu Ser 120 125 130 tac aac aac atc atg act gtg cct gcg ctg ccc aaa tcc ctc ata tcc 547 Tyr Asn Asn Ile Met Thr Val Pro Ala Leu Pro Lys Ser Leu Ile Ser 135 140 145 ctg tcc ctc agc cat acc aac atc ctg atg cta gac tct gcc agc ctc 595 Leu Ser Leu Ser His Thr Asn Ile Leu Met Leu Asp Ser Ala Ser Leu 150 155 160 gcc ggc ctg cat gcc ctg cgc ttc cta ttc atg gac ggc aac tgt tat 643 Ala Gly Leu His Ala Leu Arg Phe Leu Phe Met Asp Gly Asn Cys Tyr 165 170 175 tac aag aac ccc tgc agg cag gca ctg gag gtg gcc ccg ggt gcc ctc 691 Tyr Lys Asn Pro Cys Arg Gln Ala Leu Glu Val Ala Pro Gly Ala Leu 180 185 190 195 ctt ggc ctg ggc aac ctc acc cac ctg tca ctc aag tac aac aac ctc 739 Leu Gly Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Ser Leu Lys Tyr Asn Asn Leu 200 205 210 act gtg gtg ccc cgc aac ctg cct tcc agc ctg gag tat ctg ctg ttg 787 Thr Val Val Pro Arg Asn Leu Pro Ser Ser Leu Glu Tyr Leu Leu Leu 215 220 225 tcc tac aac cgc atc gtc aaa ctg gcg cct gag gac ctg gcc aat ctg 835 Ser Tyr Asn Arg Ile Val Lys Leu Ala Pro Glu Asp Leu Ala Asn Leu 230 235 240 acc gcc ctg cgt gtg ctc gat gtg ggc gga aat tgc cgc cgc tgc gac 883 Thr Ala Leu Arg Val Leu Asp Val Gly Gly Asn Cys Arg Arg Cys Asp 245 250 255 cac gct ccc aac ccc tgc atg gag tgc cct cgt cac ttc ccc cag cta 931 His Ala Pro Asn Pro Cys Met Glu Cys Pro Arg His Phe Pro Gln Leu 260 265 270 275 cat ccc gat acc ttc agc cac ctg agc cgt ctt gaa ggc ctg gtg ttg 979 His Pro Asp Thr Phe Ser His Leu Ser Arg Leu Glu Gly Leu Val 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Leu Gln Met Asn Phe Ile 390 395 400 aac cag gcc cag ctc ggc atc ttc agg gcc ttc cct ggc ctg cgc tac 1363 Asn Gln Ala Gln Leu Gly Ile Phe Arg Ala Phe Pro Gly Leu Arg Tyr 405 410 415 gtg gac ctg tcg gac aac cgc atc agc gga gct tcg gag ctg aca gcc 1411 Val Asp Leu Ser Asp Asn Arg Ile Ser Gly Ala Ser Glu Leu Thr Ala 420 425 430 435 acc atg ggg gag gca gat gga ggg gag aag gtc tgg ctg cag cct ggg 1459 Thr Met Gly Glu Ala Asp Gly Gly Glu Lys Val Trp Leu Gln Pro Gly 440 445 450 gac ctt gct ccg gcc cca gtg gac act ccc agc tct gaa gac ttc agg 1507 Asp Leu Ala Pro Ala Pro Val Asp Thr Pro Ser Ser Glu Asp Phe Arg 455 460 465 ccc aac tgc agc acc ctc aac ttc acc ttg gat ctg tca cgg aac aac 1555 Pro Asn Cys Ser Thr Leu Asn Phe Thr Leu Asp Leu Ser Arg Asn Asn 470 475 480 ctg gtg acc gtg cag ccg gag atg ttt gcc cag ctc tcg cac ctg cag 1603 Leu Val Thr Val Gln Pro Glu Met Phe Ala Gln Leu Ser His Leu Gln 485 490 495 tgc ctg cgc ctg agc cac aac tgc atc tcg cag gca gtc aat ggc tcc 1651 Cys Leu Arg Leu Ser His Asn Cys Ile Ser Gln Ala Val Asn Gly Ser 500 505 510 515 cag ttc ctg ccg ctg acc ggt ctg cag gtg cta gac ctg tcc cac aat 1699 Gln Phe Leu Pro Leu Thr Gly Leu Gln Val Leu Asp Leu Ser His Asn 520 525 530 aag ctg gac ctc tac cac gag cac tca ttc acg gag cta cca cga ctg 1747 Lys Leu Asp Leu Tyr His Glu His Ser Phe Thr Glu Leu Pro Arg Leu 535 540 545 gag gcc ctg gac ctc agc tac aac agc cag ccc ttt ggc atg cag ggc 1795 Glu