JP2001518799A - 酵素アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ATPのアッセイに適切な酵素及び方法、前記アッセイへの特定の適用が記載される。特に、ルシフェラーゼのATPに対するK_mが対応の非変異酵素よりも高く（例えば５倍）なる（すなわち、ほぼ500μm〜1mM程度）ような変異（例えば、フォテイナス・ピラリスの245番目のアミノ酸残基）を有している組換え変異ルシフェラーゼが開示される。更に、改善された熱安定性、改変された放射光波長を与える更なる変異を有するルシフェラーゼも開示される。組換えポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞、並びに材料（例えば、細胞）中のATP量を適宜リアルタイムでアッセイする方法が開示される。インビトロアッセイ用の試験キットも開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素アッセイ発明の属する技術分野 本発明は、広義にはATPのアッセイに適した酵素及び方法に関する。更に本発 明は、前記アッセイへの特定の適用に関する。背景技術 細胞内ATP濃度は10倍以上変動することができ、これは細胞の健康状態又は発 達段階に強く依存する。例えば、薬剤、毒素、ホルモン、環境中の物質（enviro nmental agent）又は疾患の細胞に対する作用の試験手段として、細胞内ATPレベ ルの変動を測定することができることは、大きな価値があることである。 インビボでATP濃度をアッセイする便利な方法は、現時点では明らかに存在し ない。例えば、Dementieva et al.，Biochemistry(Moscow)，Vol．61，No．7(19 96)では、E.coliの細胞内ATP濃度を、組換えルシフェラーゼを使用して存在する 全ATP量を計算し、推定した全細胞容積で割ることにより測定している。 前記の間接的アプローチは、せいぜい実際のATP濃度の推定値を与えることが できるのみである。 細胞内のATP濃度の測定は、インビトロ結合アッセイ（coupled assay）を使用 して行われてきた。これは、Sigma Diagnostic Kit Catalog No．366に開示され ており、ホスホグリセレートキナーゼを使用して、ATP依存性様式で、3-ホスホ グリセレートを1,3ジホスホグリセレートへ転換する。次いで1,3ジホスホグリセ レートを、NADHからNADへの同時転換を伴いながら、グリセロアルデヒド-3-Pヘ 転換する。これを分光学的に測定することができる。血液細胞に使用したとき、 このアッセイは、１mMまでのダイナミックレンジ、期待される範囲380〜620pmを 有する。 しかしながら、全ての結合アッセイと同様に、この試験法は、実行する際の扱 いにくさが不可避である。更に、インビボ用途への適合が容易ではない。したが って、従来技術のいくつかの欠点を克服する物質及び方法を提供することは、当 該技術分野への貢献になるだろう。発明の開示 本発明の第一の態様において、ルシフェラーゼのATPに対するK_mが、対応の未 変異酵素よりも増加するような変異を有している組換え変異ルシフェラーゼが提 供される。好ましくは、K_mは、非変異酵素の少なくとも2倍であり、より好まし くは少なくとも約5倍、10倍又は20倍である。 ルシフェラーゼは、当該技術分野において既知である。Mg²⁺の存在下、ルシフ ェラーゼ（もとはホタルから得た）は、ルシフェリン、ATP及びO₂からオキシル シフェリン、AMP、CO₂、ピロリン酸及び光への反応を触媒する。この基本的特性 （ルシフェリン及びATPからの光の生成）を、以下「ルシフェラーゼ活性」と称 する。 本発明に関連して使用される用語「ルシフェラーゼ」は、全てのルシフェラー ゼ、又は、ルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ由来の組換え酵素を包含 することを意図する。この用語は、アミノ酸構造について欠失、付加又は置換を 有している組換え変異ルシフェラーゼ（ただし、ルシフェラーゼ活性を有してい るもの）を明確に含んでいる。前記ルシフェラーゼは、通常、野生型酵素に対し て相当のホモロジー（例えば、７０、８０、９０又は９９％まで）を有している だろう。しかしながら、先行技術の酵素から差別化される本発明のルシフェラー ゼの重要な技術的特徴は、本発明のルシフェラーゼが、同一の変異を欠く点にお いてのみ異なる対応の酵素と比較して、ATPに対するK_mの増加を引き起こす変異 を有していることにある。 このK_mの増加は、後述の実施例の欄で詳述するように、当業者が従来の酵素ア ッセイする事により測定されるだろう。 