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JP2001511361A - 核酸アレイ上で行われる増幅および他の酵素反応 - Google Patents

核酸アレイ上で行われる増幅および他の酵素反応

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JP2001511361A
JP2001511361A JP2000504288A JP2000504288A JP2001511361A JP 2001511361 A JP2001511361 A JP 2001511361A JP 2000504288 A JP2000504288 A JP 2000504288A JP 2000504288 A JP2000504288 A JP 2000504288A JP 2001511361 A JP2001511361 A JP 2001511361A
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JP
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nucleic acid
oligonucleotide
mixing
dew point
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Application number
JP2000504288A
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English (en)
Inventor
ニース， ジェフリー バン
ジョン シー． タボーン，
クリステン モイニハン，
Original Assignee
ラピジーン，インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ラピジーン，インコーポレイテッド filed Critical ラピジーン，インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、固体基板、例えばシリコンウエハまたはガラススライド上にプリントされた核酸分子について、増幅および他の酵素反応を実施するための方法および装置を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は一般的に、固体基板上にアレイ化される核酸について行われる酵素反
応に関し、詳細には、アレイ化された核酸の増幅に関する。
【０００２】 （発明の背景） 多くの試料の平行試験を容易にするために、生物学的因子の複製アレイを使用
してきた。例えば、異なる増殖表現型についての多くの独立コロニーを迅速にス
クリーニングする手段として長い間、無菌ビロードクロスおよびピストンリング
装置を使用して、それぞれ異なる増殖培地を含む寒天プレートに対して、細菌お
よび酵母コロニーの複製物を作製してきた（ＬｅｄｅｒｂｅｒｇおよびＬｅｄｅ
ｒｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６３：３９９，１９５２）。同様に、９
６ウェルマイクロタイタープレートを使用して、容易に接近される様式で、多く
の、例えば、細胞株、組換えＤＮＡライブラリーを表すウィルス単離体、または
モノクローナル抗体細胞株を組織化および貯蔵する。
【０００３】 大規模ゲノム計画の出現および分子診断の使用の増加が、核酸をスクリーニン
グする大容量処理能力方法の開発を必要としてきた。最近、あり得るヌクレオチ
ド配列の全てまたは全てのうちのサブセットを表す、ガラスまたはケイ素表面に
結合した短いオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の大きなアレイを合成する
方法が、開発された（ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６７５，１９９２）。これらのＯＤＮアレイは、ハイブ
リダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３：１００８，
１９９２；Ｄｒｍａｎａｃら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１６４９，１９９３）
によるＤＮＡ配列解析を行い、発現プロフィールを決定し、変異をスクリーニン
グするためなどに利用されてきた。これらの使用の全てにおいて、ＯＤＮは基板
の表面に共有結合的に付着される。しかし、幾つかの有用なスクリーニング技術
およびアッセイは、ＯＤＮが固定されている形式に容易には適合されない。
【０００４】 特に、核酸の増幅、著しくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびその多く
の改変物により、非常に異なる多くの生物学的課題への広い適用が見出されたが
、ＯＤＮが固定化される形式に移動することは容易ではない。その標準の形式に
おいて、ＰＣＲはその商業的利用にたいして２つの主な制限がある：試薬のコス
トおよびそのプロセスを自動化する能力。試薬コスト、特にＤＮＡポリメラーゼ
は、各反応の総容量が減少すれば、低くなり得る。ロボット工学で制御したピン
ツールを使用する、少容量の試薬をアレイ化するのに正確かつ信頼性のある手段
は、この反応を小型化する。増幅をアレイ形式に移すことに対するさらなる障害
としては、加熱および冷却サイクルの間の、エバポレーションを防止すること、
およびこのアレイ上の反応物の拡散および併合を防止することが挙げられる。
【０００５】 本発明は、構成成分を固定化する必要なしに、アレイ形式で増幅および他の酵
素反応を行うための方法および組成物を開示し、他の関連する利点をさらに提供
する。
【０００６】 （発明の要旨） 本発明の１つの局面では、鋳型から核酸分子を増幅する方法であって、（ａ）
固体基板上の一本鎖核酸鋳型を、この鋳型にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを含む溶液を用いて、混合する工程で
あって、この混合する工程がこの基板上の個別の領域で生じ、この溶液が個別の
領域に残存する、工程；（ｂ）上記鋳型に対する相補鎖を合成して、二重鎖を形
成する工程；（ｃ）この二重鎖を変性させる工程；および（ｄ）上記鋳型に対す
る相補鎖を合成し、これにより核酸分子を増幅する工程；ここで混合する工程、
合成する工程、および変性する工程は露点で行われる、工程を含む方法が提供さ
れる。上記固体基板はシリコンウエハまたはガラススライドであり得る。上記の
鋳型は上記の固体基板に共有結合的に付着し得るか、または上記基板の表面に沈
着され得る。上記鋳型は混合する前にアレイ全体に一様に適用され得るか、また
は上記基板上の各個別の領域に個別に適用され得る。個別に適用する場合、好ま
しくはこの適用はスプリングプローブ（ｓｐｒｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）を使用して
行われる。最も好ましい実施態様において、装置を使用して上記露点を制御する
。
【０００７】 関連した局面では、増幅方法には、上記鋳型とハイブリダイズする第一のオリ
ゴヌクレオチドプライマー、上記鋳型の相補鎖にハイブリダイズする第二のオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使用し、そして合成し、二重鎖を変性させ；そして
、上記鋳型およびこの鋳型の相補鎖に対する相補鎖を合成した後、これにより核
酸分子が増幅される。
【０００８】 好ましい実施態様において、上記変性および合成工程は複数回行われる。他の
好ましい実施態様において、上記溶液は、粘度を与える化合物、例えばグリセロ
ールまたは糖を含む。他の好ましい実施態様において、上記ＤＮＡポリメラーゼ
は熱安定性ポリメラーゼであり、そして合成および変性は、異なる温度で行われ
る。
【０００９】 さらに他の好ましい実施態様において、上記方法は上記二重鎖を検出する工程
をさらに含む。最も好ましくは、上記オリゴヌクレオチドプライマーは、非蛍光
分光測定法または電位差測定法により、好ましくは質量分析法、赤外分光測定法
、紫外分光測定法、または電位差電流測定法により検出可能であるタグで標識さ
れる。
【００１０】 別の局面では、鋳型から核酸分子を合成する方法であって、（ａ）固体基板上
の一本鎖核酸鋳型を、この鋳型とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライ
マーおよびＤＮＡポリメラーゼを含有する溶液と混合する工程であって、この混
合する工程はアレイの個別の領域で生じ、そしてこの溶液は個別の領域に残存す
る、工程；および（ｂ）上記鋳型に対する相補鎖を合成して、二重鎖を形成する
工程であって、ここで混合する工程および合成は露点で行われ、露点は、加圧さ
れ得る容器；加熱デバイス；圧力を生成する手段；および飽和蒸気を生成する手
段を備える装置によって維持または達成され、この加熱デバイス、圧力生成手段
、および蒸気生成手段は制御可能である、工程を含む方法が提供される。
【００１１】 さらに別の局面において、核酸分子中の１塩基変化を検出する方法であって、
（ａ）固体基板上の一本鎖核酸分子を、この核酸分子にハイブリダイズする第一
および第二のオリゴヌクレオチドならびにＤＮＡリガーゼを含有する溶液と混合
する工程であって、この混合する工程はアレイの個別の領域で生じ、この溶液は
個別の領域に残存する、工程；および（ｂ）連結産物を検出する工程；ここで上
記第一および第二のオリゴヌクレオチドは、上記核酸分子上の接合部塩基で１塩
基変化がある場合、連結せず、混合する工程は露点で行われる、工程を含む方法
が提供される。
【００１２】 さらに別の局面において、単一ヌクレオチド伸長アッセイを実施する方法であ
って、（ａ）固体基板上のオリゴヌクレオチドを、このオリゴヌクレオチドにハ
イブリダイズする一本鎖核酸分子、単一ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラー
ゼを含有する溶液と混合する工程であって、この混合する工程は上記基板の個別
の領域で生じ、上記溶液は個別の領域に残存する、工程；および（ｂ）上記オリ
ゴヌクレオチドの伸長産物を検出する工程；ここで、上記オリゴヌクレオチドは
、上記単一ヌクレオチドが、上記ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに隣接
するヌクレオチドに相補性である場合のみ伸長され、混合する工程は露点で行わ
れる、工程を含む方法が提供される。
【００１３】 他の局面において、本発明は、遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）をする
ためのキットであって、標識されたオリゴヌクレオチドプライマー対のアレイを
含有する固体基板を備えるキットを提供する。好ましい実施態様において、この
キットは核酸鋳型および粘性溶液をさらに備える。
【００１４】 本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照
すれば明白となる。さらに、様々な参考文献が以下に示され、これはより詳細な
特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど）を記述しており、従ってそ
の全体が参考として援用される。
【００１５】 本発明の方法およびキットは、タグ化生体分子、例えば、切断可能なタグに共
有結合したオリゴヌクレオチドを含み得る。例示的なタグ化生体分子、およびこ
れを使用し得るアッセイが、各々１９９７年１月２２日に出願した米国特許出願
第０８／７８６，８３５号；同第０８／７８６，８３４号および同第０８／７８
７，５２１号に、ならびに各々１９９７年７月２２日に出願した出願第０８／８
９８，１８０号；同第０８／８９８，５６４号；および同第０８／８９８，５０
１号を有する３つの米国一部継続特許出願、ならびに国際公開第ＷＯ ９７／２
７３３１号；同第ＷＯ ９７／２７３２５号；および同第ＷＯ ９７／２７３２
７号に記載される。これら６つの米国特許出願および３つの国際公開は各々、こ
れにより、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【００１６】 本発明の方法およびキットは、エレメント（または「第一の領域」）内に１つ
より多くのオリゴヌクレオチド配列を含むアレイと共に使用され得る。エレメン
ト内に１つより多くのオリゴヌクレオチド配列を含む生体分子アレイ、およびそ
の使用は、１９９７年７月２２日に出願されたとおり、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｆ
ｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ Ｗｉｔｈｉｎ Ａｎ Ａｒｒａｙ Ｅｌｅｍｅ
ｎｔ Ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題された米国仮特許出願第６０／
０５３，４３６号および同様に題され、これと同日出願された米国非仮特許出願
第（ ）号（共にその全体が本明細書中に参考として援用される）に記載さ
れる。
【００１７】 本発明の方法およびキットと共に使用され得る生体分子アレイは、１９９７年
７月２２日に出願されたとおり、「Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｆｏｒ Ａｒｒａｙｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｏｎｔｏ Ａ Ｓｏｌｉｄ
Ｓｕｐｐｏｒｔ」と題された米国仮特許出願第６０／０５３，４３５号および
同様に題され、これと同日出願された米国非仮特許出願第（ ）号（共にそ
の全体が本明細書中に参考として援用される）に開示された技術に従って調製さ
れ得る。
【００１８】 本発明の方法およびキットと共に使用され得る生体分子アレイは、１９９７年
７月２２日に出願されたとおり、「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−Ｂａｓ
ｅｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｒｒａｙｓ」と題された米国仮特許出願第６
０／０５３，３５２号および同様に題され、これと同日出願された米国非仮特許
出願第（ ）号（共にその全体が本明細書中に参考として援用される）に開
示された技術に従って調製され得る。
【００１９】 １９９７年７月２２日に出願したとおり「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄ
ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ Ｄａｔａ」と題され
る米国仮特許出願第６０／０５３，４２９号および同様に題され、これと同日出
願された米国非仮特許出願第（ ）号（共にその全体が本明細書中に参考と
して援用される）に開示された、データを相関させることに関するコンピュータ
ーシステムおよび方法は、本明細書に記載のとおりの核酸アレイ上で行われる増
幅および他の酵素反応と組合せて使用され得る。
【００２０】 （発明の詳細な説明） 上述のとおり、本発明は、鋳型から核酸分子を増幅するための方法および装置
、ならびに核酸分子上で酵素アッセイを行うための方法および装置を提供する。
これらの方法は一般的に、本明細書に記載のとおり作製された核酸分子のアレイ
上で行われる。本発明において、これらの方法は露点を制御する装置内で行われ
る。
【００２１】 （Ｉ．固体基板への鋳型の適用） （Ａ．基板調製） アレイの基板は適切な材料から調製される。この基板は好ましくは剛直であり
、そして好ましくは実質的に平担である表面を有する。幾つかの実施態様におい
て、領域を示すために、この表面は隆起したリジッド（ｒａｉｓｅｄ ｒｉｇｉ
ｄ）を有し得る。代表的な基板はシリコンウエハおよびホウケイ酸スライド（例
えば、顕微鏡ガラススライド）であるが、当該分野で既知の他の材料で代用され
得る。特に有用な固体支持体の例はシリコンウエハであり、これは、半導体（ｓ
ｅｍｉｃｏｍｄｕｃｔｏｒ）の構築において電子工業産業において代表的に使用
される。このウエハは、１つの面が極めて研磨加工され反射性であり、そして種
々のリンカー、例えばシラン化学を使用するポリ（エチレンイミン）で容易にコ
