JP2001513324A - エルウィニア・アミローボラ由来の過敏感反応エリシターおよびその使用 - Google Patents
エルウィニア・アミローボラ由来の過敏感反応エリシターおよびその使用Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、植物において過敏感反応を誘起する単離されたタンパク質またはポリペプチドに加え、過敏感反応を誘起するタンパク質またはポリペプチドをコードしている単離されたDNA分子に関する。この単離されたタンパク質またはポリペプチドならびに単離されたDNA分子を用いて、植物に病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または植物体上の昆虫を防除することができる。これは、非感染型の過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドを、病気抵抗性を付与し、植物生育を強化し、および／または植物上または植物種子から生育させた植物上で昆虫を防除するのに効果的な条件下で、植物または植物種子に適用することによって達成することができる。または過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドをコードしているDNA分子で形質転換されたトランスジェニック植物または植物種子を提供し、かつトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物種子から得た植物を、病気抵抗性を付与し、植物生育を強化し、および／または植物上または植物種子から生育させた植物上で昆虫を防除するのに効果的な条件下で生育する。
Description
【０００１】 本発明は、1997年8月6日に提出された米国仮特許出願第60/055,108号の優先権
を主張するものである。
を主張するものである。
【０００２】発明の分野 本発明はエルウィニア・アミローボラ(Erwinia amylovora)由来の過敏感反応 エリシターおよびその使用に関する。
【０００３】発明の背景 病原菌とその植物宿主の間の相互作用は、一般に次の２つの範疇に収まる：(1
)適合性（病原菌−宿主）、宿主植物における、細胞内細菌増殖、徴候発現およ び病気の発症につながる；および(2)不適合性（病原菌−非宿主）、過敏感反応 をもたらし、病気の徴候の進行を伴うことなく、特定の型の不適合性の相互作用
が生じる。宿主植物との適合性のある相互作用の間には、細菌数は劇的に増加し
、かつ進行性の徴候が生じる。不適合性の相互作用の間には、細菌数は増加せず
、かつ進行性の徴候も生じない。
)適合性（病原菌−宿主）、宿主植物における、細胞内細菌増殖、徴候発現およ び病気の発症につながる；および(2)不適合性（病原菌−非宿主）、過敏感反応 をもたらし、病気の徴候の進行を伴うことなく、特定の型の不適合性の相互作用
が生じる。宿主植物との適合性のある相互作用の間には、細菌数は劇的に増加し
、かつ進行性の徴候が生じる。不適合性の相互作用の間には、細菌数は増加せず
、かつ進行性の徴候も生じない。
【０００４】 過敏感反応は、多くの病原菌に対する植物の能動的防御に関連している急性の
局所的壊死である（Kiraly, Z.、「侵略者によって惹起された防御：過敏感（“
Defenses Triggered by the Invader:Hypersensitivity”）」、201〜224頁、Pl ant Disease:An Advanced Treatise 、第5巻、J.G. HoesfallとE.B. Cowlingの編
集、アカデミックプレス社、ニューヨーク、1980年；Klement, Z.、「過敏感(“
Hypersensitivity”)」、149〜177頁、Phytopathogenic Prokaryotes、第2巻、M
.S. MountとG.H. Lacyの編集、アカデミックプレス社、ニューヨーク、1982年）
。細菌によって誘起された過敏感反応は、高濃度の（≧107細胞／ml）シュード モナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)またはエルウィニア・アミローボラ
(Erwinia amylovora)のような宿主範囲が限定された病原菌が非宿主植物の葉へ と浸潤する場合に、組織の崩壊として容易に認められる（低濃度の接種では単離
された植物細胞においてのみ壊死が生じる）（Klement, Z.、「植物病原菌シュ ードモナスの病原性の迅速な検出（“Rapid Detection of Pathogenicity of Ph
ytopathogenic Pseudomonads”）」、Nature、199:299-300；Klementら、「タバ
コ葉における植物病原菌によって誘導された過敏感反応（“Hypersensitive Rea
ction Induced by Phytopathogenic Bacteria in the Tabacco Leaf”）」、Phy topathology 、54:474-477(1963)；Turnerら、「過敏感反応に関連した植物と細 菌細胞の間の量的関係（“The Quantitative Relation Between Plant and Bact
erial Cells Involved in the Hypersensitive Reaction”）」、Phytopatholog y 、64:885-890(1974)；Klement, Z.、「過敏感（Hypersensitivity）」、Phytop athogenic Prokaryotes 、149〜177頁、第2巻、M.S.MountとG.H.Lacyの編集、ア カデミックプレス社、ニューヨーク、1982年）。非宿主において過敏感反応を誘
起する能力と宿主において病原性となる能力は関連しているように見える。Klem
ent, Z.の論文（「過敏感（Hypersensitivity）」、Phytopathogenic Prokaryot es 、149〜177頁、第2巻、M.S.MountとG.H.Lacyの編集、アカデミックプレス社、
ニューヨーク）に記されたように、これらの病原菌は更に、適合宿主との相互作
用において、遅延型ではあるが生理学的に類似した壊死も生じる。更に過敏感反
応または病原性を生じる能力は、hrpと称される共通の遺伝子セットに依存して いる（Lindgren, P.B.ら、「マメ科植物の病原性および非宿主植物の過敏感を制
御するシュードモナス・シリンガエ病原型ファセオリコラの遺伝子クラスター（
“Gene Cluster of Pseudomonas syringae pv.'phaseolicola' Controls Pathog
enicity of Bean Plants and Hypersensitivity on Nonhost Plants”）」、J. Bacteriol. 、168:512-22(1986)；Willis, D.K.ら、「植物病原菌のhrp遺伝子（ “hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria”）」、Mol.Plant-Microbe Interac t. 、4:132-138(1991)）。結論としては、過敏感反応は、植物防御の性質および 細菌の病原性の基本の両方についての手がかりとなり得る。
局所的壊死である（Kiraly, Z.、「侵略者によって惹起された防御：過敏感（“
Defenses Triggered by the Invader:Hypersensitivity”）」、201〜224頁、Pl ant Disease:An Advanced Treatise 、第5巻、J.G. HoesfallとE.B. Cowlingの編
集、アカデミックプレス社、ニューヨーク、1980年；Klement, Z.、「過敏感(“
Hypersensitivity”)」、149〜177頁、Phytopathogenic Prokaryotes、第2巻、M
.S. MountとG.H. Lacyの編集、アカデミックプレス社、ニューヨーク、1982年）
。細菌によって誘起された過敏感反応は、高濃度の（≧107細胞／ml）シュード モナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)またはエルウィニア・アミローボラ
(Erwinia amylovora)のような宿主範囲が限定された病原菌が非宿主植物の葉へ と浸潤する場合に、組織の崩壊として容易に認められる（低濃度の接種では単離
された植物細胞においてのみ壊死が生じる）（Klement, Z.、「植物病原菌シュ ードモナスの病原性の迅速な検出（“Rapid Detection of Pathogenicity of Ph
ytopathogenic Pseudomonads”）」、Nature、199:299-300；Klementら、「タバ
コ葉における植物病原菌によって誘導された過敏感反応（“Hypersensitive Rea
ction Induced by Phytopathogenic Bacteria in the Tabacco Leaf”）」、Phy topathology 、54:474-477(1963)；Turnerら、「過敏感反応に関連した植物と細 菌細胞の間の量的関係（“The Quantitative Relation Between Plant and Bact
erial Cells Involved in the Hypersensitive Reaction”）」、Phytopatholog y 、64:885-890(1974)；Klement, Z.、「過敏感（Hypersensitivity）」、Phytop athogenic Prokaryotes 、149〜177頁、第2巻、M.S.MountとG.H.Lacyの編集、ア カデミックプレス社、ニューヨーク、1982年）。非宿主において過敏感反応を誘
起する能力と宿主において病原性となる能力は関連しているように見える。Klem
ent, Z.の論文（「過敏感（Hypersensitivity）」、Phytopathogenic Prokaryot es 、149〜177頁、第2巻、M.S.MountとG.H.Lacyの編集、アカデミックプレス社、
ニューヨーク）に記されたように、これらの病原菌は更に、適合宿主との相互作
用において、遅延型ではあるが生理学的に類似した壊死も生じる。更に過敏感反
応または病原性を生じる能力は、hrpと称される共通の遺伝子セットに依存して いる（Lindgren, P.B.ら、「マメ科植物の病原性および非宿主植物の過敏感を制
御するシュードモナス・シリンガエ病原型ファセオリコラの遺伝子クラスター（
“Gene Cluster of Pseudomonas syringae pv.'phaseolicola' Controls Pathog
enicity of Bean Plants and Hypersensitivity on Nonhost Plants”）」、J. Bacteriol. 、168:512-22(1986)；Willis, D.K.ら、「植物病原菌のhrp遺伝子（ “hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria”）」、Mol.Plant-Microbe Interac t. 、4:132-138(1991)）。結論としては、過敏感反応は、植物防御の性質および 細菌の病原性の基本の両方についての手がかりとなり得る。
【０００５】 hrp遺伝子は、グラム陰性の植物病原菌に広範に存在し、ここでこれらはクラ スター化され、保存され、一部は相互交換可能である（Willis, D.K.ら、「植物
病原菌のhrp遺伝子(hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria)」、Mol.Plant-Mi crobe Interact. 、4:132-138(1991)；Bonas, U.、「植物病原菌のhrp遺伝子(hrp
Genes of Phytopathogenic Bacteria)」、79〜98頁、Current Topics in Micro biology and Immunology:Bacterial Pathogenesis of Plants and Animal-Molec ular and Cell Mechanisms 、J.L. Dangle編集、スプリンガー−ベルラグ社、ベ ルリン(1994)）。いくつかのhrp遺伝子は、エルシニア、シゲラ、およびサルモ ネラ種が動物の病気に必須のタンパク質を分泌する際に使用するものに類似した
タンパク質分泌経路の成分をコードしている（Van Gijsegemら、「植物と動物の
病原菌の間の病原性の決定因子の発展的保存（“Evolutionary Conservation of
Pathogenicity Determinats Among Plant and Animal Pathogenic Bacteria” ）」、Trends Microbiol.、1:175-180(1993)）。E.アミローボラ、P.シリンガエ
およびP.ソラナセアラム(P. solanacearum)において、hrp遺伝子は、過敏正反応
のグリシンが豊富なタンパク質エリシターの産生と分泌を制御することが示され
た（He, S.Y.ら、「シュードモナス・シリンガエ病原型シリンガエ・ハーピンPs s ：Hrp経路によって分泌され、植物の過敏感反応を誘起するタンパク質（“Pseu
domonas Syringae pv. Syringae HarpinPss : a Protein that is Secreted via
the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants”）」
、Cell、73:1255-1266(1993)；Wei, Z.H.ら、「エルウィニア・アミローボラのH
rpIは、ハーピン分泌に機能し、かつ新たなタンパク質ファミリーである(HrpI o
f Erwinia amylovora Functions in Secretion of Harpin and is a Member of
a New Protein Family)」、J.Bacteriol.、175:7958-7967(1993)；Arlat, M.ら 、「ペチュニアの特定の遺伝子型において過敏感様反応を誘起するタンパク質で
あるPopA1は、シュードモナス・ソラナセアラムのHrp経路によって分泌される(P
opA1, a Protein Which Induces a Hypersensitive-like Response on Specific
Petunia Genotypes, is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solan
acearum)」、EMBO J.、13:543-553(1994)）。
病原菌のhrp遺伝子(hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria)」、Mol.Plant-Mi crobe Interact. 、4:132-138(1991)；Bonas, U.、「植物病原菌のhrp遺伝子(hrp
Genes of Phytopathogenic Bacteria)」、79〜98頁、Current Topics in Micro biology and Immunology:Bacterial Pathogenesis of Plants and Animal-Molec ular and Cell Mechanisms 、J.L. Dangle編集、スプリンガー−ベルラグ社、ベ ルリン(1994)）。いくつかのhrp遺伝子は、エルシニア、シゲラ、およびサルモ ネラ種が動物の病気に必須のタンパク質を分泌する際に使用するものに類似した
タンパク質分泌経路の成分をコードしている（Van Gijsegemら、「植物と動物の
病原菌の間の病原性の決定因子の発展的保存（“Evolutionary Conservation of
Pathogenicity Determinats Among Plant and Animal Pathogenic Bacteria” ）」、Trends Microbiol.、1:175-180(1993)）。E.アミローボラ、P.シリンガエ
およびP.ソラナセアラム(P. solanacearum)において、hrp遺伝子は、過敏正反応
のグリシンが豊富なタンパク質エリシターの産生と分泌を制御することが示され
た（He, S.Y.ら、「シュードモナス・シリンガエ病原型シリンガエ・ハーピンPs s ：Hrp経路によって分泌され、植物の過敏感反応を誘起するタンパク質（“Pseu
domonas Syringae pv. Syringae HarpinPss : a Protein that is Secreted via
the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants”）」
、Cell、73:1255-1266(1993)；Wei, Z.H.ら、「エルウィニア・アミローボラのH
rpIは、ハーピン分泌に機能し、かつ新たなタンパク質ファミリーである(HrpI o
f Erwinia amylovora Functions in Secretion of Harpin and is a Member of
a New Protein Family)」、J.Bacteriol.、175:7958-7967(1993)；Arlat, M.ら 、「ペチュニアの特定の遺伝子型において過敏感様反応を誘起するタンパク質で
あるPopA1は、シュードモナス・ソラナセアラムのHrp経路によって分泌される(P
opA1, a Protein Which Induces a Hypersensitive-like Response on Specific
Petunia Genotypes, is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solan
acearum)」、EMBO J.、13:543-553(1994)）。
【０００６】 これらのタンパク質は最初に、バラ科の植物日焼けを引き起こす細菌であるE.
アミローボラEa321において発見され、ハーピンと称された（Wei, Z.M.ら、「植
物病原菌エルウィニア・アミローボラによって産生される過敏感反応エリシター
であるハーピン(Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced
by the Plant Pathogen Erwinia amylovora)」、Science、257:85-88(1992)）。
hrpN遺伝子をコードしている変異は、E.アミローボラが非宿主であるタバコの葉
において過敏感反応を誘起し、かつ非常に罹病性であるナシ果実において病気の
徴候を刺激するためにハーピンが必要とされることを明らかにした。P.ソラナセ
アラムGMI1000 PopA1タンパク質は、同様の生理的特性を有し、同じくこの菌株 の宿主ではないタバコの葉において過敏感反応を誘起する（Arlatら、「ペチュ ニアの特定の遺伝子型において過敏感様反応を誘起するタンパク質であるPopA1 は、シュードモナス・ソラナセアラムのHrp経路によって分泌される」、EMBO J. 、13:543-53(1994)）。しかし、P.ソラナセアラムpopA変異株は、依然タバコに おいて過敏感反応を誘起し、かつトマトにおいて病気を刺激する。従って、これ
らのグリシンが豊富な過敏感反応エリシターの役割は、グラム陰性植物病原菌に
おいて広範に変動し得る。
アミローボラEa321において発見され、ハーピンと称された（Wei, Z.M.ら、「植
物病原菌エルウィニア・アミローボラによって産生される過敏感反応エリシター
であるハーピン(Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced
by the Plant Pathogen Erwinia amylovora)」、Science、257:85-88(1992)）。
hrpN遺伝子をコードしている変異は、E.アミローボラが非宿主であるタバコの葉
において過敏感反応を誘起し、かつ非常に罹病性であるナシ果実において病気の
徴候を刺激するためにハーピンが必要とされることを明らかにした。P.ソラナセ
アラムGMI1000 PopA1タンパク質は、同様の生理的特性を有し、同じくこの菌株 の宿主ではないタバコの葉において過敏感反応を誘起する（Arlatら、「ペチュ ニアの特定の遺伝子型において過敏感様反応を誘起するタンパク質であるPopA1 は、シュードモナス・ソラナセアラムのHrp経路によって分泌される」、EMBO J. 、13:543-53(1994)）。しかし、P.ソラナセアラムpopA変異株は、依然タバコに おいて過敏感反応を誘起し、かつトマトにおいて病気を刺激する。従って、これ
らのグリシンが豊富な過敏感反応エリシターの役割は、グラム陰性植物病原菌に
おいて広範に変動し得る。
【０００７】 別の植物病原性の過敏感反応のエリシターが、単離され、クローニングされ、
かつ配列決定されている。これらは以下を含む：エルウィニア・クリサンセミ(E
ewinia chrysanthemi)（Bauerら、「エルウィニア・クリサンセミのハーピンEch ：腐朽病原菌(Erwinia chrysanthemi HarpinEch : Soft-Rot Pathogenesis)」、 MPMI 、8(4):484-91(1995)；エルウィニア・カロトボーラ(Erwinia carotovora) （Cuiら、「エルウィニア・カロトボーラ亜種カロトボーラ菌株Ecc71のRsmA-変 異株は、タバコの葉でhrpNEccを過剰発現し、過敏感反応様反応を誘起する(The
RsmA- Mutants of Erwinia carotovora subsp. carotovora Strain Ecc71 Overe
xpress hrpNEcc and Elicit a Hypersensitive Reaction-like Response in Tab
acco Leaves)」、MPMI、9(7):565-73(1966)；エルウィニア・ステワルティイ(Er
winia stewartii)（Ahmadら、「ハーピンはエルウィニア・ステワルティイのト ウモロコシに対する病原性には不要である(Harpin is not Necessary for the P
athogenicity of Erwinia stewartii)」、8th Int'l Cong. Molec. Plant-Micro b. Inter 、1996年7月14-19日、およびAhmadら、「ハーピンはエルウィニア・ス テワルチのトウモロコシに対する病原性には不要である(Harpin is not Necessa
ry for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize)」、Ann.Mtg.AmPhy topath.Soc. 、1996年7月27-31日）；および、シュードモナス・シリンガエ病原 型シリンガエ（コーネル研究財団(Cornell Research Foundation, Inc.)に付与 された国際公開公報第94/26782号））。
かつ配列決定されている。これらは以下を含む：エルウィニア・クリサンセミ(E
ewinia chrysanthemi)（Bauerら、「エルウィニア・クリサンセミのハーピンEch ：腐朽病原菌(Erwinia chrysanthemi HarpinEch : Soft-Rot Pathogenesis)」、 MPMI 、8(4):484-91(1995)；エルウィニア・カロトボーラ(Erwinia carotovora) （Cuiら、「エルウィニア・カロトボーラ亜種カロトボーラ菌株Ecc71のRsmA-変 異株は、タバコの葉でhrpNEccを過剰発現し、過敏感反応様反応を誘起する(The
RsmA- Mutants of Erwinia carotovora subsp. carotovora Strain Ecc71 Overe
xpress hrpNEcc and Elicit a Hypersensitive Reaction-like Response in Tab
acco Leaves)」、MPMI、9(7):565-73(1966)；エルウィニア・ステワルティイ(Er
winia stewartii)（Ahmadら、「ハーピンはエルウィニア・ステワルティイのト ウモロコシに対する病原性には不要である(Harpin is not Necessary for the P
athogenicity of Erwinia stewartii)」、8th Int'l Cong. Molec. Plant-Micro b. Inter 、1996年7月14-19日、およびAhmadら、「ハーピンはエルウィニア・ス テワルチのトウモロコシに対する病原性には不要である(Harpin is not Necessa
