JP2001520886A - ｗｎｔシグナル経路の阻害タンパク質 - Google Patents
ｗｎｔシグナル経路の阻害タンパク質Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、ｗｎｔシグナル経路の阻害タンパク質、かかるタンパク質をコードするＤＮＡ並びにかかるタンパク質の調製方法に関する。さらに、本発明は、前記ＤＮＡ及び前記タンパク質並びに前記タンパク質に対する抗体の使用に関する。
Description
【０００１】 本発明は、ｗｎｔシグナル経路の阻害タンパク質、該タンパク質をコードする
ＤＮＡ、および該タンパク質の調製方法に関する。さらに、本発明は、該ＤＮＡ
およびタンパク質ならびに該タンパク質に対する抗体の使用に関する。
ＤＮＡ、および該タンパク質の調製方法に関する。さらに、本発明は、該ＤＮＡ
およびタンパク質ならびに該タンパク質に対する抗体の使用に関する。
【０００２】 ｗｎｔシグナル経路は、ショウジョウバエ、アフリカツメガエル（Xenopus la
evis）およびマウスの胚発生段階における細胞増殖および分化の調節に重要な役
割を果たしている。ｗｎｔシグナル経路は、たとえばＸｗｎｔ- ８などのｗｎｔ
遺伝子によってコードされる分泌性糖タンパク質と、該糖タンパク質が結合する
ｗｎｔ受容体とを合わせたものから成る。また、ヒトにおけるｗｎｔシグナル経
路は、結腸癌および乳癌ならびに黒色腫に因果関係がある[ ペイファー(Peifer,
M.)、Science 275, (1997), 1752-1753参照] 。したがって、ｗｎｔシグナル経
路の阻害剤は、腫瘍疾患の治療への道を開く可能性がある。
evis）およびマウスの胚発生段階における細胞増殖および分化の調節に重要な役
割を果たしている。ｗｎｔシグナル経路は、たとえばＸｗｎｔ- ８などのｗｎｔ
遺伝子によってコードされる分泌性糖タンパク質と、該糖タンパク質が結合する
ｗｎｔ受容体とを合わせたものから成る。また、ヒトにおけるｗｎｔシグナル経
路は、結腸癌および乳癌ならびに黒色腫に因果関係がある[ ペイファー(Peifer,
M.)、Science 275, (1997), 1752-1753参照] 。したがって、ｗｎｔシグナル経
路の阻害剤は、腫瘍疾患の治療への道を開く可能性がある。
【０００３】 すなわち、本発明の目的は、ｗｎｔシグナル経路が阻害されうる産物を提供す
ることである。
ることである。
【０００４】 本発明によれば、この目的は、請求項において規定される主題によって達成さ
れる。
れる。
【０００５】 すなわち、本発明の主題は、Ｆｉｇ．１に示すアミノ酸コンセンサス配列Ｉお
よびＩＩのうちの少なくとも１つを含むタンパク質であるｗｎｔシグナル経路の
阻害タンパク質に関する。
よびＩＩのうちの少なくとも１つを含むタンパク質であるｗｎｔシグナル経路の
阻害タンパク質に関する。
【０００６】 本発明は、動物、とくに哺乳動物、とりわけヒトにおいて、ｗｎｔシグナル経
路を阻害するタンパク質が存在するという本出願人の知見に基づくものである。
本出願人は、アフリカツメガエルにおいて、ｗｎｔ遺伝子Ｘｗｎｔ-8が発現する
と、二重体（Siamese twins ）が生じることを見出した。この奇形は、上記タン
パク質が同時に発現されると、防止されるであろう。本タンパク質は約４０ｋＤ
の分泌性タンパク質である。このものは、Ｆｉｇ．１に示すシステインの豊富な
アミノ酸コンセンサス配列ＩおよびＩＩのうちの少なくとも１つを有する。Ｆｉ
ｇ．2 で、該タンパク質の変異体をＤＮＡの形で示している。本出願人はまた、
該タンパク質の変異体が様々な組織で発現されることを見出している（表１およ
びＦｉｇ．３参照）。
路を阻害するタンパク質が存在するという本出願人の知見に基づくものである。
本出願人は、アフリカツメガエルにおいて、ｗｎｔ遺伝子Ｘｗｎｔ-8が発現する
と、二重体（Siamese twins ）が生じることを見出した。この奇形は、上記タン
パク質が同時に発現されると、防止されるであろう。本タンパク質は約４０ｋＤ
の分泌性タンパク質である。このものは、Ｆｉｇ．１に示すシステインの豊富な
アミノ酸コンセンサス配列ＩおよびＩＩのうちの少なくとも１つを有する。Ｆｉ
ｇ．2 で、該タンパク質の変異体をＤＮＡの形で示している。本出願人はまた、
該タンパク質の変異体が様々な組織で発現されることを見出している（表１およ
びＦｉｇ．３参照）。
【０００７】 本発明においては、上記タンパク質を「ｗｎｔ阻害剤」（ｗｎｔ- Ｉ）という
。
。
【０００８】 好ましい態様においては、（ｗｎｔ- Ｉ）は、Ｆｉｇ．１に示すアミノ酸コン
センサス配列ＩおよびＩＩを有する。
センサス配列ＩおよびＩＩを有する。
【０００９】 本発明のさらなる主題は（ｗｎｔ- Ｉ）をコードする核酸に関する。このもの
はＲＮＡであってもよいし、ＤＮＡであってもよい。後者はたとえばゲノムＤＮ
Ａであってもよいし、ｃＤＮＡであってもよい。下記のものから成るＤＮＡが好
ましい： （ａ）Ｆｉｇ．２のＤＮＡまたは該ＤＮＡと１つまたは複数の塩基対だけが異な