ートされ得る。ウエハは、ＷａｆｅｒＮｅｔ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡのような
会社から市販されている。
【００２２】 核酸分子または他の生体高分子、例えばペプチドはインサイチュ、すなわち固
体基板上で合成されるか、その他の場所で合成され、この基板に適用されるかの
いずれかであり得る。あるいは、オリゴヌクレオチドが既にアレイ上に存在する
基板は購入できる（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ
）。固体基板、例えばシリコンウエハ上で核酸を合成する多くの適切な方法は容
易に入手可能である。これらの方法は、標準のプロトコル、例えばホスホルアミ
ダイト化学を頼みにしてオリゴヌクレオチドを合成する。核酸およびペプチドも
また、市販の機械を使用する自動化した様式で合成され得る。好ましい方法は、
上記核酸分子を調製し、これらを上記基板に適用することである。特定の実施態
様において、上記分子は、上記基板に共有結合的に付着している。好ましい実施
態様において、上記核酸分子は上記固体基板上に沈着され、共有結合的には付着
されない。
【００２３】 特定の実施態様において、上記基板の表面はオリゴヌクレオチドのために調製
される。この表面は、例えば、この疎水性を増加もしくは減少させる化学物質で
コーティングすること、または上記核酸分子もしくは他の重合配列の共有結合を
許容する化学物質でコーティングすることにより調製され得る。幾つかの化学的
なコーティングは、疎水性を変化させると共に、共有結合を許容し得る。固体基
板上の疎水性は、当該分野で公知のシラン処理または他の処理により容易に増加
され得る。共有結合を許容する化学物質は、一般的にリンカーと呼ばれる。これ
らのリンカー分子は、上記基板の表面に付着し、生体分子と反応する官能基を含
む。多くのこのようなリンカーは容易に入手できる。例えば、固体支持体は、感
光保護した（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）水酸基（米国特許
第５，４１２，０８７号；同第５，５７１，６３９号；同第５，５９３，８３９
号を参照のこと）、アルコキシまたは脂肪族で誘導体化した水酸基（米国特許第
５，４３６，３２７号）、または他の化学物質（例えば、米国特許第５，４４５
，９３４号；ＥＰ特許第ＥＰ−Ｂ１−０，３７３，２０３号；米国特許第５，４
７４，７９６号；米国特許第５，２０２，２３１号を参照のこと）を用いて改変
される。
【００２４】 疎水性を減少させると共に、リンカーを提供する好ましいコーティングは、ポ
リ（エチレンイミン）である。さらに、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）でコ
ーティングした固体基板はまた長い貯蔵寿命安定性という付加された利点を有す
る。ポリマー、例えばポリ（エチレンイミン）でのシリコンウエハおよびガラス
スライドのコーティングは、社内で、またはＣｅｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｈ
ｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）のような会社を通して実施され得る。ガラススライ
ドはまた、反射性材料でコーティングされ得るか、またはシラン化学を使用して
ＰＥＩでコーティングされ得る。このＰＥＩコーティングは、一本鎖もしくは二
本鎖のオリゴヌクレオチド、一本鎖もしくは二本鎖の長いＤＮＡ分子もしくはフ
ラグメント、または任意の他のアミン含有生体分子の、上記固体支持体への共有
結合的付着を許容する。オリゴヌクレオチドはヘキシルアミン修飾を使用して５
’で共有結合的に付着し得、この修飾は上記オリゴヌクレオチドの５’末端に一
級アミンを配置する。次に、上記オリゴヌクレオチド上の５’アミンは、架橋剤
と反応し得、その結果、このオリゴヌクレオチドは、上記固体支持体上にコーテ
ィングされたポリマーに共有結合的に付着される。
【００２５】 任意の核酸型は、この核酸が一級アミンを含有する限りは、ＰＥＩでコーティ
ングした表面に共有結合的に付着され得る。増幅産物（例えば、ＰＣＲによる）
は、５’ヘキシルアミン結合体化プライマーを使用することにより、一級アミン
を含有するように改変され得る。アミン基は、アリル−ｄＵＴＰ（Ｓｉｇｍａ，
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用するニックトランスレーションにより、増幅産
物および他の核酸二重鎖に導入され得る。その上、アミンは、ポリメラーゼ、例
えば、ターミナルトランスフェラーゼにより、または短いアミン含有オリゴヌク
レオチドの連結により核酸に導入され得る。当該分野において公知の他の適切な
方法が代用され得る。
【００２６】 アミン基に適切な架橋剤は一般的に市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ，
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬを参照のこと）。代表的な架橋剤は、トリクロロトリア
ジン（塩化シアヌル）（Ｖａｎ Ｎｅｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１９：３３４５−３３５０，１９９１）である。簡単には、過剰の塩化シ
アヌルが、０．０１〜１μｇ／ｍｌ、および好ましくは約０．１μｇ／ｍｌの代
表的なオリゴヌクレオチド濃度のオリゴヌクレオチド溶液（例えば、アミンの１
０〜１０００倍モル過剰の塩化シアヌル）に添加される。この反応は、一般的な
緩衝液、例えば、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、また
はＴｒｉｓ ＨＣｌを７．０〜９．０のｐＨ範囲で使用して緩衝化される。好ま
しい緩衝液は、新しく調製されたｐＨ８．３〜ｐＨ８．５の０．２Ｍ ホウ酸Ｎ
ａである。１０μｌの塩化シアヌルの１５ｍｇ／ｍｌ溶液が、添加され、１〜１
２時間および好ましくは約１時間、一定に攪拌しながら反応させる。反応温度は
、２０〜５０℃の範囲であり得、好ましい反応温度は、２５℃（または周囲温度
）である。
【００２７】 塩化シアヌルが架橋剤として使用される場合、上記核酸を固体基板にプリント
する前に過剰なクロスリンカーを除去する必要は無い。上記反応混合物中の過剰
の塩化シアヌルは、上記核酸またはオリゴヌクレオチドの上記ＰＥＩコーティン
グした固体基板ヘとの共有的付着を妨害も競合もしない。なぜなら、上記固体基
板上のアミンが、塩化シアヌル分子の数よりも過剰であるからである。好ましい
実施態様において、架橋したオリゴヌクレオチドはプリントする工程の前に精製
されない。
【００２８】 上記核酸または他のアミン含有ポリマーを共有結合的に付着させる場合、上記
活性化ポリマーを、１〜２０時間、２０〜５０℃で、好ましくは１時間２５℃で
、上記固体支持体と反応させる。次にこの固体支持体上の遊離アミンはキャッピ
ング（ｃａｐ）され、他の核酸の非特異的な付着が防止される。キャッピングは
、上記固体支持体を７０％ ｍ−ピロール（ｐｙｒｏｌ）および０．１Ｍホウ酸
Ｎａ中で０．１〜２．０Ｍ無水コハク酸、好ましくは１．０Ｍ無水コハク酸と、
１５分間〜４時間、好ましくは２５℃で３０分間の反応時間で、反応させること
により達成される。次に上記固体支持体は、０．１〜５Ｍグリシン（好ましくは
０．２Ｍグリシン）を含有する、ｐＨ７〜ｐＨ９の０．１〜１０．０Ｍホウ酸Ｎ
ａ（好ましくはｐＨ８．３の０．１Ｍ ホウ酸Ｎａ）溶液中でインキュベートさ
れ、次に界面活性剤含有溶液で洗浄される。このことは、上記ＰＥＩ表面に共有
結合し得る任意のジクロロトリアジンをキャッピングする。好ましくは、上記固
体支持体は、０．０１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ（ｐＨ８．０）中で５分間、９５℃にさらに加熱され、全ての非共有的に
付着する核酸が除去される。二本鎖核酸が固体基板上にプリントされる場合、こ
の工程はまた、この二本鎖を一本鎖形態に変換（変性）する。
【００２９】 （Ｂ．核酸分子を固体基板に適用する方法） オリゴヌクレオチド、核酸分子、または他の生体高分子は固体基板上に「プリ
ント」（送達または適用）される。好ましい実施態様において、このポリマーは
規則的なパターンまたはアレイにおいて適用される。他の好ましい実施態様にお
いて、このポリマーは上記固体基板の領域全体に適用され、乾燥させられ、その
後追加のポリマー、緩衝液、酵素などがアレイパターンにおいて適用される。上
記ポリマーは、例えば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、および５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡのように、界面活性剤なしで、ピペッター、ナイロンローラー、ス
タンプなどを使用して、緩衝化塩溶液中で上記基板に適用され得る。
【００３０】 種々のプリント方法が、アレイパターンにおいて、核酸、例えば、オリゴヌク
レオチドまたはＤＮＡフラグメントを固体基板に適用するために利用可能である
。一般的なガイドラインに従って、この送達機構は、非常に少量の液体（例えば
、ナノリッター）を、互いに非常に近接している（例えば、２５〜５００μｍの
中心間距離の）小さい領域（例えば１０〜２００μｍの直径ドット）に位置決め
することが可能でなければならない。好ましくはプリント技術は自動化できる。
１つのこのような技術は複数のヘッドを使用するインクジェットプリントである
。非常に微細なピペッターもまた使用され得る。プリントする好ましい手段は、
本明細書に記載したとおりのスプリングプローブを使用している。
【００３１】 試料のピックアップ、移動、および微小液滴沈着は、親水性の表面を有する液
体移動デバイスを使用する場合に、特にこのデバイスが改変されたスプリングプ
ローブである場合に、非常に増強される。スプリングプローブは、このプローブ
の表面を改変するように作用する化学薬剤の使用を通して、または親水性物質で
このプローブをコーティングすることを通して親水性にされる。好ましい方法に
おいて、上記スプリングプローブのチップは、１、４−ジチオスレイトール、０
．１Ｍホウ酸ナトリウムの２５〜２００ｍＭ溶液中に、１５分間〜２時間浸漬さ
れる。ジチオスレイトールは、チオール−金配位を通して金表面と反応し、この
ことは上記表面を本質的に水酸化し、上記表面を親水性にする。
【００３２】 上記親水性表面は、上記スプリングプローブを溶液中に浸漬した場合、試料の
均一なコーティングを促進する。縦つきプローブは、その親水性の性質により、
上記プローブ表面に汲み出された液体が一様におよび一貫してロードされるよう
になる。グリセロールのような粘性増強化学物質を有する溶液は、親水性表面を
使用して操作能力の改善を特に提供する。これらの溶液を用いると、液体の供給
源から引き出された場合に、このグリセロールは上記プローブに一様に接着する
。試料がその供給源から固体支持体へと移されたとき、上記プローブの親水性表
面は、移された上記試料を保持すること、および輸送の間にこの試料を無作為に
滴下または流すことを防止することにより、液体操作で利益を受け続ける。スプ
リングプローブを有する試料が固体支持体と接触する場合、特に粘度増強溶液を
含有する試料の場合、この試料はこのスプリングプローブのチップからこの固体
支持体の表面に沈着される。スポットされる領域のサイズは一般的に、代表的な
中心間距離は２５〜５００μｍで、１０〜２００μｍの範囲である。
【００３３】 簡単には、代表的な手順において、上記核酸の溶液は、５７％グリセロール中
に一様に混合され、次に上記固体支持体にプリントされる。本発明の文脈では、
上記生体高分子は、核酸分子またはタンパク質分子のいずれかであり得る。核酸
を使用する場合、これらは、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ、一本鎖もしくは二
本鎖のＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡ分子、または
二重鎖、タンパク質骨格を有するＰＮＡ核酸などを含み得る。
【００３４】 （ＩＩ．反応成分および条件） 上記のとおり、本発明は、固体基板上で核酸を増幅する方法、ならびに他の酵
素反応を提供する。上記のとおり、この核酸はこの基板の表面に共有結合的に付
着し得るか、または付着せずにこの基板上に沈着し得る。代表的には、この増幅
のための鋳型は最初にプリントされ、増幅または他の酵素反応に必要な試薬は続
いて添加される。
【００３５】 （Ａ．試薬、緩衝液、補助因子など） 反応を受けるアレイの各領域は、上記鋳型核酸に加えて、オリゴヌクレオチド
プライマー、ヌクレオチド、緩衝液、補助因子などを含むがこれに限定されない
、適切な酵素、および任意の他の必要な成分を有する。例えば、増幅反応物は、
鋳型、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰ）、オリゴヌクレオチドプライマー、および２価のカチオン（通
常はＭｇ++）を含有する緩衝液を含有する。
【００３６】 増幅反応は、プライマー伸長（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、米国特許第４
，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，８００，１５９
号、サイクリングプローブ技術、ＮＡＳＢＡを参照のこと）、連結（ＬＣＲ、連
結連鎖反応）、ＲＮＡ増幅（Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７、１９８８；Ｋｒａｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：４０１、
１９８９；Ｌｏｍｅｌｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５：１８２６、１９８９；
米国特許第３，７８６，６００号を参照のこと）、ディファレンシャルディスプ
レイ（ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７：９６７−９７
１、１９９２；Ｌｉａｎｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２：５７６
３−５７５７、１９９４）などに基づく。好ましくは、この増幅方法は，熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔR（登録 商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔR（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメ ラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼなどを用いるポリメラーゼ連鎖反応である
。これらの酵素について、至適な緩衝液および２価のカチオンは周知である。オ
リゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは平均のＧ＋Ｃ含有量であり、非対合
３’末端を有する。オリゴヌクレオチド配列はまた、増幅される領域に部分的に
依存する。オリゴの設計、緩衝液濃度、およびカチオン濃度についての条件およ
び考慮すべき事柄は周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ
ｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９５；Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９０；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ．１９８７を参照のこと）。
上記ヌクレオチドは一般的に４つのデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ
、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）であるがまた、誘導体またはまれな塩基を含み得
る。
【００３７】 本発明の文脈での他の酵素反応は、鋳型からの核酸分子の合成、核酸分子にお
ける１塩基変化を検出するためのオリゴヌクレオチド連結アッセイ、および単一