先行技術において、ルシフェラーゼは、（インビホ）遺伝子発現用のマーカー として使用されてきた。この場合、細胞内におけるルシフェラーゼの生成は特定 の遺伝子制御要素に結びついている。ルシフェリンは外来的に添加され、ほとん ど全ての条件下において、細胞内ATP濃度は、酵素が飽和されるようになってい るだろう。したがって、遺伝子発現のスイッチは、生成した活性ルシフェラーゼ 量にしたがう定量的な様式で放射される光によってシグナル化される。 しかしながら、既知のシステムにおいては、測定するのはルシフェラーゼ濃度 であることが強調されるべきである。濃度は、異なる事象、例えばプロモーター 効率と相関している。実際、時には、ルシフェラーゼのATPに対するK_mを低下さ せることを教示する先行技術もある（例えば、WO96/22376を参照）。これは、周 囲のATPの変化がアッセイを妨害しないことを保証する。 同様に、Dementievaら(1996)により開示されたアッセイは、すべてのATPが効 率的に光に転換され、存在する全ATPが計算されるようになることを要求する。 このアプローチは、低いKmルシフェラーゼを要求し、そのため酵素は、全てのAT Pが加水分解するまでほぼ最大速度で作用する。 従来技術において既知のルシフェラーゼと比較して増加したK_mを有するルシフ ェラーゼを利用可能にすることにより、本発明者等は、始めに、これらの酵素の 使用の可能性を開発し、従来不適当であった範囲の定常状態ATP濃度測定の可能 性をもたらした。一般に、これは、酵素速度（光強度によって測定されるV）と 基質濃度（ATPの濃度、ルシフェリンが過剰量で存在する場合）との関係は以下 の通りである。 V=V_m[ATP]/K_m+[ATP] それゆえ、K_mが周辺[ATP]（ambient[ATP]）よりも大きいか又は同程度である ときのみ、[ATP]の変化と光強度の変化との間のつりあいの程度をみることがで きる。K_mが周辺[ATP]よりも非常に小さい場合、[ATP]のすべての変化は、測定さ れる光強度にまったく作用しないだろう。光検出の感度が高くなればなる程、測 定できる「v」の変化は小さくなり、評価される[ATP]範囲についてのK_mは小さく なる。 特定の用途、例えばインビボ測定において、K_mがほぼ400μg〜1.4mM程度、例 えば500μm、600μm、1mM等であるルシフェラーゼを有することは有利であろう 。しかしながら、前記の検討から認められるように、主基準は、K_mが、評価され る予想の[ATP]範囲よりも非常に低くないということである。「ほぼ〜程度」と いう記載はこのように解釈されるべきである。 血球の生理学的アッセイにとって重要な特定の予想[ATP]範囲は、300μm〜1mM 、より好ましくは380μm〜620μmの範囲にある(前記Sigma Diagnostic Kit，Cat alog No．366を参照)。その他の哺乳類細胞、例えば肝細胞では、[ATP]範囲は2. 5mM〜6mMである(前記Dementieva等(1996)を参照)。これらの範囲における連続ア ッセイ用の本発明の組換えルシフェラーゼの使用は、特に予想される。 本件出願の開示は、始めに前記の高K_mルシフェラーゼを利用可能にする。先行 技術は、60μm〜150μmのK_mを有するルシフェラーゼのみを開示しており、これ は前記の範囲では飽和するだろう。 アッセイに使用する全ての酵素と同様に、変異酵素が、酵素の実際的濃度が検 出可能な結果を提供するように十分な活性（すなわち、最高のターンオーバー数 、これは高いV_mを与える）を保持していることが更に有利である。 好ましくは、変異体のATPについての活性は、対応の野生型の活性の少なくと も5〜100%である。しカルながら、高K_m変異の結果として低下した活性は、必要 ならば、更なる酵素又は感度の高い検出により補正することができる。 第一の側面の1つの態様においては、ATPに対するK_mが対応の非変異酵素に関し て増加するように、フォティナス・ピラリス（Photinus pyralis）の245番目の アミノ酸残基に対応するアミノ酸が、対応の野生型アミノ酸残基に関して置換さ れているルシフェラーゼが開示される。 異なる源に由来する多数のルシフェラーゼが、すでに文献に記載されているこ とに注意すべきである。例えば、ピー・ピラリスについてはWO 95/25798、ルシ オラ・クルシアタ（Luciola cruciata）及びルシオラ・ラテラリス（Luciola la teralis）についてはEP 0 524 448を参照のこと。その他の既知のluc遺伝子には 、ルシオラ・ミングレリカ（Luciola mingrelica）及びランピリス・ノクチルカ （Lampyris noctiluca）が含まれる(Newby et al，(1996)，Biochemical J，313 :761-767を参照)。 