JP2001523090A

JP2001523090A - フェノール酸エステラーゼ及びその使用

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Publication number: JP2001523090A
Application number: JP54346098A
Authority: JP
Inventors: イアンフィリングハムジョン; ジェフリーヘイゼルウッドピーター; ハリーギルバートジョン
Original assignee: ザバブラハムインスティテュート; ニューキャッスル−アポン−タイン大学
Priority date: 1997-04-14
Filing date: 1998-04-09
Publication date: 2001-11-20
Also published as: CA2286694A1; GB2324302A; WO1998046768A2; CN1255165A; BR9808554A; AU7642398A; GB9707540D0; WO1998046768A3; EP0975768A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、フェノール酸テステラーゼ活性を有する酵素、当該酵素をコード化するＤＮＡ分子、及び当該酵素の製造法および使用法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】フェノール酸エステラーゼ及びその使用技術分野本発明は、フェノール酸エステラーゼ活性を有する酵素、当該酵素をコード化するＤＮＡ分子、及び当該酵素の製造方法および使用に関する。背景技術植物細胞壁は、２つの部分、即ち一次壁および二次壁に分けられる。一次細胞壁は、３つの主要分類に属する多糖類、即ちセルロース、ヘミセルロース及びペクチンからなる。二次細胞壁は、同様に、リグニンと共に多糖類を含有する。植物細胞壁中の一般的な高分岐多糖類であるヘミセルロースは、セルロース及びリグニンに結合すると共にヘミセルロース自体にも結合する。これらの結合は、植物構造の安定化および支持に寄与する。キシロース主鎖を有するヘミセルロースは、キシランと称される。果実、野菜、豆類、穀類、草類、軟材および硬材等の広範囲の種々の植物中に存在するキシランは、α−Ｌ−アラビノース、α−Ｄ−グルクロン酸および／又はα−Ｄ−グルクロン酸の４−Ｏ−メチルエーテル誘導体等の、糖残基で置換されてもよい直鎖β−（１−４）−Ｄ−キシロピラノース重合体である。多くのキシランは、また、クマリン酸およびフェルラ酸等のフェノール酸残基でエステル化される。これらフェノール酸残基は、α−Ｌ−アラビノフラノシルキシランのエステル結合中に存在し、キシラン分解酵素、いわゆるキシラナーゼからキシランを保護し、また、リグニンと共有結合を形成することによって植物細胞壁に構造安定性を付与する。更に、フェルラ酸は、異なるキシラン鎖間でジフェルラ酸ブリッジとして存在し、植物細胞に更なる構造的支持を付与する（Ｌｉｎｄｅｎ、Ｊ．Ｃ．他、ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ、ｖｏｌ５６６（１９９４）、４５２−４６７参照）。植物細胞壁多糖類を酵素分解することにより、フェノール酸エステルを加水分解し、植物細胞壁を消化することができる多数の微生物が知られている。これら微生物の中には、フェノール酸エステラーゼ活性、即ちクマル酸エステラーゼ活性、フェルラ酸エステラーゼ活性またはこれら両活性を示す酵素を含んでいる微生物が存在する。例えば、Ｂｏｒｎｅｍａｎ、Ｗ．Ｓ．他ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｏｒｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ５８（１９９２）、３７６２−３７６６頁には、嫌気性菌ネオカリマスチタス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）菌株ＭＣ−２から単離された、それぞれＦＡＥ−Ｉ及びＦＡＥ−ＩＩで表される２つのフェルラ酸エステラーゼ（ＦＡＥ）が記載されている。ＦＡＥ −ＩＩは、（Ｏ−｛５−Ｏ−［（Ｅ）−フェルロイル］−α−Ｌ−アラビノフラノシル｝−（１−３）−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル−（１−４）−Ｄ−キシロピラノース（ＦＡＸＸ）基質に特異性を示すことが報告されており、一方ＦＡＥ−Ｉは、ＦＡＸＸ分解活性と（Ｏ−｛５−Ｏ−［（Ｅ）−ｐ−クマロイル］− α−Ｌ−アラビノフラノシル｝−（１−３）−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル− （１−４）−Ｄ−キシロピラノース（ＰＡＸＸ）分解活性（最大代謝比、ＦＡＸＸ：ＰＡＸＸ＝３：１）とを共に示すことが報告されている。