JP2001509390A

JP2001509390A - コイルドコイル構造を含む融合タンパク質

Info

Publication number: JP2001509390A
Application number: JP2000502201A
Authority: JP
Inventors: ウォーカー，ジョン; ミロウクス，ブルーノ
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1997-07-11
Filing date: 1998-07-10
Publication date: 2001-07-24
Also published as: EP1012310A1; WO1999002707A1; CA2290716A1; AU740755B2; AU8348198A; GB9714681D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、a)コイルドコイル構造形成能を有する第1領域；およびb)目的のポリペプチドを含み、天然では第1領域とは関連のない第2領域を含む、融合タンパク質に関する。本発明の融合タンパク質は、形質転換宿主細胞における非常に小さなポリペプチドの産生に適用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、組換えによって産生されるタンパク質の新規融合パートナーに関す
る。特に、本発明は、タンパク質分解に抵抗性があり、担体として作用してそれ
に融合したタンパク質の免疫原性を増大させる能力のあるコイルドコイル構造を
有するポリペプチドに関する。

【０００２】組換えDNA技術により、商業的に重要な多くのタンパク質を製造する産業が可能になった。タンパク質は、例えば、細菌、酵母、昆虫、植物および哺乳動物細
胞に基づく広範な発現系において産生される。組換え法によるタンパク質の産生
に関連した問題の一つは、宿主細胞がタンパク質を分解する酵素を含むというこ
とであり、そのような酵素の存在により小さなポリペプチドの産生が特に困難な
ものになる。

【０００３】そのような困難を克服するための一つのアプローチは、目的の組換えタンパク
質を融合タンパク質の状態で発現させることである。目的のタンパク質をコード
するDNAを融合パートナータンパク質にフレーム内で融合させ、得られた融合物を発現させる。多くの場合、融合物の二つの成分間に位置するプロテアーゼ切断
をコードするリンカー配列を含有せしめることにより、融合物をその宿主細胞か
ら回収した後にそれを切断することができる。

【０００４】融合パートナータンパク質は、多くの場合、ある形式の高度に特異的なアフィ
ニティ精製法により回収され精製され得るものである。そのようなタンパク質と
しては、例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質およびβ−ラクタマーゼが挙げられる。

【０００５】しかしながら、これらの融合パートナータンパク質はすべて比較的大きいので
、いくつかの欠点がある。例えば、それらの融合パートナータンパク質は大きす
ぎるために目的のタンパク質をある程度の独立性をもって機能させることができ
ないので、任意の有意義な操作をその目的のタンパク質に行い得る前にそれらを
除去することが必須である。したがって多くの小型ポリペプチドは依然として化
学合成によって製造されている。

【０００６】本発明は、本発明者らがウシATPアーゼインヒビタータンパク質、IF₁ の構造を調査している間になされたものである。これは、ミトコンドリア内でATPシンターゼの活性を調節するのを助ける、小型の、すなわち84アミノ酸のタンパク質
である。本発明者らがこのタンパク質を分析したところ、タンパク質のC末端領域（アミノ酸48〜84）がコイルドコイル構造を形成していることが分かった。

【０００７】コイルドコイルは、平行且つ正しく位置が合わさった2本または3本のαヘリッ
クスにより形成され、7残基ごとに繰り返される親水性および疎水性残基のパターンを示す（Lupasら, Science 252; 1162-1164, 1991）。右巻きαヘリックスが、わずかに左巻きの超らせんねじれを形成しながら互いに巻き付いている。コ
イルドコイルは、ケラチン、ミオシンおよびトロポミオシンのような繊維状タン
パク質において周知であるが、ロイシンジッパーモチーフを含むタンパク質のよ
うなその他のタンパク質においても見られる。

【０００８】タンパク質のコイルドコイル領域は一般的に７残基反復を含み、各反復のアミ
ノ酸はａ〜ｇで示される。各反復のアミノ酸ａおよびｄは一般的に疎水性アミノ
酸である。タンパク質におけるコイルドコイルの存在を予測するためにはいくつかのアル
ゴリズムが利用可能である。例えば、Lupasら, 1991およびBergerら, Proc. Nat
l. Acad. Sci. (USA) 92; 8259-8263, 1995を参照されたい。後者は、2本鎖コイ
ルの検出においてはより緊縮であるが、3本鎖コイルの検出においてはより低効率であると考えられる。

【０００９】発明の概要本発明者らは、ウシIF₁ ATPアーゼインヒビタータンパク質のコイルドコイル領域および第2のタンパク質の短い配列を含むいくつかの融合タンパク質をE.col
iにおいて発現させた。本発明者らは、第2のタンパク質を効率的に回収し得るこ
れらの融合タンパク質を高レベルで発現させ、そのままの状態で単離することが
できることを見出した。したがって、組換え発現系において融合パートナータン
パク質としてコイルドコイルを使用することにより、宿主細胞においてポリペプ
チドを分解から保護する様式で所望のポリペプチドを発現させることが可能であ
る。よって、本発明は、 a) コイルドコイル構造形成能を有する第1領域；および b) 目的のポリペプチド配列を含有し、天然では第1領域と関連のない第2領域を含む、融合タンパク質を提供する。

【００１０】第1領域は、第2領域のN-末端またはC-末端に位置し得る。しかしながら、第1 領域は第2領域のN-末端に位置するのが好ましく、融合タンパク質のN-末端に位置するのが最も好ましい。好ましくは、融合タンパク質は、第1領域と第2領域の
間に切断可能なリンカー領域をさらに含む。本発明はさらに、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含み、この核酸
は、好ましくは、プロモーターに機能的に連結された核酸を含む発現ベクターの
一部を形成する。

【００１１】本発明はさらに、本発明の発現ベクターを有する宿主細胞、ならびに(i) 宿主
細胞内で発現ベクターから融合タンパク質の発現を生じさせる条件下でその宿主
細胞を培養すること；および(ii) 細胞から融合タンパク質を回収することを含む、本発明の融合タンパク質の調製方法を含む。融合タンパク質が第1領域と第2領域の間にプロテアーゼ切断可能なリンカー領
域をさらに含む場合、前記方法は、任意に、タンパク質をプロテアーゼ切断可能
なリンカー部で切断すること、および第2領域を回収することをさらに含む。

【００１２】図面の簡単な説明図１：E.coli C41(DE3)細胞において発現した、uncIおよびuncII遺伝子の種々
の断片に融合した末端切断(truncated)IF₁ インヒビターをコードする発現プラスミド、ならびにクーマシー染色SDS-PAGEゲル上で分離した産物。レーンは下記
のとおりである：１：IF₁ ；２：IF₁-a1；３：IF₁-a3；４：IF₁-I1；５：IF1-I2
。分子量マーカーを左に示す；aはE.coli F₁F₀ ATPシンターゼのサブユニットa であり；IはE.coli F₁F₀ ATPシンターゼのサブユニットIである。完全な命名法については表1を参照されたい。

【００１３】図２：SDS-PAGE上で分離された、長さ２〜54アミノ酸のペプチドの、IF₁ （44
〜84）との融合物としての発現。詳細な説明を参照されたい。

【００１４】図３：逆相HPLCでの融合タンパク質の精製。AおよびC：それぞれIF₁-a1および
IF₁-a3の精製物のクロマトグラム。BおよびD:それぞれIF₁-a1およびIF₁-a3の精製物のSDS-PAGE分析。IB：封入体；数字は回収画分を示す。

【００１５】図４：逆相HPLCでの融合タンパク質の精製。AおよびC：それぞれIF₁-I1および
IF₁-I2の精製物のクロマトグラム。BおよびD:それぞれIF₁-I1およびIF₁-I2の精製物のSDS-PAGE分析。IB：封入体；数字は回収画分を示す。

【００１６】図５：その他の方法による本発明の融合タンパク質の精製。1/：封入体由来：
If-a1は封入体として発現され、6M 塩化グアニジニウムを用いて可溶化し、図３
のように逆相HPLCによって精製する。If-UCP270融合タンパク質を尿素の存在下で可溶化し、LDAO界面活性剤の存在下でニッケルカラムにて精製する（詳細につ
いてはテキストを参照されたい）。2/：３つの融合タンパク質、If-UCP1P1、If-
UCP2P2およびIf-UCP3P3を細菌細胞質に可溶化し、S-セファロース上での陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、その後ニッケルカラム上でのアフィニ
ティクロマトグラフィーにより精製する。全てのタンパク質試料を精製後にSDS-
PAGEにより分析する。ゲルはクーマシーブルー染料83で染色する。

【００１７】発明の詳細な説明Ａ：第1領域本発明の融合タンパク質の第1領域は、任意の天然または合成コイルドコイルポリペプチドを含み得る。かかる領域は、ケラチン、ミオシン、トロポミオシン
もしくはラミニンなどの種々のタンパク質、またはGCN4もしくは赤血球凝集素の
ようなロイシンジッパーモチーフを含むタンパク質などのタンパク質、またはIF ₁ ATPアーゼインヒビタータンパク質、好ましくは哺乳動物IF₁ ATPアーゼインヒ
ビタータンパク質などのその他のタンパク質に見出される。ラットおよびウシタ
ンパク質の配列は実施例において説明している。ヒトまたはマウスIF₁ ATPアーゼインヒビタータンパク質のようなその他の哺乳動物IF₁ ATPアーゼインヒビタータンパク質を使用してもよい。

【００１８】コイルドコイル領域が見出されるタンパク質全体を使用する必要はない。コイ
ルドコイル構造形成能を有する多数の7残基反復を持つ大型コイルドコイルタンパク質の場合、必ずしもコイルドコイル領域全体を使用する必要はない。下記で
検討されたサイズおよび機能的制限を受けることを条件としてその領域の一部分
を用いることができる。

【００１９】さらに、かかるタンパク質の合成変異体またはその領域が、それらがコイルド
コイル形成能を維持するという条件で使用され得る。コイルドコイルを形成する
コイルドコイルタンパク質の領域は7残基反復構造を有するので、合成変異体は、置換、特に保存的(conservative)置換により、または1個以上の完全7残基反復
の挿入により天然タンパク質とは一般的に異なる。

【００２０】保存的置換を行う場合、それらは下記の表を参考にして行われ得るものであり
、第2列の同一ブロック、好ましくは第3列の同一行にあるアミノ酸を互いに置換
し得る。 1個以上の7残基反復を天然のコイルドコイルタンパク質の構造内に挿入する場
合、挿入は上記のａ−ｇ残基構造を維持するように行われる。都合のよいことに
は、1個以上の完全ａ−ｇ反復の挿入は、天然タンパク質の連続反復のｇとａの間である。しかしながら、挿入は、その挿入物が7残基構造を維持する限り、7残
基反復のその他の残基間にもなされ得る。

【００２１】天然コイルドコイルタンパク質の合成変異体は、標準的な組換えDNA技術によって製造され得る。例えば、部位特異的突然変異誘発を用いることにより、天然
コイルドコイルタンパク質をコードするDNAのコード領域に変化をもたらし得る。挿入がなされる場合、挿入物をコードする合成DNAと天然配列に対応する5'および3'フランキング領域を挿入部位のいずれかの側に挿入する。フランキング領
域は、配列が適当な酵素で切断され、合成DNAがその切断片にライゲートされ得るように、天然配列内の部位に対応する都合のよい制限部位を含む。次いでDNA を本発明にしたがって発現させ、コードされたタンパク質を製造する。これらの
方法は、DNA配列の操作についての当技術分野で公知の多数の標準的技術を単に例証するものであり、その他の公知の技術も使用し得る。