るＤＮＡ、 （ｂ）（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、または （ｃ）縮重遺伝コードを介して（ａ）または（ｂ）のＤＮＡに関連するＤＮＡ。
はＲＮＡであってもよいし、ＤＮＡであってもよい。後者はたとえばゲノムＤＮ
Ａであってもよいし、ｃＤＮＡであってもよい。下記のものから成るＤＮＡが好
ましい： （ａ）Ｆｉｇ．２のＤＮＡまたは該ＤＮＡと１つまたは複数の塩基対だけが異な
るＤＮＡ、 （ｂ）（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、または （ｃ）縮重遺伝コードを介して（ａ）または（ｂ）のＤＮＡに関連するＤＮＡ。
【００１０】 「ハイブリダイズするＤＮＡ」という表現は、通常条件下、とくにＤＮＡの融
解温度より低い２０℃で（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡをいう。
解温度より低い２０℃で（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡをいう。
【００１１】 Ｆｉｇ．２のＤＮＡは、アフリカツメガエル、マウス、ヒトまたはニワトリに
由来するＤＮＡであって、（ｗｎｔ- Ｉ）をコードする７つのＤＮＡから成る。
これらのＤＮＡのうちの６つは、下記のように１９９７年９月１９日付けでＤＳ
ＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen［ドイツ微生
物および培養細胞タイプ・コレクション］）に寄託された： Ｆｉｇ．２．１（ヒト由来ＤＮＡ）のものは、ＤＳＭ１１７６２の下でｐｈｄｋ
ｋ- ３として寄託されている。 Ｆｉｇ．２．２（ニワトリ由来ＤＮＡ）のものは、ｐｃｄｋｋ- ３と命名されて
いる。 Ｆｉｇ．２．３（マウス由来ＤＮＡ）のものは、ＤＳＭ１１７５９の下でｐｍｄ
ｋｋ- ２として寄託されている。 Ｆｉｇ．２．４（ヒト由来ＤＮＡ）のものは、ＤＳＭ１１７６１の下でｐｈｄｋ
ｋ- ２として寄託されている。 Ｆｉｇ．２．５（マウス由来ＤＮＡ）のものは、ＤＳＭ１１７５８の下でｐｍｄ
ｋｋ- １として寄託されている。 Ｆｉｇ．２．６（ヒト由来ＤＮＡ）のものは、ＤＳＭ１１７６０の下でｐｈｄｋ
ｋ- １として寄託されている。 Ｆｉｇ．２．７（アフリカツメガエル由来ＤＮＡ）のものは、ＤＳＭ１１７５７
の下でｐＲＮｄｋｋ- １として寄託されている。
由来するＤＮＡであって、（ｗｎｔ- Ｉ）をコードする７つのＤＮＡから成る。
これらのＤＮＡのうちの６つは、下記のように１９９７年９月１９日付けでＤＳ
ＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen［ドイツ微生
物および培養細胞タイプ・コレクション］）に寄託された： Ｆｉｇ．２．１（ヒト由来ＤＮＡ）のものは、ＤＳＭ１１７６２の下でｐｈｄｋ
ｋ- ３として寄託されている。 Ｆｉｇ．２．２（ニワトリ由来ＤＮＡ）のものは、ｐｃｄｋｋ- ３と命名されて
いる。 Ｆｉｇ．２．３（マウス由来ＤＮＡ）のものは、ＤＳＭ１１７５９の下でｐｍｄ
ｋｋ- ２として寄託されている。 Ｆｉｇ．２．４（ヒト由来ＤＮＡ）のものは、ＤＳＭ１１７６１の下でｐｈｄｋ
ｋ- ２として寄託されている。 Ｆｉｇ．２．５（マウス由来ＤＮＡ）のものは、ＤＳＭ１１７５８の下でｐｍｄ
ｋｋ- １として寄託されている。 Ｆｉｇ．２．６（ヒト由来ＤＮＡ）のものは、ＤＳＭ１１７６０の下でｐｈｄｋ
ｋ- １として寄託されている。 Ｆｉｇ．２．７（アフリカツメガエル由来ＤＮＡ）のものは、ＤＳＭ１１７５７
の下でｐＲＮｄｋｋ- １として寄託されている。
【００１２】 以下、本発明のＤＮＡについて、ｃＤＮＡの形で説明する。この説明は、本発
明の範囲に入るあらゆるＤＮＡを例示するものである。
明の範囲に入るあらゆるＤＮＡを例示するものである。
【００１３】 本発明のｃＤＮＡを調製する場合、アフリカツメガエルｃＤＮＡライブラリー
をベースとして使用することが好ましい[ グリンカら（Glinka, A. et al. ）、
Mechanisms Develope 60, (1996), 221-231 参照] 。対応するｍＲＮＡは、ＲＮ
Ａポリメラーゼを用いて、各ｃＤＮＡクローンから合成する。これらのものを、
たとえばＸｗｎｔ- ８などのｗｎｔ遺伝子のｍＲＮＡとともにアフリカツメガエ
ルにマイクロインジェクションする。アフリカツメガエルを二重体の発生に関し
てスクリーニングする。後者は、ｗｎｔ遺伝子のｍＲＮＡをそのまま、または（
ｗｎｔ- Ｉ）をコードしないアフリカツメガエルＲＮＡとともにマイクロインジ
ェクションする場合に得られる。すなわち、二重体の発生がないことが、（ｗｎ
ｔ- Ｉ）をコードするｍＲＮＡの存在の証拠として評価される。かかるｍＲＮＡ
は対応するｃＤＮＡを直接的に示す。
をベースとして使用することが好ましい[ グリンカら（Glinka, A. et al. ）、
Mechanisms Develope 60, (1996), 221-231 参照] 。対応するｍＲＮＡは、ＲＮ
Ａポリメラーゼを用いて、各ｃＤＮＡクローンから合成する。これらのものを、
