JP2001511142A

JP2001511142A - ベクターとして鳥類の感染性喉頭気管炎ウイルスを用いた鳥類用組換え生ワクチン

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Publication number: JP2001511142A
Application number: JP53258198A
Authority: JP
Inventors: ブブロ，ミシェル; ラプラス，エリアーヌ; オードネ，ジャン−クリストフ
Original assignee: メリアル
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1998-01-23
Publication date: 2001-08-07
Also published as: WO1998033928A1; AU735265B2; AU6217798A; EP0968297A1; TNSN98015A1; FR2758986B1; US6306400B1; FR2758986A1; MA24458A1; CO4650230A1; EP0968297B1; AR010102A1

Abstract

(57)【要約】特定のILTV株で配列NO.1のヌクレオチド3873〜4260に規定され且つILTVのCOLD終止コドンとCOL E終止コドンとの間の内部リボソーム侵入部位(IRES)によって形成される挿入部位に挿入された少なくとも１つの異種塩基配列を含み且つ発現するILTVウイルスをベクターとして有する鳥類用組換え生ワクチン、この生ワクチンを少なくとも２種類含む多価ワクチン製剤および組換えILTVウイルス。異種塩基配列はニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス、ガンボロ病ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、ニワトリの貧血症ウイルスおよびニワトリの肺炎ウイルスから得ることができ、強い真核生物のプロモータ、例えばCMV-IEプロモータの制御下におくことができる。

Description

【発明の詳細な説明】ベクターとして鳥類の感染性喉頭気管炎ウイルスを用いた鳥類用組換え生ワクチン本発明は、ワクチンを接種した動物が病原物質から効果的に保護される免疫を獲得するような条件で鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドをコードし且つ発現する少なくとも１種の異種（heterologous）塩基配列を遺伝子組み換えによって挿ースにした鳥類用の組換え生ワクチンに関するものである。感染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)は、ニワトリの重大な呼吸系疾患(感染性喉頭気管炎またはILT)を引き起こすαヘルプスウイルス(B.Roizman,Arch.Virol.19 92．123．425-449)である(L.E．HansonおよびT.J．Bagust，Diseases of Poultr y 9th edn 1991．pp 485-495．Ames，Iowa State University Press)。この疾患に対して現在入手可能なワクチンには、飲料水およびエアロゾルによって鼻腔内、結膜経路および総排出腔経路を含む各種経路によって投与可能な弱毒化株が含まれる(L.E．Hanson and T.J.Bagust，Diseases of Poultry 9th Edition 1991 ．pp485-495.Ames，Iowa State University Press)。このILTVウイルスのゲノムはその分子生物学的研究によって特徴付けられ(M.A .Johnson et al.，Arch.Virol.1991.119.181-198)、そのいくつかのウイルス遺伝子は同定されている(A.M.Griffin,J.Gen.Vrol.1989.70.3085-3089)。これらのウイルス遺伝子は下記をコードする遺伝子を含む：チミジンキナーゼ(UL23)(A.M .Griffin and M.E.G.Boursnell，J.Gen.Virol.1990.71.841-850;C.L．Keeler et al.，Avian Dis．1991．35．920-929)、糖蛋白gB（UL27）(A.M.Griffin，J.Gen .Virol．1991．72．393-398;K.Kongsuwan et al.，Virology 1991．184．404-41 0;D.J.Poulsen et al.，Virus Genes 1991.5.335-347)、糖蛋白gC(UL44)(D.H.Ki ngsley et al.,Virology 1994.203.336-343)、キャプシド蛋白p40（UL26）（A.M ．Griffin,Nucl．Acids Res.1990.18.3664）、単純ヘルプス（HSV-1）の蛋白ICP 4と相同な蛋白（M.A.Johnson et al.,Virus Research 1995.35.193-204）、HSV-1の蛋白質ICP27（UL54）と相同な蛋白、糖蛋白gK(UL53)およびDNAヘリカーゼ（UL52）（M.A.Johnson et al.,Arch Virol 199 5.140．623-634）、リボヌクレオチド還元酵素(A.M．Griffin，J.Gen.Virol.198 9.70.3085-3089,WO-A-90/02802号)、遺伝子UL1〜UL5(W.Fuchs and T.C.Mettentl eiter,J.Gen.Virol．1996．77．2221-2229)、ゲノム独特の短配列(Us)に存在する遺伝子（M.A.Johnson et al.,DNASequence-The Journal of Sequencing and M apping 1995.Vol.5.pp191-194;K.Kongsuwan et al.,Arch Virol 1995.140.27-39 ;K.Kongsuwan et al.,Virus Research 1993.29.125-140;K.Kongsuwan et al.,Vi rus Gene 1993．7.297-303;WO-A-92/03554号、WO-A-95/08622号）。本発明の目的は、免疫性を良好に維持した状態でワクチンを接種した宿主に免疫を複製、誘導することができる、異種遺伝子を発現する組換えILTVウイルスをベースとした鳥類のワクチンを開発することにある。本発明の他の目的はさらに、感染性喉頭気管炎(ILT)に対して特に効果的であるワクチンを提供することにある。本発明の他の目的は、粘膜経路、例えばエアロゾル経路または飲料水による大量の予防接種で使用可能な、粘膜の所でウイルスを複製して粘膜および全身の免疫を誘導することができるワクチンを提供することにある。このような粘膜での免疫は呼吸器疾患および病原物質が粘膜経路で侵入する他の疾患に対して特に効果的である。本発明の他の目的は、子供の動物にも成体にも使用可能なワクチンを提供することにある。本発明の特殊な目的は、子供の動物子、例えば生後１日のヒナへの粘膜経路による大量予防接種で使用可能なワクチンを提供することにある。