【００２２】本発明の融合タンパク質は、コイルドコイル構造を形成するのに必要な数の7 残基反復を含む。一般的に、それは3個以上である（コイルドコイル形成配列の融合タンパク質への貢献を最小にするためには少なければ少ないほどよい）。こ
のことは、NMRによるタンパク質の構造決定において¹⁵N または¹³Cによる放射性
同位体標識化を行うことがしばしば必要である場合に特に重要であり得る。これ
は費用がかかり、長い融合パートナーに関しては、組み込んだ放射能の多くは担
体タンパク質（例えば多くの場合にはGST）が開裂する場合に除去される。したがって、融合パートナーは、コイルドコイル構造形成能を有する7残基反復単位を３〜14個、好ましくは４〜10個含む、約25〜100アミノ酸の大きさのものである。

【００２３】天然または合成コイルドコイル配列のコイルドコイル形成能は、当技術分野で
公知の実施例で説明した所定の方法により試験され得る。

【００２４】任意の推定コイルドコイル領域の配列は、LupasらまたはBergerらのアルゴリズムによって調査され得る。配列は、組換えDNA技術によっても合成され得るものであり、その配列の溶液は種々の濃度で円偏光二色性スペクトルについて試験
され得る。（非特異的凝集とは反対に）コイルドコイル形成が生じると、スペク
トルはある範囲の希釈度において一定である（一方、非特異的凝集は希釈される
）。

【００２５】また、第1領域は7残基反復に隣接する配列も含み得る。これらは、7残基反復のαヘリックスコイル構造が形成され得るように第1領域の全体構造を維持することが必要であり得る。例えば、ウシIF₁ ATPアーゼインヒビターの4個の7残基反復は、残基53〜80に見出される。本発明者らは、このタンパク質の残基44〜84
を用いるのが本発明の好ましい態様であることを見出した。しかしながら、この
タンパク質のその他の適当な領域、または哺乳動物相同体の対応する部分、例え
ば、１〜84、例えば23〜84、または１〜78、例えば44〜78を使用し得る。

【００２６】したがって、一般的に、０〜100個、例えば５〜50個の非コイルドコイル形成アミノ酸が第1領域のN末端および／またはC末端のどちらかまたは両方に存在し得る。これらの配列はコイルドコイル領域が誘導されるタンパク質または任意の
その他の天然もしくは合成供給源由来のものであり得る。原則として、この領域
は、コイルドコイル構造の形成に影響を及ぼさない場合、重要ではない。

【００２７】Ｂ：第2領域本発明の融合タンパク質の第2領域は、天然では第1領域とは関連のない任意の
目的のポリペプチド配列を含み得る。通常、これは、目的の配列が自然界で第1 領域をコードする遺伝子とは異なる遺伝子によってコードされることが分かって
いることを意味するものである。これは、公に利用可能な配列データバンクに対
して第1領域と第2領域の配列を調べることによって簡単に確認され得る。第2領域は第1領域と同種または異種由来のものであり得る。第1および第2領域は同一タンパク質の部分から誘導されるが、本発明の融合タンパク質においては天然タ
ンパク質配列とは異なる様式で存在することも可能である。

【００２８】本発明の融合タンパク質は任意の大きさであり得るが、一般に、本発明は、目
的のポリペプチド配列が短い、例えば長さが２〜100アミノ酸、好ましくは２〜5
0アミノ酸、または２〜30もしくは５〜10アミノ酸である場合、特に有用である。しかしながら、大型のポリペプチド配列、例えば最大150、200、400または100
0アミノ酸までのものも意図されている。本発明は、現在組換え法によって製造することが困難な小型ポリペプチドの調製に特に都合がよい。かかるポリペプチ
ドとしては、例えば、シャペロンタンパク質、代謝酵素、DNAおよびRNA結合性タ
ンパク質、抗体、ウイルスタンパク質、内在性(intrinsic)膜タンパク質（ミトコンドリア由来の輸送タンパク質、７ヘリックス受容体分子、T細胞受容体など）、および細胞骨格複合体、抗体結合性ペプチド、ペプチドホルモン（およびリ
ボソーム合成によって製造されるその他の生物活性ペプチド）、ならびに呼吸酵
素ATPシンターゼのような多サブユニット生物学的構造由来の小型サブユニットが挙げられる。一般的に、本発明は、任意のディメンジョンのペプチドとの使用
に適しているが、その都合のよい特性は、小型ポリペプチド、例えば長さ２〜50
アミノ酸、特に長さ２〜20アミノ酸、好ましくは長さ５〜10アミノ酸で最良に利
用される。

【００２９】本発明の特定の利点は、非常に短いので以前はオリゴペプチド合成技術によっ
て製造されていたペプチドが組換えDNA技術によって製造され得るということである。したがって、ペプチド、例えば生物活性ペプチドの突然変異体のライブラ
リーを製造することが可能であり、それらは組換え発現系、特に細菌発現系にお
いて安価且つ効率的にスクリーニングされ得るか、さもなければ分析され得る。

【００３０】Ｃ：切断可能なリンカー領域第1および第2領域が切断可能なリンカー領域によって連結されている場合、こ
れは本目的に適した領域であり得る。好ましくは、切断可能なリンカー領域はプ
ロテアーゼ切断可能なリンカーであるが、例えば小型分子によって切断可能なそ
の他のリンカーを使用してもよい。それらには、臭化シアンにより切断可能なMe
t-X部位、ヒドロキシルアミンにより切断可能なAsn-Gly、弱酸により切断可能な
Asp-Pro、および特にNBS-スカトールにより切断可能なTrp-Xが含まれる。プロテ
アーゼ切断部位は切断条件がより温和であるので好ましく、例えばXa因子、トロ
ンビンおよびコラゲナーゼにおいて見出される。これらのどれでも使用すること
ができる。正確な配列は当技術分野で入手可能であり、当業者は適当な切断部位
の選択には苦労しないだろう。例えば、Xa因子が標的とするプロテアーゼ切断領
域はIEGRである。エンテロキナーゼが標的とするプロテアーゼ切断領域はDDDDK である。トロンビンが標的とするプロテアーゼ切断領域はLVPRGである。

【００３１】Ｄ：核酸本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸も提供する。これらは標
準的な組換えDNA法を用いて構築され得る。核酸はRNAまたはDNAであり得るものであり、好ましくはDNAである。核酸がRNAである場合、操作はcDNA中間体によっ
て行われ得る。一般的に、第1領域をコードする核酸配列が調製され、適当な制限部位は5'および／または3'末端に付与される。都合がよいことには、配列は、
pBR322またはpUC19に基づくプラスミドベクターなどの標準的な実験室用ベクターにおいて操作される（下記参照）。SambrookらによるMolecular Cloning（Col
d Spring Harbor, 1989）または適切な技術を正確に詳述した同様の標準的な参考書を参照し得る。

【００３２】第2領域をコードする核酸は同様のベクター系において同じように付与され得る。核酸の起源は刊行物またはジーンバンクなどのデータバンクを参照すること
によって確認し得る。

【００３３】所望の第1または第2領域をコードする核酸は、学術的または商業的な供給元か
ら入手し得るものであり、そのような供給元は、その配列データのみが入手可能
である場合に適切な配列を合成またはクローニングすることによって原料を供給
することをいとわない。一般的に、これは、問題の遺伝子のクローニングを記載
する文献を参照することによって行われ得る。また、入手できる配列データが限定される場合、または公知の核酸に相同また
は関連した核酸を発現させることが望ましい場合、代表的な核酸は、当技術分野
で公知の核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列として特性付けること
ができる。

【００３４】ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を意味する。そのような条件は当業者には明らかである。当業者
には公知であるように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融解温度（Tm）
に反映し、配列相同性が１％低下するごとに約１〜1.5℃低下する。一般に、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度および温度の関数である。典型的に
は、ハイブリダイゼーション反応は、高ストリンジェンシー条件下で行われ、そ
の後種々のストリンジェンシーの洗浄が行われる。

【００３５】本明細書で用いられる場合、高ストリンジェンシーとは、1M Na+、65〜68℃に
おいて安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを
可能にする条件を意味する。高ストリンジェンシー条件は、例えば、６×SSC、５×デンハルト(Denhardt)、１％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、0.1Na＋ピロ
リン酸および非特異的競争相手として0.1mg/ml変性サケ精子DNAを含む水溶液中でのハイブリダイゼーションによって得られ得る。ハイブリダイゼーション後、
0.2〜0.1×SSC、0.1％SDS中でハイブリダイゼーション温度にて最終洗浄することにより（約30分）高ストリンジェンシー洗浄を数段階行い得る。

【００３６】中ストリンジェンシーとは、約60〜62℃である以外は上記の溶液中でのハイブ
リダイゼーションと同等の条件を意味する。この場合、最終洗浄は１×SSC、0.1
％SDS中でハイブリダイゼーション温度にて行われる。低ストリンジェンシーとは、約50〜52℃での上記溶液中におけるハイブリダイ
ゼーションと同等の条件を意味する。この場合、最終洗浄は２×SSC、0.1%SDS中
でハイブリダイゼーション温度にて行われる。

【００３７】これらの条件は、種々の緩衝液、例えばホルムアミドを基剤とする緩衝液、お
よび種々の温度を用いて調整することができ、再現され得るものと理解される。
デンハルト溶液およびSSCは、その他の適当なハイブリダイゼーション緩衝液（例えばSambrookら編 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold S
pring Harbor Laboratory Press, ニューヨークまたはAusubelら編 (1990) Curr
ent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.）と同様に当業者に周知である。最適ハイブリダイゼーション条件は、プローブの長さおよび
GC含量も役割を果たすので、経験的に決定する必要がある。

【００３８】本明細書に手引きが示されていることから、本発明の融合タンパク質の第1または第2領域を形成するのに適した核酸は当技術分野で周知の方法にしたがって取得可能である。例えば、本発明のDNAはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いる
化学合成により、または所望の核酸を有しており、それを検出可能なレベルで発
現させるものと考えられる起源から調製されたゲノムライブラリーもしくは適当
なcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより取得可能である。

【００３９】目的の核酸の化学的合成法は当技術分野で公知であり、トリエステル、亜リン
酸エステル、ホスホルアミダイトおよびH-ホスホン酸エステル法、PCRおよびその他の自己プライマー法ならびに固体担体におけるオリゴヌクレオチド合成が挙
げられる。これらの方法は、核酸の核酸配列全体が公知である場合、またはコー
ド鎖に相補的な核酸の配列が入手可能である場合に使用され得るものである。ま
た、ターゲットアミノ酸が公知である場合、各アミノ酸残基について公知の好ま
しいコード残基を用いて可能性のある核酸配列を推定することができる。

【００４０】融合タンパク質の所望の領域をコードする遺伝子を単離するための別の手段は
、例えばSambrookら, 1989の第14節に記載されたようなPCR技術を用いることである。この方法は、所望の核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプロー
ブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドの選択についての戦略を下記に示す
。

【００４１】ライブラリーは、目的の遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質を
同定するために設計されたプローブまたは分析手段を用いてスクリーニングされ
る。cDNA発現ライブラリーに適した手段としては、所望のタンパク質を認識し、
それに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体；同一または
異なる種由来の所望のタンパク質をコードすることが知られたまたは疑いのある
cDNAをコードする長さ約20〜80のオリゴヌクレオチド；および／または同一また
はハイブリダイズする遺伝子をコードする相補または相同cDNAまたはその断片が
挙げられる。ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするのに適したプローブとしては、限定するものではないが、同一またはハイブリダイズするDNAをコードするcDNAもしくはその断片；および／または相同ゲノムcDNAもしくはその断片
が挙げられる。