ry for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize)」、Ann.Mtg.AmPhy topath.Soc. 、1996年7月27-31日）；および、シュードモナス・シリンガエ病原 型シリンガエ（コーネル研究財団(Cornell Research Foundation, Inc.)に付与 された国際公開公報第94/26782号））。
【０００８】 本発明は更に、植物病原体からの過敏感反応エリシターのタンパク質またはポ
リペプチドを同定し、クローニングし、かつ配列決定する点で更なる進歩がある
。
リペプチドを同定し、クローニングし、かつ配列決定する点で更なる進歩がある
。
【０００９】発明の概要 本発明は、植物において過敏感反応を誘起する単離されたタンパク質またはポ
リペプチド、更には過敏感反応を誘起するタンパク質またはポリペプチドをコー
ドしている単離されたDNA分子に関する。
リペプチド、更には過敏感反応を誘起するタンパク質またはポリペプチドをコー
ドしている単離されたDNA分子に関する。
【００１０】 過敏感反応を誘起するタンパク質またはポリペプチドを使用して、植物に病気
抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または昆虫を防除することがで
きる。このことは、非感染型の過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプ
チドを、病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または植物上また
は植物種子から生育させた植物上で昆虫を防除するのに有効な条件下で、植物ま
たは植物種子に適用することに関する。
抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または昆虫を防除することがで
きる。このことは、非感染型の過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプ
チドを、病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または植物上また
は植物種子から生育させた植物上で昆虫を防除するのに有効な条件下で、植物ま
たは植物種子に適用することに関する。
【００１１】 病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または植物上で昆虫を防
除するために過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドを植物体また
は植物種子に適用する代わりに、トランスジェニック植物または植物種子を利用
することができる。トランスジェニック植物を利用する場合は、これは過敏感反
応エリシタータンパク質またはポリペプチドをコードしているDNAで形質転換さ れたトランスジェニック植物を提供すること、および病気抵抗性を付与し、植物
の生育を強化し、および／または植物上または植物種子から生育した植物におい
て昆虫を防除するのに有効な条件下で植物を生育することに関連している。また
は、過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドをコードしているDNA 分子で形質転換されたトランスジェニック植物種子を提供し、土壌中に植えるこ
とができる。その後植物は、病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および
／または植物上または植物種子から生育した植物上の昆虫を防除するのに有効な
条件下で繁殖される。
除するために過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドを植物体また
は植物種子に適用する代わりに、トランスジェニック植物または植物種子を利用
することができる。トランスジェニック植物を利用する場合は、これは過敏感反
応エリシタータンパク質またはポリペプチドをコードしているDNAで形質転換さ れたトランスジェニック植物を提供すること、および病気抵抗性を付与し、植物
の生育を強化し、および／または植物上または植物種子から生育した植物におい
て昆虫を防除するのに有効な条件下で植物を生育することに関連している。また
は、過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドをコードしているDNA 分子で形質転換されたトランスジェニック植物種子を提供し、土壌中に植えるこ
とができる。その後植物は、病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および
／または植物上または植物種子から生育した植物上の昆虫を防除するのに有効な
条件下で繁殖される。
【００１２】発明の詳細な説明 本発明は、下記の配列番号：1のヌクレオチド配列を有する単離されたDNA分子
に関する。
に関する。
【００１３】
【００１４】 ジェンバンク(GenBank)アクセッション番号U94513を参照のこと。本発明のこ の単離されたDNA分子は、下記の配列番号：2のアミノ酸配列を有する、過敏感反
応エリシタータンパク質またはポリペプチドをコードしている。
応エリシタータンパク質またはポリペプチドをコードしている。
【００１５】
【００１６】 このタンパク質またはポリペプチドは、酸性で、グリシンおよびセリンが豊富
であり、システインが含まれていない。さらにこれは熱安定性であり、プロテア
ーゼ感受性があり、かつ植物の代謝阻害剤によって抑制される。本発明のタンパ
ク質またはポリペプチドの予想される分子量は、約4.5kDaである。
であり、システインが含まれていない。さらにこれは熱安定性であり、プロテア
ーゼ感受性があり、かつ植物の代謝阻害剤によって抑制される。本発明のタンパ
ク質またはポリペプチドの予想される分子量は、約4.5kDaである。
【００１７】 前述の過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質の断片も、本発明
に含まれている。
に含まれている。
【００１８】 適当な断片を、いくつかの方法によって作出することができる。まず、通常の
分子遺伝学的操作によって遺伝子断片をサブクローニングして、本発明のエリシ
タータンパク質をコードする遺伝子のサブクローンを作り出す。そして、このサ
ブクローンを、インビトロ、または細菌細胞の中でインビボで発現させ、下記で
説明する手順にしたがって、エリシター活性について調べることのできる比較的
小さなタンパク質またはペプチドを得る。
分子遺伝学的操作によって遺伝子断片をサブクローニングして、本発明のエリシ
タータンパク質をコードする遺伝子のサブクローンを作り出す。そして、このサ
ブクローンを、インビトロ、または細菌細胞の中でインビボで発現させ、下記で
説明する手順にしたがって、エリシター活性について調べることのできる比較的
小さなタンパク質またはペプチドを得る。
【００１９】 または、キモトリプシン、スタフィロコッカスプロテイナーゼA、またはトリ プシンなどのタンパク質分解酵素によって、全長のエリシタータンパク質を消化
して、エリシタータンパク質の断片を作出することができる。異なったタンパク
質分解酵素は、エリシタータンパク質のアミノ酸配列にもとづいて、異なった部
位でエリシタータンパク質を切断する可能性が高い。タンパク質分解によって生
じる断片のいくつかが、抵抗性の活性エリシターである可能性がある。
して、エリシタータンパク質の断片を作出することができる。異なったタンパク
質分解酵素は、エリシタータンパク質のアミノ酸配列にもとづいて、異なった部
位でエリシタータンパク質を切断する可能性が高い。タンパク質分解によって生
じる断片のいくつかが、抵抗性の活性エリシターである可能性がある。
【００２０】 別の方法において、タンパク質の一次構造に関する知識に基づいて、タンパク
質の特定の部位を表すよう選択された特異的なプライマーセットとともに、PCR 技術を用いて、エリシタータンパク質遺伝子の断片を合成することができる。そ
して、短くなったペプチドまたはタンパク質の発現を増加させるために、適当な
ベクターの中に、これらをクローニングすることができる。
質の特定の部位を表すよう選択された特異的なプライマーセットとともに、PCR 技術を用いて、エリシタータンパク質遺伝子の断片を合成することができる。そ
して、短くなったペプチドまたはタンパク質の発現を増加させるために、適当な
ベクターの中に、これらをクローニングすることができる。
【００２１】 化学合成を用いて、適当な断片を作成することもできる。このような合成は、
産生されるエリシターに対する既知のアミノ酸配列を用いて行われる。または、
全長エリシターを高温高圧にかけると断片ができる。そして、これらの断片を、
常法（例えば、クロマトグラフィー、SDS-PAGE）によって分離できる。
産生されるエリシターに対する既知のアミノ酸配列を用いて行われる。または、
全長エリシターを高温高圧にかけると断片ができる。そして、これらの断片を、
常法（例えば、クロマトグラフィー、SDS-PAGE）によって分離できる。
【００２２】 変異型は、さらに（または、代りに）、例えば、ポリペプチドの特性、二次構
造、および水感応性に最小限の影響しか与えないようなアミノ酸を欠失または付
加して改変することができる。例えば、ポリペプチドには、タンパク質のN末端 に、翻訳と同時に、または翻訳後にタンパク質の移行を指令するシグナル（また
は先導）配列を結合させることができる。また、ポリペプチドには、ポリペプチ
ドの合成、精製、または同定を容易にするためのリンカー、またはその他の配列
を結合させてもよい。
造、および水感応性に最小限の影響しか与えないようなアミノ酸を欠失または付
加して改変することができる。例えば、ポリペプチドには、タンパク質のN末端 に、翻訳と同時に、または翻訳後にタンパク質の移行を指令するシグナル（また
は先導）配列を結合させることができる。また、ポリペプチドには、ポリペプチ
ドの合成、精製、または同定を容易にするためのリンカー、またはその他の配列
を結合させてもよい。
【００２３】 適当なDNA分子は、配列番号：1のヌクレオチド配列を含むDNA分子に、ストリ ンジェントな条件下でハイブリダイズしたものである。適当なストリンジェンシ
ー条件とは、ハイブリダイゼーションが、1M NaCl、50mM Tris-HCl、pH7.4、10m
M EDTA、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、0.2％フィコール、0.2％ポリビニルピ ロリドン、0.2％ウシ血清アルブミン、50μmg/ml E.coli DNAを含有する培地中 において、65℃で20時間行われることである。しかし、このようなストリンジェ
ントな条件下で配列番号：1のヌクレオチド配列を含むDNA分子にハイブリダイゼ
ーションされるいずれのDNA分子も、以下のものの過敏感反応エリシタータンパ ク質またはポリペプチドをコードしている核酸と同じであってはならない：E.ア
ミローボラ（本明細書中に参照として組入れられているWei, Z.M.らの論文、「 植物病原菌エルウィニア・アミローボラによって産生される過敏感反応エリシタ
ーであるハーピン」、Science、257:85-88(1992)に記されたもの）、エルウィニ
ア・クリサンセミ（本明細書に参照として組入れられているBauerらの論文、「 エルウィニア・クリサンセミのハーピンEch：腐朽病原菌」、MPMI、8(4):484-91
(1995)に記されたもの）、エルウィニア・カロトボーラ（本明細書に参照として
組入れられているCuiらの論文、「エルウィニア・カロトボーラ亜種カロトボー ラ菌株Ecc71のRsmA-変異株は、タバコ葉でhrpNEccを過剰発現し、過敏感反応様 反応を誘起する」、MPMI、9(7):565-73(1966)に記されたもの）、エルウィニア ・ステワルチ（本明細書に参照として組入れられているAhmadらの論文、「ハー ピンはエルウィニア・ステワルティイのトウモロコシに対する病原性には不要で
ある」、8th Int'l Cong. Molec. Plant-Microb. Inter、1996年7月14-19日、お
よびAhmadらの論文、「ハーピンはエルウィニア・ステワルティのトウモロコシ に対する病原性には不要である」、Ann.Mtg.AmPhytopath.Soc.、1996年7月27-31
日に記されているもの）、および、シュードモナス・シリンガエ病原型シリンガ
エ（本明細書に参照として組入れられているコーネル研究財団に付与された国際
公開公報第94/26782号、開示されているもの）である。
ー条件とは、ハイブリダイゼーションが、1M NaCl、50mM Tris-HCl、pH7.4、10m
M EDTA、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、0.2％フィコール、0.2％ポリビニルピ ロリドン、0.2％ウシ血清アルブミン、50μmg/ml E.coli DNAを含有する培地中 において、65℃で20時間行われることである。しかし、このようなストリンジェ
ントな条件下で配列番号：1のヌクレオチド配列を含むDNA分子にハイブリダイゼ
ーションされるいずれのDNA分子も、以下のものの過敏感反応エリシタータンパ ク質またはポリペプチドをコードしている核酸と同じであってはならない：E.ア
ミローボラ（本明細書中に参照として組入れられているWei, Z.M.らの論文、「 植物病原菌エルウィニア・アミローボラによって産生される過敏感反応エリシタ
ーであるハーピン」、Science、257:85-88(1992)に記されたもの）、エルウィニ
ア・クリサンセミ（本明細書に参照として組入れられているBauerらの論文、「 エルウィニア・クリサンセミのハーピンEch：腐朽病原菌」、MPMI、8(4):484-91
(1995)に記されたもの）、エルウィニア・カロトボーラ（本明細書に参照として
組入れられているCuiらの論文、「エルウィニア・カロトボーラ亜種カロトボー ラ菌株Ecc71のRsmA-変異株は、タバコ葉でhrpNEccを過剰発現し、過敏感反応様 反応を誘起する」、MPMI、9(7):565-73(1966)に記されたもの）、エルウィニア ・ステワルチ（本明細書に参照として組入れられているAhmadらの論文、「ハー ピンはエルウィニア・ステワルティイのトウモロコシに対する病原性には不要で
ある」、8th Int'l Cong. Molec. Plant-Microb. Inter、1996年7月14-19日、お
よびAhmadらの論文、「ハーピンはエルウィニア・ステワルティのトウモロコシ に対する病原性には不要である」、Ann.Mtg.AmPhytopath.Soc.、1996年7月27-31
日に記されているもの）、および、シュードモナス・シリンガエ病原型シリンガ
エ（本明細書に参照として組入れられているコーネル研究財団に付与された国際
公開公報第94/26782号、開示されているもの）である。
【００２４】 本発明のタンパク質またはポリペプチドは、好ましくは、従来からの技術によ
って、（好ましくは、少なくとも約80%、より好ましくは90%純粋な）精製された
形で製造される。典型的には、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、組換
え宿主細胞の増殖培地中に分泌される。または、本発明のタンパク質またはポリ
ペプチドは、産生されても増殖培地中には分泌されない。このような場合、タン
パク質を単離するために、組換えプラスミドをもつ宿主細胞（例えば、大腸菌）
を増殖させ、音波処理によって溶菌し、加熱、示差的圧力、もしくは化学処理し
、このホモジネートを遠心分離して、細菌の残滓を取り除く。次に、上清を段階
的硫化アンモニウム沈降法に供する。本発明のポリペプチドまたはタンパク質を
含む画分を、適当なサイズのデキストランまたはポリアクリルアミドカラムでゲ
ル濾過して、タンパク質を分離する。必要ならば、HPLCによって、このタンパク
質画分をさらに精製することができる。
って、（好ましくは、少なくとも約80%、より好ましくは90%純粋な）精製された
形で製造される。典型的には、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、組換
え宿主細胞の増殖培地中に分泌される。または、本発明のタンパク質またはポリ
ペプチドは、産生されても増殖培地中には分泌されない。このような場合、タン
パク質を単離するために、組換えプラスミドをもつ宿主細胞（例えば、大腸菌）
を増殖させ、音波処理によって溶菌し、加熱、示差的圧力、もしくは化学処理し
、このホモジネートを遠心分離して、細菌の残滓を取り除く。次に、上清を段階
的硫化アンモニウム沈降法に供する。本発明のポリペプチドまたはタンパク質を
含む画分を、適当なサイズのデキストランまたはポリアクリルアミドカラムでゲ
ル濾過して、タンパク質を分離する。必要ならば、HPLCによって、このタンパク
質画分をさらに精製することができる。
【００２５】 従来からの組換えDNA技術を用いて、細胞の中に過敏感反応エリシターポリペ プチドまたはタンパク質をコードするDNA分子を取り込むことができる。一般的 に、これには、そのDNA分子が異種的である（すなわち、通常は存在しない）発 現システムの中にDNA分子を挿入することが含まれる。異種性のDNA分子を、適正
なセンス鎖方向で、かつ正しい読み枠にはまるよう、発現システムまたはベクタ
ーの中に挿入する。このベクターは、挿入されたタンパク質をコードする配列の
転写および翻訳に必要な因子を含んでいる。
なセンス鎖方向で、かつ正しい読み枠にはまるよう、発現システムまたはベクタ
ーの中に挿入する。このベクターは、挿入されたタンパク質をコードする配列の
転写および翻訳に必要な因子を含んでいる。
【００２６】 コーエンとボイヤー（Cohen and Boyer）に対する米国特許第4,237,224号は、
参照として本明細書に組み入れられるが、制限酵素切断、およびDNAリガーゼに よるライゲーションを用いて、組換えプラスミドという形での発現システムの作
成を記載している。そして、これらの組換えプラスミドを、形質転換という方法
で導入し、原核生物、および組織培養で増殖させた真核生物細胞などの単細胞培
養で複製させる。
参照として本明細書に組み入れられるが、制限酵素切断、およびDNAリガーゼに よるライゲーションを用いて、組換えプラスミドという形での発現システムの作
成を記載している。そして、これらの組換えプラスミドを、形質転換という方法
で導入し、原核生物、および組織培養で増殖させた真核生物細胞などの単細胞培
養で複製させる。
【００２７】 組換え遺伝子は、ワクシニアウイルスなどのウイルスの中に導入することもで
きる。組換えウイルスは、ウイルス感染した細胞の中にプラスミドをトランスフ
ェクション（transfection）することによって作成することができる。
きる。組換えウイルスは、ウイルス感染した細胞の中にプラスミドをトランスフ
ェクション（transfection）することによって作成することができる。
【００２８】 適当なベクターには、以下のウイルスベクターが含まれるが、これらに限定さ
れない。すなわち、gt11、gt WES.tB、Charon 4などのラムダベクターシステム 、また、pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、p
LG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluescript II SK+/- またはKS +/- （ カリフォルニア州ラホヤ（La Jolla）にあるストラタジーン社（Stratagene）の
「ストラタジーンクローニングシステム（Stratagene Cloning Systems）」カ タログ（1993）参照。このカタログは、参照として本明細書に組み入れられる）
、pQE、pIH821、pGEX、pETシリーズ（F. W. Studierら、「クローニングした遺 伝子を発現させるためのT7RNAポリメラーゼの使用（Use of T7 RNA Polymerase
to Direct Expression of Cloned Genes）」、Gene Expression Technology vol
. 185 (1990)を参照のこと。この論文は、参照として本明細書に組み入れられる
）などのプラスミドベクター、および、これらから派生したもの。組換え分子は
、形質転換、特に、形質導入、接合、可動化、またはエレクトロポレーションに
よって、細胞の中に導入できる。参照として本明細書に組み入れられる、サムブ
ルック（Sambrook）ら、（分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Clon
ing. A Laboratory Manual）、Cold Springs Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY (1989））によって説明されているような、当技術分野において標準的なク ローニング技術を用いて、DNA配列をベクターの中にクローニングする。
れない。すなわち、gt11、gt WES.tB、Charon 4などのラムダベクターシステム 、また、pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、p
LG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluescript II SK+/- またはKS +/- （ カリフォルニア州ラホヤ（La Jolla）にあるストラタジーン社（Stratagene）の
「ストラタジーンクローニングシステム（Stratagene Cloning Systems）」カ タログ（1993）参照。このカタログは、参照として本明細書に組み入れられる）
、pQE、pIH821、pGEX、pETシリーズ（F. W. Studierら、「クローニングした遺 伝子を発現させるためのT7RNAポリメラーゼの使用（Use of T7 RNA Polymerase
to Direct Expression of Cloned Genes）」、Gene Expression Technology vol
. 185 (1990)を参照のこと。この論文は、参照として本明細書に組み入れられる
）などのプラスミドベクター、および、これらから派生したもの。組換え分子は
、形質転換、特に、形質導入、接合、可動化、またはエレクトロポレーションに
よって、細胞の中に導入できる。参照として本明細書に組み入れられる、サムブ
ルック（Sambrook）ら、（分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Clon
ing. A Laboratory Manual）、Cold Springs Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY (1989））によって説明されているような、当技術分野において標準的なク ローニング技術を用いて、DNA配列をベクターの中にクローニングする。
【００２９】 タンパク質をコードする配列を発現させるために、さまざまな宿主-ベクター システムを利用することができる。まず、このベクターシステムは、用いられる
宿主細胞に親和性がなければならない。宿主-ベクターシステムには、以下のシ ステムが含まれるが、これらに限定されない。すなわち、バクテリオファージDN
A、プラスミドDNA、またはコスミドDNAによって形質転換された細菌、酵母ベク ターを含む酵母などの微生物、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノ
ウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞系、ウイルス（例えば、バキュロウイル
ス）に感染した昆虫細胞系、および細菌に感染した植物細胞。これらのベクター
の発現因子は、それらの強度および特異性において多様である。用いられる宿主
-ベクターシステムによって、多くの適当な転写因子および翻訳因子のいずれか を用いることができる。
宿主細胞に親和性がなければならない。宿主-ベクターシステムには、以下のシ ステムが含まれるが、これらに限定されない。すなわち、バクテリオファージDN
A、プラスミドDNA、またはコスミドDNAによって形質転換された細菌、酵母ベク ターを含む酵母などの微生物、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノ
ウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞系、ウイルス（例えば、バキュロウイル
ス）に感染した昆虫細胞系、および細菌に感染した植物細胞。これらのベクター
