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JP2002014099A - バイオセンサー用測定チップ - Google Patents

バイオセンサー用測定チップ

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Publication number
JP2002014099A
JP2002014099A JP2000196371A JP2000196371A JP2002014099A JP 2002014099 A JP2002014099 A JP 2002014099A JP 2000196371 A JP2000196371 A JP 2000196371A JP 2000196371 A JP2000196371 A JP 2000196371A JP 2002014099 A JP2002014099 A JP 2002014099A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
general formula
group
physiologically active
active substance
biosensor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000196371A
Other languages
English (en)
Inventor
Masayoshi Kojima
政芳 小島
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Holdings Corp
Original Assignee
Fuji Photo Film Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuji Photo Film Co Ltd filed Critical Fuji Photo Film Co Ltd
Priority to JP2000196371A priority Critical patent/JP2002014099A/ja
Priority to US09/895,512 priority patent/US20020106654A1/en
Publication of JP2002014099A publication Critical patent/JP2002014099A/ja
Priority to US10/236,398 priority patent/US20030027199A1/en
Priority to US10/236,443 priority patent/US20030027200A1/en
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent

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  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 金属表面に容易に生理活性物質を固定化する
ための手段であって、処理過程が簡便で安全性の高い方
法を提供すること。 【解決手段】 下記一般式Ｉで表される化合物で処理し
た金属表面あるいは基板上の金属膜から成る、バイオセ
ンサー用測定チップ。 一般式Ｉ：Ｘ−Ａ−Ｙ （式中、Ｘは、環内にＺ−Ｚ（ここでＺはＳ、Ｓｅ又は
Ｐを示す）結合を含むヘテロ環基を示し、Ａは、脂肪族
基、芳香族基、ヘテロ環基又はこれらの組み合わせから
選ばれる連結基を示し、Ｙは生理活性物質と共有結合す
ることができる官能基を示す）

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生理活性物質と結
合することができるリンカー化合物で処理した金属表面
又は金属膜を有するバイオセンサー用測定チップ、並び
に該リンカー化合物を用いて金属表面又は金属膜に生理
活性物質を固定化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、臨床検査等で免疫反応を利用した
測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や
標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすること
なく、リガンドの変化を高感度に検出することのできる
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した免疫センサー
が使用されている。
【０００３】このような表面プラズモン共鳴を利用した
測定装置（表面プラズモン共鳴バイオセンサー）で一般
的に使用される測定チップは、、ガラス基板上に成膜さ
れた金属膜の上に、多孔性材料が形成されており、この
多孔性材料の表面及び内部に酵素、抗体等の生理活性物
質が担持又は固定されている。この多孔性材料として
は、例えば合成繊維、天然繊維、無機繊維等からなる織
物、編物、不織布や、多孔性の無機又は有機材料などが
使用される（特開平3-164195号公報参照）。また、市販
品（BIAcore 2000用，ファルマシアバイオセンサー社
製）では、この多孔性材料としてカルボキシメチルデキ
ストランが用いられている。
【０００４】しかしながら、測定対象物と実質的にかつ
効率的に相互作用する生理活性物質は、多孔性材料の表
面に存在するものだけであるため、多孔性材料の内部に
担持又は固定されている生理活性物質は有効に機能せ
ず、その分感度が低下することとなる。
【０００５】また、生理活性物質を金属膜に固定する方
法として、ＬＢ（Langmuir-Blodgett ）法が用いられる
場合もあるが（特開平5-288672号公報参照）、ＬＢ膜と
金属膜との結合が弱く、ＬＢ膜が生理活性物質と共に脱
落するという問題がある。また、金属表面への結合を目