たとえばＸｗｎｔ- ８などのｗｎｔ遺伝子のｍＲＮＡとともにアフリカツメガエ
ルにマイクロインジェクションする。アフリカツメガエルを二重体の発生に関し
てスクリーニングする。後者は、ｗｎｔ遺伝子のｍＲＮＡをそのまま、または（
ｗｎｔ- Ｉ）をコードしないアフリカツメガエルＲＮＡとともにマイクロインジ
ェクションする場合に得られる。すなわち、二重体の発生がないことが、（ｗｎ
ｔ- Ｉ）をコードするｍＲＮＡの存在の証拠として評価される。かかるｍＲＮＡ
は対応するｃＤＮＡを直接的に示す。
【００１４】 本発明のｃＤＮＡは、それぞれベクターおよび発現ベクター中に存在すること
ができる。当業者は、その具体例に精通している。大腸菌の発現ベクターの場合
、これらのものはたとえばｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＥ
Ｔ３ｂおよびｐＱＥ−８である。酵母における発現の場合は、たとえばｐＹ１０
０やＹｃｐａｄ１に言及しなければならず、一方、たとえばｐＫＣＲ、ｐＥＦＢ
ＯＳ、ｃＤＭ８およびｐＣＥＶ４は、動物細胞における発現の場合に適用される
べきものである。バキュロウイルス発現ベクターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａは、
昆虫細胞における発現にとくに適している。
ができる。当業者は、その具体例に精通している。大腸菌の発現ベクターの場合
、これらのものはたとえばｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＥ
Ｔ３ｂおよびｐＱＥ−８である。酵母における発現の場合は、たとえばｐＹ１０
０やＹｃｐａｄ１に言及しなければならず、一方、たとえばｐＫＣＲ、ｐＥＦＢ
ＯＳ、ｃＤＭ８およびｐＣＥＶ４は、動物細胞における発現の場合に適用される
べきものである。バキュロウイルス発現ベクターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａは、
昆虫細胞における発現にとくに適している。
【００１５】 当業者にとっては、発現ベクター中に存在する本発明のｃＤＮＡの発現に適し
た細胞は自明である。かかる細胞の具体例としては、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ
１、ｘ１７７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＬ２１およびＳＧ１３００９、酵
母菌株サッカロミセス セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）、および動物
細胞Ｌ、３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶｅｒｏおよびＨｅＬａ、ならび
に昆虫細胞ｓｆ９などがある。
た細胞は自明である。かかる細胞の具体例としては、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ
１、ｘ１７７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＬ２１およびＳＧ１３００９、酵
母菌株サッカロミセス セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）、および動物
細胞Ｌ、３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶｅｒｏおよびＨｅＬａ、ならび
に昆虫細胞ｓｆ９などがある。
【００１６】 当業者にとっては、本発明のｃＤＮＡを発現ベクターに挿入する方法は自明で
ある。また、当業者は、このｃＤＮＡを、それぞれ別のタンパク質およびペプチ
ドをコードするＤＮＡと組み合わせて挿入することができ、本発明のｃＤＮＡを
融合タンパク質の形で発現させることができるという事実にも精通している。
ある。また、当業者は、このｃＤＮＡを、それぞれ別のタンパク質およびペプチ
ドをコードするＤＮＡと組み合わせて挿入することができ、本発明のｃＤＮＡを
融合タンパク質の形で発現させることができるという事実にも精通している。
【００１７】 さらに、当業者にとっては、それぞれ形質転換細胞およびトランスフェクト細
胞を培養する条件も自明である。また、当業者は、本発明のｃＤＮＡによって発
現されるタンパク質を単離、精製するプロセスにも精通している。すなわち、融
合タンパク質であってもよい前記タンパク質も、本発明の主題の１つをなす。
胞を培養する条件も自明である。また、当業者は、本発明のｃＤＮＡによって発
現されるタンパク質を単離、精製するプロセスにも精通している。すなわち、融
合タンパク質であってもよい前記タンパク質も、本発明の主題の１つをなす。
【００１８】 本発明のさらなる主題は、それぞれ前記タンパク質および融合タンパク質に対
する抗体に関する。かかる抗体は、常法により調製することができる。該抗体は
、それぞれポリクローナルであってもよいし、モノクローナルであってもよい。
該抗体を調製する場合、動物、とくにポリクローナル抗体の場合はウサギまたは
