JP2001519164A

JP2001519164A - 植物脂肪酸ヒドロキシラーゼ遺伝子

Info

Publication number: JP2001519164A
Application number: JP2000515018A
Authority: JP
Inventors: テイジュ、ナタリー; ピノ、フランク; バンブニスト、イレーヌ; ブカン、ルノール; エルビ、クリスチアーン; バタール、ヤニック; − ユルタド、フランシスコキャベロ; − ライヒハルト、ダニエルヴェルク; サロン、ジャン、ピエール; デュルス、フランシス
Original assignee: ザサーントルナショナルドルシエルシュシアンティフィク
Priority date: 1997-10-06
Filing date: 1998-10-06
Publication date: 2001-10-23
Also published as: EP1021551A1; AU9455398A; WO1999018224A1; CA2309791A1

Abstract

(57)【要約】種々の植物資源から採取した複数のシトクロームP450依存性脂肪酸ヒドロキシラーゼを組換えクローン化技術により同定し、これらヒドロキシラーゼの構造及び機能に関してキャラクタリゼーションを行った。これらのクローンは、異種起源の酵母系の中で発現させた場合に活性を示す、代表的な新規植物ヒドロキシラーゼである。これらのヒドロキシラーゼ酵素は、種々の長さの酸基質中において、種々の明確な位置で、脂肪酸基質をヒドロキシル化する。攻撃位置に二重結合を有する、天然脂肪酸及び合成脂肪酸のエポキシ化反応において、このヒドロキシラーゼは触媒効果を発揮する。

Description

【発明の詳細な説明】

（発明の背景）

【０００１】（発明の分野）本発明は、植物脂肪酸ヒドロキシラーゼ遺伝子の同定、遺伝子工学及び細胞の
脂肪酸内容、好ましくは遺伝子導入細胞の脂肪酸内容の修飾における植物脂肪酸
ヒドロキシラーゼ遺伝子の使用、並びに核酸、組換えベクター、ポリペプチド、
宿主細胞、遺伝子導入植物、ヒドロキシル化脂肪酸の内容を変えた植物製品に関
するものである。

【０００２】（関連技術の説明）植物ミクロソームの中には、脂肪酸基質の熱ヒドロキシル化又は分子鎖内（in
-chain）ヒドロキシル化を触媒する、２種類のラウレートヒドロキシラーゼが存在する。これら２種類のヒドロキシラーゼは、両者ともシトクローム P-450酵
素であるが、これらのヒドロキシラーゼが同じ植物中には共存することは無い（
Salaunら, 1982）。

【０００３】ラウリン酸はキクイモの塊茎、チューリップの球根、トウモロコシの実生、及
びその他いくつかの植物の中で、分子鎖内ヒドロキシラーゼによりヒドロキシル
化され、ω−２、ω−３、およびω−４モノヒドロキシラウレートの混合物を生
成する。また、他の植物、主にレグミノサーエ（leguminosae）の中には、ラウレートオメガヒドロキシラーゼが存在し、当該ヒドロキシラーゼは脂肪酸基質の末端メチル基をヒドロキシル化する。これら２種類の作用は別々のP450種の中
では見いだされているが、分析した12種類の植物種の中で共存することはなかっ
た（Salaunら, 1982）。

【０００４】多くの植物中において、種々の生体異物又は生物体内生基質に曝され、真菌に
感染し、光で照射され、或いは組織が傷付けられると、シトクロームP450の濃度
は著しく増加した。合成植物ホルモンである2,4-ジクロル-フェノキシ酢酸（2,4
-D）により、キクイモの塊茎組織の中に含まれるシトクロームP450の量は、分光
分析的に検出可能な濃度範囲内において増加した（Adeleら, 1981）。同様に、種々の植物の中で、シトクロームP450含有量、さらに詳しくはラウリン酸分子鎖
内ヒドロキシラーゼ及びオメガヒドロキシラーゼの作用が、フェノバルビトール
により実質的に誘発された（Salaunら, 1981; 1982）。

【０００５】クロフィブラート（エチル 2-[4-クロルフェノキシ]-2-メチルプロパノエート
）は脂質濃度低下剤であり、ミトコンドリア、小胞体、及び哺乳類肝臓中のペル
オキシソームを増殖させる働きがある。クロフィブラートで処理した試験動物か
ら採取した肝臓組織の中で、シトクロームP450の作用、より詳しくはラウリン酸
オメガヒドロキシラーゼの作用が認められた（Gibsonら, 1982）。これと類似の
効果が、工業用可塑剤として広く使用されているジ-(2-エチルヘキシル)-フタレ
ート（DEHP）によっても誘発される。

【０００６】本明細書で開示したように、シトクロームP450を誘発することにより、富化資
源から採取した植物脂肪酸ヒドロキシラーゼの精製、植物脂肪酸ヒドロキシラー
ゼから採取したタンパク質の配列決定、及びヒドロキシラーゼ一族のクローン化
が可能となった。クローン化遺伝子が脂肪酸ヒドロキシラーゼそのものであるこ
とは、その機能を評価することにより確認されている。

【０００７】（発明の要約）本発明の目的は、植物脂肪酸ヒドロキシラーゼをコード化する、シトクローム
P450遺伝子を提供することにある。特に本発明は、植物脂肪酸オメガヒドロキシ
ラーゼ（例えば、シトクロームP450、亜類型CYP94）及び分子鎖内（ω−１、ω −２、ω−３、およびω−４）ヒドロキシラーゼ（シトクロームP450、亜類型CY
P81）に独特なペプチド配列を有する末端（オメガ又はω）ヒドロキシラーゼの植物遺伝子を提供する。

【０００８】本発明のさらに他の目的は、植物脂肪酸ヒドロキシラーゼ遺伝子誘導製品を提
供することにある。このような製品には、例えば、核酸、ポリペプチド、宿主細
胞、及び遺伝子導入植物などがある。

【０００９】本発明のさらに他の目的は、植物脂肪酸ヒドロキシラーゼ遺伝子を造り、これ
を使用する工程を提供することにある。特に、本明細書の中で開示したヌクレオ
チド及びアミノ酸の配列を使用して、遺伝子工学により植物脂肪酸ヒドロキシラ
ーゼの構造的及び機能的な変種を造ることが可能となる。さらに、脂肪酸の代謝
に影響を与えるような導入遺伝子を含む植物を造り、これによりヒドロキシル化
脂肪酸を変化させた植物製品が得られる。

【００１０】本発明の一つの態様において、核酸（例えばDNA、RNA、及びその変種）、核酸
で構成される組換えポリヌクレオチド（例えば組換えベクター及び発現ベクター
）、核酸によりコード化されたポリペプチド（例えば脂肪酸ヒドロキシラーゼ活
性を有する酵素）、上記分子を含む宿主細胞（例えば細菌、酵母、植物）、及び
、本明細書が開示する脂肪酸ヒドロキシラーゼ配列を使用することにより発生す
る野性種又は突然変異体を含む植物全体（又は野性種又は突然変異体遺伝子製品
）が提供される。

【００１１】本発明の第二の態様は、植物脂肪酸ヒドロキシラーゼ遺伝子配列を発現させる
ことにより、遺伝子組換えポリペプチドを造る工程である。当該ポリペプチドは
、当該遺伝子配列を発現している宿主細胞から単離し、工業的工程においてこれ
を酵素として使用し、又は宿主細胞又は植物の中で適切な脂肪酸基質をヒドロキ
シル化するために、当該ポリペプチドを作用させることができる。

【００１２】変種植物脂肪酸ヒドロキシラーゼは、遺伝子の突然変異により造ることができ
る。変異遺伝子及びその同種タンパク質を造る方法の例として、ランダム又はサ
イト指向突然変異、ドメインシャッフリング（domain shuffling）、酵素と基質の構造接触に基づく合理的設計、及びタンパク質構造と酵素作用の相関関係な
どを挙げることができる。変異植物脂肪酸ヒドロキシラーゼは、例えば基質特異
性の修飾など、そのときに希望する特性に対してこれを選ぶことができる。この
ような修飾の適切な例として、短め又は長めの脂肪酸鎖或いは奇数個の炭素数を
有する脂肪酸のヒドロキシル化、分子鎖内にヒドロキシ基又はエポキシ基を有す
る脂肪酸のヒドロキシル化、チア脂肪酸（硫黄原子置換メチレン基を有する脂肪
酸）のヒドロキシル化、エーテル脂肪酸（酸素原子置換メチレン基を有する脂肪
酸）のヒドロキシル化、（遊離カルボキシル基を有する通常の脂肪酸ではなく）
エステル又はアミドなどの修飾脂肪酸のヒドロキシル化を挙げることができる。
その他選択対象となる好ましい性質としては、基質に対する親和性、触媒速度の
修飾、酵素不安定性又は安定性、及び補助要因としての要件などが挙げられる。

【００１３】第三の態様において、本発明は、脂肪酸ヒドロキシラーゼの代謝産物及びこの
ような代謝産物を富化した分画を提供する。また、本発明は、本発明で開示した
配列及び発現ベクターを使用して、特定の脂肪酸ヒドロキシラーゼを増減する遺
伝子導入宿主細胞及び遺伝子導入植物を造る工程も提供する。このような遺伝子
導入宿主細胞及び遺伝子導入植物は、富化又は枯渇分画から希望する代謝作用を
得るために、有用な出発資源を提供する。ヒドロキシル化脂肪酸は、遺伝子導入
種子中の保存脂質として造ることが好ましい。

【００１４】例えば、ヒドロキシル化脂肪酸は、通常、植物のリン脂質分画（細胞膜）中に
少量存在する。遺伝子導入植物中における植物脂肪酸ヒドロキシラーゼ遺伝子の
過剰発現により、遺伝子導入植物中のトリグリセリドの中に存在するヒドロキシ
ル化脂肪酸の含有量が増加する可能性がある。種子固有プロモーターを使用する
と、大量のヒドロキシル化脂肪酸を保存脂質として蓄積させることができる。蓄
積した脂肪酸は、遺伝子導入種子から油を抽出し、その中に保存されている脂肪
酸を単離することにより、これを回収することができる。

【００１５】本発明における第四の態様は、ハイブリッド化（例えば厳しさの高いものと低
いものの組み合わせ）又は核酸（例えばLCR, PCR）の増幅により、或いは下記定
義によるオメガ脂肪酸ヒドロキシラーゼの見出しでデータベースを検索すること
により、追加脂肪酸ヒドロキシラーゼ遺伝子を同定し、ヒドロキシラーゼ配列の
酵素又は遺伝子突然変異生成を化学的に修飾（例えば点突然変異、削除、挿入、
ドメインシャッフリング）することにより、脂肪酸ヒドロキシラーゼ変異体を造る工程である。

【００１６】当該脂肪酸基質は、例えばカプリン脂肪酸（C10:0）、ラウリン脂肪酸（C12:0
）、ミリスチン脂肪酸（C14:0）、パリミチン脂肪酸（C16:0）、オレイン脂肪酸
（C18:1）、リノール脂肪酸（C18:2）とその鏡像体（9E,122）及び（9Z,12E）、
並びにリノレン脂肪酸（C18:3）などである。カプリン脂肪酸、ラウリン脂肪酸及びミリスチン脂肪酸は中位鎖（medium-chain）脂肪酸、パルミチン脂肪酸、オ
レイン脂肪酸、リノール脂肪酸、及びリノレン脂肪酸は長鎖脂肪酸であると言え
よう。

【００１７】本発明により造られたヒドロキシル化脂肪酸及びエポキシ化脂肪酸は、潤滑剤
、スリップ防止剤、可塑剤、コーティング剤、洗剤、及び界面活性剤のメーカー
にとって、新しい性質を持つ有用な油を提供する。

【００１８】種子中の保存脂質として、植物中のオメガヒドロキシル化脂肪酸は過剰に生産
されることもあり、又は不足気味に生産されることもある。大量生産などの工業
生産上の理由は別にして、これには理由が存在する。表皮合成にはオメガヒドロ
キシラーゼが関与するが、このことから、これら遺伝子の発現操作が、植物の日
照りに対する抵抗力或いは昆虫及びその他病原体の攻撃に対する抵抗力に影響す
ることが分かる。さらに、ヒドロキシル化脂肪酸は、本質的に植物の病原体に対
する防御機構を引き出す活性化剤（誘因剤）として作用する。

【００１９】（発明の詳細な説明）植物には、他とは異なるシトクロームP450の異性形が存在するのが、その特徴
である（Salaun及びHelvig, 1995）。これらの異性形のあるものは、その組織、
器官及び種に固有な種類である可能性が高い。CYP73（CA4H＝桂皮酸4-ヒドロキシラーゼ）など、上記以外の異性形は、植物王国の中で広く分布している異性形
である。哺乳動物におけるように、シトクロームP-450の多くの形が植物中に存在する中位鎖及び長鎖の脂肪酸（FA）の酸化に関与していることは、すでに良く
知られている事実である。面白いことに、哺乳動物と植物の間には、種々の生体
異物による触媒機構及び酵素活性の誘発において、いくつかの類似点が存在する
。しかし、脂肪酸の酸化に関与する植物のP450は、今日に至るまで単離されてい
ない。その理由は、これらの膜結合酵素が一般に組織中に非常に低い濃度で存在
することにある。過去10年間に、CPY4遺伝子の一族（主に脂肪酸ヒドロキシラー
ゼ）によりコード化されたシトクロームP450生成物がいくつか精製され、これら
からcDNAが単離されて、哺乳動物及び昆虫のcDNAライブラリからそれらの配列が
決定された。今日までに、50種類を越える植物P450でコード化されたcDNAの配列
が決定された。しかし、その中には、哺乳動物及び昆虫から採取したCYP4族の遺
伝子に一致するものは無かった。

【００２０】脂肪酸及びエイコサノイドの酸化に関与するシトクロームP450異性形の生物学
的役割及び基質特異性は、まだ余り解明されていない。植物から採取される酸素
化脂肪酸は、主にトリグリセリド及びリン脂質並びに重合体層中のモノマーなど
の極性脂質の中で見いだされている。

