JP2001514009A

JP2001514009A - 植物の改良されたアグロバクテリウム−媒介形質転換法

Info

Publication number: JP2001514009A
Application number: JP2000507820A
Authority: JP
Inventors: ディルクス，ロブ; ペーテルス，ロヘール
Original assignee: ヌンヘムス・ザーデン・ベー・ヴェー
Priority date: 1997-08-25
Filing date: 1998-08-25
Publication date: 2001-09-11
Also published as: AU736349B2; ATE269411T1; CN1268184A; CN1188525C; CA2301707A1; DE69824605D1; EP1009844A1; WO1999010512A1; US6323396B1; EP1009844B1; AU9264798A

Abstract

(57)【要約】 in vitroで、またはin plantaで良好に増殖する能力を失ったアグロバクテリウム菌株、ならびにこれらのアグロバクテリウム菌株を用いた形質転換法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、in vitro又はin plantaで活発に増殖する能力を失ったアグロバクテリウム菌株の用途に関し、特に形質転換した植物を生成するための、栄養要求
性であるアグロバクテリウム菌株の用途に関する。

【０００２】発明の背景永年の間、植物の遺伝子形質転換のための多くの手法が開発されている。これ
らの方法は、すべての細胞が、そのゲノム、特にその核ゲノムに安定的に組み込
まれた問題の遺伝子（いわゆる導入遺伝子）を含む外来ＤＮＡを有する、トラン
スジェニック植物を得ることを最終的な目標として有する。

【０００３】異なる植物形質転換法が、記載されており、かつ物理的ＤＮＡ送達法（例えば
、電気穿孔、ＰＥＧ媒介ＤＮＡ取込み、バイオリスティックス）、又はアグロバ
クテリウム媒介ＤＮＡ転移に分類することができる。後者のそれは、効率、単純
性、及びトランスジェニック植物（概して、より少数の導入遺伝子を含み、より
低い異常導入遺伝子の発生率を有する）の品質に優ることが多い。

【０００４】植物のアグロバクテリウム媒介ＤＮＡ形質転換は、一定のアグロバクテリウム
菌株が、そのＴｉプラスミド、すなわちＴ−ＤＮＡの一部を植物細胞に導入し、
このＴ−ＤＮＡを細胞の核ゲノムに組み込むことができる能力に基づく。転移さ
れ、組み込まれるＴｉプラスミドの部分は、特異的ＤＮＡ配列、いわゆる左右の
Ｔ−ＤＮＡ境界配列によって示され、これらの境界配列の間の天然Ｔ−ＤＮＡ配
列は、外来ＤＮＡで置き換え得ることが見出された〔ヨーロッパ特許第１１６，
７１８号公報；1987 Deblaere et al., (1987) Meth. Enzymol., 153:277-293〕
。

【０００５】しばしば、アグロバクテリウム媒介形質転換のプロトコルは、容易に再生でき
る切り出した植物の組織、器官、又は器官の部分、例えば葉盤、節間、茎分節な
どの使用を要する。これに代えて、in vitro培養組織（例えばコンパクト胚性カ
ルス）、懸濁培養物、又は単一細胞（プロトプラスト）が、形質転換するための
出発材料として用いられる。シロイヌナズナ属Arabidopsisについては、種子又は全植物を接種するプロトコル（いわゆるin planta形質転換プロトコル）が、記載されている。

【０００６】これらのプロトコルすべてに共通する特徴は、形質転換しようとする細胞、組
織又は植物を、一定時間アグロバクテリア菌株とともに同時培養し、その後、特
にin vitro培養が更に必要であるならば、抗生物質のような殺菌剤又は静菌剤の
使用によって、アグロバクテリア菌株の増殖を制限もしくは排除しなければなら
ないことである。しばしば、抗生物質の使用濃度は、形質転換される植物細胞の
有効な再生と干渉するか、又は阻害しさえする。実際、β−ラクタムの中核構造
を有する一定の抗生物質、例えばカルベニシリンの植物培地への添加は、サイト
カイン様効果を有し得ることが立証されている（国際公開特許第９７／１２５１
２号公報）。更に、問題のアグロバクテリウム菌株は、細菌で発現される抗生物
質抵抗性遺伝子、例えば、しかしそれに限らず、β−ラクタマーゼを含むことが
多く、適切な抗生物質のスペクトルを更に限定する。

【０００７】一定の不応性植物種の形質転換でしばしば観察される問題は、再生できる細胞
層は、アグロバクテリウム媒介形質転換を容易に受け付けないことがあり得るこ
とである。実際、組織形成分析は、例えばトマトで、サイトカイン処理によって
誘導されたシュートが、新形成細胞から誘導されることを立証している〔Monace
lli et al., 1988, Protoplasma, 142, 156-163〕。

【０００８】アグロバクテリウム媒介形質転換で規則的に出会うもう一つの問題は、活発に増
殖するアグロバクテリウム菌株が、特に、形質転換した植物又は組織をin vitro
で培養するときに、植物又は植物部分に影響を及ぼすことであって、細胞もしく
は外植片の再生の阻害へと、又は死へとさえ導く可能性がある。

【０００９】 Lippincottら〔1965, Journal of Bacteriology, 90, 1155-1156〕は、アグロ
バクテリウムＢ６の栄養要求性突然変異株は、感染力が非常に低いことを記載し
ている（親株の特異的感染力の＜１〜３０％）。

【００１０】 Lippincot & Lippincott〔1966, Journal of Bacteriology, 92, 937-945〕は
、アデニン、メチオニン又はアスパラギンに対して栄養要求性であるアグロバク
テリウム突然変異株の特性記述を更に記載し、感染力は、栄養要求性アグロバク
テリウムへの感染時に、所要栄養素を感染した葉に同時に与えることによって増
大させ得ることを証明した。

【００１１】 Christenら〔1984, Z. Pflanzenphysiol. Bd., 113 S. 213-221〕は、ロイシン及びヒスチジン要求性であるアグロバクテリウム・ツメファシエンスの突然変
異株が、分裂中のNicotiana tabacum cv. xanthiのプロトプラストの存在下で極
めて不完全に成長することを立証し、抗生物質の使用の代替策として、アグロバ
クテリウムを一時的に分裂させておくために限られた量の所要栄養素の存在下で
、植物プロトプラストとの同時培養にそのような栄養要求性菌株を用いることを
示唆した。

【００１２】 Changら〔1994, The Plant Journal, 5, 551-558〕は、茎頂シュートをその基
部で切断し、切断した部位にアグロバクテリウムを接種し、切断部位からシュー
トをin plantaで発生させて、安定的に形質転換した後代を生産することを含む、シロイヌナズナのための形質転換プロトコルを記載している。

【００１３】シロイヌナズナのための改良されたin planta形質転換法は、Bechtoldら〔199
3, C.R. Acad. Sci. Paris, Science de la vie, 316: 1149-9〕によって記載さ
れ、シロイヌナズナの植物体へのアグロバクテリウム細胞の懸濁液の減圧浸透、
その後のＴ１種子での形質転換された後代の選択に基づく。その著者らは、形質
転換頻度に関する主要な限定要因は、発芽工程から種子形成までの植物における
細菌の制限された存続であろうと考えた。