ニワトリ、またモノクローナル抗体の場合はマウスを、上記（融合）タンパク質
またはその断片で免疫化することが望ましい。さらに、該動物の「追加免疫」を
、同じ（融合）タンパク質またはその断片で行ってもよい。次いで、ポリクロー
ナル抗体を、それぞれ動物血清および卵黄から得てよい。モノクローナル抗体の
場合は、動物脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させる。
する抗体に関する。かかる抗体は、常法により調製することができる。該抗体は
、それぞれポリクローナルであってもよいし、モノクローナルであってもよい。
該抗体を調製する場合、動物、とくにポリクローナル抗体の場合はウサギまたは
ニワトリ、またモノクローナル抗体の場合はマウスを、上記（融合）タンパク質
またはその断片で免疫化することが望ましい。さらに、該動物の「追加免疫」を
、同じ（融合）タンパク質またはその断片で行ってもよい。次いで、ポリクロー
ナル抗体を、それぞれ動物血清および卵黄から得てよい。モノクローナル抗体の
場合は、動物脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させる。
【００１９】 本発明は、ｗｎｔシグナル経路をさらに詳細に検討、理解できるようにする。
（ｗｎｔ- Ｉ）を、本発明の抗体によって生物体内で検出することができる。ま
た、このタンパク質に対する自己抗体を、本発明の（ｗｎｔ- Ｉ）によって検出
することができる。いずれの検出も、常法とくにウエスタンブロット法、ＥＬＩ
ＳＡ、免疫沈降法、または免疫蛍光法により行うことができる。さらに、（ｗｎ
ｔ- Ｉ）をコードする遺伝子の発現は、本発明の核酸とくにそれに由来するＤＮ
Ａおよびプライマーにより検出することができる。この検出は、常法とくにサザ
ンブロット法により行うことができる。
（ｗｎｔ- Ｉ）を、本発明の抗体によって生物体内で検出することができる。ま
た、このタンパク質に対する自己抗体を、本発明の（ｗｎｔ- Ｉ）によって検出
することができる。いずれの検出も、常法とくにウエスタンブロット法、ＥＬＩ
ＳＡ、免疫沈降法、または免疫蛍光法により行うことができる。さらに、（ｗｎ
ｔ- Ｉ）をコードする遺伝子の発現は、本発明の核酸とくにそれに由来するＤＮ
Ａおよびプライマーにより検出することができる。この検出は、常法とくにサザ
ンブロット法により行うことができる。
【００２０】 すなわち、本発明はまた、ｗｎｔシグナル経路に関連するプロセスをさらに詳
細に検討、すなわち診断および理解することに役立つ。これらのプロセスとして
は、たとえば細胞増殖および分化ならびに非常に広範囲の疾患がある。後者の具
体例としては、眼や骨の疾患ならびに腫瘍疾患とりわけ結腸癌および乳癌ならび
に黒色腫が挙げられる。
細に検討、すなわち診断および理解することに役立つ。これらのプロセスとして
は、たとえば細胞増殖および分化ならびに非常に広範囲の疾患がある。後者の具
体例としては、眼や骨の疾患ならびに腫瘍疾患とりわけ結腸癌および乳癌ならび
に黒色腫が挙げられる。
【００２１】 さらに、本発明は、生物における（ｗｎｔ- Ｉ）の存在に関しおよびその存在
に対し処置を講ずるのに適している。（ｗｎｔ- Ｉ）を、本発明の抗体により、
生物体内で阻害することができる。一方、生物体内の（ｗｎｔ- Ｉ）の量を、と
りわけたとえばトランスフェリンやＢＳＡなど身体によって外来であると認識さ
れないタンパク質に結合させた後で、本発明の（ｗｎｔ- Ｉ）により、増大させ
ることができる。同じことは、本発明の核酸、とくにある種の組織中で誘導可能
なプロモーターによって制御されていて、発現後にこれらの組織に（ｗｎｔ- Ｉ
）を提供するＤＮＡによって行うこともできる。また、本発明の核酸、とくにＤ
ＮＡを用いて、（ｗｎｔ- Ｉ）を阻害することもできる。この目的のためには、
核酸をたとえば（ｗｎｔ- Ｉ）をコードする遺伝子の発現阻害用アンチセンス・
オリゴヌクレオチドを調製するためのベースとして用いる。
に対し処置を講ずるのに適している。（ｗｎｔ- Ｉ）を、本発明の抗体により、
生物体内で阻害することができる。一方、生物体内の（ｗｎｔ- Ｉ）の量を、と
りわけたとえばトランスフェリンやＢＳＡなど身体によって外来であると認識さ
れないタンパク質に結合させた後で、本発明の（ｗｎｔ- Ｉ）により、増大させ
ることができる。同じことは、本発明の核酸、とくにある種の組織中で誘導可能
なプロモーターによって制御されていて、発現後にこれらの組織に（ｗｎｔ- Ｉ
）を提供するＤＮＡによって行うこともできる。また、本発明の核酸、とくにＤ
ＮＡを用いて、（ｗｎｔ- Ｉ）を阻害することもできる。この目的のためには、
核酸をたとえば（ｗｎｔ- Ｉ）をコードする遺伝子の発現阻害用アンチセンス・
オリゴヌクレオチドを調製するためのベースとして用いる。
【００２２】 すなわち、本発明はまた、それぞれ活性化的および阻害化的に、ｗｎｔシグナ
ル経路を阻害する可能性を開くものである。前者は、たとえば（ｗｎｔ- Ｉ）に
対する本発明の抗体の投与によって行うことができる。後者の場合、本発明の（