ヌクレオチド伸長アッセイを含む。各々のこれらの方法について、適切な条件は
周知である。
【００３８】 さらに、上記反応物は、他の化学物質または成分を含有し得る（米国出願第０
８／７１９，１３２号および同第６０／０２６，６２１号、ならびにこれら２つ
の米国出願に対する優先権を主張する国際公開番号第ＷＯ ９８／１３５２７号
を参照のこと（これら全てはその全体が本明細書中に引用される）。例えばハイ
ボトロープ（ｈｙｂｏｔｒｏｐｅ）は、オリゴヌクレオチドプライマーの鋳型へ
のアニーリングを改善するために添加され得る。ハイボトロープとは、標準の塩
溶液（すなわち、０．１６５Ｍ ＮａＣｌ）を参照した場合に、核酸二重鎖のエ
ンタルピーを２０％以上増加させ得る任意の化学物質を言う。溶液として、５０
％Ｇ＋Ｃである１８ｂｐオリゴヌクレオチド二重鎖が１５℃以下のヘリックスコ
イルトランジション（ＨＣＴ）を有する場合、化学物質はハイボトロピック（ｈ
ｙｂｏｔｒｏｐｉｃ）な特性を表す。ＨＣＴは、８０％の二重鎖が一本鎖である
温度と、２０％の二重鎖が一本鎖である温度との差である。次にアニーリング温
度は識別温度であるべく選択される。識別温度は、ミスマッチ二重鎖と完全にマ
ッチした二重鎖との間の検出可能な識別を可能にするハイブリダイゼーション反
応を実行する温度である。
【００３９】 好ましい実施態様において、上記反応は粘性溶液中で行われる。このような溶
液は好ましくは、この露点を上昇させ（すなわち、蒸気圧と低下させる）、高い
表面張力を有し、そしてプリント能力を改善する。この粘性溶液は、酵素反応を
実質的に阻害してはならない。好ましくは、酵素活性は１％以下〜２０％阻害さ
れる。粘度を増加させる適切な化合物としては、グリセロールおよび糖が挙げら
れる。好ましくは、グリセロールは２０〜１００％で、より好ましくは２０〜７
０％で存在する。他の適切な化合物は、（ａ）この化合物の存在下で、酵素活性
を決定する工程、および（ｂ）固体基板上で液滴を形成し、上記反応温度でイン
キュベートし、そして個別の液滴（領域）が残存することを観察する工程、によ
り同定され得る。一般的に、上記基板表面が疎水性であればあるほど、溶液の粘
度は低下し、そして上記基板表面が親水性であればあるほど、溶液の粘度はより
高くなる。
【００４０】 （Ｂ：露点の維持のための装置） 上記の通り、反応は、露点で行われる。本明細書において使用する場合、露点
とは、液滴のサイズが有意に変化しない温度範囲をいう。本明細書において記載
するように、温度、圧力、および含水量を制御し得る装置は、露点を維持するた
めに使用され得る。
【００４１】 反応自体は、微小液滴からの水分のエバポレーションを防ぐ規定された含水量
のレベルを伴う圧力下で行われる。これらの条件は、微小液滴からの水分のエバ
ポレーションの速度と基板アレイを覆う湿った空気からの微小液滴上への水分の
凝集の速度との間の平衡状態が存在する場合に、達成される。この平衡が現実化
する場合、空気は、アレイの平面表面に関して飽和していると言われる。水蒸気
によって生じる圧力（Ｐｓ）は、反応の間において任意の所定の温度において維
持されなければならない飽和蒸気圧である。飽和蒸気圧の大きさは、温度のみに
依存して、そして上昇する温度にともなって迅速に上昇する。すなわち、熱サイ
クル増幅は、達成される温度の全てについて、本質的に露点において行われる。
例えば、０℃において、飽和蒸気の絶対圧力は、０．０８８５ｐｓｉであり、一
方、１００℃において、飽和蒸気の絶対圧力は、１７．１８６ｐｓｉである。従
って、装置は、増幅または他の酵素反応の間、生じる温度サイクリングの全ての
間に、露点を維持する能力を有するべきである。本質的に、飽和した清浄な蒸気
が、「チャンバー」内に存在する。装置は、代表的には、固体支持体、制御可能
な加熱デバイス、圧力を生成する手段、および飽和蒸気を生成する手段を含有す
る圧力チャンバーから、構成される。全てのパラメータは、好ましくは、コンピ
ュータによって制御可能である。他の実施態様において、装置は、圧力を生成す
る手段、飽和蒸気を生成する手段、ならびにこのチャンバーが制御可能な加熱お
よび冷却ブロック（市販されているようなもの）上にシールされるようなシ−ル
を有するチャンバーである。このモジュール構成の装置は、種々のサイズの加熱
および冷却ブロックの型式に適合するように設計される（例えば、９６ウェルプ
レートサイズから、顕微鏡スライドまで）。
【００４２】 好ましい実施態様において、および図５に関して、この発明は、加熱および冷
却ブロック１０１を提供し、ブロック上にカバーガラス１０２が位置し、そして
カバーガラスは、サンプル液滴の別個の領域１０３を含む。そのブロックは気密
性カバー１０４に入れられ、このカバーはチャンバーを形成し、そのチャンバー
は、内部圧を調節するためのピストン１０５、露点を測定するセンサー１０６、
および水蒸気の供給源１０７を有する。
【００４３】 本発明の好ましい実施態様において、チャンバーを開けるための装置、ブロッ
クの温度、ピストンの位置、そしてバルブは、全てコンピュータ制御下にある。
本発明の１つの実施態様において、センサー（１０６）は、ＣＣＤカメラ、およ
びそのピストンの透明部分の後ろの光源である。この実施態様において、１つ以
上の液滴のサイズは、液滴を画像化して、液滴画像と参照スポットの画像を比較
することにより、連続的に測定される。露点は、液滴のサイズをモニターするこ
とにより推定され、そして圧力は、その液滴の当初のサイズを維持するように調
整される。圧力は、ピストンの位置を制御することにより制御される。本発明の
別の実施態様において、圧力は従来のセンサーを用いてモニターされる。この実
施態様において、圧力は、サンプルの温度およびサンプルの組成に基づく事前に
設定された値に変化して、予測された露点範囲内に属する。
【００４４】 本発明の好ましい実施態様において、水蒸気の供給源（１０７）は、一定の温
度に保たれた水分飽和フィルターを通過する乾燥ガスの供給源からなる。蒸気供
給源から流れるこのガスは、水分で飽和され、そして温度が制御されている。こ
のガスは、チャンバーがシールされる前にそのチャンバー内を置換するために使
用され、そしてそのチャンバー内の雰囲気の組成が一貫していることを確実にす
るため、および平衡に達するためにサンプルからのエバポレーションを必要とす
るために役立つ。
【００４５】 （ＩＩＩ．反応産物の検出） 反応産物は、種々の方法で検出され得る。好ましくは、反応成分の１つは、標
識される。増幅反応においては、オリゴヌクレオチドプライマーまたはヌクレオ
チドが、都合よく標識される。好ましくは、プライマーが標識を含有する。単一
ヌクレオチド伸長アッセイにおいては、付加されたヌクレオチドが、一般的に標
識され、オリゴヌクレオチド連結アッセイにおいては、１つ以上のオリゴヌクレ
オチドが標識され、他の合成反応においては、プライマーまたはヌクレオチドの
いずれかが、代表的に標識される。
【００４６】 一般的に使用される標識としては、ビオチン、蛍光分子、放射性分子、色素生
産性物質、化学発光剤などが挙げられるが、これらに限定されない。核酸のビオ
チン化のための方法は、蛍光分子および放射性分子のオリゴヌクレオチドおよび
ヌクレオチドへの導入方法と同様に、当該分野において周知である。
【００４７】 ビオチンが使用される場合、ビオチンは、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ）または放射性標識（例えば、32Ｐ、35Ｓ、33Ｐ）のような検出可能な
マーカーと結合体化された、アビジン、ストレプトアビジンなどによって検出さ
れる。酵素結合体は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕ
ｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）から市販されている。ストレプトアビジンは、高親和
性でビオチンと結合し、結合しないストレプトアビジンは、洗浄除去され、そし
て次に西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素の存在が、ペルオキシドおよび適切な緩
衝液の存在下において沈殿する基質を用いて検出される。その産物は、可視光線
供給源およびＣＣＤカメラを備えた顕微鏡を使用して検出され得る（Ｐｒｉｎｃ
ｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）。そのような
機器を用いて、一度に約１０，０００μＭ×１０，０００μＭの画像がスキャン
され得る。
【００４８】 検出方法は、蛍光標識、放射性標識、化学発光標識、色素生産性標識、ならび
に他の一般に使用される標識について周知である。手短には、蛍光標識は、その
吸収および蛍光発光波長および強度によって最も直接的に同定および定量され得
る。適切な波長の光源を使用する顕微鏡／カメラ装備が、蛍光標識の検出に都合
のよい手段である。放射性標識は、標準的なオートラジオグラフィー、ホスホ（
ｐｈｏｐｈｏｒ）イメージング分析またはＣＣＤ検出器によって可視化され得る
。他の検出系が、利用可能であり、そして当該分野において公知である。ビオチ
ン、放射性、蛍光のような標識について、一度に検出されうる異なる反応の数は
、限られている。例えば、４つの蛍光分子（例えば、ＤＮＡ配列決定分析におい
て一般に使用される）の使用は、分析を、一度に４つのサンプルに対して限定す
る。本質的に、この限定のために、これらの検出器方法を使用する場合、各反応
は、個別に評価されなければならない。
【００４９】 より有利な検出方法は、サンプル反応物を少なくとも１つのアレイにプールし
て、産物の同時分析を可能にする。各反応において異なる分子量または他の物理
的性質を有するタグを使用することにより、反応産物の組全体がともに収集され
、そして分析され得る。（例えば、米国特許出願第０８／７８６，８３５号、同
第０８／７８６，８３４号、同第０８／７８７，５２１号、同第０８／８９８，
１８０号、同第０８／８９８，５６４号、同第０８／８９８，５０１号、ならび
に、国際公開第９７／２７３３１号、同第９７／２７３２５号、および同第９７
／２７３２７号を参照のこと。これら全ては、その全体において、本明細書中で
参考として援用される。）手短には、「タグ」分子は、標識として使用される。
本明細書において使用する場合、「タグ」とは、「目的の分子」を独自に同定す
るために使用される化学部分をいい、そしてより具体的には、タグ可変成分、な
らびに任意のタグ反応物、タグ成分およびタグ部分において、どんなものであっ
ても、それに最も近接して結合し得るものをいう。
【００５０】 本発明において有用なタグは、いくつかの性質を有する：（１）他の全てのタ
グから区別され得る。他の化学部分からのこの区別は、タグのクロマトグラフィ
ー挙動（特に切断反応後）、その分光学的または電位差測定での特性、あるいは
そのいくつかの組み合わせに基づき得る。タグが有用に区別される分光学的方法
としては、質量分析法（ＭＳ）、赤外（ＩＲ）、紫外（ＵＶ）、および蛍光が挙
げられ、ＭＳ、ＩＲおよびＵＶが好ましく、そしてＭＳは最も好ましい分光学的
方法である。電位差測定の電流測定方法は、好ましい電位差測定方法である。（
２）タグは、１０-22〜１０-6モル存在する場合、検出され得る。（３）タグは 、化学的なハンドル（このハンドルを介して、タグは、タグが独自に同定するこ
とが意図されるＭＯＩに結合され得る）を有する。結合は、ＭＯＩに対して直接
的にか、または「リンカー」基を介して間接的になされ得る。（４）タグは、そ
れが供される全ての操作（ＭＯＩへの結合およびＭＯＩからの切断、ならびにタ
グがそれに結合している間の、ＭＯＩの任意の操作を含む）に対して、化学的に
安定である。（５）タグは、そのタグが結合している間、ＭＯＩ上で行われる操
作を有意には妨げない。例えば、タグがオリゴヌクレオチドに結合している場合
、そのタグは、オリゴヌクレオチド上で行われる任意のハイブリダイゼーション
または酵素反応（例えば、増幅反応）を有意に妨げてはならない。
【００５１】 特定の分光学的または電位差測定方法によって検出されることが意図されるタ
グ部分は、その方法による感度および検出特異性を増強する特性を有するべきで
ある。代表的には、そのタグ部分は、それらの特性がタグ部分の主要な部分を代
表的に構成するタグ可変成分中に設計されていることによって、それらの特性を
有する。以下の議論において、用語「タグ」の使用とは、代表的にタグ部分をい
う（すなわち、タグ可変成分を含む切断産物）が、タグ可変成分自体をいうこと
もまた考慮され得る。なぜなら、それは代表的に独自の検出可能な特性を提供す
る原因であるタグ部分の一部分であるからである。式Ｔ−Ｌ−Ｘの化合物におい
て、「Ｔ」部分は、そのタグ可変成分を含有する。そのタグ可変成分が、例えば
、質量スペクトロスコピーによって特徴づけられるように設計されている場合、
Ｔ−Ｌ−Ｘの「Ｔ」部分は、Ｔmsと称され得る。同様に、Ｔを含むＴ−Ｌ−Ｘ由
来の切断産物は、Ｔms含有部分と称され得る。以下の分光学的および電位差測定
方法は、Ｔms含有部分を特徴づけるために使用され得る。
【００５２】 従って、本発明の１つの局面の中で、核酸分子またはフラグメントの同一性を
決定するための方法（または選択された核酸分子またはフラグメントの存在を検
出するための方法）が提供される。この方法は、以下の工程を包含する、（ａ）
１つ以上の選択された標的核酸分子からタグ化された核酸分子を生成する工程で
あって、ここでタグは、特定の核酸分子と相関して、そして非蛍光分光測定また
は電位差測定によって検出可能である、工程、（ｂ）標識された分子をサイズに
よって分離し（例えば、ＨＰＬＣ、電気泳動）、酵素的に生成された産物におい
て取り込まれていない標識物質を取り除く工程、（ｃ）そのタグを、そのタグ化
分子から切断する工程、および（ｄ）そのタグを、非蛍光分光測定または電位差
測定によって検出し、そしてそれにより核酸分子の同一性を決定する工程。その
ような技術の例としては、例えば、質量分析法、赤外分光測定法、定電位電流測
定法またはＵＶ分光測定法が挙げられる。
【００５３】 （ＩＶ．使用） 上記のように、本明細書に記載されるこの方法は、種々の方法において使用さ
れ得る。例えば、鋳型核酸の増幅は、個人の遺伝子型決定、変異のスキャニング
、発現プロフィールの決定、などのために使用され得る。オリゴヌクレオチド連
結アッセイおよび単一ヌクレオチド伸長アッセイは、変異分析、サンプル中の核
酸の検出などのために使用され得る。これらの使用の各々を、以下に手短に記載
する。
【００５４】 （Ａ．遺伝子型決定） 本発明の１つの好ましい局面において、選択された生物体を遺伝子型決定する
ための方法が提供され、この方法は、以下の工程を含む、（ａ）選択された標的
分子からタグ化された核酸分子を生成する工程であって、ここでタグは特定のフ
ラグメントと相関して、そして非蛍光分光測定または電位差測定によって検出さ
れ得る、工程、（ｂ）そのタグ化分子を分離する工程、（ｃ）そのタグをそのタ
グ化分子から切断する工程、そして（ｄ）そのタグを、非蛍光分光測定または電
位差測定によって検出し、それによりその生物体の遺伝子型を決定する工程。他
の実施態様において、そのタグは蛍光性、放射性などであり得る。
【００５５】 本発明の別の実施態様において、核酸分子の同一性を決定する方法、または例
えば、生物学的サンプルにおいて、ＤＮＡフィンガープリンティングの技術を用
いて、選択する核酸分子を検出する方法を提供する。手短には、そのような方法
は、一般的には、一連のタグ化核酸フラグメントを生成して、その後、そのフラ
グメントをサイズによって分離する工程を包含する。そのサイズ分離工程は、例
えば、ゲル電気泳動（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動）または好まし
くはＨＰＬＣによって達成され得る。次に、タグはその分離されたフラグメント
から切断されて、次にそのタグは対応する検出技術（例えば、質量分析法、赤外
分光測定法、定電位電流測定法またはＵＶ分光測定法）によって検出される。
【００５６】 多くのタイプのＤＮＡ配列多型性の記載が、ヒトゲノム構造の理解についての
根本的な基礎を提供している（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍａｎ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ ３２：３１４、１９８０；Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ、Ｃｅｌ