本発明の他の目的は、異種遺伝子が挿入・発現でき、親株と同じ大きな効力を有する抗ILTワクチンを提供することにある。本発明者はILTVウイルスの研究中に異種遺伝子の挿入部位として特に適したゲノム領域を発見した。それによって鳥類の免疫原、特にニューカッスル病ウイルス(NDV)の蛋白HNおよびＦ、および／またはマレック病ウイルス(MDV)の糖蛋白gB、および／またはガンボロ病ウイルス(IBDV)の蛋白VP2、および／または、感染性気管支炎ウイルス(IBV)の蛋白ＳおよびＭをコードする少なくとも１つの配列が挿入された、ILTVベクターをベースとする組換え生ワクチンを開発することができた。これらNDV、MDVおよび／またはIBV蛋白をコードする配列を組み込んだワクチンは動物をニューカッスル病、マレック病、ガンボロ病、感染性気管支炎から完全に守ることができる。本発明の対象は、特定のILTV株において配列NO.1のヌクレオチド3873から4260 の間に規定され且つILTVウイルス終止コドンORF DとORF Eとの間の遺伝子間領域 (intergene)で形成される挿入部位に挿入された鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドをコードし、発現する少なくとも１つの異種塩基配列を有するILTVウイルスをベクターとして有する鳥類用組換え生ワクチンにある。本明細書に記載の特定の配列（配列NO.1)は、Select Laboratories(10026 Mai n Street P.O.Box 6，Berlin，Maryland 21811,USA)から入手したILTVのワクチン株T-20 12-8-66（LT BLENワクチン）から得かものであるが、このワクチン株に関する本明細書に記載の情報を基に他のILTV株を使用することができるということは当業者には理解できよう。 ORF Eは、M.A.Johnson達の論文（Arch.Virol.1995.140.623-634）に記載の、オーストラリアワクチン株SA-2のUL54遺伝子に対応する。SA-2株のUL54遺伝子の塩基配列は上記T-20株のものとわずかに異なっており、これら２つの株の遺伝子のアミノ酸配列の間には相違があり、特にC末端部に相違がある（異なる終止コドン）。なお、この論文にはUL54遺伝子の下流の配列を挿入部位として使用できるということは全く示唆されていない。配列NO.19の配列はこのSA-2株に対して配列NO.1に相当する配列の一部を(反対方向に)再現したものである。本発明で挿入部位として使用する遺伝子間領域は配列NO.19の一部のヌクレオチド2808〜3116（この配列の最後のヌクレオチド）である。異種配列とは、挿入部位に由来しない配列すなわちILTVウイルスに由来しない配列またはこのウイルスの他のゲノム領域に由来するか、他のILTV株、特に毒性株に由来する配列を意味する。挿入領域への「挿入」とは単純に行う挿入か、挿入部位を完全または部分的に欠失させて行う挿入を意味する。この挿入では、発現すべき少なくとも１種の配列を有する１つまたは複数の発現カセットを挿入することもできる。挿入配列を発現させるためには、強い真核生物プロモータ、例えばCMV即時初期(または前初期、immediate early)(IE)プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（RSV ）LTRプロモータおよびSV40ウイルス初期プロモータを使用するのが好ましい。 CMV即時初期(IE)プロモータとは、例に挙げた断片およびそれと同じプロモータ活性を保持したサブ断片を意味する。 CMV IEプロモータはヒトのプロモータ（HCMV IE）またはネズミのプロモータ( MCMV IE)にするか、由来の異なるCMV IEプロモータ、例えばサル、ラット、モルモットまたはブタ由来のプロモータにすることができる。ウイルス由来または細胞由来の他のプロモータを使用することもできる。ウイルス由来のプロモータとしては、ILTVウイルスの遺伝子〔即時初期とみなされる遺伝子（ICP4、ICP27等）、初期とみなされる遺伝子（チミジンキナーゼ、DNAヘリカーゼ、リボヌクレオチド還元酵素等）、または後期とみなされる遺伝子（gB ，gD，gC，gK等）〕のプロモータ、マレック病ウイルス(MDV)の遺伝子（gB，gC ，pp38，pp14，ICP4，Meq等の遺伝子）のプロモータ、または七面鳥のヘルペスウイルスの遺伝子（gB，gC，ICP4等の遺伝子）のプロモータを挙げることができる。 ILTVベクターに挿入され、発現される塩基配列は鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドすなわち本発明の提供する好適な条件のもとで発現された時に予防接種をした動物が病原物質から効果的に防御されるような免疫を獲得できるようなポリペプチドをコードする任意の配列にすることができる。従って、所定の病気の抗原をコードする塩基配列を本発明の条件下で挿入することができる。 ILTVベクターに挿入される塩基配列で免疫調節性ポリペプチド、特にサイトカインをコードすることもできる。驚くべきことに、本発明の組換え体は卵の状態での予防接種や生後１日目のヒナの予防接種、さらに大きなヒナや成鳥の予防接種に使用することができる。各種投与経路：非経口経路、口鼻などの粘膜経路（飲料水、エアロゾル）、結膜（点眼）または総排出腔経路を用いることができる。粘膜による大量の予防接種（飲料水、エアロゾル）が可能な経路が好ましい。本発明は、病原物質の自然な侵入経路を遮断することによって呼吸症状および全身症状の両者に対する防御に特に有用であることがわかっている。本発明は特にNDVウイルスの抗原蛋白、特に糖蛋白HNまたは糖蛋白Ｆを適切にコードする塩基配列の挿入に使用することができる。これによって得られる組換え生ワクチンは感染性喉頭気管炎に対する防御に加えてニューカッスル病に対しても十分に防御できる。ニューカッスル病に対する組換えワクチンは１回の投与量当り10〜10⁴pfuの濃度で与えるのが好ましい。本発明の他の好ましいケースは他の鳥類の病原物質の抗原をコード化する塩基配列、特に下記のものを挿入したものであるが、下記に限定されるものではない：マレック病のウイルスの抗原をコード化する塩基配列、特にgB、gC、gDおよび gH+gL遺伝子（WO-A-90/02803号）、ガンボロ病ウイルスの抗原をコードする塩基配列、特にVP2遺伝子、感染性気管支炎ウイルス(IBV)の抗原をコードする塩基配列、特にＳおよびＭ遺伝子(M.Binns et al.，J.Gen.Virol.1985.66.719-726;M.B oursnell et al.,Virus Research 1984.1.303-313)、ニワトリの貧血症ウイルス (CAV)の抗原をコードする塩基配列、特にVP1(52kDa)+VP2(24kDa)(N.H.M.Notebor n et al.,J.Virol.1991.65.3131-3139)、ILTVウイルスの抗原をコードする塩基配列、特にgBをコードする遺伝子(A.M.Griffin，J.Gen.Vrol.1991.72.393-398) またはgDをコードする遺伝子（M.A.Johnson et al.,DNASequence-The Journal o f Sequencing and Mapping 1995.Vol.5.pp191-194.Harwood Academic Publisher s GmbH）、またはgp60をコードする遺伝子(K.K.Kongsuwan et al.,Virus Genes 1993．