【００２１】角皮素及びコルク質は、主にヒドロキシル化脂肪酸、特にオメガヒドロキシル
化脂肪酸で構成される重合体である。これらの物質は、水の損失、薬品の浸透、
病原体（例えば、微生物、昆虫など）の攻撃、及びその他環境ストレスから植物
を保護する。これらの中には真菌クチナーゼの強力な誘導物質も存在し、また、
抗真菌性を示すものも存在する。これらと対照的な、見掛上反対に見える効果と
しては、植物の中に見いだされる防衛機構が非常に多様であることであるが、こ
れは植物宿主への感染を容易にするために真菌類が発展させた戦略であると考え
られる。

【００２２】他方、すでに哺乳動物について報告したように、ヒドロキシル化脂肪酸は刺激
過程に似た反応を引き起こす。これは、種々のストレスに対して反応し、防衛機
構としての役割を演じるためと考えられる。さらに、植物の花の柱頭には、大量
のC18族のヒドロキシル誘導体が存在する。このことは、当該ヒドロキシル化脂肪酸が花粉による症状を認識する役割を演じていることが示唆している。

【００２３】長鎖脂肪酸のオメガヒドロキシラーゼ及び分子鎖内ヒドロキシラーゼは、植物
表皮の合成において、成分の角皮素（クチン）モノマーの重合にとって必須成分
であると考えられるヒドロキシル基を発生させるものと考えられる。これは、当
該ヒドロキシラーゼの重要な役割であると考えられる。表皮モノマーは、しばし
ば錯体混合物として存在し、当該錯体化合物は種固有のプロフィールを有してい
る。ヒドロキシル化脂肪酸に加えエポキシ化誘導体も、数種の植物種中に表皮モ
ノマーとして見いだされている。さらに、化学反応及び酵素反応によりエポキシ
化物を開環させ、これにより、C16脂肪酸族から近接ジオール誘導体を生成させるが、これらの誘導体は、まだ植物の表皮中に検出されていない。このことは、
表皮マトリックスの重合に対して、エポキシ基が必須ではない可能性を示唆して
いる。この場合、内部ヒドロキシル基を導入することにより、シトクロームP450
依存脂肪酸により触媒される直接ヒドロキシル化反応機構が、当該反応に関与し
ていることが示唆された。

【００２４】脂肪酸及びその誘導体に、ヒドロキシル化、エポキシ化、脱水及び還元など、
種々の酸化反応を行わせてみた。その結果、いくつかの形のシトクロームP450が
、これらの反応に関与しているのではないかと思われた。例えば、以前実施した
研究において、ラウリン酸などのモデル基質とともにインキュベートした場合、
少なくとも３種類の異なるP450異性形が、種々の植物種から採取したミクロソー
ム中に存在することが証明されている。これらのP450系のいずれかが、不飽和ラ
ウレート類似体（部位特異性を有し、当該部位特異性は位置特異性及び立体特異
性に強く依存し、さらに当該位置特異性及び立体特異性は、脂肪族鎖中の二重結
合の形状に依存する）のヒドロキシル化及びエポキシ化に対して触媒作用を有す
ることは興味深い。

【００２５】シトクロームP450依存反応は、植物中の脂肪酸及びその誘導体の酸化に関与し
ている。この反応を、反応の型及び攻撃される炭素原子の位置に従って下記に分
類し、目下検討の対象となっているシトクロームP450活性の化学薬品による誘発
及び自殺基質による不活性化に関し、いくつかの例について説明する。

【００２６】 12-ヒドロキシラウリン酸を独占的に造るラウリン酸オメガヒドロキシラーゼ（ω-LAH）について、Pisum sativum、Vicia sativa及びその他Leguminosaeの中
で述べられている。ラウレートのヒドロキシル化に加え、クロフィブラート処理
したV. sativaの苗から採取したミクロソーム分画も、カプリン酸（C10:0）及び
ミリスチン酸（C14:0）のオメガヒドロキシル化に対して触媒作用を示した。従って、基質と酵素の結合には遊離カルボキシル基が必須のように思われる。誘発
反応及び開始反応に関しても調べた。その結果は、単一のシトクロームP450が、
これらの脂肪酸をオメガヒドロキシル化できることを示唆している。

【００２７】当該ω-LAHの触媒能力を探究するために、一連の（1-¹⁴C）で放射能標識した不飽和ラウリン酸類自体（7-、8-、9-及び10-ドデセン酸）を、クロフィブラート処理したV. sativaの苗から採取したミクロソーム分画とともにインキュベートした。O₂及びNADPHが存在する場合、この準細胞分画がラウリン酸類自体のオメガ酸化に対して触媒能力を有していた。これら４種類の分子内不飽和類似体の
シス及びトランス形により、ほぼ同等の効率で12-ヒドロキシル化することができた。二重結合の立体化学構造を完全に保持したままアリル基の酸化（即ち10- ドデセノエートの12-ヒドロキシル化）が起こったこと、及びアリル基の転移が観察されなかったことも注目すべき事実である。これとは対照的に、末端オレフ
ィン（11-ドデセン酸）は酵素形成反応によりエポキシ化された。ミクロソームをCO、抗シトクロームP450レダクターゼ抗体及び自殺基質の存在下にインキュベ
ートした場合には、各代謝産物の生成は同程度に阻害された。このことは、単一
P-450イソ酵素がラウリン酸、二重結合又は1,4-ペンタジエンモチーフを有する
不飽和類似体をオメガヒドロキシル化し、末端オレフィン（11-ドデセン酸）をエポキシ化できることを示唆している。ω-LAH活性がラウレートの10倍の濃度の
オレイン酸（C18:1）により阻害されなかったという事実は、当該活性が短鎖及び中位鎖の脂肪酸に固有のものであることを示唆している。

【００２８】 Soliday及びKolattukudyは、初期の研究において、V. fabaから採取したミクロソーム分画により、パルミチン酸（C16:0）がオメガヒドロキシル化できることを証明した。また、COにより反応が阻害されることから、シトクロームP-450 モノオキシゲナーゼの関与を示唆している。しかし、COによる阻害効果が、光照
射により反転されることは無かった。最近、暗黄化したVicia sativaの苗から採
取し、（1-¹⁴C）オレイン酸（Z9-オクタデセン酸）、（1-¹⁴C）9,10- エポキシステアリン酸又は（1-¹⁴C）9,10-ジヒドロキシステアリン酸とともにインキュベ
ートしたミクロソームが、ヒドロキシル化代謝産物のNADPH依存形成反応において触媒活性を有することが見いだされた。これら化合物の化学構造をGC-MS分析により求めたところ、それぞれ18-ヒドロキシオレイン酸、18-ヒドロキシ-9,10-
エポキシステアリン酸、及び9,10,18-トリヒドロキシステアリン酸であることが
分かった。当該反応はCOにより阻害された。反応の阻害は、光により部分的に反
転できるものと考えられ、３つの反応全てが、キクイモから採取したNADPH-シト
クロームP450レダクターゼに対して培養した抗体により阻害された。リノール酸
によりオレイン酸のヒドロキシル化反応が阻害され、これとは逆にオレイン酸に
よりリノール酸のヒドロキシル化反応が阻害される。このように両阻害反応が競
争的に起こることから、単一P450がオレイン酸及びリノール酸（C18:2）のオメガ酸化に関与している可能性が示唆された。

【００２９】キクイモの塊茎（Helianthus tuberosus）から採取したミクロソームの中では
、ラウリン酸分子鎖内ヒドロキシラーゼ（1C-LAH）が、それぞれ24:63:13の比率
で炭素10、９及び８のヒドロキシル化反応に対して触媒作用を示す。この作用に
より、休眠中の塊茎組織の中では検出されなかった活性が、茎に傷を付けてから
薬品に曝すことにより誘発された。トウモロコシ及びチューリップなど、他のい
くつかの植物種がこの型の反応を触媒する。コムギの苗においては、ラウリン酸
が主に11-ヒドロキシ誘導体に変換される。コムギから採取したラウリン酸(ω-1
)-ヒドロキシラーゼ（(ω-1)-LAH）は、11-ヒドロキシ、10-ヒドロキシ及び9-ヒ
ドロキシラウレートに対して、それぞれ対応するモノヒドロキシラウレートの混
合物を65%、31%及び４%の割合で発生させる。カプリン酸及びミリスチン酸も（ ω-1）及び（ω-2）ヒドロキシル化生成物に変換された。この他にも、ミリスチ
ン酸を基質として使用した場合には、（ω-3）及び（ω-4）の位置でヒドロキシ
ル化された代謝産物も、少量ではあるが検出された。インキュベートする脂肪酸
（C10−C14）の長さがどうであれ、オメガヒドロキシル化生成物は全く検出され
なかった。さらに我々の実験室で得られた結果は、コムギから採取した(ω-1)-L
AHが除草剤diclofopのヒドロキシル化を触媒することを示唆していた。

【００３０】植物表皮の生合成反応には、種々の異なるP450系が関与している。V.fabaミク
ロソームによりオメガヒドロキシパルミチン酸の分子鎖内ヒドロキシル化を行う
と、9(又は10),16-ジヒドロキシパルミチン酸が生成する。この反応はCOにより阻害されるが、この効果は光により有効に逆転させることができる。この方法に
より、当該シトクロームP-450は、パルミチン酸のオメガヒドロキシル化を誘発するシクロトームP450とは、別のシクロトームP450であるものと考えられる。

【００３１】コムギ穀果の角皮素中に見いだされる最も豊富な構成成分は、オメガヒドロキ
シル化オレイン酸及び9,10- エポキシステアリン酸である。驚くべきことに、暗
黄化コムギの新芽（Triticum aesrivum L.）から採取したミクロソーム分画を（
1-¹⁴C）オレイン酸でインキュベートすると、18-、17-及び16-ヒドロキシオレイ
ン酸が生成し、GC-MSでこれを同定することができた。これら生成物の生成比率は、それぞれ1.4:4.6:４であった。これらのヒドロキル化反応がO₂及びNADPHに依存すること及びCOによる当該阻害作用が光により反転することにより、シトク
ロームP-450の関与が証明された。この反応は、適切に設計された反応機構に基づく反応阻害剤（下記参照）により選択的に阻害された。他方、ラウリン酸及び
桂皮酸のヒドロキシル化は当該反応阻害剤により影響を受けなかった。

【００３２】二種類の硫黄含有ラウリン酸類似体の酸化反応に対して、V.sativaミクロソー
ムの触媒能力を調べた。放射線標識した２種類の合成硫化物（1-¹⁴C）即ち10-メ
チルスルフィニルデカン酸(10S-LAU)及び(1-¹⁴C)δ-プロピルスルフィニルオクタン酸（8S-LAU）を、P-450又はペルオキシダーゼ反応を促進するような条件下において、V.sativaミクロソームでインキュベートした。期待されたペルオキシ
ダーゼによる酸化の他に、少なくとも２種類の異なる膜結合酵素により、8-及び
10-チオ脂肪酸を活発にスルホキシドに変換することができた。当該反応においてはNADPHが必要であり、機構的に反応を阻害するω-LAH（下記参照）の効果を標的として、阻害剤11-ドデシン酸（11-DDYA）を使用した。その結果、当該阻害
剤が、COによる阻害効果及びNADPH依存反応による不活化効果を反転させることが分かった。このことから、10S-LAU及び8S-LAUのスルホキシ化反応が、これらの阻害剤又はこれと類似のP450であるヒドロキシル化ラウリン酸が、当該反応に
対して触媒効果を示したと考えることができる。第二の膜結合酵素（NADPH依存性を有するものと思われる）のキャラクタリゼーションについては、充分にこれ
を行うことができなかった。しかし、培養媒体中に存在するベータメルカプトメタノールは、8S-LAU又は10S-LAUのスルホキシ化に対しては、何の効果も示さなかった。このことは、これらの膜中に存在するペルオキシダーゼが、当該反応
に関与していないことを示唆している。

【００３３】生きた微生物が有する顕著な性質は、化学的又は物理的なストレスに反応して
、P450モノオキシジェナーゼの活性を誘発させる能力を有することである。植物
から採取したシトクロームP-450の活性は、光照射、紫外線照射、切傷、熟成、真菌感染、誘発剤の使用、内因性化合物及び毒性緩和剤、除草剤、医薬品及び汚
染物質を含む多数の薬品類の使用により誘発される。

【００３４】ラウリン酸（ω-LAH）及びオレイン酸（ω-OAH）のオメガヒドロキシル化に関
与する植物P450系は、クロフィブラートにより、その添加量に依存して誘発され
る。クロフィブラートは、哺乳動物及び植物中でペルオキシソームの増殖を誘発
する、良く知られた脂質降下剤である。クロフィブラート及びこれと関連する2,
4-ジクロルフェノキシ酢酸（2,4-D）など、脂肪酸オメガヒドロキシラーゼ活性を選択的に誘発するアリールフェノキシ化合物は、H.tuberosusの塊茎から採取した1C-LAH及びコムギの苗から採取した(ω-1)-LAHの活性に対しては、殆ど又は
全く影響を与えない。V.sativaのミクロソームには、脂肪酸オメガヒドロキシラ
ーゼが独占的に含まれる。これらの生体異物に曝露することにより、オメガヒド
ロキシラーゼ活性が、フェノバルビタールで約20倍、クロフィブラートで30−50
倍以上と著しく増加するが、未処理のViciaの苗或いはクロフィブラート又はフェノバルビタールで処理したViciaの苗から採取したミクロソーム中で、分子鎖内ヒドロキシル化脂肪酸がこれまでに検出されたことは無い。哺乳動物系におい
て、クロフィブラートがオメガヒドロキシラーゼを選択的に誘発し、他方、フェ
ノバルビタールがラウリン酸の(ω-1)-ヒドロキシル化を高めることは注目に値する。無水ナフタリン酸（NA）又はフェノバルビタール（PB）で処理することに
より、暗黄化コムギの新芽ミクロソームの(ω-1)-LAH活性が刺激される。種子を
毒性除去剤であるNAで被覆することにより、(ω-1)-LAH 活性が4.5倍に、P-450 含有量が1.5倍に増加した。他方、桂皮酸ヒドロキシラーゼ（CA4H; リグニン合成に関与するP450）の活性は、当該被覆操作により低下した。ジクロホップアリールヒドロキシラーゼ（DIAH）の除草剤代謝活性は、当該被覆操作により４倍
に刺激された。苗を5 mMのPB溶液上で熟成すると、これより(ω-1)-LAH 及びDIA
Hの刺激効果が著しく高められることが観察された。種子を先ずNAで被覆し、次にPBで熟成すると、(ω-1)-LAH 及びDIAHの相乗的な刺激効果が得られた（20倍に高まった）。他方、この操作により、CA4H活性は強く抑制された。シクロトー
ムP450の含有量が約0.5 nmol/mgに増加したが、この水準は、これまでに植物の中で記録された中では最も高い水準であった。生成した11-, 10-及び9-ヒドロキ
シラウレートの相対量は、全ての条件下において不変であった。同様に、(ω-1)
-オレイン酸ヒドロキシラーゼの活性は、処理を行った苗の中では、(ω-1)-LAH と同程度まで誘発されていた。しかし、これらのP450依存反応を促進したのは、
それぞれ異なる異性形であった。

