JP2001509135A

JP2001509135A - 混合リンパ球と組み合わせた腫瘍細胞を用いるガン免疫療法

Info

Publication number: JP2001509135A
Application number: JP51780398A
Authority: JP
Inventors: シー．ハイザーロード，ジョン; エイ．トンプソン，ジェイムズ; エイ．グランジャー，ゲイル
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1996-10-11
Filing date: 1997-10-10
Publication date: 2001-07-10
Also published as: AR004445A1; NO991691D0; EP0930887A2; DE69718029T2; KR20000049096A; AU4824297A; NO991691L; ATE229810T1; CA2267157A1; AU743855B2; DE69718029D1; US6207147B1; CA2267157C; CN1237909A; BR9712988A; EP0930887B1; WO1998016238A3; WO1998016238A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、特にヒトにおいて、細胞性ワクチンおよびそれらをガン免疫治療において使用する方法を含む。このワクチンは、腫瘍関連抗原の供給源とともに、処置される被検体に対して同種の刺激されたリンパ球を含む。同種リンパ球は、それを処置されるべき被検体または別の第三者のドナーから得られた白血球と合わせるかまたは同時培養することにより刺激され得る。腫瘍抗原は、被検体から調製された初代腫瘍細胞、腫瘍細胞株、または腫瘍抽出物の形態で提供され得る。刺激された同種リンパ球および腫瘍抗原は組み合わされ、そして全身性細胞性抗腫瘍免疫応答をプライムまたは追加免疫するために、初代腫瘍から遠位部位に投与される。このアプローチは、腫瘍抗原による刺激、宿主応答の生成、および臨床的結果の強力な改善に対する免疫系の天然の免疫性の性質を克服する。

Description

【発明の詳細な説明】混合リンパ球と組み合わせた腫瘍細胞を用いるガン免疫療法関連出願の参照本出願は、1996年10月11日に出願された米国特許仮出願第60/028,548号（本明細書によってその全体が本明細書中に参考として援用される）の優先権の利益を請求する。発明の分野本発明は、一般的に細胞性免疫学およびガン治療の分野に関する。より詳細には、不活化腫瘍細胞および混合リンパ球培養物において生成され得るような、刺激された免疫細胞を含む細胞性ワクチンの投与による被験体（特にヒト）における抗腫瘍免疫応答の生成に関する。背景医学的研究の夥しい進歩にもかかわらず、ガンは先進諸国にわたって主な死亡原因のままである。手術、放射線療法、および一般化された化学療法のようなガン処置の非特異的なアプローチが、循環し、かつゆっくり増殖する固形腫瘍の選択的な群の管理において成功している。しかし、多くの固形腫瘍は、このようなアプローチにかなり耐性であり、そしてこのような場合の予測は相応して重篤である。一つの例は脳腫瘍である。毎年、高いグレードの星細胞腫の約15,000の症例が、合衆国において診断される。その数は、小児および成人の両集団において増加している。標準的処置は、細胞減少性手術、続いて放射線療法または化学療法を含む。治療方法がなく、そして事実上全ての患者は、最終的に疾患の再発または進行に屈服する。グレードIV星細胞腫（グリア芽細胞腫多形）の全般の生存率は乏しく、診断後の１年以内に約50％の患者が死亡する。これらの腫瘍は侵襲性でありかつ標準的な処置に非常に耐性であるので、新しい治療が必要である。ガン処置の新生の領域は免疫療法である。その一般的な原理は、処置されている被験体に拒絶応答（特に悪性細胞に対して）に影響するかどうかをマウントする能力を与えることである。開発中の多数の免疫学的研究が存在し、それらは以下を含む：１.