JP2002051775A - ドーパミン作動性ニューロンの濃縮・分離方法 - Google Patents
ドーパミン作動性ニューロンの濃縮・分離方法Info
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- JP2002051775A JP2002051775A JP2001111210A JP2001111210A JP2002051775A JP 2002051775 A JP2002051775 A JP 2002051775A JP 2001111210 A JP2001111210 A JP 2001111210A JP 2001111210 A JP2001111210 A JP 2001111210A JP 2002051775 A JP2002051775 A JP 2002051775A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 多種多様な細胞によって構成されている細胞
集団から、ドーパミン作動性ニューロンを高い割合で濃
縮し、分離する方法を提供する。 【解決手段】 細胞集団から、ドーパミン作動性ニュー
ロンを分離する方法であって、ドーパミン作動性ニュー
ロンで発現する遺伝子のプロモーター／エンハンサーの
制御下で蛍光タンパク質を発現するレポーター核酸分子
を細胞集団の各細胞に導入し、この細胞集団から、蛍光
を発する細胞を分離する。
集団から、ドーパミン作動性ニューロンを高い割合で濃
縮し、分離する方法を提供する。 【解決手段】 細胞集団から、ドーパミン作動性ニュー
ロンを分離する方法であって、ドーパミン作動性ニュー
ロンで発現する遺伝子のプロモーター／エンハンサーの
制御下で蛍光タンパク質を発現するレポーター核酸分子
を細胞集団の各細胞に導入し、この細胞集団から、蛍光
を発する細胞を分離する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、ドーパミ
ン作動性ニューロンの濃縮・分離方法に関するものであ
る。さらに詳しくは、パーキンソン病等の治療のための
移植細胞として、またそれら疾患の治療法開発のための
研究材料として有用なドーパミン作動性ニューロンを同
定し、効率よく確実に濃縮し分離する方法に関するもの
である。
ン作動性ニューロンの濃縮・分離方法に関するものであ
る。さらに詳しくは、パーキンソン病等の治療のための
移植細胞として、またそれら疾患の治療法開発のための
研究材料として有用なドーパミン作動性ニューロンを同
定し、効率よく確実に濃縮し分離する方法に関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】パーキンソン病は、中脳黒質のドーパミ
ン作動性ニューロンが選択的に変性脱落することによっ
て発症する疾患である。その治療には、ドーパミン作動
性ニューロン（またはドーパミン作動性ニューロンへの
分化能を有する細胞）を多く含む胎児中脳組織を患者の
脳内（線条体）に移植することの有効性が証明されてい
る。
ン作動性ニューロンが選択的に変性脱落することによっ
て発症する疾患である。その治療には、ドーパミン作動
性ニューロン（またはドーパミン作動性ニューロンへの
分化能を有する細胞）を多く含む胎児中脳組織を患者の
脳内（線条体）に移植することの有効性が証明されてい
る。
【０００３】しかしながら、通常の臨床使用に十分な量
の胎児脳組織を確保することは、実際上は不可能であ
る。このため、胎児中脳に替わるドナー細胞が求められ
ている。
の胎児脳組織を確保することは、実際上は不可能であ
る。このため、胎児中脳に替わるドナー細胞が求められ
ている。
【０００４】例えば、多数の未分化な神経系細胞からド
ーパミン作動性ニューロンへと分化した細胞を移植用の
ドナー細胞として使用することが検討されている。さら
に、ES細胞や骨髄間質細胞などの非神経系細胞からドー
パミン作動性ニューロンへと分化させた細胞を移植用の
ドナー細胞として使用することも検討されている。これ
らの細胞は試験管内で増殖させた後に分化誘導すること
ができるので、ドナー不足の問題を解決する手段となり
うる。さらに、骨髄間質細胞は成人から安全に採取する
ことが可能であるため、患者自身の細胞から移植用のド
ーパミン作動性ニューロンを調製することが可能であ
る。従って、このような治療方法が実現すれば、ドナー
不足の問題や拒絶反応等の技術的な問題が解決されるだ
けでなく、ドーパミン作動性ニューロンを中絶胎児から
得ることによる倫理的な問題も解決される。
ーパミン作動性ニューロンへと分化した細胞を移植用の
ドナー細胞として使用することが検討されている。さら
に、ES細胞や骨髄間質細胞などの非神経系細胞からドー
パミン作動性ニューロンへと分化させた細胞を移植用の
ドナー細胞として使用することも検討されている。これ
らの細胞は試験管内で増殖させた後に分化誘導すること
ができるので、ドナー不足の問題を解決する手段となり
うる。さらに、骨髄間質細胞は成人から安全に採取する
ことが可能であるため、患者自身の細胞から移植用のド
ーパミン作動性ニューロンを調製することが可能であ
る。従って、このような治療方法が実現すれば、ドナー
不足の問題や拒絶反応等の技術的な問題が解決されるだ
けでなく、ドーパミン作動性ニューロンを中絶胎児から
得ることによる倫理的な問題も解決される。
【０００５】しかしながら、未分化な細胞集団からドー
パミン作動性ニューロンを効率よく分化させる方法は十
分に確立されていない。また、未分化な細胞集団から
は、ドーパミン作動性ニューロン以外の各種細胞が分化
する。さらに、未分化な細胞集団の中には移植後に腫瘍
を形成する細胞が含まれている危険性がある。従って、
試験管内で分化させたドーパミン作動性ニューロンを移
植用に用いるためには、多種類の細胞集団からドーパミ