的とした各種化合物は、S、P、Se等（特表平４−５０１
６０５）を含有しており取扱に際し、臭気、毒性等に注
意を払う必要があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は上記した従来技術の問題点を解消することで
ある。即ち、本発明は、金属表面に容易に生理活性物質
を固定化するための手段であって、処理過程が簡便で安
全性の高い方法を提供することを解決すべき課題とし
た。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、金属膜上を本明細書
に定義する一般式Ｉで表される化合物で処理することに
より、生理活性物質を固定化できる官能基を有する金属
表面を作成できることを見出し、本発明を完成するに至
った。
【０００８】即ち、本発明によれば、下記一般式Ｉで表
される化合物で処理した金属表面又は金属膜から成る、
バイオセンサー用測定チップが提供される。 一般式Ｉ：Ｘ−Ａ−Ｙ （式中、Ｘは、環内にＺ−Ｚ（ここでＺはＳ、Ｓｅ又は
Ｐを示す）結合を含むヘテロ環基を示し、Ａは、脂肪族
基、芳香族基、ヘテロ環基又はこれらの組み合わせから
選ばれる２価の連結基を示し、Ｙは生理活性物質と共有
結合することができる官能基を示す）
【０００９】本発明のバイオセンサー用測定チップにお
いて、好ましくは、一般式ＩにおいてＸは下記の構造を
有するヘテロ環基である。
【化５】 （式中、ＺはＳ、Ｓｅ又はＰを示す。ｍ及びｎは各々独
立に０以上の整数を示す）
【００１０】本発明のバイオセンサー用測定チップにお
いて、好ましくは、一般式ＩにおいてＸは１，２−ジチ
オラン基である。本発明のバイオセンサー用測定チップ
において、好ましくは、一般式ＩにおいてＹは−ＯＨ、
−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＨＯ、−ＮＨＮＨ2、−ＮＣ
Ｓ、エポキシ基又はビニル基である。本発明のバイオセ
ンサー用測定チップにおいて、好ましくは、一般式Ｉに
おいてＸは１，２−ジチオラン基である。本発明のバイ
オセンサー用測定チップにおいて、好ましくは、一般式
Ｉで表される化合物は下記構造を有するリポ酸である。
【化６】
【００１１】本発明のバイオセンサー用測定チップの一
態様では、生理活性物質が一般式Ｉで示される化合物に
結合している。好ましくは、生理活性物質は、免疫蛋白
質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋
白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、
糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あ
るいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオ
リゴペプチドである。
【００１２】本発明の別の側面によれば、上記した本発
明のバイオセンサー用測定チップを含む、バイオセンサ
ーが提供される。
【００１３】本発明の別の側面によれば、上記した本発
明のバイオセンサー用測定チップ又はバイオセンサーを
用いて、該バイオセンサー用測定チップに固定化されて
いる生理活性物質と相互作用する物質を検出及び／又は
測定する方法が提供される。
【００１４】本発明の別の側面によれば、金属表面又は
金属膜を下記一般式Ｉで表される化合物で処理する工
程、及び該一般式Ｉで表される化合物に直接又は架橋性
化合物を介して生理活性物質を結合させる工程を含む、
金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化する方法が
提供される。 一般式Ｉ：Ｘ−Ａ−Ｙ （式中、Ｘは、環内にＺ−Ｚ（ここでＺはＳ、Ｓｅ又は
Ｐを示す）結合を含むヘテロ環基を示し、Ａは、脂肪族
基、芳香族基、ヘテロ環基又はこれらの組み合わせから
選ばれる２価の連結基を示し、Ｙは生理活性物質と共有
結合することができる官能基を示す）
【００１５】本発明の生理活性物質を固定化する方法に
おいて、好ましくは、一般式ＩにおいてＸは下記の構造
を有するヘテロ環基である。
【化７】 （式中、ＺはＳ、Ｓｅ又はＰを示す。ｍ及びｎは各々独
立に０以上の整数を示す）
【００１６】本発明の生理活性物質を固定化する方法に
おいて、好ましくは、一般式ＩにおいてＸは１，２−ジ
チオラン基である。本発明の生理活性物質を固定化する
方法において、好ましくは、一般式ＩにおいてＹは−Ｏ
Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＨＯ、−ＮＨＮＨ2、−
ＮＣＳ、エポキシ基又はビニル基である。本発明の生理
活性物質を固定化する方法において、好ましくは、一般
式ＩにおいてＸは１，２−ジチオラン基である。本発明
の生理活性物質を固定化する方法において、好ましく
は、一般式Ｉで表される化合物は下記構造を有するリポ
酸である。
【化８】
【００１７】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施態様及び実施
方法について詳細に説明する。本発明のバイオセンサー
用測定チップは、下記一般式Ｉで表される化合物で処理
した金属表面あるいは金属膜から成ることを特徴とす
る。 一般式Ｉ：Ｘ−Ａ−Ｙ （式中、Ｘは、環内にＺ−Ｚ（ここでＺはＳ、Ｓｅ又は
Ｐを示す）結合を含むヘテロ環基を示し、Ａは、脂肪族
基、芳香族基、ヘテロ環基又はこれらの組み合わせから
選ばれる２価の連結基を示し、Ｙは生理活性物質と共有
結合することができる官能基を示す）
【００１８】本発明のバイオセンサー用測定チップは、
例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えているこ