種々の種類の刺激された自己の細胞を用いる養子免疫療法；２.同種リンパ球の全身的導入；３.免疫的反応細胞の腫瘍内移植；および、4.全身性腫瘍特異的免疫応答を生成するための離れた部位でのワクチン化。上記に列挙したストラテジーの第１である養子免疫は、エキソビボで細胞を刺激し、次いで患者へ再投与することによって増強された免疫性のレベルを患者に提供することを指向される。その細胞は、被験体に対して組織適合性であり、そして一般的に以前の自己の提供(donation)から得られる。１つのアプローチは、自己のリンパ球を、それを腫瘍特異性にする腫瘍関連抗原でエキソビボで刺激することである。Zarlingら(1978)Nature 274:269-71は、インビトロでヒトの自己の白血病細胞に対する細胞傷害性リンパ球を作製した。 Leeら(1996)要約，Gastroenterologyは、不活性化白血球幼若細胞および自己のリンパ球でインビトロ混合リンパ球培養物を処理し、そして自己の幼若細胞上の腫瘍抗原に対して細胞傷害性であるエフェクターＴ細胞を作製した。MHC D位の非適合性は、リンパ球培養物中に適切な補助を提供する必要性があると考えられた。Leshamら(1984)Cancer Immunol.Immunother．17:117-23は、同系感作によってマウス胸腺腫細胞に対してインビトロでの細胞傷害性応答を開発した。 Gatelyら(1982)J.Natl.Cancer Inst.69:1245-54は、9のヒトグリア細胞腫細胞株の5つが、エキソビボでの培養物において異種細胞傷害性リンパ球応答を惹起しないことを見出した。しかし、不活化異種リンパ球が培養物において刺激細胞として提供された場合、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球および非特異的非Ｔエフェクターは、非刺激株のうち４つが生成された。米国特許第5,192,537号において、Osbandは、腫瘍患者単核細胞を腫瘍細胞抽出物および非特異的アクチベーター（例えば、植物性血液凝集素またはIL-1）の存在下で、エキソビボで培養することによって活性化し、次いでサプレッサー細胞活性を枯渇させるために培養物を処理することを示唆した。これらの実験的観察にも関わらず、エキソビボ刺激自己腫瘍特異的リンパ球の全身投与は、標準的ガン治療の一部とならなかった。自己リンパ球およびキラー細胞はまた、非特異的に刺激され得る。１つの例では、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性反応を媒介し得るFcレセプター発現白血球は、IL-2およびIFN-γの組み合わせと培養することによって生成される（米国特許第5,308,626）。別の例では、IL-2中で培養された末梢血由来リンパ球は、広範な新生物細胞に対して細胞溶解性であるが、正常細胞に対しては細胞溶解性ではないリンホカイン活性化キラー(LAK)細胞を形成する。LAKは、主にCD56抗原を発現しているが、CD3を発現していないナチュラルキラー細胞に由来する。このような細胞は、プラスチックへのIL-2誘導化接着によって末梢血リンパ球から生成され得る（A-LAK細胞；米国特許第5,057,423号を参照のこと）。高用量IL-2と組み合わせて、LAK細胞は、転移ヒト黒色細胞腫および腎細胞腫の処置においていくらか成功している。Rosenberg(1987)New Engl.J.Med．316:889-897。このストラテジーは、労力を要し、費用がかかり、そして全ての患者に適しているわけではない。Schwartzら(1989)Cancer Res．49:1441-1446は、A-LAK細胞が、実験動物モデルにおいて乳癌の肺転移および肝臓転移の減少においてLAK細胞より優れていることを示したが、これは治癒的ではなく、そして長期間の生存しなかった。脳腫瘍の処置におけるLAKを用いて処理された試行の例として、Merchantら(19 88)Cancer 62:665-671および(1990)J.Neuro-Oncol．8:173-198；Yoshidaら(1988 ) Cancer Res．