ン作動性ニューロンを選択的に分離する必要がある。
パミン作動性ニューロンを効率よく分化させる方法は十
分に確立されていない。また、未分化な細胞集団から
は、ドーパミン作動性ニューロン以外の各種細胞が分化
する。さらに、未分化な細胞集団の中には移植後に腫瘍
を形成する細胞が含まれている危険性がある。従って、
試験管内で分化させたドーパミン作動性ニューロンを移
植用に用いるためには、多種類の細胞集団からドーパミ
ン作動性ニューロンを選択的に分離する必要がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】前記のとおり、濃縮さ
れたドーパミン作動性ニューロンは、パーキンソン病等
の治療用の移植ドナー細胞としての有用性が期待されて
いる。また、ドーパミン作動性ニューロンを濃縮・分離
することは、このニューロンで特異的に発現する新規タ
ンパク質や遺伝子の同定にも極めて有用である。これら
のタンパク質やその遺伝子は新規の治療薬が期待される
からである。
れたドーパミン作動性ニューロンは、パーキンソン病等
の治療用の移植ドナー細胞としての有用性が期待されて
いる。また、ドーパミン作動性ニューロンを濃縮・分離
することは、このニューロンで特異的に発現する新規タ
ンパク質や遺伝子の同定にも極めて有用である。これら
のタンパク質やその遺伝子は新規の治療薬が期待される
からである。
【０００７】また、未分化な細胞からドーパミン作動性
ニューロンを試験管内で分化させる因子を同定すること
は極めて重要である。そのような因子は、未分化な細胞
からドーパミン作動性ニューロンを効率よく誘導するた
めに役立つだけでなく、その因子そのものが新規の治療
薬となりうるこが期待されるからである。
ニューロンを試験管内で分化させる因子を同定すること
は極めて重要である。そのような因子は、未分化な細胞
からドーパミン作動性ニューロンを効率よく誘導するた
めに役立つだけでなく、その因子そのものが新規の治療
薬となりうるこが期待されるからである。
【０００８】しかしながら、ドーパミン作動性ニューロ
ンを生体組織または培養条件下の細胞集団から分離する
方法は未だ確立されていない。さらに、ドーパミン作動
性ニューロンを試験管内で誘導する因子を探索する方法
は勿論のこと、そのような探索に必要なドーパミン作動
性ニューロンを生きたまま可視化する方法も未だ確立さ
れていない。
ンを生体組織または培養条件下の細胞集団から分離する
方法は未だ確立されていない。さらに、ドーパミン作動
性ニューロンを試験管内で誘導する因子を探索する方法
は勿論のこと、そのような探索に必要なドーパミン作動
性ニューロンを生きたまま可視化する方法も未だ確立さ
れていない。
【０００９】この出願の発明は、多種多様な細胞によっ
て構成されている細胞集団の中のドーパミン作動性ニュ
ーロンを生きたまま可視化し、そのドーパミン作動性ニ
ューロンを高い割合で濃縮し、分離する方法を提供する
ことを課題としている。
て構成されている細胞集団の中のドーパミン作動性ニュ
ーロンを生きたまま可視化し、そのドーパミン作動性ニ
ューロンを高い割合で濃縮し、分離する方法を提供する
ことを課題としている。
【００１０】また、この出願の発明は、その方法によっ
て分離されたドーパミン作動性ニューロンを提供するこ
とも課題としている。さらにこの出願の発明は、未分化
な細胞をドーパミン作動性ニューロンへと分化誘導する
因子を特定する方法を提供することを課題としてもい
る。
て分離されたドーパミン作動性ニューロンを提供するこ
とも課題としている。さらにこの出願の発明は、未分化
な細胞をドーパミン作動性ニューロンへと分化誘導する
因子を特定する方法を提供することを課題としてもい
る。
【００１１】
【課題を解決するための手段】この出願は、第１の発明
として、細胞集団から、ドーパミン作動性ニューロンを
分離する方法であって、ドーパミン作動性ニューロンで
発現する遺伝子のプロモーター／エンハンサーの制御下
で蛍光タンパク質を発現するレポーター核酸分子を細胞
集団の各細胞に導入し、この細胞集団から、蛍光を発す
る細胞を分離することを特徴とするドーパミン作動性ニ
ューロンの濃縮・分離方法を提供する。
として、細胞集団から、ドーパミン作動性ニューロンを
分離する方法であって、ドーパミン作動性ニューロンで
発現する遺伝子のプロモーター／エンハンサーの制御下
で蛍光タンパク質を発現するレポーター核酸分子を細胞
集団の各細胞に導入し、この細胞集団から、蛍光を発す
る細胞を分離することを特徴とするドーパミン作動性ニ
ューロンの濃縮・分離方法を提供する。
【００１２】この出願はまた、第２の発明として、前記
第１発明の方法により濃縮・分離され、培養条件下に保
持された細胞を提供する。またこの出願は、第３の発明
として、細胞集団に存在するドーパミン作動性ニューロ
ンを生きたまま可視化、同定する方法であって、ドーパ
ミン作動性ニューロンで発現する遺伝子のプロモーター
／エンハンサーの制御下で蛍光タンパク質を発現するレ
ポーター核酸分子を細胞集団の各細胞に導入し、この細
胞集団の蛍光分布を測定することを特徴とするドーパミ
ン作動性ニューロンの同定方法を提供する。
第１発明の方法により濃縮・分離され、培養条件下に保
持された細胞を提供する。またこの出願は、第３の発明
として、細胞集団に存在するドーパミン作動性ニューロ
ンを生きたまま可視化、同定する方法であって、ドーパ
ミン作動性ニューロンで発現する遺伝子のプロモーター
／エンハンサーの制御下で蛍光タンパク質を発現するレ
ポーター核酸分子を細胞集団の各細胞に導入し、この細
胞集団の蛍光分布を測定することを特徴とするドーパミ
ン作動性ニューロンの同定方法を提供する。
【００１３】さらにこの出願は、第４の発明として、ド
ーパミン作動性ニューロンへの分化能を有する細胞をド