Ala Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Ser Gln Pro Phe Gly Met Gln Gly 550 555 560 gtg ggc cac aac ttc agc ttc gtg gct cac ctg cgc acc ctg cgc cac 1843 Val Gly His Asn Phe Ser Phe Val Ala His Leu Arg Thr Leu Arg His 565 570 575 ctc agc ctg gcc cac aac aac atc cac agc caa gtg tcc cag cag ctc 1891 Leu Ser Leu Ala His Asn Asn Ile His Ser Gln Val Ser Gln Gln Leu 580 585 590 595 tgc agt acg tcg ctg cgg gcc ctg gac ttc agc ggc aat gca ctg ggc 1939 Cys Ser Thr Ser Leu Arg Ala Leu Asp Phe Ser Gly Asn Ala Leu Gly 600 605 610 cat atg tgg gcc gag gga gac ctc tat ctg cac ttc ttc caa ggc ctg 1987 His Met Trp Ala Glu Gly Asp Leu Tyr Leu His Phe Phe Gln Gly Leu 615 620 625 agc ggt ttg atc tgg ctg gac ttg tcc cag aac cgc ctg cac acc ctc 2035 Ser Gly Leu Ile Trp Leu Asp Leu Ser Gln Asn Arg Leu His Thr Leu 630 635 640 ctg ccc caa acc ctg cgc aac ctc ccc aag agc cta cag gtg ctg cgt 2083 Leu Pro Gln Thr Leu Arg Asn Leu Pro Lys Ser Leu Gln Val Leu Arg 645 650 655 ctc cgt gac aat tac ctg gcc ttc ttt aag tgg tgg agc ctc cac ttc 2131 Leu Arg Asp Asn Tyr Leu Ala Phe Phe Lys Trp Trp Ser Leu His Phe 660 665 670 675 ctg ccc aaa ctg gaa gtc ctc gac ctg gca gga aac cag ctg aag gcc 2179 Leu Pro Lys Leu Glu Val Leu Asp Leu Ala Gly Asn Gln Leu Lys Ala 680 685 690 ctg acc aat ggc agc ctg cct gct ggc acc cgg ctc cgg agg ctg gat 2227 Leu Thr Asn Gly Ser Leu Pro Ala Gly Thr Arg Leu Arg Arg Leu Asp 695 700 705 gtc agc tgc aac agc atc agc ttc gtg gcc ccc ggc ttc ttt tcc aag 2275 Val Ser Cys Asn Ser Ile Ser Phe Val Ala Pro Gly Phe Phe Ser Lys 710 715 720 gcc aag gag ctg cga gag ctc aac ctt agc gcc aac gcc ctc aag aca 2323 Ala Lys Glu Leu Arg Glu Leu Asn Leu Ser Ala Asn Ala Leu Lys Thr 725 730 735 gtg gac cac tcc tgg ttt ggg ccc ctg gcg agt gcc ctg caa ata cta 2371 Val Asp His Ser Trp Phe Gly Pro Leu Ala Ser Ala Leu Gln Ile Leu 740 745 750 755 gat gta agc gcc aac cct ctg cac tgc gcc tgt ggg gcg gcc ttt atg 2419 Asp Val Ser Ala Asn Pro Leu His Cys Ala Cys Gly Ala Ala Phe Met 760 765 770 gac ttc ctg ctg gag gtg cag gct gcc gtg ccc ggt ctg ccc agc cgg 2467 Asp Phe Leu Leu Glu Val Gln Ala Ala Val Pro Gly Leu Pro Ser Arg 775 780 785 gtg aag tgt ggc agt ccg ggc cag ctc cag ggc ctc agc atc ttt gca 2515 Val Lys Cys Gly Ser Pro Gly Gln Leu Gln Gly Leu Ser Ile Phe Ala 790 795 800 cag gac ctg cgc ctc tgc ctg gat gag gcc ctc tcc tgg gac tgt ttc 2563 Gln Asp Leu Arg Leu Cys Leu Asp Glu Ala Leu Ser Trp Asp Cys Phe 805 810 815 gcc ctc tcg ctg ctg gct gtg gct ctg ggc ctg ggt gtg ccc atg ctg 2611 Ala Leu Ser Leu Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Gly Val Pro Met Leu 820 825 830 835 cat cac ctc tgt ggc 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att gag 451 Pro Thr Gly Leu Ser Pro Leu His Phe Ser Cys His Met Thr Ile Glu 100 105 110 115 ccc aga acc ttc ctg gct atg cgt aca ctg gag gag ctg aac ctg agc 499 Pro Arg Thr Phe Leu Ala Met Arg Thr Leu Glu Glu Leu Asn Leu Ser 120 125 130 tat aat ggt atc acc act gtg ccc cga ctg ccc agc tcc ctg gtg aat 547 Tyr Asn Gly Ile Thr Thr