ピー・ピラリスのルシフェラーゼの245番目に対応するアミノ酸（野生型の非 変異酵素ではHisである）を、以下に示すようにして、当業者は困難なしに確立 することができる。ルシフェラーゼの配列を（文献又は配列決定により）確立す る。配列を、ピー・ピラリスについて、例えば市販のソフトウェア（例えば、 university of Wisconsin Genetics Computer Groupの"Bestfit"、Devereux et al，(1984)，Nucleic Acid Research，12:387-395を参照）又は手作業で並べ、 最大のホモロジーを実証し、転換したアミノ酸を並べる。ピー・ピラリスの245 番目に対応するアミノ酸を同定する。この例を後述するが、そこではエル・クル シアタを使用し、この場合、対応するアミノ酸は247番目である。 一度同定すると、変異体は、当該技術分野において一般的に使用される方法、 例えば部位特異的変異により生成することができる。後に例示する。 好ましくは、対応のアミノ酸を、朱改変の極性アミノ酸（例えばAla）又は末 改変極性アミノ酸（例えばAsn又はGln）で置換する。 WO 95/18853（プロメガ(PROMEGA)）は、多数（80以上）のピロフォラス・プラ ギオフタラマス（Pyrophorus plagiophtalamus）の変異体を列挙し、これらは改 変された特別の性質を有することを報告している。しかしながら、変異体のATP に対するK_mについては報告されておらず、また当該出願においてなんら検討され ていない。 第一の側面の別の態様において、フォティナス・ピラリスの318番目のアミノ 酸残基に対応するアミノ酸が、ATPに対するK_mが対応の非変異酵素に関して増加 するように、対応の野生型アミノ酸残基に関して置換されているルシフェラーゼ が開示される。対応については前記のようにして評価する。好ましくはアミノ酸 （野生型ではSer）が巨大なアミノ酸（例えば、Tyr）で置換されている。 好ましい形態において、本発明の変異ルシフェラーゼは、改善された熱安定性 、改変された放射光波長のうち1以上の性質を対応の非変異酵素に与えることが できる1以上の更なる変異を組み込む。ある適切な変異は、当業者にとって既知 である。例えば、熱安定性を改善した変異（例えば、ピー・ピラリスの354及び2 15 番目に対応する部位における変異）については、WO 95/25798、WO 96/22376及び EP 0 524 448を参照のこと。 好ましくは、K_mの上昇を引きおこす変異は、これらの性質の1以上、特に熱安 定性を改善する。約37℃における増強された熱安定性は、インビボで使用される 酵素にとって特に有利であることに注意すべきである。 更なる態様において、ルシフェラーゼは、融合タンパク質の形態又はポリペプ チド拡張（polypeptide extension）を組み込んでいてもよい。これは、生成、 インビボにおける局在化、抽出及び生成の容易性を改善する。 本発明の第二の側面において、本発明の変異ルシフェラーゼをコードする組換 えポリヌクレオチドが開示される。 第三の側面において、第二の側面のポリヌクレオチドを含むベクターが開示さ れる。例えばベクターは、適切な宿主細胞におけるベクターの複製を許容する複 製要素及び／又は適切な宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現を許容するプ ロモーターを更に含んでいる。プロモーターは構成プロモーターであってもよい 。プロモーターは、適宜、組織特異的又は臓器特異的であってもよい。 第四の側面において、第三の側面のベクターを含む宿主細胞又は前記ベクター で形質転換した宿主細胞が開示される。 第四の側面の宿主細胞は、ATPに対するK_mが本発明のルシフェラーゼより低い1 以上のルシフェラーゼを発現してもよい。このルシフェラーゼは異なる波長の光 を放射し、全てのアッセイの有用な範囲を拡張し及び／又は放射分析を許容する 。すなわち、高K_m変異体の活性は、更なるルシフェラーゼの活性と比較される。 更なるルシフェラーゼは、組換え非変異ルシフェラーゼ又はATPに対するK_mを対 応の非変異酵素よりも減少させる変異を有する、組換え変異ルシフェラーゼであ ってもよい(例えば、WO 96/22376を参照のこと)。 有色の変異体は、WO 95/18853及びOhmiya et al.，(1996)，FEBS Letters 384 :83-86に開示されている。 第五の側面において、第四の側面に記載した宿主細胞を培養する工程を含む、 本発明のルシフェラーゼの製造方法が開示される。 