【００３５】広範囲の薬品に関して実験を行った結果、これらの薬品がキクイモ、チューリ
ップ及びトウモロコシの苗から採取した塊茎及び球根の1C-LAH活性を誘発するこ
とが見いだされた。25 mMのMnCl₂及び20 mMのアミノピリン存在下でキクイモの塊茎の薄片に傷を付けた。この操作により、当該活性は未処理の水準を越えて誘
発された。しかし、当該組織を8 mMのフェノバルビタールに曝すことにより、当
該活性はさらに高められた。

【００３６】植物系中におけるシトクロームP450の誘発機構は、まだ解明されていない。し
かし、哺乳動物中のP450誘発剤の大部分は、植物P450の誘発においても有効であ
った。最近の実験結果から、クロフィブラートなどの脂質降下剤により、ネズミ
肝臓シトクロームP450依存脂肪酸ヒドロキシラーゼを誘発させる場合、当該反応
の誘発効果及びある特定の生理学的条件に対して、レセプター（ペルオキシソー
ム増殖剤で活性化されたレセプター）により仲介される遺伝子の転写活性化が関
与していることが分かった。これらの事実から、脂質代謝の混乱が起こり、この
混乱状態がペルオキシソーム増殖剤による脂肪酸ヒドロキシラーゼ誘発の一般的
な要因になっていることを示唆している。

【００３７】末端アセチレンを含む反応機構的阻害剤（自殺基質）は、植物及び哺乳動物両
方の脂肪酸オメガヒドロキシラーゼに対して、強力な不可逆阻害剤として作用す
る。クロフィブラート処理したV.sativaの苗からミクロソームを採取し、これを
11-ドデシン酸（11-DDYA）及びNADPHとともに前培養した。その結果、ラウリン酸オメガヒドロキシル化物の疑似一次損失が起こった（Ｋ＝150 μM、半減期＝2
.4分）。11-DDYAによる不活化反応の見掛け速度定数は4.3−4.8 x 10^-3/秒であった。V.sativaから採取したミクロソームを(1-¹⁴C)11-DDYAとともに培養すると
、主要代謝産物である1,12-デカン二酸が得られる。当該1,12-デカン二酸は、ケ
テン中間体に水が付加して生成したものと考えられる。このケテンも活性位の親
核残基と作用して、２種類のタンパク質帯（約50 kDa）を選択的に化学標識化す
るものと考えられる。ミクロソームタンパク質の標識化（二塩基酸生成とω-LA
Hの不活性化との間に良好な相関関係が得られている）は、培養時間及び(1-¹⁴C)
11-ドデシン酸濃度の関数として進行した。これらの結果に基づき、オレイン酸のオメガヒドロキシル化反応を不活化することを標的として、２種類の潜在的阻
害剤を合成した。V.sativaから採取した末端アセチレン基を有するミクロソーム
、即ち(Z)9-オクタデセン-17-イン酸（17-ODNYA）、及びこれに対応する(Z)9,10
-エポキシオクタデカン-17-イン酸（17-EODNYA）を培養することにより、オレイ
ン酸オメガヒドロキシル化の疑似一次損失反応が起こった（見掛けＫ値がそれぞ
れ60 μM及び50 μM）。酵素活性半減期の計算値は、17-ODNYA及び17-EODNYAの飽和濃度に対して、それぞれ６分及び８分であった。これらの自殺基質が、オレ
イン酸、そのエポキシ化誘導体及びジオール誘導体のオメガヒドロキシル化反応
並びにリノール酸のオメガヒドロキシル化反応を、同程度に阻害する事実は興味
深い。

【００３８】植物シトクロームP450タンパク質を精製してその配列を決定するために、P450
アポタンパク質を標識した機構的阻害剤と植物シトクロームP450タンパク質を選
択的に共有結合させる方法は、精製段階において標識タンパク質を追跡する有効
な手段となる。

【００３９】末端オレフィンである11-ドデセン酸は、コムギから採取したP450（主に内部炭素（ω-1）の酸化反応に対して触媒効果を有する）を不活化する働きがある。
Ortiz de Montellano及びその共同研究者らが提案したように、末端オレフィンによるP450の不活化は、二重結合の内部炭素（ω-1）に対する酸化的攻撃を経由
して、ヘム単位を、自由にアルキル化できる遊離末端メチレン残基に変化させる
。これと逆に、植物ω-LAH（独占的に外部位置を攻撃する）は、著しい活性損失
を起こすことなく、11-12エポキシ化物の生成反応に対して触媒として有効に機能した。また、ラウリン酸のアセチレン誘導体も、コムギから採取した(ω-1)-L
AHに対して強力な不活化剤として作用する。暗黄化したコムギの苗から採取した
ミクロソームを10-ドデシン酸（10-DDYA）とともに培養したところ、ラウリン酸
のヒドロキシル化に対して著しい阻害効果が認められた。当該阻害効果は時間及
び阻害剤の濃度に依存して変化した。これは機構的阻害剤に特徴的な現象である
。(ω-1)-LAHの阻害反応に関する疑似一次反応の動力学的研究を行い、半減期及
び見掛け阻害定数を求めた。その結果、半減期は３分、見掛け阻害定数Ｋは14 μMであった。末端アセチレン基を有するミクロソーム、即ち11-ドデシン酸（11
-DDYA）をインキュベートすることにより、上記と同様の結果が得られた。

【００４０】さらに、（ω-1）の位置でアセチレン的な機能を示す基質類似体を使用して、
コムギから採取したオレイン酸ヒドロキシラーゼ (ω-1)-OAH（主にω-1の位置を酸化する）を不可逆的に阻害した。ミクロソームをシス-9- オクタデセン-16-
イン酸（16-ODNYA）とともにインキュベートしたところ、オレイン酸のヒドロキ
シル化反応は阻害されたが、ラウリン酸のヒドロキシル化反応は阻害されなかっ
た。これらの結果から、オレイン酸及びラウリン酸の酸化反応には、少なくとも
２種類の異なるP450酵素が関与している可能性が強い。

【００４１】従って、内部アセチレンがP450に対して高度の破壊効果を与え、これにより分
子鎖内酸化に対して触媒作用を示すものと考えられる。不活化の機構に関しては
、まだ充分には解明されていない。しかし、不安定なエポキシ化アセチレンの化
学構造が再配列化を起こすことは、すでに末端アセチレン基からケテンが生成す
る反応機構において推定されており、この反応が関与している可能性は否定でき
ない。

【００４２】哺乳動物の脂肪酸ヒドロオキシラーゼに関する研究結果と比較して、植物の脂
肪酸ヒドロオキシラーゼの触媒機構及び基質特異性（表１）の解明はまだ充分に
行われていない。今日までに単離され、クローン化に使用されたP450は、脂肪酸
過酸化物の脱水反応に対して触媒効果を有する２種類のP450だけである。酸化ア
レンシンターゼは、ジャスモン酸の前駆体を生成させることにより、種々の生理段階を制御することにより、植物の開発における酵素として、重要な役割を果
たすことができる。この点に関して、グアユールゴムの粒子（これと同様の反応
に対して明らかに触媒効果を有している）から採取したRPPの生理学的な役割を理解することにも興味が持たれる。他方、植物表皮の生合成反応において、長鎖
脂肪酸の（オメガ及び分子鎖内）ヒドロキシラーゼが、末端及び内部ヒドロキシ
基を生成させることにより、重要な役割を演じている証拠もある。これらのヒド
ロキシル基は、角皮素モノマーの重合反応にとって必須であると思われる。

【００４３】本発明の植物脂肪酸ヒドロキシラーゼに対しては、少なくとも３種類の異なる
役割が予想できる。角皮素及びコルク質の合成、遊離脂肪酸の急速な異化作用（
即ち解毒作用）、及び信号発信分子の合成である。

【００４４】前記の通り、角皮素及びコルク質の合成反応を変化させることにより、植物脂
肪酸ヒドロキシラーゼの活性を制御できることが期待される。従って、角皮素及
びコルク質の製造条件を修飾することにより、希望する特性（例えば旱魃又は薬
品の浸透に対する抵抗性）を有する植物が得られるものと考えられる。例えば、
我々は無機能変異体（null mutant）又は低次形態の植物が、野性型の植物と比較して成長が遅いことを思い浮かべることができる。

【００４５】切傷又は他の種類のストレスを与えると、ホスホリパーゼが活性化され、脂肪
酸が急激に遊離され、酸化破裂が進行する（Lowら, 1996）。誘発剤が植物中のホスホリパーゼを活性化することを示す報告もいくつか存在する（Chandraら, 1
996）。ホスホリパーゼが活性化されると、遊離脂肪酸が放出される。動物におけるP450脂肪酸ヒドロキシラーゼの役割から類推して、これらの遊離脂肪酸を急
速に異化する作用が一つの役割である可能性がある。最近のデータ（Tijetら, 1
998）は、クロフィブラートに曝露した植物組織の中で、２−３分後にCYP94A1が
強く誘発され、２−３時間後に400回までこの作用が持続することを示している。クロフィブラートは、動物及び植物の中で、ペルオキシソームの増殖を誘発す
る薬剤である（Palmaら, 1991）。ペルオキシソームの増殖は、酸化破裂と強い関連性がある。

【００４６】 Schweizerら（1996ab）の研究結果は、オメガヒドロキシ C16:0及びC18:1 脂肪酸が、抵抗誘発剤であることを示している。アラキドネートカスケードとの類似性から、他のオメガヒドロキシル化脂肪酸が、ストレス信号の発信に関与し
ている可能性がある。さらに、オメガヒドロキシル化及びオメガ-1ヒドロキシル
化が進行すると、受粉のために昆虫の吸引力を高めるフェロモンのような分子の
生産量が増加する。このことは、多くの昆虫フェロモンがオメガ及び(オメガ-1)
-ヒドロキシ脂肪酸又はアルカン類である（又はこれらから誘導される）という事実に基づいている（Engelsら[1997]）を参照のこと）。

【００４７】さらに、不飽和脂肪酸のエポキシ化に関与するP450は、ヒドロキシル化脂肪酸
及びエポキシ化脂肪酸（病原体の成長を阻害することが示されている）を生産（
即ち、信号発信分子を合成）することにより、病気に対する抵抗性にも関与して
いる可能性がある。真菌感染における酸素化脂肪酸の役割を考慮すれば、角皮素
（即ちジヒドロキシ脂肪酸及び9,10,18-トリヒドロキシステアリン酸）から採取
したある種のモノマーが、いくつかの病原性真菌クチナーゼの強力な誘発剤であ
ることを示している報告もあるので、当該報告がこの事実と矛盾することは明ら
かである。Schweizerら（1996ab）の研究結果は、角皮素のモノマー、特にオメガヒドロキシ形が、オオムギのErysiphe graminisに対する抵抗性を誘発することを示している。この場合、9,10,18-トリヒドロキシステアリン酸に対して、最
高の効果が発揮される。Pinotら（1993）は、（P450ではなく）9,10-エポキシナ
ーゼを作用させ、次に18の位置をP450（CYP94A1、CYP94A4、CYP94A5及びCYP86A1
がこの反応に対して触媒効果を有する）でヒドロキシル化し、さらにエポキシ化
物ヒドロラーゼによりエポキシ環を開くことにより、この化合物が形成されるこ
とを示した。Bleeら（1993）は、エポキシジェナーゼ及びエポキシダーゼの活性
が極端に強く、そのために、P450が触媒作用を有するオメガヒドロキシル化が律
速因子となることを示した。この遺伝子は恐らくは病原体反応性プロモーターの
制御下にあるが、この遺伝子が過剰発現することにより、抵抗性が高まる可能性
がある。

【００４８】植物脂肪酸ヒドロキシラーゼの活性を変化させることにより製造した油は、野
性型植物が製造した油と異なる特性を示す可能性がある。このことは、潤滑剤、
抗スリップ剤、可塑剤、コーティング剤、洗剤、及び界面活性剤の製造に有用で
あると考えられる。例えば、炭素数10−14の（カプリン酸、ラウリン酸、又はミ
リスチン酸から誘導された）ヒドロキシル化脂肪酸は、新しい洗剤及び可塑剤の
基礎を提供するものと考えられる。ヒドロキシル化脂肪酸から製造できるプラス
チックは、ポリウレタン及びポリエステルである（Weberら, 1994）。角皮素それ自体が、ほぼ完全にオキシ脂肪酸から造られるバイオプラスチックであること
は、注目すべき事実である。

【００４９】分子鎖延長反応にはオメガヒドロキシル化が必要であり、網目形成反応には分
子鎖内のヒドロキシル化及びエポキシ化（或いはそのいずれか）が必要である。
ラウロイル-ACPに固有のUmbellularia californiaから採取した、アリール-ACP チオエステラーゼで形質変換することにより、C12脂肪酸を製造するように植物を設計することができる。この遺伝子で形質変換したArabidopsis thalianaは、
最高25%までのラウレートを造り出した。これらの植物をさらにCYP94A1で形質変
換すれば、大量のオメガヒドロキシラウリン酸を造り出すものと考えられる。同
様に、C14の脂肪酸を造るように設計され、次にCYP94A2で形質変換された植物は
、大量のオメガヒドロキシミリスチン酸を造り出すものと考えられる。今日に至
るまで、ヒドロキシル化脂肪酸の性質及びその工業的使用方法は、まだ充分には
明らかにされていない。このような脂肪酸の商業的用途が無いのは、これらのヒ
ドロキシル化脂肪酸が通常の条件下では植物中に蓄積しないためである。本発明
の植物脂肪酸ヒドロキシラーゼを使用することにより、このような化合物の大量
生産が可能となる。オメガヒドロキシル化脂肪酸の化学合成は困難であり、高価
につく。このことは、オメガヒドロキシル化脂肪酸を植物中で生産することによ
り、経済的に大きなメリットが得られることを意味している。