【００４２】所望のタンパク質をコードする核酸は、適当なcDNAまたはゲノムライブラリー
を、プローブを用いて適当なハイブリダイゼーション条件下でスクリーニングす
ることによって単離され得る。

【００４３】本明細書で用いられる場合、プローブは、例えば、公知の配列または所望の配
列由来の同等またはそれ以上の数の連続塩基と同一（またはその相補体）である
10〜50個、好ましくは15〜30個、最も好ましくは少なくとも約20個の連続塩基を
含むヌクレオチドの配列を有する1本鎖DNAまたはRNAである。プローブとして選択される核酸配列は、誤った陽性結果が最小になるように十分な長さのものであ
り、十分に明白なものであるべきである。ヌクレオチド配列は、通常、所望のタ
ンパク質の保存または高度に相同なヌクレオチド配列または領域に基づいている
。プローブとして用いられる核酸は、1個以上の位置で縮重し得るものである。縮重オリゴヌクレオチドの使用は、その種における優先的なコドン用法が知られ
ていないa種からライブラリーをスクリーニングする場合に特に重要であり得る。

【００４４】プローブを構築するのに好ましい領域としては、5'および／または3'コード配
列、リガンド結合部位をコードすると予想される配列などが挙げられる。例えば
、配列番号１として本明細書に開示された全長cDNAクローンまたはその断片を、
特に第1領域コード遺伝子を単離するためのプローブとして用いることができる。好ましくは、本発明の核酸プローブは、ハイブリダイゼーションを容易に検出
するための適当な標識手段で標識化される。例えば、適当な標識手段は放射能標
識である。DNA断片の標識化の好ましい方法は、当技術分野で周知のように、ランダムプライミング反応においてα³²P dATPをDNAポリメラーゼのクレノウ断片と混合することによるものである。オリゴヌクレオチドは、通常、γ³²P-標識化
ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼで末端標識化される。しかしながら、その他の方法（例えば非放射能）、例えば酵素標識化、適当な蛍光団による蛍光標識
化およびビオチニル化などを用いることにより、断片またはオリゴヌクレオチド
を標識化することもできる。

【００４５】ライブラリーを、例えば実質的に所望の配列全体を含むDNAの一部または該DNA
の一部に基づく適当なオリゴヌクレオチドを用いてスクリーニングした後、陽性
クローンをハイブリダイゼーションシグナルを検出することによって同定し、同
定されたクローンを制限酵素マッピングおよび／またはDNA配列分析により特性付けし、次いでそれらが完全なポリペプチドをコードするDNAを含むかどうか（すなわちそれらが翻訳開始および終結コドンを含むかどうか）を確認するために
検査する。選択されたクローンが不完全である場合、それらを用いて同一または
異なるライブラリーを再スクリーニングし、オーバーラップクローンを得ること
ができる。ライブラリーがゲノムライブラリーである場合、オーバーラップクロ
ーンはエキソンおよびイントロンを含み得る。ライブラリーがcDNAライブラリー
である場合、オーバーラップクローンはオープンリーディングフレームを含む。
いずれの場合にも、完全クローンは、本明細書に示したDNAおよび推定アミノ酸配列と比較することによって同定され得る。

【００４６】本発明の核酸は、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入ま
たはヌクレオチド伸長方向の反転およびそれらの任意の組み合わせにより容易に
改変することができると考えられる。そのような突然変異体を用いることにより
、例えば、天然で見出される配列とは異なるアミノ酸配列を有する突然変異体を
製造することができる。突然変異誘発は、予め決定され得る（部位特異的であり
得る）か、ランダムであり得る。サイレント突然変異ではない突然変異は、リー
ディングフレームからの配列を配置してはならず、ハイブリダイズしてループま
たはヘアピンのような二次mRNA構造を生じさせ得る相補領域を創出しないのが好
ましい。

【００４７】前述の方法は、もちろん、本発明の融合タンパク質のどの部分においても有用
な配列の同定および改変または作製に適用し得る。特に、本明細書に配列番号１
として示したIF₁ ポリペプチドコイルドコイルの配列または上述したようなその
適当な断片は、さらに別の適当な配列を同定するためのプローブとして使用し得
る。

【００４８】第1または第2領域は操作することによりその末端に適当な制限酵素部位を導入
してもよく、対応する制限酵素部位を介して第1領域をコードする核酸に連結されることになる。望ましくは、かかる部位は同一であるか、少なくとも適合付着
末端を有する。もちろん、第1および第2領域は別の手段によって連結され得るも
のであり、例えば、第1領域は第2領域を単離または複製するのに用いられるプラ
イマーに組み込まれ得る。

【００４９】プロテアーゼ切断可能なリンカー領域が必要である場合、かかる領域は連結さ
れた第1および第2領域（例えばその二つを連結している制限部位）に導入され得
るか、それらの連結前に一方または他方に導入され得る。

【００５０】Ｅ．発現ベクターおよび宿主細胞本発明の融合タンパク質をコードする核酸、またはその構成部分は、その後の
操作のためにベクターに組み込むことができる。本明細書で用いられる場合、ベ
クター（またはプラスミド）とは、異種DNAをその発現または複製のために細胞に導入するのに用いられる別個のエレメントを意味するものである。そのような
媒介物の選択および使用は十分に当業者の技術の範囲内である。多くのベクター
が利用可能であり、適当なベクターの選択はそのベクターの所期の用途、すなわ
ちそれがDNA増幅に使用されるのかどうか、あるいはDNA発現に使用されるのかど
うか、ベクターに挿入されるDNAの大きさ、ならびにベクターで形質転換される宿主細胞に依存する。各ベクターはその機能（DNAの増幅またはDNAの発現）およ
びそれが適合し得る宿主細胞に依存して種々の成分を含む。ベクター成分として
は、一般的に、限定するものではないが、複製の起点、1個以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結配列およびシグナル配列
の1以上が挙げられる。

【００５１】発現およびクローニングベクターの両方は、一般的に、1以上の選択宿主細胞内でベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。典型的に、クローニングベク
ターにおいては、これらの配列は、ベクターが宿主染色体DNAとは無関係に複製することができるようにするものであり、複製起点または自律複製配列を含む。
そのような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスに対して周知である。プラ
スミドpBR322由来の複製起点は、大部分のグラム陰性菌に適しており、２μプラ
スミド起点は酵母に適しており、種々のウイルス起点（例えば、SV40、ポリオー
マ、アデノウイルス）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用であ
る。一般的に、複製起点成分は、これらが哺乳動物細胞においてCOS細胞のような高レベルのDNA複製のために用いられない限り、哺乳動物発現ベクターには必要ではない。

【００５２】大部分の発現ベクターはシャトルベクターであり、すなわちそれらは少なくと
も一つのクラスの生物において複製能を有するものであるが、発現のために別の
生物にトランスフェクトすることができる。例えば、ベクターをE.coliでクロー
ニングし、次いでたとえそのベクターが宿主細胞染色体とは無関係に複製する能
力をもたないとしても同ベクターを酵母または哺乳動物細胞にトランスフェクト
する。DNAは宿主ゲノムへの挿入によっても複製され得る。しかしながら、本発明の融合タンパク質をコードするゲノムDNAの回収は、DNAを切除するには制限酵
素消化が必要であるので、外来的に複製されるベクターの回収よりも複雑である
。DNAはPCRによって増幅することができ、なんの複製成分も用いずに宿主細胞に
直接トランスフェクトすることができる。

【００５３】都合がよいことには、発現およびクローニングベクターは、選択マーカーとも
呼ばれる選択遺伝子を含み得る。この遺伝子は選択培地において増殖させた形質
転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を
含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培地中で生き残らない。典型
的な選択遺伝子は、抗体およびその他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシ
ン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を有するか、補体栄
養要求性異状を補うか、または複合培地から摂取できない重要な栄養素を供給す
るタンパク質をコードする。

【００５４】酵母に適した選択遺伝子マーカーに関し、マーカー遺伝子の表現型発現により
形質転換体の選択を容易にするマーカー遺伝子はどれでも使用することができる
。酵母に適したマーカーは、例えば、抗生物質G418、ヒグロマイシンまたはブレ
オマイシンに対する耐性を有するものであり、または栄養要求性酵母変異体、例
えばURA3、LEU2、LYS2、TRP1、またはHIS3遺伝子において原栄養性をもたらす。

【００５５】ベクターの複製はE.coliにおいてなされるのが都合がよいので、E.coli遺伝子
マーカーおよびE.coli複製起点が都合よく含まれる。これらは、pBR322、Bluesc
ript（著作権）ベクターまたはpUCプラスミド、例えばpUC18もしくはpUC19のような、E.coli複製起点およびアンピシリンのような抗生物質に対する耐性を有す
るE.coli遺伝子マーカーの両方を含むE.coliプラスミドから得られ得る。

【００５６】哺乳動物細胞に適した選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR、メ
トトレキセート耐性）、チミジンキナーゼ、またはG418またはヒグロマイシンに
対する耐性を有する遺伝子のような、ベクター核酸を取り込む能力のある細胞の
同定を可能にするものである。哺乳動物細胞形質転換体は、取り込まれてマーカ
ーを発現している形質転換体のみが唯一生き残るのに適している選択圧力下に置
かれる。DHFRまたはグルタミンシンターゼ（GS）マーカーの場合には、選択圧力
は、圧力が次第に増大する条件下で形質転換体を培養し、それによって選択遺伝
子および融合タンパク質をコードする連結DNAの両方の（その染色体組込み部位における）増幅を生じさせることにより加えられ得る。増幅は、増殖に不可欠な
タンパク質の産生に対して需要が非常に多い遺伝子ならびに所望のタンパク質を
コードし得る密接に関連した遺伝子が組換え細胞の染色体内に縦方向に繰り返さ
れるプロセスである。大量の所望のタンパク質は、通常、増幅されたDNAから合成される。

【００５７】発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識されるプロ
モーターを含み、融合タンパク質コード核酸に機能的に連結される。そのような
プロモーターは誘導性または構成性で有り得る。プロモーターは、制限酵素消化
により起源DNA由来のプロモーターを除去し、ベクターに単離されたプロモーター配列を挿入することによって融合タンパク質をコードするDNAに機能的に連結される。融合タンパク質の構成成分の一つである天然プロモーター配列および多
くの異種プロモーターを用いることにより、DNAの増幅および／または発現を誘導し得る。「機能的に連結された」という用語は、記載された成分がそれらをそ
の所期の様式で機能させる関係で並置されていることを意味するものである。コ
ード配列に「機能的に連結された」調節配列は、コード配列の発現が調節配列と
適合した条件下で得られるようにライゲートされる。

【００５８】原核生物宿主での使用に適したプロモーターとしては、例えば、β−ラクタマ
ーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファ
ン（trp）プロモーター系およびtacプロモーターなどのハイブリッドプロモータ
ーが挙げられる。それらのヌクレオチド配列は公表されており、よって当業者は
任意の必要な制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプターを用いてそれ
らに融合タンパク質をコードするDNAを機能的にライゲートすることができる。細菌系で使用するためのプロモーターは、一般的に、融合タンパク質をコードす
るDNAに機能的に連結されたシャイン・ダルガーノ配列も含む。