第六の側面において、前記宿主細胞から構成される単細胞生物又は前記宿主細 胞を含む多細胞器官若しくは生物が開示される。例えば、本発明のルシフェラー ゼが発現しているトランスジェニック高等動物の使用は、以下に詳述するように 、異なる型の細胞又は組織における[ATP]のインビボ研究を許容することができ る。特に、ATPは実質的に全ての生細胞に存在するので、ルシフェラーゼをクロ ーニングすることができる全ての型の細胞、細菌から植物又は動物までを、ATP 変化の測定により研究することができる。 したがって、本発明の第七の側面において、前記組換えルシフェラーゼを使用 する工程を含む、材料中のATP量のアッセイ方法が開示される。 好ましくは、本方法は、（ａ）ルシフェラーゼを、材料及びルシフェリンと接 触させる工程、（ｂ）ルシフェラーゼにより放射された光の強度を測定する工程 及び（ｃ）工程（ｂ）における測定値と材料中のATP量とを相関させる工程を含 んでいる。 工程（ｂ）における測定値は、対照値と比較して、ベースラインエラーを最小 化させてもよい。 このアッセイはインビトロ又はインビボで行うことができる。 より好ましくは、材料自体は、ルシフェラーゼが前記のベクターを用いた細胞 の形質転換により導入される細胞である。代替として、ルシフェラーゼを、直接 注射により細胞に導入してもよい。 また、測定する材料は、シナプスの一部、すなわちATPは神経伝達物質であっ てもよい。 一般的に、本アッセイは、特定の刺激（例えば、活性化剤の材料への添加）に より開始する事象のリアルタイム分析（例えばCCDカメラ、光電子増倍管又は光 ダイオードを使用した秒単位の時間スケールでの分析）にとって最も有用であろ う。この場合、アッセイは、比較的短い時間スケールについて[ATP]濃度の変化 をモニターすることができる。それゆえ、このような測定は、長い時間スケール の事象、例えば系のルシフェラーゼ濃度の変化等により大きな影響を受けないだ ろう。これらの変化は、細胞事象と相関させることができる。例えば組織壊死は 、筋肉疲労と同様に[ATP]の減少と関連しているだろう。このような連続測定は 今まで不可能であった。 その他の可能な応用には、種々の組織に対する薬剤治療の作用の測定、酸化的 リン酸化に対する毒素及び脱共役剤の作用の測定、細菌感染の測定、代謝過程及 びストレス（例えば、肥満症及び運動）の測定、脳活性（例えば、記憶機能及び 精神障害）の研究等が含まれる。 適切な場合には、[ATP]を、写真フィルムを使用して、（連続的ではなく）定 期的に測定することができる。 本質的に、モニタリングは、他の応用について当該技術分野において既に使用 されている方法、例えば生きている宿主における細菌性病原体の光子検出（Cont ag et al.，(1995)，Molecular Microbiology 18(4):593-603）に類似の方法で 行うことができる。前記の論文においては、Hamamatsu増感カメラを使用して、 マウスへの感染の間にルシフェラーゼを発現しているサルモネラ・チフィムリウ ム（Salmonella Typhimurium）を可視化した。なお、PET（ポジトロン放出断層 撮影、脳のスキャンに使用される）を使用して、ルシフェラーゼが生成した光の 正確な局在化を達成し、特定の身体部位の代謝を確認することを許容することも できる。 一般的には、ルシフェリンを研究する系へ導入する必要があるだろう。「ルシ フェリン」とは、ルシフェリン活性を有するすべての補因子、すなわちルシフェ ラーゼと共に使用されて、ATPの存在下で光の放射を引き起こす全ての補因子を 意味する。ルシフェリンを系に導入する方法は、系自体に依存するだろう。例え ば、動物細胞を研究する場合、細胞を成分とする動物にルシフェリン又はその前 駆体を摂取させることにより、ルシフェリンは導入されるだろう。同様に、研究 する系が1以上の植物細胞であるとき、ルシフェリン又はその前駆体の溶液を、 細胞を成分とする植物に適用することにより、ルシフェリンは細胞へ簡単に導入 されるだろう。 本発明の最後の側面において、前記ルシフェラーゼ、更には、（ａ）緩衝液又 は緩衝液調製用の乾燥材料、（ｂ）ATP標準、（ｃ）ルシフェリン、（ｄ）ジチ オスレイトール及び（ｅ）ATPアッセイ実施用の説明書を含む試験キットが開示 される。 本発明を、非限定的な図面、配列表及び実施例を参照して更に詳述する。図面の簡単な説明 図１は、実施例１に記載するプラスミドpPW601aを示している。 図２は、実施例１に記載する、変異体H245Aについての、（ａ）[ATP]に対する Vのプロット及び（ｂ）1/[ATP]に対する1/Vを示している。 