【００１４】発明の要約本発明によれば、少なくともいくつかのその細胞のゲノムに組み込まれた外来
ＤＮＡフラグメントを含むトランスジェニック植物を生産する方法であって、（１）植物細胞に転移され得るよう、少なくとも一つのＴ−ＤＮＡ境界配列に結
合された問題のＤＮＡを宿す、栄養要求性であるアグロバクテリウム菌株、好ま
しくはメチオニンもしくはヒスチジン要求性、又はヒスチジン及びアデニン要求
性である栄養要求性アグロバクテリウム菌株、特にLBA4404met又はATHVade,his に全身的に感染した、好ましくは該栄養要求性アグロバクテリア菌株を接種した
外植組織から再生した植物、又は植物の一部を与える工程と；（２）該全身的に感染した植物から単離した単一細胞又は一群の細胞から、好ま
しくは該全身的に感染した植物から単離した外植組織、プロトプラストもしくは
小胞子のin vitro再生によってか、又はこれに代えて、該全身的に感染した植物
の形質転換した後代種子の発芽によって、トランスジェニック植物を生成する工
程とを含む方法が提供される。

【００１５】この方法は、全身的に感染した植物から形質転換した植物を生成する工程の前
に、所要栄養素を、該全身的に感染した植物の少なくとも一部、好ましくは該全
身的に感染した植物の花序分裂組織又は未成熟花序に与える工程を更に含んでよ
い。

【００１６】本発明によって、メチオニンもしくはシステインに対して栄養要求性であるか
、又はアデニン及びヒスチジンに対して栄養要求性であるアグロバクテリウムの
菌株、特にLBA4404met又はATHVade,his、並びに植物のアグロバクテリウム媒介形質転換の際の、特にトウモロコシプロトプラストのアグロバクテリウム媒介形
質転換の際のか、又はこれに代えて、胚性カルス、特にキュウリもしくはテンサ
イからの胚性カルスのアグロバクテリウム媒介形質転換の際のそれらの用途も提
供する。

【００１７】（発明の詳細な説明）本発明は、以下に定義される限りでの栄養要求性アグロバクテリウム菌株が、
外植片に接種されたとき、生存し、再生した植物の全身的感染を成功裡に確立す
ることができるとの知見に基づく。固有の栄養要求性アグロバクテリウムの存在
は、殺菌性又は静菌性化合物の不在下でさえ、植物再生に干渉しない。その上、
そのような細菌は、再生した植物で、マーカー遺伝子の発現の形質転換した断片
が検出されることによって証拠付けられるとおり、依然として細胞を形質転換す
ることができる。最後に、全身的に感染した植物からの組織外植片は、外植片を
過剰成長させる細菌なしに、in vitroで更に培養することができる。

【００１８】本発明の栄養要求性アグロバクテリウム菌株は、in planta及びin vitroでの同時培養の際に、細菌細胞の制御下増殖を許し、接種された植物体、組織又は細
胞は、もはや、増殖する細菌によって過剰成長させられることがない。したがっ
て、本発明のアグロバクテリウム菌株は、そのような菌株に全身的に感染した植
物を確立するのに用いることができる。接種するアグロバクテリウム菌株との接
触時間は延長されて、細菌が、より内側の植物組織を貫通し、その下にある再生
可能細胞のような適切な標的組織に達し、かつそれを形質転換するのを許す。し
かし、インキュベーションのそのような延長は、細菌の活発な増殖が、本発明の
栄養要求性アグロバクテリア菌株によって達成されるように、それらを殺すこと
なく制御できる場合にのみ達成され得るに過ぎない。この方法は、全身的に感染
した植物の生成にin vitro培養の工程が必要とされるとき（例えば、組織外植片
、例えば茎分節からの全身的に感染した植物の再生）は常に、特に役立つ。

【００１９】更に、そのような菌株に全身的に感染した植物を生成するために、栄養要求性
アグロバクテリウム菌株を用いること、及び所要栄養素の局所的な補給との組み
合わせは、特異的に標的化された組織、例えば、しかしそれに限らず、花序を生
じる分裂組織の内部でのアグロバクテリウムの局所的な、かつ制御された増殖を
許す。

【００２０】本発明の方法に適した栄養要求性アグロバクテリウム菌株は、定義された培地
では、特別に必要とされる単数又は複数の栄養素が、その培地に供給されない限
り、増殖することができない。好ましくは、このアグロバクテリウム菌株は、植
物組織内又は表面で活発に増殖することができない。

【００２１】特に好適な栄養要求性アグロバクテリウム菌株は、植物組織又は細胞間液中に
限定量でのみ存在するにすぎない分子、より特定的には、ヌクレオシドもしくは
ヌクレオチド（プリンもしくはピリミジン）又はアミノ酸に対して栄養要求性で
ある。特に好適なのは、アミノ酸に対して栄養要求性である、特定的には硫黄を
含むアミノ酸、特にシステイン又はメチオニンに対して栄養要求性であるアグロ
バクテリウム菌株である。特に好適なのは、不完全なホモシステインメチルトラ
ンスフェラーゼ（EC.2.1.1.14）は生産するが、ホモシステインメチルトランスフェラーゼを全く生産しないアグロバクテリア菌株である。しかし、他の遺伝子
、例えば、ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ（EC2.3.1.46）、シスタチ
オニン（γ）シンターゼ（EC4.2.99.9）又はシスタチオニン（β）リアーゼ（EC
4.4.1.8）をコードする遺伝子における突然変異も、メチオニンに対して栄養要求性であるアグロバクテリウム菌株へと導くことができ、そのような菌株は、同
様の効果に向けて用い得ることが公知である。

【００２２】更にもう一つの特に好適なアグロバクテリウム菌株は、異なる２種類の栄養素
、特にアデニン及びヒスチジンを必要とする栄養要求性アグロバクテリウム菌株
、例えばATHVade,hisである。

【００２３】栄養要求性であるアグロバクテリウム突然変異株は、復帰が低頻度であるのが
好ましい。欠失突然変異は、低頻度の復帰を招くことが当技術においては公知で
あり、当業者には、細菌において欠失を発生させる方法が利用できる〔例えば、
Van Haute et al., 1983, EMBO J., 2:411-417〕。

【００２４】言うまでもなく、すべてのアグロバクテリウム菌株は、リゾゲネス（rhizogen
es）、ツメファシエンス又はラジオバクター（radiobacter）の種に属すると否とを問わず、上記に定義された限りでの栄養要求性にさせる突然変異を有するな
らば、本発明に従って、Ｔ−ＤＮＡベクターを宿すための宿主、及び問題の遺伝
子を植物細胞に転移するのに必要なヘルパープラスミドとして用いることができ
る。好適な菌株は、栄養要求性であるLBA4404、特にLBA4404metである。

【００２５】栄養要求性宿主が宿すＴ−ＤＮＡベクター又はヘルパーＴｉプラスミドの型は
、本発明を実施するには重要でないことも明白であると思われる。pTiBO542から
誘導されたpEHA101〔Hood et al., 1986, J. Bacteriology, 168:1291-1301〕の
ような一定のＴｉプラスミドが、植物へのＴ−ＤＮＡ転移の頻度を改善できるこ
とが示されている。常在性Ｔｉヘルパープラスミド、例えばpTOK47〔Jin et al.
, 1987, J. Bacteriol., 169, 4417-4425〕に例示される、それと共存できるレプリコンでの、pTiBO542のようなハイパービルレントＴｉプラスミドのvir遺伝子、特にvirG、又はvirBを伴うvirＧの導入は、植物へのＴ−ＤＮＡ転移の頻度を改善できることも示されている。そのようなプラスミドを宿す栄養要求性菌株
は、本発明の植物形質転換法に用い得ることが明らかである。更に、スーパービ
ルレントＴｉプラスミドの余分なvirG遺伝子、特にpTiBo542からのvirGを含む、
いわゆるスーパーバイナリーベクターは、一定の植物への転移の頻度を改善する
ことができることが立証されており（例えばヨーロッパ特許第０６０４６６２号
公報）、やはり、そのようなＴ−ＤＮＡベクターを宿す栄養要求性菌株は、本発
明の植物形質転換法に用いることができる。