7.297-303)、感染性頭部腫大症候群ウイルス(またはニワトリの肺炎症ウイルスまたは七面鳥の鼻気管炎ウイルス(TRTV);肺炎症ウイルス)の抗原をコードする塩基配列、特に融合糖蛋白Ｆ（Q.Yu et al.,J.Gen.Virol.1991.72.75-81)、または付着糖蛋白Ｇ(R.Ling et al.,J.Gen.Virol.1992.73.1709-1715;K.Juhasz and J.Easton．J．Gen．Virol．1994．75．2873-2880)。投与量はニューカッスルワクチンで確認されたものと同じにするのが好ましい。本発明では、同じILTVウイルス（特に上記挿入部位）に２種以上の異種配列を挿入することが可能である。特に、同じILTVウイルスに同じウイルスまたは異なるウイルスに由来する配列を挿入することができ、ILTVの配列と他の鳥類のウイルスの配列を挿入できる。同じILTVウイルスと免疫調節物質、特にサイトカインをコードする配列とを連結することもできる。例えば、CMV IEプロモータを別のプロモータにこれらの5'末端が互いに隣接する（転写が反対方向に起こる）ように連結し、２つの塩基配列を一方はCMV IEのプロモータの制御下に挿入し、もう一方は該プロモータに連結されたプロモータの制御下に挿入できるようにする。この構成はCMV IEプロモータ、特にその活性化（エンハンサー）部分によって、連結されたプロモータが誘導する転写が活性化されるという点で特筆すべきものである。連結されるプロモータは特にILTVウイルスあるいはMDVまたはHVTウイルスの遺伝子のプロモータにすることができる。本発明の有利なケースは、NDV HNをコードする塩基配列を含み且つNDV Fまたは他の鳥類疾患の抗原、特に上記のものをコードする塩基配列を含み、これら遺伝子の一方がCMV IEプロモータの制御下にあり、もう一方が連結されたプロモータの制御下にあるワクチンである。由来の異なる２種のCMV IEプロモータをこれらの5'末端が隣接するように並べることも可能である。挿入部位に挿入された複数の異種遺伝子の発現を下記のウイルスから得られた「IRES」（内部リボソーム侵入部位）とよばれる配列をこれら遺伝子のオープンリーディングフレームに挿入することによって行うこともできる：ピコルナウイルス、例えばブタの小嚢病ウイルス(SVDV;B.-F．Chen et al.，J .Virology,1993,67,2142-2148)、脳心筋炎ウイルス(EMCV;R.J.Kaufman et al.， Nucleic Acids Research,1991,19,4485-4490)、手足口病ウイルス(FMDV;N.Luz a nd E.Beck,J.Virology,1991,65,6486-6494)、または他に由来のウイルス。これら３つの論文の内容は参考として本明細書の一部を成す。従って、２つの遺伝子を発現するためのカセットはプロモータ-遺伝子１-IRES-遺伝子２-ポリアデニレーションシグナルの最小構造を有する。従って、本発明の組換え生ワクチンはプロモータと、IRESによって対を成して分離された２つまたはそれ以上の遺伝子と、ポリアデニレーションシグナルとを順次含む発現カセットを挿入部位に挿入された状態で有する。本発明部位への挿入に加えて、ゲノムの他の部位で１つまたは複数の他の挿入、１つまたは複数の変異、または１つまたは複数の欠失を行うことができる。すなわち、親株が毒性である場合は、チミジンキナーゼ遺伝子、リボヌクレオチド還元酵素遺伝子、gE遺伝子などの毒性に関与する遺伝子を例えば不活性化することができる（欠失、挿入または変異によって）。いずれの場合でも、本発明に記載の部位以外の部位に挿入することによって他の遺伝子を発現することができる。本発明のさらに他の対象はILTVの主要な免疫原をコードする遺伝子、好ましくはgBをコードする遺伝子（A.M.Griffin,J.Gen.Vrol.1991.72.393-398）またはgD をコードする遺伝子(M.A.Johnson et al.,DNASequence-The Journal of Sequenc ing and Mapping 1995.Vol.5.pp191-194.Harwood Academic Publishers GmbH)またはgp60をコードする遺伝子(K.K.Kongsuwan et al.,Virus Genes 1993.7.297-3 03)の上流に外来プロモータ、特に上記の強いプロモータが挿入された組換えILT Vウイルスを含む坑ILTワクチンにある。そうすることによって１つまたは複数のこれら遺伝子の発現のレベルを上げることができ、従ってワクチンのILTに対する有効性が増加する。当然、この構成と挿入部位に異種配列を挿入するという上記の構成とを組合せることができる。本発明のさらに他の対象は、上記定義の組換え生ワクチンと、異なる病原体に由来する異なる配列が挿入された他のワクチン、特に他の鳥類用組換え生ワクチンとを含む混合状態または混合可能な状態の多価ワクチン製剤にある。本発明の対象はさらに、上記本発明のワクチンの調製方法にある。本発明はさらに、上記定義の組換え生ワクチンまたは多価ワクチン製剤を投与する鳥類の予防接種法に関するものである。本発明は特に卵の状態での予防接種、生後１日またはそれ以上のヒナおよび成鳥の予防接種を行うための方法を対象にする。ワクチンの各種投与経路（上記参照）を用いることができ、粘膜経路（エアロゾル、飲料水）による大量の予防接種が可能な経路が好ましく、ワクチンの投与量は動物１個体当り10¹〜10⁴で選択するのが好ましい。本発明の対象はさらに、上記の挿入部位に挿入された少なくとも１つの異種塩基配列を有するILTVウイルスにある。本発明のさらに他の対象は配列NO.1の完全または部分的な配列にある。部分的な配列とは、分離して特徴付けされたORFsおよびその断片を意味するだけでなく、ORF DとORF Eとの間の遺伝子間領域と、この遺伝子間領域の両側に位置する断片を意味し、この断片は必要に応じて上記遺伝子間領域の一部を含むことができ相同組換えのためのフランキングアームの役目をすることができる。この方法は当業者に周知である。一般にフランキングアームは100〜1500の塩基対を有することができるが、これに限定されるものではない。以下、図面を参照して非限定的な実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。