48:5011−5016；Barbaら(1989)J.Neurosurg．70:175-182；Hayesら (1988)Lymphokine Res．7:337-345;ならびにNaganumaら(1989)Acta Neurochir.( Wien)99:157-160を参照のこと。別の研究は、自己のマイトジェン活性化およびI L-2刺激(MAK)キラーリンパ球をIL-2と組み合わせて用いる、再発高グレード神経膠腫に対する治療を提案する。Jeffesら(1991)Lymphokine Res.10:89-94。重篤な臨床的合併症と関連したこれらの試行はないが、有効性は逸話的(anecdotal) であるかまたは一過的だけであった。このような処置を受けた患者における腫瘍特異的免疫性の誘導は示されていない。自己の細胞を用いる養子療法の別の形態は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を用いた観察に基づいて提案されている。TILは、腫瘍内へ浸潤するリンパ球集団を収集し、それらをIL-2とエキソビボで培養することによって得られる。Finkeら(1990 )Cancer Res．50:2363-2370は、ヒト網膜細胞腫においてCD4+およびCD8+TILの細胞溶解性活性を特徴づけている。TILは、LAK細胞より優れた活性および腫瘍特異性を有し、そして、例えば、進行した黒色腫を有するヒトに実験的に投与されている。Rosenbergら(1990)New Eng.J.Med323:570-578。TIL内のエフェクター集団は、宿主において腫瘍特異性をプライムし、溶解性顆粒を欠き、そして培養において刺激された場合、細胞溶解性リンパ球へ変換される細胞傷害性Ｔリンパ球(C TL)であり得る。Berkeら(1988)J.Immunol．129:303 ff。不幸なことに、TILは限られた数の腫瘍タイプに臨床的に関連した充分な量で調製され得るのみである。これらのストラテジーは、特にヒトの治療において実験的なままである。先に列挙したガン免疫療法の第２のストラテジーは、同種間リンパ球の養子移入である。この実験的ストラテジーの理論的根拠は、免疫刺激の一般的レベルを作製し、それによって宿主免疫系の腫瘍を拒絶することから妨害するアネルギーを克服することである。Strausserら(1981)J.Immunol．第127巻，No.1は、インビトロでアロ抗原に感作された自己の細胞によるヒト固形腫瘍の溶解を記載している。Zarlingら(1978)Nature 274:269-71は、ヒト抗リンパ腫が、同種白血球での感作に従ってインビボで応答することを示した。Kondoら(1984)Med Hypothesi s 15:241-77は、患者の20〜30％がこのストラテジーの目的の応答を観察し、そしてその効果をサプレッサーＴ細胞の枯渇の結果であるとした。この研究は、汎発するかまたは循環する疾患を有する患者に対して実施された。これらの初期の研究は10年前から行われているにもかかわらず、このストラテジーは、特に固形腫瘍の処置について一般的な容認を得られていない。先に列挙したガン免疫療法の第３のストラテジーは、腫瘍内移植である。これは、エフェクター細胞を直接作用部位へ送達することを指向するストラテジーである。移植された細胞は循環しないので、これらは宿主に組織適合性である必要はない。同種細胞の腫瘍内移植は、移植細胞の腫瘍に対して反応する能力を促進し得、そして強力な移植片対腫瘍応答を開始し得る。 Kruseら(1990)Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．87:9557-9581は、同種細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)のFischerラットにおいて増殖している脳腫瘍への腫瘍内移植がリンパ球の多の集団（同質遺伝子CTL、LAK細胞、接着LAK細胞、またはIL-2単独を含む）を超える顕著な生存的利点を生じることを示した。