これら２つの酵素の最適ｐＨは、ＦＡＸＸを基質として使用した場合、それぞれ６．２及び７．０であることが示されている。英国特許第２，３０１，１０３号公報には、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ・ｎｉｇｅｒ）から得られるＦＡＥ、並びにこの酵素をコード化する遺伝子が開示されている。上記酵素は、フェルラ酸メチルを基質として使用するとき、最適ｐＨ約５及び最適温度約５０〜６０℃を示す。フェルラ酸エステラーゼ活性を有するその他の精製酵素も知られている（例えば、ＭｃＣｒａｅ、Ｓ．Ｉ．他、ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、ｖｏｌ１６（１９９４）、８２６−８３４頁；Ｆａｕｌｄｓ、Ｃ．Ｂ．及びＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ、Ｇ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ１４０（１９９４）、７７９−７８７頁；Ｃａｓｔａｎａｒｅｓ、Ａ．他、ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、ｖｏｌ１４（１９９２）、８７５頁；及びＫｒｏｏｎ、Ｐ．Ａ．他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、ｖｏｌ２３（１９９６）、２５５−２６２頁を参照）。これらの酵素は、約５．０〜６．０の範囲の最適ｐＨ及び３０〜６０℃の最適温度を有する。フェノール酸エステラーゼ活性を有する酵素は、多くの工業的、農業的および保健用途で使用可能であり、これらの用途では、約６．５又はそれ以上のｐＨ値および／または４５℃以上の温度で使用し得る。発明の要旨本発明の目的は、良好なフェノール酸エステラーゼ活性を有する酵素を提供することにある。本発明の他の目的は、比較的多量に得られる、フェノール酸エステラーゼ活性を有する酵素源を提供することにある。本発明の他に別の目的は、フェノール酸エステラーゼ活性を有する酵素の製造方法を提供することにある。本発明の他に別の目的は、フェノール酸エステラーゼ活性を有する酵素の、食料および飼料の調製、紙およびパルプの加工並びにリグノセルロース廃物の生物学的変換への使用を提供することにある。本発明の更に他の目的は、以下の詳細な説明から明らかになる。本発明の要旨は、基質として３３μＭのＦＡＸＸを含有するクエン酸／オルトリン酸水素二ナトリウム緩衝液中で測定した際、６．５を越える、好ましくは約７．０の最適ｐＨ、及び４５℃より高い、好ましく５０℃より高い、より好ましくは約５５℃の最適温度を有することを特徴とするフェノール酸エステラーゼ活性を示す酵素に存する。好ましくは、前記酵素は、フェルラ酸エステラーゼ活性およびクマル酸エステラーゼ活性を示す。また、本発明の要旨は、ＰｉｒｏｍｙｃｅｓＳｐ、例えばピロマイセスエクイ（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓｅｑｕｉ）、更に好ましくは受託番号３７５０６１により国際細菌学協会（ＩＭＩ：ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＭｙｃｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ；所在地：ベイクハムレーン、イーガム、サーリー、英国（ＢａｋｅｈａｍＬａｎｅ，Ｅｇｈａｍ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）に寄託されたＰｉｒｏｍｙｃｅｓｅｑｕｉ菌株から得られるフェノール酸エステラーゼ活性を示す酵素に存する。好ましくは、本発明の酵素は、ＳＥＱＩＤＮｏ：１に従うアミノ酸配列またはその機能性誘導体からなる。本発明の酵素の機能性誘導体とは、ＳＥＱＩＤＮｏ：１に従うアミノ酸配列内に１つ以上のＮ−末端、Ｃ−末端または内部置換、挿入および／または欠落を有する酵素として規定され、基質としてＦＡＸＸ３３μＭを含有するクエン酸／オルトリン酸水素二ナトリウム緩衝液中で測定した際、６．５を越える、好ましくは約７．０の最適ｐＨ、及び４５℃より高い、好ましくは５０℃より高い、より好ましくは約５５℃の最適温度を有しているものである。より好ましくは、本発明の酵素は、ＳＥＱＩＤＮｏ：３に従うアミノ配列またはその機能性誘導体からなる。更に、本発明の酵素は、好ましくは、ＳＥＱＩＤＮｏ：１に従うＤＮＡ配列またはその機能性誘導体によりコード化される。より好ましくは、本発明の酵素は、ＳＥＱＩＤＮｏ：３に従うＤＮＡ配列またはその機能性誘導体によりコード化される。本発明は、上記特性の一つ以上を示すフェノール酸エステラーゼに関する。