とを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップ等として用いることができる。なお、表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー用測定チップとは、表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサーに使用されるチップであっ
て、該センサーより照射された光を透過及び反射する部
分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を
言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよ
く、また脱着可能なものであってもよい。
【００１９】表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の
光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射され
た単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に
依存することによるものであり、従って、反射された単
色光の強度を測定することにより、試料を分析すること
ができる。
【００２０】本発明のバイオセンサー用測定チップは、
金属表面又は金属膜を本明細書に定義する一般式Ｉで表
される化合物で処理することにより製造される。金属膜
は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板
上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触する
ように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接
接触することなく、他の層を介して配置されている場合
をも含む意味である。
【００２１】金属膜が基板上に配置されている場合、本
発明のバイオセンサー用測定チップは、基板と、基板上
に形成された金属膜と、金属膜上に形成されたリンカー
層（一般式Ｉで示される化合物から成る）とを有する。
【００２２】本発明で使用することができる基板として
は例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考え
た場合、固定化法に使用されるものであればどのような
ものでもよく、一般的にはガラス、ポリエチレンテレフ
タレート、ポリカーボネートなどのレーザー光に対して
透明な材料からなるものが使用できる。このような基板
は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工
性の優れた材料が望ましい。基板の厚さは特には限定さ
れないが、通常0.1 〜20mm程度である。
【００２３】本発明のバイオセンサー用測定チップにお
ける金属膜としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイ
オセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ
得るようなものであれば特に限定されない。この金属膜
に使用することのできる金属の種類としては、金、銀、
銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それらを単独又
は組み合わせて使用することができる。また、上記基板
への付着性を考慮して、基板と金、銀等からなる層との
間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２４】金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表
面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、１０
０ 〜２０００オングストロームであるのが好ましく、
特に２００〜６００オングストロームであるのが好まし
い。３０００オングストロームを超えると、媒質の表面
プラズモン現象を十分検出することができない。また、
クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚
さは、５〜５０オングストロームであるのが好ましい。
【００２５】金属膜の形成は常法によって行えばよく、
例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング
法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うこと
ができる。
【００２６】本発明では、下記一般式Ｉで表される化合
物を使用する。 一般式Ｉ：Ｘ−Ａ−Ｙ （式中、Ｘは、環内にＺ−Ｚ（ここでＺはＳ、Ｓｅ又は
Ｐを示す）結合を含むヘテロ環基を示し、Ａは、脂肪族
基、芳香族基、ヘテロ環基又はこれらの組み合わせから
選ばれる２価の連結基を示し、Ｙは生理活性物質と共有
結合することができる官能基を示す）
【００２７】一般式Ｉにおいて、Ｘは、環内に−Ｓ−Ｓ
−、−Ｓｅ−Ｓｅ−、又は−Ｐ−Ｐ−を含むヘテロ環基
を示す。Ｘは好ましくは、下記の構造を有するヘテロ環
基である。
【００２８】
【化９】
【００２９】（式中、ＺはＳ、Ｓｅ又はＰを示す。ｍ及
びｎは各々独立に０以上の整数を示す）ｍ及びｎの上限
値は特に限定されないが、化学合成の便宜等の観点から
ｍ＋ｎの合計数は好ましくは０〜１０であり、より好ま
しくは０〜７であり、さらに好ましくは０〜５であり、
特に好ましくは２又は３である。Ｘは特に好ましくは、
１，２−ジチオラン基である。
【００３０】一般式Ｉにおいて、Ａは、脂肪族基、芳香
族基、ヘテロ環基又はこれらの組み合わせから選ばれる
２価の連結基を示す。
【００３１】脂肪族基としては、アルキレン基、アルケ
ニレン基又はアルキニレン基等を包含し、鎖の形態は直
鎖、分岐鎖、環状鎖又はこれらの組み合わせの何れでも
よい。脂肪族基としてはアルキレン基が特に好ましく、