ーパミン作動性ニューロンへと誘導する因子を同定する
方法であって、ドーパミン作動性ニューロンで発現する
遺伝子のプロモーター／エンハンサーの制御下で蛍光タ
ンパク質を発現するレポーター核酸分子を細胞に導入
し、この細胞と候補物質とを共存させ、細胞の蛍光を指
標として候補物質がドーパミン作動性ニューロン誘導因
子か否かを決定するドーパミン作動性ニューロン誘導因
子の同定方法を提供する。
ーパミン作動性ニューロンへの分化能を有する細胞をド
ーパミン作動性ニューロンへと誘導する因子を同定する
方法であって、ドーパミン作動性ニューロンで発現する
遺伝子のプロモーター／エンハンサーの制御下で蛍光タ
ンパク質を発現するレポーター核酸分子を細胞に導入
し、この細胞と候補物質とを共存させ、細胞の蛍光を指
標として候補物質がドーパミン作動性ニューロン誘導因
子か否かを決定するドーパミン作動性ニューロン誘導因
子の同定方法を提供する。
【００１４】前記第１および第３の各発明方法において
は、以下を好ましい態様としている。ドーパミン作動性
ニューロンで発現する遺伝子が、チロシンハイドロキシ
ラーゼ遺伝子であること。
は、以下を好ましい態様としている。ドーパミン作動性
ニューロンで発現する遺伝子が、チロシンハイドロキシ
ラーゼ遺伝子であること。
【００１５】蛍光タンパク質が、グリーン蛍光タンパク
質であること。細胞集団の各細胞が、脳由来であるこ
と。細胞集団の各細胞が、ES細胞であること。
質であること。細胞集団の各細胞が、脳由来であるこ
と。細胞集団の各細胞が、ES細胞であること。
【００１６】細胞集団の各細胞が、骨髄間質細胞由来で
あること。細胞集団の各細胞が、ヒト由来であること。
細胞集団の各細胞が、レポーター核酸分子を保有する組
換えベクターを導入された細胞であること。
あること。細胞集団の各細胞が、ヒト由来であること。
細胞集団の各細胞が、レポーター核酸分子を保有する組
換えベクターを導入された細胞であること。
【００１７】細胞集団が、レポーター核酸分子を導入し
た非ヒト動物の全能性細胞を個体発生させた動物または
その子孫動物由来であること。また、前記第１発明にお
いては、蛍光を発する細胞を、セルソーターを用いて濃
縮・分離することを好ましい態様としている。
た非ヒト動物の全能性細胞を個体発生させた動物または
その子孫動物由来であること。また、前記第１発明にお
いては、蛍光を発する細胞を、セルソーターを用いて濃
縮・分離することを好ましい態様としている。
【００１８】さらに、前記第３発明においては、以下を
好ましい態様としている。ドーパミン作動性ニューロン
で発現する遺伝子が、チロシンハイドロキシラーゼ遺伝
子であること。
好ましい態様としている。ドーパミン作動性ニューロン
で発現する遺伝子が、チロシンハイドロキシラーゼ遺伝
子であること。
【００１９】蛍光タンパク質が、グリーン蛍光タンパク
質であること。ドーパミン作動性ニューロンへの分化能
を有する細胞が、神経幹細胞であること。
質であること。ドーパミン作動性ニューロンへの分化能
を有する細胞が、神経幹細胞であること。
【００２０】ドーパミン作動性ニューロンへの分化能を
有する細胞が、ES細胞であること。ドーパミン作動性ニ
ューロンへの分化能を有する細胞が、骨髄間質細胞であ
ること。
有する細胞が、ES細胞であること。ドーパミン作動性ニ
ューロンへの分化能を有する細胞が、骨髄間質細胞であ
ること。
【００２１】ドーパミン作動性ニューロンへの分化能を
有する細胞が、ヒト由来であること。ドーパミン作動性
ニューロンへの分化能を有する細胞が、レポーター核酸
分子を保有する組換えベクターを導入された細胞である
こと。
有する細胞が、ヒト由来であること。ドーパミン作動性
ニューロンへの分化能を有する細胞が、レポーター核酸
分子を保有する組換えベクターを導入された細胞である
こと。
【００２２】ドーパミン作動性ニューロンへの分化能を
有する細胞が、レポーター核酸分子を導入した非ヒト動
物の全能性細胞を個体発生させた動物またはその子孫動
物由来であること。
有する細胞が、レポーター核酸分子を導入した非ヒト動
物の全能性細胞を個体発生させた動物またはその子孫動
物由来であること。
【００２３】以下、この出願の発明について実施の形態
を詳しく説明する。
を詳しく説明する。
【００２４】
【発明の実施の形態】第１発明は、ドーパミン作動性ニ
ューロンで発現する遺伝子のプロモーター／エンハンサ
ーの制御下で蛍光タンパク質を発現するレポーター核酸
分子を、動物由来の細胞集団の各細胞に導入し、この細
胞集団から、蛍光を発する細胞を分離することを特徴と
する方法である。
ューロンで発現する遺伝子のプロモーター／エンハンサ
ーの制御下で蛍光タンパク質を発現するレポーター核酸
分子を、動物由来の細胞集団の各細胞に導入し、この細
胞集団から、蛍光を発する細胞を分離することを特徴と
する方法である。
【００２５】細胞集団の細胞に導入するレポーター核酸
分子は、ドーパミン作動性ニューロンで発現する遺伝子
のプロモーター／エンハンサーをコードするポリヌクレ
オチド配列と、このポリヌクレオチド配列の下流に、蛍
光タンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結した
融合核酸分子である。
分子は、ドーパミン作動性ニューロンで発現する遺伝子
のプロモーター／エンハンサーをコードするポリヌクレ
オチド配列と、このポリヌクレオチド配列の下流に、蛍
光タンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結した
融合核酸分子である。
【００２６】ドーパミン作動性ニューロンで発現する遺
伝子のプロモーター／エンハンサーとしては、様々な動
物種のチロシンハイドロキシラーゼ（TH）遺伝子のプロ
モーター配列を使用することができるが、特にラットTH