Reddら(1992)Canc er Immunol.Immunother．34:349-354は、ラットにおいて同種脳腫瘍に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球を開発した。このリンパ球は、腫瘍によってのみ発現される決定基に特異的であり、そしてインビボでの治療目的に有用であると予想された。Kruseら(1994)J.Neurooncol．19:161-168は４つのMHC非適合性ラット系統由来のCTLを調製し、そしてそれらを確立された9L脳腫瘍を有するFischerラットを処置するために使用した。CTLは隔週計画で、各時間で投与される異なるMHC非適合性CTL調製物で投与された。腫瘍を有さない動物は、最小限の局在化した脳損傷を示した。腫瘍を有する動物は、以下のいずれかを示した：a)単核細胞浸潤、処置の２〜４日後の大量の腫瘍壊死、および15日での全腫瘍の崩壊；またはb)細胞性浸潤、初期腫瘍崩壊、次いで動物の死まで進行する腫瘍再増殖。腫瘍抑制動物は、生存腫瘍細胞による頭蓋内再チャレンジに耐性であった。Kruseら(1994) 。腫瘍内CTL移植物は、必要に応じてシクロホスファミドを用いる化学療法と組み合わされ得る。Kruseら(1993)J.Neurooncol．15:97-112。腫瘍内移植技術の有望さにもかかわらず、いくつかの警告がある。１つには、移植はしばしば外科的技術により実施され、それは、日常的維持にとっては浸襲的過ぎ得る。さらに、この戦略は、局所応答の生成を指向し、一般に、転移に対する保護に必要である全身応答の生成を指向しない。先に列挙した第４の免疫療法戦略は、宿主起源の活性な全身腫瘍特異的免疫応答の生成である。この応答は、腫瘍から遠く離れた部位でワクチン組成物を投与することにより患者自身の免疫系から惹起される。結果として宿主中に惹起された特異的抗体または免疫細胞は、願わくば腫瘍に移動し、次いで腫瘍細胞が身体内のどこにあれ、それを根絶する。単離された腫瘍抗原ワクチンおよび抗イディオ型ワクチンを含む、種々の型のワクチンが提案されている。Mitchellら(1993)Ann．N.Y．Acad．Sci．690:153-1 66は、アジュバントDETOX^TMと組み合わせた、複数の同種異系(allogenic)の黒色腫細胞株からの機械的溶解液で癌患者を処置した。これらのアプローチはすべて、関連した組織型の腫瘍がすべて共通の腫瘍関連抗原を共有するという前提に基づいている。悪性変態の間に抗原の発現を得なかったか、またはそれを発現しないように続いて分化した腫瘍を持つ患者には、これらのワクチンは、成功しない。抗腫瘍ワクチンに対する別のアプローチは、処置されるべき被験体からの腫瘍細胞、またはこれら細胞の誘導体を用いることである。総説として、Schinmache rら(1995)J．Cancer．Res．Clin．Oncol．121:487-489を参照のこと。米国特許第5,484,596号、Hanna Jr.らは、再発または転移を防ぐための切除可能な癌腫を処置する方法を請求の範囲に記載し、この方法は、腫瘍を外科的に除去する工程、細胞をコラゲナーゼで分散する工程、細胞を照射する工程、および患者を約10⁷ 細胞の少なくとも３回の連続する用量でワクチン化する工程を包含する。必要に応じて、細胞は低温保存され得、そして免疫系は、皮膚試験によりモニターされ得る。このアプローチは、多くの腫瘍が自然には免疫原性ではないという良く確立された観察を解決しない。腫瘍が切除された多くの患者は、たとえワクチン調製物中に含まれていたとしても、それら自身の腫瘍抗原に耐性であるか、それに応答し得ない。潜在的に免疫原性を増大させる自己または同系の腫瘍細胞を調製するいくつかの方法が現れ出た。腫瘍細胞は、バチルスCalmette-Guerln(BCG)またはA60ミコバクテリア抗原複合体の抽出物と組合せられ得るか、またはワクシニアウイルスまたはニューカッスル病ウイルス(NDV)と混合され得る。Guoおよび共同実験者は、(WO 95/16775)は、腫瘍細胞がより大きな免疫原性能力を有するＢ細胞のような第２の膜成分と融合され得ることを示唆した。