ｗｎｔ- Ｉ）を投与するのは明白である。ｗｎｔシグナル経路の活性化は、臓器
提供目的の生物の培養を検討する場合に有用であり得る。しかしながら、ｗｎｔ
シグナル経路の阻害自体は、骨および眼の疾患ならびに腫瘍疾患とくに結腸癌お
よび乳癌ならびに黒色腫の場合に、治療手段を講じることができるようにするも
のである。
ル経路を阻害する可能性を開くものである。前者は、たとえば（ｗｎｔ- Ｉ）に
対する本発明の抗体の投与によって行うことができる。後者の場合、本発明の（
ｗｎｔ- Ｉ）を投与するのは明白である。ｗｎｔシグナル経路の活性化は、臓器
提供目的の生物の培養を検討する場合に有用であり得る。しかしながら、ｗｎｔ
シグナル経路の阻害自体は、骨および眼の疾患ならびに腫瘍疾患とくに結腸癌お
よび乳癌ならびに黒色腫の場合に、治療手段を講じることができるようにするも
のである。
【００２３】 とりわけ、本発明は、組織特異的に使用することができるという点に特徴を有
する。この特徴は、診断と治療の両方に当てはまる。たとえば、本発明のＤＮＡ
であるＤｋｋ- １、対応するタンパク質、およびその抗体はそれぞれ、脳、心臓
、血管、骨、軟骨、結合組織および眼などの組織にとくに適している。さらに、
本発明のＤＮＡであるＤｋｋ- ２、対応するタンパク質、およびその抗体はそれ
ぞれ、脳、心臓、血管、骨、結合組織、腎臓、精巣、脾臓、卵巣、筋肉、子宮、
軟骨、眼および乳房などの組織にとくに適している。さらに、本発明のＤＮＡで
あるＤｋｋ- ３、対応するタンパク質、およびその抗体はそれぞれ、脳、心臓、
血管、骨、軟骨、眼、結合組織、肺、卵巣、筋肉および乳房などの組織にとくに
適している。
する。この特徴は、診断と治療の両方に当てはまる。たとえば、本発明のＤＮＡ
であるＤｋｋ- １、対応するタンパク質、およびその抗体はそれぞれ、脳、心臓
、血管、骨、軟骨、結合組織および眼などの組織にとくに適している。さらに、
本発明のＤＮＡであるＤｋｋ- ２、対応するタンパク質、およびその抗体はそれ
ぞれ、脳、心臓、血管、骨、結合組織、腎臓、精巣、脾臓、卵巣、筋肉、子宮、
軟骨、眼および乳房などの組織にとくに適している。さらに、本発明のＤＮＡで
あるＤｋｋ- ３、対応するタンパク質、およびその抗体はそれぞれ、脳、心臓、
血管、骨、軟骨、眼、結合組織、肺、卵巣、筋肉および乳房などの組織にとくに
適している。
【００２４】 以下、実施例により本発明を説明する。
【００２５】 実施例１： 本発明の（ｗｎｔ- Ｉ）の調製と精製 本発明の（ｗｎｔ- Ｉ）を調製するために、Ｆｉｇ．２．６のＤＮＡであるｐ
ｈｄｋｋ- １にＢａｍＨＩリンカーを付与した後、ＢａｍＨＩで切断し、あらか
じめＢａｍＨＩで切断しておいた発現ベクターｐＱＥ- ８（Diagen社）に挿入し
た。発現プラスミドｐＱ/ ｗｎｔ- Ｉが得られた。該プラスミドは、６個のヒス
チジン残基（Ｎ末端側要素）と本発明の（ｗｎｔ- Ｉ）（Ｃ末端側要素）とから
成る融合タンパク質をコードする。ｐＱ/ ｗｎｔ- Ｉを用いて、大腸菌ＳＧ１３
００９の形質転換を行った[ ゴッテスマンら（Gottesman, S. et al.）、J. Bac
teriol. 148, (1981), 265-273参照] 。細菌を、１００μｇ/ ｍｌのアンピシリ
ンと２５μｇ/ ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、６０μＭのイソプ
ロピル- β- Ｄ- チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で４時間誘導した。細菌
の溶解は、６Ｍ塩酸グアニジンの添加により行った。次いで、この溶菌物を用い
て、クロマトグラフィー資材製造業者(Diagen 社) の指示に従い、８Ｍ尿素の存
在下で、クロマトグラフィー（Ｎｉ- ＮＴＡ樹脂）を行った。結合した融合タン
パク質を、ｐＨ３．５の緩衝液で溶出した。中和後、融合タンパク質を１８％Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、クーマシー・ブルーで染色した[
トーマスとコーンバーグ（Thomas, J.O. and Kornberg, R.D. ）、J. Mol. Biol
. 149 (1975), 709-733 参照] 。
ｈｄｋｋ- １にＢａｍＨＩリンカーを付与した後、ＢａｍＨＩで切断し、あらか
じめＢａｍＨＩで切断しておいた発現ベクターｐＱＥ- ８（Diagen社）に挿入し
た。発現プラスミドｐＱ/ ｗｎｔ- Ｉが得られた。該プラスミドは、６個のヒス
チジン残基（Ｎ末端側要素）と本発明の（ｗｎｔ- Ｉ）（Ｃ末端側要素）とから
成る融合タンパク質をコードする。ｐＱ/ ｗｎｔ- Ｉを用いて、大腸菌ＳＧ１３
００９の形質転換を行った[ ゴッテスマンら（Gottesman, S. et al.）、J. Bac
teriol. 148, (1981), 265-273参照] 。細菌を、１００μｇ/ ｍｌのアンピシリ
ンと２５μｇ/ ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、６０μＭのイソプ