【００２６】本発明によれば、少なくともいくつかのその細胞のゲノムに組み込まれた外来
ＤＮＡフラグメントを含むトランスジェニック植物を生産する方法であって、以
下の工程：（１）少なくとも一つのＴ−ＤＮＡ境界配列に機能的に結合された、好ましくは
二つのＴ−ＤＮＡ境界配列に機能的に結合された、問題のＤＮＡを宿す栄養要求
性であるアグロバクテリウム属の菌株に全身的に感染した植物、又は植物の一部
を提供する工程と；（２）該全身的に感染した植物に由来する形質転換した単一細胞、又は形質転換
した一群の細胞から形質転換された植物を生成する工程とを含む方法が提供される。

【００２７】好適実施態様では、全身的に感染した植物は、外植組織に、問題のＤＮＡを宿
す、上記のような栄養要求性アグロバクテリウム菌株を接種し、次いで、外植片
と栄養要求性アグロバクテリウム菌株とを、好結果の感染を確立するのに充分な
時間にわたってin vitroで同時培養することによって生成する。次に、過剰な細
菌を除去し、全身的に感染した、完全な植物を再生させる。

【００２８】栄養要求性アグロバクテリアを培養する方法は、当技術に広く公知である。好
結果の全身的感染を確立するためには、培地から持ち越された所要栄養素が、接
種工程の前に完全には除去されないことが重要であると考えられる。更に、vir 遺伝子の発現を誘導する植物フェノール性化合物、例えばアセトシリンゴンの存
在下での、接種前の栄養要求性アグロバクテリウム菌株のインキュベーションが
、本発明の方法に包含されてよい。そのような植物フェノール性化合物による前
誘導は、入手できる文献に広く記載されている〔例えば、Vernade et al., 1988
, J. Bacteriol., 170:5822-5829〕。これに代えて、vir誘導性化合物は、全身的に感染した植物に局所的に与えてもよい。

【００２９】用いる接種方法は、重要ではないと予測される。好ましくは、外植片を、アグ
ロバクテリウム細胞の０．０１〜２、好ましくは０．１〜１．５、特に約０．１
の範囲の密度又はＯＤ₆₀₀を有する懸濁液に浸漬する。しかし、植物体又は植物部分への減圧浸透、アグロバクテリウムの注入などのようなその他の方法を、同
様の効果に向けて用いることもできる。

【００３０】外植組織の細胞を形質転換することは、必要でなく、単に外植片をアグロバク
テリウムによって感染させる結果、アグロバクテリウム菌株によって全身的に感
染した植物体への再生が可能になることは、明らかであると思われる。

【００３１】外植組織に対する主な制約は、全植物体、好ましくは稔性植物体へと再生でき
る能力にあると考えられる。そのため、形質転換しようとする植物種に応じて、
広範囲の外植片、例えば、茎分節又は節間、カルス組織、好ましくは胚性カルス
、特に穀物植物の緊密胚性カルス組織を、本発明の形質転換法のための出発材料
として用いることができる。

【００３２】好適実施態様では、外植片とアグロバクテリウム菌株とのin vitroでの同時培
養は、約２〜５日間に達するが、この期間は、１日という短期に短縮するか、又
は１０日もの長期に延長することができる。しかし、長期のインキュベーション
期間では特に、接種の際の細菌培養液から持ち越された、残留する所要栄養素の
ために分裂し続けるアグロバクテリアが、外植片を完全に過剰成長させないよう
注意しなければならない。

【００３３】外植片の表面に固着する過剰な細菌は、場合により、例えば、無菌のティシュ
ーペーパーで単に拭うか、又は浸すことによって除去することができる。

【００３４】最後に、問題のアグロバクテリアに全身的に感染した植物を、in vitro、土壌
中、又はその双方のいずれかで再生させる。本方法は、in vitroでの再生が必要
とされる場合に、栄養要求性アグロバクテリアが、（例えばMurashige及びSkoog
の培地のような）補足しない汎用植物培地では、抗生物質の不在下でさえ増殖で
きないことから、特に関心が持たれる。

【００３５】形質転換した植物細胞は、外植組織からの植物体の再生の際に、当技術に一般
的に公知であるような、形質転換した植物細胞の選択剤を含有する培地での培養
によって富化してよい。しかし、本発明の方法のためには、アグロバクテリアは
、用いた選択剤に耐容できることが重要である。

【００３６】全身的に感染した再生植物体内に存在する栄養要求性アグロバクテリアは、問
題のＤＮＡをいくつかの組織に転移できる能力を保持することが公知であり、導
入遺伝子の発現は、少なくとも葯、葉、花原基などで立証されている。安定的に
形質転換した組織の観察される多様性を考慮すると、アグロバクテリアは、すべ
ての組織のすべての細胞、特に再生できる細胞及び組織に到達できると考えられ
る。

【００３７】再生した植物体は、通常、形質転換した細胞と形質転換しなかったそれとのモ
ザイクからなることになり、トランスジェニック細胞の異なるパッチは、独立し
た形質転換事象に起因し得ると考えられる。異なる形質転換事象を選択するため
に、好ましくは、「クローン的」工程を本方法に包含させる。「クローニング」
とは、単一細胞又は一群の細胞から出発する、植物の再生の工程を意味する。天
然に起こるクローニング工程は、配偶子形成によって与えられる。したがって、
半数体のクローニングされた植物は、例えば花粉培養によって生成することがで
きる。そうして、限られた数の導入遺伝子が挿入された同型接合植物が、「半数
体倍化」として容易に得られる。しかし、配偶子は、対応する配偶子によって受
精するか、又は受精させるのに用いて、接合体の胚を生じることができる。

【００３８】種子、好ましくは再生した植物体の自家受粉で得られた種子は、アグロバクテ
リウム菌株に全身的に感染した再生植物の後代中の、限られた数の導入遺伝子を
有する形質転換植物系統の単離を許す。すべての後代種子が、必ずしもトランス
ジェニック植物を生じるわけではないことは明らかであるが、導入遺伝子の存在
を検出する方法（サザン解析、ＰＣＲ、マーカー遺伝子の発現）が当技術に周知
である。

【００３９】上記のクローニング方法は、稔性植物にのみ適用できるにすぎないことを認識
しなければならない。例えば配偶子形成ができない植物は、in vitroのクローニ
ング方法の使用が必要とされることになる。プロトプラスト形成〔例えばLisebe
ttens et al., 1986, J. Mol. Biol., 188, 129-145に記載のもの〕、組織の機械的破裂〔Meins & Binns, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 2928-2832〕、又
は例えば葉盤のような外植片からのシュート形成を包含するが、これらに限定さ
れないいくつかの方法が、当技術で利用できる。植物組織中に存在する栄養要求
性アグロバクテリア菌株が、in vitro培養に用いられる植物培地では増殖できず
、殺菌又は静菌化合物に頼る必要なしにin vitroクローニング系の使用を許すこ
とは、記載された形質転換法の主な利点を構成すると考えられる。

【００４０】再生した植物体は、所要栄養素の不在下で、かつ殺菌化合物、例えば抗生物質
の存在下で完全な再生植物体を培養することによって、全身的に拡散したアグロ
バクテリアを治癒させることができる。この工程では、再生は、もはや全く必要
とされず、そのため、再生に対するその潜在的に有害な効果にも拘わらず、殺菌
化合物を用い得ることに注目しなければならない。アグロバクテリウムは種子を
介しては伝播しないとも、一般に考えられている。したがって、後代種子を収穫
することは、アグロバクテリアから回復した植物体を得る代替的な方法を意味す
る。