更に、本発明の要旨は、フェノール酸エステラーゼ活性を示す酵素をコード化するＤＮＡ分子に存する。当該ＤＮＡ分子は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１に従うＤＮＡ配列もしくはその機能性誘導体または同族体を含むことを特徴とする。前記ＳＥＱＩＤＮｏ．１に従うＤＮＡ配列の機能性誘導体とは、ＳＥＱＩＤＮｏ．１に従うＤＮＡ配列内に一つ以上の５’−、３’−又は内部置換、挿入および／または欠落を有するＤＮＡ配列として規定され、基質としてＦＡＸＸ３３ μＭを含有するクエン酸／オルトリン酸水素二ナトリウム緩衝液中で測定した際、６．５を越える、好ましくは約７．０の最適ｐＨ、及び４５℃より高い、好ましくは５０℃より高い、より好ましくは約５５℃の最適温度を有すると共にフェノール酸エステラーゼ活性を示す酵素をコード化する能力を保持している。前記本発明のＤＮＡ配列の機能性同族体とは、ＳＥＱＩＤＮｏ．１又はＳＥＱＩＤＮｏ．３に従うＤＮＡ配列に対し、好ましくは７５％の相同率、より好ましくは８５％の相同率、最も好ましくは９５％の相同率を有するＤＮＡ配列として規定される。より好ましくは、本発明の酵素コード化ＤＮＡ分子は、ＳＥＱＩＤＮｏ．３に従うＤＮＡ配列もしくはその機能性誘導体または同族体からなる。好ましい実施態様においては、本発明のＤＮＡ分子は、前記ＤＮＡ分子を複製し得るベクター配列および／または前記酵素を、原核または真核宿主細胞内で発現し得るベクター配列を有する。更に、本発明の要旨は、一つ以上の本発明のＤＮＡ分子を含む形質転換原核細胞または真核細胞にある。好ましくは、前記細胞は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のＥ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，ｓｐ．及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｍｕｃｏｒ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｎｙｃｅｓ及びサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓからなる群より選択される。本発明の酵素は、トウモロコシ、大豆およびキャノーラ（ｃａｎｏｌａ）／アブラナ種子等の形質転換植物内、又はポテト、ニンジン及びテンサイ等の植物の塊茎内で発現させることができる。適当な段階、例えば収穫期に、発現または潜伏した本発明のエステラーゼを導入することにより、成長中に形質転換植物または塊茎構造を弱める恐れが少なくなる。形質転換原核または真核細胞の製造方法は公知である。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）等の形質転換菌類、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）等の形質転換酵母および形質転換植物も、同様に、公知であり、英国特許第２，３０１，１０３号およびヨーロッパ特許第４７９，３５９号および４４９，３７５号各公報で教示される方法により製造可能である。また、本発明の要旨は、フェノール酸エステラーゼ活性を有する酵素または酵素製剤の製造方法にあり、当該酵素は、自然界の生物、形質転換細胞または本発明の酵素を発現可能な生物から単離されることを特徴とする。更に、本発明の要旨は、例えば、細胞または生物抽出物として得られた部分的精製製剤を含む酵素製剤にある。本発明の酵素製剤は、更に、一つ以上の多糖類改質酵素および／または多糖類分解酵素を含むことができる。前記多糖類改質酵素および／または多糖類分解酵素は、好ましくは、キシラナーゼ、アラビナナーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、エンドグルカナーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ、ペクチナーゼ、アセチルエステラーゼ、マンナナーゼ、アセチルキシランエステラーゼ及び他のグリコシル加水分解酵素からなる群より選択される。本発明の酵素製剤は、更に、アミラーゼ、プロテアーセ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ及びリパーゼからなる群より選択された一つ以上の酵素を含むことができる。本発明に係わる酵素および／または酵素製剤の使用は、フェノール酸部位を有する基質からフェノール酸を遊離する工程での使用を含む。前記本発明の酵素および／または酵素製剤は、同様に、動物飼料製造で使用することもでき、植物材料、特に植物細胞壁が高フェノール酸含量を有する飼料の消化性を高める。更に、本発明の酵素および／または酵素製剤は、トウモロコシ、草類およびアルファルファ等の穀物に使用して、予め細胞壁含量を調製することにより家畜に対する消化性を改良する。