【００５９】好ましい発現ベクターは、細菌内で機能する能力を有するphagexまたはT7のよ
うなバクテリオファージのプロモーターを含む細菌発現ベクターである。最も広
く用いられている発現系の一つにおいては、融合タンパク質をコードする核酸は
、T7 RNAポリメラーゼによってベクターから転写され得る（Studierら, Methods
in Enzymol. 185; 60-89, 1990）。pETベクターとともに用いられるE.coli BL2
1(DE3)宿主株においては、T7 RNAポリメラーゼは、宿主細菌におけるλ−溶原菌
(lysogen)DE3から産生され、その発現はIPTG誘導性lac UV5プロモーターの支配下にある。この系は、多くの球状タンパク質の過剰産生にうまく用いられている
が、多くのその他の場合においては、過剰発現の毒性のために有意な過剰産生を
得ることができない（Studierら, 1990; Georgeら, J. Mol. Biol. 235; 424-43
5, 1994）。また、ポリメラーゼ遺伝子は、市販のCE6ファージ（Novagen、マディソン、USA）のようなインテグラーゼファージの感染によりλファージに導入され得る。その他のベクターとしては、PLEX（Invitrogen、NL）のようなλ PL プロモーターを含むベクター、pTrcHisXpressTm（Invitrogen）もしくはpTrc99 （Pharmacia Biotech, SE)のようなtrcプロモーターを含むベクター、またはpKK
223-3(Pharmacia Biotech)もしくはPMAL(New England Biolabs, MA, USA）のようなtacプロモーターを含むベクターが挙げられる。

【００６０】さらに、本発明による融合タンパク質遺伝子は、細菌宿主由来のポリペプチド
の分泌を促進するために分泌配列を含み得るものであり、その結果かかるポリペ
プチドは封入体の状態というよりも可溶性天然ペプチドとして産生される。ペプ
チドは、細菌細胞周辺腔または培地から適宜回収され得る。

【００６１】酵母宿主との使用に適した促進配列は調節され得るか構成的であり得るもので
あり、好ましくは高発現酵母遺伝子、特にSaccharomyces cerevisiae遺伝子から
誘導される。したがって、TRP1遺伝子、ADHIもしくはADHII遺伝子、酸ホスファターゼ（PH05）遺伝子のプロモーター、a-もしくはα-因子をコードする酵母接合フェロモン遺伝子のプロモーター、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3
-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAP）、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グル
コース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼまたは
グルコキナーゼ遺伝子のプロモーターなどの解糖酵素をコードする遺伝子、S.ce
revisiae GAL4遺伝子、S.pombe nmt1遺伝子由来のプロモーター、またはTATA結合タンパク質（TBP）遺伝子由来のプロモーターを用いることができる。さらに、一つの酵母遺伝子の上流活性化配列（UAS）および別の酵母遺伝子の機能的TAT
Aボックスなどの下流プロモーターエレメントを含むハイブリッドプロモーター、例えば酵母PH05遺伝子のUASおよび酵母GAP遺伝子の機能的TATAボックスなどの
下流プロモーターエレメントを含むハイブリッドプロモーター（PH05-GAPハイブ
リッドプロモーター）を使用することができる。適当な構成的PH05プロモーター
は、例えば、PH05遺伝子のヌクレオチド-173で始まり、ヌクレオチド-9で終わる
PH05(-173)プロモーターエレメントのような上流調節エレメント(UAS)が欠けた短縮化された酸ホスファターゼPH05プロモーターである。

【００６２】哺乳動物宿主におけるベクターからの融合タンパク質遺伝子転写は、ポリオー
マウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、鳥類肉
腫ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、レトロウイルスおよびシミアンウイルス40（SV40）のようなウイルスのゲノムから誘導されたプロモーター、アク
チンプロモーターもしくは超強力プロモーター、例えばリボソームタンパク質プ
ロモーターのような異種哺乳動物プロモーターから誘導されたプロモーター、な
らびに融合タンパク質の成分をコードする遺伝子に正常に関連したプロモーター
から誘導されたプロモーターによって、そのようなプロモーターが宿主細胞系に
適合する場合、制御され得る。

【００６３】高等真核生物による融合タンパク質をコードするDNAの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増大され得る。エンハンサーは比較的方
向および位置非依存性である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が
公知である（例えばエラスターゼおよびグロビン）。しかしながら、典型的に、
真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられる。例えば、複製起点（100〜2
70bp）の後期側にあるSV40エンハンサーおよびCMV早期プロモーターエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、コード配列の5'位または3'位でベクターにス
プライスされ得るものであるが、プロモーターの5'側に位置するのが好ましい。

【００６４】都合がよいことに、融合タンパク質をコードする真核生物発現ベクターは、遺
伝子座調節領域(LCR)を含み得る。LCRは、宿主細胞クロマチンに組み込まれた導
入遺伝子の高レベルの組み込み部位非依存性発現を誘導する能力を有し、これは
、特に、遺伝子治療用途のためにデザインされたベクターまたはトランスジェニ
ック動物において、融合タンパク質遺伝子をベクターの染色体組込みが生じる永
久トランスフェクト真核細胞系において発現させる場合に重要である。

【００６５】発現ベクターは、そのようなDNAを発現させる能力を有するプロモーター領域のような調節配列に機能的に連結されている核酸の発現能を有する任意のベクタ
ーを含む。したがって、発現ベクターは、適切な宿主細胞への導入によりクロー
ン化したDNAの発現が生じるプラスミド、ファージ、組換えウイルスまたはその他のベクターのような組換えDNAまたはRNA構築物を意味する。適切な発現ベクタ
ーは当業者には周知であり、真核細胞および／または原核細胞において複製可能
なベクター、ならびにエピソーム状態にあるベクターもしくは宿主細胞ゲノムに
組込むベクターが挙げられる。例えば、本発明の融合タンパク質をコードするDN
Aは、哺乳動物細胞におけるcDNAの発現に適したベクター、例えばpEVRF（Matthi
asら, (1989) NAR 17, 6418）のようなCNVエンハンサー基ベクターに挿入され得
る。

【００６６】本発明の実施に特に有用なものは、哺乳動物細胞において融合タンパク質をコ
ードするDNAの一過性発現を生じさせる発現ベクターである。一過性発現は、通常、宿主細胞が発現ベクターの多数のコピーを蓄積し、次いで高レベルの融合タ
ンパク質を合成するように、宿主細胞において効率的に複製することができる発
現ベクターの使用を含む。本発明の目的のために、一過性発現系は、例えば融合
タンパク質変異体を同定してリン酸化の可能性のある部位を同定するか、または
タンパク質の機能的ドメインを特性付けるのに有用である。

【００６７】本発明のベクターの構築には通常のライゲーション技術が用いられる。単離さ
れたプラスミドまたはDNA断片を切断し、調整し、要求されるプラスミドを作製するのに望ましい状態で再ライゲートする。所望により、構築されたプラスミド
における正確な配列を確認するための分析を公知の様式で行う。発現ベクターの
構築、in vitro転写物の調製、DNAの宿主細胞への導入ならびに発現および機能を評価するための分析の実施に適した方法は当業者には公知である。遺伝子の存
在、増幅および／または発現は、例えば、通常のサザンブロッティング、mRNAの
転写を定量するためのノーザンブロッティング、ドットブロッティング（DNAまたはRNAの分析）、またはin situハイブリダイゼーションによって、本明細書に
示した配列に基づく適切に標識したプローブを用いて直接試料中で測定され得る
。当業者には、所望により、これらの方法をどのように変更し得るかを容易に考
えられるであろう。

【００６８】本発明は、さらに、コイルドコイル構造形成能を有するポリペプチドをコード
する第1核酸配列であって宿主細胞においてその第1核酸配列を発現させる能力を
有するプロモーターに連結されたもの、および該核酸配列に連結されており、第
1核酸配列との融合において発現する能力を有する第2核酸配列の挿入を可能にす
るクローニング部位を含む発現ベクターを提供する。そのようなベクターは、任
意の所望のポリペプチドを本発明の融合タンパク質の状態で発現させるのに有用
な媒介物である。

【００６９】本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドの複製および発現用のベ
クターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。細胞は、
ベクターと適合するように選択され、例えば細菌、酵母、昆虫または哺乳動物で
あり得る。

【００７０】原核細胞、酵母細胞および高等真核細胞のような宿主細胞は、DNAの複製および融合タンパク質の産生に用いられ得る。適当な原核細胞としては、例えばE.co
li K-12株、DH5aおよびHB101などのE.coliまたはBacilliといったグラム陰性またはグラム陽性生物のような真正細菌が挙げられる。融合タンパク質コードベク
ターに適したその他の宿主としては、糸状菌または酵母、例えばSaccharomyces
cerevisiaeのような真核微生物が挙げられる。高等真核細胞としては、昆虫細胞
または脊椎動物細胞、特に哺乳動物細胞が挙げられる。近年、培養（組織培養）
における脊椎動物細胞の増殖はルーチン操作になった。有用な哺乳動物宿主細胞
系は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NIH 3T3細胞、HeLa細胞
または293T細胞のような上皮細胞または繊維芽細胞系である。本開示において言
及される宿主細胞は、in vitro培養における細胞ならびに宿主動物内の細胞を含
む。

【００７１】 DNAは、細胞に安定的に組込まれ得るか、または当技術分野で公知の方法を用いて一時的に発現され得る。安定的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞は、
選択マーカー遺伝子を有する発現ベクターで細胞をトランスフェクトし、マーカ
ー遺伝子を発現している細胞を選択する条件下でトランスフェクトされた細胞を
増殖させることにより調製され得るものである。一過性トランスフェクタントを
調製するために、哺乳動物細胞をレポーター遺伝子でトランスフェクトしてトラ
ンスフェクション効率を監視する。

【００７２】このような安定的または一時的にトランスフェクトされた細胞を産生するため
に、細胞を、融合タンパク質を生成するのに十分な量の融合タンパク質コード核
酸でトランスフェクトする。融合タンパク質をコードするDNAの正確な量は実験的に測定し得るものであり、特定の細胞およびアッセイについて最適化され得る
。

【００７３】宿主細胞を、上記の本発明の発現またはクローニングベクターでトランスフェ
クト、あるいは好ましくは形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選別
、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜変更した通常の栄養
培地で培養する。異種DNAは、リン酸カルシウム共沈技術またはエレクトロポレーションによる異種DNAをコードするベクターでのトランスフェクションのような当技術分野で公知の任意の方法により宿主細胞に導入され得る。多数のトラン
スフェクション法が当業者には公知である。トランスフェクションの成功は、一
般的に、宿主細胞においてこのベクターの操作についての何らかの徴候が生じる
場合に認識される。形質転換は、用いられる特定の宿主細胞に適した標準技術を
用いて行われる。

【００７４】適当な発現ベクターへのクローン化DNAの組込み、それぞれ1個以上の別個の遺
伝子をコードする一のプラスミドベクターもしくはプラスミドベクターの組み合
わせ、または線状DNAによる真核細胞のトランスフェクション、ならびにトランスフェクトされた細胞の選別は当技術分野では周知である（例えば、Sambrookら
(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spr
ing Harbor Laboratory Pressを参照されたい）。トランスフェクトまたは形質転換された細胞は、当技術分野で公知の培地およ
び培養方法を用いて、好ましくはDNAによりコードされる融合タンパク質が発現するような条件下で培養される。適当な培地の組成は当業者には公知であるので
、それらは容易に調製することができる。適当な培地は市販もされている。