図３は、実施例２に記載する、ピー・ピラリス（Pp）の或る領域とエル・クル シアタ（Lc）の対応の領域との配列の比較を示している。 図４は、変異体H245Nについての光放射対ATP濃度を示すグラフである。 図５は、実施例６に記載する、ルシフェリンを事前に導入したルシフェラーゼ 発現E.coliに対する栄養培地添加の影響を示している。 図６は、ピー・ピラリス由来の野生型luc遺伝子のヌクレオチド配列（配列番 号１）を示している。 図７は、変異H245A、N及びQ（Ala、Asn又はGln(配列番号２、３及び４を参照 のこと)）の作成に使用するプライマー（配列番号２〜５）並びに対応の野生型 配列（配列番号５）を示している。 図８は、本発明の高K_m変異体H245Qのアミノ酸配列を示している。この配列は2 45番目のアミノ酸がGlnに変化している。実施例 実施例１：組換え高K_m変異ルシフェラーゼの生成 別言する場合を除いて、用いた方法は、White et al.，(1996)，Biochemical Journal，319:342-350が用いた方法と同一である。この方法は耐熱性変異体に関 するものである。 出発材料：変異体は、ピー・ピラリス由来のルシフェラーゼ遺伝子lucを含む プラスミドpPW601a（図１）の部位特異的変異誘発により生成した。ピー・ピラ リス由来の野生型luc遺伝子は配列番号１に示される。プラスミドpPW601aは、pG EM-luc（プロメガ（Promega）より入手可能）由来のluc遺伝子BamHI/SstI断片を pDR540（ファルマシア（Pharmacia）より入手可能）ヘクローニングすることに より作成した。プラスミドのポリリンカーにおける唯一のXhoI部位を除去して、 以降の手順を単純化した。 部位特異的変異誘発：３つの変異誘発性オリゴヌクレオチドを使用して、変異 体H245A、N及びQ（Ala、Asn又はGln(配列番号２、３及び４)）を作成した。対応 の野生型配列を配列番号５に示す。更にオリゴヌクレオチドは、luc遺伝子の唯 一のXmnI部位を破壊するサイレント変異を導入した。この変異はアミノ酸の置換 を起こさないが、変異体の選択を容易にした。変異誘発は、キットの説明書（ク ローンテック・ラボラトリー(Clontech laboratories Inc.)、パロアルト、カリ フォルニア、アメリカ）にしたがい行った。 H245Qのアミノ酸配列を配列番号６に示す。 プラスミドDNAの単離及び形質転換：Brinboim & Doly，(1979)，Nucleic Acid s Research,7:1513に記載される方法より行った。 細胞培養及び抽出：E.coli JM109形質転換体をOD₆₀₀＝1.0になるまで増殖させ た。プラスミドpPW601aより変異ルシフェラーゼを発現している細胞のアリコー トを、プロメガ・テクニカル・ブリティンに記載されるようにして溶菌し、溶菌 抽出物をアッセイまで氷中で保存した。 変異ルシフェラーゼのK_mのアッセイ：ルシフェラーゼアッセイを、21℃下、10 0μlのアッセイ緩衝液（20mM MgSO₄、0.1mM EDTA、33mMジチオスレイトール、47 0μM D-ルシフェリン及び6.25〜800μMのATPを含む20mMトリシン(pH7.8)）を使 用して行った。各アッセイは、5〜10μlの粗細胞抽出物を含んでいた。 変異体H245Aについての、[ATP]に対するVのプロット及び1/[ATP]に対する1/V のプロットを図２に示す。各プロットはK_mの決定に使用することができる。 各変異体及び組換え野生型の結果を表１に示す。 *A215Lは耐熱性変異体であり、215番目の部位のアミノ酸がリジンで置換され ている（WO 96/22376(防衛大臣(SECRETARY OF STATE FOR DEFENCE))）を参照の こと。） 変異ルシフェラーゼの耐熱性のアッセイ：H245N及びH245Qの耐熱性を試験し、 変異体A215L及び野生型と比較した。ルシフェラーゼ活性を含む溶菌した粗抽出 物を37℃で設定時間期間インキュベートした。変異体H245Aの耐熱性は、組換え 野生型の耐熱性と非常に類似していることが見いだされた。結果を表２に示す。 精製：例えばH245Q変異を組み込んだルシフェラーゼは、前出White et al，(1 996)に記載されるようにして精製するだろう。要約すると、細胞溶菌物を30000g で30分間遠心分離し、上清を硫酸アンモニウム（30〜55%）で分画した。画分を 再懸濁し、脱塩した。脱塩した材料を、ヒドロキシアパタイトカラムを通過させ 、ジチオスレイトールを含む10〜200mMリン酸ナトリウムで溶離した。ルシフェ ラーゼを含む溶離剤を透析し、モノ（Mono）Q陰イオン交換カラムにかけた。酵 素は0〜500mM NaClを用いて溶離することができた。