最も好ましくは直鎖のアルキレン基である。脂肪族基の
長さは特に限定されないが、例えば、炭素数１〜２０で
あり、より好ましくは炭素数１〜１０程度であり、特に
好ましくは炭素数２〜１０程度である。芳香族基として
は、アリーレン基などが挙げられ、具体的にはフェニレ
ン基、ナフチレン基などが挙げられる。
【００３２】ヘテロ環としては、窒素原子、酸素原子又
は硫黄原子から選ばれる１種以上のヘテロ原子を１個以
上含む５または７員の飽和または不飽和の単環または縮
合環などが挙げられ、具体的には、ピリジン、キノリ
ン、イソキノリン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジ
ン、フタラジン、トリアジン、フラン、チオフェン、ピ
ロール、オキサゾール、ベンゾオキサゾール、チアゾー
ル、ベンゾチアゾール、イミダゾール、ベンゾイミダゾ
ール、チアジアゾール、トリアゾール等が挙げられる。
ヘテロ環基とは上記したようなヘテロ環から誘導される
２価の基を言う。Ａで表される２価の連結基は、上記し
たような脂肪族基、芳香族基又はヘテロ環基の組み合わ
せから構成されるものでもよい。
【００３３】一般式Ｉにおいて、Ｙは生理活性物質と共
有結合することができる官能基を示し、例えば、−Ｏ
Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＨＯ、−ＮＨＮＨ2、−
ＮＣＳ、エポキシ基又はビニル基であり、特に好ましく
は−ＣＯＯＨである。
【００３４】一般式Ｉの化合物の中でも、塩基性の水、
アルコール等に易溶で、取扱の容易なリポ酸を用いるこ
とが好ましい。リポ酸（thioctic acid；和光純薬）は
カルボキシル基を有し金属表面とはジチイラン部分が結
合することで、カルボキシル基を生理活性物質の固定化
に効果的に使用することができる。なお、リポ酸誘導体
を界面状態の改質に用いた例としては、歯科用金属への
レジン接着性が報告されている（門磨義則、歯科材料・
器械、16巻(2)、114‐121(1997)。一般式Ｉの化合物は
当業者に公知の通常の有機化学合成法により合成するこ
とができ、具体的には、例えば、Ralph G. Nuzzo and D
avid L. Allara, "Adsorption of Bifunctional Organi
c Disulfides on Gold Surfaces", J.Amer.Chem.Soc, 1
05, 4481-4483(1983)に記載の合成法に準じて合成する
ことができる。
【００３５】一般式Ｉの化合物で金属表面又は金属膜を
処理する方法としては、該化合物を含む溶液中に金属膜
等を一定時間浸漬する方法（浸漬法）、スピンコータを
用いる方法（スピンコーティング法）、グラビア印刷機
を用いる方法（グラビア法）などを例示することができ
る。
【００３６】本発明で用いる一般式Ｉの化合物（リンカ
ー化合物）は、以下のような利点を有する。 （１）生理活性物質を金属膜に極めて近い位置に固定化
することができるので、従来の固定化法を使用する場合
よりも大幅に測定感度を向上させることができる。 （２）表面処理が容易であり、また、一度に大量の表面
処理ができる。 （３）生理活性物質と共有結合することができる官能基
である置換基Ｙを選択することにより表面改質、他官能
基導入などの化学修飾が可能となる。
【００３７】バイオセンサー用測定チップにおいては、
上記した一般式Ｉの化合物（リンカー化合物）で処理し
た金属表面に対し、直接又は架橋性試薬（例えば、水溶
性多価性試薬等）を介して、生理活性物質を固定して使
用する。
【００３８】架橋性試薬としては、例えば、グルタルア
ルデヒド、過ヨウ素酸、Ｎ−スクシニミジル−２−マレ
イミド酢酸、Ｎ−スクシニミジル−４−マレイミド酪
酸、Ｎ−スクシニミジル−６−マレイミドヘキサン酸、
Ｎ−スクシニミジル−４−マレイミドメチルシクロヘキ
サン−１−カルボン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−４
−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、
Ｎ−スクシニミジル−４−マレイミドメチル安息香酸、
Ｎ−スクシニミジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ−ス
ルホスクシニミジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ−ス
クシニミジル−４−マレイミドフェニル−４−酪酸、Ｎ
−スルホスクシニミジル−４−マレイミドフェニル−４
−酪酸、ＮＮ'−オキシジメチレン−ジマレイミド、Ｎ
Ｎ'−O-フェニレン−ジマレイミド、Ｎ，Ｎ'−ｍ-フェ
ニレン−ジマレイミド、Ｎ，Ｎ'−p-フェニレン−ジマ
レイミド、Ｎ，Ｎ'−ヘキサメチレン−ジマレイミド、
Ｎ−スクシニミジルマレイミドカルボン酸、Ｎ−スクシ
ニミジル−Ｓ−アセチルメルカプト酢酸、Ｎ−スクシニ
ミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、
Ｓ−アセチルメルカプトスクシニックアンヒドライド、
メチル−３−（４'−ジチオピリジル）プロピオニミデ
ート、メチル−４−メルカプトブチルイミデート、メチ
ル−３−メルカプトプロピオニミデート、イミノチオレ
ン、O−カルボキシメチル−ヒドロキシルアミン、アゾ
ジフェニルビルマレイミド、ビス（スルホサクシニイミ
ジル）スペレイト、４,４'−ジイソチオシアノ−２,２'
−ジスルホン酸スチルベン、４,４'−ジフルオロ−３,
３'−ジニトロジフェニルスルホン、１,５−ジフルオロ
−２,４−ジニトロベンゼン、p−フェニレンジイソチオ
シアネイト、ジメチルアジピミデイト、ジメチルピメル
イミデイト、ジメチルスベルイミデイト、ｐ−アジドフ
ェナアシルブロマイド、ｐ−アジドフェニルグリオキサ
ル、Ｎ−ヒドロキシサクシニイミジル−４−アジドベン