【００７５】微生物、および特にEscherichia coliなどの細菌は、原核生物および真核生物
のタンパク質両方の過剰発現を最も成功させる媒介物の中に含まれる（概観につ
いてはHockney, 1994; Grisshammer & Tate, 1955を参照されたい）。したがって、本発明の宿主細胞は、本発明の融合タンパク質をコードするベクターで形質
転換された微生物を含む。しかしながら、膜タンパク質、いくつかの細胞質タン
パク質（Dongら, 1995)および細胞分裂タンパク質(de Boerら, 1988; Gutzmanら
, 1992)を含む多くの原核生物タンパク質を発現させるのに用いられる発現系ならびにDNアーゼのような毒性タンパク質の発現は、一定の状況においては宿主細
菌に対して毒性であり得る。

【００７６】微生物における真核生物タンパク質の発現は同様に問題であり得る。かかるタ
ンパク質の発現も細胞に対して毒性であり得る。それにもかかわらず、細菌発現
系が工業において用いられており、キモシン、インスリン、インターフェロン、
インスリン様増殖因子、ヒト化抗体などの抗体またはその断片などの広範な種類
のタンパク質を発現させるのに用いられている。

【００７７】本発明者らは、宿主において毒性作用が観察できるように、本発明の融合タン
パク質をコードする発現ベクターで形質転換された宿主細胞の培養物から融合タ
ンパク質をコードする遺伝子の誘導後に細胞を回収し、選別条件下でかかる細胞
を培養することにより、細胞において通常観察される有害な作用を伴わずに高レ
ベルの融合タンパク質を発現させる能力のある培養細胞から回収することが可能
であることを見出した。驚いたことに、観察される作用は一般的であり、発現系
によりコードされるどの標的ペプチドにおいても観察される。よって、細胞は、
特定の毒性遺伝子の発現に対して耐性があるのとは対照的に「発現系毒性に対し
て耐性」がある。

【００７８】したがって、好ましい局面においては、本発明は、 (a) 本質的に、本発明の融合ポリペプチドをコードする誘導性発現ベクターで
形質転換された宿主細胞および選択マーカーからなる発現系を調製する工程； (b) 選択マーカーと適合する選択圧力下で発現系で形質転換された細胞を培養
する工程； (c) 毒性作用が宿主において観察できるように発現系に融合ポリペプチド産生
を誘導する工程； (d) 宿主細胞を培養物から回収し、それらを選択圧力および誘導条件下で増殖
させる工程；ならびに (e) 融合ポリペプチドを産生しつづける生存宿主細胞を選別する工程を含む発
現系の改良方法を提供する。

【００７９】発現系毒性に対して耐性のある突然変異体の作製は、本出願人の名義で1996年
7月12日に出願されたUK特許出願9614700.4に開示されており、その内容は参照に
より本明細書に含まれる。

【００８０】コイルドコイル領域、そしてさらに所望のタンパク質産物をコードする領域を
含む融合ポリペプチドは、本発明の融合タンパク質である。そのような所望のタ
ンパク質としては、例えば、ウシオキソグルタル酸−リンゴ酸担体、ADP/ATPトランスロカーゼ(translocase)、ラット非結合タンパク質UCP1およびUCP2、Esche
richia coli unc I、E.coli F-ATPアーゼサブユニットa、ウシF-ATPアーゼサブユニットエプシロンならびにヒト免疫不全ウイルスTATタンパク質が挙げられる。

【００８１】上記方法において用いられ得る好ましい細菌宿主としては、BL21のようなE.co
liのB株またはJM109のようなK株が挙げられる。これらの株は、当技術分野においては学術的および／または商業的な供給元から広く入手可能である。B株はロンプロテアーゼが欠けており、この遺伝子型を有するその他の株も用いることが
できる。好ましくは、この株は組換え遺伝子が欠けているべきではない。

【００８２】最も好ましくは、この株はStudierら(1990)に開示されているようなBL21(DE3)
である。上記の選別方法によって取得可能な、任意にベクターが処理された細菌
は、本発明において宿主細胞として用いられ得る。特定の細菌としては、E.coli
C43(DE3)（European Collection of Cell Cultures(ECCC)(ソールズベリー、ウ
ィルトシア州、UK）に1996年7月4日に、B96070445として寄託）；E.coli C0214(
DE3)（National Collections of Industrial and Marine Bacteriaに1997年6月2
5日にNCIMB40884として寄託）；E.coli DK8(DE3)S(National Collections of In
dustrial and Marine Bacteriaに1997年6月25日にNCIMB40885として寄託）；またはE.coli C41(DE3)(ECCCに1996年7月4日に、B96070444として寄託)が挙げられ
る。そのような細菌は、処理された場合、本発明の融合タンパク質の発現のため
の宿主になり、その発現が細菌に対して毒性である融合タンパク質の発現に特に
適している。

【００８３】Ｆ．選別方法上記の選別方法はUK特許出願9614700.4（その内容は参照により本明細書に含まれる）に完全に開示されているが、この方法は下記のようにして実施するのが
好ましい：宿主細胞の培養は選別圧力の存在下、通常、ベクターの選択マーカー遺伝子に
よって代謝される抗生物質の存在下で生じる。用いられる抗生物質の濃度は、耐
性遺伝子の正確な性質および形質転換細胞がその抗生物質によって死滅する濃度
に依存する。アンピシリンの場合、通常、培養物１ml当たり大体20〜200μgで十
分であるが、これは必要に応じて当業者によって実験的に決定され得る。一般的
に、抗生物質の適切な濃度は、標準的な実験参考書（例えばSambrookら, 1989）
を参照して決定され得る。

【００８４】発現系の細胞に対する毒性のために、宿主は、最初のうちは、細胞の対数増殖
が得られるように標的遺伝子の発現がほとんどまたは全く生じない条件下で培養
される。E.coliについては、これは典型的には細胞を約10⁶ 細胞／ml、例えば10 ² 〜10⁷ ／mlの範囲の密度まで増殖させることを意味する。細胞密度は、吸光度
測定を用いて測定し得る。また、細胞を、適当な時間、例えば37℃で1〜6時間、
例えば３〜４時間増殖させ得るものである。

【００８５】細胞は低温または高温で培養してもよい。これは、例えば標的ポリペプチドの
発現が温度感受性遺伝子に連結している場合に有用であり得る。そのような状況
においては、細胞をまず非許容性温度、すなわち標的遺伝子の発現が生じない温
度で増殖させる。選択圧力下で細胞を培養した後、培養物に標的遺伝子の発現を誘導する。細菌
内で機能的ないくつかの誘導プロモーターが利用可能である。trpEプロモーター
のようないくつかのプロモーターは、培地中の代謝産物または異化代謝産物（す
なわちtrpEプロモーターの場合にはトリプトファン）の存在または不存在により
誘導可能である。その他のプロモーターとしては、tacプロモーターまたはλP_R
プロモーターが挙げられる。

【００８６】しかしながら、好ましいプロモーターは発現用のバクテリオファージポリメラ
ーゼを必要とするバクテリオファージプロモーターである。上記のように、好ま
しいプロモーターは、T7ポリメラーゼ遺伝子が別個の誘導プロモーターの制御下
にクローニングされ、配置された細胞に関して用いられ得るT7プロモーターであ
る。T7ポリメラーゼはそのプロモーター結合部位に対して選択的であり、よって
T7ポリメラーゼの不存在下では標的遺伝子の発現はほとんど生じないので特に有
用である。ポリメラーゼをコードする遺伝子を、ファージがゲノムからの組込み
または切除用のヘルパーファージを必要とするようにλファージ中で細胞に導入
し、int遺伝子内のファージゲノムに置く。ポリメラーゼ遺伝子を、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）によって誘導可能なUV5プロモーターに連結して、IPTGを培養物に添加することによりT7ポリメラーゼの産生を誘導す
る。また、遺伝子は、市販のCE6ファージ（Novagen、マディソン、USA）のようなintファージを感染させることによりλファージ上に導入され得る。

【００８７】融合ポリペプチドをコードする遺伝子の誘導後、細胞における毒性作用が観察
され、細胞死が生じ始め、培養物中の細胞が標的ポリペプチドをコードするベク
ターを遊離し始めるような適当な期間培養を維持する。通常、細胞のわずか50％
、好ましくはわずか10％、例えば１％または0.1％のみがベクターを保持するまで細胞を液体培養物中に維持するべきである。これは、固体培地上で培養物のア
リコート2組を選択圧力下および選択圧力無しで平板培養し、選択条件下または非選択条件下で増殖するコロニーの数の割合を測定することにより測定され得る
ものである。

【００８８】増殖および誘導後、培養物中の細胞を回収し、選択および誘導条件下で新鮮培
地上で増殖させる。新鮮培地は、固体培地、典型的には細胞増殖に必要な栄養素
を含む寒天であるのが望ましい。残存種を、標的遺伝子の存在について調べる。
本発明者らは、驚いたことに、この培地から回収されたコロニーのいくつかは、
標的遺伝子の毒性作用に耐性のある細胞を含むということを見出した。これは、
標的ポリペプチドの回収後に「使用済み」培養物を不用の産物とみなす通常の慣
習とは対照的である。

【００８９】Ｇ．融合タンパク質の産生およびそのプロセシング本発明の宿主細胞は、融合タンパク質の発現が生じる条件下で培養され得る。
融合タンパク質は任意の適当な手段、例えばアフィニティクロマトグラフィーま
たはHPLCで回収され得る。小型融合タンパク質が関係する場合、HPLCが特に適し
ている。融合タンパク質を、例えば適当なプロテアーゼを用いて切断することにより目
的のポリペプチド配列が得られ得るものであり、この配列は、生じた融合タンパ
ク質の第1および第2領域の混合物から回収され得るものである。また、融合タンパク質には、例えばコイルドコイルが凝集体を形成する場合、
免疫原のような用途が見出され得る。これにより、小型タンパク質およびペプチ
ドをキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)のような担体タンパク質に別個の化学反応により結合させることにより免疫原性物質を調製する必要性が回避され
る。

【００９０】Ｈ．抗体の産生本発明の融合タンパク質をさらなるアジュバントを用いずに免疫原として直接
用いることにより、抗血清およびモノクローナル抗体を作製し得る。本発明のさらに別の態様によれば、本発明の融合タンパク質を特異的に認識し
、結合する抗体が提供される。しかしながら、より好ましくは、抗体は融合タン
パク質の第2領域に特異的であり、すなわちその発現を得るために本発明の遺伝子産物に融合されるポリペプチドである。都合のよいことには、融合タンパク質
の第2領域はその天然状態にある場合には抗体によって認識される。したがって、第2領域が大型タンパク質から得た単離ペプチドまたはドメインである場合、そのペプチドまたはドメインは大型タンパク質全体に関して本発明の抗体によっ
て認識される。

【００９１】本発明は、さらに、 a) 請求項１〜７のいずれか1項に記載の融合タンパク質で動物を免疫感作する
工程、および b) 動物の血清から融合タンパク質の領域に特異的な免疫グロブリンを回収する工程を含む、免疫グロブリンの調製方法を提供する。

