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JP2002078478A - 細胞処理方法、細胞処理装置及び細胞から取り出された物質 - Google Patents

細胞処理方法、細胞処理装置及び細胞から取り出された物質

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Publication number
JP2002078478A
JP2002078478A JP2000269225A JP2000269225A JP2002078478A JP 2002078478 A JP2002078478 A JP 2002078478A JP 2000269225 A JP2000269225 A JP 2000269225A JP 2000269225 A JP2000269225 A JP 2000269225A JP 2002078478 A JP2002078478 A JP 2002078478A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cell
carbon dioxide
suspension
target substance
pressure
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000269225A
Other languages
English (en)
Inventor
Yutaka Osajima
豊 筬島
Mitsuya Shimoda
満哉 下田
Masaki Miyake
正起 三宅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shimadzu Corp
Original Assignee
Shimadzu Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shimadzu Corp filed Critical Shimadzu Corp
Priority to JP2000269225A priority Critical patent/JP2002078478A/ja
Publication of JP2002078478A publication Critical patent/JP2002078478A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/06Hydrolysis; Cell lysis; Extraction of intracellular or cell wall material

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 目的物質を生産する細胞の細胞膜や細胞壁を
効率よく破壊し、目的物質を安定な状態で効率よく回収
できる細胞処理方法及びそのための装置を提供する。 【解決手段】 高圧ガス状態(好ましくは、超臨界状態
又は亜臨界状態)の二酸化炭素を直径1000μm以下
(好ましくは200μm以下)の微小泡27にして処理
槽16中の細胞懸濁液13に導入する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物や動植物の
細胞内で生産された物質を細胞外に取り出す方法及びそ
のための装置に関する。
【0002】
【従来の技術】従来より、微生物や動植物の細胞の機能
を利用して様々な有用物質(例えば、各種蛋白質、酵
素、ビタミン、核酸)を量産するための技術が盛んに研
究されている。このような技術の実用化に際しては、細
胞膜や細胞壁を破壊し、細胞内で生産された目的物質を
取り出す処理(以下、細胞破壊処理と呼ぶ)を効率よく
行うことが必要である。
【0003】細胞破壊処理としては、(1)超音波処
理、フレンチプレス、ヒュープレス、ホモジナイザー、
ビーズミル等の機械的方法、(2)酸加水分解、アルカ
リ処理、塩や界面活性剤の添加等の化学的方法、(3)
酵素処理、自己消化法等の生化学的方法、等が知られて
いる。このうち機械的方法は、特別な処理物質を用いな
いため目的物質の抽出工程において他の物質が製品に混
入することがなく、比較的簡便であるという利点がある
一方、摩擦や流体運動により熱が発生して処理対象物の
温度が上昇すること、処理に時間がかかること、装置の
大型化が困難であるため大量生産には適していないこと
といった問題がある。化学的方法及び生化学的方法は、
細胞からの目的物質の抽出を選択的に行うことができる
という利点がある一方、添加する薬剤や酵素が目的物質
に不所望の影響を与えたり、細胞破壊処理後の試料から
目的物質を分離させる処理が煩雑になるという問題があ
る。
【0004】特公平6−9502号公報には、菌体の培
養液を、超臨界状態又は擬臨界状態の溶解溶剤と混合し
た後、圧力を瞬時に下げることを特徴とする菌体の粉砕
方法が開示されている。この方法(以下、従来型臨界法
と呼ぶ)では、超臨界状態又は擬臨界状態の溶解溶剤
(例えば、炭酸ガス、炭素数2〜4の炭化水素及びこれ
らの混合物)を溶解溶剤と混合することにより細胞膜内
にその溶解溶剤を拡散させた後、急激に圧力を下げる。
すると、細胞膜内に拡散した高密度の溶解溶剤が急激に