【００５０】比較的に高等な植物に関しては、そのω-脂肪酸ヒドロキシラーゼ及び分子鎖内脂肪酸ヒドロキシラーゼのキャラクタリゼーションが完了しているものもいく
つかある。Helianthus tuberosusの角皮素から採取したミクロソームにおいては
、ラウリン酸のω-2、ω-3及びω-4ヒドロキシル化に対して、互いに密接に関連
した、アミノピリン及びMnCl₂で誘発可能なシトクロームP450の一種類又は二種類以上が触媒として使用される。cDNAを単離し、これら酵素の配列を決定するた
めに、Mn⁺⁺誘発組織から精製した、P450富化分画に対する抗体を使用した。アミ
ノピリン処理した角皮素から採取したcDNAの発現ライブラリをスクリーニングし
、アミノピリンにより誘発された写しに対応するcDNA（CYP81B1）を同定することができた。CYP81B1を酵母の中で発現させ、その機能を組織的に探索した結果、この酵素は特に中位鎖飽和脂肪酸、即ちカプリン酸（C10:0）、ラウリン酸（C
12:0）及びミリスチン酸（C14:0）のヒドロキシル化反応に対して触媒効果を有することが分かった。遺伝子を導入した酵母及び植物ミクロソームでも、同じ代
謝産物、即ちω-1−ω-5モノヒドロキシル化生成物が得られた。これら３種類の
脂肪酸は、同じように高い効率で代謝させることができ、主な攻撃位置は分子鎖
の長さにより異なっていた。ラウリン酸を基質として使用した場合、ターンオー
バーは30.7±1.4/分、見掛けのK_m,appは788±400 nMであった。長鎖脂肪酸、芳香族分子又は除草剤では、代謝反応は検出されなかった。この新しい脂肪酸ヒド
ロキシラーゼは、高等植物に典型的なものであり、すでに他の生きた微生物から
単離されている脂肪酸ヒドロキシラーゼとは異なっていた。

【表１】

【００５１】 1974年以来、植物のP450が、膨大な数の物理的、生理学的及び化学的要因によ
り誘発されることを示す報告が、数多く行われてきた。しかし、多くの場合にお
いて、どんな誘発機構により、どんな異性形が誘発されているかについては分か
っていなかった。下記に、３種類の異なるクローン化P450種、CYP73A1、CYP76B1
及びCYP94A1の制御機能について、その誘発機構及び機能的特徴を示す。

【００５２】 CYP73A1は、桂皮酸4-ヒドキシラーゼであり、最初に一般的なフェニルプロパノイド酵素触媒反応で関係した酸化反応を触媒して、リグニン、フラボノイド、
防御分子、抗UV保護剤を生成する。この酵素を、均質になるまでトライトンX114
相分画法により精製し、純粋なタンパク質に対して育成した固有抗体を使用して
クローン化した（Teutschら, 1993）。そのデータは、桂皮酸4-ヒドロキシラーゼ活性の誘発が、主に遺伝子の活性化に起因していることを示唆している。切傷
処理及びアミノピリン処理を行った後、反応時間及び反応経路に関して実験を行
った。活性誘発変化のタイミング、タンパク質及び写しの状況から、切傷組織及
びアミノピリン処理組織の両方において、C4Hが主にCYP73A1 mRNAの増加により誘発されることが確認された。しかし、写し後の反応機構も、C4H活性の制御機能に寄与しているものと考えられる。

【００５３】 CYP76B1は、アルコキシクマリンO-デアルキラーゼ（Batardら, 1995）であり、この物質の真の生理学的機能は、まだ良く知られていない。このタンパク質を
、CYP73A1に使用したのと同じ方法で精製し、ミクロ配列を決定したペプチド（B
atardら, 1998）から誘導したシトクロームP-450プライマーを使用して、その遺
伝子をクローン化した。塊茎組織をスライスし、これらを水の中で熟成した後、
CYP76B1の写しだけ又はこれと種々の薬品が共存する状態で、その定常化濃度を決定した。その結果、このP450の発現は、機械的なストレスに反応して起こって
いるのではなく、化学処理に強く依存していることが分かった。従って、CYP76B
1は、化学的ストレス及び環境汚染の良いマーカーになり得るものと思われる。

【００５４】これらのデータから、「植物P450誘発機構」が存在する可能性は極めて高いこ
とが分かる。これまでに、60種類を越えるP450の生理学的活性効果がすでに確認
されており、さらに500-600種類の生理学的活性効果のキャラクタリゼーションが、近い将来において完了する見込みである。これら植物P450の生理学的活性効
果の二次的植物代謝経路は、多技に亘っている。このように、植物P450酵素の誘
発は、その経路において、恐らく他の酵素の誘発と同等であろう。このことは、
防御化合物の合成に関与する酵素全てについて特に言えることであり、これら防
御化合物は、機械的な切傷、感染及びストレスの状態により誘発される。化学誘
発剤による誘発状況は、さらに興味をそそるものであり、非常に思索的でもある
。植物を化学薬品で処理する方法は、植物にとって「痛み」を伴う種類のストレ
スであり、これにより、種々の信号発信鎖の一つから信号を引き出すものであろ
う。他方、動物の体内でP450を誘発する化学薬品の中には、同じ基質上で、同時
に植物P450を誘発するものも存在し、これらの植物P450は、部位選択性を有する
ものさえ存在する。動物、植物及びB.megateriumの体内において、脂肪酸分子鎖
内ヒドロキシラーゼは、フェノバルビタールにより選択的に誘発される。これに
対して、動物及び植物の体内においては、クロフィブラートにより、ω-ヒドロキシラーゼが選択的に誘発される。進化の過程において、触媒機能とともに調整
機構が温存されていることがあり得ることを、これらのデータは示唆している。
最後に、（生化学的、系統発生的、及び恐らくは構造的な観点から）変種の中に
は、ジャスモン酸及びサリチル酸の主要合成段階を触媒して、それぞれ酸化アレ
ンシンターゼ（Songら, 1993）又は安息香酸2-ヒドロキシラーゼ（Leonら, 1995
）のようなP450を形成するものも存在することを、ここに強調しておきたい。

【００５５】 Vicia sativaの苗の中で、クロフィブラートは高効率（20倍の効率）で、ラウ
リン酸及びオレイン酸のオメガヒドロキシル化におけるシトクロームP450の触媒
活性を刺激する。DEHP及び2,4-Dは、同じ物質の中において、ラウリン酸オメガヒドロキシラーゼに対して類似の刺激効果を有している。最近、内部ペプチド配
列に基づき、本発明者らは植物脂肪酸オメガヒドロキシラーゼをコード化するcD
NAを単離した。酵母中でこれを発現させた後、これらのオメガヒドキシラーゼ基
質、即ち、種々の鎖長（C10−C18）及び種々の不飽和度（C18:1、C18:2、C18:3 ）を有するCYP94A1オメガヒドロキシル化脂肪酸の特異性について、そのキャラクタリゼーションを行った。クロフィブラート処理Vicia sativaの苗から採取し
たRNAについて、ノーザンブロット分析を行った結果、非常に急速（30分後）且つ大量のCYP94A1転写体の蓄積が起こることが分かった。このことは、クロフィブラートレセプターが信号形質導入に関与していることを示唆している。クロフィブラートによるCYP94A1の調整機構、及びこの調整機構にPPARが関与している可能性について解明するに、CYP94A1のプロモーター配列を単離した。現在、主要調整剤要素の探索を行っているところである。さらに、Vicia sativa中にお
いて、アシルCoAオキシダーゼの濃度におけるクロフィブラートによるペルオキシソームの増殖研究を、すでに開始している。

【００５６】さらに、本発明者らは、最近、暗黄化したVicia sativaの苗を植物ホルモンで
あるジャスモン酸メチル（MetJA）で処理することにより、シトクロームP450含有量が増加することに気づいた。このことは、この植物防御分子が、CYP94A1経路を経由して作用し得ることを示唆している（Pinotら, 1998）。苗をMetJAの1
mM溶液で48時間処理することにより、ラウリン酸のω-ヒドロキシル化が、比較対照サンプルと比較して14倍に刺激された（153 pmol/分/mgタンパク質：11 pmo
l/分/mgタンパク質）。この誘発反応は、投与量に依存していた。活性が増大（2
.7倍）したことは、すでに処理３時間後に検出が可能であった。活性は時間の関
数として増加し、24時間後には定常水準に達した。ノーザンブロット法により分
析を行った結果、脂肪酸ω-ヒドロキシラーゼCYP94A1をコード化した写しが、Me
tJAに曝露した１時間後に蓄積し始め、３−６時間後には最高濃度に達することが明らかになった。これと同じ条件下において、9,10-エポキシステアリン酸の酵素加水分解を行ったところ、水溶性エポキシ化物のミクロソームヒドロキシラーゼ活性は、MetJA処理により影響を受けなかった。従って、植物防御分子の一般的な反応機構においては、ジャスモン酸メチルによる脂肪酸のミクロソーム
ω-ヒドロキシル化の調整機能が主な役割を果しているものと考えられる。

【００５７】過去数年間に亘り、本発明者らは、Vicia sativaの中に存在する少なくとも３
種類の脂肪酸ω-ヒドロキシラーゼのクローン化を行い、そのキャラクタリゼーションを行ってきた。これらのP450酵素は、種々の鎖長及び種々の不飽和度を有
する脂肪酸の末端炭素に、アルコール基を導入する能力を有している。これらの
新規酵素は、CYP94一族における最初のメンバーである。哺乳動物のω-ヒドロキ
シル化酵素に関して広範囲の研究が行われ（Simpson, 1997）、これらの酵素はC
YP4Aの一族に分類されている。CYP4Aは、アラキドン酸の代謝に関与し、生理学的に重要な代謝産物を生成することが知られている。これらの物質は、脂肪酸の
異化作用にも関与している（Gibson, 1989）。植物中においては、脂肪酸ω-ヒドロキシラーゼは表皮の生合成に関与する（Kolattukudy, 1981）。さらに、最近、ω-ヒドロキシ脂肪酸は、植物の防御機構において、重要な役割を演じることが報告されている（Schweizer, 1996）。誘発剤処理したサヤインゲンのコルク形成反応にも関与している可能性がある（Bolwell, 1997）。

【００５８】脂肪酸ω-ヒドロキシラーゼの生理学的な役割を特徴付けるために、本発明者らは、遺伝子導入タバコの系統を使用する方法を開発した。今日に至るまでに、
CYP94一族に属する３種類の新しいクローン（CYP94A4、CYP94A5及びCYP94A6）が
タバコのcDNAライブラリから単離されている。これらP450の活性を生体内で調整
するために、２種類のコード化配列を、T-DNAベクター中へセンス及びアンチセンスの方向に組み入れ、タバコの葉の円盤状組織を形質変換した。これらの遺伝
子導入系列への形態学的表現型の発現が期待されるが、表皮の質及び量、並びに
その病原体に対する抵抗性も同時に影響を受ける可能性がある。

【００５９】脂質低下薬剤であるクロフィブラート及び除草剤である2,4-Dなどのアリールフェノキシ化合物は、脂肪酸ヒドロキシラーゼ活性及びペルオキシソームの誘発
物質として知られる化学品である。植物においては、長鎖脂肪酸オメガヒドロキ
シラーゼは、植物を外部環境から保護する表皮の合成反応において、非常に重要
な役割を演じるものと信じられている。植物から採取した最初のクローン化P450
依存脂肪酸オメガヒドロキシラーゼであるCYP94A1は、P450アポタンパク質を放射性同位元素で標識化した反応機構的阻害剤を使用することにより単離された。
S.cerevisiae中において、この新規P450を機能的に発現させることにより、CYP9
4A1で飽和（C10−C16）及び不飽和（C18:1、C18:2及びC18:3）脂肪酸のメチル末
端基が主に酸化されることが分かった。この植物性酵素は、動物性オメガヒドロ
キシラーゼと同様に、クロフィブラート処理により強く誘発された。CYP94A1の急速な蓄積により、Vicia sativaの苗をクロフィブラートに曝露した後20分未満
の間に、その写しが検出された。CYP94A1が急速に誘発されることにより、修理及び防御に必要な角皮素モノマーに脂肪酸（FA）が有効に形質変換された。植物
防御機構の天然誘発剤としてヒドロキシル化脂肪酸に考えられる役割が、天然に
存在する植物が化学的ストレス又は病原体ストレスに対する防御化合物に関して
新らしい調整経路を研究する上において、これまで予期しなかった展望を開くこ
とになった。

【００６０】本明細書に引用した本、記事及び特許に関しては、参考のために、本明細書中
に全てこれらを完全な形で詳述した。

【００６１】下記の例は、本発明を説明するために記述するものであり、これらの例により
、本発明の実施が何らかの制限又は制約を受けるものではあり得ない。

【００６２】（例Ｉ−クローンＡ [CYP94A1]）飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸（FA）オメガヒドロキシラーゼ即ちミクロソーム
シトクロームP450依存ヒドロキシラーゼは、カプリン酸 (C10:0)、ラウリン酸
(C12:0)、ミリスチン酸 (C14:0)、パルミチン酸 (C16:0)、オレイン酸 (C18:1) 、リノール酸（C18:2及びその鏡像体 [9E,12Z];[9Z,12E]）並びにリノレン酸 (C
18:3)をこれらに対応するオメガヒドロキシ酸にそれぞれ形質変換する反応を触媒し、クローンＡは、当該オメガヒドロキシラーゼをコード化する働きを有して
いる。さらに、２種類の硫黄含有ラウリン酸類似体、即ち10-メチルスルフィニルデカン酸（10S-LAU）及び（8-プロピルスルフィニルオクタン酸（8S-LAU）は、活発にこれらに対応する10- 及び8-スルフォキシドにそれぞれ変換される（
図３）。