ロピル- β- Ｄ- チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で４時間誘導した。細菌
の溶解は、６Ｍ塩酸グアニジンの添加により行った。次いで、この溶菌物を用い
て、クロマトグラフィー資材製造業者(Diagen 社) の指示に従い、８Ｍ尿素の存
在下で、クロマトグラフィー（Ｎｉ- ＮＴＡ樹脂）を行った。結合した融合タン
パク質を、ｐＨ３．５の緩衝液で溶出した。中和後、融合タンパク質を１８％Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、クーマシー・ブルーで染色した[
トーマスとコーンバーグ（Thomas, J.O. and Kornberg, R.D. ）、J. Mol. Biol
. 149 (1975), 709-733 参照] 。
【００２６】 本発明の( 融合) タンパク質を高純度の形で調製することができることが示さ
れた。
れた。
【００２７】 実施例２： 本発明の抗体の調製と検出 本発明の実施例１の融合タンパク質を１８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動に付した。ゲルを４Ｍ酢酸ナトリウムで染色した後、約４０ｋＤのバンド
をゲルから切り出し、リン酸緩衝食塩水中でインキュベートした。ゲル片を沈殿
させた後、上清のタンパク質濃度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で測
定した後、クーマシー・ブルー染色を行った。以下のようにして、ゲル精製融合
タンパク質で動物を免疫化した：
気泳動に付した。ゲルを４Ｍ酢酸ナトリウムで染色した後、約４０ｋＤのバンド
をゲルから切り出し、リン酸緩衝食塩水中でインキュベートした。ゲル片を沈殿
させた後、上清のタンパク質濃度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で測
定した後、クーマシー・ブルー染色を行った。以下のようにして、ゲル精製融合
タンパク質で動物を免疫化した：
【００２８】 ウサギにおけるポリクローナル抗体のための免疫化プロトコル ３５μｇのゲル精製融合タンパク質を０．７ｍｌのＰＢＳとそれぞれ０．７ｍ
ｌのフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントに溶解し
たものを各回の免疫化に使用した。 ０日目 ： 第１回免疫化（フロイント完全アジュバント） １４日目： 第２回免疫化（フロイント不完全アジュバント；ｉｃＦＡ） ２８日目： 第３回免疫化（ｉｃＦＡ） ５６日目： 第４回免疫化（ｉｃＦＡ） ８０日目： 放血致死。
ｌのフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントに溶解し
たものを各回の免疫化に使用した。 ０日目 ： 第１回免疫化（フロイント完全アジュバント） １４日目： 第２回免疫化（フロイント不完全アジュバント；ｉｃＦＡ） ２８日目： 第３回免疫化（ｉｃＦＡ） ５６日目： 第４回免疫化（ｉｃＦＡ） ８０日目： 放血致死。
【００２９】 ウサギ血清を免疫ブロット法で試験した。この目的のために、本発明の実施例
１の融合タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ニトロセ
ルロース・フィルターに移した[ カイゼ- アンデルセン（Khyse-Andersen, J.）
、J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209参照] 。ボックら（Bock,
C.-T. et al.）、Virus Genes 8, (1994), 215-229の記載に従い、ウエスタンブ
ロット分析を行った。この目的のために、ニトロセルロース・フィルターを一次
抗体とともに３７℃で１時間インキュベートした。この抗体は、ウサギ血清( Ｐ
ＢＳで１：１００００希釈したもの) であった。ＰＢＳによる洗浄操作を数回繰
り返した後、ニトロセルロース・フィルターを二次抗体とともにインキュベート
した。この抗体は、アルカリホスファターゼ結合モノクローナルヤギ抗ウサギＩ
ｇＧ抗体(Dianova社) をＰＢＳで１：５０００希釈したものであった。３７℃で
３０分間インキュベートした後、ＰＢＳを用いた洗浄操作を数回繰り返し、次い
で、バンドが出現するまで、室温で、展開溶液( ３６μＭの５’- ブロモ- ４-
クロロ- ３- インドリルリン酸、４００μＭのニトロブルー・テトラゾリウム、
１００ｍＭのトリス- ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭ
ｇＣｌ2 ) によるアルカリホスファターゼ検出反応を行った。
１の融合タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ニトロセ
ルロース・フィルターに移した[ カイゼ- アンデルセン（Khyse-Andersen, J.）