なお別のアプローチでは、自己または同系腫瘍細胞が遺伝子的に改変されて同時刺激分子を生成する。同時刺激分子の例は、B7-1同時刺激分子または同種異系組織適合性抗原のような細胞表面レセプターを含む。他の例は、サイトカインを含む分泌されたアクチベーターである。総説として、Pardollら(1992)Curr．Opi n．Immunol．4:619-23；Saitoら(1994)Cancer Res．54:3516-3520；Viewegら（1 994）Cancer Res．54:1760-1765；Gastlら(1992)、Cancer Res．52:6229-6236；およびWO 96/07433を参照のこと。腫瘍細胞は遺伝子的に改変されて、TNF-α、I L-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IFN-α、IFN-γおよびGM-CSFを産生する。例えば、Santinら、Gynecol．Oncol．58:230-239、1955b；Int．J．G ynecol．Cancer 5:401-410、1995c；Am J．Obst．Gynecol．174:633-639、1996 。 Golumbekら(1989)は、IL-4遺伝子が挿入されたマウス腎癌腫細胞が、全身Ｔ細胞免疫について強く免疫原性であって、次の改変されていない親の腫瘍細胞の致死投与に対してマウスを保護したことを報告した。Cavalloら、1991＆1992。抗腫瘍免疫は、GM-CSFおよびIL-4の両方を産生する癌ワクチンにより強化される。 Wakimotoら(1996)Cancer Res．56:1828-33。サイトカインまたはサイトカインの組合せは、免疫系の細胞を補充または刺激し、そしてそれによって免疫に対する正常なバリアを圧倒する。特定のサイトカインはまた、癌細胞による主要組織適合性分子および細胞内アドヒロン(adheelon)分子の発現に影響し(Santinら、199 5a、Int．J．Cancer 65:688-694；Santin（1996）Am．J．Obst．Gynecol)、免疫原性を改善している可能性がある。サイトカイン分泌性組織適合性腫瘍細胞を用いた実験は、遺伝子的に制限された動物モデルで主になされており、それは異質なヒト患者集団に直接等価ではない。Colomboら(1995)Cancer Immunol．Immunother.41:265-270。すべての癌型が同じサイトカインに応答性であるわけではない。特に遺伝子改変後の、複製能力のある腫瘍細胞をもつヒト患者に注入することに関心がある。さらに、通常、ワクチンにおける使用のために処置されるべき患者の十分な細胞を遺伝子的に改変および生長させるに十分な時間はない。 Blumbach(WO 96/05866)は、以下で形質導入された生存腫瘍細胞のワクチンを示唆した：a)免疫刺激タンパク質をコードする遺伝子；b)サイトカイン；および c)チミジンキナーゼ遺伝子。この組成物は、インビボで増殖し得る生存細胞として提供され、そして応答を刺激し、次いでチミジンキナーゼを介して選択的に殺される。逃れる変異体の可能性は、ヒト治療におけるこのアプローチにとって調整事項の主題である。Golumbek(1992)J．Immunother．12:224-230らは、自殺遺伝子をともなう増殖腫瘍細胞もまた、それらが細胞周期を一時的に出るとき、または薬理学的に隔絶されるとき、トキシン処理を生存し得る。その代わりとして、Cohen(WO 95/31107)は、新形成疾患は、遺伝子的に改変されて１つ以上のサイトカインを発現し、そしてまた自己ゲノム腫瘍DNAによりコードされる腫瘍関連抗原を発現する同種異系細胞を含む細胞の免疫原で処理され得ることを示唆した。このアプローチでは、同種異系細胞(マウスLM細胞として例示される)が遺伝子的に改変されて、a)サイトカイン；およびb)処置されるべき被験体に対して自系である腫瘍関連抗原を発現する。従って、ワクチンは、生存腫瘍細胞を含む必要はない。しかし、ヒト患者に対するCohenの発明の適用は、特定の腫瘍によって発現される特定の腫瘍関連抗原の各患者の従前の知識を必要とする。