膨張し、この膨張力に細胞膜は抗しきれず粉々に破壊さ
れるものである。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】上記従来型臨界法で
は、培養液中に水分が存在するとその水分が溶解溶剤の
拡散抵抗を増大させる。このため、好ましくは遠心分離
器等により前もって培養液から水分を可能な限り除去す
るべきであるとされている(上記公報第2頁右欄第6〜
9行目)。このような水分除去工程が必要であること
は、細胞破壊処理の効率化を妨げる一つの要因となって
いる。本発明はこのような課題を解決するために成され
たものであり、その目的とするところは、目的物質を生
産する細胞の細胞膜や細胞壁を効率よく破壊し、目的物
質を安定な状態で効率よく回収できる細胞処理方法及び
そのための装置を提供することにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に成された本発明に係る細胞処理方法は、目的物質を内
包する微生物又は動植物細胞の懸濁液に高圧ガス状態の
二酸化炭素を微小泡状にして導入する工程を備えること
を特徴としている。
【0007】また、本発明に係る細胞処理装置は、目的
物質を内包する微生物又は動植物細胞の細胞膜又は細胞
壁を破壊するための細胞処理装置において、高圧ガス状
態の二酸化炭素を発生させる手段、及び前記二酸化炭素
を微小泡状にして前記微生物又は動植物細胞の懸濁液に
導入する手段を備えることを特徴としている。
【0008】
【発明の実施の形態】本発明に係る方法では、微生物又
は動植物細胞の懸濁液に高圧ガス状態の二酸化炭素を接
触させるに際して、その二酸化炭素を微小泡状にして懸
濁液に導入するようにしている。高圧ガス状態の二酸化
炭素とは、圧力1MPa以上の二酸化炭素をいい、好ま
しくは超臨界状態(温度31.1℃以上、圧力7.38
MPa以上。図3の相平衡図参照)又は亜臨界状態(温
度25℃以上、圧力5MPa以上)の二酸化炭素であ
る。また、微小泡とは径が1000μm以下、好ましく
は200μm以下の泡である。このような本発明に係る
方法によれば、たとえ微生物又は動植物細胞の懸濁液が
希薄なもの(水分を多く含むもの)であっても、二酸化
炭素は懸濁液に効率よく溶解する。懸濁液に溶解した二
酸化炭素は、細胞膜や細胞壁を構成する脂質二重膜に浸
透し、それを破壊する。このとき、処理に関する諸条件
(温度、圧力、懸濁液の量(バッチ処理の場合)又は供
給流量(連続処理の場合)、二酸化炭素の量(バッチ処
理の場合)又は供給流量(連続処理の場合)、処理時
間、処理液のpH等)を適切に設定しておくことによ
り、細胞内に含まれる目的物質に影響を与えることなく
細胞膜や細胞壁だけを破壊することができる。
【0009】本発明に係る方法において、二酸化炭素を
溶解させた懸濁液を急激に減圧する工程を更に設けるよ
うにすれば、減圧に伴う二酸化炭素の膨張によって確実
に細胞膜や細胞壁が破壊される。また、減圧の結果、二
酸化炭素は気体となるため、懸濁液から容易にこれを分
離することができる。
【0010】本発明に係る細胞処理方法は、高圧ガス状
態の二酸化炭素を発生させる手段及び前記二酸化炭素を
微小泡状にして前記微生物又は動植物細胞の懸濁液に導
入する手段を備える本発明に係る細胞処理装置を用いて
実施することができる。
【0011】図1は本発明に係る細胞処理装置の一形態
である連続式細胞処理装置の概略構成図である。この装
置1は、原液タンク12、ボンベ14、処理槽16、減
圧槽18及び回収タンク20を備えている。原液タンク
12には細胞懸濁液13が貯留されており、ボンベ14
には液体二酸化炭素が封入されている。原液タンク12
及びボンベ14はそれぞれ原液供給管22及び二酸化炭
素供給管24によって処理槽16の底部と接続されてい
る。原液供給管22及び二酸化炭素供給管24の途上に
はそれぞれポンプ26及び28が配設されている。処理
槽16の上部は液配送管30により減圧槽18と接続さ
れている。減圧槽18の底部には液体取出口32が設け
られており、その下に回収タンク20が配置されてい
る。減圧槽18の上部にはリサイクル管34の一端が接
続されている。リサイクル管34の他端は二酸化炭素供
給管24に接続されている。
【0012】上記細胞処理装置1の作用は以下の通りで
ある。まず、ポンプ26及び28を起動し、原液タンク
12及びボンベ14から細胞懸濁液13及び高圧二酸化
炭素(好ましくは超臨界状態又は亜臨界状態の二酸化炭
素)を処理槽16の底部に送り込む。処理槽16の底部
にはメッシュフィルタ26が二酸化炭素供給管24の出
口に配設されており、高圧二酸化炭素はこのメッシュフ
ィルタ26を通過する際に直径数100μm以下の微小
泡27となる。こうして微小泡化されて細胞懸濁液13
に放出された高圧二酸化炭素は、細胞懸濁液13に効率
よく高い濃度まで溶け込む。高圧二酸化炭素は、細胞懸
濁液13中に浮遊する細胞の細胞膜又は細胞壁を構成す
る脂質二重膜に浸透し、その一部を破壊する。
【0013】上記のように高圧二酸化炭素の溶解した細
胞懸濁液13は処理槽16内を上へ向かって流れて処理
槽16の上部に到達し、液配送管30に流入する。液配
送管30には圧力調整弁31が配設されており、液配送
管30を流れる細胞懸濁液13の圧力は圧力調整弁31