の発現因子は、それらの強度および特異性において多様である。用いられる宿主
-ベクターシステムによって、多くの適当な転写因子および翻訳因子のいずれか を用いることができる。
【００３０】 さまざまな遺伝子シグナルおよびプロセッシング事象によって、遺伝子発現（
例えば、DNA転写、およびメッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳）が、さまざまなレ
ベルで調節される。
例えば、DNA転写、およびメッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳）が、さまざまなレ
ベルで調節される。
【００３１】 DNAの転写は、RNAポリメラーゼを結合させ、それによってmRNA合成を促進させ
るDNA配列であるプロモーターの存在に依存している。真核生物のプロモーター のDNA配列は、原核生物のプロモーターのDNA配列とは異なっている。さらに、真
核生物のプロモーターと、それにともなう遺伝子シグナルは、原核生物システム
の中では認識されないか、機能しない可能性がある。そして、さらに、原核生物
のプロモーターは、真核生物の細胞の中では認識もされなければ、機能もしない
。
るDNA配列であるプロモーターの存在に依存している。真核生物のプロモーター のDNA配列は、原核生物のプロモーターのDNA配列とは異なっている。さらに、真
核生物のプロモーターと、それにともなう遺伝子シグナルは、原核生物システム
の中では認識されないか、機能しない可能性がある。そして、さらに、原核生物
のプロモーターは、真核生物の細胞の中では認識もされなければ、機能もしない
。
【００３２】 同様に、原核生物におけるmRNAの翻訳は、真核生物のシグナルとは異なる、原
核生物の適正なシグナルが存在することに依存する。原核生物におけるmRNAの効
率的な翻訳には、mRNA上に、シャイン-ダルガーノ（「SD」）配列と呼ばれるリ ボソーム結合部位が必要である。この配列は、タンパク質のアミノ末端のメチオ
ニンをコードする、通常はAUGの開始コドンの前に存在するmRNAの短いヌクレオ チド配列である。SD配列は、16S rRNA（リボソームRNA）の3'末端に相補的であ り、恐らく、rRNAと二本鎖を形成することによって、リボソームが正しい位置に
なるようにして、mRNAがリボソームに結合するのを促進すると考えられる。遺伝
子発現を最大にすることに関する総説は、参照として本明細書に組み入れられる
、ロバートとロウアー（Robert and Lauer）、Methods in Enzymology, 68:473
(1979)を参照のこと。
核生物の適正なシグナルが存在することに依存する。原核生物におけるmRNAの効
率的な翻訳には、mRNA上に、シャイン-ダルガーノ（「SD」）配列と呼ばれるリ ボソーム結合部位が必要である。この配列は、タンパク質のアミノ末端のメチオ
ニンをコードする、通常はAUGの開始コドンの前に存在するmRNAの短いヌクレオ チド配列である。SD配列は、16S rRNA（リボソームRNA）の3'末端に相補的であ り、恐らく、rRNAと二本鎖を形成することによって、リボソームが正しい位置に
なるようにして、mRNAがリボソームに結合するのを促進すると考えられる。遺伝
子発現を最大にすることに関する総説は、参照として本明細書に組み入れられる
、ロバートとロウアー（Robert and Lauer）、Methods in Enzymology, 68:473
(1979)を参照のこと。
【００３３】 プロモーターの「強度」（すなわち、転写を促進する能力）はさまざまである
。クローニングされた遺伝子を発現させるために、転写のレベルを高くして、そ
れによって遺伝子発現レベルを上げるためには、強いプロモーターを使用するこ
とが望ましい。使用する宿主細胞システムによって、数ある適当なプロモーター
のいずれか一つを用いることができる。例えば、大腸菌、そのバクテリオファー
ジ、またはプラスミドにクローニングするときには、T7ファージプロモーター、
lacプロモーター、trpプロモーター、recAプロモーター、リボソームRNAプロモ ーター、コリファージラムダのPR、およびPLプロモーター、ならびにその他、la
cUV5、ompF、bla、lppなどを含むが、これらに限定されないプロモーターを用い
て、隣接するDNAセグメントを高レベルで転写させることができる。さらに、雑 種trp-lacUV5（tac）プロモーター、または組換えDNAもしくはその他の合成DNA 技術によって作出された大腸菌プロモーターを用いて、挿入された遺伝子の転写
をもたらすことができる。
。クローニングされた遺伝子を発現させるために、転写のレベルを高くして、そ
れによって遺伝子発現レベルを上げるためには、強いプロモーターを使用するこ
とが望ましい。使用する宿主細胞システムによって、数ある適当なプロモーター
のいずれか一つを用いることができる。例えば、大腸菌、そのバクテリオファー
ジ、またはプラスミドにクローニングするときには、T7ファージプロモーター、
lacプロモーター、trpプロモーター、recAプロモーター、リボソームRNAプロモ ーター、コリファージラムダのPR、およびPLプロモーター、ならびにその他、la
cUV5、ompF、bla、lppなどを含むが、これらに限定されないプロモーターを用い
て、隣接するDNAセグメントを高レベルで転写させることができる。さらに、雑 種trp-lacUV5（tac）プロモーター、または組換えDNAもしくはその他の合成DNA 技術によって作出された大腸菌プロモーターを用いて、挿入された遺伝子の転写
をもたらすことができる。
【００３４】 細菌の宿主細胞菌株と発現ベクターは、特異的な誘導があるまでは、プロモー
ターの作用を阻止するものを選ぶことができる。ある操作においては、挿入され
たDNAの転写を効率的に行うためには、特異的なインデューサーの添加が必要に なる。例えば、lacオペロンは、ラクトースかIPTG（イソプロピルチオ-ベータ-D
-ガラクトシド）を加えることによって誘導される。その他、trp、proなど、さ まざまなオペロンが、異なる調節の下にある。
ターの作用を阻止するものを選ぶことができる。ある操作においては、挿入され
たDNAの転写を効率的に行うためには、特異的なインデューサーの添加が必要に なる。例えば、lacオペロンは、ラクトースかIPTG（イソプロピルチオ-ベータ-D
-ガラクトシド）を加えることによって誘導される。その他、trp、proなど、さ まざまなオペロンが、異なる調節の下にある。
【００３５】 また、原核生物細胞での効率的な遺伝子転写と翻訳には、特異的な開始シグナ
ルも必要とされる。これらの転写および翻訳開始シグナルは、それぞれ、遺伝子
特異的なメッセンジャーRNAと合成されたタンパク質の量で測定される「強度」 がさまざまである。プロモーターを含むDNA発現ベクターは、さまざまな「強い 」転写シグナルおよび/または翻訳開始シグナルを任意に組み合わせたものを含 んでいてもよい。例えば、大腸菌における効率的な翻訳には、リボソーム結合部
位を提供するために、開始コドン（「ATG」）から約7〜9塩基5'側にあるSD配列 が必要である。したがって、宿主細胞のリボソームによって利用できる、いかな
るSD-ATGの組み合わせも用いることができる。このような組合せには、コリファ
ージラムダのcro遺伝子もしくはN遺伝子由来のSD-ATGの組合せ、または大腸菌の
トリプトファンE、D、C、B、もしくはA遺伝子由来のSD-ATGの組合せが含まれる が、これらに限定されない。さらに、組換えDNAまたは合成ヌクレオチドの組み 込みを含むその他の技術によって作出されたSD-ATGの組合せを用いることもでき
る。
ルも必要とされる。これらの転写および翻訳開始シグナルは、それぞれ、遺伝子
特異的なメッセンジャーRNAと合成されたタンパク質の量で測定される「強度」 がさまざまである。プロモーターを含むDNA発現ベクターは、さまざまな「強い 」転写シグナルおよび/または翻訳開始シグナルを任意に組み合わせたものを含 んでいてもよい。例えば、大腸菌における効率的な翻訳には、リボソーム結合部
位を提供するために、開始コドン（「ATG」）から約7〜9塩基5'側にあるSD配列 が必要である。したがって、宿主細胞のリボソームによって利用できる、いかな
るSD-ATGの組み合わせも用いることができる。このような組合せには、コリファ
ージラムダのcro遺伝子もしくはN遺伝子由来のSD-ATGの組合せ、または大腸菌の
トリプトファンE、D、C、B、もしくはA遺伝子由来のSD-ATGの組合せが含まれる が、これらに限定されない。さらに、組換えDNAまたは合成ヌクレオチドの組み 込みを含むその他の技術によって作出されたSD-ATGの組合せを用いることもでき
る。
【００３６】 過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコードする単離DNA分 子が、発現系にクローニングされたら、宿主細胞の中に取り込ませる準備ができ
たことになる。この取り込みは、ベクター/宿主細胞システムに応じて、上記し たさまざまな形質転換の形で行うことができる。適当な宿主細胞には、細菌、ウ
イルス、酵母、哺乳動物細胞、昆虫、植物などが含まれるが、これらに限定され
ない。
たことになる。この取り込みは、ベクター/宿主細胞システムに応じて、上記し たさまざまな形質転換の形で行うことができる。適当な宿主細胞には、細菌、ウ
イルス、酵母、哺乳動物細胞、昆虫、植物などが含まれるが、これらに限定され
ない。
【００３７】 本発明は更に、植物に病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／ま
たは植物のための昆虫の防除に作用する方法に関する。これらの方法は、非感染
型の過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を、植物または植物種
子の全体または一部に、ポリペプチドまたはタンパク質が植物の全体もしくは一
部または植物種子の細胞と接触するような条件下で適用する。あるいは、過敏感
反応エリシタータンパク質またはポリペプチドは、このような植物自身から回収
された種子が植物に病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または
昆虫の防除に作用するように、植物に適用することができる。
たは植物のための昆虫の防除に作用する方法に関する。これらの方法は、非感染
型の過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を、植物または植物種
子の全体または一部に、ポリペプチドまたはタンパク質が植物の全体もしくは一
部または植物種子の細胞と接触するような条件下で適用する。あるいは、過敏感
反応エリシタータンパク質またはポリペプチドは、このような植物自身から回収
された種子が植物に病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または
昆虫の防除に作用するように、植物に適用することができる。
【００３８】 植物に病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または植物または
種子から生育した植物上で昆虫を防除するために過敏感反応エリシターポリペプ
チドまたはタンパク質を植物または植物種子に適用する代わりに、トランスジェ
ニック植物又は植物種子を利用することができる。トランスジェニック植物を利
用する場合は、これは過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコ
ードしているDNAで形質転換されたトランスジェニック植物を提供すること、お よび病気抵抗性を植物に付与し、植物の生育を強化し、および／または昆虫を防
除するのに有効な条件下で植物を生育することに関連している。または、過敏感
反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコードしているDNA分子で形質 転換されたトランスジェニック植物種子を提供または土壌中に植えることができ
る。その後植物は、植物に病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／
または昆虫を防除するのに有効な条件下で繁殖される。
種子から生育した植物上で昆虫を防除するために過敏感反応エリシターポリペプ
チドまたはタンパク質を植物または植物種子に適用する代わりに、トランスジェ
ニック植物又は植物種子を利用することができる。トランスジェニック植物を利
用する場合は、これは過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコ
ードしているDNAで形質転換されたトランスジェニック植物を提供すること、お よび病気抵抗性を植物に付与し、植物の生育を強化し、および／または昆虫を防
除するのに有効な条件下で植物を生育することに関連している。または、過敏感
反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコードしているDNA分子で形質 転換されたトランスジェニック植物種子を提供または土壌中に植えることができ
る。その後植物は、植物に病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／
または昆虫を防除するのに有効な条件下で繁殖される。
【００３９】 本発明の過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質が植物または植
物種子に適用されるような態様は、いくつかの方法で行うことができ、これは以
下を含んでいる：1)単離されたエリシターポリペプチドまたはタンパク質の適用
；2)病気を引き起こさず、かつ過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパ
ク質をコードしている遺伝子により形質転換された細菌の適用；および、3)一部
の植物種において病気を引き起こし（しかし適用された植物においては引き起こ
さない）、かつ天然に過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコ
ードしている遺伝子を含んでいる細菌の適用。
物種子に適用されるような態様は、いくつかの方法で行うことができ、これは以
下を含んでいる：1)単離されたエリシターポリペプチドまたはタンパク質の適用
；2)病気を引き起こさず、かつ過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパ
ク質をコードしている遺伝子により形質転換された細菌の適用；および、3)一部
の植物種において病気を引き起こし（しかし適用された植物においては引き起こ
さない）、かつ天然に過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコ
ードしている遺伝子を含んでいる細菌の適用。
【００４０】 本発明のある態様において、本発明の過敏感反応エリシターポリペプチドまた
はタンパク質は、下記実施例に記載されたようにエルウィニア・アミローボラか
ら単離することができる。しかし好ましくは、単離された本発明の過敏感反応エ
リシターポリペプチドまたはタンパク質は、前述のように組換えにより作出され
、精製される。
はタンパク質は、下記実施例に記載されたようにエルウィニア・アミローボラか
ら単離することができる。しかし好ましくは、単離された本発明の過敏感反応エ
リシターポリペプチドまたはタンパク質は、前述のように組換えにより作出され
、精製される。
【００４１】 本発明の別の態様において、本発明の過敏感反応エリシターポリペプチドまた
はタンパク質は、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコード
している遺伝子を含む細菌を適用することによって、植物または植物種子に適用
することができる。このような細菌は、該エリシターが植物または植物種子細胞
に接触することができるようなポリペプチドまたはタンパク質を分泌もしくは作
成することが可能でなければならない。これらの態様において、過敏感反応エリ
シターポリペプチドまたはタンパク質は、植物内(in planta)もしくは種子上の 細菌によって、または植物もしくは植物種子への細菌の導入直前に産生される。
はタンパク質は、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコード
している遺伝子を含む細菌を適用することによって、植物または植物種子に適用
することができる。このような細菌は、該エリシターが植物または植物種子細胞
に接触することができるようなポリペプチドまたはタンパク質を分泌もしくは作
成することが可能でなければならない。これらの態様において、過敏感反応エリ
シターポリペプチドまたはタンパク質は、植物内(in planta)もしくは種子上の 細菌によって、または植物もしくは植物種子への細菌の導入直前に産生される。
【００４２】 本発明の細菌適用法のある態様において、細菌は病気を引き起こさず、かつ過
敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子によ
り（例えば組換えにより）形質転換されている。例えば植物において過敏感反応
を誘起しないE.coliは、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を
コードしている遺伝子により形質転換することができ、その後植物に適用される
。E.coli以外の細菌種も、本発明のこの態様において使用することができる。
敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子によ
り（例えば組換えにより）形質転換されている。例えば植物において過敏感反応
を誘起しないE.coliは、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を
コードしている遺伝子により形質転換することができ、その後植物に適用される
。E.coli以外の細菌種も、本発明のこの態様において使用することができる。
【００４３】 本発明の細菌適用法の別の態様において、細菌は病気を引き起こし、かつ天然
に過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子
を含む。このような細菌の例は、前述のものである。しかしこの態様においては
、これらの細菌は、細菌によって運ばれた病気に対し罹病性でない植物またはそ
れらの種子に適用される。例えば、エルウィニア・アミローボラは、リンゴまた
はナシにおいて病気を引き起こすが、トマトにおいては引き起こさない。しかし
このような細菌は、トマトにおいて過敏感反応を誘起するであろう。従って、本
発明のこの態様に従って、エルウィニア・アミローボラは、トマト植物または種
子に適用して、その種において病気を引き起こすことなく、病気抵抗性を付与し
、生育を強化し、または昆虫を防除することができる。
に過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子
を含む。このような細菌の例は、前述のものである。しかしこの態様においては
、これらの細菌は、細菌によって運ばれた病気に対し罹病性でない植物またはそ
れらの種子に適用される。例えば、エルウィニア・アミローボラは、リンゴまた
はナシにおいて病気を引き起こすが、トマトにおいては引き起こさない。しかし
このような細菌は、トマトにおいて過敏感反応を誘起するであろう。従って、本
発明のこの態様に従って、エルウィニア・アミローボラは、トマト植物または種
子に適用して、その種において病気を引き起こすことなく、病気抵抗性を付与し
、生育を強化し、または昆虫を防除することができる。
【００４４】 本発明の方法を使用して、病気の抵抗性を付与する、生長を増強させる、およ
び／または昆虫を防除するために、さまざまな植物またはそれらの種子を処理す
ることができる。適当な植物には、双子葉類と単子葉類が含まれる。より具体的
には、有用な作物植物として、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ、ライ
ムギ、ワタ、ヒマワリ、ラッカセイ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、
マメ、エンドウ、チコリ、レタス、エンダイブ、キャベツ、芽キャベツ、ビート
、パースニップ、カブ、カリフラワー、ブロッコリー、ラディッシュ、ホウレン
ソウ、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、カボチャ属、
カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、メロン、柑橘類、イチゴ、ブ
ドウ、ラズベリー、パイナップル、ダイズ、タバコ、トマト、ソルガム、および
サトウキビが含まれる。適当な観賞用植物の例は、シロイヌナズナ（Arabidopsi
s thaliana）、セントポーリア、ペチュニア、ペラルゴニューム、ポインセチア
、キク、カーネーション、およびジニアである。
び／または昆虫を防除するために、さまざまな植物またはそれらの種子を処理す
ることができる。適当な植物には、双子葉類と単子葉類が含まれる。より具体的
には、有用な作物植物として、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ、ライ
ムギ、ワタ、ヒマワリ、ラッカセイ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、
マメ、エンドウ、チコリ、レタス、エンダイブ、キャベツ、芽キャベツ、ビート
、パースニップ、カブ、カリフラワー、ブロッコリー、ラディッシュ、ホウレン
ソウ、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、カボチャ属、
カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、メロン、柑橘類、イチゴ、ブ
ドウ、ラズベリー、パイナップル、ダイズ、タバコ、トマト、ソルガム、および
サトウキビが含まれる。適当な観賞用植物の例は、シロイヌナズナ（Arabidopsi
s thaliana）、セントポーリア、ペチュニア、ペラルゴニューム、ポインセチア
、キク、カーネーション、およびジニアである。
【００４５】 病気抵抗性を付与する本発明の過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペ
プチドの使用に関して、感染に対する絶対免疫は授けることができないが、この
病気に対する感受性は低下させられ、かつ徴候発現が遅延される。病巣数、病巣
の大きさ、および真菌病原体の胞芽形成の程度は全て減少される。この病気抵抗
性を付与する方法は、これまで治療することができなかった病気を治療し、費用
の点から個別に治療されなかった全身性病気を治療し、感染性薬剤および環境に
有害な物質の使用を回避する可能性がある。
プチドの使用に関して、感染に対する絶対免疫は授けることができないが、この
病気に対する感受性は低下させられ、かつ徴候発現が遅延される。病巣数、病巣
の大きさ、および真菌病原体の胞芽形成の程度は全て減少される。この病気抵抗
性を付与する方法は、これまで治療することができなかった病気を治療し、費用
の点から個別に治療されなかった全身性病気を治療し、感染性薬剤および環境に
有害な物質の使用を回避する可能性がある。
【００４６】 本発明に従って植物に病原体抵抗性を付与する方法は、ウイルス、細菌および
真菌を含む広範な多様な病原体に対する抵抗性を付与するのに有用である。特に
下記のウイルスに対する抵抗性は、本発明の方法によって達成することができる
：タバコモザイクウイルスおよびトマトモザイクウイルス。特に下記の細菌に対
する抵抗性も、本発明に従って植物に付与することができる：シュードモナス・
ソランセアラム、シュードモナス・シリンガエ病原型タバシ(tabaci)、およびキ
サンタモナス・カンペストリス病原型ペラルゴニ(Xanthamonas campestris pv.
pelargoni)。本発明の方法を使用することにより特に下記の真菌に対して植物を
抵抗性にすることができる：フサリウム・オキシプラム(Fusarium axysporum)お
よびフィトフソラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)。
真菌を含む広範な多様な病原体に対する抵抗性を付与するのに有用である。特に
下記のウイルスに対する抵抗性は、本発明の方法によって達成することができる
：タバコモザイクウイルスおよびトマトモザイクウイルス。特に下記の細菌に対
する抵抗性も、本発明に従って植物に付与することができる：シュードモナス・
ソランセアラム、シュードモナス・シリンガエ病原型タバシ(tabaci)、およびキ
サンタモナス・カンペストリス病原型ペラルゴニ(Xanthamonas campestris pv.