広く広がった臨床目的の多くのヒト癌は、信頼し得る一般に共有されるマーカーを持っていない。特定の患者について、関係するマーカーが同定されるなら、従って細胞株が操作され、そして処置の前に必要とされる密度に培養されなければならない。従って、各患者は、それら自身の研究開発プロジェクトになる。免疫応答は、用いられる特定の腫瘍関連抗原にのみ集中されるので、完全な腫瘍細胞により発現される抗原スペクトルに対して向けられるものより有効ではない。さらに、このワクチンは、遺伝子的に改変された生存細胞を含み、先に概説された懸念を生じる。Co henは、動物研究では、最も控え目な改良が生存し、そしてヒト癌患者で彼の処方物が有効である任意の証拠を提供しなかった。ヒト抗腫瘍細胞ワクチンに対する適切な戦略は、以下の問題を意図しなければならない：a)腫瘍関連抗原の呈示における腫瘍間の異質性(同じ型の腫瘍でさえ) ；b)抗原およびサイトカインの両方に関する個体間の免疫応答の異質性；c)ヒトで用いられる得る組成物のついての倫理的および規制事項；ならびにd)大部分の臨床設定における開発時間の欠如が、新規細胞株を操作するかまたはそうでなければ各患者に対するワクチンを仕立てる能力を制限すること。発明の要旨本発明は、抗腫瘍免疫応答を、その必要があるヒト患者において惹起するための組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、生理学的に適合する賦形剤中の細胞混合物であり、そして本明細書中で、ワクチンまたは免疫原性組成物と称される。それらは、臨床的に検出され得る腫瘍を処置するかまたは軽減するため、または予防、特に先に検出された腫瘍の外科的切除(debulking)、化学療法または放射線照射療法後の予防のために患者に投与され得る。代表的には、この組成物は、原発性腫瘍および転移に対する全身の反応性を刺激する目的で、起源腫瘍から離れた部位で投与される。この反応性は、次いで、腫瘍細胞の進行を、原発部位か、(存在するとき)転移内、またはその両方で退縮または遅延させる。本発明のワクチンは、最小限、２つの成分を含む。第１は腫瘍抗原の供給源であり、好ましくは、患者がその危険にある癌に関連する複数の抗原である。腫瘍関連抗原の簡便な供給源は、外科的切除の間にのような、患者から先に得られた腫瘍細胞である。第２の成分は、患者の免疫系の刺激に参加し、抗腫瘍応答を生成し得る刺激されたリンパ球集団である。特に、刺激されたリンパ球集団は、患者に対して同種異系であるリンパ球を含む。好ましくは、それらは、患者から、または応答細胞に寄与するドナーに対して同種異系である第２の第三者ドナーから得られた白血球のような刺激細胞とエクスビボで同時培養することにより予備活性化される。本発明に含まれる組成物は、複数の刺激細胞または応答細胞、または両方を含み、この刺激細胞は、培養において応答細胞を同種異系活性化(all oactivating)する組成物である。本発明の実施態様は、癌の処置用の組成物を含む。１つ実施態様は、処置されるヒトまたは他の被験体への投与のために適切な細胞ワクチンであり、薬学的にまたは生理学的に適合する賦形剤中の以下の成分の有効な組合せを含む：a)ヒトからまたは第三者ドナーからの白血球、b)この白血球に対して同種異系であって、そして好ましくはこれらに対して同種異系活性化された白血球：およびc)不活性化腫瘍細胞集団であって、上記ヒトから得られた原発性腫瘍細胞、そのような細胞株細胞の子孫、またはそれらの組合せのいずれかからなる集団。第１の成分は、同種異系リンパ球が混合物中に含まれる前に、別に刺激される場合には必要に応じて含まれる。上記の不活性化腫瘍細胞は、腫瘍細胞ホモジネート、界面活性剤溶解液、または単離されたタンパク質のようなそれらの精製された誘導体のような腫瘍関連抗原の代替供給源により置き換えられ得る。好ましくは、上記の不活性化腫瘍細胞集団は、上記ヒトから切除された固形腫瘍から分散された原発性腫瘍細胞から本質的になり、そして神経膠腫(glioma)細胞、グリア芽細胞腫細胞、神経膠肉腫細胞、神経膠星状細胞腫細胞、および卵巣癌細胞からなる群から選択され得る。