Val Pro Arg Leu Pro Ser Ser Leu Val Asn 135 140 145 ctg agc ctg agc cac acc aac atc ctg gtt cta gat gct aac agc ctc 595 Leu Ser Leu Ser His Thr Asn Ile Leu Val Leu Asp Ala Asn Ser Leu 150 155 160 gcc ggc cta tac agc ctg cgc gtt ctc ttc atg gac ggg aac tgc tac 643 Ala Gly Leu Tyr Ser Leu Arg Val Leu Phe Met Asp Gly Asn Cys Tyr 165 170 175 tac aag aac ccc tgc aca gga gcg gtg aag gtg acc cca ggc gcc ctc 691 Tyr Lys Asn Pro Cys Thr Gly Ala Val Lys Val Thr Pro Gly Ala Leu 180 185 190 195 ctg ggc ctg agc aat ctc acc cat ctg tct gtg aag tat aac aac ctc 739 Leu Gly Leu Ser Asn Leu Thr His Leu Ser Val Lys Tyr Asn Asn Leu 200 205 210 aca aag gtg ccc cgc caa ctg ccc ccc agc 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ttt cag aac cta acc cgc ctg cgc aag ctc 1123 Ile Asn His Thr Asn Ala Phe Gln Asn Leu Thr Arg Leu Arg Lys Leu 325 330 335 aac ctg tcc ttc aat tac cgc aag aag gta tcc ttt gcc cgc ctc cac 1171 Asn Leu Ser Phe Asn Tyr Arg Lys Lys Val Ser Phe Ala Arg Leu His 340 345 350 355 ctg gca agt tcc ttc aag aac ctg gtg tca ctg cag gag ctg aac atg 1219 Leu Ala Ser Ser Phe Lys Asn Leu Val Ser Leu Gln Glu Leu Asn Met 360 365 370 aac ggc atc ttc ttc cgc tcg ctc aac aag tac acg ctc aga tgg ctg 1267 Asn Gly Ile Phe Phe Arg Ser Leu Asn Lys Tyr Thr Leu Arg Trp Leu 375 380 385 gcc gat ctg ccc aaa ctc cac act ctg cat ctt caa atg aac ttc atc 1315 Ala Asp Leu Pro Lys Leu His Thr Leu His Leu Gln Met Asn Phe Ile 390 395 400 aac cag gca cag ctc agc atc ttt ggt acc ttc cga gcc ctt cgc ttt 1363 Asn Gln Ala Gln Leu Ser Ile Phe Gly Thr Phe Arg Ala Leu Arg Phe 405 410 415 gtg gac ttg tca gac aat cgc atc agt ggg cct tca acg ctg tca gaa 1411 Val Asp Leu Ser Asp Asn Arg Ile Ser Gly Pro Ser Thr Leu Ser Glu 420 425 430 435 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Pro Lys Ser Leu Lys Leu Leu 645 650 655 agc ctc cga gac aac tac cta tct ttc ttt aac tgg acc agt ctg tcc 2131 Ser Leu Arg Asp Asn Tyr Leu Ser Phe Phe Asn Trp Thr Ser Leu Ser 660 665 670 675 ttc ctg ccc aac ctg gaa gtc cta gac ctg gca ggc aac cag cta aag 2179 Phe Leu Pro Asn Leu Glu Val Leu Asp Leu Ala Gly Asn Gln Leu Lys 680 685 690 gcc ctg acc aat ggc acc ctg cct aat ggc acc ctc ctc cag aaa ctg 2227 Ala Leu Thr Asn Gly Thr Leu Pro Asn Gly Thr Leu Leu Gln Lys Leu 695 700 705 gat gtc agc agc aac agt atc gtc tct gtg gtc cca gcc ttc ttc gct 2275 Asp Val Ser Ser Asn Ser Ile Val Ser Val Val Pro Ala Phe Phe Ala 710 715 720 ctg gcg gtc gag ctg aaa gag gtc aac ctc agc cac aac att ctc aag 2323 Leu Ala Val Glu Leu Lys Glu Val Asn Leu Ser His Asn Ile Leu Lys 725 730 735 acg gtg gat cgc tcc tgg ttt ggg ccc att gtg atg aac ctg aca gtt 2371 Thr Val Asp Arg Ser Trp Phe Gly Pro Ile Val Met Asn Leu Thr Val 740 745 750 755 cta gac gtg aga agc aac cct ctg cac tgt gcc tgt ggg gca gcc ttc 2419 Leu Asp Val Arg Ser Asn Pro Leu His Cys Ala Cys Gly Ala Ala Phe 760 765 770 gta gac tta ctg ttg gag gtg cag acc aag gtg cct ggc ctg gct aat 2467 Val Asp Leu Leu Leu Glu Val Gln Thr Lys Val Pro Gly Leu Ala Asn 775 780 