【００６３】前にもV.sativaから採取したミクロソームをインキュベートする場合について
示したように、炭素位置８、９及び10に二重結合又は三重結合を有する一連の不
飽和ラウリン酸類似体は、オメガヒドロキシル化される可能性がある。さらに、
末端にエチレン基を有するラウリン酸類似体である11-ドデセン酸も、CYP94A1（
クローンＡ）により11-エポキシラウリン酸に変換される可能性がある（Weissba
rtら, 1992; Pinotら, 1992, 1993; Helvigら, 1997）。

【００６４】（CYP94A1[クローンＡ]の単離） P450アポタンパク質を放射能標識（1-¹⁴C）した11-ドデシン酸（11-DDYA）（S
alaunら, 1988; Helvigら, 1997）でアルキル化することにより、クロフィブラート処理V.sativaミクロソームから採取したラウリン酸オメガヒドロキシラーゼ
固有のペプチド配列（Salaunら, 1986）を、新しく開発された方法により決定し
た。先ず連続SDS-PAGE分析を行い、次に「ゲル内」V8タンパク質分解にかけるこ
とにより、化学標識タンパク質（約53 kDa）を単離した。この方法で得られたペ
プチドをナイロン膜（IMMOBILON（登録商標））に移し、エドマン分解法により配列決定を行った。４種類のペプチドに関して、それらの配列を決定した。その
中の２種類だけが、P450への類似性を示した。後になって、これら２種類のペプ
チドは、クローンＡの推定アミノ酸配列（SEQ ID NO:４）の中に見いだされた。

【００６５】第一のペプチドは、全てのミクロソームP450の中に見いだされる膜アンカーに
典型的な、18−20個のアミノ酸疎水性ドメインを含んでいた。当該クローンを単
離した後、このペプチドが、当該酵素のN-末端アミノ酸配列、即ち、 MFQFLLEVLLPYLLPLLLYILPF ペプチドミクロ配列 MFQFHLEVLLPYLLPLLLLILPT クローンＡの配列（SEQ ID NO:４の残基１−23）から
推定されるペプチドに対応することが確認された。

【００６６】第二のペプチドは、配列 LMNLYPPVPMMNAKEVVVXVLLXQ を有していた。コンピュータで、既知のシトクロームP450酵素全てに対して当該ペプチドを検索した結果、ドメインの始めの部分（
CYP4一族は哺乳動物の脂肪酸オメガヒドロキシラーゼ、即ちペプチド p3、ネズミCYP4A1、ネズミCYP4B1及びネズミCYP4A3を含有し、この一族に属するいくつか
のP450におけるC-末端基から約130個の残基）に類似性が存在することが分かった。クローン化し、配列決定を行った後、最初の10個のアミノ酸の中で、太字で
示した８個だけが、CYP94A1（SEQ ID NO:４、残基370−394;SMRLYPPVPMDSKEAVND
DVLPDGW）の対応ドメインの中で見いだされた。このことは、ペプチドが他のタンパク質で汚染されていることを暗示している。428個のシトクロームP450の配列を調べた結果、２個のメチオンが連続して存在することは決して無いことが分
かった。下記のPCRプライマー配列（SEQ ID NO: ４及び３にそれぞれ含まれるペ
プチド及び核酸の配列）を推定した。

【化１】

【００６７】 V.sativaの苗をRT-PCRによりクロフィブラート処理し、これから採取した全て
のRNA上に661 bpのプローブを造るために、このプライマーをオリゴ（dT）プライマーとともに使用した。この場合の条件は下記の通りであった。即ち、93℃で
５分間変成し、93℃−１分間の変成サイクルを30回繰返し、48℃で２分間ハイブ
リッド化し、72℃で３分間延伸し、72℃で10分間延伸することにより反応を停止
させた。

【００６８】 48時間クロフィブラート処理したV.sativaの苗からポリ(A)RNAを採取し、メー
カー（Stratagene社）の指示に従ってこれからλZAP cDNAライブラリを調製し、
650 bpのプローブを使用して当該ライブラリの厳密なスクリーニングを行った。
（α-³²dCTP）を使用して当該プローブをランダムに標識し、5 x SSC、0.5% SDC
、5 x デンハルト溶液、100 μg/mlのサケ精液DNA、2-mM EDTA、及びpH 6.0の50
-mM リン酸ナトリウム中において、65℃で24時間かけてハイブリッド化した。ハ
イブリッド化の後、当該汚れを2 x SSC、0.1% SDSにより常温で15分間の洗浄を２回繰返し、さらに0.2 x SSC、0.1% SDSにより、55℃で30分間の洗浄を２回繰返した。一つのクローン（1862 bp）VAGHI11を単離し、その配列を決定した。当
該クローンは、新しいシトクロームP450、CYP94A1をコード化することが見いだされた（図１）。

【００６９】（酵母における異種発現） Saccharomyces cerevisiaeゲノムの完全配列決定を行った結果、この酵母には
、P450が４種類しか無く、そのいずれもが、脂肪酸のヒドロキシル化反応に対し
て触媒効果の無いものばかりであることが分かった。さらに、この酵母は、内因
性P450の発現が最少限である（即ち、P450が分光分析により検出されない）よう
な状態で成長させることができる。遺伝子設計した酵母の中でCYP94A1（クローンＡ）の機能を発現させることにより、その触媒活性を評価した。Urbanら（199
0）が開発したシステムを使用して、異種起源P450酵素をSaccharomyces cerevis
iae中で発現させた。これら全ての方法（例えば、P450 cDNA、pYeDP60シャトル
ベクターの準クローン化、酵母の形質変換、及びクローン化P450遺伝子の発現を
可能にする成長条件）に関しては、Pomponら（1996）が述べている。クローンＡ
のコード化配列（SEQ ID NO:３）は、下記のように、BamH1及びEcoR1制限サイト
を使用してPCRを発現ベクターpYeDP60の中へクローン化したものである。センスプライマー

【化２】アンチセンスプライマー

【化３】

【００７０】メーカーの指示に従って、Stratagene Pfuポリメラーゼを使用し、ポリメラー
ゼにより発生するエラーを避けるために、増幅配列の検証を行った。Schiestl及
びGietz（1989）の方法により、発現ベクターで酵母菌株WAT1（Urbanら, 1990）
を形質変換した。

【００７１】（CYP94A1[クローンＡ]のキャラクタリゼーション）ミクロソームの調製：Pomponら（1996）の方法に従い、pYeDP60中でCYP94A1（
クローンＡ）で形質変換した酵母菌株WAT11を成長させ、CPY94A1を誘発させた。
培養は、単離コロニーからカリチャーを単離して開始させた。成長後に、細胞を
4℃で7500g×10分間遠心分離した。ペレットをTEK（2ml TEK/g細胞）で洗浄し、
４℃で7500g×10分間遠心分離した。当該ペレットを1 mlのTES中に再度懸濁させ
、液体表面の高さまでガラスビーズを添加した。低温室の中で、直径0.5 mmのガ
ラスビーズを入れたプラスチック製の円錐形30-mlファルコン管を使用し、手で５分間良く振って細胞を破壊した。90%以上の細胞が溶解した。このホモジェネートと、ガラスビーズを5 mlのTESで２回洗浄した洗浄液とを一緒にして、4℃で
7500g×10分間遠心分離した。さらに、得られた上澄液を4℃で、100,000g×45分
間遠心分離した。目の粗い陶器製のホモジナイザーを使用し、得られたペレット
を2 mlのTEG中に再懸濁させ、下記のミクロソーム設計分画を得た。ミクロソームは、-20℃で数週間保存しても、活性を失うことは無かった。pYeDP60表現ベク
ターだけで形質変換したWAT11細胞を、これと同じ操作にかけて比較対照とした。 TEK: トリス-HCl 50 mM, pH 7.5; EDTA 1 mM; KCl 100 mM TES: トリス-HCl 50 mM, pH 7.5; EDTA 1 mM; ソルビトール 600 mM TEG: トリス-HCl 50 mM, pH 7.5; EDTA 1 mM; グリセリン 20%

【００７２】 P450量の測定: ミクロソームをTEGで５倍に希釈し、Omura及びSato（1964）の
方法で91/cm/mMの吸光係数を使用してP450量を測定した（図２）。

【００７３】活性の測定: 前述の方法（Weissbartら, 1992; Pinotら, 1992, 1993; Bouche
rら, 1996）に従い、培養中における放射能標識基質含有形質変換酵母ミクロソームの代謝産物生成速度を測定し、これから酵素活性を求めた。最終体積0.2 ml
の標準液の中には、ミクロソームタンパク質0.19−0.43 mg、リン酸塩緩衝液（p
H: 7.4）20 mM、及び放射能標識基質100 μMが含まれていた。オメガヒドロキシ
ラーゼの活性は、0.6-mM NADPH＋再生システム及び375-μM β-メルカプトメタノールの存在下でこれを測定した。放射能標識基質を含むエタノール溶液をアル
ゴン気流中で蒸発させ、その後で、これに培養に必要な他の分画を添加した。27
℃でNADPHを添加して反応を開始させ、10分間培養した後で、0.2-mlのアセトニトリル−酢酸（99.8/0.2 v/v）を添加して反応を停止させた。2 x 600-μlのジエチルエーテルで抽出を行った後、有機相をシリカの薄層プレート上に滴加し、
ジエチルエーテル−軽油（沸点: 40−60℃）−ギ酸混合物（C16基質に対しては7
0/30/1 v/v/v、C18基質に対しては50/50/1 v/v/v）の中で展開させた。プレート
をベルトホールド薄層スキャナーで走査した。正確な速度測定を行うために、放
射性スポットを計数ビンの中へ掻き落とし、液体シンチレーション法により生成
物を定量した。この実験においては、全反応生成物の同定はGC/MS分光分析法により行った。種々の脂肪酸基質を含むCYP94A1（クローンＡ）の活性を、表２に示す。

【表２】

【００７４】図４（カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸及びパルミチン酸）、図５（オ
レイン酸、リノール酸及びリノレン酸）、並びに図６（C18:2-9E,12Z酸; C18:2-
9Z,12E酸; 8S-LAU酸及び10S-LAU酸）に、TLCラジオクロマトグラムを示した。各
基質に対して、クロマトグラムを２つずつ（NADPHが存在する〔Ａ：ヒドロキシラーゼが活性化されている〕場合と存在しない〔ヒドロキシラーゼが活性化され
ていない〕場合を）示した。

【００７５】（例II−クローンＢ [CYP94A2]）クローンＢはω-MAH（オメガミリスチン酸ヒドロキシラーゼ）、即ちミクロソ
ームシトクロームP-450依存ヒドロキシラーゼをコード化する。当該ヒドロキシ
ラーゼは、ミリスチン酸（C14:0）を形質変換して14-ヒドロキシテトラデカン酸
を生成する（即ち、末端メチル基がヒドロキシル化される）反応を触媒する。ラ
ウリン酸（C12:0）及びパルミチン酸（C16:0）を低レベルで形質変換して、対応
するオメガヒドロキシ脂肪酸を生成する反応も観察された。

【００７６】（VAGH811の単離）クロフィブラート処理したVicia sativaの苗から調製したλZAP cDNAライブラ
リを、下記のようにしてクローンＡでスクリーニングすることにより、当該クロ
ーンが得られた。V.sativaの苗を48時間クロフィブラートで処理し、これからポ
リ(A)RNAを採取し、このポリ(A)RNAから、メーカー（Stratagene社）の指示に従
ってλZP cDNAライブラリを調製し、当該ライブラリを低厳密度でスクリーニングした。クローンＡを単離する間にRT-PCR法により661 bp DNAフラグメントを造
り、これを使用してスクリーニングを行った。また、スクリーニングは、図１に
おける1201の位置から開始した。当該フラグメントは、ランダムプライミングに
より³²Pで放射能標識した。ハイブリッド化は、55℃で一晩、5 x SSC、0.5% SDS
、5 x デンハルト溶液、100 μg/mlのサケの精液 DNA、2 mMのEDTA、及び100 mM
のリン酸ナトリウム中、pH 6.0で行った。ハイブリッド化を行った後、汚れを2
x SSC、0.1% SDSにより室温で15分間ずつ２回洗浄し、さらに、0.2 x SSC、0.1%
SDSにより、45℃で30分ずつ２回洗浄した。単離したクローンの一つ（1437 bp ）であるVAGH811の配列を決定し、このクローンが新しいシトクロームP450をコード化することを見いだした（図７）。このクローンの5'端は不完全であった。
しかし、この不完全クローンの配列を使用して、クロフィブラートで96時間処理
したVicia sativaの苗からVAG811の配列をコード化し、ポリ(A)RNAを含む5'-RAC
Eのプライマーを合成した。このクローンを、以後クローンＢと呼称する（図７）。

【００７７】（酵母中における異種起源発現） CYP94A2（クローンＢ）の触媒活性を、先にクローンＡに関して述べた方法により、遺伝子設計した酵母中で機能を発現させて評価した。CYP94A2（クローンＢ、SEQ ID NO:５）のコード化配列を、SmaI及びSacI制限サイトを使用して、下
記の通り発現ベクター pYeDP60中へPCRクローン化した（SEQ ID NO:６に含まれるペプチド配列）。センスプライマー：

【化４】アンチセンスプライマー：

【化５】

【００７８】メーカーの指示に従って、Boehringer HiFi（登録商標）ポリメラーゼを使用した。ポリメラーゼにより発生するエラーを避けるために、増幅配列についてこ
れを検証した。酵母菌株WAT11（Urbanら, 1990）を、Schiestl及びGietz（1989 ）の方法に従って形質変換した。

【００７９】（CYP94A2[クローンＢ]のキャラクタリゼーション）ミクロソームの調製：pYeDP60発現ベクターにCYP94A2（クローンＢ）を組み込
み、当該pYeDP60発現ベクターで酵母菌株WAT11を形質変換し、クローンＡに関し
て述べた方法に従い、当該酵母菌株WAT11を育成してミクロソームを誘発させた。

【００８０】 P450の評価：ミクロソームをTEGで５倍に希釈し、Omura及びSato（1964）の方
法により、91/cm/mMの吸光係数を使用してP450量を測定した（図８）。

【００８１】活性の測定：酵素活性を、クローンＢに関して前述した方法により測定した。
これらの実験で同定した全反応生成物は植物ミクロソームを使用して同定した。
同定には、真正化合物を比較対照とする再クロマトグラフ法、及びGC/MS法を使用した。表３に、種々の脂肪酸を基質として使用したω-MAHの活性を示す。