ｌ ５１：３１９、１９８７；Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ ３５
９：７９４）。広範な連鎖地図の枠組みの構築が、これらのＤＮＡ多型性の使用
により促進され、そして連鎖による疾患遺伝子の位置決めのための現実的な手段
を提供している。１塩基変異に加えて、直列反復の長さのバリエーションもまた
ゲノムにおいて一般的であり、少なくとも数万の分散した多型性部位（遺伝子座
と呼ばれる）をともなっている。直列反復多型性の２つの主要な群が存在する：
ミニサテライト／代表的な数１０塩基対の反復長および数１０〜数千の全反復単
位を有する可変の数の直列反復（ＶＮＴＲ）、ならびに６ｂｐまでの反復長およ
び最大で約７０ｂｐの全長を有するマイクロサテライト。マイクロサテライトジ
ヌクレオチド反復は、ヒト遺伝子の同定において非常に強力な道具であることが
証明されており、非常に多型性であり（Ｗｅｂｅｒ、１９９０、Ｇｅｎｏｍｉｃ
Ａｎａｌｙｓｉｓ、１：１５９〜１８１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ｗ
ｅｂｅｒおよびＷｏｎｇ、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２：１１２３、
１９９３）、そして２４までの対立遺伝子を有し得る。高レベルの多様性を可能
にする染色体特異的マーカーは、連鎖分析のために全ゲノムのスキャンを行うこ
とについて報告されている（Ｄａｖｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３７１：１３０、
１９９４）。
【００５７】 反復は、ジヌクレオチド反復の周囲の独特の領域に相補的なプライマーを使用
して増幅され得る。増幅後に、いくつかの増幅された遺伝子座は、アレイでの捕
獲の前に合わせられ得る（多様化）。
【００５８】 遺伝子型決定またはＤＮＡフィンガープリンティングは、特定のサンプルから
の１組のＤＮＡフラグメントの提示を含む。種々のＤＮＡフィンガープリンティ
ング技術が現在利用可能である（Ｊｅｆｆｒｅｙｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：
６７〜７３、１９８５：ＺａｂｅａｕおよびＶｏｓ、欧州特許出願９２４０２６
２９．７．；Ｖｏｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４４０７〜４４
１４、１９９６；Ｂａｔｅｓら、Ｔｈｅ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４章、２３９〜２５５頁、Ｂ．Ｗ．Ｓ
．Ｓｏｂｒａｌ編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。ＤＮＡフ
ィンガープリンティングは、特定のＤＮＡサンプルからの１組のＤＮＡフラグメ
ントの提示を含む。種々のＤＮＡフィンガープリンティング技術が、現在利用可
能であり（Ｊｅｆｆｒｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：６７、１９８５；Ｗｅ
ｌｓｈおよびＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：８６
１、１９９１）、これらのほとんどは増幅（例えば、ＰＣＲ）を使用してフラグ
メントを生成する。ＤＮＡフィンガープリンティング手順は、個々の生物体にと
って特徴的で再現性のある、異なるフラグメント長の「フィンガープリント」パ
ターンを作製する。これらのフィンガープリントは、非常に密接に関連する生物
体（ほぼ同質遺伝子的系統を含む）でさえも区別するために使用され得る。フラ
グメント長または配列の差異は、制限部位またはプライマー伸長部位の塩基変化
、あるいはＤＮＡフラグメント内の挿入または欠失にまで追跡され得る。
【００５９】 どのフィンガープリント技術を使用するかの選択は、適用（例えば、ＤＮＡ型
決定、ＤＮＡマーカーマッピング）および研究中の生物種（例えば、原核生物、
植物、動物、ヒト）に依存する。これらの要求を満たす多数のフィンガープリン
ト方法が開発されている。これらとしては、ランダム増幅多型性ＤＮＡ（ＲＡＰ
Ｄ）、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（ＤＡＦ）、および任意に開始（ｐ
ｒｉｍｅ）するＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）が挙げられる。これらの方法は、全て任
意に選択されたＰＣＲプライマーが、以前の配列知識なしで任意のＤＮＡからＤ
ＮＡフラグメントパターンを生成させることによる、ランダムなゲノムＤＮＡの
フラグメントの増幅に基づく。生成されたパターンは、増幅プライマーの配列お
よび鋳型ＤＮＡの性質に依存する。低いアニーリング温度を使用して、プライマ
ーをＤＮＡ上の複数の遺伝子座にアニールさせる。この遺伝子座は、プライマー
結合部位が互いに十分近い場合に増幅される。原則として、単一のプライマーが
バンドのパターンを生じるために十分である。
【００６０】 さらなるＤＮＡフィンガープリンティング技術が記載されており、ＡＦＬＰと
称される（Ｖｏｓら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４４０７、１９９５
）。ＡＦＬＰ技術は、増幅によるゲノム制限フラグメントの検出に基づき、そし
て任意の起源または複雑性のＤＮＡに使用され得る。手短には、この技術は、ゲ
ノムＤＮＡの全消化物由来の制限フラグメントの選択的増幅に基づく。この技術
は、３つの工程を包含する：１）ＤＮＡフラグメントの制限およびその後のオリ
ゴヌクレオチドアダプターの連結、２）複数組（ｓｅｔｓ）の制限フラグメント
の選択的増幅、３）増幅フラグメントの分析。制限フラグメントの増幅は、プラ
イマーのアニーリングのための標的部位としての、アダプターおよび制限部位配
列を使用して達成される。この選択的増幅は、制限フラグメント中へ伸長するプ
ライマーの使用によって達成され、これはフラグメントにおけるプライマーの伸
長物が制限部位に隣接するヌクレオチドにマッチするフラグメントのみを増幅す
る。従って、この方法は、ヌクレオチド配列の以前の知識なしに、種々の方法（
例えば、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、または他のタイプの分光測定）によって可視化さ
れ得る複数組の制限フラグメントを生じる。この方法はまた、多数の制限フラグ
メントの同時増幅を可能にする。しかし、フラグメントの数は、検出系の解像度
に依存する。代表的には、５０〜１００制限フラグメントが増幅され、そして検
出される。
【００６１】 制限フラグメント長多型性（ＲＦＬＰ）を同定する増幅アプローチは、分離技
術と、特異的ＰＣＲプライマーと結合したタグの検出を組み合わせる。一般的に
、１つのプライマーは、１つの特異的タグを有する。従って、そのタグは、１組
のプライマーを表し、従って所定のＤＮＡフラグメント長を表す。多型性は、ゲ
ル中か、またはゲルから溶出される標識化フラグメントの長さのバリエーション
として検出される。ＨＰＬＣまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動は、単一反
復単位で異なるミニサテライト／ＶＮＴＲ対立遺伝子を区別するのに必要な解像
度を、通常生じる。マイクロサテライト多型性の分析は、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）による、反復のブロックを含むＤＮＡの小フラグメントの増幅、その
後の変性ポリアクリルアミドゲルでの増幅されたＤＮＡの電気泳動か、またはＨ
ＰＬＣによるＤＮＡフラグメントの分離を含む。その増幅されたＤＮＡは、標識
が結合されたプライマーを用いて標識され得る。プライマーは、新規に合成され
た鎖中に、鎖伸長によって取り込まれる。プライマーは、反復のブロックに隣接
する独特の配列に対して相補的である。
【００６２】 タグの使用は、マイクロサテライトを用いた遺伝子型決定において大きな効果
をもたらし得る。手短には、ＰＣＲプライマーは、タグを有するように構築され
、そしてジ−、トリ−、またはテトラ−ヌクレオチド反復を増幅するために注意
深く選択されたＰＣ反応において使用される。次に、増幅産物は、ＨＰＬＣまた
はＰＡＧＥのような方法によって、サイズに従って分離される。次に、そのＤＮ
Ａフラグメントを、時間的な様式において収集し、そのそれぞれのＤＮＡフラグ
メントからタグを切断し、そしてサイズ分離工程における内部標準との比較から
長さを推定する。対立遺伝子の同定は、その増幅された産物のサイズの参照から
行う。
【００６３】 遺伝子型決定において、切断可能タグを使用することにより、単一の分離工程
において複数のサンプルを組み合わせることが可能である。これを行い得るため
に、２つの一般的な方法が存在する。高スループットスクリーニングのための第
１の一般的な方法は、個体の大きな群における単一多型性を、検出することであ
る。このシナリオにおいては、単一のまたはネスト化したＰＣＲプライマーの組
を使用し、１反応ごとに１つのＤＮＡサンプルタイプを用いて、各増幅を行う。
分離工程において組み合わせられ得るサンプルの数は、１検出技術ごとに生成さ
れ得る切断可能タグの数に比例する（すなわち、質量スペクトロメータタグにつ
いて４００〜６００）。従って、個体の大きな群におけるいくつかの多型性を同
時に同定することが可能である。第２のアプローチは、単一のＤＮＡサンプル上
での多数の多型性を同定し得る複数の組のプライマーを使用すること（例えば、
個体の遺伝子型決定）である。このアプローチにおいては、単一の増幅反応にお
いてプライマーを組み合わせて、これが異なる配列の増幅産物を生成する。各プ
ライマー対または、ネスト化された組は、特異的な切断可能なタグによってコー
ドされ、特異的なタグを用いてコードされる各増幅されたフラグメントを生じる
。その反応を、単一の分離工程において行う。分離工程において組み合わせられ
得るサンプルの数は、１つの検出技術ごとに生成され得る切断可能なタグの数に
比例する（すなわち、重量スペクトロメータタグについて、４００〜６００）。
【００６４】 （Ｂ．変異検出） 疾患の検出は、予防および処置において、ますます重要である。多因子性疾患
のための遺伝子試験を開発するのは困難であるが、２００を超える既知のヒトの
障害が単一遺伝子における欠損（しばしば、単一のアミノ酸残基の変化）によっ
て生じる（Ｏｌｓｅｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ
ｃｏｍｅｓ ｏｆ ａｇｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ、１９８６）。これら変異の多数は、疾患状態を引き起こす変化したアミノ酸
を生じる。
【００６５】 感受性変異検出技術は、変異スクリーニングについて、驚くべき可能性を提供
する。例えば、受精卵の移植の前ですら分析を行い得る（Ｈｏｌｄｉｎｇおよび
Ｍｏｎｋ、Ｌａｎｃｅｔ３：５３２、１９８９）。ますます効率的な遺伝子試験
によって、健康診査と関連して気道および膀胱からの剥離細胞における、発ガン
性変異についてのスクリーニングが可能となり得る（Ｓｉｄｒａｎｓｋｙら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２５２：７０６、１９９１）。また、未知の遺伝子が遺伝性疾患を
生じる場合、ＤＮＡ配列変異をモニターする方法は、遺伝子連鎖分析を介した疾
患の遺伝を研究するために有用である。しかし、個々の遺伝子における変異を検
出および診断することは、技術的および経済的に難しい問題を引き起こす。いく
つかの異なるアプローチが探求されているが、いずれも本当に広範囲の適用のた
めには十分に効率的でも安価でもない。
【００６６】 単一ヌクレオチドに関与する変異は、物理的、化学的、または酵素学的手段に
よってサンプルにおいて同定され得る。一般的に、変異検出の方法は、以前には
未知であった変異の同定に適切であるスキャニング技術と、既知の配列変異の検
出、識別または定量のために設計される技術とに分類され得る。変異検出のため
のいくつかのスキャニング技術は、野生型および変異型配列由来のミスマッチし
た相補的ＤＮＡ鎖のヘテロ２本鎖が、異常な移動挙動を示すという観察に基づい
て、開発されている。
【００６７】 ＤＮＡ鎖において変異を検出するための１つの戦略は、正常なヌクレオチドの
１つを、修飾されたかまたは標識されたヌクレオチドに置換（合成の間）するこ
とによるか、または産物の分子量または他の物理学的パラメータを変更させるこ
とによる。野生型配列と比較して、増加したまたは減少したこの修飾されたヌク
レオチドの数を有する鎖は、変化した移動度を示す（Ｎａｙｌｏｒら、Ｌａｎｃ
ｅｔ３３７：６３５、１９９１）。増幅によって生成され、内部ミスマッチを含
むヘテロ２本鎖ＤＮＡ分子はまた、移動度によって、正確にマッチした分子から
分離され得（Ｏｒｉｔａ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５：８７４、１９８９；Ｋｅｅｎ
、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．７：５、１９９１）、このことは限定されたＤＮ
Ａのセグメントに変異が存在することを示す。
【００６８】 変異はまた、標的配列への短いオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼ
ーションに対する、その不安定化効果を介して同定され得る（Ｗｅｔｍｕｒ、Ｃ
ｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６：２２７、１９９
１）。一般的に、この技術、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイ
ゼーションは、標的配列の増幅、およびその後の短いオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いるハイブリダイゼーションを含む。従って、増幅された産物は、固定化
されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイに対するそのハイブリダイゼーショ
ンパターンを決定することにより、多くの可能な配列変異についてスキャンし得
る。別の方法は、３’の最後から２番目の位置で標的配列に対してミスマッチで
あるオリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＣＲにおいてプライマーとして作用す
ることにおける減少した能力を示すという性質を利用する。さらなるミスマッチ
が、３’末端から３番目の位置においてプライマーに取り込まれ得る。これは１
つの対立遺伝子変異体に対してハイブリダイズしたプライマーの３つの３’ヌク
レオチドにおいて２つのミスマッチ位置を生じる。そして、別の対立遺伝子変異
体に対してハイブリダイズした場合、３’末端からの第３の位置における１つの
ミスマッチを生じる（Ｎｅｗｔｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：
２５０３、１９８９）。１ｂｐミスマッチの増幅に有意に好ましい増幅条件が、
選択される。
【００６９】 （Ｃ．発現プロフィール／ディファレンシャルディスプレイ） 人類のような哺乳動物は、それらのゲノムに約１００，０００の異なる遺伝子
を有し、それらの内、小さな割合、おそらく１５％が任意の個々の細胞で発現し
ている。正常な細胞増殖および分化のプロセス、ならびにガンのような病気で生
じる病理的変化は、すべて遺伝子発現における変化によって駆動される。ディフ
ァレンシャルディスプレイ技術によって、個々の細胞タイプに特異的な遺伝子の
同定が可能になる。
【００７０】 本明細書に開示されているように、膨大な遺伝子（１〜２，０００）の発現を
測定するための高処理量法が提供される。本発明の一つの局面において、選択さ
れた生物学的試料からの遺伝子発現のパターンを分析する方法が提供される。こ
の方法は、（ａ）一つ以上のタグ化プライマーを使って生物学的試料からｃＤＮ
Ａを増幅する工程であって、ここで、このタグが特定の核酸プローブと相関があ
り、非蛍光分光測定法または電位差測定法によって検出可能である、工程、（ｂ
）増幅されたフラグメントを分離する工程、（ｃ）タグ化フラグメントからタグ