実施例２：対応の高K_m変異体の同定 図３は、実施例２に記載する、ピー・ピラリスの或る領域とエル・クルシアタ の対応する領域との配列の比較を示している。この場合、245番目の部位のアミ ノ酸は247番目に対応していることをみることができる。実施例３：哺乳類における変異ルシフェラーゼの発現 Liu et al.，(1997)，Nature Biotechnology，15:167-173に記載される方法に 類似した方法により行うことができた。この方法においては、カチオン性リポソ ームを使用して、ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドDNAをマウスに送達し た。実施例４：哺乳類におけるインビボATPアッセイ Contag et al.，(1995)，Molecular Microbiology，18(4):593-603に記載され る方法に類似した方法により行うことができた。この方法においては、マウスに おけるエス・チフィムリウム（S typhimurium）のルシフェラーゼ発現を、CCDカ メラを使用してモニターした。実施例５：インビトロATPアッセイ用のキット このキットは、ルシフェラーゼH245Q、緩衝液又は緩衝液調整用の乾燥材料、 基準用ATP、ルシフェリン及びATPアッセイ実施用説明書によって提供される。実施例６：細胞の挙動測定用アッセイ 実施例１に記載のルシフェラーゼアッセイを使用して、光子数対ATP濃度のプ ロットをH245N変異体について作成した。結果を図４に示す。 細胞の挙動の研究において本発明の酵素をどのように使用することができるか ということを説明するために、H245N変異ルシフェラーゼを発現した組換えE.col i細胞のサンプルを、栄養枯渇によって休止させた。この細胞を、1mMルシフェリ ンを含むクエン酸緩衝液（pH5.0）に10分間浸すことによりルシフェリンを導入 した。細胞を遠心分離により洗浄し、1mlの栄養培地中に再懸濁し、発光をモニ ターした。結果を図５に示す。 本発明の変異ルシフェラーゼを使用して、機能性細胞の回復及び増殖をモニタ ーすることができるだろう。

【手続補正書】 【提出日】平成１１年１１月１６日（１９９９．１１．１６） 【補正内容】 請求の範囲 １．フォティナス・ピラリスの245番目又は318番目のアミノ酸残基に対応するア ミノ酸が、ATPに対するK_mが対応の非変異酵素よりも高くなるように、対応の 野生型アミノ酸残基に対して置換されていることを特徴とする、組換え変異ル シフェラーゼ。 ２．フォティナス・ピラリスの245番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸が、 対応の野生型アミノ酸残基に対して置換されていることを特徴とする、請求項 １に記載の組換え変異ルシフェラーゼ。 ３．K_mが非変異酵素の少なくとも２倍である、請求項１又は２に記載のルシフェ ラーゼ。 ４．K_mが非変異酵素の少なくとも５倍高い、請求項３に記載のルシフェラーゼ。 ５．K_mがほぼ500μm程度である、請求項１又は２に記載のルシフェラーゼ。 ６．K_mがほぼ１mM程度である、請求項１又は２に記載のルシフェラーゼ。 ７．ATPについてのV_mが、対応の野生型の少なくとも5〜100%である、請求項１〜 ６のいずれかに記載のルシフェラーゼ。 ８．アミノ酸が、非荷電アミノ酸で置換されている、請求項２に記載のルシフェ ラーゼ。 ９．アミノ酸が、Ala、Asn又はGlnで置換されている、請求項７に記載のルシフ ェラーゼ。 10．フォティナス・ピラリスに由来し、245番目のアミノ酸残基が置換されてい る、請求項１〜９のいずれかに記載のルシフェラーゼ。 11．ルシオラ・クルシアタに由来し、247番目のアミノ酸残基が置換されている 、請求項１〜９のいずれかに記載のルシフェラーゼ。 12．改善された熱安定性、改変された放射光波長の性質のうちの1以上を、対応 の非変異酵素に与えることができる1以上の更なる変異を組み込んでいる、請 求項１〜11のいずれかに記載のルシフェラーゼ。 13．請求項１〜12のいずれかに記載のルシフェラーゼを含む融合タンパク質。 14．請求項１〜12のいずれかに記載のルシフェラーゼをコードする、組換えポリ ヌクレオチド。 15．更に、適切な宿主細胞におけるベクターの複製を許容する複製要素を含んで いる、請求項14に記載のポリヌクレオチドを含む複製ベクター。 16．更に、適切な宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現を許容するプロモー ター要素を含んでいる、請求項14に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクタ ー。 