【００９２】抗体（または免疫グロブリン）は、融合タンパク質または融合タンパク質の一
つの領域が誘導されるタンパク質に対するアフィニティクロマトグラフィーによ
り、粗調製物、すなわち抗血清の状態で単離され得る。都合のよいことには、こ
の領域は第2領域である。また、抗体がコイルドコイルおよび融合タンパク質の両方を認識する場合、その抗体は融合タンパク質と、別個のコイルドコイル構造
の間の別個の融合を用いて単離され得る。抗体産生に用いられる動物は、かかる目的に通常用いられる任意の動物、特に
哺乳動物であり得る。特に、マウス、ラット、モルモットおよびウサギが挙げら
れる。

【００９３】下記の説明においては、融合タンパク質に特異的な抗体および融合タンパク質
の一つの領域に特異的な融合タンパク質に対して生じさせた抗体の両方が、「抗
融合タンパク質」抗体を意味するものである。

【００９４】本発明の抗体は、IgEおよびIgM抗体のような天然クラスの全抗体であり得るが
、IgG抗体が好ましい。さらに、本発明は、Fab、F(ab')2、FvおよびScFvのような抗体フラグメントを含む。FvおよびScFvのような小型フラグメントは、そのサ
イズの小ささとその結果として生じる優れた組織分布のために診断および治療的
用途に都合のよい特性を有する。

【００９５】本発明の抗体は、特に、診断および治療的用途に望ましい。したがって、それ
らは毒素または標識のようなエフェクタータンパク質を含む改変型抗体であり得
る。特に好ましいのは、in vivoで腫瘍における抗体分布の画像化を可能にする標識である。そのような標識は、患者の体内で容易に視覚化可能な金属粒子など
の放射能標識または放射線不透過性標識であり得る。さらに、患者から回収され
た組織試料において視覚化可能な蛍光標識またはその他の標識であり得る。

【００９６】組換えDNA技術を用いることにより本発明の抗体を改良することができる。したがって、診断的または治療的用途においてその免疫原性を低下させるためにキ
メラ抗体を構築し得る。さらに、免疫原性は、CDR移植（ヨーロッパ特許出願0 2
39 400(Winter)）および任意にフレームワーク改変によって抗体をヒト化するこ
とにより最小化され得る。また、ヒト抗体は、ファージディスプレイ選択技術を
用いて合成され得る。

【００９７】本発明の抗体は、動物血清から得られ得るものであり、またはモノクローナル
抗体もしくはそのフラグメントの場合には細胞培養において産生され得る。組換
えDNA技術を用いることにより、確立された手順にしたがって細菌細胞培養または好ましくは哺乳動物細胞培養において抗体を産生させ得る。選択された細胞培
養系は抗体産物を分泌するのが好ましい。

【００９８】したがって、本発明は、本発明の抗体をコードする第2DNA配列に適正なリーデ
ィングフレーム内で連結された、シグナルペプチドをコードする第1DNA配列に機
能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含有するハイブリッドベク
ターで形質転換された宿主、例えばE.coliまたは哺乳動物細胞を培養すること、
および前記タンパク質を単離することを含む、本発明の抗体の産生方法を含む。

【００９９】ハイブリドーマ細胞または哺乳動物宿主細胞のin vitroでの増殖を適当な培地
中で行う。ここで、この培地は、通常の標準培地、例えば、任意に、哺乳動物血
清、例えばウシ胎児血清、または微量元素および増殖維持補給物、例えば正常マ
ウス腹腔滲出細胞のようなフィーダー細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、2-
アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オ
レイン酸を補給したダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)またはRPMI 1640培地である。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増殖は、同様に、当技術分野で
公知の適当な培地中、例えば、細菌については、培地LB、NZCYM、NZYM、NZM、Te
rrific Broth、SOB、SOC、2×YT、またはM9最小培地中、酵母については培地YPD
、YEPD、最小培地、または完全最小ドロップアウト(dropout)培地中で行われる。

【０１００】 in vitro産生により比較的純粋な抗体調製物が得られ、大量の所望の抗体を得
るまでスケールアップすることが可能である。細菌細胞、酵母または哺乳動物細
胞培養についての技術は当技術分野で公知であり、例えばエアリフトリアクター
もしくは連続攪拌リアクター中での均一懸濁培養、または中空糸、マイクロカプ
セル中、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上における
固定化もしくは捕捉細胞培養が挙げられる。

【０１０１】大量の所望の抗体は、哺乳動物細胞をin vivoで増殖させることによっても取得することができる。この目的のために、所望の抗体を産生するハイブリドーマ
細胞を組織適合性哺乳動物に注射して抗体産生腫瘍の増殖を生じさせる。注射前
に、任意に動物を炭水化物、特にプリスタン（テトラメチル-ペンタデカン）などの鉱油でプライミングする。１〜３週間後、抗体をそれらの哺乳動物の体液か
ら単離する。例えば、適当なミエローマ細胞とBalb/cマウス由来の抗体産生脾臓
細胞との融合により得られたハイブリドーマ細胞、または所望の抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞系Sp2/0由来のトランスフェクト細胞を、任意にプリスタンで前処理されたBalb/cマウスに腹腔内注射し、１〜２週間後、腹水液を動物から
採取する。

【０１０２】細胞培養上清を、好ましくは、融合タンパク質を発現している細胞の免疫蛍光
染色により、免疫ブロッティングにより、酵素イムノアッセイ、例えばサンドイ
ッチアッセイもしくはドットアッセイにより、またはラジオイムノアッセイによ
り所望の抗体についてスクリーニングする。

【０１０３】抗体の単離のために、培養上清または腹水液中の免疫グロブリンは、例えば、
硫酸アンモニウムによる沈殿、ポリエチレングリコールなどの吸湿性材料に対す
る透析、選択膜による濾過などによって濃縮され得る。必要および／または所望
により、抗体を慣例のクロマトグラフィー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロ
マトグラフィー、DEAE-セルロース上のクロマトグラフィーおよび／または免疫アフィニティクロマトグラフィー、例えば関連融合タンパク質（融合タンパク質
の関連部分）もしくはタンパク質-Aを用いたアフィニティクロマトグラフィーに
よって精製する。本発明は、さらに、本発明のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細
胞に関する。本発明の好ましいハイブリドーマ細胞は、遺伝子的に安定であり、
所望の特異性の本発明のモノクローナル抗体を分泌し、解凍および再クローニン
グにより低温凍結培養物から活性化され得る。

【０１０４】本発明は、適当な哺乳動物、例えばBalb/cマウスを精製融合タンパク質、また
は融合タンパク質を有する細胞で免疫感作し、免疫感作動物の抗体産生細胞を適
当なミエローマ細胞系の細胞と融合し、融合で得られたハイブリッド細胞をクロ
ーン化することを特徴とする、融合タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を
分泌するハイブリドーマ細胞系の調製方法にも関する。例えば融合タンパク質で
免疫感作されたBalb/cマウスの脾臓細胞をミエローマ細胞系PAIまたはミエローマ細胞系Sp2/0-Ag14の細胞と融合し、得られたハイブリッド細胞を所望の抗体の
分泌に対してスクリーニングし、陽性ハイブリドーマ細胞をクローン化する。

【０１０５】適当な量の本発明の融合タンパク質を数回、例えば４〜６回、数ヶ月、例えば
２〜４ヶ月にわたって皮下および／または腹腔内注射することによりBalb/cマウ
スを免疫感作し、最後の注射の２〜４日後に免疫感作されたマウスから脾臓細胞
を採取し、融合プロモーター、好ましくはポリエチレングリコールの存在下でミ
エローマ細胞系PAIの細胞と融合させることを特徴とする、ハイブリドーマ細胞系の調製方法が好ましい。好ましくは、ミエローマ細胞を、分子量約4000の約30
〜約50％ポリエチレングリコールを含む溶液中で３〜20倍過剰の免疫感作マウス
由来の脾臓細胞と融合させる。融合後、正常なミエローマ細胞が所望のハイブリ
ドーマ細胞を過剰増殖するのを防ぐために、細胞を、選択培地、例えばHAT培地を定期的に補給した前記のような適当な培地で増殖させた。

【０１０６】また、本発明は、本発明の融合タンパク質に特異的な抗体のH鎖可変ドメインおよび／またはL鎖可変ドメインをコードする挿入物を含む組換え核酸にも関する。定義上、そのようなDNAはコード1本鎖DNA、前記コードDNAおよびそれに相補
的なDNAからなる2本鎖DNA、またはこれらの相補的（1本鎖）DNAを含む。

【０１０７】さらに、融合タンパク質に特異的な抗体のH鎖可変ドメインおよび／またはL鎖
可変ドメインをコードするDNAは、H鎖可変ドメインおよび／またはL鎖可変ドメインをコードする真正DNA配列、またはその突然変異体を有する酵素的または化学的に合成されたDNAであり得る。真正DNAの突然変異体は、1個以上のアミノ酸が欠失しているか、1個以上のその他のアミノ酸で置換されている上記抗体のH鎖
可変ドメインおよび／またはL鎖可変ドメインをコードするDNAである。好ましく
は、前記改変は、抗体のH鎖可変ドメインおよび／またはL鎖可変ドメインのCDR の外側にある。そのような突然変異体DNAは、サイレント突然変異体であることも企図され、その場合、1個以上のヌクレオチドが、同一アミノ酸をコードする新たなコドンを有するその他のヌクレオチドで置換される。そのような突然変異
体配列は縮重配列でもある。縮重配列は、無制限数のヌクレオチドがもともとコ
ードされるアミノ酸配列の変化が生じないようにその他のヌクレオチドで置換さ
れている遺伝子コードの目的内で縮重される。そのような縮重配列は、特定の宿
主、特にE.coliがH鎖マウス可変ドメインおよび／またはL鎖マウス可変ドメイン
の最適発現を得るのに好まれるその種々の制限部位および／または特定のコドン
の頻度により有用であり得る。

【０１０８】突然変異体という用語は、当技術分野で公知の方法による真正DNAのin vitro 突然変異誘発によって得られたDNA突然変異体を含むものである。完全テトラマー免疫グロブリン分子のアッセンブリーおよびキメラ抗体の発現
のために、H鎖およびL鎖可変ドメインをコードする組換えDNA挿入物を、H鎖およ
びL鎖定常ドメインをコードする対応するDNAと融合させ、次いで、例えばハイブ
リッドベクターへの組み込み後に適当な宿主細胞に移入する。

【０１０９】したがって、本発明は、ヒトγ定常ドメイン、例えばγ1、γ2、γ3またはγ4
、好ましくはγ1またはγ4に融合した本発明の融合タンパク質に特異的な抗体の
H鎖マウス可変ドメインをコードする挿入物を含む組換えDNAにも関する。同様に
、本発明は、ヒト定常ドメインκまたはλ、好ましくはκに融合した融合タンパ
ク質に特異的な抗体のL鎖マウス可変ドメインをコードする挿入物を含む組換えD
NAに関する。

【０１１０】別の態様においては、本発明は、H鎖可変ドメインおよびL鎖可変ドメインが、
宿主細胞において抗体のプロセシングを促進するシグナル配列および／または抗
体の精製を促進するペプチドをコードするDNAおよび／または切断部位をコードするDNAおよび／またはペプチドスペーサーをコードするDNAおよび／またはエフ
ェクター分子をコードするDNAを任意に含む、スペーサー基をコードするDNA挿入
物によって連結されている、組換えDNAをコードする組換えDNAに関する。