前記本発明の酵素および／または酵素製剤は、同様に、人用食料製造にも使用できる。また、本発明の要旨は、フェノール酸エステラーゼ活性を示す本発明の酵素または酵素製剤からなる飼料添加物および当該飼料添加物を含む飼料にある。前記本発明の酵素および／または酵素製剤は、同様に、紙およびパルプ工業、例えばセルロースパルプからのリグニンの除去に使用できる。加えて、キシラン分解酵素と組合せ使用した場合、本発明の酵素および／または酵素製剤は、パルプからのリグニンの溶解性および抽出性を高めることによってブリーチングに要する塩素量を減じるのに有効である。さらには、キシラナーゼ及び／またはセルラーゼと組合せ使用した場合、本発明の酵素および／または酵素製剤は、植物材料またはリグノセルロース廃物から糖類への生物学的変換、例えば、薬剤または燃料製造、及び／又はフェノール酸の製造に使用し得る。図面の簡単な説明図１は、基質としてＦＡＸＸを使用して測定された、本発明のフェノール酸エステラーゼのｐＨ特性図である。図２は、基質としてＦＡＸＸを使用して測定された、本発明のフェノール酸エステラーゼの温度特性図である。発明の詳細な説明以下、本発明を、実施例により詳述するが、これら実施例は単なる例示であり、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。実施例１炭素源として０．１０％可溶キシラン及び０．５％シグマセル（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社製、プーレ、ドーセット、英国）を含む反蒭胃液含有媒体（Ｋｅｍｐ，Ｐ．、Ｌａｎｄｅｒ，Ｄ．Ｊ．及びＯｒｐｉｎ，Ｃ．Ｇ．著「Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、ｖｏｌ１３０（１９８４）、２７−３７頁参照）中で３９℃嫌気性条件下において、馬盲嚢から分離し、次の各文献：Ｏｒｐｉｎ、Ｃ．Ｇ．著、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、ｖｏｌ１２３（１９８１）、２８７−２９６頁参照；Ｅ．Ａ．Ｍｕｎｎ著、嫌気性菌類、生物学、生態学および機能（ＡｎａｅｒｏｂｉｃＦｕｎｇｉＢｉｏｌｏｇｙ，ＥｃｏｌｏｇｙａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎ）、Ｄ．０．Ｍｏｕｎｔｆｏｒｔ及びＣ．Ｇ．０ｒｐｉｎ編、マーセルデッカー社（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、１９９４、４７−１０５頁に記載され、かつブタペスト条約に基づき受託番号３７５０６１により国際細菌学協会（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＭｙｃｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＩＭＩ）に寄託されたＰｉｒｏｍｙｃｅｓｅｑｕｉを培養した。全ＲＮＡを、上記条件下で成長した菌類から抽出し、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）クロマトグラフにより選択し、次いで、二本鎖ｃＤＮＡを、選択ＲＮＡから合成した。合成されたｃＤＮＡを、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キットを使用してλＺＡＰＩＩ中にクローニングし、メーカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、ラ・ジョーラ、カルフォルニア州、米国）の指示マニュアルに従って真空パッケージした（Ｘｕｅ，Ｇ．Ｐ．他著、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、ｖｏｌ１３８（１９９２）、１４１３−１４２０頁およびＡｌｉ，Ｂ．Ｒ．Ｓ．他著、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、ｖｏｌ１２５（１９９５）、１５−２２頁参照）。組換えファージを、軟寒天オーバーレイ中のＥ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅの菌叢上での平板培養により成長させ、Ａｌｉ，Ｂ．Ｒ．Ｓ．他著、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、ｖｏｌ１２５（１９９５）、１５−２２頁に記載の方法で精製した菌セルラーゼ／ヘミセルラーゼ複合体に対する抗体を使用してスクリーニングした。