785 ggt gtg aag tgt ggc agc ccc ggc cag ctg cag ggc cgt agc atc ttc 2515 Gly Val Lys Cys Gly Ser Pro Gly Gln Leu Gln Gly Arg Ser Ile Phe 790 795 800 gca cag gac ctg cgg ctg tgc ctg gat gag gtc ctc tct tgg gac tgc 2563 Ala Gln Asp Leu Arg Leu Cys Leu Asp Glu Val Leu Ser Trp Asp Cys 805 810 815 ttt ggc ctt tca ctc ttg gct gtg gcc gtg ggc atg gtg gtg cct ata 2611 Phe Gly Leu Ser Leu Leu Ala Val Ala Val Gly Met Val Val Pro Ile 820 825 830 835 ctg cac cat ctc tgc ggc tgg gac gtc tgg tac tgt ttt cat ctg tgc 2659 Leu His His Leu Cys Gly Trp Asp Val Trp Tyr Cys Phe His Leu Cys 840 845 850 ctg gca tgg cta cct ttg ctg gcc cgc agc cga cgc agc gcc caa gct 2707 Leu Ala Trp Leu Pro Leu Leu Ala Arg Ser Arg Arg Ser Ala Gln Ala 855 860 865 ctc ccc tat gat gcc ttc gtg gtg ttc gat aag gca cag agc gca gtt 2755 Leu Pro Tyr Asp Ala Phe Val Val Phe Asp Lys Ala Gln Ser Ala Val 870 875 880 gcg gac tgg gtg tat aac gag ctg cgg gtg cgg ctg gag gag cgg cgc 2803 Ala Asp Trp Val Tyr Asn Glu Leu Arg Val Arg Leu Glu Glu Arg Arg 885 890 895 ggt cgc cga gcc cta cgc ttg tgt ctg gag gac cga gat tgg ctg cct 2851 Gly Arg Arg Ala Leu Arg Leu Cys Leu Glu Asp Arg Asp Trp Leu Pro 900 905 910 915 ggc cag acg ctc ttc gag aac ctc tgg gct tcc atc tat ggg agc cgc 2899 Gly Gln Thr Leu Phe Glu Asn Leu Trp Ala Ser Ile Tyr Gly Ser Arg 920 925 930 aag act cta ttt gtg ctg gcc cac acg gac cgc gtc agt ggc ctc ctg 2947 Lys Thr Leu Phe Val Leu Ala His Thr Asp Arg Val Ser Gly Leu Leu 935 940 945 cgc acc agc ttc ctg ctg gct cag cag cgc ctg ttg gaa gac cgc aag 2995 Arg Thr Ser Phe Leu Leu Ala Gln Gln Arg Leu Leu Glu Asp Arg Lys 950 955 960 gac gtg gtg gtg ttg gtg atc ctg cgt ccg gat gcc cac cgc tcc cgc 3043 Asp Val Val Val Leu Val Ile Leu Arg Pro Asp Ala His Arg Ser Arg 965 970 975 tat gtg cga ctg cgc cag cgt ctc tgc cgc cag agt gtg ctc ttc tgg 3091 Tyr Val Arg Leu Arg Gln Arg Leu Cys Arg Gln Ser Val Leu Phe Trp 980 985 990 995 ccc cag cag ccc aac ggg cag ggg ggc ttc tgg gcc cag ctg agt aca 3139 Pro Gln Gln Pro Asn Gly Gln Gly Gly Phe Trp Ala Gln Leu Ser Thr 1000 1005 1010 gcc ctg act agg gac aac cgc cac ttc tat aac cag aac ttc tgc cgg 3187 Ala Leu Thr Arg Asp Asn Arg His Phe Tyr Asn Gln Asn Phe Cys Arg 1015 1020 1025 gga cct aca gca gaa tag ctcagagcaa cagctggaaa cagctgcatc 3235 Gly Pro Thr Ala Glu 1030 ttcatgcctg gttcccgagt tgctctgcct gccttgctct gtcttactac accgctattt 3295 ggcaagtgcg caatatatgc taccaagcca ccaggcccac ggagcaaagg ttggcagtaa 3355 agggtagttt tcttcccatg catctttcag gagagtgaag atagacacca gacccacaca 3415 gaacaggact ggagttcatt ctctgcccct ccaccccact ttgcctgtct ctgtat 3471 <210> 4 <211> 1032 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Val Leu Arg Arg Arg Thr Leu His Pro Leu Ser Leu Leu Val Gln 1 5 10 15 Ala Ala Val Leu Ala Glu Thr Leu Ala Leu Gly Thr Leu Pro Ala Phe 20 25 30 Leu Pro Cys Glu Leu Lys Pro His Gly Leu Val Asp Cys Asn Trp Leu 35 40 45 Phe Leu Lys Ser Val Pro Arg Phe Ser Ala Ala Ala Ser Cys Ser Asn 50 55 60 Ile Thr Arg Leu Ser Leu Ile Ser Asn Arg Ile His His