図１：クローン化断片の制限地図とORFsの位置図２： Select laboratoriesワクチン株T-20(Vaccin LT BLEN)のORFsA，B，C， D，EおよびFの7082bpの配列および翻訳図３：プラスミドpEL 168を得る方法の模式図図４：プラスミドpEL 024を得る方法の模式図図５：プラスミドpEL 027を得る方法の模式図図６：プラスミドpEL 169の図図７：プラスミドpCD 009を得る方法の模式図図８：プラスミドpEL 070の得る方法の模式図図９：プラスミドpEL 170の図図10： ND VHN遺伝子の配列図11：プラスミドpEL 171の得る方法の模式図図12：プラスミドpEL 160の図図13：プラスミドpEL 033の図図14：プラスミドpEL 172の図図15：二重発現カセットの図図16：プラスミドpCD 011の図図17：プラスミドpEL 181の図図18： SA-2株のUL53および54の3116bpの配列と翻訳配列リスト：配列 NO.1 EcoRI-EcoRI断片の配列（7082bp;図２参照）配列 NO.2 オリゴヌクレオチドEL005 配列 NO.3 オリゴヌクレオチドEL006 配列 NO.4 オリゴヌクレオチドEL007 配列 NO.5 オリゴヌクレオチドEL008 配列 NO.6 オリゴヌクレオチドMB070 配列 NO.7 オリゴヌクレオチドMB071 配列 NO.8 NDV NH遺伝子の配列（図10参照）配列 NO.9 オリゴヌクレオチドEL071 配列 NO.10 オリゴヌクレオチドEL073 配列 NO.11 オリゴヌクレオチドEL074 配列 NO.12 オリゴヌクレオチドEL075 配列 NO.13 オリゴヌクレオチドEL076 配列 N0.14 オリゴヌクレオチドEL077 配列 NO.15 オリゴヌクレオチドCD001 配列 NO.16 オリゴヌクレオチドCD002 配列 NO.17 オリゴヌクレオチドCD003 配列 NO.18 オリゴヌクレオチドCD004 配列 NO.19 SA-2株の配列（3116bp、EcoRI部位から、Genbank、アクセス番号第L34065号の配列の1696位置、図18参照）実施例全てのプラスミドの作製はJ.サムブルック(Sambrook)達のMolecular Cloning ：A Laboratory Manual.第２版、Cold Spring Harbor Laboratory．Cold Spring Harbor New York.1989)に記載の分子生物学の標準的手法で行った。本発明で使用した全ての制限酵素断片はジェネクリーン(Geneclean)キット（BIO 101 Inc． La Jolla，CA)を用いて単離した。親ウイルスとして使用したウイルスはJ.R.Andreasen達の（Avian Diseases.1990.34.646-656）に記載のワクチンの株またはSelect laboratories 10026 Main Street P.O.Box 6 Berlin，Maryland 21811,USAで得られたT-2012-8 -66株よりなる群の中から選択することができる。さらに、毒性株、例えば用することもでき、これらは公知の方法、例えばWO-A-95/08622号に記載の方法によって弱毒化することができる。実施例１ ILTV ウイルスの培養 ILTVウイルス（Select laboratories株T-20）をニワトリの腎臓の初代細胞(CK C)上で培養する。この細胞を75cm²の培養フラスコ（２×１０⁵細胞／cm²）内に３％の牛胎児血清(FCS)を添加したMEM培地で１日または２日培養し、その後接種する。接種日には、1000投与量の凍結乾燥したワクチンを入れたフラスコを、１％の FCSを添加したMEM培地10ｍｌに再懸濁する；次いで、この溶液約0.5ｍｌをCKC培地に沈着させる。翌日、この培地が変化し、翌々日、細胞変性効果(CPE)が汎化したとき、培養フラスコを-70℃で凍結させる。 ILTVウイルスの培養を不死化したニワトリ肝細胞、特にLMH系統（W.M.Schnitz lein et al,Avian Diseases.1994.38.211-217）で行うこともできる。実施例２ ILTV のゲノムDNAの調製２回の凍結／融解サイクルの後、ILTV培養物（75ｃｍ²の２つのフラスコ）を回収し、低速（20ロータ、Beckman JA 21遠心分離機で5000回転／分）で５分間遠心分離して大きな細胞片を除去する。次いで、上澄みを超遠心分離する（TLA1 00.3ロータ、Beckman TL 100遠心分離機で100,000回転／分で１時間）。このペレットを1.6ｍｌのTEN-SDS(10mM Tris pH8.0;1mM EDTA;0.5M NaCl;0.5％の硫酸ドデシルナトリウム）に取り、35μｌの20ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ溶液を添加する。この溶液を37℃の水浴で３〜４時間インキュベートし、次いでDNA をフェノール／クロロホルムを用いて３回、クロロホルムを用いて１回抽出し、これを-20℃でエタノール沈殿させる。遠心分離後、ペレットを70％エタノールを用いて洗浄し、乾燥させて200μｌのTE(10mM Tris pH8.0;1mM EDTA)に再懸濁する。次いでヌクレイン酸濃度を分光光度計(OD₂₆₀)で測定する。このDNAは適当な制限酵素を用いて直接処理でき、次いでプラスミドpBlue Script II SK+;にクローニングすることができる。また、組換えウイルスを得るためのトランスフェクション試験に用いることもできる。実施例３組換えILTVウイルスの単離および精製挿入部位の２つのフランキング領域の間に挿入されたポリペプチドを発現するためのカセットよりなるドナープラスミドを制限酵素で処理し、プラスミドを直線化することができ、これをフェノール／クロロホルム混合物を用いて抽出し、無水エタノール沈殿させ、滅菌水に取る。24時間培養した初代CKC細胞を0.2〜1 μｇの直鎖状ドナープラスミド＋２〜５μｇのILTVのウイルスDNA(実施例２で調製)を300μｌのOPtiMEM培地（ギブコBRL カタログ番号041-01985H）に入れたものと、100μｇのLipofectAMINEを300μｌの培地に希釈したものとの混合物（混合物の最終量は600μｌ）を用いて感染させた。この600μｌを３ｍｌ（最終量）の培地に希釈して５×10⁶CKC上に播く。混合物を細胞に接触させた状態で５時間保ち、その後取り除いて５ｍｌの培養培地で置き換える。その後細胞を37℃で３〜８日間培養し、細胞変性効果が見られたとき、-70℃で細胞を凍結する。融解後、必要に応じてさらに超音波処理し、このウイルス群を限定的な希釈でマイクロプレート（96ウエル）にクローニングし、相同性組換えウイルス群を単離する。このプレートを１〜３日間培養し、上澄みを空の96ウエルプレートに回収し、この上澄みを含むプレートを４℃または-70℃に置く。次いで、他のプレートに残っている細胞を95％のアセトン中で-20℃で20〜30分間、または室温で５分間固定する。発現されたポリペプチドに直接対するモノクロナル抗体を用いて間接蛍光抗体(IIF)反応を行い、このポリペプチドを発現するプラークを調べる。再び同じ方法で(96-ウエルプレートにおける限定的な希釈で)、４℃または-70℃ に置かれたプレートのウエルで、IIFによって陽性プラークを有するウエルに対応するウエル内に存在する上澄みからクローニングを行う。一般に、連続４回の単離サイクル（限定的な希釈、上澄みの回収、IIFによる細胞のモニタリング、上澄みからの限定的な希釈等）を行うことによって子孫全てが特異的な蛍光を示す組換えウイルスを得ることができる。この組換えウイルスのゲノムDNAについて適当なオリゴヌクレオチドおよびDNAプローブを用いた標準的なPCRおよびサザンブロット法によって分子レベルでの特徴付けを行う。組換えウイルスの単離は挿入された発現カセットに特異的なプローブとのハイブリダイゼーションによって行うこともできる。