を切断する工程、および（ｄ）非蛍光分光測定法または電位差測定法によりタグ
を検出し、そしてそのことから生物学的試料の遺伝子発現のパターンを決定する
工程を包含する。
【００７１】 簡潔には、ディファレンシャルディスプレイにおいてｍＲＮＡの３’末端部分
は増幅されそしてサイズに基づいて同定される。逆転写のためにポリＡテイルの
５’境界に結合するように設計されたプライマーを使い、続いて上流の任意配列
プライマーでｃＤＮＡを増幅して、ｍＲＮＡのサブ集合が得られる。サイズ分離
法（ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣなど）は、目的の２つの生物学的試料間のｍＲＮＡの長
さまたは量を直接並べて比較することができる。このディファレンシャルディス
プレイ法は、複数のプライマーの組み合わせを用いることによって哺乳動物細胞
で発現された遺伝子（約１０，０００〜１５，０００のｍＲＮＡ種）をすべて可
視化する能力を有する。
【００７２】 固体基板上のタグベースのディファレンシャルディスプレイによって異なって
発現された遺伝子の特徴付けを行い得る。それは目的の２以上の細胞タイプまた
は試料において発現している大半のｍＲＮＡが、逆転写およびＰＣＲでｍＲＮＡ
の部分集合から部分的なｃＤＮＡ配列を増幅することによってゲル上で直接比較
され得るという原理に基づいている。簡潔には、３つの１塩基係留オリゴｄＴプ
ライマーは、目的の細胞または試料由来のｍＲＮＡを逆転写および増幅するため
に一連の任意の１３塩基オリゴヌクレオチドと組み合わせて用いられる。１５，
０００の遺伝子の発現をモニターするため、少なくとも９つの異なった任意のプ
ライマーを用いることが好ましい。目的の２つの細胞集団あるいは２つの試料の
完全なディファレンシャルディスプレイ分析のためには、少なくとも４００の増
幅反応が必要とされる。２つの細胞タイプのタグベースのディファレンシャルデ
ィスプレイ分析を用いると、少なくとも１，５００の増幅反応が、容易で迅速に
実行される。
【００７３】 （Ｄ．単一ヌクレオチド伸長アッセイ） プライマー伸長法は核酸鋳型における単一ヌクレオチドの検出に使用され得る
（Ｓｏｋｏｌｏｖ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓ．，１８：３６７１、１９
８９）。原著に記載されているように、嚢胞性線維症遺伝子の既知配列に相補的
な３０塩基のオリゴヌクレオチドおよび２０塩基のオリゴヌクレオチドが単一の
標識されたヌクレオチドの存在下で伸長された。この方法は遺伝子内の単一ヌク
レオチド変化を正しく同定する能力を有した。この技術は一般的に任意の１塩基
変異の検出に適用できる（Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１１４３−１１４７、１９９１）。
【００７４】 簡潔には、この方法は、既知の単一ヌクレオチド多型に近接した標的分子中の
配列にハイブリダイズするプライマーに基づいている。本発明の範囲内では、こ
の標的分子は好ましくは固体基板に対して共有結合される。鋳型中の次の塩基が
反応混合液中の標識されたヌクレオチドと相補的である場合、プライムされたＤ
ＮＡは、標識されたｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰをＤＮＡポリメラーゼが付加する
条件に置かれる。遊離した標識されたｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰは洗い流され、
そして伸長産物が検出される。
【００７５】 この技術の変法では、ｃＤＮＡは、２つの対立遺伝子間で１塩基の相違を含む
目的の配列の増幅のための鋳型である。その増幅産物はそれからアレイ上にプリ
ントされる。次いで、増幅された産物はそれぞれ、多型に対して１塩基５’側で
あるプライマーをアニーリングし、そして１つの標識塩基（普通、ジデオキシヌ
クレオチド）だけ伸長することによって、各対立遺伝子の存在、欠如、あるいは
相対的な量について分析される。正しい塩基がこの反応で利用できる時だけ、取
り込みがプライマーの３’末端で起こる。伸長産物はそれから上記のように分析
される。
【００７６】 本発明において、それぞれの（ジ）デオキシヌクレオチドは、特有のタグで標
識される。４つの反応混合液中、１つだけがプライマー配列に対してジデオキシ
ターミネーターを付加する。この変異が存在する場合、ジデオキシヌクレオチド
上の独特のタグを通じて検出され、そのアイデンティティーが確立される。複数
の変異が同様に独特のタグでＤＮＡプライマーをタグ化することによって同時に
確認され得る。このように、このＤＮＡフラグメントは異なるタグ化（ジ）デオ
キシターミネーターをそれぞれ含んだ４つの別の反応物中で反応させる。ここで
、このタグは特定のジデオキシヌクレオチドと相関し、そして非蛍光測定法また
は電位差測定法によって検出できる。ＤＮＡフラグメントは、例えば、ゲル電気
泳動（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動）または好ましくはＨＰＬＣに
よりサイズに従って分離されるかまたはインサイチュで検出される。そのタグは
フラグメントから切断され、それぞれの検出技術（例えば、質量分析法、赤外分
光測定法、定電位電流測定法または紫外／可視分光光度法）によって検出される
。検出されたタグは、研究中の特定のＤＮＡフラグメントおよび変異ヌクレオチ
ドのアイデンティティーと相関付けられ得る。
【００７７】 （Ｅ．オリゴヌクレオチド連結アッセイ） Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（Ｌａｎｄｅｇｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４８
７、１９８８）によって原著記載されているように、オリゴヌクレオチド連結ア
ッセイ（ＯＬＡ）は、大変大きくそして複雑なゲノムにおける既知配列の同定に
使用される。ＯＬＡの原理は、所定のＤＮＡ標的に互いに隣接してハイブリダイ
ズしたとき、２つの診断オリゴヌクレオチドを共有結合するリガーゼの能力に基
づく。もしプローブの接合点の配列が、完全に塩基対合していなければ、そのプ
ローブはリガーゼによって結合されない。「上流」プローブの３’末端に位置し
ているときに、可能性のある１塩基対の差異を識別する熱安定リガーゼの能力に
よって、１塩基の解像度を得る機会が提供される（Ｂａｒｏｎｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８：１８９、１９９１）。タグが使用
されたとき、それらはプローブに付着され、プローブは増幅された産物に連結さ
れる。ＯＬＡの終了後、連結されていないオリゴヌクレオチドは、連結されてい
ないオリゴヌクレオチドは溶融するが連結したオリゴヌクレオチドは溶融しない
温度でインキュベートすることによって除かれる。あるいは、フラグメントはサ
イズに基づいて分けられる。そのタグは切断され、そしてマススペクトルで検出
される。
【００７８】 他の実施態様では、オリゴヌクレオチド連結アッセイは、以下の２つの近接し
たオリゴヌクレオチドを使用する：「レポーター」プローブ（５’末端でタグ化
）および５’−リン酸化／３’タグ化「アンカー」プローブ。この２つのオリゴ
ヌクレオチド（これは、異なったタグが組み込まれている）は、標的ＤＮＡとア
ニ−リングされ、そして、完全な相補性があればその２つのプローブはＴ４ Ｄ
ＮＡ リガーゼによって連結される。一つの実施態様では、この３’のタグはビ
オチンであり、固定化されたストレプトアビジン上でのビオチン化されたアンカ
ープローブの捕捉および共有結合的に連結したレポータープローブについての分
析が、標的配列の存在あるいは不在について試験される。
【００７９】 本発明の１つの実施態様において、オリゴヌクレオチド連結アッセイの技術を
利用して、例えば、生物学的試料において、核酸分子のアイデンティティーを決
定するための方法、あるいは選択した核酸分子を検出するための方法が提供され
る。簡潔には、そのような方法は一般に、標的ＤＮＡについて増幅を実行する工
程、続いて、５’タグ化したレポーターＤＮＡプローブおよび５’リン酸化／非
ビオチン化プローブとハイブリダイズする工程を包含する。その試料はＴ４ Ｄ
ＮＡ リガーゼとともにインキュベートされる。連結されたプローブを有するＤ
ＮＡ鎖は、例えば、好ましくはＬＣまたはＨＰＬＣによって、非連結プローブを
有するＤＮＡから分離される。このタグは分離されたフラグメントから切断され
、次いでそれぞれの検出技術（例えば、質量分析法、赤外分光光度法、定電位電
流測定法または紫外／可視分光光度法）で検出される。
【００８０】 本発明において、複数の試料および複数の変異は同時に分析され得る。簡潔に
は、その方法は、目的の変異を含む遺伝子フラグメントを増幅する工程から成る
。その増幅された産物は、次いで共通のまたは２つの対立遺伝子特異的なオリゴ
ヌクレオチドプローブ（一方は変異を含むが、他方は含まない）とハイブリダイ
ズし、その結果、対立遺伝子特異的プローブの３’末端は、共通のプローブの５
’末端にすぐ隣接する。このことによってそれぞれの遺伝子座で２つの対立遺伝
子プローブと共通プローブとの間で競合的なハイブリダイゼーション−連結プロ
セスが組み立てられている。その共通プローブは４つの蛍光団の一つで標識され
ており、そして対立遺伝子特異的プローブはそれぞれ、サイズの相違を提供する
１つ以上のタグで標識されている。この試料は、次いで、改変するテイルの長さ
に基づいて分離され、そして、共通プローブ上の蛍光タグによって検出される。
その対立遺伝子特異的プローブ上のサイズの相違、およびその共通プローブにつ
いて使用可能な４つの発色団の利用を通じて、多くの試料は分析され得る。
【００８１】 本発明の１つの実施態様において、同時の複数試料の検出のオリゴヌクレオチ
ド連結アッセイの技術を利用して、例えば、生物学的試料において、核酸分子の
アイデンティティーを決定する、または選択する核酸分子を検出する方法が提供
される。簡潔には、そのような方法は一般に、標的ＤＮＡを増幅する工程、続い
て共通プローブ（非タグ化）および本発明の明細書に従ってタグ化された２つの
対立遺伝子特異的プローブとハイブリダイズさせる工程を包含する。この試料は
ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートされ、フラグメントが、例えば好ましくは
ＬＣまたはＨＰＬＣによって分離される。そのタグは、この分離されたフラグメ
ントから切断され、次いでそれぞれの検出技術（例えば、質量分析法、赤外分光
光度法、定電位電流測定法および紫外／可視分光光度法）によって検出される。
【００８２】 （Ｆ．他のアッセイ） 本明細書に記載された方法はまた、ウイルスまたは微生物の遺伝子型決定また
は同定に対しても利用され得る。例えば、Ｆ＋ ＲＮＡ コリファージは、腸ウ
イルス汚染の指標として有用な候補であり得る。核酸の増幅およびハイブリダイ
ゼーション法による遺伝子型の決定は、信頼でき、早く、単純であり、そして高
価でない、血清型決定の代替である（Ｋａｆａｔｏｓら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．７：１５４１、１９７９）。増幅技術および核酸のハイブリダ
イゼーション技術は大腸菌（Ｆｅｎｇ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ７：
１５１、１９９３）、ロタウイルス（Ｓｅｔｈａｂｕｔｒら Ｊ．Ｍｅｄ Ｖｉ
ｒｏｌ ３７：１９２、１９９２）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｓｔｕｙｖｅｒら、Ｊ
．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．７４：１０９３、１９９３）および単純ヘルペスウイル
ス（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４０：１１９、
１９９２）を含む様々な微生物を分類するために首尾よく利用されつづけている
。
【００８３】 遺伝子改変が様々な実験哺乳動物新生物およびヒト新生物で記載されており、
そして、発ガン現象で観察される形態学的変化の続発の形態的な基礎を示す（Ｖ
ｏｇｅｌｓｔｅｉｎら、ＮＥＪＭ ３１９：５２５、１９８８）。近年、分子生
物学技術の到来と共に、特定染色体上の対立遺伝子の欠如または腫瘍抑制遺伝子
の変異およびいくつかのガン遺伝子（例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎおよびｒ
ａｓファミリー）における変異が観察されている。例えば、Ｋ−ｒａｓガン遺伝
子中の特定の型の点変異と結腸直腸ガン腫における診断のステージとの間の相関
が同定されている（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎら、 Ａｒｃｈ Ｓｕｒｇ．１２８
：５２６、１９９３）。このように、変異分析は、転移のパターンおよび拡散を
含む、腫瘍の攻撃性に関する重要な情報を提供し得る。実際、結腸の第３期ガン
腫におけるＴＰ５３およびＫ−ｒａｓ−２変異分析の予後の値が示されている（
Ｐｒｉｃｏｌｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１７１：４１、１９９６）。したがっ
て、腫瘍および前ガン状態細胞の遺伝子型決定、および特定の変異の検出は、ヒ
トにおけるガンの処置においてますます重要になる。
【００８４】 以下の実施例は、例示の方法として提供され、限定ではない。
【００８５】
【実施例】 （実施例１：市販のスプリングプローブ（ｓｐｒｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）からの
アレイ化チップ（ａｒｒａｙｉｎｇ ｔｉｐ）の調製） この実施例は、アレイに沈着することにおける試料の使用のための、スプリン
グプローブチップの製造および改変を記載している。
【００８６】 ＸＰ５４Ｐスプリングプローブは、Ｏｓｂｙ−Ｂａｒｔｏｎ（Ｅｖｅｒｅｔｔ
Ｃｈａｒｌｅｓの１部門（Ｐｏｍｏｎａ、ＣＡ））から購入する。このプロー
ブを、超微細ダイヤモンド鋭利ストーンの上の「チップダウン（ｔｉｐ−ｄｏｗ
ｎ）」に配置し、そして緩やかな圧力で約０．５ｃｍ、その石の上を移動させた
。顕微鏡で観察して、金属の約０．００５インチ（０．００１〜０．０１インチ
）をチップの末端から取り除く。このチップ末端を皮細片を横切ってチップをこ
することにより磨き、次いで水で洗浄した。チップは乾燥して保存されるかまた
は−２０℃で５０％グリセロール中で保存される。アレイの調製における使用の
ために、このチップを、アレイの様式で頭部に取り付ける。この頭部をＺ軸で制
御し得る動作を所有するロボットアーム上に取り付ける。
【００８７】 （実施例２：ガラススライド上のマイクロスフェアのアレイの調製） ガラススライド上で容易に検出し得るマイクロスフェアの沈着は、アレイ形成
の再現性を示している。この方法では、５６％グリセロール、０．０１Ｍ Ｔｒ
ｉｓ、ｐＨ ７．２、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ サルコシルおよび１％
ｖ／ｖ Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ Ｐｌａｉｎ ０．５μＭ マイクロスフェ
ア（２．５％ 固体ラテックス）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇ
ｔｏｎ、ＰＡ）からなる溶液が調製される。アレイ針を５秒間、この溶液に５ｍ
ｍ浸漬する。次いでマイクロスフェアをガラススライド上に繰り返し並べる。ス
ライドの顕微鏡写真を蛍光用のフィルターを用いて蛍光光下で撮影する。図１は
、このアレイの各領域に沈着された溶液の量が非常に一致していることを示す。
さらに、少なくとも１００の沈着物がピックアップ当たりに作製され得、これら
は実質的に同一である。
【００８８】 （実施例３：修飾された親水性スプリングプローブを用いたアレイ調製） 試料のピックアップ、移入およびミクロ小滴沈着は、親水性の表面を有する液
体移入デバイスを用いるとき、特にこのデバイスが修飾されたスプリングプロー
ブであるとき大いに高められる。プローブの表面を修飾するために作用する化学
薬剤の使用によるか、または親水性物質を用いたプローブのコーティングにより