【表３】

【００８２】実際のTLCラジオクロマトグラムを、図９（カプリン酸）、図10（ラウリン酸）、図11（ミリスチン酸）、図12（パルミチン酸）、図13（ステアリン酸）、及
び図14（オレイン酸）に示す。各基質に対して、２つのクロマトグラムを示した
。一つはNADPHを含む（Ａ：ヒドロキシラーゼは活性を有する）場合、他の一つはNADPHを含まない（Ｂ：ヒドロキシラーゼは活性を有しない）場合である。

【００８３】（動力学的変数及び比活性） CYP94A2（クローンＢ）について、別々の実験で、ミリスチン酸に対する見掛けのKm値及びVmax値を測定した。これらの値は、それぞれ3.8 μM及び80-モル 1
4-ヒドロキシミリスチン酸/分/モル-ω-MAHであった。

【００８４】（例III−クローンＣ[CYP94A3]） CYP94A3はシトクロームP450依存ヒドロキシラーゼをコード化し、シトクロームP450依存ヒドロキシラーゼは、カプリン酸（C10:0）、ラウリン酸（C12:0）、
及びミリスチン酸（C14:0）のメチル末端の酸化反応を触媒する。さらに、これより程度は低いが、パルミチン酸（C16:0）、オレイン酸（C18:1）、及びリノー
ル酸（C18:2）のオメガヒドロキシル化反応も触媒する。

【００８５】（CYP94A3[クローンＣ]の単離）クロフィブラートで処理したVicia sativaの苗からλZap cDNAライブラリを調
製し、このライブラリをCYP94A2（クローンＢ）の3'末端cDNAフラグメント（300
bp）で高厳密スクリーニングすることにより、（ヘム結合ドメインをポリＡ末尾にコード化する配列から）クローンＣを得た。5 x SSC、0.5% SDS、5 x デンハルト溶液、100 μg/mlのサケ精液DNA、2 mMのEDTA、及び50 mMのリン酸ナトリ
ウム、pH 6.0、65℃、24時間の条件でハイブリッド化を行った。ハイブリッド化
が終了した後、室温、15分の条件で、2 x SSC、0.1% SDSで２回洗浄して汚れを落とした。さらに55℃、30分の条件で0.2 x SSC、0.1% SDSで２回洗浄した。フラグメントは、ランダムプライミング法により³²Pで放射能標識した。このクロ
ーン（1600 bp）の配列を決定し、新しいシトクロームP450がコード化されていることを見いだした（図15）。その配列をCYP94A2と比較することにより、CYP94
A3には９つのヌクレオチドが欠落していることが分かった。CYP94A2の最初の９つのヌクレオチドを、不完全なCYP94A3（クローンＣ）の配列の前に追加して異種起源発現させた。その後完全な長さを有するcDNAを単離したが、このcDNAは、
これらの活性評価実験で使用したcDNAと同一であることが分かった。

【００８６】（酵母中における異種起源発現） CYP94A3（クローンＣ）の触媒活性を、前述の方法により、遺伝子設計酵母の中で先行クローンに機能発現させて評価した。CYP94A3（クローンＣ; SEQ ID NO
:７）のコード化配列は、SmaI及びSacI制限サイト（SEQ ID NO:８に含まれるペプチド配列）を使用して、下記のように発現ベクターpYeDP60の中へPCRでクロー
ン化した。センスプライマー：

【化６】アンチセンスプライマー：

【化７】

【００８７】メーカーの指示に従い、Boehringer HiFi（登録商標）ポリメラーゼを使用して当該配列を増幅し、得られた増幅配列にポリメラーゼに起因するエラーが存在
しないかどうかを検証した。酵母菌株WAT11（Urbanら, 1990）を、Schiestl及び
Gietz（1989）の方法に従って形質変換した。

【００８８】（CYP94A3[クローンＣ]のキャラクタリゼーション）ミクロソームの調製：CYP94A3（クローンＣ）を組み込んだpYeDP60で酵母菌株
WAT11を形質変換し、前述した方法で当該酵母菌株を育成し、その先行クローンに対してクローンＣを誘発させた。このミクロソームは、-20℃で５−６週間保存しても、その活性は失われない。pYeDP60発現ベクターだけで形質変換したWAT
11細胞に同じ操作を施し、これを比較対照サンプルとした。

【００８９】 P450の評価：ミクロソームをTEGで５倍に希釈し、Omura及びSato（1964）の方
法で、91/cm/mMにおける吸光係数を使用してP450量を測定した。

【００９０】活性の測定：前述した方法により、先行クローンに対する酵素活性を測定した
。表４に、種々の脂肪酸基質を含むCYP94A3（クローンＣ）の活性値を示す。

【表４】

【００９１】図17（カプリン酸及びラウリン酸）、図18（ミリスチン酸及びパルミチン酸）
、及び図19（オレイン酸及びリノール酸）に、TLCラジオクロマトグラムを示す。各基質に対して、クロマトグラムを２つずつ示したが、その一つはNADPHが存在する（Ａ：ヒドロキシラーゼが活性を有する）場合であり、もう一つはNADPH が存在しない（Ｂ：ヒドロキラーゼが活性を有しない）場合である。

【００９２】（例IV−クローンＤ[CYP81B1]；カプリン酸、ラウリン酸、及びミリスチン酸の分子鎖内ヒドロキシラーゼ[IC-LAH]）クローンＤは、カプリン酸（C10:0）、ラウリン酸（C12:0）、及びミリスチン
酸（C14:0）のω-2、ω-3及びω-4ヒドロキシル化反応を触媒し、Helianthus tu
berosis（キクイモ）から採取したミクロソームP450をコード化する働きを有している。主な代謝産物はω-3ヒドロキシル化物である。

【００９３】（CYP81B1[クローンＤ]の単離） H.tuberosusから採取した生体異物誘発性7-エトキシクマリンo-デエチラーゼを精製することにより、５−６種類のP450タンパク質混合物を含むP450富化分画
を単離した（Batardら, 1995）。このP450富化分画に対してポリクローン抗体を
育成した。他方、H.tuberosusの角皮素組織をスライスしてアミノピリン20 mMの
存在下に24時間熟成した。当該ポリクローン抗体を使用して、当該熟成物から調
製したλZAPII cDNAライブラリをスクリーニングし、これからクローンＤを育成
した。陽性クローン（56）を単離し、Meijerら（1993）が記述したPCR技術を使用して、P450の共通配列の存在を調べた。15種類のクローンから、期待通りの大
きさのPCRフラグメントが得られた。これらを標識し、休眠中の角皮素組織或いは切傷処理又はアミノピリン処理した角皮素組織から調製した完全RNAとハイブリッド化した。15種類のクローンの一つは、2.2 kbの写しに対応していた。当該
写しは、休眠中の角皮素及び切傷処理した角皮素中には殆ど検出されないが、ア
ミノピリン処理によって誘発される。その挿入部分の配列決定を行った結果、こ
の配列が、P450を欠く約150種類のヌクレオチドを、N-末端基でコード化することが分かった。当該ライブラリを再スクリーニングして、ヌクレオチドを５個だ
け欠いている、これらより長いcDNAを単離した。アミノピリンで24時間処理した
角皮素組織からポリ(A)RNAを採取し、このポリ(A)RNAを使用して、5'-RACEにより、行方不明のコード化配列を得ることができた。このようにして完全配列を再
構成し、これをクローンＤと命名することとした（図20）。

【００９４】（酵母中における異種起源発現） CYP81B1（クローンＤ）の触媒活性を、酵母中でその機能を発現させて評価した。植物P450の発現（膜構造及び植物P450レダクターゼの存在）に適した環境を
提供する酵母菌株に遺伝子設計を施し、これを使用して異種起源発現を行わせた
。当該菌株WAT11、当該発現ベクター、コード化配列のサブクローン化、酵母の生育、形質変換、及び酵母ミクロソームの調製に関しては、Pomponら（1996）の
記述がある。そのコード化配列以外の配列を除去したCYP81B1（クローンＤ）cDN
Aを、ガラクトース誘発プロモーター（GAL10-CYC1）による調節制御の下に、pYe
DP60発現ベクターの中に発現させた。Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene社製）を使用して、CYP81B1（クローンＤ）をサブクローン化してこのベクターの中に挿入し、この被修飾cDNAをチェックして、PCRに起因するエラーが無いことを確かめた。

【００９５】形質変換酵母及び比較対照酵母（比較対照酵母＝空プラスミドで形質変換した
酵母）から調製したミクロソーム中で、P450含有量及び触媒活性を測定した。比
較対照ミクロソーム中では、P450又は脂肪酸の代謝は全く検出されなかった。CY
P81B1（クローンＤ）から調製したミクロソーム膜の中で、ガラクトースの存在下に形質変換酵母を16時間生育し、Omura及びSato（1964）の方法でP450含有量を測定した（図21）。P450の含有量は、約202 pmol/mgタンパク質（即ち、ミクロソームタンパク質の約１%）であった。芳香族化合物、ステロール、除草剤、
及び脂肪酸を含む潜在的放射能標識基質20種類以上について、その触媒活性を調
べた。脂肪酸の代謝を、Salaunら（1981）の方法により評価した。

【００９６】 CYP81B1（クローンＤ）により代謝を起こした分子は、C10:0、C12:0及びC14:0
の脂肪酸だけであった（表５）。代謝は、NADPHの存在により左右された。

【００９７】（表５：CYP81B1の基質特異性）放射能標識基質を使用して、活性を測定した。ラジオTLCにより、代謝産物量（３種類のヒドロキシル化生成物の合計値）を定量した。比較対照酵母（空発現
ベクターで形質変換）又はNADPHの不存在下においては、活性は検出されなかった。

【表５】

【００９８】（動力学的変数及び比活性）カプリン酸及びラウリン酸の場合について、反応の見掛けVmax及びKmを測定し
た。Arabiodopsisレダクターゼ（即ち、WAT11菌株）を過剰発現している酵母から採取したミクロソーム中において、カプリン酸の場合には酵素回転率 41±0.8
/分、Km値 903±168 nMで、ラウリン酸の場合には酵素回転率 30.7±1.4/分、Km
値 788±400 nMで反応が進行した。

【００９９】（代謝産物のキャラクタリゼーション）本発明者らが前に行った研究（Salaunら, 1981）の結果は、H.ruberosusの角皮素ミクロソーム中において、ラウリン酸が8-, 9-及び10-ヒドロキシル化代謝産物（それぞれ25:60:15）に変換されることを示している。植物ミクロソームで
得られた生成物は、GC-MSによりそのキャラクタリゼーションを行った。ラウリン酸の分子鎖内ヒドロキシラーゼの活性は、トウモロコシ及びチューリップのミ
クロソーム中においても検出され、アミノピリン、フェノバルビタール及びその
他の生体異物によって誘発された（Adeleら, 1981; Salaunら, 1982; Salaunら,
1986; Fonne-Pfisterら, 1988）。

【０１００】図22のTLCプロフィールは、CYP81B1（クローンＤ）が、同じ代謝産物に対して
P450触媒形成をコード化することを示している。ω-2, ω-3, ω-4ヒドロキシル
化代謝産物が、３種類の脂肪酸基質（カプリン酸、ラウリン酸、及びミリスチン
酸）から、植物ミクロソームにおけるのと同じ割合で生成した。その他少量の生
成物が、ラウリン酸を酵母発現酵素で培養した後で検出されている。この代謝産
物の構造については、現在検討中である。ラウリン酸及びミリスチン酸の場合に
は、３種類の代謝産物の存在及びそれらの割合をHPLCにより確認した（図23）。

【０１０１】本発明者らが前に行った研究の結果も、同じ酵素が、不飽和酸であるラウリン
酸のアリルヒドロキシル化又はエポキシ化（Salaunら, 1989, 1992, 1993）を、また9- 及び11-チアドデカン酸のスルホキシド化（Bosch, 1992）を触媒する可能性が非常に高いことを示している。（Ｚ配列の）不飽和類似体が高度の立体
選択性で代謝される場合も見いだされている（Salaunら, 1992）。

【０１０２】（例Ｖ−クローンＥ（CYP94A4））シトクロームP450依存ヒドロキシラーゼは、カプリン酸（C10:0）、ラウリン酸（C12:0）、ミリスチン酸（C14:0）、パルミチン酸（C16:0）、オレイン酸（C
18:0）、リノール酸（C18:2）及びリノレン酸（C18:3）のメチル末端基酸化反応
を触媒し、CYP94A4はシトクロームP450依存ヒドロキシラーゼをコード化する。最高活性は、C14:0及びC12:0において得られる。

【０１０３】（CYP94A4[クローンＥ]の単離） TMVに感染させたタバコの葉から調製したラムダ-Zap cDNAライブラリを、CYP9
4A1、A2及びA3でスクリーニングすることにより、下記の通りクローンＥを得た（IBMP社[Strasbourg] M.Legrand博士）。

【０１０４】タバコ（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）の葉を48時間かけてTMVに感染させ、この葉からポリ(A⁺)RNAを採取し、このポリ(A⁺)RNAからλZAP cDNAライブ
ラリを調製した。CYP94A1、A2及びA3のコード化配列混合物をプローブとして使用し、このライブラリを低厳密度でスクリーニングした。このプローブを、ラン
ダムプライミング法により、³²Pで放射能標識した。1500 pbより大きい15種類のクローンを単離し、その配列を決定した。これらの中の10種類が完全長を有し
、これらのクローンがCYP94一族の新しいシトクロームP450をコード化することが分かった。このクローンをCYP94A4と命名した（図24）。

【０１０５】（酵母中における異種起源発現） CYP94A4（クローンＥ）の触媒活性を、本明細書の中ですでに先行するクローンのために説明した方法により、特に設計した酵母の中で、その機能を発現させ
て評価した。クローンＥ（SEQ ID NO:９）のコード化配列を、BamHI制限サイトを使用して、次のように発現ベクターpYeDP60の中へPCRでクローン化した。センスプライマー（BamHI）

【化８】アンチセンスプライマー（KpnI）

【化９】

【０１０６】メーカーの指示に従ってBoehringer HIFI（登録商標）ポリメラーゼを使用し、増幅配列にポリメラーゼに起因するエラーが発生していないかどうかを検証し
た。酵母菌株WAT11（Urbanら, 1990）を、Schiestl及びGietz（1989）の方法に従って形質変換した。