遺伝子のプロモーターが好ましい。このラットTH遺伝子
プロモーター配列は、GenBank Accession No.AF069036
として登録されており、この公知の配列に基づき合成し
たプローブを用いてラットゲノムライブラリーをスクリ
ーニングする方法、または合成プライマーを用いたPCR
法等により取得、利用することができる。
伝子のプロモーター／エンハンサーとしては、様々な動
物種のチロシンハイドロキシラーゼ（TH）遺伝子のプロ
モーター配列を使用することができるが、特にラットTH
遺伝子のプロモーターが好ましい。このラットTH遺伝子
プロモーター配列は、GenBank Accession No.AF069036
として登録されており、この公知の配列に基づき合成し
たプローブを用いてラットゲノムライブラリーをスクリ
ーニングする方法、または合成プライマーを用いたPCR
法等により取得、利用することができる。
【００２７】蛍光タンパク質としては、オワンクラゲ由
来のグリーン蛍光タンパク質（GFP）、イソギンチャク
由来のレッド蛍光タンパク質（RFP）等を利用すること
ができるが、特にGFPあるいはGFP誘導体（例えば、Curr
ent Biology 6(2):178-182,1996に記載の誘導体）の使
用が好ましい。なお、GFPをコードするポリヌクレオチ
ドとしては、そのcDNA（Gene 111(2):229-233, 1990：G
enBank No. M62654）が知られている。また、EGFP cDNA
のクローン（EGFP Poly(A)：Clontech社製）を利用する
こともできる。
来のグリーン蛍光タンパク質（GFP）、イソギンチャク
由来のレッド蛍光タンパク質（RFP）等を利用すること
ができるが、特にGFPあるいはGFP誘導体（例えば、Curr
ent Biology 6(2):178-182,1996に記載の誘導体）の使
用が好ましい。なお、GFPをコードするポリヌクレオチ
ドとしては、そのcDNA（Gene 111(2):229-233, 1990：G
enBank No. M62654）が知られている。また、EGFP cDNA
のクローン（EGFP Poly(A)：Clontech社製）を利用する
こともできる。
【００２８】レポーター核酸分子を導入する細胞は、ヒ
トを含めた動物の脳由来の分化した神経系細胞を対象と
することができる。あるいは、ドーパミン作動性ニュー
ロンへの分化能を有する神経幹細胞、ES細胞、骨髄間質
細胞等を試験管内で分化誘導したドーパミン作動性ニュ
ーロンを対象とすることもできる。これらの未分化な細
胞からドーパミン作動性ニューロンを分化誘導するに
は、公知の方法（例えば、神経幹細胞：Nat. Neurosci.
1: 290-295, 1998、ES細胞：Nat. Biotechnol.18: 675
-679, 2000およびNeuron 28: 31-40, 2000）に従うこと
ができる。
トを含めた動物の脳由来の分化した神経系細胞を対象と
することができる。あるいは、ドーパミン作動性ニュー
ロンへの分化能を有する神経幹細胞、ES細胞、骨髄間質
細胞等を試験管内で分化誘導したドーパミン作動性ニュ
ーロンを対象とすることもできる。これらの未分化な細
胞からドーパミン作動性ニューロンを分化誘導するに
は、公知の方法（例えば、神経幹細胞：Nat. Neurosci.
1: 290-295, 1998、ES細胞：Nat. Biotechnol.18: 675
-679, 2000およびNeuron 28: 31-40, 2000）に従うこと
ができる。
【００２９】レポーター核酸分子を細胞に導入するに
は、このレポーター核酸分子を組み込んだ発現ベクター
を個々の培養細胞に導入する方法を採用することができ
る。発現ベクターとしては、動物細胞発現用のプラスミ
ドベクターを使用することができる。このようなプラス
ミドベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン
酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法を
採用することができる。また、アデノウイルスベクター
等のウイルスベクターを細胞に感染させる方法を利用す
ることもできる。
は、このレポーター核酸分子を組み込んだ発現ベクター
を個々の培養細胞に導入する方法を採用することができ
る。発現ベクターとしては、動物細胞発現用のプラスミ
ドベクターを使用することができる。このようなプラス
ミドベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン
酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法を
採用することができる。また、アデノウイルスベクター
等のウイルスベクターを細胞に感染させる方法を利用す
ることもできる。
【００３０】あるいはまた、非ヒト動物を対象とする場
合には、レポーター核酸分子を導入したトランスジェニ
ック動物を作成することによって、細胞にレポーター核
酸分子を導入するようにしてもよい。トランスジェニッ
ク動物は、公知の作成法（例えば、Proc. Natl. Acad.
Scl. USA 77;7380-7384, 1980）に従って作成すること
ができる。このようなトランスジェニック非ヒト動物
は、全ての体細胞にレポーター核酸分子を保有している
ため、その中枢神経系組織を取り出し、蛍光シグナルを
発する細胞を単離することによって、ドーパミン作動性
ニューロンを大量に取得することができる。
合には、レポーター核酸分子を導入したトランスジェニ
ック動物を作成することによって、細胞にレポーター核
酸分子を導入するようにしてもよい。トランスジェニッ
ク動物は、公知の作成法（例えば、Proc. Natl. Acad.