【０１１１】エフェクター分子をコードするDNAは、診断または治療的用途において有用なエフェクター分子をコードするDNAであることが企図される。したがって、毒素または酵素、特にプロドラッグの活性化を触媒する能力を有する酵素であるエフ
ェクター分子が特に望ましい。そのようなエフェクター分子をコードするDNAは、天然酵素または毒素コードDNAまたはその突然変異体の配列を有しており、当技術分野で周知の方法により調製することができる。

【０１１２】本発明の抗体および抗体フラグメントは、診断および治療上有用である。した
がって、本発明は本発明の抗体を含む治療または診断用組成物を提供する。診断組成物の場合、抗体は、抗体を検出するための手段とともに提供されるの
が好ましく、そのような手段は酵素的、蛍光的、放射性同位体的またはその他の
手段であり得る。抗体および検出手段は、診断用の診断キットにおいて、同時、
同時分離(simultaneous separate)または連続使用のために提供され得る。

【０１１３】Ｉ．NMR研究における使用本発明の融合タンパク質は極小融合パートナーを有する。その一つの利点は、
融合タンパク質を、得られるスペクトルが融合パートナーにより干渉されること
なくNMR実験において直接用いることができるということである。 NMR分析は、例えばK.Wurtrich, "NMR of Protein and Nucleic Acids", Wiley
, New York, 1986（これは参照により本明細書に含まれる）に記載されているよ
うに、当技術分野で公知の技術および方法にしたがって行われ得る。本発明を下記の実施例を参照することにより説明する。

【０１１４】一般操作タンパク質の過剰発現および細菌細胞破壊発現宿主E.coli C41(DE3)の一つの新たに形質転換したコロニーを500mlの2×T
Y培地に接種する。培養物の600nmにおける吸光度が0.6になったら、融合タンパク質の発現をIPTG（最終濃度0.7mM）を加えることにより誘導する。誘導後、増殖温度を25℃に低下させ、18時間培養を行った。次いで細胞を遠心分離によって
採取し、TEP緩衝液（10mMのトリス-HCl、pH8.0、1mM EDTA、および0.001％フェニルメチルスルホニルフロリド）に再懸濁し、フレンチ加圧セルを2回通すことによって破壊する。破壊した細胞を遠心分離する（60分、100,000×ｇ）。

【０１１５】 S-セファロース上での可溶性融合タンパク質の精製過剰発現タンパク質が細菌細胞質ゾルに可溶性である場合、遠心分離した破壊
細菌細胞の上清をTEP緩衝液中で平衡化したS-セファロースのカラムに加える。カラムに結合したタンパク質を塩化ナトリウムの直線グラジエント（0〜1M）で溶離させる。融合タンパク質の大部分は、約0.9Mの塩化ナトリウムで溶離するIf
-ADPIを除き、約0.5Mの塩化ナトリウムの塩濃度でカラムから溶離する。タンパク質の純度をSDS-PAGEで調べる。不純物が存在する場合、融合タンパク質を含む
適当な画分をNi-NTA樹脂（Quiagen社、Chatworth、CA91311、USAにより供給され
たもの。NTAはニトリロ-三酢酸である。）のカラム上に加える。

【０１１６】封入体を形成した融合タンパク質の精製 If-ε。E.coli C41(DE3)の破壊細胞の遠心分離により得られたペレットを、6M
の塩酸グアニジンおよび0.33Mの塩化ナトリウムを含むPBSに再溶解する。不溶性
物質を遠心分離（40,000g、10分）により除去し、融合タンパク質を逆相HPLCまたはNi-NTAカラムクロマトグラフィーにより、下記のようにして上清から精製す
る。 (a) 逆相HPLC。If-εの溶液を、0.1％のトリフルオロ酢酸水溶液中で平衡化した
Aquapore RP-300(Applied Biosystems；粒径７ミクロン、孔径330Å；内径10cm ×2.1mm）のカラムに加える。カラムを0.1％のトリフルオロ酢酸水溶液中のアセ
トニトリルの直線グラジエントにより溶出する（流量0.1ml/ml）。カラムからの
溶出物の吸光度を225nmで監視する。タンパク質は41％アセトニトリルでカラムから溶離した。 (b) Ni-NTAカラムクロマトグラフィー。6M-塩酸グアニジンに溶解したIf-εの試
料をn Ni-NTA樹脂（床容積2ml）のカラムに加える。カラムを0.33Mの塩化ナトリ
ウムを含むPBS中で平衡化する。カラムをまず5mMのイミダゾールを含むPBS(20ml
)で洗浄し、次いで50mMのイミダゾールを含むPBS（20ml）で洗浄することにより
If-εを溶離させる。225nmにおける吸光度を監視することにより溶出液中のタン
パク質を検出する。タンパク質の純度をSDS-PAGEにより確認する。 If-UCP270。このタンパク質（そのC末端にヒスチジン₆ タグを含む）はE.coli C
41(DE3)において発現され、細菌細胞質において封入体も形成する。培養物を遠心分離により採取し、細胞を0.3Mの塩化ナトリウムを含むPBS緩衝液に再懸濁する。細胞をフレンチプレスに2回通して非破壊細胞を低速遠心分離（2,000×g、1
0分）により除去する。封入体を遠心分離（10,000g、10分）により回収する。封
入体ペレットをタンパク質濃度が２mg/mlになるまでPBS緩衝液に再懸濁する。4m
lの懸濁液を遠心分離し（10分、10,000×g）、得られた封入体のペレットを緩衝
液A（0.1Mリン酸ナトリウム、0.01M トリス-HCl、8.0および6M 塩酸グアニジンを含む）に可溶化する。残留する不溶性物質を遠心分離（10,000×g、10分）により除去する。上清を、同一緩衝液中で平衡化したNi-NTA樹脂のスラリー2mlと混合する。このスラリーを室温で45分間攪拌し、次いで5mlのクロマトグラフィーカラムに注ぐ。カラムを10容量の緩衝液A、pH8.0、５容量の緩衝液B（8Mの尿素、0.1Mのリン酸ナトリウム、0.01Mのトリス-HCl、pH6.8）で連続して洗浄する
。融合タンパク質を、8Mの尿素、0.1Mのリン酸ナトリウム、0.01Mのトリス、pH4
.5を含む緩衝液C 4mlでカラムを洗浄することにより溶離させる。界面活性剤ラウリル-ジメチルアミンオキシド（LDAO；最終濃度1％）を溶出画分に加えて、下
記の緩衝液：1番目は0.15％のLDAOおよび4Mの尿素を含む緩衝液A、pH8.0；2番目
は0.15％のLDAOおよび0.5Mの尿素を含む緩衝液A、pH8.0；3番目は0.15％のLDAO を含む緩衝液A、pH8.0を用いて３つの連続透析工程（それぞれ3時間）で尿素を除去する。

【０１１７】 S-セファロースクロマトグラフィー後のNi-NTAカラム上での融合タンパク質の精
製融合タンパク質を含む画分をプールし、0.3Mの塩化ナトリウムを含むPBS緩衝液で予め平衡化したNi-NTA樹脂2mlとともに4℃で45分間インキュベートする。次
に混合物を10mlのクロマトグラフィーカラムに注ぎ、5mMのイミダゾールを含むP
BS緩衝液(20ml)で洗浄する。さらなるC末端Hisタグを持たない融合タンパク質を
50mMのイミダゾールを含む緩衝液で溶離させ、さらなるC末端Hisタグを有する融
合タンパク質を500mMのイミダゾールを含む緩衝液で溶離させる。融合タンパク質をPBS緩衝液に対して透析し、Amiconカラム3で限外濾過することにより濃縮す
る。

【０１１８】実施例１コイルドコイル融合発現ベクターの構築 pMW T7発現ベクター(Studierら, 1990; Wayら, 1990)を、IF₁ のアミノ酸44〜
84からなるコイルドコイル融合パートナーを含む融合タンパク質を発現するよう
に調節した。この終わりまでに、配列番号１に示したアミノ酸配列（開始ATG(Me
t)が先行するIF₁ のアミノ酸44〜84からなる）は、該配列をNde1制限部位にライ
ゲートすることによってpMW中のT7プロモーターの下流に連結される。IF₁ 配列の下流に切断可能なリンカーG S P K Lを挿入する。これはBamH1およびHindIII 制限エンドヌクレアーゼ部位を付与する。この配列はベクター構築に用いられる
逆プライマーの一部であり、ベクター内のBamHIおよびHindIII部位に対応する。

【０１１９】別のベクターを同一の様式であるが、別の切断可能なリンカー：G S I E G R （Xa因子により切断可能である）およびG S S L V P R G S G S（トロンビンにより切断可能である）を組み込むことにより構築する。図１、レーン１に融合パートナー＋切断可能なリンカーのみの発現を示す。発
現ベクターをE.coli C41(DE3)細胞に形質転換する（UK特許出願9614700.4；Miro
uxおよびWalker, 1996も参照されたい）。一つの形質転換体コロニーを、アンピ
シリン（100μg/ml）の存在下で500ml 2×TY培地に接種し、培養物のOD₆₀₀ が0.
6になるまで37℃で増殖させる。この段階で、培養物に0.7mM IPTGを加えることにより融合パートナー発現を誘導する。誘導の16時間後に細胞を採取し、SDS-PA
GE可溶化緩衝液に溶解する。培養物の7.5μlを等容量のSDS-PAGE緩衝液と混合し
、さらに精製することなく12〜22％SDS-PAGEゲル上に加える。次いでゲルをクー
マシーブルー83染料で染色する。

【０１２０】発現したポリペプチドは、細菌内の全細胞タンパク質の主要な構成成分として
目に見える。多用途ベクター(General utility vector) 種々のペプチドをルーチン的にクローニングし、発現させるのに用いることが
できる発現ベクターを得るために、上記のベクターをMCSおよびHisタグの付加に
よりさらに改変する。Hisタグは、ニッケルカラム上での融合タンパク質の単離を容易にするものであるが、IF₁ 44〜84配列自体が5個のHis残基を含むので厳密
には必ずしも必要ではない。

【０１２１】実施例２融合タンパク質の発現 E.coli F₁ F₀ ATPシンターゼのサブユニットaのアミノ酸１〜39および118〜15
5ならびにE.coli F₁ F₀ ATPシンターゼのサブユニットIのアミノ酸１〜13および
55〜75をコードする核酸配列を、実施例１に記載した発現ベクター内のIF₁ の44
〜84配列のGSPKL伸長部分上に直接クローニングすることにより融合ポリペプチドを発現させる。実験の結果を図１のレーン２〜５に示す。

【０１２２】発現ベクターをE.coli C41(DE3)に形質転換する。一つの形質転換体コロニーを500ml 2×TY培地にアンピシリン(100μg/ml）の存在下で接種し、培養物のOD₆ ₀₀ が0.6になるまで37℃にて増殖させる。この段階で、培養物に0.7mM IPTGを加
えることにより融合パートナー発現を誘導する。細胞を25℃の低温で培養し、誘
導の18時間後、またはIF₁ (44-84)-a(1-39)融合の場合には誘導の3時間後に遠心
分離によって細胞を採取する。培養物の7.5μlをさらに精製することなく12〜22
％SDS-PAGEゲル上に加える。次いでゲルをクーマシーブルー83染料で染色する。
発現したポリペプチドは、細菌内の全細胞タンパク質の主要な構成成分として
目に見える。

【０１２３】表1にはいくつかの融合タンパク質について行った発現実験の結果を示す。２つの場合、ラットミトコンドリア非結合タンパク質の一部との融合物を含むので
、Hisタグを用いてニッケルカラム上での単離をさらに促進させた。ウシF₁ F₀ A
TPシンターゼのεサブユニットとの２つの融合物は、代替の切断可能な配列、す
なわちXa因子およびトロンビンについての配列を用いて製造した。