そのために、トランスフェクション後に回収されたウイルス群を希釈してＣＫＣ細胞（ペトリ皿で培養）上に沈着させて単離したプラークを得る。37℃で１時間接触させた後、感染培地を取り除いて１％のアガロースを含む５ｍｌのMEM培地で置き換え、42℃で灌流状態を維持する。アガロースが凝固したとき、皿を37℃で48〜72時間CO2インキュベータ内で、プラークが現れるまでインキュベートする。その後アガロース層を除去し、ウイルスプラークを培養物用のペトリ皿と同じ径を有する無菌のニトロセルロース膜上に移す。この膜自体は他のニトロセルロース膜上に移し、第１番目のトランスファーの逆「コピー」を得る。後者のコピー上に移されたプラークを当業者に周知の標準的な方法に従って発現カセットのジゴキシゲニン標識DNA断片（DNAラベリングキット、ベーリンガーマンハイム，カタログ番号1175033）とハイブリッド化する。ハイブリッド化後、洗浄し、現れた基質と接触させ、このニトロセルロース膜をオートラジオグラフィーのフィルムと接触状態に置く。この膜上の陽性ハイブリッド化のイメージはプラークが発現カセットを挿入した組換えILTVウイルスを含むことを示している。この陽性プラークに対応するプラークを第１のニトロセルロース膜から無菌状態で切断し、0.5ｍｌのMEM培地を入れたエッペンドルフ管に入れ、超音波処理し、この膜からビリオンを放出する。エッペンドルフ管に入れた培地をMEM培地に希釈し、こうして得られた希釈溶液はCKC 細胞の新しい培養物を感染する役目をする。実施例４ ILTV のゲノム領域のクローニングおよび特徴付け ILTVウイルスから抽出されたDNAを制限酵素EcoRIで37℃で２時間処理した。次いで、この制限酵素をフェノール／クロロホルム抽出物によって除去した後、エタノール沈殿させる。次いで、この処理で得られる断片をEcoRIで処理してアルカリホスファターゼで処理したプラスミドpBlueScriptII SK+(pBS SK+;Stratage ne)に導入し（14℃で一晩）、E.coli DH5αバクテリアの形質転換およびアンピシリンを添加した培地での培養後に得られたクローンを分折し、約7kbの断片(プラスミドpEL133)を含む寸法の異なるEcoRI−EcoRI挿入断片を同定することができた。 pEL133に存在する挿入断片の完全な配列（図１参照）によって５個の完全なオープンリーディングフレーム(ORFs A、B、C、DおよびE)および他のORF(ORF F)の一部を同定することができた。このクローン化および配列決定されたゲノム領域の制限地図は図１に示されている。7082pbの配列(配列NO.1)は図２に示されている。ORFs A、B、C、D、EおよびFの位置およびアミノ酸配列も図１および図２にそれぞれ示されている。終止コドンORF DとORF Eとの間の配列（配列NO.1の3873〜4260位置）をポリペプチドを発現するためのカセットをILTVゲノムに挿入するのに用いることができる。この配列を挿入部位とよぶ。この遺伝子間領域への挿入は欠失を伴っても伴わなくてもよい（実施例５参照）。実施例５ ORFs D とEとの間の遺伝子間領域に挿入するためのドナープラスミドpEL168の作製プラスミドpBlueScriptII SK+（pBS SK+;Stratagene）を酵素XhoIとHindIIで処理し、次いでdNTPの存在下でDNAポリメラーゼ（クレノウ断片）で処理し、ブラントエンドを作り、E.coliバクテリアの連結および形質転換後、クローンpEL1 66(2957bp)を得た。プラスミドpEL 166を酵素ScaIIとXbaIで処理し、4.5-kbのNotI−SpeI断片を単離した。この処理した断片をdNTPの存在下でDNAポリメラーゼ（クレノウ断片）で処理し、ブラントエンドを作り、E.coliバクテリアの連結および形質転換後、クローンpEL167(2944bp)を得た。オリゴヌクレオチドEL005(配列NO.2)およびEL006(配列NO.3)はTaqポリメラーゼによる第１の連鎖増幅（PCR）のためのプライマーの役目をする。オリゴヌクレオチドEL007(配列NO.4)およびEL008(配列NO.5)はTaqポリメラーゼによる第２の連鎖増幅（PCR）のためのプライマーの役目をする。第１のPCRはPCRバッファーと、dNTPと、プラスミドpEL133 DNAと、Taqポリメラーゼと、オリゴヌクレオチドEL005およびEL006との存在下で行い、第２のPCR はPCRバッファーと、dNTPと、プラスミドpEL133 DNAと、Taqポリメラーゼと、オリゴヌクレオチドEL007およびEL008の存在下でPCRを行った。両PCRとも25回のサイクル（94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒）を行った。両PCRの生成物をフェノール／クロロホルム抽出によって精製し、次いでエタノールを用いて精製した。第１のPCR（EL005/EL006）の生成物を次いで制限酵素 BstBIとEcoRIで37℃で２時間処理し、1132-bpのBstBI‐EcoRI DNA断片を生成し、この断片をアガロースゲル電気泳動を行って溶離した。第２のPCR（EL007/EL0 08）の生成物を次いで制限酵素BglIIとEcoRIで37℃で２時間処理し、550-bpのBg lII‐EcoRI DNA断片を生成し、この断片をアガロースゲル電気泳動を行って溶離した。プラスミドpEL167を酵素ClaIとBamHIで処理した。２つのPCR断片、BstBI ‐EcoRI（1132bp）およびBglII‐EcoRI（550bp）をClaIとBamHIで処理したプラスミドpEL167に14℃で一晩導入した。E.coliバクテリアの形質転換およびアンピシリンを添加した培地の皿で培養した後に、EcoRI- HindIII-SmaI-SalIポリリンカーを含むクローンpEL168（4589bp）を得た（図３のpEL168の製造模式図参照）。実施例６ IBDV VP2 遺伝子を発現するカセットをHCMV IEプロモータの制御下で ORF D とORF Eとの間の遺伝子部位に挿入するためのドナープラスミドpEL169の作製と、vILTV 13の単離 6.1 ガンボロ病ウイルス（IBDV）のVP2遺伝子のクローニングおよびHCMV IEプロモータの制御下でのVP2発現カセットの作製 BamHI-HindIIIカセット状のIBDV VP2遺伝子を含むプラスミドpEL004(図６参照；＝フランス国特許第92/13109号に記載のプラスミドpGH004に等しい)を、BamHI とXbaIとで処理して1104bpのBamHI-XbaI断片（切り出されたVP2遺伝子）を単離した。この断片を予めXbaIおよびBamHIで処理したベクターpBS SK+にクローニングして4052bpのプラスミドpEL022（図４）を得た。このベクターpBS SK+をEcoRV とXbaIで処理し、次いでそれをつないでpBS-SK^*(変性されたもの)を得た。プラスミドpEL004を、KpnIとHindIIIで処理して、完全なIBDV VP2遺伝子を含有する1 387-bpのKpnI-HindIII断片を単離した。この断片を予めKpnIとHindIIIで処理したベクターpBS-SK^*にクローニングして4292bpのプラスミドpEL023（図４）を得た。プラスミドpEL022をBamHIおよびNotIで処理して1122-bpのBamHI-NotI断片（断片Ａ）を単離した。