を通過する際に急激に低下する。このとき、細胞膜又は
細胞壁に浸透した二酸化炭素が急激に膨張し、気化す
る。これにより細胞膜又は細胞壁は確実に破壊される。
液配送管30を流れる細胞懸濁液13は減圧槽18に入
り、ここで二酸化炭素ガスが細胞懸濁液13から分離さ
れる。細胞懸濁液13は液体取出口32から流下し、回
収タンク20に貯まる。一方、二酸化炭素ガスはリサイ
クル管34を通じて二酸化炭素供給管24に戻り、再利
用される。
【0014】なお、図1の装置は連続式細胞処理装置で
あるが、処理槽16をバッチ処理用のものに置き換える
ことにより、バッチ式細胞処理装置を構成することも可
能である。
【0015】
【実施例】本発明の方法の効果を確認するため、次のよ
うな実験を行った。
【0016】(実験1)標準栄養培地を用いて常法によ
り培養した酵母を菌体重量基準で1.0%となるように
生理食塩水で調整した酵母懸濁液と、メッシュ径10μ
mのミクロフィルタで微小泡化した高圧二酸化炭素とを
処理槽16に連続的に導入した。実験は二酸化炭素圧力
の異なる3試験区で行った。処理条件は以下の通りであ
る。 処理温度:35℃ 懸濁液供給速度:20kg/時間 二酸化炭素供給速度:4kg/時間 二酸化炭素圧力:10MPa、20MPa、30MPa
(3試験区) 平均滞留時間:15分
【0017】上記処理の後、細胞内から懸濁液中に溶出
した目的物質の量を測定した。目的物質は、アミノ酸、
蛋白質、核酸の3つであり、アミノ酸はニンヒドリン
法、蛋白質はLOWRY法、核酸は紫外線吸収法により
それぞれ懸濁液中の濃度を求め、それに基づいて各目的
物質の菌体重量当たりの溶出量を算出した。
【0018】(実験2)従来型臨界法についても上記と
同様の処理条件で実験を行った。
【0019】(実験3)対照区として、上記酵母懸濁液
に対して30秒間の超音波処理と2分間の冷却処理を交
互に30回繰り返すことにより細胞の完全破壊を行い、
細胞内からの各目的物質の溶出量を測定した。この溶出
量は、細胞内の各目的物質の総量とみなされる。
【0020】以上の実験結果を図2に示す。図2の表で
は、実験3(超音波法)での各目的物質の溶出量を10
0として実験1及び実験2の各試験区での溶出量を収率
(%)で表している。なお、この表では本発明に係る方
法をミクロバブル法と表記している。この結果から分か
るように、本発明に係る方法によれば、従来型臨界法よ
りもはるかに高い収率で目的物質を回収することができ
る。
【0021】
【発明の効果】化学的又は生化学的方法と比較すると、
本発明による方法は二酸化炭素のみを用いるものである
ため低コストであるだけでなく、薬剤や酵素等の特殊物
質が目的物質に不所望の影響を与える恐れもない。ま
た、本発明の方法では、上記のような減圧処理により二
酸化炭素は容易に懸濁液から分離できるため、細胞破壊
処理後の懸濁液から目的物質を分離させる処理も容易で
あり、また、たとえ処理後の懸濁液中に二酸化炭素が残
留しても、それが人体に害を与える恐れはない。
【0022】機械的方法と比較すると、本発明による処
理は常温域又はそれ以下の温度で行われるため、熱によ
る目的物質の変質のおそれがない。更にまた、本発明に
係る方法では、連続処理用のラインを構成することも容
易であるため、量産用設備への応用に適している。
【0023】従来型臨界法と比較すると、本発明による
方法は、水分を含有する懸濁液にも効率よく十分に二酸
化炭素を溶解させることができるため、処理対象となる
試料形態の範囲が広い。また、実施例に示したように、
本発明による方法によれば、従来型臨界法によるよりも
はるかに効率よく目的物質を回収することができる。
【0024】なお、二酸化炭素以外のガス、例えば窒素
ガスを用いて細胞処理を行う場合も、本発明に従ってそ
の窒素ガスを微小泡化して細胞懸濁液に導入するように
すれば、窒素ガスの溶解効率が高まり、目的物質の収率
が高くなることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明に係る細胞処理装置の一形態である連
続式細胞処理装置の概略構成図。
【図2】 本発明の効果を調べた実験の結果を示す表。
【図3】 温度、圧力と物質の超臨界状態との関係を示
す相平衡図。
【符号の説明】
1…連続式細胞処理装置 12…原液タンク 13…細胞懸濁液 14…ボンベ 16…処理槽 18…減圧槽 20…回収タンク 24…二酸化炭素供給管 26…メッシュフィルタ 27…微小泡 31…圧力調整弁
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12P 19/34 C12P 19/34 21/00 21/00 B //(C12P 13/04 (C12P 13/04 C12R 1:645) C12R 1:645) (C12P 19/34 (C12P 19/34 C12R 1:645) C12R 1:645) (C12P 21/00 (C12P 21/00 B C12R 1:645) C12R 1:645) Fターム(参考) 4B029 AA15 AA27 BB01 CC01 4B064 AE03 AF27 AG01 CA01 CA10 CA11 CC30 4B065 AA01X AA88X AA90X BD04 BD50 CA17 CA23 CA24