Leu His Asn 65 70 75 80 Ser Asp Phe Val His Leu Ser Asn Leu Arg Gln Leu Asn Leu Lys Trp 85 90 95 Asn Cys Pro Pro Thr Gly Leu Ser Pro Leu His Phe Ser Cys His Met 100 105 110 Thr Ile Glu Pro Arg Thr Phe Leu Ala Met Arg Thr Leu Glu Glu Leu 115 120 125 Asn Leu Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Thr Val Pro Arg Leu Pro Ser Ser 130 135 140 Leu Val Asn Leu Ser Leu Ser His Thr Asn Ile Leu Val Leu Asp Ala 145 150 155 160 Asn Ser Leu Ala Gly Leu Tyr Ser Leu Arg Val Leu Phe Met Asp Gly 165 170 175 Asn Cys Tyr Tyr Lys Asn Pro Cys Thr Gly Ala Val Lys Val Thr Pro 180 185 190 Gly Ala Leu Leu Gly Leu Ser Asn Leu Thr His Leu Ser Val Lys Tyr 195 200 205 Asn Asn Leu Thr Lys Val Pro Arg Gln Leu Pro Pro Ser Leu Glu Tyr 210 215 220 Leu Leu Val Ser Tyr Asn Leu Ile Val Lys Leu Gly Pro Glu Asp Leu 225 230 235 240 Ala Asn Leu Thr Ser Leu Arg Val Leu Asp Val Gly Gly Asn Cys Arg 245 250 255 Arg Cys Asp His Ala Pro Asn Pro Cys Ile Glu Cys Gly Gln Lys Ser 260 265 270 Leu His Leu His Pro Glu Thr Phe His His Leu Ser His Leu Glu Gly 275 280 285 Leu Val Leu Lys Asp Ser Ser Leu His Thr Leu Asn Ser Ser Trp Phe 290 295 300 Gln Gly Leu Val Asn Leu Ser Val Leu Asp Leu Ser Glu Asn Phe Leu 305 310 315 320 Tyr Glu Ser Ile Asn His Thr Asn Ala Phe Gln Asn Leu Thr Arg Leu 325 330 335 Arg Lys Leu Asn Leu Ser Phe Asn Tyr Arg Lys Lys Val Ser Phe Ala 340 345 350 Arg Leu His Leu Ala Ser Ser Phe Lys Asn Leu Val Ser Leu Gln Glu 355 360 365 Leu Asn Met Asn Gly Ile Phe Phe Arg Ser Leu Asn Lys Tyr Thr Leu 370 375 380 Arg Trp Leu Ala Asp Leu Pro Lys Leu His Thr Leu His Leu Gln Met 385 390 395 400 Asn Phe Ile Asn Gln Ala Gln Leu Ser Ile Phe Gly Thr Phe Arg Ala 405 410 415 Leu Arg Phe Val Asp Leu Ser Asp Asn Arg Ile Ser Gly Pro Ser Thr 420 425 430 Leu Ser Glu Ala Thr Pro Glu Glu Ala Asp Asp Ala Glu Gln Glu Glu 435 440 445 Leu Leu Ser Ala Asp Pro His Pro Ala Pro Leu Ser Thr Pro Ala Ser 450 455 460 Lys Asn Phe Met Asp Arg Cys Lys Asn Phe Lys Phe Thr Met Asp Leu 465 470 475 480 Ser Arg Asn Asn Leu Val Thr Ile Lys Pro Glu Met Phe Val Asn Leu 485 490 495 Ser Arg Leu Gln Cys Leu Ser Leu Ser His Asn Ser Ile Ala Gln Ala 500 505 510 Val Asn Gly Ser Gln Phe Leu Pro Leu Thr Asn Leu Gln Val Leu Asp 515 520 525 Leu Ser His Asn Lys Leu Asp Leu Tyr His Trp Lys Ser Phe Ser Glu 530 535 540 Leu Pro Gln Leu Gln Ala Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Ser Gln Pro Phe 545 550 555 560 Ser Met Lys Gly Ile Gly His Asn Phe Ser Phe Val Ala His Leu Ser 565 570 575 Met Leu His Ser Leu Ser Leu Ala His Asn Asp Ile His Thr Arg Val 580 585 590 Ser Ser His Leu Asn Ser Asn Ser Val Arg Phe Leu Asp Phe Ser Gly 595 600 605 Asn Gly Met Gly Arg Met Trp Asp Glu Gly Gly Leu Tyr Leu His Phe 610 615 620 Phe Gln Gly Leu Ser Gly Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ser Gln Asn Asn 625 630 635 640 Leu His Ile Leu Arg Pro Gln Asn Leu Asp Asn Leu Pro Lys Ser Leu 645 650 655 Lys Leu Leu Ser Leu Arg Asp Asn Tyr Leu Ser Phe Phe Asn Trp Thr 660 665 670 Ser Leu Ser Phe Leu Pro Asn Leu Glu