17．プロモーター要素が組織又は臓器特異的である、請求項16に記載のベクター 。 18．請求項15〜17のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞。 19．請求項15〜17のいずれかに記載のベクターで形質転換した宿主細胞。 20．更に、ATPに対する低Klを有する第二のルシフェラーゼを発現する、請求項1 9に記載の宿主細胞。 21．第二のルシフェラーゼが、（ａ）組換え非変異ルシフェラーゼ及び（ｂ）ル シフェラーゼのATPに対するK_mが、対応の非変異酵素よりも減少するような変 異を有する組換え変異ルシフェラーゼの中から選ばれる、請求項20に記載の宿 主細胞。 22．請求項19〜21のいずれかに記載の宿主細胞を培養する工程を含むことを特徴 とする、ルシフェラーゼの製造方法。 23．請求項19〜21のいずれかに記載の宿主細胞からなる又は含む宿主生物。 24．材料中のATP量のアッセイのための、請求項１〜12のいずれかに記載の組換 えルシフェラーゼの使用であって、ATP濃度が300μm〜６mMにあることが予想 されることを特徴とする使用。 25．請求項１〜13のいずれかに記載の組換えルシフェラーゼを使用する工程を含 むことを特徴とする、材料中のATP量のアッセイ方法。 26．（ａ）ATPに対するK_mが非変異酵素よりも高く、かつほぼ材料中の予想され るATP範囲にある組換え変異ルシフェラーゼを材料及びルシフェリンと接触さ せる工程、 （ｂ）ルシフェラーゼにより放射された光の強度を測定する工程、及び、 （ｃ）工程（ｂ）における測定値と材料中のATP量とを直接相関させる工程、 を含む材料中のATP量のアッセイ方法。 27．工程（ｂ）における測定値を対照値と比較する、請求項26に記載の方法。 28．工程（ｂ）における測定をリアルタイムで行う、請求項26又は27に記載の方 法。 29．測定する材料がシナプスの一部を形成する、請求項26〜28のいずれかに記載 の方法。 30．材料が細胞であり、ルシフェラーゼを細胞へ導入する、請求項26〜29のいず れかに記載の方法。 31．細胞を請求項25に記載の組換え変異ルシフェラーゼをコードするポリヌクレ オチドを含むベクターで形質転換することにより、ルシフェラーゼを細胞に導 入する、請求項30に記載の方法。 32．直接注射によりルシフェリンを細胞へ導入する、請求項30又は31に記載の方 法。 33．細胞が動物細胞であり、細胞を成分とする動物にルシフェリン又はその前駆 体を摂取させることによりルシフェリンを細胞へ導入する、請求項31又は32に 記載の方法。 34．細胞が植物細胞であり、細胞を成分とする植物にルシフェリン又はその前駆 体の溶液を適用することによりルシフェリンを細胞へ導入する、請求項31又は 32に記載の方法。 35．組換え変異ルシフェラーゼが、請求項１〜12のいずれかに記載のルシフェラ ーゼである、請求項25〜34のいずれかに記載の方法。 36．請求項１〜12のいずれかに記載のルシフェラーゼを含み、更に（ａ）緩衝液 又は緩衝液調製用の乾燥材料、（ｂ）標準溶液調製に適した２以上の測定され たATP部分、（ｃ）ルシフェリン及び（ｄ）ATPアッセイ実施用の説明書の１以 上を含むことを特徴とする試験キット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ホワイト ピーター ジョン イギリス ケンブリッジ シービー２ ４ エイティー バーブラハム バーブラハム ホール（番地なし） ザ バーブラハム インスティテュート (72)発明者 ロウ クリストファー ロビン イギリス ケンブリッジシャー シービー ２ １キューティー ケンブリッジ テニ ス コート ロード（番地なし） ユニヴ ァーシティー オヴ ケンブリッジ (72)発明者 マーレイ ジェームズ オーガスタス ヘ ンリー イギリス ケンブリッジシャー シービー ２ １キューティー ケンブリッジ テニ ス コート ロード（番地なし）ユニヴァ ーシティー オヴ ケンブリッジ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ATPに対するK_mが対応の非変異酵素よりも高くなるような変異を有している ことを特徴とする、組換え変異ルシフェラーゼ。 ２．K_mが非変異酵素の少なくとも２倍である、請求項１に記載のルシフェラーゼ 。 ３．K_mが非変異酵素の少なくとも５倍高い、請求項２に記載のルシフェラーゼ。 ４．K_mがほぼ500μm程度である、請求項１に記載のルシフェラーゼ。 ５．K_mがほぼ1mM程度である、請求項１に記載のルシフェラーゼ。 ６．ATPについてのV_mが、対応の野生型の少なくとも5〜100%である、請求項１〜 ５のいずれかに記載のルシフェラーゼ。 ７．フォティナス・ピラリスの245番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸が、 ATPに対するK_mが対応の非変異酵素に関して増加するように、対応の野生型ア ミノ酸残基に関して置換されている、請求項１〜６のいずれかに記載のルシフ ェラーゼ。 ８．アミノ酸が、非荷電アミノ酸で置換されている、請求項７に記載のルシフェ ラーゼ。 ９．アミノ酸が、Ala、Asn又はGlnで置換されている、請求項８に記載のルシフ ェラーゼ。 10．フォティナス・ピラリスに由来し、245番目のアミノ酸残基が置換されてい る、請求項７〜９のいずれかに記載のルシフェラーゼ。 11．ルシオラ・クルシアタに由来し、247番目のアミノ酸残基が置換されている 、 請求項７〜９のいずれかに記載のルシフェラーゼ。 12．改善された熱安定性、改変された放射光波長の性質のうちの1以上を、対応 の非変異酵素に与えることができる1以上の更なる変異を組み込んでいる、請 求項１〜11のいずれかに記載のルシフェラーゼ。 13．請求項１〜12のいずれかに記載のルシフェラーゼを含む融合タンパク質。 14．請求項１〜12のいずれかに記載のルシフェラーゼをコードする、組換えポリ ヌクレオチド。 15．更に、適切な宿主細胞におけるベクターの複製を許容する複製要素を含んで いる、請求項14に記載のポリヌクレオチドを含む複製ベクター。 16．更に、適切な宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現を許容するプロモー ター要素を含んでいる、請求項14に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクタ ー。 17．プロモーター要素が組織又は臓器特異的である、請求項16に記載のベクター 。 18．請求項15〜17のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞。 19．請求項15〜17のいずれかに記載のベクターで形質転換した宿主細胞。 20．更に、ATPに対する低K_mを有する第二のルシフェラーゼを発現する、請求項 19に記載の宿主細胞。 21．第二のルシフェラーゼが、（ａ）組換え非変異ルシフェラーゼ及び（ｂ）ル シフェラーゼのATPに対するK_mが、対応の非変異酵素よりも減少するような変 異を有する組換え変異ルシフェラーゼの中から選ばれる、請求項20に記載の宿 主細胞。 22．請求項19〜21のいずれかに記載の宿主細胞を培養する工程を含むことを特徴 とする、ルシフェラーゼの製造方法。 23．請求項19〜21のいずれかに記載の宿主細胞からなる又は含む宿主生物。 24．材料中のATP量のアッセイのための、請求項１〜12のいずれかに記載の組換 えルシフェラーゼの使用であって、ATP濃度が300μm〜６mMにあることが予想 されることを特徴とする使用。 25．請求項１〜12のいずれかに記載の組換えルシフェラーゼを使用する工程を含 むことを特徴とする、材料中のATP量のアッセイ方法。 26．（ａ）ルシフェラーゼを材料及びルシフェリンと接触させる工程、 （ｂ）ルシフェラーゼにより放射された光の強度を測定する工程、及び、 （ｃ）工程（ｂ）における測定値と材料中のATP量とを相関させる工程、 を含む請求項25に記載の方法。 27．工程（ｂ）における測定値を対照値と比較する、請求項26に記載の方法。 28．工程（ｂ）における測定をリアルタイムで行う、請求項26に記載の方法。 29．測定する材料がシナプスの一部を形成する、請求項25〜28のいずれかに記載 の方法。 30．材料が細胞であり、ルシフェラーゼを細胞へ導入する、請求項25〜28のいず れかに記載の方法。 31.細胞を請求項15〜17のいずれかに記載のベクターで形質転換することにより 、ルシフェラーゼを細胞に導入する、請求項30に記載の方法。 32．直接注射によりルシフェリンを細胞へ導入する、請求項30又は31に記載の方 法。 33．細胞が動物細胞であり、細胞を成分とする動物にルシフェリン又はその前駆 体を摂取させることによりルシフェリンを細胞へ導入する、請求項30又は31に 記載の方法。 34．細胞が植物細胞であり、細胞を成分とする植物にルシフェリン又はその前駆 体を適用することによりルシフェリンを細胞へ導入する、請求項30又は31に記 載の方法。 35．請求項１〜12のいずれかに記載のルシフェラーゼを含み、更に（ａ）緩衝液 又は緩衝液調製用の乾燥材料、（ｂ）標準溶液調製に適した２以上の測定され たATP部分、（ｃ）ルシフェリン、（ｄ）ジチオスレイトール及び（ｅ）ATPア ッセイ実施用の説明書の１以上を含むことを特徴とする試験キット。