一次抗体としてラビット−アンチコンプレックス抗体を使用するファージプラークの抗体スクリーニングは、以下で述べる手順を除いて、基本的に、ピコブルー（ｐｉｃｏＢｌｕｅ：登録商標）免疫スクリーニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に添付された指示マニュアルに記載の通りに行った。即ち、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ：０．３３ｍＭ）を、直接、組換えλＺＡＰＩＩ及び宿主バクテリア（Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を含有する軟寒天オーバーレイに添加した。；プラークを、ハイボンド−Ｃ（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ）フィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）上に取り上げた。；ブロキング溶液は、ＢＳＡの代わりに、乾燥ミルク粉末（４体％Ｗ／Ｖ）を含んでいた。；ホースラディシュペルオキシダーゼ（シグマケミカル社製）に結合した抗ラビット免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（全分子）を、二次抗体として使用した。；着色発育溶液は、過酸化水素（０．５μｌ／ｍｌ）含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．４中に、３，３’−ジアミノベンジジン（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含んでいた。エステラーゼの形成は、Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ，Ｂ．Ｐ．他著、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、ｖｏｌ１４３（１９９６）、１１５−１２０頁の記載に従って、抗体スクリーニングによって選択されたクローンが、［４−メチルウンベリフェロイル（ｐ−トリメチルアンモニウムシンナメートクロリド）］を加水分解する酵素を合成したことで確認された。ＤＮＡ単離、制限エンドヌクレアーゼ消化、連結反応、形質転換およびエステラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列決定等の一般的分子生物学的操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他著「分子クローニング：研究室マニュアル」、第２版（１９８９）、コールドスプリングハーバー、ニューヨークの記載に従って行った。本発明のフェノール酸エステラーゼ活性を示す酵素をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列の決定を行ったところ、ＳＥＱＩＤＮｏ．３０に従う配列であった。読み取り枠は、予測分子量５５，５４０ドルトンを有する５３６アミノ酸のタンパク質をコード化する１６０８ヌクレオチドを含む。実施例２最適ｐＨの測定ＳＥＱＩＤＮｏ．１によりコード化された切頭形酵素を、５０ｍＭトリス −塩酸、ｐＨ９．０、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、２００μＭｄＮＴＰｓ、５０ピコモルのプライマー：５’末端：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＡＧＣＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＴＴＧ−３’ ３’末端：５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＴＴＡＴＧＧＧＡＧＡＧＡＧ− ３’及び２５０ｎｇ鋳型ＤＮＡからなる緩衝液中でＰＣＲ反応（９４℃３０秒間、５０℃４５秒間および７２℃１分間を２０サイクル）により形成し、ベクターｐＥＴ３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、ウィスコンシン州、米国）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）内で発現させた。酵素は、ｐＥＴベクターに関して使用するＮｏｖａｇｅｎ社から提供されたガイドラインに従って、タロン（Ｔａｌｏｎ）樹脂（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）研究所社製、カルフォルニア州、米国）に結合することにより、新たに調製された無細胞抽出液から精製され、制限級トロンビン（シグマ社製）を使用してその金属親和性樹脂から分離した。酵素は、更に、以下の方法で精製した。