Val Leu Asp Leu Ala Gly Asn 675 680 685 Gln Leu Lys Ala Leu Thr Asn Gly Thr Leu Pro Asn Gly Thr Leu Leu 690 695 700 Gln Lys Leu Asp Val Ser Ser Asn Ser Ile Val Ser Val Val Pro Ala 705 710 715 720 Phe Phe Ala Leu Ala Val Glu Leu Lys Glu Val Asn Leu Ser His Asn 725 730 735 Ile Leu Lys Thr Val Asp Arg Ser Trp Phe Gly Pro Ile Val Met Asn 740 745 750 Leu Thr Val Leu Asp Val Arg Ser Asn Pro Leu His Cys Ala Cys Gly 755 760 765 Ala Ala Phe Val Asp Leu Leu Leu Glu Val Gln Thr Lys Val Pro Gly 770 775 780 Leu Ala Asn Gly Val Lys Cys Gly Ser Pro Gly Gln Leu Gln Gly Arg 785 790 795 800 Ser Ile Phe Ala Gln Asp Leu Arg Leu Cys Leu Asp Glu Val Leu Ser 805 810 815 Trp Asp Cys Phe Gly Leu Ser Leu Leu Ala Val Ala Val Gly Met Val 820 825 830 Val Pro Ile Leu His His Leu Cys Gly Trp Asp Val Trp Tyr Cys Phe 835 840 845 His Leu Cys Leu Ala Trp Leu Pro Leu Leu Ala Arg Ser Arg Arg Ser 850 855 860 Ala Gln Ala Leu Pro Tyr Asp Ala Phe Val Val Phe Asp Lys Ala Gln 865 870 875 880 Ser Ala Val Ala Asp Trp Val Tyr Asn Glu Leu Arg Val Arg Leu Glu 885 890 895 Glu Arg Arg Gly Arg Arg Ala Leu Arg Leu Cys Leu Glu Asp Arg Asp 900 905 910 Trp Leu Pro Gly Gln Thr Leu Phe Glu Asn Leu Trp Ala Ser Ile Tyr 915 920 925 Gly Ser Arg Lys Thr Leu Phe Val Leu Ala His Thr Asp Arg Val Ser 930 935 940 Gly Leu Leu Arg Thr Ser Phe Leu Leu Ala Gln Gln Arg Leu Leu Glu 945 950 955 960 Asp Arg Lys Asp Val Val Val Leu Val Ile Leu Arg Pro Asp Ala His 965 970 975 Arg Ser Arg Tyr Val Arg Leu Arg Gln Arg Leu Cys Arg Gln Ser Val 980 985 990 Leu Phe Trp Pro Gln Gln Pro Asn Gly Gln Gly Gly Phe Trp Ala Gln 995 1000 1005 Leu Ser Thr Ala Leu Thr Arg Asp Asn Arg His Phe Tyr Asn Gln Asn 1010 1015 1020 Phe Cys Arg Gly Pro Thr Ala Glu 1025 1030 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:CpG ODN <400> 5 tccatgacgt tcctgatgct 20

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウスと野生型
マウスの遺伝子地図を示す図である。

【図２】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウスのサザン
ブロット分析の結果を示す図である。

【図３】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウスの脾臓細
胞におけるノーザンブロット分析の結果を示す図であ
る。

【図４】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウスと野生型
マウスのアミノ酸配列の比較結果を示す図である。

【図５】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウス及び野生
型マウスにおけるＣｐＧ ＯＤＮ、ＰＧＮ又はＬＰＳ誘
導によるＴＮＦα、ＩＬ−６又はＩＬ１２の産生量の結
果を示す図である。

【図６】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウス及び野生
型マウスにおけるＣｐＧ ＯＤＮ又はＬＰＳ誘導による
細胞増殖応答の結果を示す図である。

【図７】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウス及び野生
型マウスにおけるＣｐＧ ＯＤＮ又はＬＰＳ誘導による
ＩＬ−１２の産生量の結果を示す図である。

【図８】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウス及び野生
型マウスにおけるＣｐＧ ＯＤＮ又はＬＰＳ誘導による
ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＭＨＣクラスIIの発
現量の結果を示す図である。

【図９】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウス及び野生
型マウスにおけるＣｐＧ ＯＤＮ又はＬＰＳ誘導による
ＮＦ−κＢの活性化の結果を示す図である。

【図１０】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウス及び野
生型マウスにおけるＣｐＧ ＯＤＮ又はＬＰＳ誘導によ
るＪＮＫの活性化の結果を示す図である。

【図１１】本発明のＴＬＲ９ノックアウトマウス及び野
生型マウスにおけるＣｐＧ ＯＤＮ又はＬＰＳ誘導によ