スプリングプローブは親水性となる。好ましい方法では、スプリングプローブの
チップは、２５−２００ｍＭの１，４−ジチオスレイトール溶液、０．１Ｍ ホ
ウ酸ナトリウム中に１５分〜２時間浸される。ジチオスレイトールは、チオール
−金の配位により金表面と反応し、これは、その表面を本質的に水酸化し、それ
を親水性にする。
【００８９】 アレイ化溶液は、５６％グリセロールおよび食用青で着色した４４％の水から
成っている。アレイ化チップをアレイ化溶液中に２秒間５ｍｍ浸す。次いで、グ
リセロールを支持するチップをロボットにより制御して、シリコンウエハ上に１
２×６グリッド中７２の微小スポットをプリントする。生成されたスポットは、
直径が約１００−１５０ミクロンで、スポット間の間隔は中央から中央まで２０
０ミクロンである。図２は生成されたグリッドのＣＣＤカメライメージを示す。
スポット直径の標準偏差は約１５％である。
【００９０】 （実施例４：アレイオリゴヌクレオチドの比色検出） 鋳型オリゴヌクレオチド（０．５μｇ／μｌの７５μｌ） （５’−ヘキシル
アミンＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣＴ−ＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧ−３
’）を室温で３０分間、２０μｌの１Ｍホウ酸ナトリウム中で５μｌの２０ｍｇ
／ｍｌ 塩化シアヌルと反応させる。この反応から、アレイ化溶液が作製され、
５６％ グリセロ−ル、５６ｎｇ／μｌ オリゴヌクレオチド、０．０６ｍＭ
ホウ酸ナトリウムおよび０．３ｍｇ／ｍｌ 塩化シアヌルからなる。このアレイ
化チップを２秒間アレイ化溶液に５ｍｍ浸す。次いで、この溶液を保持するチッ
プをロボットにより制御して、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をコートしたシリ
コンウエハに、１２×６グリッド中７２の微小スポットをプリントする。生成さ
れたスポットは、直径が約１００〜１５０ミクロンで、スポット間の間隔は中央
から中央まで２００ミクロンである。アレイ化の後、ウエハの未反応のＰＥＩ部
位を１５分間１００％のｎ−メチルピロリニドン中の１００ｍｇ／ｍｌ コハク
酸無水物でブロックし、水で３回洗浄する。未反応塩化シアヌル部位は、１５分
間、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ中の０．１Ｍ グリシンでブロックし、Ｔｅｎｓ緩衝
液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、０．０１ＭＴｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）で４回洗浄する。次いで、鋳型オリゴマーをそのビオチン化した相補体（
５’ビオチン−ＴＧＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＡＴＧ−３’）と
２０分間３７℃でハイブリダイズさせ、次いで、６×Ｔｅｎおよび２×ＯＨＳ（
０．０６Ｍ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、６×Ｓ
ＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、３．６
８ｍＭ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．００５％ ＮＰ−４０）で洗浄した。
次いで、ウエハを０．５μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼ結合ストレプトア
ビジンに、１５分間浸し、次いで、２×Ｔｅｎｓ、４×ＴＷＳ（０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ）で洗浄する。次い
で、微小スポットをＶｅｃｔｏｒ Ｂｌｕｅ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）（キットのプロトコ
ールに従って）を用いて発達させ、そしてＣＣＤカメラおよび顕微鏡で造影する
。図３は生成された像を示す。得られた微小スポットは、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ（
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ、ＭＤ）によって測定すると直径で約１５％の変動および約１０％の変動のす
る強度値を有する。
【００９１】 （実施例５：単一のアレイエレメント内の複数オリゴ） ２つの鋳型オリゴ（＃１、５’−ヘキシルアミン−ＴＧＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡ
ＡＧＣＡＧＧＡＧＴＡＴＧ−３’、＃２、 ５’−ヘキシルアミン−ＡＣＴＡＣ
ＴＧＡＴＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’
）を０．５μｇ／μｌで別々に、５μｌの２０ｍｇ／ｍｌ 塩化シアヌルおよび
２０μｌの１Ｍ ホウ酸ナトリウムと、室温で３０分間、全反応量１００μｌで
反応させる。これらの２つの反応から、アレイ化溶液を５６％のグリセロランド
（ｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄ）で希釈した２つの反応したオリゴの組み合わせから
作成する（以下の表を参照のこと）。８つのアレイチップを２秒間、８つのアレ
イ化溶液の各々に５ｍｍ浸す。この溶液を保持するチップをロボットにより制御
して、２セットの８つの１２×６グリッドをプリントする。各グリッドはポリエ
チレンイミン（ＰＥＩ）をコートしたシリコンウエハ上に７２の微小スポットを
含んでいる。各グリッドは単一アレイ化溶液を表している。この生成されたスポ
ットは、約１００−１５０ミクロンの直径でスポット間の間隔は中央から中央ま
で２００ミクロンである。
【００９２】 アレイ化に続いて、ウエハ上の未反応のＰＥＩ部位を１００％ ｎ−メチルピ
ロリニドン中の１００ｍｇ／ｍｌ コハク酸無水物で１５分間ブロックし、水で
３回洗浄する。未反応の塩化シアヌル部位は、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ中の０．１
Ｍグリシンで１５分間ブロックし、４×Ｔｅｎｓ（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１
％ ＳＤＳ、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄する。次いで、
２回のハイブリダイゼーションを実施する。最初のハイブリダイゼーションでは
、１セットの８つのアレイオリゴの組み合わせをオリゴ＃１と相補的であるオリ
ゴヌクレオチド ５’−ビオチン−ＴＧＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧ
ＴＡＴＧ−３’とハイブリダイズさせる。 第２のハイブリダイゼーションでは
、他のセットの８つのアレイオリゴの組み合わせをオリゴ＃２と相補的であるオ
リゴヌクレオチド（５’−ビオチン−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧＡＴＣＡＧＴＡＧＴ）とハイブリダイズさせる。これら
のハイブリダイゼーションは、Ｈｙｂｒｉｗｅｌｌ Ｓｅａｌｉｎｇ Ｃｏｖｅ
ｒｓ（Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔ Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）の下
で２０分間、３７℃で同時におこなわれ、続いて、６×Ｔｅｎｓ、２×ＯＨＳ（
０．０６Ｍ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、６×Ｓ
ＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、３．６
８ｍＭ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．００５％ ＮＰ−４０）で洗浄する。
ハイブリダイゼーション後、このウエハを０．５μｇ／ｍｌの西洋ワサビペルオ
キシダーゼストレプトアビジン中に１５分間浸し、次いで、２×Ｔｅｎ、４×Ｔ
ＷＳ（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．０５Ｍ Ｔｒｉ
ｓ）で洗浄する。次いで、この微小スポットを、０．４ｍｇ／ｍｌ ４−メトキ
シ １−ナフトール（０．０２％過酸化水素、１２％メタノール、ＰＢＳ）を用
い発達させ、最後に３回水で洗浄する。
【００９３】 オリゴ＃１の相補体とハイブリダイズする混合オリゴのセットは、最高濃度の
オリゴ＃１を含むグリッドに対して最大の色強度を示し、そして最低濃度のオリ
ゴ＃１を含むグリッドと最小の色強度を示す。その一方、オリゴ＃２の相補体と
ハイブリダイズする混合オリゴのセットは、最高濃度のオリゴ＃２を含むグリッ
ドに対して最大の色強度を示し、そして最低濃度のオリゴ＃２を含むグリッドと
最小の色強度を示す（図４を参照のこと）。
【００９４】
【表１】
【００９５】 前記から、本発明の具体的な実施形態が例示の目的で本明細書に記載されてい
るが、様々な改変が本発明の思想および範囲を逸脱することなくなされ得ること
が理解される。従って、本発明は、添付の請求の範囲によることを除いて制限さ
れない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、可視光照射（上のパネル）および蛍光照射（下のパネル）下で撮影さ
れたアレイ化したミクロスフェアの顕微鏡写真を示す。
【図２】 図２は、本発明の方法論を使用してロボットにより生成したアレイのＣＣＤカ
メラ画像を示し、このドメインは平均直径が約１００〜１５０ミクロンであり、
各スポットの中心と中心との間隔は２００ミクロンある。このスポット直径の標
準偏差は約１５％である。
【図３】 図３は、本発明に従って調製し、ベクターブルー（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｌｕｅ）
（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ）を使用して発色し、そしてＣＣＤカメラおよび顕微鏡を用いて画
像化したマイクロスポット（ｍｉｃｒｏｓｐｏｔ）のアレイを示す。
【図４】 図４は、２つの異なるオリゴヌクレオチド（共に単一のアレイエレメント内に
存在する）が、本発明に従って同定および部分的に定量され得る方法を示す図で
ある。
【図５】 図５は、露点を制御する装置の図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 モイニハン， クリステン アメリカ合衆国 ワシントン 98105， シアトル， ９ティーエイチ アベニュー エヌ．イー． 5026 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA20 HA08 HA11 HA14 4B063 QA01 QQ42 QR08 QR31 QR46 QR62 QR66 QR84 QS02 QS24 QS34 QX01 QX04 QX05

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 鋳型から核酸分子を増幅する方法であって、以下の工程： （ａ）固体基板上の一本鎖核酸鋳型を、該鋳型にハイブリダイズするオリゴヌ
    クレオチドプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを含有する溶液と混合する工程
    であって、該混合する工程は該基板上の個別の領域で生じ、そして該溶液は該個
    別の領域に残存する、工程； （ｂ）該鋳型に対する相補鎖を合成し、二重鎖を形成する工程； （ｃ）該二重鎖を変性させる工程；および （ｄ）該鋳型に対する相補鎖を合成し、そこから核酸分子を増幅する工程であ
    って、 ここで、混合する工程、合成する工程、および変性する工程は露点で行われる
    、工程を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 鋳型から核酸分子を増幅する方法であって、以下の工程： （ａ）固体基板上の一本鎖核酸鋳型を、該鋳型にハイブリダイズする第一のオ
    リゴヌクレオチドプライマー、該鋳型の相補鎖にハイブリダイズする第二のオリ
    ゴヌクレオチドプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含有する溶液と混合す
    る工程であって、該混合する工程は該基板上の個別の領域で生じ、そして該溶液
    は該個別の領域に残存する、工程； （ｂ）該鋳型に対する相補鎖を合成し、二重鎖を形成する工程； （ｃ）該二重鎖を変性させる工程；および （ｄ）該鋳型および該鋳型の該相補鎖に対する相補鎖を合成し、そこから核酸
    分子を増幅する工程であって、 ここで、混合する工程、合成する工程、および変性する工程は露点で行われる
    、工程を包含する、方法。
  3. 【請求項３】 工程（ｃ）および（ｄ）が複数回行われる、請求項１または
    請求項２のいずれかに記載の方法。
  4. 【請求項４】 工程（ｃ）および（ｄ）が約１０〜約２５回行われる、請求
    項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記溶液が粘度を与える化合物を含む、請求項１または請求
    項２のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記化合物がグリセロールまたは糖である、請求項５に記載
    の方法。
  7. 【請求項７】 グリセロールが約３０〜約１００％の濃度で存在する、請求
    項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 グリセロールが約２０〜約７０％の濃度で存在する、請求項
    ６に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請
    求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
  10. 【請求項１０】 合成および変性が異なる温度で行われる、請求項１または
    請求項２のいずれかに記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記二重鎖を検出する工程をさらに含む、請求項１または
    請求項２のいずれかに記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記オリゴヌクレオチドプライマーが標識されている、請
    求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記標識が蛍光分子である、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記標識が非蛍光分光測定法または電位差測定法により検
    出可能なタグである、請求項１２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記タグの検出が質量分析法、赤外分光測定法、紫外分光
    測定法、または電位差電流測定法による、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記第一もしくは第二または両方のオリゴヌクレオチドプ
    ライマーの配列およびタグが各鋳型について異なる、請求項１４に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記増幅した核酸が検出の前にプールされる、請求項１６
    に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記アレイが、シリコンウエハまたはホウケイ酸スライド
    を含む固体基板上にある、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記鋳型が前記固体基板上に共有結合的に付着される、請
    求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記付着がポリエチレンイミン結合を介する、請求項１９