【００４１】本発明によれば、好ましくは適切な標的組織の部位での、特に花序分裂組織の
部位での、固有アグロバクテリウムの集団の成長を局所的に刺激する工程を更に
含む、形質転換のプロトコルが提供される。そのためには、栄養要求性アグロバ
クテリウム菌株に全身的に感染した植物に、所要栄養素、特に所要メチオニンを
局所的に供給して、アグロバクテリウムの分裂、及び問題の標的組織の細胞への
問題のＤＮＡの転移を局所的に刺激する。適用の様式は、重要ではないと考えら
れ、植物への化学物質の適用の方法は、当技術で一般的に利用できる（例えば、
７０％アセトン中の所要栄養素の溶液の吹付け）。

【００４２】好適実施態様では、所要栄養素を、配偶子、及び最終的には種子を生じる細胞
系譜、特に花序分裂組織又は未成熟花序に供給する。もう一つの実施態様では、
所要栄養素を、in vitro再生に特に適応し易い組織に供給する。

【００４３】クローニング工程に進む前に、ある期間、特に少なくとも１日を経過させるの
が好ましい。花序分裂組織又は未成熟花序に所要栄養素を供給した場合、配偶子
又は種子の収穫を許すのに充分な時間を経過させるのが好ましいことは、明らか
である。

【００４４】本発明の方法のためには、全植物体を栄養要求性アグロバクテリアに感染させ
ることは、厳格に必要とはされないことが明らかである。部分、例えば葉のみを
栄養要求性アグロバクテリアに感染させたにすぎない植物を、本発明の方法によ
る形質転換植物の再生のための形質転換細胞を単離するのに適した材料として用
いることができる。

【００４５】ちなみに、本明細書に用いられる限りでの「全身的に感染した植物」とは、ア
グロバクテリウム菌株が、植物体の少なくと何らかの部分、好ましくは植物体の
少なくともいくつかの部分に存在する植物であることに留意するのが重要である
。

【００４６】栄養要求性アグロバクテリウム菌株を用いた、記載のin planta形質転換方法は、外植組織からの再生方法が利用できるいかなる植物の形質転換にも適すると
期待される。本発明の方法は、形質転換及び再生を一工程で達成することができ
ない、植物の形質転換に特に適すると思われる。このin planta形質転換方法は、ピーマン（Capsicum annuum）、キュウリ（Cucumis sativus）、ヒマワリ（He
liantus annuum）、ネギ（Allium ampeloprasum）、トウモロコシ（Zea mays）、コムギ（Triticum spp.、特にT. aestivum及びT. turgidum）、オオムギ（Hor
deum vulgare）、ライコムギ（Triticosecale spp.）、エンバク（Avena spp.）
、ライムギ（Secale cereale）及びイネ（Oriza sativa）の形質転換に特に適す
る。

【００４７】明らかに、本発明の栄養要求性アグロバクテリウム菌株は、いかなるアグロバ
クテリウム媒介植物形質転換プロトコルにも用いることができ、それによって、
静菌又は殺菌化合物によるアグロバクテリウムの増殖の制御に対する必要性を回
避することができる。本発明の栄養要求性アグロバクテリウム菌株、好ましくは
メチオニン要求性アグロバクテリウム菌株、特にLBA4404metは、植物プロトプラ
スト、特にニンジン葉柄のプロトプラスト、テンサイ孔辺細胞のプロトプラスト
、及びトウモロコシのプロトプラストの形質転換における使用、並びにカルス組
織、好ましくは胚性カルス組織、特にテンサイ又はキュウリからの胚性カルス組
織の形質転換における使用に特に適すると考えられる。本発明の栄養要求性アグ
ロバクテリウム菌株は、双子葉類であれ単子葉類であれ、すべての植物の形質転
換に役立つと期待されるが、ピーマン（Capsicum annuum）、キュウリ（Cucumis
sativus）、ヒマワリ（Heliantus annuum）、ネギ（Allium ampeloprasum）、テンサイ(Beta spp.）、チコリー（Cichorium spp.）トウモロコシ（Zea mays）
、コムギ（Triticum spp.、特にT. aestivum及びT. turgidum）、オオムギ（Hor
deum vulgare）、ライコムギ（Triticosecale spp.）、エンバク（Avena spp.）
、ライムギ（Secale cereale）及びイネ（Oriza sativa）の形質転換には特に適
する。

【００４８】本発明をいかなる一つの理論又は作用様式に限定することも意図しないが、用
いられるin vitro培養の培地での栄養要求性細菌の適合性の低下は、活発な増殖
と、それに付随する、植物で誘導される病態形成関連過程とが誘導するストレス
を低下させ、なおかつ植物細胞、特にプロトプラストに加えられる、添加された
静菌又は殺菌化合物の否定的効果を回避することによる、転移の効率の上昇に枢
要であると考えられる。

【００４９】下記の実施例は、本発明の方法を詳しく説明する。実施例中に別途記述されな
い限り、すべての組換えＤＮＡ手法は、Sambrook et al., (1989) Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual、第２版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press
, NY、並びにAusubel et al., (1994) Current Protocols in Molecular Biolog
y, Current Protocols, USAの第１及び２巻に記載されたような標準的プロトコルに従って実施する。植物の分子的作業のための標準的材料及び方法は、BIOS S
cientific Publications Ltd. (UK) とBlackwell Scientific Publications, UK
とが合弁出版したR.D.D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax (1993)に
記載されている。

【００５０】実施例、及び本発明の説明においては、配列リストの配列が参照される。配列
リストの中には、下記のフリーテキストが含まれる： <223>人工配列の記載：pGSV71のＴ−ＤＮＡ <223>ＲＢ：Ｔ−ＤＮＡ右境界 <223>CaMV35SＰ３プロモーター <223>ホスホイノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする領域 <223>3'nos：アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡのノパリンシンターゼ遺伝子のポリ
アデニル化シグナルを含む３′非翻訳領域 <223>ＬＢ：Ｔ−ＤＮＡ左境界

【００５１】菌株LBA4404metHV及びATHVade,hisは、ベルギー微生物共同コレクション（Bel
gian Coordinated Collections of Microorganisms：ＢＣＣＭ）、Laboratorium
voor Microbiologie-Bacterienverzameling（ＬＭＧ）、Universiteit Gent, K
.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent、ベルギー国に１９９８年８月２０日に寄託され、下記の登録番号下にある： LBA4404metHV：LMG P-18486 ATHVade,his：LMG P-18485