pelargoni)。本発明の方法を使用することにより特に下記の真菌に対して植物を
抵抗性にすることができる：フサリウム・オキシプラム(Fusarium axysporum)お
よびフィトフソラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)。
【００４７】 植物の生育を強化するための本発明の過敏感反応エリシタータンパク質または
ポリペプチドの使用に関して、様々な形の植物の生育強化または促進を行うこと
ができる。これは、植物の生育が種子から始まる場合はできるだけ早く、もしく
は植物生活環のより後期において引き起こすことができる。例えば、本発明の植
物の生育は、増量した収穫高、産生された種子量の増大、種子の発芽率の上昇、
植物丈の伸張、より大きい有機物量(biomass)、より多くかつ大きい果実、より 早期の果実の色付き、ならびにより早い果実および植物の成熟を含んでいる。結
果的には、本発明は、栽培者に著しい経済的利益をもたらす。例えば早期の発芽
および早い成熟は、生育期が短くその地域での生育が妨げられるような地域で作
物が生育できるようにする。種子の発芽率の上昇は、結果的に作物の株立本数(s
tand)を改善し、より効果的な種子の使用ができる。より多い収穫量、丈の伸張 および増強された有機物量生成は、所定の土地区画からのより多い収益形成を可
能にする。
ポリペプチドの使用に関して、様々な形の植物の生育強化または促進を行うこと
ができる。これは、植物の生育が種子から始まる場合はできるだけ早く、もしく
は植物生活環のより後期において引き起こすことができる。例えば、本発明の植
物の生育は、増量した収穫高、産生された種子量の増大、種子の発芽率の上昇、
植物丈の伸張、より大きい有機物量(biomass)、より多くかつ大きい果実、より 早期の果実の色付き、ならびにより早い果実および植物の成熟を含んでいる。結
果的には、本発明は、栽培者に著しい経済的利益をもたらす。例えば早期の発芽
および早い成熟は、生育期が短くその地域での生育が妨げられるような地域で作
物が生育できるようにする。種子の発芽率の上昇は、結果的に作物の株立本数(s
tand)を改善し、より効果的な種子の使用ができる。より多い収穫量、丈の伸張 および増強された有機物量生成は、所定の土地区画からのより多い収益形成を可
能にする。
【００４８】 本発明の別の局面は、何らかの形で、植物のために昆虫防除を行うことに関す
る。例えば、本発明に従った昆虫防除には、過敏感反応エリシターが適用されて
いる植物には昆虫が接触できなくなるようにすること、食害によって植物が直接
的な虫害を受けるのを阻止すること、このような植物から昆虫が離れていくよう
にさせること、このような植物のすぐ近くにいる昆虫を殺すこと、昆虫の幼虫が
このような植物を餌にするのを阻止すること、昆虫が宿主植物上でコロニーを形
成するのを阻止すること、コロニーを形成した昆虫がフィトトキシンを放出する
のを阻止することなどが含まれる。本発明は、昆虫の感染から、その後に生じる
植物の病害も防止する。
る。例えば、本発明に従った昆虫防除には、過敏感反応エリシターが適用されて
いる植物には昆虫が接触できなくなるようにすること、食害によって植物が直接
的な虫害を受けるのを阻止すること、このような植物から昆虫が離れていくよう
にさせること、このような植物のすぐ近くにいる昆虫を殺すこと、昆虫の幼虫が
このような植物を餌にするのを阻止すること、昆虫が宿主植物上でコロニーを形
成するのを阻止すること、コロニーを形成した昆虫がフィトトキシンを放出する
のを阻止することなどが含まれる。本発明は、昆虫の感染から、その後に生じる
植物の病害も防止する。
【００４９】 本発明は、広範な種類の昆虫に対して有効である。アワノメイガ(European Co
rn Borer)は、トウモロコシ（デントコーンおよびスイートコーン）の主要害虫 であるだけでなく、グリーンビーン、ワックスビーン(wax bean)、ライビーン、
食用ダイズ、コショウ、ジャガイモ、およびトマト、更に多くの草本種を含む20
0を超える植物種を餌にする。さまざまな野菜に損傷を与える別の食害虫の幼虫 は以下を含む：ビートアーミーワーム(beat armyworm)、キャベツルーパ(cabbag
e looper)、コーンイヤーワーム(corn earworm)、フォールアーミーワーム(fall
armyworm)、ダイヤモンドバックモス(diamondback moth)、キャベツルートマゴ
ット(cabbage root maggot)、オニオンマゴット(onion maggot)、シードコーン マゴット(seed corn maggot)、ピックルワーム(pickleworm)（メロンワーム(mel
oneworm)）、ペッパーマゴット(pepper maggot)、およびトマトピンワーム(toma
te pinworm)。この昆虫のグループは、集合的に、世界中の野菜の生産にとって 経済的に最も重要な害虫グループである。
rn Borer)は、トウモロコシ（デントコーンおよびスイートコーン）の主要害虫 であるだけでなく、グリーンビーン、ワックスビーン(wax bean)、ライビーン、
食用ダイズ、コショウ、ジャガイモ、およびトマト、更に多くの草本種を含む20
0を超える植物種を餌にする。さまざまな野菜に損傷を与える別の食害虫の幼虫 は以下を含む：ビートアーミーワーム(beat armyworm)、キャベツルーパ(cabbag
e looper)、コーンイヤーワーム(corn earworm)、フォールアーミーワーム(fall
armyworm)、ダイヤモンドバックモス(diamondback moth)、キャベツルートマゴ
ット(cabbage root maggot)、オニオンマゴット(onion maggot)、シードコーン マゴット(seed corn maggot)、ピックルワーム(pickleworm)（メロンワーム(mel
oneworm)）、ペッパーマゴット(pepper maggot)、およびトマトピンワーム(toma
te pinworm)。この昆虫のグループは、集合的に、世界中の野菜の生産にとって 経済的に最も重要な害虫グループである。
【００５０】 過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質の適用に関する本発明の
方法は、葉、茎、根、栄養分体（例えば挿し木）、その他を含む、植物の全身ま
たは一部を処理するときに、さまざまな手順によって実施することができる。こ
れには、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を植物の中に浸潤
させることが含まれていてもよい（しかしその必要はない）。適切な適用法には
、高圧または定圧の噴霧、注入、およびエリシターを適用する直前に葉の表皮を
剥脱することが含まれる。本発明の応用の態様に従って植物種子を処理する場合
は、低圧または高圧の噴霧、コーティング、浸漬、または注入によって、過敏感
反応エリシタータンパク質またはポリペプチドを適用することができる。過敏感
反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を植物または植物種子の細胞に接
触させることができるようにする、他の適当な適用手順を、当業者が考案するこ
とも可能である。本発明の過敏感反応エリシターで処理したら、植物を生産する
ための常法を用いて、種子を天然または人工の土に植えて栽培できる。本発明に
従って処理した種子から植物体を繁殖させた後、植物体に病気抵抗性を付与し、
植物の生育を強化し、および／または植物体上の昆虫を防除するために、過敏感
反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質で植物体を１回以上処理すること
ができる。
方法は、葉、茎、根、栄養分体（例えば挿し木）、その他を含む、植物の全身ま
たは一部を処理するときに、さまざまな手順によって実施することができる。こ
れには、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を植物の中に浸潤
させることが含まれていてもよい（しかしその必要はない）。適切な適用法には
、高圧または定圧の噴霧、注入、およびエリシターを適用する直前に葉の表皮を
剥脱することが含まれる。本発明の応用の態様に従って植物種子を処理する場合
は、低圧または高圧の噴霧、コーティング、浸漬、または注入によって、過敏感
反応エリシタータンパク質またはポリペプチドを適用することができる。過敏感
反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を植物または植物種子の細胞に接
触させることができるようにする、他の適当な適用手順を、当業者が考案するこ
とも可能である。本発明の過敏感反応エリシターで処理したら、植物を生産する
ための常法を用いて、種子を天然または人工の土に植えて栽培できる。本発明に
従って処理した種子から植物体を繁殖させた後、植物体に病気抵抗性を付与し、
植物の生育を強化し、および／または植物体上の昆虫を防除するために、過敏感
反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質で植物体を１回以上処理すること
ができる。
【００５１】 過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質は、単独で、または他の
材料と混ぜて、本発明に従って、植物または植物種子に適用することができる。
または、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質は、異なった時機
に適用される別の材料とは別に植物へ適用することができる。
材料と混ぜて、本発明に従って、植物または植物種子に適用することができる。
または、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質は、異なった時機
に適用される別の材料とは別に植物へ適用することができる。
【００５２】 本発明の応用態様に従って植物または植物種子を処理するのに適した組成物は
、担体の中にか敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を含んでいる
。適当な担体としては、水、水溶液、スラリー、または乾燥粉末などがある。本
態様において、この組成物は、500nMよりも多い過敏感反応エリシターポリペプ チドまたはタンパク質を含む。
、担体の中にか敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を含んでいる
。適当な担体としては、水、水溶液、スラリー、または乾燥粉末などがある。本
態様において、この組成物は、500nMよりも多い過敏感反応エリシターポリペプ チドまたはタンパク質を含む。
【００５３】 必要ではないが、この組成物は、肥料、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、および
これらの混合物など、更に別の添加剤を含むことができる。適当な肥料としては
、(NH4)2NO3などがある。適当な殺虫剤の例はマラチオン(Malathion)である。有
用な殺真菌剤としては、キャプタン(Captan)などがある。
これらの混合物など、更に別の添加剤を含むことができる。適当な肥料としては
、(NH4)2NO3などがある。適当な殺虫剤の例はマラチオン(Malathion)である。有
用な殺真菌剤としては、キャプタン(Captan)などがある。
【００５４】 この他の適当な添加剤には、緩衝剤、湿潤剤、被覆剤、および摩砕剤などがあ
る。これらの素材を用いて、本発明の処理を容易にすることができる。さらに、
過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質は、粘土および多糖類など
、他の従来からある種子用調合剤および処理剤とともに植物種子へ適用すること
ができる。
る。これらの素材を用いて、本発明の処理を容易にすることができる。さらに、
過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質は、粘土および多糖類など
、他の従来からある種子用調合剤および処理剤とともに植物種子へ適用すること
ができる。
【００５５】 トランスジェニック植物およびトランスジェニック種子を使用することを含む
本発明の代替的態様において、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパ
ク質を植物または種子に局所的に用いる必要はない。その代わりに、過敏感反応
エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコードしているDNA分子で形質転換 されたトランスジェニック植物を、当該技術分野において周知の処理法に従って
作出する。
本発明の代替的態様において、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパ
ク質を植物または種子に局所的に用いる必要はない。その代わりに、過敏感反応
エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコードしているDNA分子で形質転換 されたトランスジェニック植物を、当該技術分野において周知の処理法に従って
作出する。
【００５６】 組換えDNAを機械的に移すために、前述のベクターを植物細胞にマイクロピペ ットを用いて直接微量注入することができる（本明細書に参照として組入れられ
ているCrosswayの論文、Mol. Gen. Genetics.、202:179-85(1985)）。遺伝的材 料は、ポリエチレングリコールを用いて、植物細胞へ移すこともできる（本明細
書に参照として組入れられているKrensらの論文、Nature、296:72-74(1982)）。
ているCrosswayの論文、Mol. Gen. Genetics.、202:179-85(1985)）。遺伝的材 料は、ポリエチレングリコールを用いて、植物細胞へ移すこともできる（本明細
書に参照として組入れられているKrensらの論文、Nature、296:72-74(1982)）。
【００５７】 病原菌に抵抗性を持つ遺伝子で植物細胞を形質転換する別の方法は、宿主細胞
のパーティクルガン法（バイオリスティック形質転換としても公知）である。こ
れは、いくつかの方法のひとつで達成することができる。第一の方法は、細胞へ
の不活性または生物学的に活性の粒子の打ち込みに関する。この技術は、米国特
許第4,945,050号、第5,036,006号および第5,100,792号に開示されているが、こ れらは全てStanfordらの特許であり、本明細書に参照として組入れられている。
一般に、この手順は、細胞外面を透過し、かつ細胞内に組込まれるのに有効な条
件下で、細胞で不活性または生物学的に活性の粒子を打ち込むことに関する。不
活性粒子を利用する場合は、粒子を異種DNAを含むベクターでコーティングする ことにより、ベクターを細胞内へ導入することができる。あるいは、標的細胞を
、ベクターで取り囲み、その結果ベクターが粒子の後を追って細胞へと運ばれる
ようにすることができる。生物学的に活性のある粒子（例えばベクターと異種DN
Aを含む乾燥した細菌細胞）も植物細胞に打ち込むことができる。
のパーティクルガン法（バイオリスティック形質転換としても公知）である。こ
れは、いくつかの方法のひとつで達成することができる。第一の方法は、細胞へ
の不活性または生物学的に活性の粒子の打ち込みに関する。この技術は、米国特
許第4,945,050号、第5,036,006号および第5,100,792号に開示されているが、こ れらは全てStanfordらの特許であり、本明細書に参照として組入れられている。
一般に、この手順は、細胞外面を透過し、かつ細胞内に組込まれるのに有効な条
件下で、細胞で不活性または生物学的に活性の粒子を打ち込むことに関する。不
活性粒子を利用する場合は、粒子を異種DNAを含むベクターでコーティングする ことにより、ベクターを細胞内へ導入することができる。あるいは、標的細胞を
、ベクターで取り囲み、その結果ベクターが粒子の後を追って細胞へと運ばれる
ようにすることができる。生物学的に活性のある粒子（例えばベクターと異種DN
Aを含む乾燥した細菌細胞）も植物細胞に打ち込むことができる。
【００５８】 更に別の導入法は、プロトプラストの、他の実体(entity)、ミニ細胞、細胞、
リソソームまたは他の融合可能な脂質表面を持つ本体のいずれかとの融合である
（本明細書に参照として組入れられているFraleyらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、79:1859-63(1982)）。
リソソームまたは他の融合可能な脂質表面を持つ本体のいずれかとの融合である
（本明細書に参照として組入れられているFraleyらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、79:1859-63(1982)）。
【００５９】 DNA分子は更に、電気穿孔により植物細胞へ導入することができる（本明細書 に参照として組入れられているFrommらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、8
2:5824(1985)）。この技術において、植物のプロトプラストは、発現カセットを
有するプラスミドの存在下で、電気穿孔される。高い電場強度の電気パルスは、
プラスミドを導入できるように生体膜を可逆的に透過する。電気穿孔された植物
のプロトプラストは、細胞壁を再構築し、分割され、かつ再生される。
2:5824(1985)）。この技術において、植物のプロトプラストは、発現カセットを
有するプラスミドの存在下で、電気穿孔される。高い電場強度の電気パルスは、
プラスミドを導入できるように生体膜を可逆的に透過する。電気穿孔された植物
のプロトプラストは、細胞壁を再構築し、分割され、かつ再生される。
【００６０】 植物細胞にDNA分子を導入する別の方法は、あらかじめ該遺伝子で形質転換さ れたアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)また はA.リゾゲネス(A. rhizogenes)による植物細胞の感染である。当該技術分野に おいて公知の適切な条件下で、形質転換された植物細胞は増殖し、徒長枝または
根を形成し、更に植物体へと成長する。一般にこの方法は、細菌浮遊液による植
物組織の接種、および組織の抗生物質を含まない再生培地上の25〜28℃での48〜
72時間の培養に関連している。
根を形成し、更に植物体へと成長する。一般にこの方法は、細菌浮遊液による植
物組織の接種、および組織の抗生物質を含まない再生培地上の25〜28℃での48〜
72時間の培養に関連している。
【００６１】 アグロバクテリウムは、リゾビアセアエ科のグラム陰性菌の代表的種である。
この種は、クラウンゴール（A.ツメファシエンス）および毛根の病気（A.リゾゲ
ネス）に寄与している。クラウンゴール腫瘍や毛根中の植物細胞は、細菌によっ
てのみ異化されるオパインとして公知のアミノ酸誘導体の生成が誘導される。オ
パインの発現に寄与している細菌遺伝子は、キメラ発現カセットの調節エレメン
トの都合の良い供給源である。これに加えて、オパインの存在をアッセイして、
形質転換された組織を同定することができる。
この種は、クラウンゴール（A.ツメファシエンス）および毛根の病気（A.リゾゲ
ネス）に寄与している。クラウンゴール腫瘍や毛根中の植物細胞は、細菌によっ
てのみ異化されるオパインとして公知のアミノ酸誘導体の生成が誘導される。オ
パインの発現に寄与している細菌遺伝子は、キメラ発現カセットの調節エレメン
トの都合の良い供給源である。これに加えて、オパインの存在をアッセイして、
形質転換された組織を同定することができる。
【００６２】 A.ツメファシエンスのTiプラスミドまたはA.リゾゲネスのRiプラスミドにより
、異種遺伝子配列を、適当な植物細胞に導入することができる。TiおよびRiプラ
スミドは、アグロバクテリウムに感染時に植物細胞に伝達され、植物ゲノムに安
定して導入される。本明細書に参照として組入れられているシェル（J.Schell）
の論文、Science、237:1176-83(1987)。
、異種遺伝子配列を、適当な植物細胞に導入することができる。TiおよびRiプラ
スミドは、アグロバクテリウムに感染時に植物細胞に伝達され、植物ゲノムに安
定して導入される。本明細書に参照として組入れられているシェル（J.Schell）
の論文、Science、237:1176-83(1987)。
【００６３】 形質転換後、形質転換された細胞は再生されなければならない。
【００６４】 培養したプロトプラストからの植物の再生は、エバンス（Evans）らの論文、 植物細胞培養ハンドブック（Handbook of Plant Cell Cultures 、第1巻：マクミ
ラン出版社、ニューヨーク、1983年）；およびバシル（Vasil I.R.）編集の植物 細胞培養および植物体細胞遺伝学Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants 、アカデミックプレス社、オーランド、第1巻、1984年、および第3巻、19
86年）に記載されており、これらは本明細書に参照として組入れられている。
ラン出版社、ニューヨーク、1983年）；およびバシル（Vasil I.R.）編集の植物 細胞培養および植物体細胞遺伝学Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants 、アカデミックプレス社、オーランド、第1巻、1984年、および第3巻、19