Scl. USA 77;7380-7384, 1980）に従って作成すること
ができる。このようなトランスジェニック非ヒト動物
は、全ての体細胞にレポーター核酸分子を保有している
ため、その中枢神経系組織を取り出し、蛍光シグナルを
発する細胞を単離することによって、ドーパミン作動性
ニューロンを大量に取得することができる。
【００３１】前記の方法によってレポーター核酸分子を
導入した細胞集団から、ドーパミン作動性ニューロンを
濃縮・分離するには、蛍光顕微鏡によって培養細胞から
蛍光シグナルを発する細胞を１個ずつ分離することも可
能であるが、作業の大幅な効率化のためには、セルソー
ター（蛍光活性化セルソーター：FACS）を使用する方法
が好ましい。このセルソーターによって、ドーパミン作
動性ニューロンを自動的に濃縮・分離することが可能で
ある。
導入した細胞集団から、ドーパミン作動性ニューロンを
濃縮・分離するには、蛍光顕微鏡によって培養細胞から
蛍光シグナルを発する細胞を１個ずつ分離することも可
能であるが、作業の大幅な効率化のためには、セルソー
ター（蛍光活性化セルソーター：FACS）を使用する方法
が好ましい。このセルソーターによって、ドーパミン作
動性ニューロンを自動的に濃縮・分離することが可能で
ある。
【００３２】第３発明の方法は、前記レポーター核酸分
子を細胞集団の各細胞に導入し、この細胞集団の蛍光分
布を測定することによって、細胞集団に存在するドーパ
ミン作動性ニューロンを生きたまま可視化、同定する方
法である。材料や核酸分子導入方法は、基本的に第１発
明と同一とすることができる。レポーター酢酸分子を導
入した細胞集団を顕微鏡で観察することにより、蛍光分
布としてドーパミン作動性ニューロンを可視化、同定す
ることができる。
子を細胞集団の各細胞に導入し、この細胞集団の蛍光分
布を測定することによって、細胞集団に存在するドーパ
ミン作動性ニューロンを生きたまま可視化、同定する方
法である。材料や核酸分子導入方法は、基本的に第１発
明と同一とすることができる。レポーター酢酸分子を導
入した細胞集団を顕微鏡で観察することにより、蛍光分
布としてドーパミン作動性ニューロンを可視化、同定す
ることができる。
【００３３】第４発明の方法は、ドーパミン作動性ニュ
ーロンへの分化能を有する細胞にレポーター核酸分子を
細胞に導入し、この細胞と候補物質とを共存させ、細胞
の蛍光を指標として候補物質がドーパミン作動性ニュー
ロン誘導因子か否かを決定するドーパミン作動性ニュー
ロン誘導因子の同定方法である。ドーパミン作動性ニュ
ーロンへの分化能を有する細胞は、神経幹細胞、ES細
胞、骨髄間質細胞等である。前記第１発明と同じレポー
ター核酸分子をこれらの未分化細胞に導入し、細胞の培
地中に候補物質を添加する。候補物質が未分化細胞をド
ーパミン作動性ニューロンへと誘導するか否かは、前記
第２発明の方法によって容易に確認することができる。
ーロンへの分化能を有する細胞にレポーター核酸分子を
細胞に導入し、この細胞と候補物質とを共存させ、細胞
の蛍光を指標として候補物質がドーパミン作動性ニュー
ロン誘導因子か否かを決定するドーパミン作動性ニュー
ロン誘導因子の同定方法である。ドーパミン作動性ニュ
ーロンへの分化能を有する細胞は、神経幹細胞、ES細
胞、骨髄間質細胞等である。前記第１発明と同じレポー
ター核酸分子をこれらの未分化細胞に導入し、細胞の培
地中に候補物質を添加する。候補物質が未分化細胞をド
ーパミン作動性ニューロンへと誘導するか否かは、前記
第２発明の方法によって容易に確認することができる。
【００３４】以下、実施例を示してこの出願の発明につ
いてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発
明は以下の例によって限定されるものではない。
いてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発
明は以下の例によって限定されるものではない。
【００３５】
【実施例】実施例１ トランスジェニックマウス個体から、以下のとおりにド
ーパミン作動性ニューロンを濃縮・分離した。
ーパミン作動性ニューロンを濃縮・分離した。
【００３６】ラットTH遺伝子のプロモーター配列の制御
下でGFPを発現するベクター（RTH−GFP）を構築した。
すなわち、ドーパミン作動性ニューロンで特異的に発現
することが知られているラットTH遺伝子上流10 kbのプ
ロモーター配列（Mol. BrainRes. 27:281-289, 1994; M
ol. Cells 7:394-398, 1997）をEGFP cDNA（Clontech社
製）の上流に挿入して導入ベクターを構築した。次に、
この組換えベクターを開列して直鎖状とし、C57BL/6Jマ
ウスとDBA/2JマウスとのＦ１マウス由来の受精卵前核に
注入した。遺伝子導入受精卵は常法に従って仮親の卵管
に移植し、個体へと発生させ、TH-EGFPトランスジェニ
ックマウスを作成した。
下でGFPを発現するベクター（RTH−GFP）を構築した。
すなわち、ドーパミン作動性ニューロンで特異的に発現
することが知られているラットTH遺伝子上流10 kbのプ
ロモーター配列（Mol. BrainRes. 27:281-289, 1994; M
ol. Cells 7:394-398, 1997）をEGFP cDNA（Clontech社
製）の上流に挿入して導入ベクターを構築した。次に、
この組換えベクターを開列して直鎖状とし、C57BL/6Jマ
ウスとDBA/2JマウスとのＦ１マウス由来の受精卵前核に
注入した。遺伝子導入受精卵は常法に従って仮親の卵管
に移植し、個体へと発生させ、TH-EGFPトランスジェニ
ックマウスを作成した。
【００３７】得られたTH-EGFPマウスの雄を野生型マウ
スと交配し、胎生12日目の胎仔の中脳腹側部を切り取
り、この組織をトリプシン・EDTA溶液中で処理した後、
ピペッティングにより細胞を分散させた。この細胞を24
時間培養した後、抗TH抗体およびテキサスレッド標識２
次抗体と反応させて解析した結果、GFP陽性抗体の約半
分以上がTH陽性のドーパミン作動性ニューロンであるこ
とが確認された。
スと交配し、胎生12日目の胎仔の中脳腹側部を切り取
り、この組織をトリプシン・EDTA溶液中で処理した後、
ピペッティングにより細胞を分散させた。この細胞を24
時間培養した後、抗TH抗体およびテキサスレッド標識２
次抗体と反応させて解析した結果、GFP陽性抗体の約半
分以上がTH陽性のドーパミン作動性ニューロンであるこ
とが確認された。
【００３８】得られた細胞分散液にpropidium iodideを
添加し、ナイロンメッシュをとおして未消化の組織片を
除去した後、セルソーター（FACS Vantage：ベクトンデ
ィッキンソン社）を用いて解析した。その結果、図１に