るＩＲＡＫの活性化の結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/08 Ｃ０７Ｋ 16/28 ４Ｃ０８４ Ｃ０７Ｋ 14/005 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 33/577 Ｂ 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/566 (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 33/577 Ｃ１２Ｒ 1:91） // Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB01 BB20 BB24 BB51 CB01 CB17 DA36 FB02 FB03 FB05 FB08 4B024 BA44 BA63 CA04 DA02 DA06 DA12 EA04 FA10 GA05 HA14 HA15 4B063 QA01 QA19 QQ43 QR08 QR32 QR42 QR56 QS25 QS34 QX05 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA15 4B065 AA26X AA58X AA72X AA90Y AA91X AA92X AB01 AB05 AC10 BA02 CA24 CA25 CA43 4C084 AA01 AA17 BA44 ZB132 ZB262 ZB352 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 EA50 EA52 FA72 FA74

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮ
   Ａを特異的に認識する受容体タンパク質をコードするＤ
   ＮＡ。
2. 【請求項２】 非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮ
   Ａを特異的に認識する受容体タンパク質が、以下の(ａ)
   又は(ｂ)のタンパク質であることを特徴とする請求項１
   記載のＤＮＡ。 (ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質 (ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若
   しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
   アミノ酸配列からなり、かつ非メチル化ＣｐＧ配列を有
   する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質
3. 【請求項３】 配列番号１に示される塩基配列又はその
   相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含む
   ことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項３記載の遺伝子を構成するＤＮＡ
   とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすること
   を特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮ
   Ａを特異的に認識する受容体タンパク質が、以下の(ａ)
   又は(ｂ)のタンパク質であることを特徴とする請求項１
   記載のＤＮＡ。 (ａ)配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質 (ｂ)配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若
   しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
   アミノ酸配列からなり、かつ非メチル化ＣｐＧ配列を有
   する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク質
6. 【請求項６】 配列番号３に示される塩基配列又はその
   相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含む
   ことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項６記載の遺伝子を構成するＤＮＡ
   とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすること
   を特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
8. 【請求項８】 非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮ
   Ａを特異的に認識する受容体タンパク質。
9. 【請求項９】 配列番号２に示されるアミノ酸配列から
   なることを特徴とする請求項８記載のタンパク質。
10. 【請求項１０】 配列番号２に示されるアミノ酸配列に
    おいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しく
    は付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請
    求項８記載のタンパク質。
11. 【請求項１１】 配列番号４に示されるアミノ酸配列か
    らなることを特徴とする請求項８記載のタンパク質。
12. 【請求項１２】 配列番号４に示されるアミノ酸配列に
    おいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しく
    は付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請
    求項８記載のタンパク質。
13. 【請求項１３】 請求項８〜１２のいずれか記載のタン
    パク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグ
    とを結合させた融合タンパク質。
14. 【請求項１４】 請求項８〜１２のいずれか記載のタン
    パク質と特異的に結合する抗体。
15. 【請求項１５】 抗体がモノクローナル抗体であること
    を特徴とする請求項１４記載の抗体。
16. 【請求項１６】 請求項８〜１２のいずれか記載のタン
    パク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主
    細胞。