86年）に記載されており、これらは本明細書に参照として組入れられている。
【００６５】 特にサトウキビ、テンサイ、ワタ、果樹、およびマメの全ての主要な種を含む
が、これに限定されるものではない、あらゆる植物が、培養された細胞または組
織から再生できることが公知である。
が、これに限定されるものではない、あらゆる植物が、培養された細胞または組
織から再生できることが公知である。
【００６６】 再生手段は、植物種毎に異なるが、一般に形質転換されたプロトプラストの浮
遊液または形質転換された外植片(explant)を含むペトリ皿が最初に提供される 。カルス組織が形成され、かつこのカルスから徒長枝が誘導され、次に根が生え
る。あるいは、胚の形成が、カルス組織において誘導される。これらの胚は天然
の胚のように発芽し、植物体を形成する。培地は一般に、オーキシンやサイトカ
インのような様々なアミノ酸およびホルモンを含むであろう。培地へのグルタミ
ン酸やプロリンの添加も、特にトウモロコシやアルファルファのような種におい
ては利点である。効率的再生は、培地、遺伝子型、および培養歴によって左右さ
れるであろう。これら3種の変数が制御できる場合は、従って再生は通常再現可 能かつ反復可能なものである。
遊液または形質転換された外植片(explant)を含むペトリ皿が最初に提供される 。カルス組織が形成され、かつこのカルスから徒長枝が誘導され、次に根が生え
る。あるいは、胚の形成が、カルス組織において誘導される。これらの胚は天然
の胚のように発芽し、植物体を形成する。培地は一般に、オーキシンやサイトカ
インのような様々なアミノ酸およびホルモンを含むであろう。培地へのグルタミ
ン酸やプロリンの添加も、特にトウモロコシやアルファルファのような種におい
ては利点である。効率的再生は、培地、遺伝子型、および培養歴によって左右さ
れるであろう。これら3種の変数が制御できる場合は、従って再生は通常再現可 能かつ反復可能なものである。
【００６７】 発現カセットがトランスジェニック植物に安定導入された後、有性交配により
他の植物体へ転移することができる。多くの標準的繁殖技術のいずれかを、交配
される種に応じて使用することができる。
他の植物体へ転移することができる。多くの標準的繁殖技術のいずれかを、交配
される種に応じて使用することができる。
【００６８】 一旦この種のトランスジェニック植物が作出されると、植物体それ自身を常法
に従い、過敏感反応エリシターをコードしている遺伝子の存在下で、栽培するこ
とができ、その結果病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または
植物上で昆虫を防除することができる。あるいは、トランスジェニック種子が、
トランスジェニック植物から回収される。これらの種子は次に土壌に植え、常法
により栽培し、トランスジェニック植物を作出することができる。このトランス
ジェニック植物は、植えられたトランスジェニック種子から、植物体に病気抵抗
性を付与し、植物の生育を強化し、および／または昆虫を防除するような条件下
で繁殖される。理論的裏付けを意図するものではないが、このような病気抵抗性
、生育の強化および／または昆虫防除は、RNA媒介型であるか、もしくは、エリ シターポリペプチドまたはタンパク質の発現の結果であることができる。
に従い、過敏感反応エリシターをコードしている遺伝子の存在下で、栽培するこ
とができ、その結果病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または
植物上で昆虫を防除することができる。あるいは、トランスジェニック種子が、
トランスジェニック植物から回収される。これらの種子は次に土壌に植え、常法
により栽培し、トランスジェニック植物を作出することができる。このトランス
ジェニック植物は、植えられたトランスジェニック種子から、植物体に病気抵抗
性を付与し、植物の生育を強化し、および／または昆虫を防除するような条件下
で繁殖される。理論的裏付けを意図するものではないが、このような病気抵抗性
、生育の強化および／または昆虫防除は、RNA媒介型であるか、もしくは、エリ シターポリペプチドまたはタンパク質の発現の結果であることができる。
【００６９】 本発明にしたがってトランスジェニック植物および植物種子を用いるとき、過
敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を適用した植物または種子を
処理するために用いた材料と同じもので、さらに、それらを処理することができ
る。これら、過敏感反応エリシターを含む他の材料を、高圧または低圧の噴霧、
注入、被覆、および浸漬を含む上記の処理法によって、トランスジェニック植物
または植物種子に適用することができる。同様に、トランスジェニック種子から
植物体を繁殖させた後、病気への抵抗性を付与するため、生長を増強させるため
、および／または昆虫を防除するために、過敏感反応エリシターを1回以上適用 して植物を処理することができる。従来からある植物処理剤（例えば、殺虫剤、
肥料など）で、これらの植物を処理することもできる。
敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を適用した植物または種子を
処理するために用いた材料と同じもので、さらに、それらを処理することができ
る。これら、過敏感反応エリシターを含む他の材料を、高圧または低圧の噴霧、
注入、被覆、および浸漬を含む上記の処理法によって、トランスジェニック植物
または植物種子に適用することができる。同様に、トランスジェニック種子から
植物体を繁殖させた後、病気への抵抗性を付与するため、生長を増強させるため
、および／または昆虫を防除するために、過敏感反応エリシターを1回以上適用 して植物を処理することができる。従来からある植物処理剤（例えば、殺虫剤、
肥料など）で、これらの植物を処理することもできる。
【００７０】 実施例実施例1 −細菌株およびプラスミド E.アミローボラEa321およびEa273は、リンゴ科植物に感染する野生型の菌株で
ある（本明細書に参照として組入れられているBeerらの論文、The hrp Gene Clu ster of Erwinia amylovora 、Hennecke, H.およびVerma, D.P.S.編集（クルワー
アカデミック出版、ドルレヒト、オランダ）、第1巻、53〜50頁(1991)）。E.col
i DH5αを、通常のようにプラスミド宿主として使用した。pCPP1012は、pCPP430
のサブクローンであり、かつpCPP1152、pCPP1218、pCPP1219およびpCPP1220は、
pCPP1012の制限断片のpBluescript KS(+)（ストラタジーン社、ラホヤ、CA）へ のクローニングにより構築した（図1B）。pCPP1127は、pCPP1220から同じベクタ
ーヘとクローニングした。
ある（本明細書に参照として組入れられているBeerらの論文、The hrp Gene Clu ster of Erwinia amylovora 、Hennecke, H.およびVerma, D.P.S.編集（クルワー
アカデミック出版、ドルレヒト、オランダ）、第1巻、53〜50頁(1991)）。E.col
i DH5αを、通常のようにプラスミド宿主として使用した。pCPP1012は、pCPP430
のサブクローンであり、かつpCPP1152、pCPP1218、pCPP1219およびpCPP1220は、
pCPP1012の制限断片のpBluescript KS(+)（ストラタジーン社、ラホヤ、CA）へ のクローニングにより構築した（図1B）。pCPP1127は、pCPP1220から同じベクタ
ーヘとクローニングした。
【００７１】実施例2 −分子生物学的技術および配列解析 一般的な分子的手順は、公表された標準的技法を用いて行った（本明細書に参
照として組入れられているSambrookらの論文、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 、（コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハ ーバー、NY）(1989)）。配列決定は、コーネル大学のバイオテクノロジープログ
ラムDNAシーケンシング施設においてABI 373A自動DNAシークエンサーを用いて行
った。DNAおよびタンパク質の配列解析については、GCGソフトウェアパッケージ
、ver.7.3（ジェネティックス・コンピュータ・グループ社、マディソン、WI） およびDNASTAR（DNASTAR社、マディソン、WI）を使用した。
照として組入れられているSambrookらの論文、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 、（コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハ ーバー、NY）(1989)）。配列決定は、コーネル大学のバイオテクノロジープログ
ラムDNAシーケンシング施設においてABI 373A自動DNAシークエンサーを用いて行
った。DNAおよびタンパク質の配列解析については、GCGソフトウェアパッケージ
、ver.7.3（ジェネティックス・コンピュータ・グループ社、マディソン、WI） およびDNASTAR（DNASTAR社、マディソン、WI）を使用した。
【００７２】実施例3 −E.coliにおけるhrpWの発現 hrpWを含むpCPP1227の1.4kb Hpal断片を、pBC SK(-)(ストラタジーン社、ラホ
ヤ、CA）に、hrpWがT7Φ1Oプロモーターの制御下にあるようにサブクローニング
した。得られたプラスミドpCPP1232（図1B）を、E.coli DH5α(pGP1-2)に導入し
た（本明細書に参照として組入れられているTaborらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 、82:1074-78(1985)）。細胞を、42℃でインキュベーションし、T7 RN
Aポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導し、かつ新たに合成されたタンパク質を、記 載されているように35S-Metで放射性標識した（Taborらの論文、Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 、82:1074-78(1985)）。得られた試料を、亀裂(crackling)バッフ ァー中で再懸濁し、かつ95℃で3分間加熱した後、10％ゲル中でSDS-ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を行った。
ヤ、CA）に、hrpWがT7Φ1Oプロモーターの制御下にあるようにサブクローニング
した。得られたプラスミドpCPP1232（図1B）を、E.coli DH5α(pGP1-2)に導入し
た（本明細書に参照として組入れられているTaborらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 、82:1074-78(1985)）。細胞を、42℃でインキュベーションし、T7 RN
Aポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導し、かつ新たに合成されたタンパク質を、記 載されているように35S-Metで放射性標識した（Taborらの論文、Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 、82:1074-78(1985)）。得られた試料を、亀裂(crackling)バッフ ァー中で再懸濁し、かつ95℃で3分間加熱した後、10％ゲル中でSDS-ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を行った。
【００７３】実施例4 −HrpWの精製 E.coli DH5α(pGP1-2、pCPP1232)の42℃での熱ショック処理により作成したHr
pWを、HrpWを含有するゲル領域を切り出し、タンパク質をELUTRAP（シュレイチ ャー＆シュエル社、キーン、NH)で溶出し、かつHrpW-含有溶液を、Centriprep-3
0（アミコン社、ビバリー、MA)および5mMリン酸カリウム(KP04)バッファー(pH6.
5)を用いて脱塩することにより精製した。または、熱で誘導しかつ10-倍濃縮し たE.coli DH5α(pGP1-2、pCPP1232)細胞を、1mMフェニルメタンスルホニルフル オリド(PMSF)(phenylmethlsulfonyl fluoide)の存在下で音波処理し、煮沸水浴 に10分間静置し、17,500gで10分間遠心分離した。上清を脱塩して、HrpWの“無 細胞エリシター調製物(CFEP)”を得た。HrpNを過剰産生するE.coli DH5α(pCPP2
139)からも、同じ方法でHrpWのCFEPを調製した。
pWを、HrpWを含有するゲル領域を切り出し、タンパク質をELUTRAP（シュレイチ ャー＆シュエル社、キーン、NH)で溶出し、かつHrpW-含有溶液を、Centriprep-3
0（アミコン社、ビバリー、MA)および5mMリン酸カリウム(KP04)バッファー(pH6.
5)を用いて脱塩することにより精製した。または、熱で誘導しかつ10-倍濃縮し たE.coli DH5α(pGP1-2、pCPP1232)細胞を、1mMフェニルメタンスルホニルフル オリド(PMSF)(phenylmethlsulfonyl fluoide)の存在下で音波処理し、煮沸水浴 に10分間静置し、17,500gで10分間遠心分離した。上清を脱塩して、HrpWの“無 細胞エリシター調製物(CFEP)”を得た。HrpNを過剰産生するE.coli DH5α(pCPP2
139)からも、同じ方法でHrpWのCFEPを調製した。
【００７４】実施例5 −HrpWの免疫学的検出 コーネル大学獣医学部で、HrpWに対するポリクローナル抗体を、ウサギにHrpW
の約100μgを、2〜3週間の間隔で3回注射することにより作成した。最終注射後2
週間で、抗血清を採取し、E.coli DH5α(pGP1-2、pBC SK(-))の熱処理溶菌液と 交差−吸着した。
の約100μgを、2〜3週間の間隔で3回注射することにより作成した。最終注射後2
週間で、抗血清を採取し、E.coli DH5α(pGP1-2、pBC SK(-))の熱処理溶菌液と 交差−吸着した。
【００７５】 E.アミローボラEa321Rp（Ea321のリファンピシン-耐性誘導体）、Ea321-K49(h
rpL::Tn lO-miniKim) （本明細書に参照として組入れられているWeiらの論文、J . Bacteriol. 、177:62Ol-10(1995)）、Ea321-G84(hrcC::Tn5-gusA1)（本明細書 に参照として組入れられているKimらの論文、J. Bacteriol.、179:1690-97(1997
)）、Ea273Rp、Ea273-K49、およびEa273-G73(hrcV::Tn5-gusA1)を、Terrificブ ロス上で一晩増殖し、1H108 cfu／mlでhrp最小培地（本明細書に参照として組入
れられているHuynhらの論文、Science、345:1374-77(1989)）に移し、かつ細菌 が1H109 cfu/mlに増殖するまで20℃でインキュベーションした。培地を17,500g で遠心分離し、ペレットを負荷用バッファー中に再懸濁した。上清は、1mM PMSF
を添加してからメンブレンフィルター(孔径0.2μm；ワットマン社、フェアフィ ールド、NJ)を通し、Centricon-1OおよびMicrocon-1O（アミコン社、ビバリー、
MA）を用いて4℃で100倍濃縮した。その後細胞分画と上清分画の両方を、10％ゲ
ルでのSDS-PAGEにかけた。
rpL::Tn lO-miniKim) （本明細書に参照として組入れられているWeiらの論文、J . Bacteriol. 、177:62Ol-10(1995)）、Ea321-G84(hrcC::Tn5-gusA1)（本明細書 に参照として組入れられているKimらの論文、J. Bacteriol.、179:1690-97(1997
)）、Ea273Rp、Ea273-K49、およびEa273-G73(hrcV::Tn5-gusA1)を、Terrificブ ロス上で一晩増殖し、1H108 cfu／mlでhrp最小培地（本明細書に参照として組入
れられているHuynhらの論文、Science、345:1374-77(1989)）に移し、かつ細菌 が1H109 cfu/mlに増殖するまで20℃でインキュベーションした。培地を17,500g で遠心分離し、ペレットを負荷用バッファー中に再懸濁した。上清は、1mM PMSF
を添加してからメンブレンフィルター(孔径0.2μm；ワットマン社、フェアフィ ールド、NJ)を通し、Centricon-1OおよびMicrocon-1O（アミコン社、ビバリー、
MA）を用いて4℃で100倍濃縮した。その後細胞分画と上清分画の両方を、10％ゲ
ルでのSDS-PAGEにかけた。
【００７６】 ゲル中のタンパク質を、Immobilon-P（ミリポア社、ベッドフォード、MA）に 移し、Ea273およびE.coli株についてはビオチン化した抗−ウサギIgG、エクスト
ラアビジン、およびBCIP/NBT錠からなるシステム（シグマ社、セント・ルイス、
MO）を、ならびにEa321についてはWestern-Light Plusシステム（トロピックス 社、ベッドフォード、MA）を用いてウェスタンブロットを行った。
ラアビジン、およびBCIP/NBT錠からなるシステム（シグマ社、セント・ルイス、
MO）を、ならびにEa321についてはWestern-Light Plusシステム（トロピックス 社、ベッドフォード、MA）を用いてウェスタンブロットを行った。
【００７７】実施例6 −HrpWのN-末端断片の作成 pCPP1232をBamHIおよびBstEIIで消化し、4.1-kb断片の末端を、クレノウ断片 を用いて平滑化し、自己ライゲーションした。得られたプラスミドpCPP1254は、
HrpWの226個のアミノ酸のN-末端およびベクター配列に由来するIle-His残基をコ
ードしているが、これをE.coli DH5αにクローニングし、その後E.coli DH5α(p
GP1-2)に移し、E.coli DH5α(pGP1-2、pCPP1254)を作成した。
HrpWの226個のアミノ酸のN-末端およびベクター配列に由来するIle-His残基をコ
ードしているが、これをE.coli DH5αにクローニングし、その後E.coli DH5α(p
GP1-2)に移し、E.coli DH5α(pGP1-2、pCPP1254)を作成した。
【００７８】実施例7 −植物のアッセイ HRの誘起を、タンパク質または細菌の調製物を、タバコ葉（ニコチアナ・タバ
カム(Nicoliana tabacm) L.、'xanthi') および他の植物の細胞間隙に浸潤する ことにより試験した（本明細書に参照として組入れられているKimらの論文、J. Bacteriol. 、179:1690-97(1997)）。細胞を、Luriaブロス（E.coli DH5αおよび
MC41OO）またはhrp最小培地（本明細書に参照として組入れられているHuynhらの
論文、Science、345:1374-77(1989)）（E.アミローボラEa321およびEa321-T5） のいずれかの中で5H108 cfu/mlまで増殖し、5mM KP04バッファー(pH6.5)中で、2
H108 cfu/ml（E.coli株）または5H108 cfu/ml（E.アミローボラ株）となるよう に再浮遊した。使用した植物の代謝阻害剤は、100μMのシクロヘキシミド、1mM
LaCl3、および50μMのNa3VO4であった。
カム(Nicoliana tabacm) L.、'xanthi') および他の植物の細胞間隙に浸潤する ことにより試験した（本明細書に参照として組入れられているKimらの論文、J. Bacteriol. 、179:1690-97(1997)）。細胞を、Luriaブロス（E.coli DH5αおよび
MC41OO）またはhrp最小培地（本明細書に参照として組入れられているHuynhらの
論文、Science、345:1374-77(1989)）（E.アミローボラEa321およびEa321-T5） のいずれかの中で5H108 cfu/mlまで増殖し、5mM KP04バッファー(pH6.5)中で、2
H108 cfu/ml（E.coli株）または5H108 cfu/ml（E.アミローボラ株）となるよう に再浮遊した。使用した植物の代謝阻害剤は、100μMのシクロヘキシミド、1mM
LaCl3、および50μMのNa3VO4であった。
【００７９】実施例8 −サザンブロット ゲノムDNAを、EcoRIで消化し、0.7％アガロースゲル上で電気泳動し、Immobil
on-N膜（ミリポア社、ベッドフォード、MA）に移し、pCPP1227の32P-標識した1.
4kb-Hpal断片で、65℃、24時間ハイブリダイズした。この膜を、65℃の2H SCCお
よび0.1％ SDS溶液で2回洗浄し、洗浄液中に放射能が検出されなくなるまで0.1H
SCCで洗浄した。ストリンジェンシーが低いハイブリダイゼーションについては
、膜を50℃でインキュヴェーションし、かつ45℃の2H SCCで洗浄した。
on-N膜（ミリポア社、ベッドフォード、MA）に移し、pCPP1227の32P-標識した1.