即ち、１ｍｌのモノＱ（ＭｏｎｏＱ）カラム（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｓｉａ）社製）を、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０で平衡させ、フレッシュな酵素を添加した。酵素は、塩化ナトリウム勾配（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０中で０〜０．５ＭＮａＣｌ）により１．０ｍｌ／分で溶離し、１．０ｍｌの画分を捕集した。酵素は、ｐＨ値３〜７の範囲に関してはマクイルバイン（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ）緩衝液（クエン酸／オルトリン酸水素二ナトリウム；ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、第３版、Ｄａｗｓｏｎ、Ｅｌｌｉｏｔ、Ｅｌｌｉｏｔ、Ｊｏｎｅｓ、オックスフォードサイエンス出版、オックスフォード大学プレス、１９８７参照）中で検定し、またｐＨ値８〜９の範囲に関しては塩化カリウム／ホウ酸を含む緩衝液中で検定した。上記検定は、ＦＡＸＸの最終濃度３３μＭの条件下３７℃で行った。ＦＡＸＸからのフェルラ酸の遊離は、Ｆａｕｌｄｓ，Ｃ．Ｂ．及びＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｇ．著、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ１４０（１９９４）、７７９−７８７頁の記載に従って、３３５ｎｍで３分間連続的にモニターされた。検定結果を、図１に示す。図１から分かるように、本発明の酵素は、ｐＨ約５．５及び約８．５において５０％の活性を示した。基質としてＦＡＸＸを使用した本発明の酵素の最適温度を求めるため、ＦＡＸＸを３３μＭの濃度で使用して、１００ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液中でｐＨ６．０にて検定を行った。インキュベーション温度は、サーモスタット制御分光光度計を使用して、２０〜７０℃の範囲で変化させた。ＦＡＸＸからのフェルラ酸の遊離は、上記したように、３３５ｎｍで測定された。結果を、図２に示す。速度論（動力学）本発明の酵素のＫ_m及びＶ_maxは、基質としてＦＡＸＸ及びＡｒａ₂Ｆ（Ｏ−［２−Ｏ−（トランス−フェルロイル）−α−アラビノフラノシル］−（１−５） −Ｌ−アラビノフラノース）を使用して求めた。ＦＡＸＸは、３．７２μＭ〜４９．１８μＭの範囲の濃度で使用し、Ａｒａ₂Ｆは、４．４６μＭ〜１２２．９２μＭの範囲の濃度で使用した。検定は、９０ｎｇ酵素を含む１００ｍＭ−ＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルホン酸）緩衝液中で３７℃及びｐＨ６．０にて行った。両基質とも、フェルラ酸の遊離は、上記したように、３３５ｎｍで測定された。上記実験の結果に基づき、本発明の酵素は以下の反応速度定数を有することが判明した。基質Ｋ_m Ｖ_max ＦＡＸＸ３．０±０．３μＭ３５．６±０．９μモル／分／ｍｇＡｒａ₂Ｆ２３４±２７μＭ１９．６±１．７μモル／分／ｍｇよって、本発明の酵素は、基質としてＦＡＸＸを使用した上記条件下で約３．０のＫ_m及び約３５のＶ_maxを有する。１００ｍＭ−ＭＯＰＳ緩衝液（０．０２％アジドを含む）、ｐＨ６．０、酵素４４ｎｇ、上記基質１ｍＭから構成される３７℃での検定により、フェルラ酸メチル、クマル酸メチル及びｐ−クマル酸メチルに対する本発明の酵素の比活性を求めた。１５分間のインキュベーションの後、沸騰により反応を停止し、単離した遊離酸を逆相ＨＰＬＣを使用して測定した（Ｋｒｏｏｎ、Ｐ．Ａ．及びＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｇ．著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、ｖｏｌ２３（１９９６）、２６３−２６７頁参照）。上記実験の結果を、以下に示す。更に、Ｆｅｒｒｅｉｒａ、Ｌ．Ｍ．Ａ．他著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、ｖｏｌ２９４（１９９３）、３４９−３５５頁に記載の方法に従って、ｐ−ニトロフェニルアセテート、α−ナフチルアセテート、α−ナフチルブチレート、α−ナフチルカプロエート、α−ナフチルカプリレート及びα−ナフチルラウレートに対する本発明の酵素の比活性を求めた。上記検定の結果を以下に示す。基質比活性（Ｕ＊／ｍｇ）ｐ−ニトロフェニルアセテート２０４．３ α−ナフチルアセテート１２１ α−ナフチルブチレート２２０ α−ナフチルカプロエート２５６ α−ナフチルカプリレート５４ α−ナフチルラウレート６フェルラ酸メチル１０．６クマル酸メチル１０．５ｐ−クマル酸メチル２．