示したように、細胞分散液に含まれている細胞のうち７
％の細胞が蛍光シグナルを示した。
添加し、ナイロンメッシュをとおして未消化の組織片を
除去した後、セルソーター（FACS Vantage：ベクトンデ
ィッキンソン社）を用いて解析した。その結果、図１に
示したように、細胞分散液に含まれている細胞のうち７
％の細胞が蛍光シグナルを示した。
【００３９】次いで、propidium iodide陰性（生細胞）
で、GFPの蛍光を発する細胞を試験管に集めた。集めた
細胞をカバーグラスに接着させ、前記２と同様の方法に
より抗体との反応性を解析した。その結果、図２（B）
に示したように、ほとんど全ての細胞がGFP陽性であ
り、その約60%がTH陽性（ドーパミン作動性ニューロ
ン）であることが確認された。 実施例２ 実施例１で得た細胞を、6-OHDAによって作製したパーキ
ンソンモデルラットの線条体へ移植した。５週間後にア
ンフェタミン投与によって引き起こされる回転運動を解
析したところ、全ての個体で有意な症状の改善が観察さ
れた。 実施例３ 実施例１でトランスジェニックマウスの作成に用いたも
のと同様のTH-EGFP組換えベクターをトランスフェクシ
ョン法によってマウスES細胞に導入し、導入遺伝子を有
するES細胞株を樹立した。このES細胞株10,000個を、骨
髄間質細胞株PA6が飽和状態で接着した直径3 cmの培養
皿上で10% KSR、2 mM グルタミン、1 mMピルビン酸、0.
1 mM 非必須アミノ酸、および0.1 mM ２メルカプトエタ
ノールを含むG-MEM培地を用いて37℃で静置培養した。
で、GFPの蛍光を発する細胞を試験管に集めた。集めた
細胞をカバーグラスに接着させ、前記２と同様の方法に
より抗体との反応性を解析した。その結果、図２（B）
に示したように、ほとんど全ての細胞がGFP陽性であ
り、その約60%がTH陽性（ドーパミン作動性ニューロ
ン）であることが確認された。 実施例２ 実施例１で得た細胞を、6-OHDAによって作製したパーキ
ンソンモデルラットの線条体へ移植した。５週間後にア
ンフェタミン投与によって引き起こされる回転運動を解
析したところ、全ての個体で有意な症状の改善が観察さ
れた。 実施例３ 実施例１でトランスジェニックマウスの作成に用いたも
のと同様のTH-EGFP組換えベクターをトランスフェクシ
ョン法によってマウスES細胞に導入し、導入遺伝子を有
するES細胞株を樹立した。このES細胞株10,000個を、骨
髄間質細胞株PA6が飽和状態で接着した直径3 cmの培養
皿上で10% KSR、2 mM グルタミン、1 mMピルビン酸、0.
1 mM 非必須アミノ酸、および0.1 mM ２メルカプトエタ
ノールを含むG-MEM培地を用いて37℃で静置培養した。
【００４０】TH-EGFPを導入したES細胞株は、未分化な
状態ではEGFPを発現しないが、PA6との混合培養開始後4
日目より、緑色蛍光を発する細胞が出現し、その数は次
第に増加した。12日後にEGFP陽性細胞におけるTH、Huタ
ンパク質、ドーパミンβヒドロキシラーゼのそれぞれの
発現を間接蛍光抗体法によって調べた結果、EGFP陽性細
胞（図３左）の大部分がTH陽性（図３右）、Huタンパク
質陽性、ドーパミンβヒドロキシラーゼ陰性であること
が確認された。
状態ではEGFPを発現しないが、PA6との混合培養開始後4
日目より、緑色蛍光を発する細胞が出現し、その数は次
第に増加した。12日後にEGFP陽性細胞におけるTH、Huタ
ンパク質、ドーパミンβヒドロキシラーゼのそれぞれの
発現を間接蛍光抗体法によって調べた結果、EGFP陽性細
胞（図３左）の大部分がTH陽性（図３右）、Huタンパク
質陽性、ドーパミンβヒドロキシラーゼ陰性であること
が確認された。
【００４１】THはドーパミンだけではなく、ノルアドレ
ナリンおよびアドレナリンの合成にも関与している。し
かしながら、ドーパミンからノルアドレナリンおよびア
ドレナリンを合成するためにはドーパミンβヒドロキシ
ラーゼが必要である。EGFP陽性細胞の大多数はTH陽性、
ドーパミンβヒドロキシラーゼ陰性であり、さらにニュ
ーロン特異的マーカーであるHuタンパク質を発現してい
ることから、これらの細胞はノルアドレナリン作動性ニ
ューロンやアドレナリン作動性ニューロンではなく、ド
ーパミン作動性ニューロンであることが確認された。
ナリンおよびアドレナリンの合成にも関与している。し
かしながら、ドーパミンからノルアドレナリンおよびア
ドレナリンを合成するためにはドーパミンβヒドロキシ
ラーゼが必要である。EGFP陽性細胞の大多数はTH陽性、
ドーパミンβヒドロキシラーゼ陰性であり、さらにニュ
ーロン特異的マーカーであるHuタンパク質を発現してい
ることから、これらの細胞はノルアドレナリン作動性ニ
ューロンやアドレナリン作動性ニューロンではなく、ド
ーパミン作動性ニューロンであることが確認された。
【００４２】以上の結果から、未分化なES細胞からドー
パミン作動性ニューロンへと分化した細胞を確実に同定
することが可能であることが確認された。また、このよ
うに同定されたドーパミン作動性ニューロンは、実施例
１と同様のセルソーターを用いた方法によって分離する
ことが可能である。
パミン作動性ニューロンへと分化した細胞を確実に同定
することが可能であることが確認された。また、このよ
うに同定されたドーパミン作動性ニューロンは、実施例
１と同様のセルソーターを用いた方法によって分離する
ことが可能である。
【００４３】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、様々な種類の細胞によって構成される細
胞集団からドーパミン作動性ニューロンを濃縮・分離す
る方法と、この方法によって高度に濃縮されたドーパミ
ン作動性ニューロンが提供される。この細胞は、ヒトの
パーキンソン病等の治療材料（移植用細胞）として有用
であるばかりか、パーキンソン病の病因および病態解
析、並びにその治療技術や治療薬等の開発に有用であ
る。さらに、この出願の発明によって、ドーパミン作動
性ニューロンを生きたまま可視化、同定する方法と、こ
の方法を用いてドーパミン作動性ニューロン分化誘導因
子を同定する方法が提供される。これらの方法によっ
て、パーキンソン病等の移植用細胞を未分化細胞から効
率よく取得することが可能となる。また、ドーパミン作
動性ニューロン分化誘導因子は新たな治療薬の開発に有
用である。
発明によって、様々な種類の細胞によって構成される細
胞集団からドーパミン作動性ニューロンを濃縮・分離す
る方法と、この方法によって高度に濃縮されたドーパミ
ン作動性ニューロンが提供される。この細胞は、ヒトの
パーキンソン病等の治療材料（移植用細胞）として有用
であるばかりか、パーキンソン病の病因および病態解
析、並びにその治療技術や治療薬等の開発に有用であ