【００５２】

【実施例】

実施例１：栄養要求性アグロバクテリウム菌株の選択（ストレプトマイシン２５μg/mlを追加したＬＢ培地で）活発に増殖させたア
グロバクテリウム・ツメファシエンスの菌株LBA4404からの単一コロニーを、ＬＢブロス（ストレプトマイシン２５μg/mlを追加）５mlに接種し、回転振盪機で
２８℃で４８時間増殖させた。この培養体２mlにＸ線を６００Kradで３７．５分
間、又は２００Kradで１２．５分間照射した。照射した培養体１mlに、１g／Lの
カザアミノ酸、及び２５μg/mlのストレプトマイシンを追加した最少Ｍ９培地（
Ｋ₂ＨＰＯ₄ ６０mM、ＫＨ₂ＰＯ₄ ３３mM、（ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ ０．７５mM、クエン酸三ナトリウム・２Ｈ₂Ｏ０．１７mM、ＭｇＳＯ₄ ０．０２％、グルコース０．
２％、チアミン０．０００５％）２mlを加え、振盪しつつ２８℃で４８時間温置
した。これらの培養体を、適切な希釈で平板播種し、生存コロニー（約１０⁶CFU
/ml）を、１g/Lのカザアミノ酸あり及びなしの最少培地（ストレプトマイシン２
５μg/ml）上でスクリーニングした。非追加最少培地で増殖できなかった２コロ
ニーを単離した。次いで、これらの栄養要求性コロニーを用いて、各アミノ酸０
．１mMを別個に追加した一連の液体最少Ｍ９培地の培養体２mlに接種し、振盪し
つつ２８℃で約４８時間インキュベートした。第一の栄養要求性菌株は、イソロ
イシン及びトレオニン追加培地で充分に増殖し、アスパラギン、フェニルアラニ
ン又はアラニンでわずかに増殖した。第二の栄養要求性突然変異株は、メチオニ
ンを追加した最少培地でのみ増殖したにすぎない。この後者の菌株を、LBA4404m
etと名付けた。

【００５３】 LBA4404metは、メチオニン、ホモシステインの直接前駆体を含む培地で増殖す
ることができなかった。したがって、LBA4404metにおける突然変異は、ホモシス
テインメチルトランスフェラーゼに影響すると推論することができる。

【００５４】復帰変異の頻度は、LBA4404metの密集培養を（メチオニンを追加していない）
最少培地プレートに播種し、２８℃で長時間インキュベートすることによって推
計した。２週間後でさえ、希釈しなかった細菌培養体１０μl（１．７×１０⁸CF
U/ml）を接種したプレートに、コロニーは全く観察されず、復帰頻度が０．５×
１０^-7未満との推計を許した。

【００５５】実施例２：ハイパービルレントヘルパーＴｉプラスミドに由来するvir遺伝子の含有によって改善される、アグロバクテリウムLBA4404met媒介形質転換の効率ほぼ同型の菌株であるLBA4404met、及びＴ−ＤＮＡベクターpNUN25を含むLBA4
404metHVを用いて、栄養要求性アグロバクテリウム菌株でのハイパービルレント
ヘルパーＴｉプラスミドの形質転換効率に対する影響を評価した。菌株LBA4404m
etHVは、プラスミドpTOK47〔Jin et al., 前掲〕のLBA4404met中への導入（電気
穿孔法による）によって得た。pNUN25は、Ｔ−ＤＮＡベクターであって、nosプロモーターの制御下にあるnptII遺伝子を含み、Ｔ−ＤＮＡ境界間でnosターミネ
ーターに、またＴ−ＤＮＡ境界の外部で、細菌で発現されるnptII遺伝子にも機能的に結合されている。これは、ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylv
estris）からのグルタミンシンターゼコーディング領域を含み、これにXbaI部位
（出発コドンの５′）及びEcoRV部位（コーディング領域末端の３′）をＰＣＲ増幅によって加工したＤＮＡフラグメント（登録番号第Ｘ６６９４０号の下にＥ
ＭＢＬ登録の６７番目のヌクレオチドから１３６３番目のヌクレオチドまでの配
列を有する）を、XbaI／EcoCRIで線状化したpNUN5に導入することによって構築した（国際公開特許第９４／２９４６５号公報）。

【００５６】ニコチアナ・タバクム（N. tabacum）の葉盤を、１mg/L ＢＡＰ（ベンジルアミノプリン）を追加したＭＳ２０培地（２０g/Lショ糖を追加したＭＳ塩〔Muras
hige & Skoog, 1968, Physiol. Plant., 15, 473-497〕）５ml中で２日間インキ
ュベートし、次いで、LBA4404met（pNUN25）又はLBA4404metHV（pNUN25）のいず
れかを０．０５の最終ＯＤ₆₀₀まで接種した。同時培養は、１６時間／８時間の明／暗周期の下、２７℃で２日間温置した。次いで、葉盤を、１mg/L ＢＡＰ及び１００mg/Lカナマイシンを追加した、固化したＭＳ２０培地に移した。カナマ
イシン耐性シュートは、出現する都度除去し、選択培地で更に培養した。LBA440
4met（pNUN25）を用いたときは、約１００個の葉盤から約６０個の形質転換した
シュートが単離され、LBA4404metHV（pNUN25）を用いたときは、約１００個の葉
盤から約２２３個の形質転換シュートが単離された。

【００５７】このことより、ハイパービルレントＴｉプラスミドのvir遺伝子は、Jin ら（前掲）が原栄養性の背景で観察したのと同じ効果を、栄養要求性の背景でもなお
発揮すると結論づけることができる。

【００５８】実施例３：キュウリ（Cucumis sativa）のin planta形質転換遺伝子型がGu1665-Mのキュウリの種子を、７０％エタノール溶液中で１分間イ
ンキュベートした後、４％次亜塩素酸塩溶液中で１５分間インキュベートするこ
とによって、表面滅菌した。種子を、滅菌Ｈ₂Ｏ中で３回洗浄し、in vitroで植物体まで栽培した。無菌的に増殖させた細胞から２４の節間を採集し、LBA4404m
etHV（pNUN8）の細菌（メチオニン０．１mM、カナマイシン１００mg/L、ストレプトマイシン２５mg/L、及びテトラサイクリン２mg/Lを追加したＬＢ中で増殖）
を０．１の最終ＯＤ₆₀₀まで加えた、１０mlの液体ＭＳ２０中で３０分間インキュベートした。pNUN8は、pVDH99（説明については下記を参照されたい）に類似するＴ−ＤＮＡベクターであって、nptIIのキメラ性マーカー遺伝子を含むEcoRI
／XhoIＤＮＡフラグメントが、CaMV35S由来プロモーターとターミネーター配列との間のキメラ性ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼコーディング
領域を含むＤＮＡフラグメントに置き換えられている。節間を、細菌懸濁液から
除去し、過剰な細菌を、濾紙に素早く吸い取ることによって除去した。次に、接
種した節間を、再生のためのＭＳ２０固体培地に移した。

【００５９】次いで、健康そうな再生植物体を用いて、組織化学的染色によって、花中の細
菌の存在はもとより、花の部分でのβ−グルクロニダーゼ活性も立証した。アグ
ロバクテリアの存在を立証するため、ノトバイオート的に栽培した植物体からの
３０個の花を、それぞれ、ＬＢ１ml中でインキュベートした。２８例で、インキ
ュベーションの２〜３日後に細菌の増殖が観察された。

【００６０】また、Jefferson（1987）〔Plant Mol. Biol. Rep. 5(4): 387-405〕に従っ
て、β−グルクロニダーゼ活性について、花を組織化学的に染色した。少なくと
も６個の花で、これらの組織でのＧＵＳ活性、従ってＤＮＡ転移を示す青い斑点
が観察された。これらの植物体からの花粉を用いて、雌花を受粉させる。受粉し
た雌花から発生した種子を、ホスフィノトリシンを含む培地で発芽させて、形質
転換した植物体を得る。

【００６１】実施例４：タバコ（Nicotiana tabacum）のin planta形質転換無菌的に栽培したタバコの植物体（ＳＲ１）から、節間を単離し、LBA4404met
HV（pNUN8）細菌の懸濁液（ＯＤ₆₀₀＝０．０５／３０mlのＭＳ２０）中で１２０
分間温置した。次に、節間を、１０μMアセトシリンゴンを追加した固体ＭＳ２０培地に移した。in vitroで再生した植物体からの若い葉を、組織化学的ＧＵＳ
染色に付し、いくつかの葉で、異なる大きさの青い区域が観察された。染色され
た区域の大きさの相違は、その細胞系譜の前駆細胞にＴ−ＤＮＡが進入した、入
場時点を反映している可能性がある。再生植物体の葉は、葉盤を単離するための
出発材料として用い、これをＰＰＴを含む培地で培養して、トランスジェニック
シュート、及び最終的にはトランスジェニック植物を得た（Horsch et al., 198
4, Science 223:496-498が記載した方法による）。