、J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209参照] 。ボックら（Bock,
C.-T. et al.）、Virus Genes 8, (1994), 215-229の記載に従い、ウエスタンブ
ロット分析を行った。この目的のために、ニトロセルロース・フィルターを一次
抗体とともに３７℃で１時間インキュベートした。この抗体は、ウサギ血清( Ｐ
ＢＳで１：１００００希釈したもの) であった。ＰＢＳによる洗浄操作を数回繰
り返した後、ニトロセルロース・フィルターを二次抗体とともにインキュベート
した。この抗体は、アルカリホスファターゼ結合モノクローナルヤギ抗ウサギＩ
ｇＧ抗体(Dianova社) をＰＢＳで１：５０００希釈したものであった。３７℃で
３０分間インキュベートした後、ＰＢＳを用いた洗浄操作を数回繰り返し、次い
で、バンドが出現するまで、室温で、展開溶液( ３６μＭの５’- ブロモ- ４-
クロロ- ３- インドリルリン酸、４００μＭのニトロブルー・テトラゾリウム、
１００ｍＭのトリス- ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭ
ｇＣｌ2 ) によるアルカリホスファターゼ検出反応を行った。
【００３０】 本発明のポリクローナル抗体を調製することができることが示された。
【００３１】 ニワトリにおけるポリクローナル抗体のための免疫化プロトコル ４０μｇのゲル精製融合タンパク質を０．８ｍｌのＰＢＳとそれぞれ０．８ｍ
ｌのフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントに溶解し
たものを各回の免疫化に使用した。 ０日目 ： 第１回免疫化（フロイント完全アジュバント） ２８日目： 第２回免疫化（フロイント不完全アジュバント；ｉｃＦＡ） ５０日目： 第３回免疫化（ｉｃＦＡ）
ｌのフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントに溶解し
たものを各回の免疫化に使用した。 ０日目 ： 第１回免疫化（フロイント完全アジュバント） ２８日目： 第２回免疫化（フロイント不完全アジュバント；ｉｃＦＡ） ５０日目： 第３回免疫化（ｉｃＦＡ）
【００３２】 抗体を卵黄から抽出し、ウエスタンブロット法で試験した。本発明のポリクロ
ーナル抗体が検出された。
ーナル抗体が検出された。
【００３３】 マウスにおけるモノクローナル抗体のための免疫化プロトコル １２μｇのゲル精製融合タンパク質を０．２５ｍｌのＰＢＳとそれぞれ０．２
５ｍｌのフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントに溶
解したものを各回の免疫化に使用した。第４回免疫化では、０．５ｍｌ（アジュ
バントなし）に融合タンパク質を溶解した。 ０日目 ： 第１回免疫化（フロイント完全アジュバント） ２８日目： 第２回免疫化（フロイント不完全アジュバント；ｉｃＦＡ） ５６日目： 第３回免疫化（ｉｃＦＡ） ８４日目： 第４回免疫化（ＰＢＳ） ８７日目： 融合
５ｍｌのフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントに溶
解したものを各回の免疫化に使用した。第４回免疫化では、０．５ｍｌ（アジュ
バントなし）に融合タンパク質を溶解した。 ０日目 ： 第１回免疫化（フロイント完全アジュバント） ２８日目： 第２回免疫化（フロイント不完全アジュバント；ｉｃＦＡ） ５６日目： 第３回免疫化（ｉｃＦＡ） ８４日目： 第４回免疫化（ＰＢＳ） ８７日目： 融合
【００３４】 ハイブリドーマの上清をウエスタンブロット法で試験した。本発明のモノクロ
ーナル抗体が検出された。
ーナル抗体が検出された。
【００３５】
【表１】
【００３６】
【配列表】
【図１】 Ｆｉｇ．１は、本発明の（ｗｎｔ- Ｉ）のアミノ酸コンセンサス配列Ｉおよび
ＩＩを示す。記号「−」はアミノ酸を示し、アスタリスクが付されている場合、
アミノ酸の数は変動しうる。
ＩＩを示す。記号「−」はアミノ酸を示し、アスタリスクが付されている場合、
アミノ酸の数は変動しうる。
【図２】 Ｆｉｇ．２は、（ｗｎｔ- Ｉ）のアミノ酸コンセンサス配列に寄与する塩基を
示すことによって、（ｗｎｔ- Ｉ）をコードする７つのＤＮＡの塩基配列を示す
。
示すことによって、（ｗｎｔ- Ｉ）をコードする７つのＤＮＡの塩基配列を示す
。
【図３】 Ｆｉｇ．３は、（ｗｎｔ- Ｉ）、Ｄｋｋ- １、Ｄｋｋ- ２およびＤｋｋ- ３を
コードする３つのＤＮＡの組織における発現を示す。