る。さらに、この出願の発明によって、ドーパミン作動
性ニューロンを生きたまま可視化、同定する方法と、こ
の方法を用いてドーパミン作動性ニューロン分化誘導因
子を同定する方法が提供される。これらの方法によっ
て、パーキンソン病等の移植用細胞を未分化細胞から効
率よく取得することが可能となる。また、ドーパミン作
動性ニューロン分化誘導因子は新たな治療薬の開発に有
用である。
【図１】TH-EGFPトランスジェニックマウスの胎仔中脳
から得た細胞分散液のFACS解析の結果である。
から得た細胞分散液のFACS解析の結果である。
【図２】細胞分散液の全細胞（A）およびFACSにより得
た細胞（B）のそれぞれのGFP蛍光とTH遺伝子発現を解析
した結果である。
た細胞（B）のそれぞれのGFP蛍光とTH遺伝子発現を解析
した結果である。
【図３】TH-EGFP遺伝子を導入したES細胞をPA6細胞と混
合培養し、12日後に固定し、緑色蛍光を発する細胞を観
察した結果（左）と、抗TH抗体を用いて染色した細胞を
観察した結果である。
合培養し、12日後に固定し、緑色蛍光を発する細胞を観
察した結果（左）と、抗TH抗体を用いて染色した細胞を
観察した結果である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 33/50 Ｃ１２Ｒ 1:91） 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 松下 夏樹 福島県福島市野田町６−10−30 サンテ・ ルミエル202号 Ｆターム(参考） 2G045 BA13 BB03 BB13 BB20 BB24 CB17 CB26 CB30 DA12 DA13 DA14 DA80 FA37 FB02 FB03 4B024 AA11 AA20 CA01 CA04 CA11 DA02 EA04 FA02 FA06 FA10 GA12 GA27 HA13 4B063 QA01 QA18 QQ08 QR32 QR35 QR60 QR77 QR80 QS03 QS05 QS36 QS38 QS39 QX02 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 CE20 DA01 DA13 4B065 AA91X AA93X AB01 BA04 BA25 CA46 CA60
Claims (29)
- 【請求項１】 細胞集団から、ドーパミン作動性ニュー
ロンを分離する方法であって、ドーパミン作動性ニュー
ロンで発現する遺伝子のプロモーター／エンハンサーの
制御下で蛍光タンパク質を発現するレポーター核酸分子
を細胞集団の各細胞に導入し、この細胞集団から、蛍光
を発する細胞を分離することを特徴とするドーパミン作
動性ニューロンの濃縮・分離方法。 - 【請求項２】 ドーパミン作動性ニューロンで発現する
遺伝子が、チロシンハイドロキシラーゼ遺伝子である請
求項１の方法。 - 【請求項３】 蛍光タンパク質が、グリーン蛍光タンパ
ク質である請求項１の方法。 - 【請求項４】 細胞集団の各細胞が、脳由来である請求
項１の方法。 - 【請求項５】 細胞集団の各細胞が、ES細胞由来である
請求項１の方法。 - 【請求項６】 細胞集団の各細胞が、骨髄間質細胞由来
である請求項１の方法。 - 【請求項７】 細胞集団の各細胞が、ヒト由来である請
求項１、４、５または６の方法。 - 【請求項８】 細胞集団の各細胞が、レポーター核酸分
子を保有する組換えベクターを導入された細胞である請
求項１から７のいずれかの方法。 - 【請求項９】 細胞集団の各細胞が、レポーター核酸分
子を導入した非ヒト動物の全能性細胞を個体発生させた
動物またはその子孫動物由来である請求項１から６のい
ずれかの方法。 - 【請求項10】 蛍光を発する細胞を、セルソーターを用
いて濃縮・分離する請求項１から９のいずれかの方法。 - 【請求項11】 請求項１から10のいずれかの方法により
濃縮・分離され、培養条件下に保持された細胞。 - 【請求項12】 細胞集団に存在するドーパミン作動性ニ
ューロンを生きたまま同定する方法であって、ドーパミ
ン作動性ニューロンで発現する遺伝子のプロモーター／
エンハンサーの制御下で蛍光タンパク質を発現するレポ
ーター核酸分子を細胞集団の各細胞に導入し、この細胞
集団の蛍光分布を測定することを特徴とするドーパミン
作動性ニューロンの同定方法。 - 【請求項13】 ドーパミン作動性ニューロンで発現する
遺伝子が、チロシンハイドロキシラーゼ遺伝子である請
求項12の方法。 - 【請求項14】 蛍光タンパク質が、グリーン蛍光タンパ
ク質である請求項12の方法。 - 【請求項15】 細胞集団の各細胞が、脳由来である請求
項12の方法。 - 【請求項16】 細胞集団の各細胞が、ES細胞由来である
請求項12の方法。 - 【請求項17】 細胞集団の各細胞が、骨髄間質細胞由来
である請求項12の方法。 - 【請求項18】 細胞集団の各細胞が、ヒト由来である請
求項12、15、16または17の方法。 - 【請求項19】 細胞集団の各細胞が、レポーター核酸分
子を保有する組換えベクターを導入された細胞である請
求項12から18のいずれかの方法。 - 【請求項20】 細胞集団の各細胞が、レポーター核酸分
子を導入した非ヒト動物の全能性細胞を個体発生させた
動物またはその子孫動物由来である請求項12から17のい
ずれかの方法。 - 【請求項21】 ドーパミン作動性ニューロンへの分化能
を有する細胞をドーパミン作動性ニューロンへと誘導す
る因子を同定する方法であって、ドーパミン作動性ニュ
ーロンで発現する遺伝子のプロモーター／エンハンサー
の制御下で蛍光タンパク質を発現するレポーター核酸分
子を細胞に導入し、この細胞と候補物質とを共存させ、
細胞の蛍光を指標として候補物質がドーパミン作動性ニ
ューロン誘導因子か否かを決定するドーパミン作動性ニ
ューロン誘導因子の同定方法。 - 【請求項22】 ドーパミン作動性ニューロンで発現する
遺伝子が、チロシンハイドロキシラーゼ遺伝子である請
求項21の方法。 - 【請求項23】 蛍光タンパク質が、グリーン蛍光タンパ
ク質である請求項21の方法。 - 【請求項24】 ドーパミン作動性ニューロンへの分化能
を有する細胞が、神経幹細胞である請求項21の方法。 - 【請求項25】 ドーパミン作動性ニューロンへの分化能
を有する細胞が、ES細胞である請求項21の方法。 - 【請求項26】 ドーパミン作動性ニューロンへの分化能
を有する細胞が、骨髄間質細胞である請求項21の方法。 - 【請求項27】 ドーパミン作動性ニューロンへの分化能
を有する細胞が、ヒト由来である請求項21、24、25また
は26の方法。 - 【請求項28】 ドーパミン作動性ニューロンへの分化能
を有する細胞が、レポーター核酸分子を保有する組換え
ベクターを導入された細胞である請求項21から27のいず