4kb-Hpal断片で、65℃、24時間ハイブリダイズした。この膜を、65℃の2H SCCお
よび0.1％ SDS溶液で2回洗浄し、洗浄液中に放射能が検出されなくなるまで0.1H
SCCで洗浄した。ストリンジェンシーが低いハイブリダイゼーションについては
、膜を50℃でインキュヴェーションし、かつ45℃の2H SCCで洗浄した。
【００８０】実施例9 −HrpWのペクチックエンザイムアッセイ 熱で誘導したE.coli DH5α(pGP1-2、pCPP1232)をペレット化し、1/10量の5mM
KP04バッファー(pH6.5)または10mM Tris-HCl(pH8.5)中に再浮遊し、氷上で音波 処理し、遠心分離し、上清のPL活性を測定した。さらに50-倍濃縮したEa321培地
の上清についてもこの試験を行った。10mM Tris-HCl(pH7.8)を溶媒とするエルウ
ィニア・クリサンセミEC16の希PelEを対照として用いた。
KP04バッファー(pH6.5)または10mM Tris-HCl(pH8.5)中に再浮遊し、氷上で音波 処理し、遠心分離し、上清のPL活性を測定した。さらに50-倍濃縮したEa321培地
の上清についてもこの試験を行った。10mM Tris-HCl(pH7.8)を溶媒とするエルウ
ィニア・クリサンセミEC16の希PelEを対照として用いた。
【００８１】 各調製物10μLを、0.7％ポリガラクツロン酸（シグマ社、セント・ルイス、MO
）または0.7％ペクチン（88％メトキシル化；シグマ社、セント・ルイス、MO） を含有するYC寒天プレート上にpH6.5、8.0または9.5で（本明細書に参照として 組入れられているKeenらの論文、J. Bacteriol.、159:825-31(1984)）、および3
％ペクチン（88％メトキシル化）を含むペクチン半固形寒天プレート（本明細書
に参照として組入れられているStarrらの論文、J. Clin. Microbiol.、6:379-86
(1977)）中にpH6.5、8.0または9.5でスポットした。これらのプレートを37℃で2
4時間インキュベーションし、1M CaCl2中に浸水させ、かつハロゲンの存在につ いて調べた。粘度計分析（本明細書に参照として組入れられているBateman, D.F
.の論文、Phytopathology、53:197-204(1963)）および修飾されたチオバルビツ ール酸(thioarbituric acid)法（本明細書に参照として組入れられているSherwo
od, R.T.の論文、Phytopathology、56:279-86(1966)）を、2.5mM CaCl2および1O
OmM Tris-HCl、pH9.5中で、 基質として1％ポリガラクツロン酸または1％ペクチ
ン（68％メトキシル化）を用いて行った。等電点電気泳動法および分光光度法を
含む、前述の方法よりも恐らくより感度が高い方法も試みた。試料10μLを、0.2
％ペクチン（88％メトキシル化）、1％アガロース、1.5mM CaCl2、および50mM T
ris-HCl(pH8.8)を含有するオーバーレイゲル上に載せ（本明細書に参照として組
入れられているCollmerらの論文、J. Bacteriol.、161:913-20(1985)）、プラス
チックフィルムで覆った。ゲルを28℃で24時間インキュベーションし、1％ヘキ サデシルトリメチル臭化アンモニウムで浸水し、かつ透明化(clearing)について
調べた。二重結合の形成によりPL活性をアッセイするために、O.1％ペクチン（6
8％メトキシル化）、5mM CaCl2、および100mM Tris-HClの1.9ml溶液、pH5.5また
は9.5に、試料100μLを混合し、232nmでの吸光度の変化を記載されているように
30分間記録した（本明細書に参照として組入れられているAlfanoらの論文、J. B acteriol. 、177:4553-56(1995)）。
）または0.7％ペクチン（88％メトキシル化；シグマ社、セント・ルイス、MO） を含有するYC寒天プレート上にpH6.5、8.0または9.5で（本明細書に参照として 組入れられているKeenらの論文、J. Bacteriol.、159:825-31(1984)）、および3
％ペクチン（88％メトキシル化）を含むペクチン半固形寒天プレート（本明細書
に参照として組入れられているStarrらの論文、J. Clin. Microbiol.、6:379-86
(1977)）中にpH6.5、8.0または9.5でスポットした。これらのプレートを37℃で2
4時間インキュベーションし、1M CaCl2中に浸水させ、かつハロゲンの存在につ いて調べた。粘度計分析（本明細書に参照として組入れられているBateman, D.F
.の論文、Phytopathology、53:197-204(1963)）および修飾されたチオバルビツ ール酸(thioarbituric acid)法（本明細書に参照として組入れられているSherwo
od, R.T.の論文、Phytopathology、56:279-86(1966)）を、2.5mM CaCl2および1O
OmM Tris-HCl、pH9.5中で、 基質として1％ポリガラクツロン酸または1％ペクチ
ン（68％メトキシル化）を用いて行った。等電点電気泳動法および分光光度法を
含む、前述の方法よりも恐らくより感度が高い方法も試みた。試料10μLを、0.2
％ペクチン（88％メトキシル化）、1％アガロース、1.5mM CaCl2、および50mM T
ris-HCl(pH8.8)を含有するオーバーレイゲル上に載せ（本明細書に参照として組
入れられているCollmerらの論文、J. Bacteriol.、161:913-20(1985)）、プラス
チックフィルムで覆った。ゲルを28℃で24時間インキュベーションし、1％ヘキ サデシルトリメチル臭化アンモニウムで浸水し、かつ透明化(clearing)について
調べた。二重結合の形成によりPL活性をアッセイするために、O.1％ペクチン（6
8％メトキシル化）、5mM CaCl2、および100mM Tris-HClの1.9ml溶液、pH5.5また
は9.5に、試料100μLを混合し、232nmでの吸光度の変化を記載されているように
30分間記録した（本明細書に参照として組入れられているAlfanoらの論文、J. B acteriol. 、177:4553-56(1995)）。
【００８２】実施例10 −グリシンが豊富なタンパク質をコードしている遺伝子の同定 E.coliのhrpN変異体pCPP430-T5およびpCPP450-T5は、残存するHR-誘起活性を 発揮し（図5A、パネル2および4）、このことは、これらのクローン中に別のHRエ
リシターが存在することを示唆している。したがってpCPP430およびpCPP450が重
なっているhrpNの下流側DNAをサブクローニングし、かつその配列を決定した。 これは、4種のオープンリーディングフレームを明らかにし、これらはORFA、ORF B、ORFCおよびhrpWと称した（図1B）。推定されるHrpL-依存型プロモーター（本
明細書に参照として組入れられているBogdanoveらの論文、J. Bacteriol.、178:
1720-30(1996)およびKimらの論文、J. Bacteriol.、179:1690-97(1997)）である
CGGAACC-N4-C-N10-CCACTCAATが、hrpWの開始コドンの58-bp上流に見つかり、こ のことは、hrpWの発現が別のシグマ因子であるHrpLにより制御されていることを
示唆している（本明細書に参照として組入れられているWeiらの論文、J. Bacter iol. 、177:6201-10(1995)）。pCPP1232のhrpW（図1B)を、T7 RNAポリメラーゼ／
プロモーターシステムを用いて発現し、見かけの分子量が約60-kDaの特異的タン
パク質バンドが得られた（図2)。これは予想されたサイズ45-kDaよりも大きかっ
た。しかし同じサイズのバンドが、E.アミローボラの上清でも認められ（図4)、
これはこのタンパク質の異常なサイズがクローニングの人為的結果ではないこと
を示した。
リシターが存在することを示唆している。したがってpCPP430およびpCPP450が重
なっているhrpNの下流側DNAをサブクローニングし、かつその配列を決定した。 これは、4種のオープンリーディングフレームを明らかにし、これらはORFA、ORF B、ORFCおよびhrpWと称した（図1B）。推定されるHrpL-依存型プロモーター（本
明細書に参照として組入れられているBogdanoveらの論文、J. Bacteriol.、178:
1720-30(1996)およびKimらの論文、J. Bacteriol.、179:1690-97(1997)）である
CGGAACC-N4-C-N10-CCACTCAATが、hrpWの開始コドンの58-bp上流に見つかり、こ のことは、hrpWの発現が別のシグマ因子であるHrpLにより制御されていることを
示唆している（本明細書に参照として組入れられているWeiらの論文、J. Bacter iol. 、177:6201-10(1995)）。pCPP1232のhrpW（図1B)を、T7 RNAポリメラーゼ／
プロモーターシステムを用いて発現し、見かけの分子量が約60-kDaの特異的タン
パク質バンドが得られた（図2)。これは予想されたサイズ45-kDaよりも大きかっ
た。しかし同じサイズのバンドが、E.アミローボラの上清でも認められ（図4)、
これはこのタンパク質の異常なサイズがクローニングの人為的結果ではないこと
を示した。
【００８３】実施例11 −hrpW産物の予想される特徴 hrpWは、酸性(pl-4.5)親水性であり、Gly、SerおよびAsnが豊富で、Glu、Arg 、TrpおよびTyrが少なく、Cysをもたないような、447個のアミノ酸残基のタンパ
ク質をコードしていると推定された（図3）。これらの特徴はハーピン類に似て いるが、HrpWの一次構造はそれらのいずれとも相同ではないように見えた。HrpW
の配列は、このタンパク質が2個のドメイン：N-末端のGlyとSerが豊富なドメイ ン、およびPLと相同なC-末端ドメインから成ることを示している（下記参照）。
GlyおよびSerの約2/3は、N-末端領域に位置している。最初の240個のアミノ酸残
基中のGlyおよびSerの含量は、各々、17.5％および14.2％である。N-末端領域は
、5個のサブ領域に分割することができ、かつ両親媒性のα−ヘリックスを形成 する2個の配列を含む（残基40〜59および131〜145）。N-末端の最初の39残基は 、多くのGly、Ser、LeuおよびAsnを含んでいるが、帯電したまたは芳香族アミノ
酸はほとんど含まない。同様に、2個の可能性のあるα−ヘリックスが連結して いるこの領域は、Gly、AsnおよびGln含量は高いが、芳香族残基は含まない。残 基146-232は、いくつかのSer/Thr-Pro/Ser/Thr-Pro/Ser/Thrの反復を含み、この
ことはこの領域がリンカーであり得ることを示唆している（本明細書に参照とし
て組入れられているGilkesらの論文、Microbiol. Rev.、55:303-15(1991)）。
ク質をコードしていると推定された（図3）。これらの特徴はハーピン類に似て いるが、HrpWの一次構造はそれらのいずれとも相同ではないように見えた。HrpW
の配列は、このタンパク質が2個のドメイン：N-末端のGlyとSerが豊富なドメイ ン、およびPLと相同なC-末端ドメインから成ることを示している（下記参照）。
GlyおよびSerの約2/3は、N-末端領域に位置している。最初の240個のアミノ酸残
基中のGlyおよびSerの含量は、各々、17.5％および14.2％である。N-末端領域は
、5個のサブ領域に分割することができ、かつ両親媒性のα−ヘリックスを形成 する2個の配列を含む（残基40〜59および131〜145）。N-末端の最初の39残基は 、多くのGly、Ser、LeuおよびAsnを含んでいるが、帯電したまたは芳香族アミノ
酸はほとんど含まない。同様に、2個の可能性のあるα−ヘリックスが連結して いるこの領域は、Gly、AsnおよびGln含量は高いが、芳香族残基は含まない。残 基146-232は、いくつかのSer/Thr-Pro/Ser/Thr-Pro/Ser/Thrの反復を含み、この
ことはこの領域がリンカーであり得ることを示唆している（本明細書に参照とし
て組入れられているGilkesらの論文、Microbiol. Rev.、55:303-15(1991)）。
【００８４】実施例12 −HrpWのC-末端はペクテートリアーゼと相同である BLASTおよびFASTAアルゴリズムを用いるデータベースの検索（本明細書に参照
として組入れられているAltschulらの論文、J. Mol. Biol.、215:403-10(1990) およびPearsonらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85:2444-48(1988)）は 、HrpWのC-末端領域がネクトリア・ハエマトコッカ接合型IV（フサリウム・ソラ
ニf.sp.ピシ）のPL A-Dと相同であることを示した（本明細書に参照として組入 れられているGonzalezらの論文、J. Bacteriol.、174:6343-49(1992)；Guoらの 論文、J. Bactcriol.、177:7070-77(1995)；Guoらの論文、Arch. Biochem. Biop hys. 、323:352-60(1995)；および、Guoらの論文、Arch Brochem Biophys.、332:
305-12(1996))。デフォルトパラメータによる試行で得られたBLASTのP()値およ びFASTAのE()値は、各々、4.0e-14〜3.03-1Oおよび2.7e-08〜1e-06であった。BE
STFITを並置すると、HrpWは、真菌のPLと27〜33％同一であり、かつZ-スコアは8
.14〜13.3であった。さらに、N.ハエマトコッカのPLでデータベースを検索した ところ、これらがエルウィニア・カロトボーラ亜種カロトボーラのPel-3およびP
elBと相同であることを示した（本明細書に参照として組入れられているLiuらの
論文、Appl. Env. Microbiol.、60:2545-52(1994)およびHeikinheimoらの論文、 Mol. Plant-Microbe Interact. 、8:207-17(1995)）。（BLASTPのP()値は9.0e-15
〜8.6e-1Oの範囲であり、かつBESTFITの同一性は31〜36％であった。）。これら
の真菌PLおよびE.カロトボーラPel-3/PelBは、HrpWと共に、他のPLファミリーと
は別のクラスを形成している。これらのタンパク質の並置から、5個の高度に保 存されたブロックが認められた（図3）。7種のメンバーは、20個の同一の残基を
共有し、その中の5個がGlyであった。PHDアルゴリズムは、HrpWのPL-相同領域に
ついて、α−ヘリックスを形成する傾向がある残基329-336の配列以外は、β（ ＆）−シートおよびループであると予想した（図3）。興味深いことに、HrpWは 、このクラスのPL間では保存されているCysを全く含まない。さらにHrpWのPL活 性は、「材料および方法」に記されたいくつかの試験法を用いても検出されなか
った。
として組入れられているAltschulらの論文、J. Mol. Biol.、215:403-10(1990) およびPearsonらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85:2444-48(1988)）は 、HrpWのC-末端領域がネクトリア・ハエマトコッカ接合型IV（フサリウム・ソラ
ニf.sp.ピシ）のPL A-Dと相同であることを示した（本明細書に参照として組入 れられているGonzalezらの論文、J. Bacteriol.、174:6343-49(1992)；Guoらの 論文、J. Bactcriol.、177:7070-77(1995)；Guoらの論文、Arch. Biochem. Biop hys. 、323:352-60(1995)；および、Guoらの論文、Arch Brochem Biophys.、332:
305-12(1996))。デフォルトパラメータによる試行で得られたBLASTのP()値およ びFASTAのE()値は、各々、4.0e-14〜3.03-1Oおよび2.7e-08〜1e-06であった。BE
STFITを並置すると、HrpWは、真菌のPLと27〜33％同一であり、かつZ-スコアは8
.14〜13.3であった。さらに、N.ハエマトコッカのPLでデータベースを検索した ところ、これらがエルウィニア・カロトボーラ亜種カロトボーラのPel-3およびP
elBと相同であることを示した（本明細書に参照として組入れられているLiuらの
論文、Appl. Env. Microbiol.、60:2545-52(1994)およびHeikinheimoらの論文、 Mol. Plant-Microbe Interact. 、8:207-17(1995)）。（BLASTPのP()値は9.0e-15
〜8.6e-1Oの範囲であり、かつBESTFITの同一性は31〜36％であった。）。これら
の真菌PLおよびE.カロトボーラPel-3/PelBは、HrpWと共に、他のPLファミリーと
は別のクラスを形成している。これらのタンパク質の並置から、5個の高度に保 存されたブロックが認められた（図3）。7種のメンバーは、20個の同一の残基を
共有し、その中の5個がGlyであった。PHDアルゴリズムは、HrpWのPL-相同領域に
ついて、α−ヘリックスを形成する傾向がある残基329-336の配列以外は、β（ ＆）−シートおよびループであると予想した（図3）。興味深いことに、HrpWは 、このクラスのPL間では保存されているCysを全く含まない。さらにHrpWのPL活 性は、「材料および方法」に記されたいくつかの試験法を用いても検出されなか
った。
【００８５】実施例13 −HrpWの生成および分泌はhrp-依存性である 抗-HrpW抗体とのイムノブロッティングでは、E.アミローボラEa321およびEa27
3の上清調製物からのみHrpWは検出され、このことはHrpWが効果的に分泌された ことを示している（図4）。HrpWは、hrpL変異体であるEa321-K49およびEa273-K4
9からの調製物中には認められず、このことはhrpWの発現はhrpL-依存性であるこ
とを明らかにしている。さらにHrpWは、hrp分泌変異体Ea321-G84の全細胞調製物
では検出されず、およびEa273-G73の全細胞調製物では制限されなかった。した がってHrpWの分泌は、Hrp経路-依存性である。抗-HrpW抗体は、HrpWとは反応せ ず（図4、レーン2）、このことは、これら2つのエリシター間の構造的差異を示 唆している。
3の上清調製物からのみHrpWは検出され、このことはHrpWが効果的に分泌された ことを示している（図4）。HrpWは、hrpL変異体であるEa321-K49およびEa273-K4
9からの調製物中には認められず、このことはhrpWの発現はhrpL-依存性であるこ
とを明らかにしている。さらにHrpWは、hrp分泌変異体Ea321-G84の全細胞調製物
では検出されず、およびEa273-G73の全細胞調製物では制限されなかった。した がってHrpWの分泌は、Hrp経路-依存性である。抗-HrpW抗体は、HrpWとは反応せ ず（図4、レーン2）、このことは、これら2つのエリシター間の構造的差異を示 唆している。
【００８６】実施例14 −HrpWは植物において熱安定性かつプロテアーゼ感受性の様式で急性の
組織壊死を誘導する HrpWの予想される特性から、これはHRエリシターであると推察される。この可
能性を調べるために、部分的に精製されたタンパク質を、タバコ葉に浸潤させた
。浸潤した領域は、8〜12時間後に崩壊が始まり、HrpNによる誘起されたものと は識別不能の典型的組織壊死が、接種の24〜36時間後に出現し始めた（図5A、パ
ネル9)。HrpWは、濃度1.1μM(5Oμg/ml)で、タバコにおいて組織壊死を誘導した
。さらにHrpWは、セントポーリア、ゼラニウム、トマト、コショウ、カランコエ
・ディアグリモンチアナ(Kalanchoe diagremontiana)、およびシロイヌナズナに
おいても壊死を引き起こしたが、ダイズでは引き起こさなかった。HrpWの熱処理
した調製物は、依然タバコ葉において急性壊死を引き起こし、このことは、この
活性が熱安定性であることを示している（図5A、パネル2）。他方で、HrpWの3mg
/mlプロテアーゼ（タイプXIV；シグマ社、セント・ルイス、MO）による1時間の 処理は、HR-誘起活性を阻害した。
組織壊死を誘導する HrpWの予想される特性から、これはHRエリシターであると推察される。この可
能性を調べるために、部分的に精製されたタンパク質を、タバコ葉に浸潤させた
。浸潤した領域は、8〜12時間後に崩壊が始まり、HrpNによる誘起されたものと は識別不能の典型的組織壊死が、接種の24〜36時間後に出現し始めた（図5A、パ
ネル9)。HrpWは、濃度1.1μM(5Oμg/ml)で、タバコにおいて組織壊死を誘導した
。さらにHrpWは、セントポーリア、ゼラニウム、トマト、コショウ、カランコエ
・ディアグリモンチアナ(Kalanchoe diagremontiana)、およびシロイヌナズナに
おいても壊死を引き起こしたが、ダイズでは引き起こさなかった。HrpWの熱処理
した調製物は、依然タバコ葉において急性壊死を引き起こし、このことは、この
活性が熱安定性であることを示している（図5A、パネル2）。他方で、HrpWの3mg
/mlプロテアーゼ（タイプXIV；シグマ社、セント・ルイス、MO）による1時間の 処理は、HR-誘起活性を阻害した。
【００８７】実施例15 −HrpWによる誘起は植物代謝が必要である 大きな疑問点は、HrpWによって惹起された組織壊死が、ハーピンに似た機序 （本明細書に参照として組入れられているHeらの論文、Cell、73:1255-66(1993)
およびHeらの論文、Mol. Plant-Microbe Interact.、7:289-92(1994)）に起因し
ているかどうかということである。HrpW CFEPと、代謝阻害剤であるシクロヘキ サミド、塩化ランタンまたはバナジン酸ナトリウム（標的は、それぞれ、80Sリ ボソーム、Ca2+チャネル、ATPアーゼ／Y-ホスファターゼである)の共浸潤はHRを
妨害し（図5B、パネル3-5）、これらの阻害剤とHrpN CFEPの場合も同様であった
（図5B、パネル7-8）。これは、HrpWが誘導したHRには、活性のある植物代謝が 必要であることを示している。E.クリサンセミEC16のPelEで浸潤されたタバコ葉
も、同じく、急性組織壊死を示した（図5B、パネル9）。しかしPelEによって引 き起こされた壊死はより迅速に引き起こされ、かつ崩壊した領域は、ハーピンに
よって誘起された壊死と比べて、より半透明、暗色、軟らかであり、より容易に
押し潰された。さらにPelEが誘導した組織壊死は、阻害剤の存在は問わなかった
（図5B、パネル10-11)。
およびHeらの論文、Mol. Plant-Microbe Interact.、7:289-92(1994)）に起因し
ているかどうかということである。HrpW CFEPと、代謝阻害剤であるシクロヘキ サミド、塩化ランタンまたはバナジン酸ナトリウム（標的は、それぞれ、80Sリ ボソーム、Ca2+チャネル、ATPアーゼ／Y-ホスファターゼである)の共浸潤はHRを
妨害し（図5B、パネル3-5）、これらの阻害剤とHrpN CFEPの場合も同様であった
（図5B、パネル7-8）。これは、HrpWが誘導したHRには、活性のある植物代謝が 必要であることを示している。E.クリサンセミEC16のPelEで浸潤されたタバコ葉
も、同じく、急性組織壊死を示した（図5B、パネル9）。しかしPelEによって引 き起こされた壊死はより迅速に引き起こされ、かつ崩壊した領域は、ハーピンに
よって誘起された壊死と比べて、より半透明、暗色、軟らかであり、より容易に
押し潰された。さらにPelEが誘導した組織壊死は、阻害剤の存在は問わなかった
（図5B、パネル10-11)。
【００８８】実施例16 −N-末端領域はHR誘起に十分である HrpW(1-226)と称される、N-末端の226残基をコードしているhrpW断片を構築し
、HrpW(1-226)を生成することを確認した。典型的HRは、タバコ葉へHrpW(1-226)
CFEPを浸潤して24〜36時間後に生じたが、その活性は、完全な長さのHrpWの場 合よりも弱かった。このHrpW(1-226)は、安定して産生され、かつC-末端領域と は無関係にHRを誘起し、配列データから得たHrpWの2ドメイン構造を裏付けてい る。
、HrpW(1-226)を生成することを確認した。典型的HRは、タバコ葉へHrpW(1-226)