７＊：１Ｕは、１μモル／分のエステル加水分解を生じる酵素量として規定した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年６月２日（１９９９．６．２）【補正内容】請求の範囲１．基質としてＦＡＸＸ３３μＭを含有するクエン酸／オルトリン酸水素二ナトリウム緩衝液中で測定した際、６．５より大きな最適ｐＨ及び４５℃より高い最適温度を有するとともに、基質としてＦＡＸＸを含有するＭＯＰＳ緩衝液中で３７℃及びｐＨ６．０で測定した際、約３．０μｍのＫ_m及び約３５μｍｏｌ／分／ｍｇ蛋白のＶ_maxを有することを特徴とするフェノール酸エステラーゼ活性を有する酵素。２．前記酵素が約７．０の最適ｐＨ及び／又は約５５℃の最適温度を有する請求項１に記載の酵素。３．前記酵素が、ＰｉｒｏｍｙｃｅｓＳｐ、好ましくは、受託番号３７５０６１で国際細菌学協会（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＭｙｃｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＩＭＩ）に寄託されたＰｉｒｏｍｙｃｅｓｅｑｕｉから得られる請求項１又は２に記載の酵素。４．前記酵素が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１、ＳＥＱＩＤＮｏ．３又はこれらの機能性誘導体で与えられるアミノ酸配列から成る請求項１〜３の何れかに記載の酵素。５．前記酵素が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１、ＳＥＱＩＤＮｏ．３若しくはこれらの機能性誘導体または同族体に従ったＤＮＡ配列によってコード化されている請求項１〜４の何れかに記載の酵素。６．請求項１〜５に記載の酵素をコード化するＤＮＡ分子であって、ＳＥＱＩＤＮｏ．１、ＳＥＱＩＤＮｏ．３若しくはこれらの機能性誘導体または同族体に従ったＤＮＡ配列を含むことを特徴とするＤＮＡ分子。７．更に、原核または真核宿主細胞内で前記酵素を発現し得るベクター配列を有する請求項６に記載のＤＮＡ分子。８．請求項６又は７に記載の一つ以上のＤＮＡ分子を有する形質転換された原核細胞、真核細胞または生物。９．請求項１〜５に記載のフェノール酸エステラーゼ活性を有する酵素または酵素製剤の製造方法であって、請求項８に記載の細胞または生物から単離することを特徴とする製造方法。１０．請求項１〜５の何れかに記載の酵素を含み及び／又は請求項９に記載の方法により得られた酵素製剤。１１．更に、一つ以上の多糖類改質酵素および／または多糖類分解酵素を含む請求項１０に記載の酵素製剤。１２．前記多糖類改質酵素および／または多糖類分解酵素が、キシラナーゼ、アラビナナーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、エンドグルカナーゼ、α−Ｄ −グルクロニダーゼ、ペクチナーゼ、アセチルエステラーゼ、マンナナーゼ、アセチルキシランエステラーゼ及び他のグリコシル加水分解酵素からなる群より選択される請求項１１に記載の酵素製剤。１３．更に、アミラーゼ、プロテアーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ及びリパーゼからなる群より選択された一つ以上の酵素を含む請求項１０〜１２の何れかに記載の酵素製剤。１４．フェノール酸部位を有する基質からフェノール酸を遊離または調製する工程での、請求項１〜５の何れかに記載の酵素および／または請求項１０〜１３の何れかに記載の酵素製剤の使用。１５．請求項１〜５の何れかに記載の酵素および／または請求項１０〜１３の何れかに記載の酵素製剤の動物飼料製造における使用。１６．請求項１〜５の何れかに記載の酵素および／または請求項１０〜１３の何れかに記載の酵素製剤の食料製造における使用。１７．請求項１〜５の何れかに記載の酵素および／または請求項１０〜１３の何れかに記載の酵素製剤の紙製造における使用。１８．請求項１〜５の何れかに記載の酵素および／または請求項１０〜１３の何れかに記載の酵素製剤の、植物材料またはリグノセルロース廃物を糖類に生物学的変換する工程における使用。１９．家畜用植物の消化性を改良するために、請求項１〜５の何れかに記載の酵素および／または請求項１０〜１３の何れかに記載の酵素製剤の作物における使用。２０．請求項１〜５の何れかに記載の酵素および／または請求項１０〜１３の何れかに記載の酵素製剤を含む飼料添加物。２１．請求項２０に記載の飼料添加物を含む飼料。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｄ２１Ｃ 9/00 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:645）Ｄ２１Ｃ 9/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:645）Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ピータージェフリーヘイゼルウッドイギリス国ＣＢ８８ＡＬサフォークニューマーケットダッチェスドライブ 109Ａ (72)発明者ジョンハリーギルバートイギリス国ＮＥ９５ＸＳタインアンドウエアゲイツヘッドロウフェルケルズガーデンズ 16