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 目的物質を内包する微生物又は動植物細
    胞の懸濁液に高圧ガス状態の二酸化炭素を微小泡状にし
    て導入する工程を備えることを特徴とする細胞処理方
    法。
  2. 【請求項2】 目的物質を内包する微生物又は動植物細
    胞の細胞膜又は細胞壁を破壊するための細胞処理装置に
    おいて、 高圧ガス状態の二酸化炭素を発生させる手段、及び前記
    二酸化炭素を微小泡状にして前記微生物又は動植物細胞
    の懸濁液に導入する手段を備えることを特徴とする細胞
    処理装置。
  3. 【請求項3】 請求項1の方法又は請求項2の装置によ
    り微生物又は動植物細胞から取り出された物質。
JP2000269225A 2000-09-05 2000-09-05 細胞処理方法、細胞処理装置及び細胞から取り出された物質 Pending JP2002078478A (ja)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006187231A (ja) * 2005-01-05 2006-07-20 Shimadzu Corp 酵母エキスの製造方法
JP2017526348A (ja) * 2014-07-25 2017-09-14 フェート・エンフェー (フラームス・インステリング・フーア・テクノロジシュ・オンダーゾエク・エンフェー) バイオマス細胞を破壊するための方法および装置

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A521 Written amendment

Effective date: 20070518

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A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20071127