【０１２４】全ての場合において、E.coli C41(DE3)細胞を上記のようにして形質転換し、タンパク質を可溶性状態で、または示したような封入体として細胞質ゾルから単
離した。封入体を6M-塩化グアニジウムまたは8M-尿素のどちらかに可溶化し、可
溶化後、遠心分離して膜および不溶性物質を除去する。可溶化タンパク質を含有
する上清を0.1％トリフルオロ酢酸中で平衡化した逆相HPLCカラム（C8 Aquapore
RP-300、７μm粒子、粒径300Å；内径10cm×2.1mm）上に注入し、アセトニトリ
ルの直線グラジエントで溶出した。溶離したペプチドを220nmにおける溶出物の吸光度を監視することにより検出し、それらをSDS-PAGEで分析する。

【０１２５】各場合において、融合タンパク質の質量を理論的手法で計算し、Perkin-Elmer
Sciex API III+ 三重四重極質量分析計を用いてエレクトロスプレーイオン化質
量分析法により実験的に測定した。精製タンパク質またはペプチド試料を水また
は0.1％トリフルオロ酢酸に溶解し、入口流れに導入して装置内に噴霧する。この流れは50％アセトニトリル水溶液からなっていた。スペクトルを質量範囲10〜
2,400で記録した（Molecular Biology, 第61巻: "Protain and Peptide Analysi
s by Mass Spectrometry": J.R.Chapman編集, Humana Press, 1996; M.Mannおよ
びM.Wilm(1995) Trends Biochem Sci. 20, 219-224を参照されたい）。計算値と
測定値の相関性は著しく、これはポリペプチドが合成操作中に全く破壊されてい
ないということを示すものである。

【０１２６】

【表１】

【０１２７】イタリック体の文字は余分のアミノ酸を示し、太文字はタンパク質の名称を示
し、カッコ内の太字の数字はタンパク質におけるペプチドの位置を示す。下記の
略語を用いた：インヒビター：F₁ F₀ -ATPシンターゼのウシインヒビター；Eca ：E.coli F₁ F₀ -ATPシンターゼのサブユニットa ；uncl:E.coli F₁ F₀ -ATPシンターゼのサブユニットI；OGCP:ウシミトコンドリアオキソグルタル酸担体；AA
C:ウシアデニンヌクレオチドトランスロケーター；UCPI:ラットミトコンドリア非結合タンパク質1；UCP2:ラットミトコンドリア非結合タンパク質2；ADPI：HIV
-TATタンパク質由来のペプチド；エプシロン：ウシF₁ F₀ -ATPシンターゼのサブ
ユニット；e:ウシF₁ F₀ -ATPシンターゼのサブユニット；IB:封入体；m:膜タンパク質；g:球状タンパク質；aa:アミノ酸；LDAO:ラウリルジメチルアミンオキシ
ド。

【０１２８】融合ペプチドの発現いくつかのランダムに選択したペプチドをコードする核酸cDNA断片をIF₁ 融合
物を含む発現ベクターにライゲートした。これらのベクターの発現を図２に示す
；操作は図1に報告した実験と同一であった。発現したペプチドを表2に示す。

【０１２９】

【表２】

【０１３０】実施例３融合タンパク質の精製ニッケルカラム図５にニッケルカラムおよび逆相HPLC法による本発明の融合タンパク質の精製
を示す。1/には封入体からのタンパク質の精製を示す：If-a1は封入体として発現し、6M塩化グアニジニウムを用いて可溶化し、図３のように逆相HPLCにより精
製する。If-UCP270融合タンパク質を尿素の存在下で可溶化し、LDAO界面活性剤の存在下でニッケルカラム上で精製する（詳細については「一般操作」を参照さ
れたい）。

【０１３１】 2/にはニッケルカラム上での３つの融合タンパク質If-UCP1P1、If-UCP2P2およ
びIf-UCP3P3の精製を示す。これらの融合物は細菌細胞質に可溶性であり、S-セファロース上での陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製し（「一般操作」
を参照されたい）、その後ニッケルカラム上でのアフィニティクロマトグラフィ
ーで精製する。全タンパク質試料を精製後にSDS-PAGEで分析する。ゲルはクーマ
シーブルー染料83で染色する。

【０１３２】したがって、ニッケルカラムは本発明の融合タンパク質を精製し得る便利で効
率的な手段を提供する。逆相HPLC 図３および４は、逆相HPLCによる本発明の融合タンパク質の精製を説明するも
のである（「一般操作」；表1も参照されたい）。

【０１３３】逆相HPLCにより単離されるポリペプチドは、封入体および6M塩化グアニジニウ
ムの0.1M トリスHCl、pH8.0に溶解した物質約150μgの状態で細菌宿主細胞から単離される。試料をHP 1090液体クロマトグラフを用いてAquapore RP300カラムに注入した。 If-I1、If-I2、If-a1およびIf-A3の精製を示す（表1も参照されたい）。

【０１３４】実施例４抗体の作製 E.coli F₁ F₀ -ATPシンターゼのaサブユニットの残基１〜39にリンカーGSPKL を介して融合されたIF₁ のアミノ酸44〜84を含む融合タンパク質を、抗F₁ F₀ -A
TPシンターゼ抗体を作製するためにウサギの抗原投与に直接用いる。免疫感作を確立された技術にしたがって行う（"Antibodies. A Laboratory Ma
nual", E.HarlowおよびD.Lane(1988)Cold Spring Harbor, U.S.Aを参照されたい
）。精製融合タンパク質（約１mg）を完全フロイントアジュバントの存在下でウ
サギに注射した。融合タンパク質0.5mgを不完全フロイントアジュバントに加えたもののブースター注射を、最初の注射の4週間後に行った。ウサギ血清から抗体を単離し、F₁ F₀ -ATPシンターゼのaサブユニットとの反応性について試験した。この方法により、選択されたポリペプチドに対する選択的結合能を有する抗体
が得られる。

【０１３５】実施例５融合タンパク質のNMRへの直接的適用融合タンパク質を、融合パートナーを分析されるポリペプチドから分離しない
こと以外は通常の技術にしたがってNMR分析にかける（K.Wurtrich, "NMR of Pro
teins and Nucleic Acids", Wiley, New York, 1986)。プロトンおよび¹³C NMR分析により所望のタンパク質の構造を確認する。関連のあるスペクトルは、融合パートナーのためにせいぜい最小のスペクトルピーク
を有する。

【０１３６】参考文献： Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Seidman, D.D., Smith, J.G., St
ruhl, J.A. & Struhl. K.(1987)。分子生物学における最新プロトコル（In Curr
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よびMarullo, S.(1991)。Escherichia coliにおけるヒトセロトニン5-HT1A受容体の機能的発現（Functional expression of the human serotonin 5-HT1A rece
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遺伝子発現用のマーカーとしての緑色蛍光タンパク質（Green fluorescent prot
ein as a marker for gene expression）。Science 263, 802-805。 Chapot, M.P., Eshdat, Y., Marullo, S., Guillet, J.G., Charbit, A., Stros
berg, A.D., Delavier-Klutchko, C.(1990)。Escherichia coliにおいて発現した３つの異なるβ-アドレナリン受容体の局在化および特性付け（Localization
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d in its absence）。J. Biol. 242, 408-421。 de Boerら, (1983) PNAS(USA) 80:21-25。 de Boer, P.A.J., Crossley, R.E. & Rothfield, L.I.(1988)。Escherichia col
iにおける分裂部位の正確な配置に関与する複雑な遺伝子座min Bの単離および特
性（Isolation and properties of min B, a complex genetic locus involved
in correct placement of the division site in Escherichia coli）。J. Bact
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based vector）。Gene 136, 337-340。 Dong, H., Nilsson, L. & Kurland, C.G.(1995)。増殖阻害およびリボソーム破壊を生じさせるEscherichia coliにおける遺伝子の根拠のない過剰発現（Gratui
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in segment 1 of gelsolin critical for actin binding）。EMBO J. 9, 4103-4
109。

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：141 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO フラグメント型：C-末端フラグメント起源生物名：Bos bovis 直接の起源クローン名：IF1 ATPアーゼインヒビター配列の特徴特徴を表わす記号：CDS 存在位置：1..141 配列配列番号：２配列の長さ：47 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１月７日（２０００．１．７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲（全文）

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲(全文)】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｇ０１Ｒ 33/24 5/10 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｇ０１Ｒ 33/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ミロウクス，ブルーノイギリス国シービー２２キューエイチケンブリッジ，ヒルズロード，メディカルリサーチカウンシルセンター, エムアールシーラボラトリーオブモレキュラーバイオロジー

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 a) コイルドコイル構造形成能を有する第1領域；および b) 目的のポリペプチド配列を含み、天然では第1領域とは関連のない第2領域を含む融合タンパク質。
【請求項２】第1領域と第2領域の間に切断可能なリンカー領域をさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】第1領域がタンパク質のN末端にあるか、N末端の近傍にある、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】目的のポリペプチド配列の長さが２〜100アミノ酸である、請求項１〜３のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】目的のポリペプチド配列が哺乳動物ホルモンである、請求項
１〜４のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】第1領域が、コイルドコイル構造形成能を有する４〜10個の７残基反復ユニットを含む、請求項１〜５のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】第1領域が、ウシIF₁ ATPアーゼインヒビタータンパク質の全
部または一部を含む、請求項１〜６のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】請求項１〜７のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項９】プロモーターに機能的に連結された請求項８の核酸を含む発
現ベクター。
【請求項１０】宿主細胞における第1核酸配列発現能を有するプロモーターに機能的に連結されたコイルドコイル構造形成能を有するポリペプチドをコー
ドする第1核酸配列、ならびに該核酸配列に連結された、第1核酸配列との融合物
において発現する能力を有するように第2核酸配列を挿入することが可能なクローニング部位を含む発現ベクター。
【請求項１１】請求項９または請求項１０に記載の発現ベクターで形質転
換された宿主細胞。
【請求項１２】 (i) 請求項１１に記載の宿主細胞を形質転換すること、こ
こでこの方法は宿主細胞内で発現ベクターから融合タンパク質の発現を生じさせ
る条件下で宿主細胞を培養することを含み；そして (ii) 融合タンパク質を回収することを含む融合タンパク質の調製方法。
【請求項１３】宿主細胞がE.coliである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】発現ベクターがバクテリオファージT7プロモーターを含む
、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】融合タンパク質が第1領域と第2領域との間にプロテアーゼ
切断可能なリンカー領域をさらに含み、その方法がプロテアーゼ切断可能なリン
カーでタンパク質を切断して第2領域を回収することをさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】請求項１２〜１５のいずれか1項に記載の方法により調製されたポリペプチド。
【請求項１７】コイルドコイル構造形成能を有するポリペプチドの、融合
タンパク質の構築における融合パートナーとしての使用。
【請求項１８】融合タンパク質が請求項１〜７のいずれか1項に記載の融合タンパク質である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】 NMR研究における請求項１〜７のいずれか1項に記載の融合
タンパク質の使用。
【請求項２０】 a) 請求項１〜７のいずれか1項に記載の融合タンパク質で
動物を免疫感作する工程、ならびに b) 動物の血清から融合タンパク質の領域に特異的な免疫グロブリンを回収する工程を含む、免疫グロブリンの調製方法。