【００６２】実施例５：トマト（Lycopersium esculentum）のin planta形質転換無菌的に栽培したトマトの植物体（Moneymaker）から、節間を単離し、LBA440
4metHV（pVDH99）細菌の懸濁液（ＯＤ₆₀₀＝０．０５／３０mlのＭＳ２０）中で１５分間温置した。pVDH99は、Van Cannytら〔1990, Mol. Gen. Genet. 220: 24
5-250〕が記載したような、３５ＳのＧＵＳイントロンのキメラ遺伝子と、キメラ性の選択できるCaMV35S-nptII遺伝子とを有するＴ−ＤＮＡを含むプラスミドである。このプラスミドは、細菌のカナマイシン抵抗性を更に含む。次に、節間
を、１０μMアセトシリンゴンを追加した固体ＭＳ２０培地に移した。in vitro で再生した植物体からの若い葉を、組織化学的ＧＵＳ染色に付し、いくつかの葉
で、異なる大きさの青い区域が観察された。染色された区域の大きさの相違は、
その細胞系譜の前駆細胞にＴ−ＤＮＡが進入した、進入時点を反映している可能
性がある。再生植物体の葉は、葉盤を単離するための出発材料として用い、これ
をカナマイシンを含む培地で培養して、トランスジェニックシュート、及び最終
的にはトランスジェニック植物を得た（McCormick et al., 1986, Plant Cell R
eports 5:81-84が記載した方法による）。

【００６３】実施例６：ネギ（Allium ampeloprasum）のin planta形質転換この目的のため、完全に成熟した野外栽培の植物体を用い、採集した。植物体
は、感染を低下させるため、３日間放置して乾燥させた。基底板を捕集し、（根
を完全に排除した）４片に切断し、次いで、７０％エタノール溶液に１分間浸漬
した後、２％ＮａＯＣｌ（市販の漂白剤）で２０分間処理する。この処理の後、
外植片を、減菌水で４回洗浄するが、洗浄工程の間に１０分の間隔を置く。

【００６４】これらの外植片を、誘導培地〔ＤＳマクロエレメント（Dustan & Short, 1978
, Sci. Hort. 112: 37-43）、ＭＳミクロエレメント（Murashige & Skoog, 1968
、上記を参照されたい）、ＦｅＥＤＴＡ、チアミン１０mg/L、ピリドキシン１mg
/L、ニコチン酸１mg/L、イノシトール１００mg/L、ショ糖３０g/L、イソペンテニルアデニン（２−ＩＰ）ＮＡＡ４mg/L、ＮＡＡ１．２５mg/L、寒天８g/L〕に移す。２，０００〜４，０００ルクスの光強度、２１℃での３〜４週間のイン
キュベーションの後、最初の幼植物が出現し、次いで、これをアグロバクテリウ
ムLBA4404metHV（pVDH99）の接種に用いる。そのためには、若い幼植物を、初め
の外植片から取り出し、この若い幼植物の基底部に切開を行った。この傷ついた
基底部を、約０．０１のＯＤ₆₀₀を有するアグロバクテリウム懸濁液に３０分間浸漬した。過剰なアグロバクテリウム懸濁液を、濾紙に吸い取ることによって素
早く除去してから、誘導培地に移す。接種した植物体は、不定植物体を発生し、
うちいくつかを、組織化学的ＧＵＳ染色によって試験して、推定されるトランス
ジェニック領域の存在を検証した。類似の不定幼植物を、成熟したネギの植物体
への過剰成長を許す培地（ＮＡＡを０．１mg/Lに、ショ糖を２０g/Lに減らした以外は、誘導培地に類似する）に移した。再生した成熟植物体から種子を採集し
、発芽させて、トランスジェニック植物を得た。トランスジェニック植物は、カ
ナマイシン含有培地で成長できるその能力によって認識される。トランスジェニ
ック植物は、更に、挿入されたＴ−ＤＮＡ配列のＰＣＲ検出によって確認した。

【００６５】実施例７：キュウリ（Cucumis sativa）からの胚性カルスのアグロバクテリウム
媒介形質転換キュウリの遺伝子型941687-Gからの胚性カルスを、記載のとおり〔Chee, P. (
1990) Hortscience 25 (7), 792-793〕発生させた。カルスは、ペトリ皿内で、ＭＳ３０2/0.5 2-4D/kin（ＭＳ塩〔Murashige & Skoog, 1968 Physiol. Plant.
15, 473-497〕；３０g/Lショ糖、２mg/L ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、及び０．５mg/Lカイネチンを追加）５ml中で１mm未満の小片に切断
した。このペトリ皿に、アグロバクテリウム・ツミファシエンスLBA4404metHV（
pTOK47）（pVDH99）の懸濁液を０．５の最終ＯＤ₆₀₀まで加えた。細菌を、メチオニン０．１mM、カナマイシン１００mg/L、ストレプトマイシン２５mg/L、及び
テトラサイクリン２mg/Lを追加したＬＢ１０ml中で、２８℃で２日間、振盪しつ
つ培養した。細菌を遠心分離によって採集し、ＭＳ３０2/0.5 2-4D/kin培地で洗
浄し、最初の密度まで再懸濁させた。

【００６６】暗所で２７℃での同時培養の４日後に、カルスを、液体ＭＳ３０2/0.5培地２５mlで２回洗浄し、カナマイシン１００mg/Lを追加した固体培地ＭＳ３０2/0.5 に平板播種し、暗所で２７℃で更にインキュベートした。２週間後、選ばれたカ
ルスを、Jefferson（1987）〔Plant Mol. Biol. Rep. 5(4): 387-405〕が記載し
たような組織化学的ＧＵＳ染色に付した。少なくとも５個のカルスで、ｐＶＤＨ
９９のＴ−ＤＮＡによって形質転換された細胞を示す、青い領域を視覚化するこ
とができた。選択培地で栽培したカルスの健康そうな領域を切り出し、カナマイ
シンなしの類似の培地に移して、再生させた。

【００６７】実施例８：栄養要求性アグロバクテリウム菌株によるニンジンプロトプラストの
形質転換 Dirksら（1996）〔R. Dirks, V. Sidorov, C. Tulmens 1996, Theor. Appl. G
enet. 93: 809-815〕に従って、ダウクス・カロタの変種（Daucus carrota var ）であるSytan B142の葉柄からニンジンプロトプラストを単離し、２，４−Ｄ０．１mg/L、及びゼアチン０．２mg/Lを追加したＣＰＰ−ＣＡ（カザアミノ酸を
省いたDirksら（1996）によるＣＰＰ培地）中に、８×１０⁵個/mlのプロトプラストの密度で再懸濁させた。プロトプラスト懸濁液１．５mlを含むペトリ皿４枚
を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404met（pNUN20）とともに（０
．０５の最終ＯＤ₆₀₀まで添加）、２７℃で２日間同時培養した。プロトプラスト培地には、抗生物質を全く加えなかった。細菌を採集し、洗浄してメチオニン
を除去してから、プロトプラストに加えた。