CFEPを浸潤して24〜36時間後に生じたが、その活性は、完全な長さのHrpWの場 合よりも弱かった。このHrpW(1-226)は、安定して産生され、かつC-末端領域と は無関係にHRを誘起し、配列データから得たHrpWの2ドメイン構造を裏付けてい る。
【００８９】実施例17 −hrpWはE.アミローボラ菌株間で保存されている 他の細菌におけるhrpWの存在を、サザンハイブリダイゼーションによって調べ
た。高度にストリンジェントな条件での、試験した10種のE.アミローボラ菌株の
各々について1本のバンドを認めた。制限バンドのサイズは、3種の異なるグルー
プを示した。低いストリンジェトな条件を用いた場合は、ハイブリダイズしてい
るバンドが、E.カロトボーラおよびE.サリシス、ならびに含むE.クリサンセミの
hrp遺伝子クラスターを含むクローンであるpCPP2157(本明細書に参照として組入
れられているBauerらの論文、Mol. Plant-Microbe Interact.、8:484-91(1995) ）のような他のエルウィニア種のいくつかで認められた（図6）。
た。高度にストリンジェントな条件での、試験した10種のE.アミローボラ菌株の
各々について1本のバンドを認めた。制限バンドのサイズは、3種の異なるグルー
プを示した。低いストリンジェトな条件を用いた場合は、ハイブリダイズしてい
るバンドが、E.カロトボーラおよびE.サリシス、ならびに含むE.クリサンセミの
hrp遺伝子クラスターを含むクローンであるpCPP2157(本明細書に参照として組入
れられているBauerらの論文、Mol. Plant-Microbe Interact.、8:484-91(1995) ）のような他のエルウィニア種のいくつかで認められた（図6）。
【００９０】 これまでに、各細菌から多くてもせいぜい一種のハーピンがわかっている。し
かしE.アミローボラは、公表された最初のハーピン（HrpN；本明細書に参照とし
て組入れられているWeiらの論文、Science、257:85-88(1992)）とは異なるハー ピンであるHrpWをコードしている。サザン分析は、hrpWが他のエルウィニア種の
いくつかに存在していることを示し、このことは病理発生におけるHrpWの役割を
示唆している。さらに配列を比較すると、EXP-60（P.シリンガエ病原型トマトの
HrpWの別名）(本明細書に参照として組入れられているYuanらの論文、J. Bacter iol. 、178:6399-6402(1996)）は、E.アミローボラのHrpWと相同である。
かしE.アミローボラは、公表された最初のハーピン（HrpN；本明細書に参照とし
て組入れられているWeiらの論文、Science、257:85-88(1992)）とは異なるハー ピンであるHrpWをコードしている。サザン分析は、hrpWが他のエルウィニア種の
いくつかに存在していることを示し、このことは病理発生におけるHrpWの役割を
示唆している。さらに配列を比較すると、EXP-60（P.シリンガエ病原型トマトの
HrpWの別名）(本明細書に参照として組入れられているYuanらの論文、J. Bacter iol. 、178:6399-6402(1996)）は、E.アミローボラのHrpWと相同である。
【００９１】 分析から、HrpWは、N-末端のGly/Serが豊富なドメインとC-末端のPL-相同ドメ
インの複数のドメインを持つタンパク質であることがわかった。E.アミローボラ
は非-ペクチン分解性(pecolytic)であると考えられている (本明細書に参照とし
て組入れられているSeemullerらの論文、Phytopathology、66:433-36(1976))の で、HrpWがPL類と相同性があることは驚くべきことであった。一方で、ハーピン
について、ペクチックエンザイム機能がないことが示唆されている（本明細書に
参照として組入れられているAlfanoらの論文、Plant Cell、8:1683-98(1996)） 。PL活性は検出されてはいないが、HrpWは、ペクチックエンザイム活性機能が明
らかにされていない第一のPL相同体ではない。いくつかの植物の花粉タンパク質
はPL相同体であり、ペクチックエンザイム活性機能が、このコード遺伝子が花粉
に特異的に発現することから予想されている（本明細書に参照として組入れられ
ているWingらの論文、Plant Mol. Biol.、14:17-28(1990)）；しかし、これらは
検出可能な酵素活性ではない（本明細書に参照として組入れられているDircksら
の論文、Plant Physiol. Biochem.、34:509-20(1996)）。HrpWは、基質特異性に
関してその相同体とは異なっているか、もしくは、リゾチーム相同体であるがリ
ゾチーム機能を有さないα−ラクトアルブミンのように、ペクチックエンザイム
機能が失われているかもしれない（本明細書に参照として組入れられているMcKe
nzieらの論文、Adv. Prot. Chem.、41:173-315(1991)）。あるいはHrpWは、リア
ーゼ機能の代わりに、ペクチック基質−結合機能を有するだけかもしれない（本
明細書に参照として組入れられているKuroskyらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci . USA 、77:3388-92(1980)）。
インの複数のドメインを持つタンパク質であることがわかった。E.アミローボラ
は非-ペクチン分解性(pecolytic)であると考えられている (本明細書に参照とし
て組入れられているSeemullerらの論文、Phytopathology、66:433-36(1976))の で、HrpWがPL類と相同性があることは驚くべきことであった。一方で、ハーピン
について、ペクチックエンザイム機能がないことが示唆されている（本明細書に
参照として組入れられているAlfanoらの論文、Plant Cell、8:1683-98(1996)） 。PL活性は検出されてはいないが、HrpWは、ペクチックエンザイム活性機能が明
らかにされていない第一のPL相同体ではない。いくつかの植物の花粉タンパク質
はPL相同体であり、ペクチックエンザイム活性機能が、このコード遺伝子が花粉
に特異的に発現することから予想されている（本明細書に参照として組入れられ
ているWingらの論文、Plant Mol. Biol.、14:17-28(1990)）；しかし、これらは
検出可能な酵素活性ではない（本明細書に参照として組入れられているDircksら
の論文、Plant Physiol. Biochem.、34:509-20(1996)）。HrpWは、基質特異性に
関してその相同体とは異なっているか、もしくは、リゾチーム相同体であるがリ
ゾチーム機能を有さないα−ラクトアルブミンのように、ペクチックエンザイム
機能が失われているかもしれない（本明細書に参照として組入れられているMcKe
nzieらの論文、Adv. Prot. Chem.、41:173-315(1991)）。あるいはHrpWは、リア
ーゼ機能の代わりに、ペクチック基質−結合機能を有するだけかもしれない（本
明細書に参照として組入れられているKuroskyらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci . USA 、77:3388-92(1980)）。
【００９２】 HrpWは、いくつかの点で、PL相同体として例外的である。HrpWは、分泌機構(S
ec machinary)によって認められるN-末端シグナルペプチドを有さず；むしろ、 これはタイプIII経路を介して分泌される。HrpWは、構造的および機能的役割を 果たしているPLに保存されたCys残基を全く含まない。さらにHrpWによるHR誘起 は、植物代謝に左右される。サザン分析の結果は、E.カロトボーラがpel-3/pelB
とは異なるhrpW相同体を有することを示している。hrpシステムへの依存性およ び検出可能なPL活性の欠如を考慮すると、病理発生におけるHrpWの役割は、炭素
源として使用するための細胞壁の単純な分解ではなく；むしろ、可能性のあるペ
クチックエンザイム活性または細胞壁−結合活性を介しての、Hrp線毛(pilus)（
本明細書に参照として組入れられているRoineらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci . USA 、94:3459-64(1997)）、もしくは、細胞壁を通じて得られる他の病原性／ 毒性／非毒性(avirulence)タンパク質を補助するものであるかもしれない。
ec machinary)によって認められるN-末端シグナルペプチドを有さず；むしろ、 これはタイプIII経路を介して分泌される。HrpWは、構造的および機能的役割を 果たしているPLに保存されたCys残基を全く含まない。さらにHrpWによるHR誘起 は、植物代謝に左右される。サザン分析の結果は、E.カロトボーラがpel-3/pelB
とは異なるhrpW相同体を有することを示している。hrpシステムへの依存性およ び検出可能なPL活性の欠如を考慮すると、病理発生におけるHrpWの役割は、炭素
源として使用するための細胞壁の単純な分解ではなく；むしろ、可能性のあるペ
クチックエンザイム活性または細胞壁−結合活性を介しての、Hrp線毛(pilus)（
本明細書に参照として組入れられているRoineらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci . USA 、94:3459-64(1997)）、もしくは、細胞壁を通じて得られる他の病原性／ 毒性／非毒性(avirulence)タンパク質を補助するものであるかもしれない。
【００９３】 ペクチックエンザイムのグループに関連したいくつかの進化が、アミノ酸の比
較および構造分析を基に明らかである：i)植物病原菌、バチラス・サブチリスお
よびいくつかの真菌の2個のPLファミリー、E.カロトボーラのPleX、ペクチンリ アーゼ、ならびに植物の花粉および花柱のタンパク質を含む、“細胞外PLスーパ
ーファミリー”と称されるクラス（本明細書に参照として組入れられているHenr
issatらの論文、Plant Physiol.、107:963-76(1995)）、ii)エルシニア・偽結核
菌(Yersinia pseudotuberculosis)とE.カロトボーラ（本明細書に参照として組 入れられているHintonらの論文、Mol. Microbiol.、3:1785-96(1989)）の細胞周
辺腔(periplasmic)PL類、ならびにE.クリサンセミのKdgC（本明細書に参照とし て組入れられているCondemineらの論文、Mol. Microbiol.、5:2191-2202(1991) ）を含むクラス、iii)N.ハエマトコッカのPL類、およびE.カロトボーラのPel-3/
PelBからなるクラス、iv)E.クリサンセミのPelXおよびPelL（本明細書に参照と して組入れられているAlfanoらの論文、J. Bacteriol.、177:4553-56(1995)、お
よびLojkowskaらの論文、Mol. Microbiol.、16:1183-95(1995)）、ならびにv)最
近報告された、E.クリサンセミおよびE.カロトボーラのPelZ（本明細書に参照と
して組入れられているPissavinらの論文、J. Bacteriol.、178:7187-96(1996)) 。相同なグループの第三のクラスはタンパク質ファミリーとしてはまだ認められ
てはいないが、そのメンバーについては文献において言及されている（本明細書
に参照として組入れられているHenrissatらの論文、Plant Phvsiol.、l07:963-7
6(1995)、およびLiaoらの論文、Mol. Plant-Microbe Interact.、9:14-21(1996)
）。したがって、このE.アミローボラのHrpWが属する第三のクラスは、“クラス
I”“クラスII”と称される先行する2種のクラスと区別するために“クラスIII ペクテートリアーゼ”と称されるであろう。この“クラスIII PL”のメンバーは
、植物病原菌に広く分布しているように見える。P.シリンガエ病原型トマトのHr
pWのほかに、E.クリサンセミは、E.カロトボーラのPel-3/PelBに非常に密に関連
したPellを有する。
較および構造分析を基に明らかである：i)植物病原菌、バチラス・サブチリスお
よびいくつかの真菌の2個のPLファミリー、E.カロトボーラのPleX、ペクチンリ アーゼ、ならびに植物の花粉および花柱のタンパク質を含む、“細胞外PLスーパ
ーファミリー”と称されるクラス（本明細書に参照として組入れられているHenr
issatらの論文、Plant Physiol.、107:963-76(1995)）、ii)エルシニア・偽結核
菌(Yersinia pseudotuberculosis)とE.カロトボーラ（本明細書に参照として組 入れられているHintonらの論文、Mol. Microbiol.、3:1785-96(1989)）の細胞周
辺腔(periplasmic)PL類、ならびにE.クリサンセミのKdgC（本明細書に参照とし て組入れられているCondemineらの論文、Mol. Microbiol.、5:2191-2202(1991) ）を含むクラス、iii)N.ハエマトコッカのPL類、およびE.カロトボーラのPel-3/
PelBからなるクラス、iv)E.クリサンセミのPelXおよびPelL（本明細書に参照と して組入れられているAlfanoらの論文、J. Bacteriol.、177:4553-56(1995)、お
よびLojkowskaらの論文、Mol. Microbiol.、16:1183-95(1995)）、ならびにv)最
近報告された、E.クリサンセミおよびE.カロトボーラのPelZ（本明細書に参照と
して組入れられているPissavinらの論文、J. Bacteriol.、178:7187-96(1996)) 。相同なグループの第三のクラスはタンパク質ファミリーとしてはまだ認められ
てはいないが、そのメンバーについては文献において言及されている（本明細書
に参照として組入れられているHenrissatらの論文、Plant Phvsiol.、l07:963-7
6(1995)、およびLiaoらの論文、Mol. Plant-Microbe Interact.、9:14-21(1996)
）。したがって、このE.アミローボラのHrpWが属する第三のクラスは、“クラス
I”“クラスII”と称される先行する2種のクラスと区別するために“クラスIII ペクテートリアーゼ”と称されるであろう。この“クラスIII PL”のメンバーは
、植物病原菌に広く分布しているように見える。P.シリンガエ病原型トマトのHr
pWのほかに、E.クリサンセミは、E.カロトボーラのPel-3/PelBに非常に密に関連
したPellを有する。
【００９４】 配列、そして恐らく構造も相同ではないように思われるハーピン類が、どのよ
うにして同じ植物反応を誘導することができるかは謎である。ハーピンの“細胞
−殺傷”作用は、細胞膜に孔をあけるような可能性のある酵素機能または毒性機
能に起因するものではないように見え；HR活性は熱安定性であり（本明細書に参
照として組入れられているWeiらの論文、Science、257:85-88(1992)、Heらの論 文、Cell、73:55-66(1993)、およびArlatらの論文、EMBO J.、13:543-53(1994) ）、植物代謝を必要とし（本明細書に参照として組入れられているHeらの論文、 Cell 、73:1255-66(1993)、およびHeらの論文、Mol. Plant-Microbe Interact.、
7:289-92(1994)）、かつ断片はHR反応を誘起する（本明細書に参照として組入れ
られているArlatらの論文、EMBO J.、13:543-53(1994)、Alfanoらの論文、Mol. Microbial. 、l9:715-28(1996)、およびLabyらの論文、Molecular Studies on In teractions Between Erwinia amylovora and Its Host and Non-Host Plant 、コ
ーネル大学、イサカ、NY、(1997)）。Avrタンパク質は、対応する耐性遺伝子を 保持する植物においてHRを誘導する（本明細書に参照として組入れられているSt
askawiczらの論文、Science、268:661-67(1995)）。ハーピンは、下流のシグナ ル伝達の事象は共有されるにもかかわらず、ハーピンが同種のメカニズムにより
HRを誘導する可能性は低いように見える。ハーピンに対してHRを導くような可能
性のあるシグナル伝達メカニズムは、Novackとその同僚によって考察されている
（本明細書に参照として組入れられているHoyosらの論文、Mol. Plant-Microbe Interact. 、9:608-16(1996)）。
うにして同じ植物反応を誘導することができるかは謎である。ハーピンの“細胞
−殺傷”作用は、細胞膜に孔をあけるような可能性のある酵素機能または毒性機
能に起因するものではないように見え；HR活性は熱安定性であり（本明細書に参
照として組入れられているWeiらの論文、Science、257:85-88(1992)、Heらの論 文、Cell、73:55-66(1993)、およびArlatらの論文、EMBO J.、13:543-53(1994) ）、植物代謝を必要とし（本明細書に参照として組入れられているHeらの論文、 Cell 、73:1255-66(1993)、およびHeらの論文、Mol. Plant-Microbe Interact.、
7:289-92(1994)）、かつ断片はHR反応を誘起する（本明細書に参照として組入れ
られているArlatらの論文、EMBO J.、13:543-53(1994)、Alfanoらの論文、Mol. Microbial. 、l9:715-28(1996)、およびLabyらの論文、Molecular Studies on In teractions Between Erwinia amylovora and Its Host and Non-Host Plant 、コ
ーネル大学、イサカ、NY、(1997)）。Avrタンパク質は、対応する耐性遺伝子を 保持する植物においてHRを誘導する（本明細書に参照として組入れられているSt
askawiczらの論文、Science、268:661-67(1995)）。ハーピンは、下流のシグナ ル伝達の事象は共有されるにもかかわらず、ハーピンが同種のメカニズムにより
HRを誘導する可能性は低いように見える。ハーピンに対してHRを導くような可能
性のあるシグナル伝達メカニズムは、Novackとその同僚によって考察されている
（本明細書に参照として組入れられているHoyosらの論文、Mol. Plant-Microbe Interact. 、9:608-16(1996)）。
【００９５】 HRを誘起する重複しない配列はGly/Serが豊富な領域を含むので、Gly/Serが豊
富であることは、ハーピンのHR-誘起機能にとって重要であるように見える（本 明細書に参照として組入れられているArlatらの論文、EMBO J.、13:543-53(1994
)、 Alfanoらの論文、Mol. Microbial.、19:715-28(1996)、およびLabyらの論文
、Molecular Studies on Interactions Between Erwinia amylovora and Its Ho st and Non-Host Plant 、コーネル大学、イサカ、NY、(1997)）。この仮説を基 に、N-末端Gly/Ser-豊富なドメインを含む短縮されたHrpWは、HR-誘起能を持つ 。他方で、断片によるHRの誘起は、全タンパク質によるものと比較すると弱く（
本明細書に参照として組入れられているLabyらの研究、Molecular Studics on I nteractions. Between Erwinia amvlovora and Its Host and Non-Host Plants 、コーネル大学、イサカ、NY(1997)、および本研究）、これはハーピンの他の部
分（複数）が、完全な長さのHRに寄与していることを示している。キシロ化(xyl
ogenesis)の間および損傷またはウイルス感染の後に発現されるコード遺伝子で ある植物細胞壁のGly-豊富なタンパク質（“GRPs”）（本明細書に参照として組
入れられているShowalterらの論文、Plant Cell、5:9-23(1993)）が、細胞死を 引き起こす能力を有しているかどうかを調べることは興味深いであろう。
富であることは、ハーピンのHR-誘起機能にとって重要であるように見える（本 明細書に参照として組入れられているArlatらの論文、EMBO J.、13:543-53(1994
)、 Alfanoらの論文、Mol. Microbial.、19:715-28(1996)、およびLabyらの論文
、Molecular Studies on Interactions Between Erwinia amylovora and Its Ho st and Non-Host Plant 、コーネル大学、イサカ、NY、(1997)）。この仮説を基 に、N-末端Gly/Ser-豊富なドメインを含む短縮されたHrpWは、HR-誘起能を持つ 。他方で、断片によるHRの誘起は、全タンパク質によるものと比較すると弱く（
本明細書に参照として組入れられているLabyらの研究、Molecular Studics on I nteractions. Between Erwinia amvlovora and Its Host and Non-Host Plants 、コーネル大学、イサカ、NY(1997)、および本研究）、これはハーピンの他の部
分（複数）が、完全な長さのHRに寄与していることを示している。キシロ化(xyl
ogenesis)の間および損傷またはウイルス感染の後に発現されるコード遺伝子で ある植物細胞壁のGly-豊富なタンパク質（“GRPs”）（本明細書に参照として組
入れられているShowalterらの論文、Plant Cell、5:9-23(1993)）が、細胞死を 引き起こす能力を有しているかどうかを調べることは興味深いであろう。
【００９６】 ハーピンは、細胞壁のような植物細胞の外側部分を標的とするように見える。
これらは、浸潤により植物組織に外来性に適用された場合に、HRを誘起すること
ができる。ハーピンが細胞浮遊培養液に添加された場合は、交換反応（“XR”）
と称される、培地のK+流出とアルカリ化、それに続く細胞死が生じる（本明細書
に参照として組入れられているWeiらの論文、Science、257:85-88(1992)、およ びPophamらの論文、Physiol. Mol. Plant Pathol.、47:39-50(1995)）。しかしX
Rは、プロトプラスト培養においては生じない。さらにHrpZ抗体は、植物細胞の 外側のHrpZに局在し、プロトプラストには位置せず、アルカリ化およびこの局在
は、Ca2+を抽出するキレート剤およびペクチンによって阻害される（本明細書に
参照として組入れられているHoyosらの論文、Mol. Plant-Microbe Interact.、9
:608-16(1996)）。PLに対するHrpWの相同性は、ハーピン作用部位が植物細胞壁 であるようなモデルと一致している。
これらは、浸潤により植物組織に外来性に適用された場合に、HRを誘起すること
ができる。ハーピンが細胞浮遊培養液に添加された場合は、交換反応（“XR”）
と称される、培地のK+流出とアルカリ化、それに続く細胞死が生じる（本明細書
に参照として組入れられているWeiらの論文、Science、257:85-88(1992)、およ びPophamらの論文、Physiol. Mol. Plant Pathol.、47:39-50(1995)）。しかしX
Rは、プロトプラスト培養においては生じない。さらにHrpZ抗体は、植物細胞の 外側のHrpZに局在し、プロトプラストには位置せず、アルカリ化およびこの局在
は、Ca2+を抽出するキレート剤およびペクチンによって阻害される（本明細書に
参照として組入れられているHoyosらの論文、Mol. Plant-Microbe Interact.、9
:608-16(1996)）。PLに対するHrpWの相同性は、ハーピン作用部位が植物細胞壁 であるようなモデルと一致している。
【００９７】 動物病原菌のタイプIIIシステムは、病原性に関連した多くのタンパク質を分 泌する（例えば、本明細書に参照として組入れられているComelisらの論文、Mol . Microbiol. 、23:861-67(1997)を参照のこと）。しかし最近まで、ハーピンの みが、植物病原菌のタイプIII機構によって誘導されるものであることが示され てきた。最近の証拠は、複数のタンパク質がHrp経路を介して分泌され、かつい くつかのAvrタンパク質が、Hrp分泌機構により植物細胞に直接移されることを示