プラスミドpEL023をBamHIとNotIで処理して333bpのBamHI- NotI断片（断片Ｂ）を単離した。断片Ａと断片Ｂとを予めNotIで処理してアルカリホスファターゼで処理したベクターpBS-SK+に導入して4369bpのプラスミドpEL 024（図４）を得た。プラスミドpEL024をNotIで処理して1445bpのNotI-NotI断片を単離した。この断片を予めNotIで処理したプラスミドpCMVβ（クロンテックカタログ番号61 77-1、図５）に導入して5095bpのプラスミドpEL026（図５）を得た。プラスミドpEL026をEcoRI、SalIおよびXmnIで処理して2428bpのEcoRI-SalI断片を単離した。この断片を予めEcoRIとSalIで処理したベクターpBS SK+に導入して5379bpのプラスミドpEL027（図５）を得た。 6.2 ドナープラスミドpEL169の作製プラスミドpEL027をEcoRI、SalIおよびXmnIで処理して2428bpのEcoRI-SalI断片を単離した。この断片を予めEcoRIとSalIで処理したプラスミドpEL168(実施例５、図３参照)に導入して7007bpのプラスミドpEL169（図６）を得た。 6.3 組換えウイルスvILTV13の単離と精製実施例３の方法で、予め酵素KpnIを用いて直線化したプラスミドpEL169のDNA と、そのウイルスDNAとの同時形質転換(cotransfection)を行ってウイルスvILTV 13の単離・精製をした。この組換え体はILTVウイルスのORF DとORF Eとの間の遺伝子間部位（実施例５参照）内にHCMV-IE/IBDV VP2カセットを含んでいる。実施例７ IBDV VP2 遺伝子を発現するカセットをMCMV IEプロモータの制御下で ORF D とORF Eとの間の遺伝子間部位に挿入するためのドナープラスミドpEL170の作製と、vILTV 14の単離 7.1 MCMV( マウスのサイトメガロウイルス)の即時初期(IE)プロモータの制御下でIBDV VP2遺伝子を発現するカセットを含むpEL070の作製プラスミドpCMVβ（クロンテックカタログ番号6177-1、図７）をSalIとSmaIで処理してlacZ遺伝子およびSV40ウイルスの後期遺伝子のポリアデニレーションシグナルを含む3679bpのSalI-SmaI断片を単離した。この断片を予めSalIとEcoRVとで処理したベクターpBS SK+に挿入して6625bpのプラスミドpCD002（図７）を得た。このプラスミドはlacZレポータ遺伝子を含むが、この遺伝子の上流に位置するプロモータはない。 MCMVウイルスのSmith株は米国タイプカルチャーコレクション（Type Culture Collection,Rockville,Maryland,USA)から入手した(ATCC No.VR-194)。このウイルスをBalb/Cマウスの胎児細胞上で培養し、このウイルスのウイルスDNAをエベリング達(Ebeling A.et al.,J.Virol.1983.47.421-433)の方法で調製した。このウイルスのゲノムDNAをPstIで処理して2285bpのPstI-PstI断片を単離した。この断片を予めPstIで処理してアルカリホスファターゼで処理したベクターpBS SK+にクローニングしてプラスミドpCD004（図７）を得た。プラスミドpCD004をH paIとPstIで処理して1389bpのHpaI-PstI断片を得た。この断片はネズミのサイトメガロウイルス(ネズミのサイトメガロウイルス＝MCMV)の即時初期遺伝子のプロモータ／エンハンサー領域を含む（Dorsch-Hasler K.et al.，Proc．Natl．Acad ．Sci．1985．82．8325-8329、WO-A-87/03905号）。この断片を予めPstIとSmaI とで処理したプラスミドpCD002にクローニングして8007bpのプラスミドpCD009（図７）を得た。下記２つのオリゴヌクレオチドのハイブリッド化を行って２本鎖のオリゴヌクレオチドを作製した：この２本鎖オリゴヌクレオチドを予めKpnIとSacIとで処理したベクターpBS-SK +に導入してプラスミドpEL067を得た（図８）。プラスミドpCD009をPstIとSpeIで処理して1396bpのPstI-SpeI断片を単離した。この断片を予めPstIとSpeIとで処理したプラスミドpEL067に導入して4297bpのプラスミドpEL068（図８）を得た。プラスミドpEL024（実施例６、段落6.1、図５参照、）をHindIIIおよびNotIで処理して1390bpのHindIII-NotI断片（断片Ａ）を単離した。プラスミドpEL027（実施例６、段落6.1、図５参照、）をHindIII およびSalIで処理して235bpのHindIII-SalI断片（断片Ｂ）を単離した。断片ＡとＢを同時に予めNotIとSalIで処理したプラスミドpEL068に導入して5908bpのプラスミドpEL070（図８）を得た。このプラスミドは従って、MCMV IEプロモータと、VP2遺伝子と、SV40ポリＡシグナルとよりなる発現カセットを含んでいる。 7.2 ドナープラスミドpEL170の作製プラスミドpEL070をEcoRI、SalIおよびXmnIで処理して3035bpのEcoRI-SalI断片を単離した。この断片を予めEcoRIとSalIで処理したプラスミドpEL168(実施例５、図３参照)に導入して7602bpのプラスミドpEL170（図９）を得た。このプラスミドによってILTVウイルスのORF DとORF Eとの間の遺伝子間部位にMCMV-IE/IB DV-VP2発現カセットを挿入することが可能となる。 7.3 組換えウイルスvILTV14の単離と精製実施例３の方法で、予め酵素BssHIIを用いて直線化したプラスミドpEL170のDN Aと、そのウイルスDNAとの同時形質転換を行ってウイルスvILTV14の単離・精製をした。この組換え体はILTVウイルスのORF DとORF Eとの間の遺伝子間部位（実施例５参照）内にMCMV-IE/IBDV VP2カセットを含んでいる。実施例８ NDV HN 遺伝子を発現するカセットをORF DとORF Eとの間の遺伝子間部位に挿入するためのドナープラスミドpEL171の作製と、vILTV 15の単離 8.1 ニューカッスル病ウイルス(NDV)HN遺伝子のクローニングテイラー達の方法(Taylor J.et al.,J.Virol.1990.64.1441-1450)に従ってニューカッスル病ウイルス(NDV)テキサス株のゲノムに対して相補的なDNAライブラリーを作製した。融合遺伝子(F)の末端、赤血球凝集素ノイラミニダーゼ（HN）遺伝子全体およびポリメラーゼ遺伝子の開始点を含むpBR322クローンをpHN01であると同定した。このクローン内に存在するNDV HN遺伝子の配列を図10(配列NO. 8)に示す。プラスミドpHN01をSphIおよびXbaIで処理して2520-bpのSphI-XbaI断片を単離した。この断片を予めSphIとXbaIで処理したベクターpUC19に導入して5 192bpのプラスミドpHN02を得た。プラスミドpHN02をClaIとPstIで処理して700-b pのClaI-PstI断片（断片Ａ）を単離した。