    に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記オリゴヌクレオチドプライマーの対が各々異なる配列
    を有する、請求項２に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記鋳型が混合する工程より前に前記アレイ全体に一様に
    適用される、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記鋳型が前記基板上の各個別の領域に個別に適用される
    、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記適用する工程がスプリングプローブを使用して行われ
    る、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 装置を使用して前記露点を制御する、請求項１または請求
    項２のいずれかに記載の方法。
  26. 【請求項２６】 鋳型から核酸分子を合成する方法であって、以下の工程： （ａ）固体基板上の一本鎖核酸鋳型を、該鋳型にハイブリダイズするオリゴヌ
    クレオチドプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを含有する溶液と混合する工程
    であって、該混合する工程はアレイの個別の領域で生じ、該溶液は個別の領域に
    残存する工程；および （ｂ）該鋳型に対する相補鎖を合成して二重鎖を形成する工程であって、 ここで、混合する工程および合成は露点で行われ、 露点は、加圧され得る容器；加熱デバイス；圧力を生成する手段；および飽和
    蒸気を生成する手段、を備える装置により達成され； 該加熱デバイス、圧力生成手段、および蒸気生成手段は制御可能である、工程
    を包含する、方法。
  27. 【請求項２７】 核酸分子中の１塩基変化を検出する方法であって、以下の
    工程： （ａ）固体基板上の一本鎖核酸分子を、該核酸分子にハイブリダイズする第一
    および第二のオリゴヌクレオチドならびにＤＮＡリガーゼを含有する溶液と混合
    する工程であって、該混合する工程はアレイの個別の領域で生じ、該溶液は該個
    別の領域に残存する、工程；および （ｂ）連結産物を検出する工程であって、 ここで、該核酸分子上の接合部塩基で１塩基変化がある場合、該第一および第
    二のオリゴヌクレオチドは連結せず、 ここで、混合する工程は露点で行われ、 露点は、加圧され得る容器；加熱デバイス；圧力を生成する手段；および飽和
    蒸気を生成する手段、を備える装置により達成され、 該加熱デバイス、圧力生成手段、および蒸気生成手段は制御可能である、工程
    を包含する、方法。
  28. 【請求項２８】 単一ヌクレオチド伸長アッセイを行う方法であって、以下
    の工程： （ａ）固体基板上のオリゴヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドにハイブリ
    ダイズする一本鎖核酸分子、単一ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼを含
    有する溶液と混合する工程であって、該混合する工程は該基板の個別の領域で生
    じ、該溶液は個別の領域に残存する、工程；および （ｂ）該オリゴヌクレオチドの伸長産物を検出する工程であって； ここで、該オリゴヌクレオチドは、該単一ヌクレオチドが、該ハイブリダイズ
    したオリゴヌクレオチドに隣接するヌクレオチドに相補的である場合にのみ、伸
    長され、 混合する工程は露点で行われ、 露点は、加圧され得る容器；加熱デバイス；圧力を生成する手段；および飽和
    蒸気を生成する手段、を備える装置によって達成され、 該加熱デバイス、圧力生成手段、および蒸気生成手段は制御可能である、工程
    を包含する、方法。
  29. 【請求項２９】 遺伝子型決定するためのキットであって、実質的に平坦で
    ある表面を有する固体基板であって、該表面が標識オリゴヌクレオチドプライマ
    ー対のアレイを支持する、固体基板を備える、キット。
  30. 【請求項３０】 核酸鋳型をさらに備える、請求項２９に記載のキット。
  31. 【請求項３１】 粘性溶液をさらに備える、請求項２９に記載のキット。
  32. 【請求項３２】 約４℃〜約９５℃の範囲内での温度サイクリングの間、チ
    ャンバーを露点に維持するための機器であって、以下： （ａ）加熱および冷却ブロック； （ｂ）該ブロックを覆うことが可能な気密チャンバー； （ｃ）該チャンバー内の圧力を調整する手段；および （ｄ）該チャンバー内に水蒸気を注入する手段； を備える、機器。
  33. 【請求項３３】 約４℃〜約９５℃の範囲内での温度サイクリングの間、チ
    ャンバーを露点に維持するための機器であって、以下： （ａ）加熱および冷却ブロックを覆うことが可能な気密チャンバー； （ｂ）該チャンバーと該ブロックとの間のシール； （ｃ）該チャンバー内の圧力を調整する手段；および （ｄ）該チャンバー内に水蒸気を注入する手段； を備える、機器。
  34. 【請求項３４】 前記圧力調整手段がピストンである、請求項３２または請
    求項３３のいずれかに記載の機器。
  35. 【請求項３５】 前記ピストンがコンピューター制御される、請求項３４に
    記載の機器。
  36. 【請求項３６】 液滴を容積で測定し、そして前記圧力を制御するセンサー
    をさらに備える、請求項３２または請求項３３のいずれかに記載の機器。
  37. 【請求項３７】 前記ブロック温度がコンピューター制御される、請求項３
    ２に記載の機器。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2003006650A1 (ja) * 2001-07-09 2004-11-04 旭化成株式会社 不織布を用いた核酸精製法及び検出法
WO2005021753A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-10 Canon Kabushiki Kaisha Probe carrier and method for quantifying target substance using the probe carrier

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7560273B2 (en) * 2002-07-23 2009-07-14 Applied Biosystems, Llc Slip cover for heated platen assembly
CA2307674C (en) 1997-10-30 2013-02-05 Cold Spring Harbor Laboratory Probe arrays and methods of using probe arrays for distinguishing dna
DE69825722T2 (de) * 1998-02-04 2005-08-25 Corning Inc. Substrat zum Drucken einer Matrize
US6787308B2 (en) 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
GB0002310D0 (en) * 2000-02-01 2000-03-22 Solexa Ltd Polynucleotide sequencing
US6703228B1 (en) * 1998-09-25 2004-03-09 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to genotyping and DNA analysis
US6333499B1 (en) * 1998-12-15 2001-12-25 Fuji Photo Film Co., Ltd. Method of detecting a scanning start point, scanner, method of reading out image information, and image information reader
AU3567900A (en) * 1999-03-30 2000-10-16 Solexa Ltd. Polynucleotide sequencing
EP1175512B1 (en) * 1999-04-09 2008-02-20 Keygene N.V. Method for the analysis of AFLP reaction mixtures using primer extension techniques
US6642000B1 (en) * 1999-11-12 2003-11-04 University Of Chicago PCR amplification on microarrays of gel immobilized oligonucleotides
DE19957827C2 (de) * 1999-11-25 2003-06-12 Epigenomics Ag Verwendung eines Oligomer-Arrays mit PNA- und/oder DNA-Oligomeren auf einer Oberfläche
WO2001048242A2 (en) * 1999-12-29 2001-07-05 Mergen Ltd. Methods for amplifying and detecting multiple polynucleotides on a solid phase support
WO2001059432A2 (en) * 2000-02-10 2001-08-16 Illumina, Inc. Array of individual arrays as substrate for bead-based simultaneous processing of samples and manufacturing method therefor
US6770441B2 (en) * 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
WO2001061040A1 (en) * 2000-02-16 2001-08-23 Quantum Dot Corporation Microarray methods utilizing semiconductor nanocrystals
US6579680B2 (en) * 2000-02-28 2003-06-17 Corning Incorporated Method for label-free detection of hybridized DNA targets
US20040009514A1 (en) * 2000-02-28 2004-01-15 Frutos Anthony G. Assembly for label-free detection of hybridized nucleic targets
US6376191B1 (en) * 2000-03-22 2002-04-23 Mergen, Ltd. Microarray-based analysis of polynucleotide sequence variations
US6713258B2 (en) * 2000-03-29 2004-03-30 Center For The Application Of Molecular Biology To International Agriculture (Cambia) Methods for genotyping by hybridization analysis
DE10021204A1 (de) * 2000-04-25 2001-11-08 Epigenomics Ag Verfahren zur hochparallelen Analyse von Polymorphismen
AU2001257448A1 (en) * 2000-05-01 2001-11-12 Cold Spring Harbor Laboratory Use of representations of dna for genetic analysis
EP1186669B1 (de) * 2000-09-05 2006-01-25 Zeltz, Patrick, Dr. Verfahren zur spezifischen Bestimmung von DNA-Sequenzen mittels paralleler Amplifikation
AU2002235128A1 (en) * 2000-11-14 2002-05-27 Genetag Technology, Inc. Expression miniarrays and uses thereof
WO2002088388A1 (en) * 2001-04-26 2002-11-07 Ruebben Albert A method and a device for quantification of mutation loads
CA2492423A1 (en) * 2001-07-15 2004-03-18 Keck Graduate Institute Exponential amplification of nucleic acids using nicking agents
CA2457714A1 (en) * 2001-08-17 2003-02-27 University Of Pennsylvania-Center For Technology Transfer Method for sample preparation and storage for use with bioreaction chips
EP1432829A4 (en) * 2001-10-04 2005-01-19 Univ California EVIDENCE OF POLYNUCLEOTIDE HYBRIDIZATION
US7005293B2 (en) 2001-12-18 2006-02-28 Agilent Technologies, Inc. Multiple axis printhead adjuster for non-contact fluid deposition devices
US7563600B2 (en) 2002-09-12 2009-07-21 Combimatrix Corporation Microarray synthesis and assembly of gene-length polynucleotides
US7368082B1 (en) * 2002-12-12 2008-05-06 Tung-Lian Huang Formulation of spotting solution to achieve uniform spot size and morphology and for nondestructive quality control of assay articles
US6852494B2 (en) * 2003-01-10 2005-02-08 Linden Technologies, Inc. Nucleic acid amplification
AU2003901717A0 (en) * 2003-04-10 2003-05-01 Western Sydney Area Health Service Identification of streptococcus pneumoniae serotypes
US20040241732A1 (en) * 2003-04-11 2004-12-02 Chu-An Chang Method of generating long nucleic acid molecules of defined sequence
GEP20125384B (en) 2003-05-23 2012-01-25 Cold Spring Harbor Lab Representations of nucleotide sequences
EP1660674B1 (en) * 2003-09-10 2010-03-17 Althea Technologies, Inc. Expression profiling using microarrays