れかの方法。 - 【請求項29】 ドーパミン作動性ニューロンへの分化能
を有する細胞が、レポーター核酸分子を導入した非ヒト
動物の全能性細胞を個体発生させた動物またはその子孫
動物由来である請求項21から26のいずれかの方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001111210A JP2002051775A (ja) | 2000-06-01 | 2001-04-10 | ドーパミン作動性ニューロンの濃縮・分離方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000165150 | 2000-06-01 | ||
| JP2000-165150 | 2000-06-01 | ||
| JP2001111210A JP2002051775A (ja) | 2000-06-01 | 2001-04-10 | ドーパミン作動性ニューロンの濃縮・分離方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002051775A true JP2002051775A (ja) | 2002-02-19 |
Family
ID=26593187
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001111210A Pending JP2002051775A (ja) | 2000-06-01 | 2001-04-10 | ドーパミン作動性ニューロンの濃縮・分離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002051775A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004038018A1 (ja) | 2002-10-22 | 2004-05-06 | Eisai Co., Ltd. | 分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞に特異的に発現している遺伝子 |
| WO2006009241A1 (ja) | 2004-07-22 | 2006-01-26 | Eisai Co., Ltd. | Lrp4/Corinドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー |
| WO2007119759A1 (ja) | 2006-04-11 | 2007-10-25 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー１８７ａ５ |
| US8067161B2 (en) | 2005-08-18 | 2011-11-29 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Dopaminergic neuron proliferative progenitor cell marker Nato3 |
| US9453840B2 (en) | 2011-07-27 | 2016-09-27 | Kyoto University | Markers for dopaminergic neuron progenitor cells |
| JP2017511153A (ja) * | 2014-03-21 | 2017-04-20 | セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド | 中脳ドーパミン作動性ニューロンの生産およびその使用方法 |
| EP3246407A1 (en) | 2007-02-09 | 2017-11-22 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Gaba neuron progenitor cell marker 65b13 |
-
2001
- 2001-04-10 JP JP2001111210A patent/JP2002051775A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004038018A1 (ja) | 2002-10-22 | 2004-05-06 | Eisai Co., Ltd. | 分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞に特異的に発現している遺伝子 |
| WO2006009241A1 (ja) | 2004-07-22 | 2006-01-26 | Eisai Co., Ltd. | Lrp4/Corinドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー |
| US9994816B2 (en) | 2004-07-22 | 2018-06-12 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Lrp4/corin dopamine-producing neuron precursor cell marker |
| US8067161B2 (en) | 2005-08-18 | 2011-11-29 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Dopaminergic neuron proliferative progenitor cell marker Nato3 |
| WO2007119759A1 (ja) | 2006-04-11 | 2007-10-25 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー１８７ａ５ |
| EP3246407A1 (en) | 2007-02-09 | 2017-11-22 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Gaba neuron progenitor cell marker 65b13 |
| US9453840B2 (en) | 2011-07-27 | 2016-09-27 | Kyoto University | Markers for dopaminergic neuron progenitor cells |
| JP2017511153A (ja) * | 2014-03-21 | 2017-04-20 | セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド | 中脳ドーパミン作動性ニューロンの生産およびその使用方法 |
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