Claims

【特許請求の範囲】１．基質としてＦＡＸＸ３３μＭを含有するクエン酸／オルトリン酸水素二ナトリウム緩衝液中で測定した際、６．５より大きな最適ｐＨ及び４５℃より高い最適温度を有することを特徴とするフェノール酸エステラーゼ活性を有する酵素。２．前記酵素がフェルラ酸エステラーゼ活性および／またはクマリン酸エステラーゼ活性を有する請求項１に記載の酵素。３．前記酵素が約７．０の最適ｐＨ及び／又は約５５℃の最適温度を有する請求項１又は２に記載の酵素。４．前記酵素が、ＰｉｒｏｍｙｃｅｓＳｐ、好ましくは、受託番号３７５０６１で国際細菌学協会（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＭｙｃｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＩＭＩ）に寄託されたＰｉｒｏｍｙｃｅｓｅｑｕｉから得られる請求項１〜３の何れかに記載の酵素。５．前記酵素が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１、ＳＥＱＩＤＮｏ．３これらの機能性誘導体で与えられるアミノ酸配列から成る請求項１〜４の何れかに記載の酵素。６．前記酵素が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１、ＳＥＱＩＤＮｏ．３若しくはこれらの機能性誘導体または同族体に従ったＤＮＡ配列によってコード化されている請求項１〜５の何れかに記載の酵素。７．ＳＥＱＩＤＮｏ．１、ＳＥＱＩＤＮｏ．３若しくはこれらの機能性誘導体または同族体に従ったＤＮＡ配列を含む、フェノール酸エステラーゼ活性を有する酵素をコード化するＤＮＡ分子。８．前記ＤＮＡ分子が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１、ＳＥＱＩＤＮｏ．３若しくはこれらの機能性誘導体または同族体に従ったＤＮＡ配列を含む請求項１〜６の何れかに記載の酵素をコード化するＤＮＡ分子。９．更に、原核または真核宿主細胞内で前記酵素を発現し得るベクター配列を有する請求項７又は８に記載のＤＮＡ分子。１０．請求項７〜９の何れかに記載の一つ以上のＤＮＡ分子を有する形質転換された原核細胞、真核細胞または生物。１１．請求項１０に記載の細胞または生物から酵素を単離することを特徴とするフェノール酸エステラーゼ活性を有する酵素または酵素製剤の製造方法。１２．請求項１〜６の何れかに記載の酵素を含み及び／又は請求項１１に記載の方法により得られた酵素製剤。１３．更に、一つ以上の多糖類改質酵素および／または多糖類分解酵素を含む請求項１２に記載の酵素製剤。１４．前記多糖類改質酵素および／または多糖類分解酵素が、キシラナーゼ、アラビナナーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、エンドグルカナーゼ、α−Ｄ −グルクロニダーゼ、ペクチナーゼ、アセチルエステラーゼ、マンナナーゼ、アセチルキシランエステラーゼ及び他のグリコシル加水分解酵素からなる群より選択される請求項１３に記載の酵素製剤。１５．更に、アミラーゼ、プロテアーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ及びリパーゼからなる群より選択された一つ以上の酵素を含む請求項１１〜１４の何れかに記載の酵素製剤。１６．フェノール酸部位を有する基質からフェノール酸を遊離または調製する工程での、請求項１〜６の何れかに記載の酵素および／または請求項１１〜１５の何れかに記載の酵素製剤の使用。１７．請求項１〜６の何れかに記載の酵素および／または請求項１１〜１５の何れかに記載の酵素製剤の動物飼料製造における使用。１８．請求項１〜６の何れかに記載の酵素および／または請求項１１〜１５の何れかに記載の酵素製剤の食料製造における使用。１９．請求項１〜６の何れかに記載の酵素および／または請求項１１〜１５の何れかに記載の酵素製剤の紙製造における使用。２０．請求項１〜６の何れかに記載の酵素および／または請求項１１〜１５の何れかに記載の酵素製剤の、植物材料またはリグノセルロース廃物を糖類に生物学的変換する工程における使用。２１．家畜用植物の消化性を改良するために、請求項１〜６の何れかに記載の酵素および／または請求項１１〜１５の何れかに記載の酵素製剤の作物における使用。２２．請求項１〜６の何れかに記載の酵素および／または請求項１１〜１５の何れかに記載の酵素製剤を含む飼料添加物。２３．請求項２２に記載の飼料添加物を含む飼料。