US20050095664A1 (en) * 2003-10-30 2005-05-05 Carpenter Steven E. Printing growth medium for culture and analysis of biological material
DE10353887A1 (de) * 2003-11-18 2005-06-16 Febit Ag Hochparalleler DNA-Synthesizer auf Matrizenbasis
US20060008823A1 (en) * 2004-05-12 2006-01-12 Kemp Jennifer T DNA profiling and SNP detection utilizing microarrays
DE102005007148B4 (de) * 2005-02-11 2008-05-15 Universität Rostock Verfahren und Array zur Replizierung und Analytik von Nukleinsäuren
WO2007107810A1 (en) * 2006-03-20 2007-09-27 Council Of Scientific And Industrial Research A method for detecting the presence of water born pathogens and indicator microorganism
US20090087840A1 (en) * 2006-05-19 2009-04-02 Codon Devices, Inc. Combined extension and ligation for nucleic acid assembly
US8053191B2 (en) * 2006-08-31 2011-11-08 Westend Asset Clearinghouse Company, Llc Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
DE102007056398A1 (de) * 2007-11-23 2009-05-28 Febit Holding Gmbh Flexibles Extraktionsverfahren für die Herstellung sequenzspezifischer Molekülbibliotheken
US20090215050A1 (en) * 2008-02-22 2009-08-27 Robert Delmar Jenison Systems and methods for point-of-care amplification and detection of polynucleotides
US20090269746A1 (en) * 2008-04-25 2009-10-29 Gil Atzmon Microsequencer-whole genome sequencer
WO2010003132A1 (en) 2008-07-02 2010-01-07 Illumina Cambridge Ltd. Using populations of beads for the fabrication of arrays on surfaces
US8808986B2 (en) 2008-08-27 2014-08-19 Gen9, Inc. Methods and devices for high fidelity polynucleotide synthesis
WO2011056872A2 (en) 2009-11-03 2011-05-12 Gen9, Inc. Methods and microfluidic devices for the manipulation of droplets in high fidelity polynucleotide assembly
WO2011066185A1 (en) 2009-11-25 2011-06-03 Gen9, Inc. Microfluidic devices and methods for gene synthesis
ES2574055T3 (es) 2009-11-25 2016-06-14 Gen9, Inc. Métodos y aparatos para la reducción de errores en el ADN basada en un chip
WO2011085075A2 (en) 2010-01-07 2011-07-14 Gen9, Inc. Assembly of high fidelity polynucleotides
US10457935B2 (en) 2010-11-12 2019-10-29 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
JP6118725B2 (ja) 2010-11-12 2017-04-19 ジェン９・インコーポレイテッドＧｅｎ９，ＩＮＣ． 核酸合成のための方法およびデバイス
US10208334B2 (en) * 2011-04-12 2019-02-19 Michael D. Okura Systems, methods, and compositions for enhancing the specificity of nucleic acid hybridization
HUE068153T2 (hu) 2011-04-15 2024-12-28 Univ Johns Hopkins Biztonságos szekvenálási rendszer
US9752176B2 (en) 2011-06-15 2017-09-05 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods for preparative in vitro cloning
LT2944693T (lt) 2011-08-26 2019-08-26 Gen9, Inc. Kompozicijos ir būdai, skirti nukleorūgščių didelio tikslumo sąrankai
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
EP4001427A1 (en) 2012-04-24 2022-05-25 Gen9, Inc. Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning
EP2864531B2 (en) 2012-06-25 2022-08-03 Gen9, Inc. Methods for nucleic acid assembly and high throughput sequencing
ES2886507T5 (es) 2012-10-29 2024-11-15 Univ Johns Hopkins Prueba de Papanicolaou para cánceres de ovario y de endometrio
US11286531B2 (en) 2015-08-11 2022-03-29 The Johns Hopkins University Assaying ovarian cyst fluid
US11781133B2 (en) 2015-12-28 2023-10-10 Pathogendx, Inc. Microarray based multiplex pathogen analysis and uses thereof
US11851705B2 (en) 2015-12-28 2023-12-26 PathogenDX Inc Microarray based multiplex pathogen analysis for plants, agriculture, food, and water
SG11202001010UA (en) 2017-08-07 2020-03-30 Univ Johns Hopkins Methods and materials for assessing and treating cancer
WO2019173695A2 (en) * 2018-03-08 2019-09-12 Pathogendx, Inc. Microarray based multiplex pathogen analysis and uses thereof
GB2591092A (en) * 2020-01-14 2021-07-21 Stratec Se Pressure chamber for processing reagents ans liquid samples
AU2021219794A1 (en) 2020-02-14 2022-09-08 The Johns Hopkins University Methods and materials for assessing nucleic acids
WO2024137514A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Synthego Corporation Systems and method for automated oligonucleotide synthesis

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2295405A1 (fr) 1974-10-29 1976-07-16 Marteau D Autry Eric Pipette etalonnable
US4981783A (en) 1986-04-16 1991-01-01 Montefiore Medical Center Method for detecting pathological conditions
US4827780A (en) 1986-04-17 1989-05-09 Helena Laboratories Corporation Automatic pipetting apparatus
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
GB8822228D0 (en) 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
GB8910880D0 (en) * 1989-05-11 1989-06-28 Amersham Int Plc Sequencing method
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5346672A (en) 1989-11-17 1994-09-13 Gene Tec Corporation Devices for containing biological specimens for thermal processing
GB8926269D0 (en) * 1989-11-21 1990-01-10 Dynal As Plasmid
DE4001154A1 (de) * 1990-01-17 1991-07-18 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung von modifizierten nukleinsaeuren
US5846710A (en) * 1990-11-02 1998-12-08 St. Louis University Method for the detection of genetic diseases and gene sequence variations by single nucleotide primer extension
US5709668A (en) 1991-01-16 1998-01-20 Senetek Plc Automatic medicament injector employing non-coring needle
US5474796A (en) 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US5384261A (en) 1991-11-22 1995-01-24 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths
US5605798A (en) * 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
ATE267877T1 (de) * 1993-01-07 2004-06-15 Sequenom Inc Dns - sequenzierung durch massenspektronomie
ATE165118T1 (de) 1993-06-09 1998-05-15 Gamera Bioscience Corp Magnetische zyklusreaktionen
GB9315847D0 (en) 1993-07-30 1993-09-15 Isis Innovation Tag reagent and assay method
AU1608095A (en) * 1994-01-26 1995-08-15 Hybridon, Inc. Method of detecting sub-ppb levels of oligonucleotides in biological fluids
US5512462A (en) * 1994-02-25 1996-04-30 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences
NZ287118A (en) * 1994-05-28 1999-01-28 Tepnel Medical Ltd Method of detecting and amplifying oligonucleotides
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5641658A (en) * 1994-08-03 1997-06-24 Mosaic Technologies, Inc. Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support
GB9507238D0 (en) 1995-04-07 1995-05-31 Isis Innovation Detecting dna sequence variations
US5624711A (en) * 1995-04-27 1997-04-29 Affymax Technologies, N.V. Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis
US5658802A (en) 1995-09-07 1997-08-19 Microfab Technologies, Inc. Method and apparatus for making miniaturized diagnostic arrays
US5770151A (en) 1996-06-05 1998-06-23 Molecular Dynamics, Inc. High-speed liquid deposition device for biological molecule array formation
US5741554A (en) 1996-07-26 1998-04-21 Bio Dot, Inc. Method of dispensing a liquid reagent
US6101946A (en) 1997-11-21 2000-08-15 Telechem International Inc. Microarray printing device including printing pins with flat tips and exterior channel and method of manufacture

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2003006650A1 (ja) * 2001-07-09 2004-11-04 旭化成株式会社 不織布を用いた核酸精製法及び検出法
WO2005021753A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-10 Canon Kabushiki Kaisha Probe carrier and method for quantifying target substance using the probe carrier

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