ゾエイト、４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド、
メチル−４−アジドベンゾイミデイト、Ｎ−５−アジド
−２−ニトロベンゾイルオキシスクシイミド、Ｎ−スク
シイミジル６−（４'−アジドー２'−ニトロフェニルア
ミノ）ヘキサノエイト、１、４ベンゾキノン、Ｎ−スク
シンイミジル−３−（２'-ピリジルジチオ）プロピオネ
ート、Ｎ−（４−マレイミドブチリロキシ）スルホスク
シンイミドナトリウム塩、Ｎ−（６−マレイミドカプロ
イロキシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩、Ｎ−
（８−マレイミドカプロイロキシ）スルホスクシンイミ
ドナトリウム塩、Ｎ−（11−マレイミドウンデカノイロ
キシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩、Ｎ−［２−
（１−ピペラジニル）エチル］マレイミド二塩酸、ビス
ジアゾベンジジン、ヘキサメチレンジイソシアネート、
トルエンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオ
シアネート、Ｎ，Ｎ'−エチレンビスマレインイミド、
Ｎ，Ｎ'−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、２、
４−ジニトロベンゼンスルフォネートナトリウム塩、ジ
アゾ化合物あるいは縮合試薬がＲＮ＝Ｃ＝ＮＲ（又は
Ｒ'）で表されるカルボジイミド誘導体、Ｎ−ヒドロキ
シスクシイミド、トリ−ｎ−ブチルアミン、ブチルクロ
ロフォルメーテ、イソブチルイソシアニドなどが挙げら
れる。
【００３９】本発明のバイオセンサー用測定チップにお
いて固定される生理活性物質としては、測定対象物と相
互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋
白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫
蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白
質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステ
ル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもし
くはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００４０】免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原と
する抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体
としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。
具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれ
ば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用するこ
とができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色
ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、ク
ラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗
体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あ
るいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、15
7 などに対する抗体等を使用することができる。
【００４１】酵素としては、測定対象物又は測定対象物
から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、
特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元
酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素
等を使用することができる。具体的には、測定対象物が
グルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定
対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキ
シダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫
剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、
コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場
合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示
す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールア
ミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ド
ーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができ
る。
【００４２】微生物としては、特に限定されることな
く、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用すること
ができる。核酸としては、測定の対象とする核酸と相補
的にハイブリダイズするものを使用することができる。
核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも
使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来
のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮ
Ａ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。低分子有機化
合物としては通常の有機化学合成の方法で合成すること
ができる任意の化合物が挙げられ、好ましくは、本発明
で使用する一般式Ｉのリンカー化合物と直接又は架橋性
化合物を介して結合することができるような官能基を有
する化合物である。
【００４３】非免疫蛋白質としては、特に限定されるこ
となく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオ
チン又はレセプターなどを使用できる。免疫グロブリン
結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプ
ロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することが
できる。糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げら
れる。脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステア
リン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチ
ル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられ
る。
【００４４】生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又
は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミ
ノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有
結合させることで行うことができる。例えば、金属膜表
面をリポ酸で処理し、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドと
ＷＳＣで活性エステルとし、一定量の生理活性物質を所
定時間（所定量）接触ことによって固定化できる。ま
た、一般的な、アビジンまたはビオチンを固定化したア
ビジン‐ビオチン系の生理活性物質固定化方法を構成す
ることも容易であるが、これらに限定されるわけではな
い。このように該リンカーを介して生理活性物質を強固
に固定化することにより、当該固定化法を洗浄しても生
理活性物質の固定化を維持できるため、繰り返し測定に
使用することができるという利点が得られる。以下の実
施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は
これらの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
【実施例】実施例１：金蒸着表面への抗CRP抗体の結合
と検出 金蒸着ガラス表面に下記の処理方法にてリンカーを結合
し、これに共有結合させた抗CRP抗体を、抗IgG-POD抗体
とABTSとの反応で検出した。なお、実施例で使用したリ
ポ酸は和光純薬から購入したものである。また、金蒸着
表面は5mm径の円形に表面積を規定したマスクを用い実
験に供した。
【００４６】（１）操作：約300オングストロームの厚
さに金蒸着した1.5cm×1.5cmのカバーガラスを、1.0質
量％のリポ酸水溶液(0.1MのNaHCO3溶液中)、1.0質量%リ
ポ酸エタノール溶液に2枚ずつ浸漬し、37℃で4時間表面
処理を行った。また、他の2枚の金蒸着カバーガラスも
同様に200mMメルカプト酢酸-エタノール溶液に浸漬し、
40℃で3時間処理（ドラフト内で作業）した。純水、PBS
で２回金蒸着面を洗浄した後、金蒸着面に5mm径の穴を
あけたマスクを接着し以下の抗体結合面積を規定した。
4mg/mlの濃度に水溶性カルボジイミド(EDC：Ｎ−エチル
−Ｎ'−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド)を
PBS(pH6.0)に溶解し、100μlを金表面に分注した。37℃
で2時間静置した後、純水、PBSで2回表面を洗浄した。
【００４７】抗CRP抗体のPBS（pH6.4）溶液(1.0μg/ml)
を、各表面に100μl分注し4℃で一晩静置した。純水、P
BSで2回表面を洗浄した後、3％BSAを100μl分注し37℃
で2時間ブロッキングした。純水、PBSで2回表面を洗浄
した後、抗IgG-POD抗体(1.0μg/ml, pH7.4)PBS溶液100
μlを分注し、37℃、2時間反応させた。純水、PBSで2回
表面を洗浄した後、50μlのABTS溶液を分注し、室温で1
5分反応させる。発色した液の40μlを分取し、純水60μ
lを加え分光光度計で415nmの吸光度を測定した。
【００４８】（２）結果 得られた結果を以下の表１に記載する。
【００４９】
【表１】
【００５０】表１に示す結果より、リポ酸を使用した金
属表面への生理活性物質の固定化方法は、一般のチオー
ルカルボン酸を用いた場合と同等以上に効果的であるこ
とが実証された。
【００５１】
【発明の効果】本発明のバイオセンサー用測定チップ
は、製造が容易であり、また、固定化する生理活性物質
が少量であっても、良好な感度で測定対象物質を測定す
ることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｍ 1/34 Ｃ１２Ｍ 1/34 Ｅ Ｚ 1/40 1/40 Ｂ Ｃ１２Ｎ 11/14 Ｃ１２Ｎ 11/14 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｇ０１Ｎ 21/27 Ｃ Ｇ０１Ｎ 21/27 33/553 33/553 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ Ｆターム(参考） 2G059 AA05 BB12 DD01 EE01 EE02 FF12 GG01 HH02 HH06 KK01 4B024 AA11 CA01 CA09 HA14 4B029 AA07 AA21 AA23 BB01 BB15 BB16 BB17 BB20 CC03 CC08 CC11 FA11 FA12 FA15 4B033 NA11 NA22 NA42 NA43 NB04 NB15 NB22 NB25 NB63 NC03 NC12 ND05 ND06 ND16 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ79 QR48 QR55 QR74 QR84 QS02 QS07 QS33 QS34 QS39 QX01

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記一般式Ｉで表される化合物で処理し
    た金属表面又は金属膜から成る、バイオセンサー用測定
    チップ。 一般式Ｉ：Ｘ−Ａ−Ｙ （式中、Ｘは、環内にＺ−Ｚ（ここでＺはＳ、Ｓｅ又は
    Ｐを示す）結合を含むヘテロ環基を示し、 Ａは、脂肪族基、芳香族基、ヘテロ環基又はこれらの組
    み合わせから選ばれる２価の連結基を示し、 Ｙは生理活性物質と共有結合することができる官能基を
    示す）
  2. 【請求項２】 一般式ＩにおいてＸが下記の構造を有す
    るヘテロ環基である、請求項１に記載のバイオセンサー
    用測定チップ。 【化１】 （式中、ＺはＳ、Ｓｅ又はＰを示す。ｍ及びｎは各々独
    立に０以上の整数を示す）
  3. 【請求項３】 一般式ＩにおいてＸが１，２−ジチオラ
    ン基である、請求項１又は２に記載のバイオセンサー用
    測定チップ。
  4. 【請求項４】 一般式ＩにおいてＹが−ＯＨ、−ＣＯＯ
    Ｈ、−ＮＨ2、−ＣＨＯ、−ＮＨＮＨ2、−ＮＣＳ、エポ
    キシ基又はビニル基である、請求項１から３の何れか１
    項に記載のバイオセンサー用測定チップ。
  5. 【請求項５】 一般式ＩにおいてＸが１，２−ジチオラ
    ン基である、請求項１から４の何れか１項に記載のバイ
    オセンサー用測定チップ。
  6. 【請求項６】 一般式Ｉで表される化合物が下記構造を
    有するリポ酸である、請求項１から５の何れか１項に記
    載のバイオセンサー用測定チップ。 【化２】
  7. 【請求項７】 生理活性物質が一般式Ｉで示される化合
    物に結合していることを特徴とする、請求項１から６の
    何れか１項に記載のバイオセンサー用測定チップ。
  8. 【請求項８】 生理活性物質が、免疫蛋白質、酵素、微
    生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グ
    ロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する
    糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガン
    ド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチド
    である、請求項７に記載のバイオセンサー用測定チッ
    プ。
  9. 【請求項９】 請求項１から８の何れか１項に記載のバ
    イオセンサー用測定チップを含む、バイオセンサー。
  10. 【請求項１０】 請求項１から請求項８の何れか１項に
    記載のバイオセンサー用測定チップ又は請求項９に記載
    のバイオセンサーを用いて、該バイオセンサー用測定チ
    ップに固定化されている生理活性物質と相互作用する物
    質を検出及び／又は測定する方法。
  11. 【請求項１１】 金属表面又は金属膜を下記一般式Ｉで
    表される化合物で処理する工程、及び該一般式Ｉで表さ
    れる化合物に直接又は架橋性化合物を介して生理活性物
    質を結合させる工程を含む、金属表面又は金属膜に生理
    活性物質を固定化する方法。 一般式Ｉ：Ｘ−Ａ−Ｙ （式中、Ｘは、環内にＺ−Ｚ（ここでＺはＳ、Ｓｅ又は
    Ｐを示す）結合を含むヘテロ環基を示し、 Ａは、脂肪族基、芳香族基、ヘテロ環基又はこれらの組
    み合わせから選ばれる２価の連結基を示し、 Ｙは生理活性物質と共有結合することができる官能基を
    示す）
  12. 【請求項１２】 一般式ＩにおいてＸが下記の構造を有
    するヘテロ環基である、請求項１１に記載の生理活性物
    質を固定化する方法。 【化３】 （式中、ＺはＳ、Ｓｅ又はＰを示す。ｍ及びｎは各々独
    立に０以上の整数を示す）
  13. 【請求項１３】 一般式ＩにおいてＸが１，２−ジチオ
    ラン基である、請求項１１又は１２に記載の生理活性物
    質を固定化する方法。
  14. 【請求項１４】 一般式ＩにおいてＹが−ＯＨ、−ＣＯ
    ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＨＯ、−ＮＨＮＨ2、−ＮＣＳ、エ
    ポキシ基又はビニル基である、請求項１１から１３の何
    れか１項に記載の生理活性物質を固定化する方法。
  15. 【請求項１５】 一般式ＩにおいてＸが１，２−ジチオ
    ラン基である、請求項１１から１４の何れか１項に記載
    の生理活性物質を固定化する方法。
  16. 【請求項１６】 一般式Ｉで表される化合物が下記構造
    を有するリポ酸である、請求項１１から１５の何れか１
    項に記載の生理活性物質を固定化する方法。 【化４】
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