下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pHN0 2を用いて270bpのPCR断片を作製した：この断片をHindIIIとPstIで処理して220-bpのHindIII-PstI断片（断片Ｂ）を単離した。断片Ａと断片Ｂを同時に予めClaIとHindIIIで処理したベクターpBS-S K+に導入して3872bpのプラスミドpEL028(図11)を得た。プラスミドpHN02をBsphI とClaIで処理して425-bpのBsphI-ClaI断片（断片Ｃ）を単離した。下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pHN02を用いて465bpのPCR断片を作製した：この断片をBsphIとNotIで処理して390bpのBsphI-NotI断片（断片Ｄ）を単離した。断片Ｃと断片Ｄを同時に予めClaIとNotIで処理したベクターpBS-SK+に導入して3727bpのプラスミドpEL029bis（図11）を得た。プラスミドpEL028をClaIとS acIIで処理して960bpのClaI-SacII断片（断片Ｅ）を単離した。プラスミドpEL02 9bisをClaIとNotIで処理して820bpのClaI-NotI断片(断片Ｆ)を単離した。断片Ｅと断片Ｆを同時に予めNotIとSacIIで処理したベクターpBS-SK+に導入して4745bp のプラスミドpEL030（図11）を得た。 8.2 ORF D とORF Eとの間の遺伝子間部位にNDV HNを発現するカセットを含むプラスミドpEL171の作製プラスミドpEL030をNotIで処理して1780bpのNotI-NotI断片(完全なNDV HN遺伝子)を単離した。この断片を、IBDVの蛋白質VP2をコードする遺伝子を含む1405-b pのNotI-NotI断片の代わりに、プラスミドpEL170（実施例７、図９参照）のNotI 部位に挿入した。このクローニングによって7978bpのプラスミドpEL171（図12）を単離することができた。このプラスミドによってILTVウイルスのORF DとORF E との間の遺伝子間部位にMCMV-IE/NDV-HN発現カセットを挿入することが可能となる。 8.3 組換えウイルスvILTV15の単離と精製実施例３の方法で、予め酵素BssHIIを用いて直線化したプラスミドpEL171のDN Aと、そのウイルスDNAとの同時形質転換を行ってウイルスvILTV15の単離・精製をした。この組換え体はILTVウイルスのORF DとORF Eとの間の遺伝子間部位（実施例５参照）内にMCMV-IE/NDV-HNカセットを含んでいる。実施例９ NDV F 遺伝子を発現するカセットをORF DとORF Eとの間の遺伝子間部位に挿入するためのドナープラスミドpEL172の作製とvILTV 16の単離 9.1 ニューカッスル病ウイルス（NDV）F遺伝子のクローニングニューカッスル病ウイルスのゲノム（実施例８、段落8.1）に対して相補的なD NAライブラリーで得られた、完全な融合(F)遺伝子を含むクローンをpNDV81とよぶ。このプラスミドは既に記載しており、このクローン内に存在するNDV F遺伝子の配列は開示されている（Taylor J.et al.,J.Virol.1990.64.1441-1450）。プラスミドpNDV81をNarIおよびPstIで処理して1870bpのNarI-PstI断片(断片Ａ) を単離した。下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pNDV81を用いて160bpのPCR断片を作製した：この断片をPstIとSalIで処理して130bpのPstI-SalI断片（断片Ｂ）を単離した。断片Ａと断片Ｂを同時に予めClaIとSalIで処理したベクターpBS-SK+に導入して4846bpのプラスミドpEL033（図13）を得た。 9.2 ORF D とORF Eとの間の遺伝子間部位にNDV Fを発現するカセットを含むプラスミドpEL172の作製プラスミドpEL033をNotIで処理して1935bpのNotI-NotI断片（完全なF遺伝子）を単離した。この断片を、IBDVの蛋白質VP2をコードする遺伝子を含む 1405bpのNotI-NotI断片の代わりに、プラスミドpEL170（実施例７、図９）のNot I部位に挿入した。このクローニングによって8131bpのプラスミドpEL172（図14 ）を単離することができた。このプラスミドによってILTVウイルスのORF DとORF Eとの間の遺伝子間部位にMCMV-IE/NDV-F発現カセットを挿入することが可能となる。 9.3 組換えウイルスvILTV16の単離と精製実施例３の方法で、予め酵素BssHIIを用いて直線化したプラスミドpEL172のDN Aと、そのウイルスDNAとの同時形質転換を行ってウイルスvILTV16の単離・精製をした。この組換え体はILTVウイルスのORF DとORF Eとの間の遺伝子間部位（実施例５参照）内にMCMV-IE/NDV-Fカセットを含んでいる。実施例10 NDV HN およびF遺伝子を発現する二重カセットをORF DとORF Eとの間の遺伝子間部位に挿入するためのドナープラスミドの作製と組換えILTVウイルスの単離２つの遺伝子、例えばNDV HNおよびF遺伝子を発現する二重カセットを作製することができる。この構造は図15に概念的に示されている。この構造では、２つのプロモータの5'末端は隣接しており、２つの遺伝子の転写が反対方向に起こるようになっている。２つのプロモータのうちの一方がMCMV IEプロモータで、他方のプロモータ（連結されたプロモータとよぶ）がSV40プロモータ(プラスミドp SVベータ、Clontech Laboratories,Palo Alto，California 94303-4607，USA，内に存在する)であるのが好ましい。この構造では、連結されたプロモータはCMV IEプロモータのエンハンサー領域によって活性化される。この二重発現カセットは上記のドナープラスミド（図３に示された実施例５に記載のpEL168）に挿入することができる。組換えウイルスの単離は上記と同じ方法（実施例３参照）で行う。実施例11 MDV gB 遺伝子を発現するカセットをORF DとORF Eとの間の遺伝子間部位に挿入するためのドナープラスミドpEL181の作製とvILTV17の単離 11.1 マレック病ウイルスgB遺伝子のクローニング MDV gB遺伝子を含むMDVウイルス株RB1BのゲノムDNAの3.9kbpのEcoRI-SalI断片〔この配列はロス(Ross.N)達が開示している（J.Gen.Virol.1989.70.1789-1804 ）〕を予めEcoRIとSalIで処理したベクターpUC13に導入して6543bpのプラスミド pCD007(図16）を得た。このプラスミドをSacIおよびXbaIで処理して2260bpのSac I-XbaI断片（gB遺伝子の中心部＝断片Ａ）を単離した。下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pCD007を用いて222bpのPCR断片を作製した：この断片をKpnIとXbaIで処理して190bpのKpnI-XbaI断片（gB遺伝子の5'末端＝断片Ｂ）を単離した。下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pCD007を用いて195bpのP CR断片を作製した：この断片をSacIとSacIIで処理して162bpのSacI-SacII断片（gB遺伝子の3'末端＝断片Ｃ）を単離した。