【０１０７】（ミクロソームの調製）酵母（菌株WAT11）をクローンＥを組み込んだpYeDP60で形質変換し、この酵母
を生育し、前に述べた方法によりミクロソームを誘発させた。形質変換しないWA
T11細胞にも同じ操作を施し、これを比較対照サンプルとした。

【０１０８】（P450量の測定）ミクロソームをTEGで５倍に希釈し、Omura及びSato（1964）の方法により、91
/cm/mMの吸光係数を使用してP450量を測定した（図２）。

【０１０９】（活性の測定）酵素活性を、前述の方法により測定した。これらの実験において同定された全
ての反応生成物は、前にも植物ミクロソームに関して、純正化合物を使用する再
クロマトグラフ法及びGC/MS 分光分析法により、すでに同定されているものであ
る。各基質について、完全動力学的研究を実施した。

【表６】

【０１１０】（例VI−クローンＦ[CYP94A5]） CYP94A5は、シトクロームP450依存ヒドロキシラーゼをコード化し、シトクロームP450依存ヒドロキシラーゼは、ラウリン酸（C12:0）、ミリスチン酸（C14:0
）、パルミチン酸（C16:0）、オレイン酸（C18:1）、リノール酸（C18:2）、及びリノレン酸（C18:3）のメチル末端基の酸化反応を触媒する。しかし、その効率は上記脂質の種類により大きく異なっている。最高の活性はC14:0及びC18:2に
おいて得られる。

【０１１１】（CYP94A5[クローンＦ]の単離） TMVを感染させたタバコの葉からラムダ-Zap cDNAライブラリを調製し、このラ
ムダ-Zap cDNAライブラリをCYP94A1、A2及びA3でスクリーニングして、下記の通
りクローンＦを得た（IBMP社[Strasbourg] M. Legrand 博士）。

【０１１２】 λZAP cDNAライブラリを、48時間かけてTMVを感染させたタバコ（Nicotiana t
abacum var. Samsun NN）の葉から採取したポリ(A⁺)RNAから調製し、このλZAP
cDNAライブラリを、CYP94A1、A2及びA3のコード化配列混合物をプローブとして使用し、低厳密度でスクリーニングした。このプローブは、ランダムプライミングにより、³²Pで放射能標識した。1500 pbより大きな15種類のクローンを単離
し、その配列を決定した。完全な長さのクローン２種類が、CYP94一族の新しいシトクロームP450をコード化することが見いだされた。この新しいシトクローム
P450を、CYP94A5と命名した（図25）。

【０１１３】（酵母中における異種起源発現） CYP94A5（クローンＦ）の触媒活性を、先行クローンについて述べた方法により、その場限りの目的で設計した酵母の中で機能を発現させて評価した。

【０１１４】（クローンＦの再フォーマット）クローンＦ（SEQ ID NO:11）のコード化配列を、下記のようにしてBamHI制限サイトを使用し、PCRでベクターpYeDP60の中へクローン化した。SEQ ID NO:12の
中に含まれるペプチド配列は下記の通りである。センスプライマー（BamHI）

【化１０】アンチセンスプライマー（KpnI）

【化１１】

【０１１５】メーカーの指示に従って、Boehringer HIFI（登録商標）ポリメラーゼを使用し、増幅配列にポリメラーゼに起因するエラーが存在しないかどうかを検証した
。Schiestl及びGietz（1989）の方法に従って酵母菌株WAT11（Urbanら, 1990）を形質変換した。

【０１１６】（ミクロソームの調製）酵母（菌株WAT11）をクローンＦを組み込んだpYeDP60で形質変換し、先行クロ
ーンについて前述した方法でこの酵母を生育し、クローンＦを誘発させた。形質
変換しないWAT11細胞をこれと同じ操作にかけ、比較対照サンプルとした。

【０１１７】（P450量の測定）ミクロソームをTEGで５倍に希釈し、Omura及びSato（1964）の方法で、91/cm/
mMにおける吸光係数を使用して、P450を定量した（図２）。

【０１１８】（活性の測定）前述した方法で、酵素活性を測定した。これらの実験で同定した全ての生成物
は、前に植物ミクロソームについて行った実験でも、純正化合物を使用する再ク
ロマトグラフ法及びGC/MS法ですでに同定を行ったものである。各基質に関しては、完全動力学研究を実施した。

【表７】

【表８】

【０１１９】（例VII クローンＧ[CYP94A6]） CYP94A6はシトクロームP450をコード化する。現在、その触媒活性を評価中である。CYP94A6は、この分類の酵素に特徴的なシグネチャー配列を示すので、脂肪酸ヒドロキシラーゼ活性を有することが期待される。

【０１２０】（CYP94A6[クローンＧ]の単離） TMVに感染させたタバコの葉（IBMP社[Strasbourg] M. Legrand博士による）か
ら調製したラムダ-Zap cDNAライブラリを、下記のようにCYP94A1、A2及びA3でス
クリーニングすることにより、クローンＧを得た。

【０１２１】タバコ（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）の葉を48時間かけてTMVに感染させ、このタバコの葉からポリ(A⁺)RNAを採取し、このポリ(A⁺)RNAからλZAP cD
NAライブラリを調製し、CYP94A1、A2及びA3のコード化配列混合物をプローブとして使用して、このλZAP cDNAライブラリを低厳密度でスクリーニングした。こ
のプローブは、ランダムプライミングにより³²Pで放射能標識した。1500 pbより大きな15種類のクローンを単離し、その配列を決定した。一つの完全クローン
が、CYP94一族の新しいシトクロームP450をコード化することが見いだされた。このクローンをCYP94A6と命名した。594の位置にあるNdel制限サイトACATAT（図
26）を使用してゲノム状のタバコ（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）DNAに関して逆PCRを実施することにより、CYP94A6の完全配列及び配列固有プライマー
を得た。

【０１２２】（酵母中における異種起源発現）前述の方法によりCYP94A6を酵母中に発現させ、ウェスタンブロット法により
、製造されたタンパク質を検出した。クローンＧの触媒活性は、その機能を特別
に設計した酵素中に発現させ、現在これを評価しているところである。

【０１２３】（クローンＧのリフォーム） BamHI制限サイトを使用して、下記のように、クローンＧのコード化配列（SEQ
ID NO:13）をベクターpYeDP60中にPCRでクローン化した。（SEQ ID NO:14に含まれるペプチド配列）センスプライマー（BamHI）

【化１２】アンチセンスプライマー（KpnI）

【化１３】メーカーの指示通り、Boehringer HIFI（登録商標）ポリメラーゼを使用し、増幅配列についてポリメラーゼエラーの有無を検証した。Schiestl及びGietz（19
89）の方法により、酵母菌株 WAT11（Urbanら, 1990）を形質変換した。

【０１２４】（ミクロソームの調製） pYeDP60にクローンＧを組み込み、このpYeDP60で酵母（菌株WAT11）を形質変換し、前述の方法によりこの酵母を生育させて、ミクロソームを誘発させた。形
質変換しないWAT11細胞に同じ操作を施し、これを比較対照サンプルとした。

【０１２５】（P450量の測定) ミクロソームをTEGで５倍に希釈し、Omura及びSato（1964）の方法で、91/cm/
mMの吸光係数を使用してP450量を測定した。

【０１２６】（CYP94A4、CYPA5、CYPA6を発現した遺伝子導入タバコの調製）タバコ（Nicotiana tabacum L. var Xanthi）を、クローンＥ（CYP94A4）、Ｆ
（CYPA5）及びＧ（CYPA6）の「開放−反復−開放」読み枠で、センス及びアンチ
センスの方向に形質変換した。コード化配列を、我々の研究所で特に構築したベ
クター pFB8（Atanassovaら, Plant J. 1995, 8, pp 465-477）の中へクローン化した。この形質変換は、タバコ葉の円盤状組織を使用し、Horschの方法（Scie
nce 1985, 227, pp 1227-1237）により、腫瘍菌（菌株 LBA 4404）経由で行った
。

【０１２７】（CYP94A4、CYPA5、CYPA6コード化配列のリフォーマット）コード化配列を、下記に太字で示したBamHI及びKpnI制限サイトを使用してベクターpFB8の中へPCRでクローン化した。（94A4に対してそれぞれSEQ ID NO:４及び３、94A5及び94A6に対してそれぞれSE
Q ID NO:13及び12の中に含まれる、ペプチド及び拡散の配列）ａ）pFB8中におけるセンス方向の配列センスプライマー（KpnI）

【化１４】アンチセンスプライマー（BamHI）

【化１５】ｂ）pFB8中におけるアンチセンス方向の配列センスプライマー（BamHI）

【化１６】アンチセンスプライマー（KpnI）

【化１７】現在、センス及びアンチセンスの両方向に形質変換した植物を、T1のシーズで育
成中であり、近々その結果が出る予定である。

【０１２８】（脂肪酸オメガヒドロキシラーゼのシグナチャー）本発明者らは、ペプチド配列（SEQ ID NO:２）を同定した。これを、図１、７
、15、24、25及び26において、二重下線で印を付けて示した。この配列は、これ
までにキャラクタリゼーションが行われた全ての植物脂肪酸オメガヒドロキシラ
ーゼ中に見いだされる、独特のシグナチャーである。 S(AVS)AL(TVS)WFFWL(LIV) ここに、（AVS）は、Ａ、Ｖ又はＳの一つを，（TVS）はＴ、Ｖ又はＳの一つを、
また（LIV）はＬ、Ｉ又はＶの一つを意味している。このシグナチャー配列は、C
YP86A1（SEQ ID NO:１）、CYP86A5、CYP94A1、CYP94A2、CYP94A3、CYP94A4、CYP
94A5、及びCYP94A6の中に存在する。CYP94A6（現在キャラクタリゼションを実施
中）を除く全てのシグナチャー配列が、オメガヒドロキシラーゼ活性を有してい
る。このシグナチャー配列は、配列調整の結果、分子鎖内ヒドロキシラーゼであ
るCYP81B1中には存在しないことが明らかになっている。

【０１２９】ジーンバンク（GenBank）に保存されている全脂肪酸遺伝子の中から、このシグナチャー配列を探索したところ、12配列が存在することが分かった。これらの
全てが、シトクロームP450の異性形であった。配列の中には、種々の研究室で同
じ遺伝子を再クローン化しているために、重複するものも存在した。

【０１３０】当該データベース（GenBank、EMBL、DDBI、PDBにおける配列の合計個数の中で
、重複していないものの数は364,804個であった）に含まれる全配列を走査した結果、このシグナチャーは、本発明の適用を受け、同じタイプの触媒活性を示す
全ての植物、動物又は微生物から採取されたものであっても、本発明の対象遺伝
子以外の遺伝子の中には一切存在しないことが確認された。従って、当該シグナ
チャーを代表する単離遺伝子は、全て本発明対象の遺伝子に係わり、本発明の遺
伝子と同じタイプの触媒活性を示すものと考えられる。（引用文献）

【０１３１】本発明に関して、現時点において現実的であると考えられる内容及び態様につ
いてここに記述した。従って、本発明は、ここに開示した態様に限定又は制限さ
れるものではない。本発明は、本明細書に添付した特許請求範囲の精神及び適用
範囲に含まれる種々の修飾及びこれと同等の内容全てに適用されるものである。

【０１３２】従って、本発明の新規側面から逸脱すること無く本発明の記述内容に変更を加
えることは、当該技術に精通した者にとっては容易である。従って、このような
変更は、全て本発明の特許請求範囲に含まれるものとする。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 CYP94A1（クローンＡ）及びこれから誘導されるタンパク質翻訳（それぞれSEQ ID NO:３及び４）のヌクレオチド配列。開放読み枠のヌクレオチドを、大文字で示した。P450のシグナチャーを構成する代表的なヘム結合ドメインには下線を
付けてこれを示した。

【図２】 CYP94A1（クローンＡ）を発現した酵母ミクロソームの一酸化炭素差異スペクトル。Pomponら（1996）の方法で調製したミクロソーム（10 mgタンパク質/ml）
を５倍に希釈し、数粒の次亜硫酸ナトリウムで還元し、２つのキュベットの中に
分けて入れた。島津MP2000二重ビーム分光分析計を使用して、ベースラインを40
0及び500 nmの間に記録した。一酸化炭素をサンプルの入ったキュベットの中へ吹き込み、得られたP450-CO錯体のスペクトルを記録した。91/cm/mMにおける吸光度で測定した結果、CYP94A1の量は176 pmol/mgタンパク質であった。

【図３】硫黄含有ラウリン酸類似体及びスルホキシ化代謝産物の化学構造。

【図４】 CYP94A1（クローンＡ）により、カプリン酸（C10:0）、ラウリン酸（C12:0）、ミリスチン酸（C14:0）、及びパルミチン酸（C16:0）から生成した反応生成物
のラジオクロマトグラム。脂肪酸で形質変換した酵母からミクロソームを採取し
、これを培養した後、反応混合物を前述の方法で抽出し、TLCにより分析した。Ａ：NADPHの存在下、Ｂ：NADPHの不存在下、及びＳ：残存基質。

【図５】 CYP94A1（クローンＡ）により、オレイン酸（C18:1）、リノール酸（C18:2）、及びリノレン酸（C18:3）から生成した反応生成物のラジオクロマトグラム。不飽和脂肪酸で形質変換した酵母からミクロソームを採取し、これを培養した後
、前述の方法で反応混合物を抽出し、TLCにより分析した。Ａ：NADPHの存在下、
Ｂ：NADPHの不存在下（比較対照）、及びＳ：残存基質。

【図６】 CYP94A1（クローンＡ）により、9Z,12E-オクタデカジエン酸(C18:2-9E,12Z)、
9E,12Z-オクタデカジエン酸(C18:2-9Z,12E)、8-プロピルスルフィニルオクタン酸（8S-LAU）、及び10-メチルスルフィニルデカン酸（10S-LAU）から生成した反
応生成物のラジオクロマトグラム。不飽和脂肪酸で形質変換した酵母からミクロ
ソームを採取し、これを培養した後、反応混合物を前述の方法で抽出し、TLC（C
18:2-9E,12Z及びC18:2-9Z,12E）又はHPLC（8S-LAU及び10S-LAU）で分析した。Ａ
：NADPHの存在下、Ｂ：NADPHの不存在下（比較対照）、及びＳ：残存基質。