【００６８】 pNUN20は、キメラ性の選択できるnptII遺伝子と、β−サブユニットＨ⁺ＡＴＰ
アーゼに機能的に結合されたCaMV35Sプロモーターよりなるキメラ性遺伝子〔Shi
nozaki, K., Devo, H., Keto, A & Suginec, M. (1983) Gene 24, 147-155；EMB
L data base accesion number K00507〕とを有し、ノパリンシンターゼの遺伝子
ターミネーターが後続するＴ−ＤＮＡを含む、Ｔ−ＤＮＡベクターである。この
プラスミドは、Ｔ−ＤＮＡ境界の外に細菌性カナマイシン抵抗性遺伝子を更に含
む。

【００６９】２日後、アルギン酸塩１．５mlを各ペトリ皿に加え、プロトプラストを含むア
ルギン酸塩ディスクを、２，４−Ｄ０．１mg/L、及びゼアチン０．２mg/Lを追加したＣＰＰ−ＣＡ３mlに約１２日間浮かせてから、カナマイシン１００mg/Lを
加えた。ディスクを約２週間更にインキュベートした。次に、アルギン酸塩ディ
スクを、４０mMのクエン酸ナトリウムに溶解し、洗浄し、ＮＡＡ（ナフタレン酢
酸）０．１mg/L、及びゼアチン０．２mg/Lを追加したＣＰＰ−ＣＡ30/20 S/N５m
lに再懸濁させ、７５又は１００mg/Lのいずれかのカナマイシンを含有するナトリウム培地（２，４−Ｄ０．１mg/L、及びゼアチン０．２mg/Lを追加したＣＰＰ−ＣＡ30/20 S/N）平板播種した。選択培地上で健康に成長しているカルスを、それらが出現した都度、新鮮な選択培地に移した。約２８５の緑色のカナマイ
シン耐性であるカルスが、約４．８×１０⁶個のプロトプラストから得られた。これらのカルスを、クラフォラン２００mg/L、及びカナマイシン１００mg/Lを追
加したＢ５−０．１培地〔２，４−Ｄ０．１mg/Lを含有するGamborg, O., Mill
er, R., Ojima, K. (1968) Experimental Cell Research 50: 151-158によるＢ５培地〕に移して、胚性カルスを誘導し、成長レギュレーターなしのＢ５培地を
用いて、植物体を再生させた。

【００７０】実施例９：栄養要求性アグロバクテリア菌株によるチコリー（Cichorium sp.）の形質転換チコリーの種子を、（２％次亜塩素酸ナトリウム中で）表面滅菌し、洗浄し、
ＭＳ２０培地上で発芽させ、２７℃で４〜８週間栽培した。直径約４〜６mmの葉
盤を、ＢＡＰ１mg/L、ＮＡＡ０．２mg/L、及びメチオニン０．０１mg/Lを追加
したＭＳＮ２０培地（ＭＳ塩〔Murashige & Skoog, 前掲〕、Nitsch及びNitsch （1965）〔Ann. Phys. Veg. 7, 251-266〕によるビタミン類、グリシン２．０mg
/L、ショ糖２０g/L pH５．８、寒天８g/L）に、葉盤の背軸表面が培地に接触す
るように注意しつつ、移した。１日後、Ｔ−ＤＮＡベクターであるpNUN7を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404metの細菌懸濁液（ＯＤ₆₀₀：０．０１〜０．１）に２０分間、葉盤を浸漬した。pNUN7は、Van Canneytら〔前掲
〕が記載したとおりのCAMV35Sプロモーター−ＧＵＳイントロンのキメラ遺伝子と、キメラ性の選択できるnptII遺伝子とを有するＴ−ＤＮＡを含むプラスミドである。このプラスミドは、細菌で発現されるカナマイシン抵抗性遺伝子を更に
含む。

【００７１】葉盤を、ＢＡＰ１mg/L、ＮＡＡ０．２mg/Lを追加したＭＳＮ２０上で更に２
日間インキュベートし、次いで、液体のＭＳ２０培地で洗浄した。洗浄した葉盤
を、ＢＡＰ１mg/L、ＮＡＡ０．２mg/L、及びカナマイシン１００mg/Lを追加し
た選択培地のＭＮＳ２０上で（１４日ごとに新鮮な選択培地に移しつつ）更にイ
ンキュベートした。約５週間後に、選択培地をＢＡＰ０．１〜１mg/L、及びカナマイシン１００mg/Lを有するＭＳ２０に変えた。

【００７２】約２０のカナマイシン耐性形質転換植物体が、４８枚の葉片から発生した。

【００７３】実施例１０：DSM6009トウモロコシプロトプラストのアグロバクテリウム媒介形質転換遺伝子型DSM6009のトウモロコシプロトプラストを、ヨーロッパ特許第０４６９２７３Ａ−１号公報に従って調製し、ヘルパープラスミドpAL4404及びＴ −ＤＮＡベクターpGSV71を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404m
etとともに２〜３日同時培養した。pGSV71は、ラクタマーゼ遺伝子の不在、及び
SEQ ID NO:1の配列を特徴とするＴ−ＤＮＡの存在が異なる、pGSC1700〔Corneli
ssen & Vandewiele, 1989, Nucl. Acids Res. 17: 833〕から誘導されたＴ−ＤＮＡベクターである。pGVS71は、CaMV35Sプロモーターとノパリンシンターゼ遺伝子の３′末端とに機能的に結合された、選択できるキメラ性barマーカー遺伝子を含む。２〜３日後、プロトプラストを、Ｗ５緩衝液で洗浄し、ヨーロッパ特
許第０４６９２７３Ａ−１号公報に従って、更に培養した。形質転換細胞の
選択、及び形質転換したトウモロコシ植物体への再生は、ヨーロッパ特許第０
４６９２７３Ａ−１号公報に記載されたとおりである。ホスフィノトリシン耐
性であるトウモロコシ植物体を得、導入遺伝子の存在を、ポリメラーゼ連鎖反応
及びサザン分析によって確認した。

【００７４】実施例１１：栄養要求性アグロバクテリウム菌株ATHVade,hisの単離及び評価２種類の栄養素に対して栄養要求性であるアグロバクテリア菌株を、菌株ＡＴ
ＨＶ〔Lazo et al., 1991, Biotechnology 9:963-967では菌株AGL0として記載〕
から出発して、下記のプロトコルに従うことによって選択した。

【００７５】菌株ATHVを、１００μg/mlリファンピン（Ｒｉｆ）を追加したＬＢ中で一晩栽
培した。この細胞培養体１mlを用いて、ＬＢ２０ml／Ｒｉｆ１００μgを入れたフラスコに接種し、３０℃で４時間（振盪しつつ）増殖させた。この培養体１０
mlを２５４nmＵＶ光で２〜４時間照明した。ＵＶ照明した培養体１００μlを、寒天で固化したＬＢ／Ｒｉｆ培地に平板播種し、暗所で３０℃で２〜３日間温置
した。得られたコロニーを、ともにリファンピン１００μg/mlを追加した最少培
地（Ｍ９；実施例１を参照されたい）及びＬＢ培地にレプリカ平板播種した。最
少培地で成長できなかったコロニーを、単離し、栄養要求性について分析した。
ATHVade,hisと名付けた一菌株が特定されたが、これは、成長にはアデニンの添加を必要とし、加えて、ヒスチジンを加えたときに、はるかに良好に増殖した（
表１を参照されたい）。外から供給された栄養素に対するこの二重の要求性は、
このアグロバクテリウム菌株のはるかに優れた成長制御を許す。