17. 【請求項１７】 非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌Ｄ
    ＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする
    遺伝子が過剰発現することを特徴とする非ヒト動物。
18. 【請求項１８】 非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌Ｄ
    ＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする
    遺伝子機能が染色体上で欠損したことを特徴とする非ヒ
    ト動物。
19. 【請求項１９】 非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌Ｄ
    ＮＡに対して不反応性であることを特徴とする請求項１
    ８記載の非ヒト動物。
20. 【請求項２０】 齧歯目動物が、マウスであることを特
    徴とする請求項１７〜１９のいずれか記載の非ヒト動
    物。
21. 【請求項２１】 非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌Ｄ
    ＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする
    遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞に、請求項１〜７
    のいずれか記載のＤＮＡを導入することを特徴とする非
    メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性
    を有するタンパク質を発現する細胞の調製方法。
22. 【請求項２２】 請求項２１記載の非メチル化ＣｐＧ配
    列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパ
    ク質を発現する細胞の調製方法により得られることを特
    徴とする非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特
    異的に認識する受容体タンパク質を発現する細胞。
23. 【請求項２３】 被検物質の存在下、非メチル化ＣｐＧ
    配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タン
    パク質を発現している細胞をインビトロで培養し、ＴＬ
    Ｒ９活性を測定・評価することを特徴とする非メチル化
    ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容
    体タンパク質のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリ
    ーニング方法。
24. 【請求項２４】 非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌Ｄ
    ＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする
    遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に被検物質
    を投与し、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又
    は脾臓細胞のＴＬＲ９活性を測定・評価することを特徴
    とする非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異
    的に認識する受容体タンパク質のアゴニスト又はアンタ
    ゴニストのスクリーニング方法。
25. 【請求項２５】 非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌Ｄ
    ＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする
    遺伝子が過剰発現した非ヒト動物に被検物質を投与し、
    該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞
    のＴＬＲ９活性を測定・評価することを特徴とする非メ
    チル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識す
    る受容体タンパク質のアゴニスト又はアンタゴニストの
    スクリーニング方法。
26. 【請求項２６】 非ヒト動物が、マウスであることを特
    徴とする請求項２４又は２５記載の非メチル化ＣｐＧ配
    列を有する細菌ＤＮＡに対して反応性を有するタンパク
    質のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方
    法。
27. 【請求項２７】 請求項２３〜２６のいずれか記載の非
    メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識
    する受容体タンパク質のアゴニスト又はアンタゴニスト
    のスクリーニング方法により得られる非メチル化ＣｐＧ
    配列を有する細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タン
    パク質のアゴニスト又はアンタゴニスト。
28. 【請求項２８】 非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌Ｄ
    ＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質の全部又はそ
    の一部を有効成分として含有する医薬組成物。
29. 【請求項２９】 請求項２７記載のアゴニスト又はアン
    タゴニストを有効成分として含有する医薬組成物。
30. 【請求項３０】 検体中の非メチル化ＣｐＧ配列を有す
    る細菌ＤＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコ
    ードするＤＮＡと、請求項３記載のＤＮＡとの塩基配列
    を比較することができる、請求項３記載のＤＮＡを含む
    ことを特徴とする非メチル化ＣｐＧ配列を有する細菌Ｄ
    ＮＡを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする
    ＤＮＡ配列の欠失、置換及び／又は付加に関連する疾病
    の診断キット。