唆している（本明細書に参照として組入れられているGopalanらの論文、Plant C ell, 8:1095-1105(1996)、Leisterらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93:
15497-15507(1996)、Scofieldらの論文、Science、274:2063-65(1996)、Tangら の論文、Science、274:2060-63(1996)、およびVan Den Ackervekenらの論文、Ce ll 、87:1307-16(1996)）。
唆している（本明細書に参照として組入れられているGopalanらの論文、Plant C ell, 8:1095-1105(1996)、Leisterらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93:
15497-15507(1996)、Scofieldらの論文、Science、274:2063-65(1996)、Tangら の論文、Science、274:2060-63(1996)、およびVan Den Ackervekenらの論文、Ce ll 、87:1307-16(1996)）。
【００９８】 hrpWは、P.シリンガエavrEの相同体であるdspE、およびX.カンペストリス病原
型ベシカトリアavrRxvの相同体であるORFBに隣接している（図1B)ことは興味深 い。ハーピン遺伝子と非宿主avr遺伝子相同体の連結は、病原性における両者間 の関係のヒントを提供する。ハーピンは現実にはAvrタンパク質のクラスである か、もしくは、Avrタンパク質は実際に毒性タンパク質であるかであろう。P.ソ ラナセアラムGMI1OOOのPopAは、耐性(resistant)ペチュニア系においてのみHRを
誘起する（本明細書に参照として組入れられているArlatらの論文、EMBO J.、13
:543-53(1994)）。さらにAvr表現型の発現はhrpシステムにより制御され、かつa
vr遺伝子のいくつかは毒性または病原性の機能を有する（本明細書に参照として
組入れられているDanglらの論文、Curr. Top. Microbiol. Immunol.、192:99-11
8(1994))。実際にdspEは病原性因子である。したがって、ハーピン遺伝子とavr 相同体が存在するE.アミローボラのゲノム領域は、宿主細胞の異なる部分の攻撃
に使用されるタンパク質の保管庫を構成している。それらの特異的標的ならびに
HRおよび病原性における作用の説明は、植物−細菌相互作用の機序を理解する上
での中心となるであろう。
型ベシカトリアavrRxvの相同体であるORFBに隣接している（図1B)ことは興味深 い。ハーピン遺伝子と非宿主avr遺伝子相同体の連結は、病原性における両者間 の関係のヒントを提供する。ハーピンは現実にはAvrタンパク質のクラスである か、もしくは、Avrタンパク質は実際に毒性タンパク質であるかであろう。P.ソ ラナセアラムGMI1OOOのPopAは、耐性(resistant)ペチュニア系においてのみHRを
誘起する（本明細書に参照として組入れられているArlatらの論文、EMBO J.、13
:543-53(1994)）。さらにAvr表現型の発現はhrpシステムにより制御され、かつa
vr遺伝子のいくつかは毒性または病原性の機能を有する（本明細書に参照として
組入れられているDanglらの論文、Curr. Top. Microbiol. Immunol.、192:99-11
8(1994))。実際にdspEは病原性因子である。したがって、ハーピン遺伝子とavr 相同体が存在するE.アミローボラのゲノム領域は、宿主細胞の異なる部分の攻撃
に使用されるタンパク質の保管庫を構成している。それらの特異的標的ならびに
HRおよび病原性における作用の説明は、植物−細菌相互作用の機序を理解する上
での中心となるであろう。
【００９９】 本発明は例証することを目的として詳細に説明してきたが、このような詳細は
その目的のためのみであり、添付された請求の範囲によって限定された本発明の
精神および範囲を逸脱しない限りは、当業者によって変更することができると理
解される。
その目的のためのみであり、添付された請求の範囲によって限定された本発明の
精神および範囲を逸脱しない限りは、当業者によって変更することができると理
解される。
【配列表】
【図１】 図1AおよびBは、hrpWを含むE.アミローボラゲノム領域の分子構 造を示す。図1Aは、E.アミローボラのhrpクラスターの調節領域および分泌領域 を含むコスミドpCPP430およびpCPP450を表している。コスミドクローンの上の矢
印形ボックスは転写ユニットを示し、特徴付けられたオペロン名を上に記してい
る（本明細書に参照として組入れられているWeiらの論文、Science、257:85-88(
1992)；Zumoffらの論文、The hrp Gene Cluster of Erwinia amylovora、Hennec
ke,H.とVerma, D.P.S.の編集（クルワーアカデミック出版、ドルレヒト、オラン
ダ）、第1巻、53〜60頁(1991)；Bogdanoveらの論文、J. Bacteriol.、178:1720-
30(1996)；およびKimらの論文、J. Bacteriol.、179:1690-97 (1997)）。図1Bは
、グリシンが豊富なタンパク質をコードしているhrpWの位置、および本研究にお
いて使用したサブクローンpCPP1012を示す。ボックスおよび矢印形ボックスは、
遺伝子またはオープンリーディングフレームを示す；黒三角は推定されるHrpL- 依存型プロモーターである。制限部位：B、BamHI；E、EcoRI；H、HindIII；Ea、
Eagl；Hp、Hpal。
印形ボックスは転写ユニットを示し、特徴付けられたオペロン名を上に記してい
る（本明細書に参照として組入れられているWeiらの論文、Science、257:85-88(
1992)；Zumoffらの論文、The hrp Gene Cluster of Erwinia amylovora、Hennec
ke,H.とVerma, D.P.S.の編集（クルワーアカデミック出版、ドルレヒト、オラン
ダ）、第1巻、53〜60頁(1991)；Bogdanoveらの論文、J. Bacteriol.、178:1720-
30(1996)；およびKimらの論文、J. Bacteriol.、179:1690-97 (1997)）。図1Bは
、グリシンが豊富なタンパク質をコードしているhrpWの位置、および本研究にお
いて使用したサブクローンpCPP1012を示す。ボックスおよび矢印形ボックスは、
遺伝子またはオープンリーディングフレームを示す；黒三角は推定されるHrpL- 依存型プロモーターである。制限部位：B、BamHI；E、EcoRI；H、HindIII；Ea、
Eagl；Hp、Hpal。
【図２】 図2Aは、T7 RNAポリメラーゼで規定された遺伝子発現システムに
よるhrpWの発現を示す。レーン1、E.coliDH5α(pGP1-2/pBC SK(-))；2、E.coliD
H5α(pGP1-2/pCPP1232)。84kDと53kDの間の矢印は、HrpWタンパク質に相当する レーン2のバンドを示す。
よるhrpWの発現を示す。レーン1、E.coliDH5α(pGP1-2/pBC SK(-))；2、E.coliD
H5α(pGP1-2/pCPP1232)。84kDと53kDの間の矢印は、HrpWタンパク質に相当する レーン2のバンドを示す。
【図３】 図3は、HrpWと、ネクトリア・ハエマトコッカ(Nectria haematoc
occa)接合型VI（フサリウム・ソラニ f.sp.ピシ(Fusarium solani f.sp. pisi)
）、およびエルウィニア・カロトボーラ亜種カロトボーラ(Erwinia carotovora
subsp. carotovora)のペクテートリアーゼを並置した。これらの配列は、デフォ
ルトパラメータによるPILEUPプログラム（GCGソフトウェアパッケージ、ver.7.3
）により並べ、この並べたものを、同じパッケージのLINEUPプログラムを用いて
手操作により編集した。保存された残基をボックスで囲み、高度に保存された領
域には下線をつけ、HrpWにおいてα−ヘリックス構造の可能性のある部分に影を
つけた。
occa)接合型VI（フサリウム・ソラニ f.sp.ピシ(Fusarium solani f.sp. pisi)
）、およびエルウィニア・カロトボーラ亜種カロトボーラ(Erwinia carotovora
subsp. carotovora)のペクテートリアーゼを並置した。これらの配列は、デフォ
ルトパラメータによるPILEUPプログラム（GCGソフトウェアパッケージ、ver.7.3
）により並べ、この並べたものを、同じパッケージのLINEUPプログラムを用いて
手操作により編集した。保存された残基をボックスで囲み、高度に保存された領
域には下線をつけ、HrpWにおいてα−ヘリックス構造の可能性のある部分に影を
つけた。
【図４】 図4AおよびBは、E.アミローボラにおけるHrpWのhrp-依存型産生 および分泌を示すイムノブロティングである。図4のレーン：1、E.coliDH5α(pG
P1-2/pCPP1232)；2、HrpN；3、Ea321の全細胞調製品(“CP”)；4、Ea321の上清 調製品(“SP”)；5、Ea321-K49のCP；6、Ea321-K49のSP；7、Ea321-G84のCP；8 、Ea321-G84のSP。図4Bのレーン：1、E.coliDH5α(pGP1-2/pCPP1232)；2、HrpN ；3、Ea273のCP；4、Ea273のSP；5、Ea321-K49のCP；6、Ea321-K49のSP；7、Ea3
21-G73のCP；8、Ea321-G73のSP。
P1-2/pCPP1232)；2、HrpN；3、Ea321の全細胞調製品(“CP”)；4、Ea321の上清 調製品(“SP”)；5、Ea321-K49のCP；6、Ea321-K49のSP；7、Ea321-G84のCP；8 、Ea321-G84のSP。図4Bのレーン：1、E.coliDH5α(pGP1-2/pCPP1232)；2、HrpN ；3、Ea273のCP；4、Ea273のSP；5、Ea321-K49のCP；6、Ea321-K49のSP；7、Ea3
21-G73のCP；8、Ea321-G73のSP。
【図５】 図5Aは、hrpN変異体の残存している過敏感反応(“HR”)誘起活性
、ならびにHrpNおよびHrpWにより誘導されたHRを示しているタバコ葉を示す。パ
ネル：1、E.coliDH5(pCPP430)；2、E.coliDH5(pCPP430-T5)；3、E.coliMC4100(p
CPP450)；4、E.coliMC4100(pCPP450-T5)；5、5 mM KP04バッファー(pH6.5)；6、
E.アミローボラEa321；7、E.アミローボラEa321-T5；8、HrpN CFEP （HrpN 0.5m
g/mlを含む）；9、E.coliDH5α(pGP1-2/pCPP1232)からのタンパク質を含むゲル から溶離されたHrpW調製物(0.5mg/ml)；10、E.coliDH5α(pGP1-2/pBC SK (-))か
ら9と同様に作成された調製物。写真は、浸潤の3日後に撮影した。 図5Bは、植物の代謝阻害剤によるHrpWが誘導したHRの抑制を示す。パネル：1 、5mM KP04バッファー(pH6.5)；2、HrpW CFEP；3、HrpN CFEP＋シクロヘキシミ ド；4、HrpW CFEP＋LaCl3；5、HrpW CFEP＋Na3V04；6、HrpN CFEP；7、HrpN CFE
P＋シクロヘキシミド；8、HrpN CFEP＋Na3V04；9、10mM Tris-HCl(pH7.8)中のPe
lE；lO、PelE＋シクロヘキシミド；11、PelE＋Na3V04。CFEPは、HrpNのHrpWを0.
1mg/ml含む。タバコ葉の写真は、浸潤の36時間後に撮影した。
、ならびにHrpNおよびHrpWにより誘導されたHRを示しているタバコ葉を示す。パ
ネル：1、E.coliDH5(pCPP430)；2、E.coliDH5(pCPP430-T5)；3、E.coliMC4100(p
CPP450)；4、E.coliMC4100(pCPP450-T5)；5、5 mM KP04バッファー(pH6.5)；6、
E.アミローボラEa321；7、E.アミローボラEa321-T5；8、HrpN CFEP （HrpN 0.5m
g/mlを含む）；9、E.coliDH5α(pGP1-2/pCPP1232)からのタンパク質を含むゲル から溶離されたHrpW調製物(0.5mg/ml)；10、E.coliDH5α(pGP1-2/pBC SK (-))か
ら9と同様に作成された調製物。写真は、浸潤の3日後に撮影した。 図5Bは、植物の代謝阻害剤によるHrpWが誘導したHRの抑制を示す。パネル：1 、5mM KP04バッファー(pH6.5)；2、HrpW CFEP；3、HrpN CFEP＋シクロヘキシミ ド；4、HrpW CFEP＋LaCl3；5、HrpW CFEP＋Na3V04；6、HrpN CFEP；7、HrpN CFE
P＋シクロヘキシミド；8、HrpN CFEP＋Na3V04；9、10mM Tris-HCl(pH7.8)中のPe
lE；lO、PelE＋シクロヘキシミド；11、PelE＋Na3V04。CFEPは、HrpNのHrpWを0.
1mg/ml含む。タバコ葉の写真は、浸潤の36時間後に撮影した。
【図６】 図6は、E.アミローボラEa321のhrpWが別の細菌にも存在すること を示すサザンブロットを示す。菌株のゲノムDNAを、Ea321 hrpWを含む1.4kbのHp
al断片でプローブした。レーン：1、Ea321；2、Ea266；3、Ea273；4、Ea246；5 、Ea51O；6、Ea528；7、Ea574；8、Ea546；9、Ea557；10、Ea562；11、Ea587；1
2、E.カロトボーラ亜種カロトボーラ、ATCC15713；13、E.マロチボーラ(malloti
vora)1818；14、E.サリシス(salicis)1822；15、E.クリサンセミEC16のpCPP2157
。
al断片でプローブした。レーン：1、Ea321；2、Ea266；3、Ea273；4、Ea246；5 、Ea51O；6、Ea528；7、Ea574；8、Ea546；9、Ea557；10、Ea562；11、Ea587；1
2、E.カロトボーラ亜種カロトボーラ、ATCC15713；13、E.マロチボーラ(malloti
vora)1818；14、E.サリシス(salicis)1822；15、E.クリサンセミEC16のpCPP2157
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ ４Ｈ０４５ 5/10 5/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2B022 AA05 AB11 AB15 AB17 AB20 BA01 BA02 BA11 BA21 BB10 2B030 AA02 AB03 AD04 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD09 CD10 CD12 CD13 CD17 CD21 4B024 AA08 CA03 DA01 DA05 EA04 GA11 4B065 AA01X AA25Y AA88X AA89X AB01 AC14 BA02 CA24 CA53 4C087 AA01 AA03 BC34 4H045 AA10 BA10 CA11 EA05 FA72 FA74
Claims (39)
- 【請求項１】 (a)配列番号：1記載のヌクレオチド配列を含むDNA分子、(b)
配列番号：2記載のアミノ酸を含むタンパク質をコードするDNA分子、(c)ストリ ンジェントな条件下で配列番号：1記載のヌクレオチド配列を含むDNA分子とハイ
ブリダイズするDNA分子、ならびに(d)DNA分子(a)、(b)および(c)と相補的なDNA 分子からなる群より選択される、過敏感反応を誘起するタンパク質またはポリペ
プチドをコードする単離されたDNA分子。 - 【請求項２】 配列番号：1記載のヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の
単離されたDNA分子。 - 【請求項３】 配列番号：2記載のアミノ酸を含むタンパク質をコードする 、請求項1記載の単離されたDNA分子。
- 【請求項４】 ストリンジェントな条件下で配列番号：1記載のヌクレオチ ド配列を含むDNA分子にハイブリダイズする、請求項１記載の単離されたDNA分子
。 - 【請求項５】 DNA分子(a)、(b)および(c)と相補的な、請求項１記載の単離
されたDNA分子。 - 【請求項６】 請求項１記載のDNA分子が挿入された発現ベクター。
- 【請求項７】 DNA分子が、適正なセンス鎖方向であり、かつ正しい読み枠 を持つ、請求項６記載の発現ベクター。
- 【請求項８】 請求項１記載のDNA分子により形質転換された宿主細胞。
- 【請求項９】 植物細胞または細菌細胞からなる群より選択される、請求項
８記載の宿主細胞。 - 【請求項10】 発現ベクターを用いてDNA分子による形質転換がなされる、 請求項８記載の宿主細胞。
- 【請求項11】 請求項１記載のDNA分子により形質転換されたトランスジェ ニック植物。
- 【請求項12】 アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ワタ
、ヒマワリ、ラッカセイ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、マメ、エン
ドウ、チコリ、レタス、エンダイブ、キャベツ、メキャベツ、ビート、パースニ
ップ、カブ、カリフラワー、ブロッコリー、ラディッシュ、ホウレンソウ、タマ
ネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、カボチャ属、カボチャ、
ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、メロン、柑橘類、イチゴ、ブドウ、ラズ
ベリー、パイナップル、ダイズ、タバコ、トマト、ソルガム、およびサトウキビ
からなる群より選択される、請求項11記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項13】 シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、セントポーリア、
ペチュニア、ペラルゴニューム、ポインセチア、キク、カーネーション、および
ジニアからなる群より選択される、請求項11記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項14】 請求項１記載のDNA分子により形質転換されたトランスジェ ニック植物種子。
- 【請求項15】 アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ワタ
、ヒマワリ、ラッカセイ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、マメ、エン
ドウ、チコリ、レタス、エンダイブ、キャベツ、メキャベツ、ビート、パースニ
ップ、カブ、カリフラワー、ブロッコリー、ラディッシュ、ホウレンソウ、タマ
ネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、カボチャ属、カボチャ、
ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、メロン、柑橘類、イチゴ、ブドウ、ラズ
ベリー、パイナップル、ダイズ、タバコ、トマト、ソルガム、およびサトウキビ
からなる群より選択される、請求項14記載のトランスジェニック植物種子。 - 【請求項16】 シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、セントポーリア、
ペチュニア、ペラルゴニューム、ポインセチア、キク、カーネーション、および
ジニアからなる群より選択される、請求項14記載のトランスジェニック植物種子
。 - 【請求項17】 配列番号：2を含むアミノ酸、および配列番号：1記載のヌク
レオチド配列を含むDNA分子にハイブリダイズする核酸によりコードされるアミ ノ酸を有するタンパク質またはポリペプチドからなる群より選択される、過敏感
反応を誘起する単離されたタンパク質またはポリペプチド。 - 【請求項18】 配列番号：2を含むアミノ酸を有する、請求項17記載の単離 されたタンパク質またはポリペプチド。
- 【請求項19】 配列番号：1記載のヌクレオチド配列を含むDNA分子にハイブ
リダイズする核酸によってコードされる、請求項17記載の単離されたタンパク質
またはポリペプチド。 - 【請求項20】 病気抵抗性を付与するために有効な条件下で、植物または植
物種子に、非感染型の請求項17記載のタンパク質またはポリペプチドを適用する
工程を含む、植物に病気抵抗性を付与する方法。 - 【請求項21】 適用の間に植物が処理される、請求項20記載の方法。
- 【請求項22】 適用の間に植物種子が処理され、更に過敏感反応エリシター
により処理された種子を天然または人工の土壌に植える工程、および土壌に植え
た種子から植物を繁殖させる工程を含む、請求項20記載の方法。 - 【請求項23】 植物の生育を強化するために有効な条件下で、植物または植
物種子に、非感染型の請求項17記載のタンパク質またはポリペプチドを適用する
工程を含む、植物の生育を強化する方法。 - 【請求項24】 適用の間に植物が処理される、請求項23記載の方法。
- 【請求項25】 適用の間に植物種子が処理され、更に過敏感反応エリシター
により処理された種子を天然または人工の土壌に植える工程、および土壌に植え
た種子から植物を繁殖させる工程を含む、請求項23記載の方法。 - 【請求項26】 昆虫防除に有効な条件下で、植物または植物種子に、非感染
型の請求項17記載のタンパク質またはポリペプチドを適用する工程を含む、植物
のための昆虫防除の方法。 - 【請求項27】 適用の間に植物が処理される、請求項26記載の方法。
- 【請求項28】 適用の間に植物種子が処理され、更に過敏感反応エリシター
により処理された種子を天然または人工の土壌に植える工程、および土壌に植え
た種子から植物を繁殖させる工程を含む、請求項26記載の方法。 - 【請求項29】 請求項１記載のDNA分子により形質転換されたトランスジェ ニック植物、または植物種子を提供する工程、および病気抵抗性を付与するため
に有効な条件下で、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物種子
から作出されたトランスジェニック植物を生育させる工程を含む、植物に病気抵
抗性を付与する方法。 - 【請求項30】 トランスジェニック植物が提供される、請求項29記載の方法
。 - 【請求項31】 トランスジェニック植物種子が提供される、請求項29記載の
方法。 - 【請求項32】 請求項１記載のDNA分子により形質転換されたトランスジェ ニック植物または植物種子を提供する工程、および植物の生育を強化するために
有効な条件下で、トランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物種子
から作出されたトランスジェニック植物を生育させる工程を含む、植物の生育を
強化する方法。 - 【請求項33】 トランスジェニック植物が提供される、請求項32記載の方法
。 - 【請求項34】 トランスジェニック植物種子が提供される、請求項32記載の
方法。 - 【請求項35】 請求項１記載のDNA分子により形質転換されたトランスジェ ニック植物または植物種子を提供する工程、および昆虫防除に有効な条件下で、
トランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物種子から作出されたト
ランスジェニック植物を生育させる工程を含む、植物のための昆虫防除の方法。 - 【請求項36】 トランスジェニック植物が提供される、請求項35記載の方法
。 - 【請求項37】 トランスジェニック植物種子が提供される、請求項35記載の
方法。 - 【請求項38】 請求項17記載のタンパク質またはポリペプチド、および 担体を含む組成物。
- 【請求項39】 肥料、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、およびそれらの混合物
からなる群より選択される添加剤をさらに含む、請求項38記載の組成物。
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