【００７６】

【表１】

【００７７】菌株ATHVade,hisが、依然としてＴ−ＤＮＡ転移ができるか否かを解析するため、Ｔ−ＤＮＡベクターpNUN7（実施例９を参照されたい）を含む誘導株を用いて、ニコチアナ・タバクム及びニコチアナ・シルベストリスの葉盤を、同じＴ−Ｄ
ＮＡベクターを含む野生型ATHV菌株と比較して、感染させた。ニコチアナ・タバクムでは、ATHV（pNUN7）の接種後に、約１１５の形質転換シュートが約５０の葉の分節から得られたが、ATHVade,his（pNUN7)の接種後は、約１１２の形質転換シュートが、約５０の葉の分節から得られた。ニコチアナ・シルベストリスで
は、ATHV（pNUN7）の接種後に、約１７の形質転換シュートが約５０の葉の分節から得られたが、ATHVade,his（pNUN7)の接種後は、約４０の形質転換シュートが、約５０の葉の分節から得られた。

【００７８】実施例１２：ペチュニア（Petunia hybrida）のin planta形質転換節間又はシュート先端（最初の３〜４mmの葉を有する節の下で切断した）のい
ずれかを、無菌的に栽培した植物体から単離し、アグロバクテリウムLBA4404met
HV（pNUN7）の細胞懸濁液とともに約７〜１０分間インキュベートし、吸い取って乾燥させ、前記実施例に記載したとおりの植物培地で培養した。シュート先端
は、アグロバクテリアを有するウエルに、浸漬せずに、切断端を入れた。異なる
時点での、外植片及び再生植物体の内部検査は、少なくとも維管束に付随する、
ＧＵＳの発現を明らかにした。

【００７９】 in vitro培養の４週間後の植物体の異なる部分で、細菌の存在を推計した。そ
のために、異なる葉の部分を取り出し、ＬＢ１００μlを入れた管内で摩砕した。沈澱した後、上清２０μlを、リファンピンを含むＬＢ培地に平板播種した。結果を表２に要約する。

【００８０】

【表２】

【００８１】試験したすべての植物体が、Ｒｉｆ耐性アグロバクテリアを含み、試験したサ
ンプルの約７５％が、アグロバクテリアを含んでいた。

【００８２】実施例１３：ブラッシカ・ナプスBrassica napusの形質転換の際の、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの菌株LBA4404HVとのLBA4404metHVの形質転換効率の
比較ブラッシカ・ナプスBrassica napusの「Topas」の小胞子培養体から得られた胚
の形質転換の際の、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのLBA4404metHV誘導体（キメラ性β−グルクロニダーゼ遺伝子を有するＴ−ＤＮＡベクターを含む）
の形質転換効率を、類似のＴ−ＤＮＡベクターを含むLBA4404HV及びGV3101の形質転換効率と比較した。形質転換の際の事象の順序は、下記のとおり要約するこ
とができる：

【００８３】ａ．ブラッシカ・ナプスの小胞子からの細胞培養体の確立ｂ．体細胞胚の発生ｃ．Ｔ−ＤＮＡベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株とのこれらの胚の同時培養ｄ．同時培養した胚の「胚軸」期までの成長、及び二次胚形成の誘導ｅ．選択体制への二次胚の導入ｆ．β−グルクロニダーゼ発現についての生存胚の記録

【００８４】キメラ性β−グルクロニダーゼ遺伝子を有するＴ−ＤＮＡベクターを含む、LB
A4404metHVを用いて、ブラッシカ・ナプス胚を形質転換したとき、得られた二次胚の約８０％は、ＧＵＳ＋領域を有したのに対し、類似のＴ−ＤＮＡベクターを
含むLBA4404HVと同時培養したときは、二次胚の５％のみが、そのような斑点を示したにすぎない。より定量的なアッセイでは、キメラ性β−グルクロニダーゼ
遺伝子を有するＴ−ＤＮＡベクターをそれぞれ含む、LBA4404metHV、LBA4404HV 及びGV3101の形質転換効率を比較した。LBA4404metHVによる、より効率的な形質
転換を立証する結果を、表３に要約する。

【００８５】

【表３】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 2B030 CA06 CA14 CA17 CD02 CD03 CD05 CD07 CD09 CD10 CD12 CD14 CD15 CD17 4B024 AA08 AA20 BA79 CA02 DA01 EA04 FA00 FA20 GA11 GA17 GA19 GA21 GA27 4B065 AA11X AA88X AB01 AC20 BA02 BA10 BA17 BA25 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくともいくつかのその細胞のゲノムに組み込まれた外来
ＤＮＡフラグメントを含むトランスジェニック植物を生産する方法であって、（１）少なくとも一つのＴ−ＤＮＡ境界配列に作動可能に結合された問題のＤＮ
Ａを宿す、栄養要求性アグロバクテリウム菌株に全身的に感染した植物を与える
工程と；（２）該全身的に感染した植物から単離した単一細胞又は一群の細胞から、トラ
ンスジェニック植物を生成する工程とを含む方法。
【請求項２】該栄養要求性アグロバクテリウム菌株に全身的に感染した該
植物を、該栄養要求性アグロバクテリウム菌株を接種した外植組織から再生する
、請求項１記載の方法。
【請求項３】該栄養要求性アグロバクテリウム菌株に全身的に感染した該
植物の再生を、該栄養要求性アグロバクテリウム菌株に対して殺菌又は静菌効果
を有する化合物の不在下での植物再生培地で実施する、請求項２記載の方法。
【請求項４】該トランスジェニック植物を、該全身的に感染した植物から
単離したプロトプラストのin vitro再生によって生成する、請求項１〜３のいず
れか１項記載の方法。
【請求項５】該トランスジェニック植物を、該全身的に感染した植物から
単離した外植組織のin vitro再生によって生成する、請求項１〜３のいずれか１
項記載の方法。
【請求項６】該トランスジェニック植物を、該全身的に感染した植物の花
粉粒のin vitro再生によって生成する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法
。
【請求項７】該トランスジェニック植物を、該全身的に感染した植物の形
質転換した後代種子の発芽によって生成する、請求項１〜３のいずれか１項記載
の方法。
【請求項８】形質転換した植物を生成する工程の前に、所要栄養素を、全
身的に感染した植物の少なくとも一部に与える工程を更に含む、請求項１〜７の
いずれか１項記載の方法。
【請求項９】該所要栄養素を、該全身的に感染した植物の花序分裂組織又
は未成熟花序に与える、請求項８記載の方法。
【請求項１０】該アグロバクテリウムが、システインもしくはメチオニン
、又はアデニン及びヒスチジンに対して栄養要求性である、請求項１〜９のいず
れか１項記載の方法。
【請求項１１】該アグロバクテリウムが、LBA4404met又はATHVade,hisである、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】細菌株LBA4404met。
【請求項１３】細菌株ATHVade,his
【請求項１４】植物のアグロバクテリウム媒介形質転換の際の、メチオニ
ンもしくはシステイン、又はアデニン及びヒスチジンに対して栄養要求性である
アグロバクテリウム菌株の使用。
【請求項１５】テンサイからのカルスのアグロバクテリウム媒介形質転換
の際の、システインもしくはメチオニン、又はアデニン及びヒスチジンに対して
栄養要求性であるアグロバクテリア菌株の使用。
【請求項１６】トウモロコシプロトプラストのアグロバクテリウム媒介形
質転換の際の、システインもしくはメチオニン、又はアデニン及びヒスチジンに
対して栄養要求性であるアグロバクテリウム菌株の使用。
【請求項１７】該栄養要求性アグロバクテリウムが、LBA4404met、ATHVad
e,his、及びそれらの誘導種の群から選ばれる、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の使用。