【図７】 VAGH811（5'端で不完全）のヌクレオチド配列〔クローンＢ（CYP94A2をコード
化する完全cDNA）とも呼ばれる〕及び推定タンパク質翻訳（ωMAH又はCYP94A2）
（SEQ ID NO:それぞれ５及び６）。P450シグナチャーを構成するコンセンサスヘム結合ドメインには下線を付してこれを示した。

【図８】 ω-MAHを発現した酵母ミクロソーム（クローンＢ）の一酸化炭素差異スペクト
ル。Pomponら（1996）が述べた方法で調製したミクロソーム（10 mg-タンパク質
/ml）を５倍に希釈し、数粒の次亜硫酸ナトリウムで還元し、２個のキュベット中へ二分して入れた。島津 MP2000二重ビーム分光分析計を使用して、400及び50
0 nmの間にベースラインを記録した。このサンプルキュベットの中へ一酸化炭素を吹き込み、P450-CO錯体のスペクトルを記録した。91/cm/mMにおける吸光係数に基づきω-MAHの量を測定した結果、80 pmol/mlミクロソームであった。

【図９】カプリン酸からω-MAHにより生成させた反応生成物のラジオクロマトグラム。 ¹⁴ C-カプリン酸で培養した後、前述の方法で反応混合物を抽出し、TLCで分析した。Ａ：NADPHの存在下、Ｂ：NADPHの不存在下。

【図１０】ラウリン酸からω-MAHにより生成させた反応生成物のラジオクロマトグラム。 ¹⁴ C-ラウリン酸とともに培養した後、反応生成物を前述の方法で抽出し、TLCで分析した。Ａ：NADPHの存在下、Ｂ：NADPHの不存在下。

【図１１】ミリスチン酸からω-MAHにより生成させた反応生成物のラジオクロマトグラム
。¹⁴C-ミリスチン酸とともに培養した後、反応生成物を前述の方法で抽出し、TL
Cで分析した。Ａ：NADPHの存在下、Ｂ：NADPHの不存在下。

【図１２】パルミチン酸からω-MAHにより生成させた反応生成物のラジオクロマトグラム
。¹⁴C-パルミチン酸とともに培養した後、反応生成物を前述の方法で抽出し、TL
Cで分析した。Ａ：NADPHの存在下、Ｂ：NADPHの不存在下。

【図１３】ステアリン酸からω-MAHにより生成させた反応生成物のラジオクロマトグラム
。¹⁴C-ステアリン酸とともに培養した後、反応生成物を前述の方法で抽出し、TL
Cで分析した。Ａ：NADPHの存在下、Ｂ：NADPHの不存在下。

【図１４】オレイン酸からω-MAHにより生成させた反応生成物のラジオクロマトグラム。 ¹⁴ C-オレイン酸とともに培養した後、反応生成物を前述の方法で抽出し、TLCで分析した。Ａ：NADPHの存在下、Ｂ：NADPHの不存在下。

【図１５】 CYP94A3（クローンＣ）のヌクレオチド配列及び推定タンパク質翻訳。SEQ ID
NOは、それぞれ７及び８。クローンＢと比較して、5'端において９個のヌクレオ
チドが欠落している。

【図１６】 CYP94A3（クローンＣ）を発現した酵母ミクロソームの一酸化炭素差異スペクトル。Pomponら（1996）が述べた方法で調製したミクロソーム（10 mgタンパク質/ml）を５倍に希釈し、数粒の次亜硫酸ナトリウムで還元し、２個のキュベット中へ二分して入れた。島津 MP2000二重ビーム分光分析計を使用して、400及び
500 nmの間にベースラインを記録した。このサンプルキュベットの中へ一酸化炭素を吹き込み、P450-CO錯体のスペクトルを記録した。91/cm/mMにおける吸光係数に基づきCYP94A3の量を測定した結果、550 pmol/mlミクロソームであった。

【図１７】 CYP94A3（クローンＣ）により、カプリン酸（C10:0）及びラウリン酸（C12:0 ）から生成させた反応生成物のラジオクロマトグラム。脂肪酸で形質変換した酵
母からミクロソームを採取し、これを培養した後、前述の方法で反応混合物を抽
出し、TLCにより分析した。Ａ：NADPHの存在下、Ｂ：NADPHの不存在下（比較対照）、及びＳ：残存基質。

【図１８】 CYP94A3（クローンＣ）により、ミリスチン酸（C14:0）及びパルミチン酸（C1
6:0）から生成させた反応生成物のラジオクロマトグラム。脂肪酸で形質変換した酵母からミクロソームを採取し、これを培養した後、前述の方法で反応混合物
を抽出し、TLCにより分析した。Ａ：NADPHの存在下、Ｂ：NADPHの不存在下（比較対照）、及びＳ：残存基質。

【図１９】 CYP94A3（クローンＣ）により、オレイン酸（C18:1）及びリノール酸（C18:2 ）から生成させた反応生成物のラジオクロマトグラム。脂肪酸で形質変換した酵
母からミクロソームを採取し、これを培養した後、前述の方法で反応混合物を抽
出し、TLCにより分析した。Ａ：NADPHの存在下、Ｂ：NADPHの不存在下（比較対照）、及びＳ：残存基質。

【図２０】 CYP81B1（クローンＤ）のヌクレオチド配列及び推定タンパク質翻訳（それぞれSEQ ID NO:15及び16）。P450シグナチャーを構成するコンセンサスヘム結合ドメインには、下線を付してこれを示した。

【図２１】 CYP81B1（クローンＤ）を発現した酵母ミクロソームの一酸化炭素差異スペクトル。Pomponら（1996）が述べた方法で調製したミクロソーム（10 mgタンパク質/ml）を５倍に希釈し、数粒の次亜硫酸ナトリウムで還元し、２個のキュベット中へ二分して入れた。島津 MP2000二重ビーム分光分析計を使用して、400及び
500 nmの間にベースラインを記録した。このサンプルキュベットの中へ一酸化炭素を吹き込み、P450-CO錯体のスペクトルを記録した。91/cm/mMにおける吸光係数に基づきCYP81B1の量を測定した結果、202 pmol/mgタンパク質であった。

【図２２】 ¹⁴Cで放射能標識したC10:0（ａ）、C12:0（ｂ）、C14:0（ｃ）100 μMを、Hel
ianthus tuberosus（H.tub., 1.2 mgタンパク質）又は遺伝子導入酵母（CYP81B1
, 0.1 mgタンパク質）から採取したミクロソーム、及び600 μMのNADPHとともに
27℃で45分間培養し、得られた代謝産物をTLCで分析した。１容のアセトニトリル−酢酸（99.8/0.2）で反応を停止した後、培養媒体をTLC-シリカプレート（Me
rck社製60 F254）上に直接滴下し、エーテル−石油ベンジン−ギ酸（70/30/0.2 ）の混合物で展開した。ラジオメーター薄層スキャナー（Berthold社製 LB 2723
）を使用して、反応生成物の位置を確認した。

【図２３】 100 μMのC12:0（ａ）及びC14:0（ｂ）を、遺伝子導入酵母（0.1 mgタンパク質）のミクロソーム及び600 mMのNADPHとともに、27℃で45分間培養して得られた代謝産物のラジオHPLC分析結果。１容のアセトニトリル−酢酸（99.8/0.2 v/v
）で反応を停止した後、この培養媒体をエーテルで２回抽出した。エーテルをア
ルゴン雰囲気中で蒸発させ、Beckman HPLC ODS 5 μmを使用し、1.6 mm x 15 cm
のカラム上で、溶出液としてH₂O−アセトニトリル−酢酸（C12:0に対しては体積
比で75/25/0.2、C14:0に対しては体積比で68/32/0.2）を使用して代謝産物を分離した。流速は2 ml/分であった。HPLC溶出物の放射能をコンピュータ化したオンライン固体シンチレーションカウンター（Isomess社製Ramona D）で監視した。

【図２４】タバコモザイクウィルスに感染させたタバコの葉から調製したCYP94A4（クロ
ーンＥ）のヌクレオチド配列及び推定タンパク質翻訳（それぞれSEQ ID NO:９及
び10）。

【図２５】タバコモザイクウィルスに感染させたタバコの葉から調製したCYP94A5（クロ
ーンＦ）のヌクレオチド配列及び推定タンパク質翻訳（それぞれSEQ ID NO:11及
び12）。

【図２６】タバコモザイクウィルスに感染させたタバコの葉から調製したCYP94A6（クロ
ーンＧ）のヌクレオチド配列及び推定タンパク質翻訳（それぞれSEQ ID NO:13及
び14）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/68 5/00 Ｃ (72)発明者バンブニスト、イレーヌフランス国ストラルブール、リュゲーテ、21 (72)発明者ルブカン、ルノーフランス国ストラスブール、リュデフロン、16 アー (72)発明者エルビ、クリスチアーンフランス国サルブール、リュモリエール、19 (72)発明者バタール、ヤニックフランス国ストラスブール、リュドレマン、５ (72)発明者キャベロ − ユルタド、フランシスコスペイン国コルドバ、バジョ２、ピントベラズケズ５内 (72)発明者ヴェルク − ライヒハルト、ダニエルフランス国ディングシャイム、リュドバグダッド、３ (72)発明者サロン、ジャン、ピエールフランス国ストラスブール、リュデキャピュサン、68 (72)発明者デュルス、フランシスフランス国ベルノルシャイム、リュドランシャンヌネコール、７

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】オメガヒドロキシラーゼ、分子鎖内（in-chain）ヒドロキシ
ラーゼ、及びその機能的誘導体で構成されるグループから選ばれる植物脂肪酸ヒ
ドロキシラーゼをコードする単離核酸。
【請求項２】植物脂肪酸ヒドロキシラーゼをコードする単離核酸であり、
当該植物脂肪酸ヒドロキシラーゼがSEQ ID NO:2又はその機能誘導体のペプチド配列を有するオメガヒドロキシラーゼであり、脂肪酸基質を末端でヒドロキシル
化する単離核酸。
【請求項３】当該オメガヒドロキシラーゼがCYP94A1、CYP94A2、CYP94A3 、CYP94A4、CYP94A5及びCYP94A6で構成されるグループから選ばれる請求項２の単離核酸。
【請求項４】当該植物脂肪酸ヒドロキシラーゼが分子鎖内ヒドロキシラー
ゼ（CYP81）又はその機能誘導体であり、脂肪酸基質を末端近傍でヒドロキシル化する請求項１の単離核酸。
【請求項５】当該分子鎖内ヒドロキシラーゼがCYP81B1である請求項４の単離核酸。
【請求項６】請求項１−５のいずれか一項に記載の単離核酸で構成される
組換え型核酸。
【請求項７】さらに宿主細胞中において植物脂肪酸ヒドロキシラーゼの発
現に適した調節領域で構成される請求項６の組換え型核酸。
【請求項８】請求項６の組換え型核酸で構成される宿主細胞。
【請求項９】当該宿主細胞が細菌細胞、真菌細胞、及び植物細胞で構成さ
れるグループから選ばれる請求項８の宿主細胞。
【請求項１０】請求項６の遺伝子組換え核酸で構成される遺伝子導入植物
。
【請求項１１】請求項７の遺伝子組換え核酸で構成される宿主細胞。
【請求項１２】当該宿主細胞が細菌細胞、真菌細胞、及び植物細胞で構成
されるグループから選ばれる請求項11の宿主細胞。
【請求項１３】請求項７の遺伝子組換え核酸で構成される遺伝子導入植物
。
【請求項１４】請求項１−５のいずれか一項に記載の単離核酸によりコー
ドされる植物脂肪酸ヒドロキシラーゼ。
【請求項１５】請求項14の植物脂肪酸ヒドロキシラーゼを必須成分とする
組成物。
【請求項１６】請求項７の遺伝子組換え核酸により生産されるポリペプチ
ド。
【請求項１７】請求項16のポリペプチドを必須成分とする組成物。
【請求項１８】請求項１−５のいずれか一項に記載の単離核酸を使用して
、付加的な脂肪酸ヒドロキシラーゼ遺伝子を植物から単離する方法。
【請求項１９】付加的な脂肪酸ヒドロキシラーゼ遺伝子のコード化核酸を
選択するために、植物から採取した一連の核酸にハイブリッド化された標識プロ
ーブとして当該単離核酸が使用される請求項18の方法。
【請求項２０】単離核酸の保存ヌクレオチド配列に従って合成されたプラ
イマーが、付加的な脂肪酸ヒドロキシラーゼ遺伝子をコードする核酸を選択する
ために、一連の植物から採取した核酸を増幅する請求項18の方法。
【請求項２１】請求項18の方法により選択された単離核酸。
【請求項２２】植物中の脂肪酸組成物を変化させる方法であり、遺伝子導
入植物を生産するために、請求項１−５のいずれか一項に記載の単離核酸を植物
に導入し、植物脂肪酸ヒドロキシラーゼを遺伝子導入植物中に発現させ、遺伝子
導入植物中の脂肪酸基質をヒドロキシル化又はエポキシ化する上記方法。
【請求項２３】当該脂肪酸基質が中位鎖（medium-chain）の脂肪酸である
請求項22の方法。
【請求項２４】当該中位鎖脂肪酸がカプリル脂肪酸、ラウリン脂肪酸、及
びミリスチン脂肪酸で構成されるグループから選ばれる請求項23の方法。
【請求項２５】当該脂肪酸基質が長鎖脂肪酸である請求項22の方法。
【請求項２６】当該長鎖脂肪酸がパルミチン脂肪酸、オレイン脂肪酸、リ
ノール脂肪酸、及びリノレン脂肪酸で構成されるグループから選ばれる請求項25
の方法。
【請求項２７】当該脂肪酸基質が奇数の単素数を有する脂肪酸、分子鎖内
（in-chain）ヒドロキシ基を有する脂肪酸、分子鎖内エポキシ基を有する脂肪酸
、チア脂肪酸、エーテル脂肪酸、エステル結合を有する修飾脂肪酸及びアミド結
合を有する修飾脂肪酸で構成されるグループから選ばれる請求項25の方法。