コードする３つのＤＮＡの組織における発現を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年４月２７日（２０００．４．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８６ 16/22 1/19 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 1/21 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｅ 5/10 Ｔ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ａ６１Ｋ 39/395 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 グリンカ，アンドレイ ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー −69126 エリーンヴェーク 22 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA43 BA44 BA80 CA04 CA07 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA03 GA11 HA01 HA15 4B064 AG01 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA91Y AA93Y AB01 AB04 BA02 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 NA14 ZB262 4C085 AA13 AA14 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA11 BA10 BA41 CA40 DA76 EA28 EA50 FA72 FA74
Claims (10)
- 【請求項１】 タンパク質が、Ｆｉｇ．１に示されるアミノ酸コンセンサス
配列ＩおよびＩＩの少なくとも１つを含有してなるものである、ｗｎｔシグナル
経路の阻害タンパク質。 - 【請求項２】 前記タンパク質が、アミノ酸コンセンサス配列ＩおよびＩＩ
を含有してなるものである、請求項１記載のタンパク質。 - 【請求項３】 請求項１または２記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 【請求項４】 前記ＤＮＡが、 （ａ）Ｆｉｇ．２のＤＮＡまたは１つ若しくは複数の塩基対がそれとは異なるＤ
ＮＡ、 （ｂ）（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡまたは （ｃ）縮重遺伝コードを介して（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡに関連するＤＮＡ
、 を含むものである、請求項３記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項３または４記載のＤＮＡを含有してなる発現プラスミ
ド。 - 【請求項６】 請求項５記載の発現プラスミドを含む形質転換体。
- 【請求項７】 好適な条件下に請求項６記載の形質転換体を培養する工程を
含む、請求項１または２記載のタンパク質の調製方法。 - 【請求項８】 請求項１または２記載のタンパク質に対する抗体。
- 【請求項９】 診断剤および／または治療剤としての、請求項１または２記
載のタンパク質の使用。 - 【請求項１０】 診断剤および／または治療剤としての、請求項３または４
記載のＤＮＡの使用。
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|---|---|---|---|
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| DE19747418A DE19747418C1 (de) | 1997-10-27 | 1997-10-27 | Inhibitor-Protein des wnt-Signalwegs |
| PCT/DE1998/003155 WO1999022000A1 (de) | 1997-10-27 | 1998-10-27 | Inhibitor-protein des wnt-signalwegs |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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| EP (2) | EP1923465A1 (ja) |
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| ES (1) | ES2306483T5 (ja) |
| PT (1) | PT1027440E (ja) |
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| EP1161445A2 (en) * | 1999-03-05 | 2001-12-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Human dickkopf-related protein and nucleic acid molecules and uses therefor |
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