断片Ａ、ＢおよびＣを同時に予めKpnIとSacIで処理したベクターpBS-SK+に導入して5485bpのプラスミドpCD011（図16）を得た。 11.2 ILTV ウイルスのORF DとORF Eとの間の遺伝子間部位にMDV gB遺伝子を発現するカセットを含むプラスミドpEL181の作製プラスミドpCD011をNotIで処理して2608bpのNotI-NotI断片(完全なMDV gB遺伝子)を単離した。この断片を、IBDVの蛋白質VP2をコードする遺伝子を含む 1405bpのNotI-NotI断片の代わりに、プラスミドpEL170（実施例７、図９）のNot I部位に挿入した。このクローニングによって8806bpのプラスミドpEL181（図17 ）を単離することができた。このプラスミドによってILTVウイルスのORF DとORF Eとの間の遺伝子間部位にMCMV-IE/MDV-gB発現カセットを挿入することが可能となる。 11.3 組換えウイルスvILTV17の単離と精製実施例３の方法で、予め酵素BssHIIを用いて直線化したプラスミドpEL181のDN Aと、そのウイルスDNAとの同時形質転換を行ってウイルスvILTV17の単離・精製をした。この組換え体はILTVウイルスのORF DとORF Eとの間の遺伝子間部位（実施例５参照）内にMCMV-IE/MDV-gBカセットを含んでいる。実施例12 IBV 遺伝子（１つまたは複数）を発現するカセットをORF DとORF Eとの間の遺伝子間部位に挿入するためのドナープラスミドの作製と組換えILTVウイルスの単離上記の部位（実施例５）への単一のカセットの挿入（実施例６、７、８、９および11）または二重カセットの挿入（実施例10）に関する上記の戦略と同様な戦略に従って、鳥類の感染性気管支炎ウイルス(IBV)の膜（Ｍ）またはスパイク（Ｓ）蛋白質、またはスパイクの一部（S1またはS2）またはヌクレオカプシド（Ｎ）蛋白質を高レベルで発現する組換えILTVウイルスを調製することができる。特に、二重発現カセットはCMV IEプロモータの制御下でＳ遺伝子を用いて、且つ連結されたプロモータの制御下でＭ遺伝子を用いて調製する。実施例13 他の鳥類の病原物質または免疫調節性ペプチドの遺伝子（１つまたは複数）を発現するカセットを上記部位に挿入するためのドナープラスミドの作製と組換えILTVウイルスの単離上記の部位（実施例５）への単一カセットの挿入（実施例６、７、８、９および11）または二重カセットの挿入（実施例10）を行う上記手法と同様な手法で、 CAVの免疫源（特に、VP1およびVP2をコードする遺伝子を発現するための二重カセット）、ニワトリの肺炎ウイルスの免疫源または他の鳥類の病原物質の免疫源あるいは免疫調節性ペプチド、特にサイトカインを高レベルで発現する組換えIL TVウイルスを調製することができる。実施例14 ワクチンの製造本発明に従って得られた組換えウイルスは孵化鶏卵で製造する。回収したウイルス溶液を凍結乾燥安定剤に希釈し、1000ワクチン投与量の割合でバイヤルに分配して最後に凍結乾燥する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者オードネ，ジャン−クリストフフランス国 69006 リヨンリュドゥクレキ 119

Claims

【特許請求の範囲】１．特定のILTV株において配列NO.1のヌクレオチド3873〜4260の間に規定され且つILTVのORF D終止コドンとORF E終止コドンとの間の遺伝子間領域で形成される挿入部位に挿入された少なくとも１つの異種塩基配列を含み且つ発現するILTV ウイルスをベクターとして有する鳥類用組換え生ワクチン。２．上記の塩基配列が単純に挿入されるか、挿入部位を完全または部分的に欠失させて挿入されたものである請求項１に記載の組換え生ワクチン。３．挿入される塩基配列を発現するためにベクターが強い真核生物プロモータを有する請求項１または２に記載の組換え生ワクチン。４．強いプロモータがCMV即時初期プロモータ、好ましくはネズミまたはヒトのCWV即時初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（RSV）LTRプロモータ、SV40ウイルス初期プロモータからなる群の中から選択される請求項３に記載の組換え生ワクチン。５．異なる真核生物のプロモータの制御下で挿入部位に挿入される少なくとも２つの塩基配列を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え生ワクチン。６．真核生物のプロモータが由来の異なる動物のCMV即時初期プロモータである請求項５に記載の組換え生ワクチン。７． CMV即時初期プロモータと他の塩基配列を有する他のプロモータと組み合された第１の塩基配列を有し、これら２つのプロモータの5'末端が隣接するように配置された請求項５に記載の組換え生ワクチン。８．一連のプロモータと、IRESによって対になって分離された２つまたはそれ以上の遺伝子と、ポリアデニレーションシグナルとを有する発現カセットが挿入部位に挿入された請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え生ワクチン。９．鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドをコードする塩基配列が挿入部位に挿入された請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え生ワクチン。 10．ニューカッスル病ウイルス(NDV)、ガンボロ病ウイルス(IBDV)、マレック病ウイルス(MDV)、感染性気管支炎ウイルス(IBV)、ニワトリの貧血症ウイルス(C AV)、ニワトリの肺炎ウイルスより成る群の中から選択される鳥類の病原物質の抗原をコードする塩基配列を有する請求項９に記載の組換え生ワクチン。 11． NDVウイルスのポリペプチドＦおよびHNをコードする塩基配列から選択される塩基配列を有する請求項10に記載の組換え生ワクチン。 12． MDVウイルスのポリペプチドgB,gC，gDおよびgH+gLをコードする塩基配列から選択される塩基配列を有する請求項10に記載の組換え生ワクチン。 13． IBDVのVP2抗原、IBVウイルスのＳまたはＳの一部、ＭおよびＮの抗原、CA VのVP1およびVP2抗原、ニワトリの肺炎ウイルスのＧおよびＦ抗原に対応する配列より成る群の中から選択される少なくとも１つの塩基配列を有する請求項10に記載の組換え生ワクチン。 14．免疫調節性ポリペプチドをコードする塩基配列が挿入部位に挿入された請求項１〜13に記載の組換え生ワクチン。 15．この塩基配列がサイトカインをコードする配列の群の中から選択される請求項14に記載の組換え生ワクチン。 16．互いに異なる配列が挿入された請求項１〜15のいずれか一項に記載の組換え生ワクチンを混合状態または混合が可能な状態で少なくとも２種類含む多価ワクチン製剤。 17．特定のILTV株の配列NO.１のヌクレオチド3873〜4260で規定され且つILTV のORF D終止コドンとORF E終止コドンとの間の遺伝子間領域で形成される挿入部位に挿入された少なくとも１つの異種塩基配列を有するILTVウイルス。