他の実施態様では、白血病およびリンパ腫を含むがそれらに制限されない非固形腫瘍が用いられ得る。代表的には、同種異系リンパ球は、適切なドナーの末梢血から単離され、そして、必要に応じて遺伝子的に改変され、増大したレベルで、サイトカイン(特にI L-2、IL-4、GM-CSF、TNF-αまたはM-CSF、またはそれらの任意の組合せ)を発現し得る。好ましい実施態様では、白血球およびリンパ球は、上記腫瘍細胞集団との組合せの前に、リンパ球の同種異系刺激または増殖のために十分な条件下で、所定期間同時培養される。本発明はまた、単位投与量またはキット形態にある本発明のワクチンおよび免疫原性組成物を具現化する。また本発明の任意の組成物を生成する方法が具現化され、この組成物は、処置されるべき被験体由来の白血球を、同種異系のリンパ球と同時培養すること、および/または刺激された同種異系リンパ球を、被験体由来の原発性腫瘍細胞、子孫、または腫瘍抗原と組合せることを含む、組成物の種々の成分を調製または混合する工程を包含する。抗腫瘍免疫学的応答、特に細胞応答を誘導、促進、またはそうでなければ刺激するための、または癌のような新形成疾患を処置するための方法もまた具現化され、本発明の組成物またはワクチンの任意の１つを投与する工程を包含する。さらなる実施態様は、抗腫瘍免疫学的応答を誘導、促進、もしくはそうでなければ刺激するための、または新形成疾患をそのような処置を必要とするヒトにおいて処置するための方法であり、a)腫瘍関連抗原(特に腫瘍細胞集団)を、上記ヒトに対して同種異系である刺激されたリンパ球を含む第２の細胞集団とインビトロで一緒に混合する工程；およびb)上記ヒトに、免疫原性量の上記細胞混合物を投与する工程を包含する。上記具現化される方法の１つにより刺激された免疫原性応答は、一次応答または二次応答であり得、そして上記ヒトは、必要に応じて、上記ヒトの固形腫瘍中か、または固形腫瘍またはその部分の除去により形成された上記ヒト中の腔中への、同種異系リンパ球の投与により、先に処理され得る。好ましくは、上記腫瘍細胞集団は、上記ヒトから得られる原発性腫瘍細胞、または上記ヒトから得られる原発性腫瘍細胞由来の腫瘍細胞株であって不活性化されている細胞株を含む。特定の実施態様では、第２の細胞集団はまた、上記ヒト由来の白血球を含み、好ましくはこれは不活性化され、そして、代表的には、末梢血から単離される。好ましくは、上記白血球およびリンパ球は、腫瘍細胞に添加する前に、所定の期間、リンパ球の同種異系刺激に、または上記腫瘍細胞集団との組合せの前の、リンパ球の増殖のために十分な条件下で、同時培養される。特定の実施態様では、患者からのリンパ球が代わりにまたは追加して遺伝子的に改変されて増大したレベルでサイトカインを発現する。図面の簡単な説明図１は、９人の異なる患者において、２、４、または６×10⁹細胞(それぞれ、パネルＡ，Ｂ、およびＣ)で腫瘍内移植した後の種々の時間で、磁気共鳴造影(MR I)により測定した相対的腫瘍サイズを示す３つのパネルのグラフである。移植細胞は、自己および同種異系白血球の混合リンパ球培養から得た。下に向かって傾斜した線は、腫瘍塊において進行する現象の指標であり、一部、この移植の結果生じる局所免疫学的反応による。図２は、確立されたIL-4分泌腫瘍細胞株に対する照射の効果を示す３つのパネルのグラフである。パネルＡは、5,000(□)または10,000(■)ラドを与えた細胞の増殖パターンを示す。パネルＢおよびＣは、照射後種々の時間の培養培地中の ELISAにより検出されるIL-4を、総濃度(パネルＢ)または細胞あたり(パネルＣ) で表して示す。図３は、Balb/cマウスにおけるJ588Lリンパ腫細胞を用いた２次抗原投与に耐性を提供することに対し、異なる同種異系活性化したリンパ球調製物の効果を示す棒グラフである。同系の脾細胞かまたは特定の第三者脾細胞のいずれかで刺激された同種異系細胞の両方が効果的である。図４は、マウスリンパ腫モデルにおいて生存時間に対する異なる細胞培養比の効果を示す棒グラフである。図５は、４つの異なるアッセイで測定したとき、異なるヒト同種異系活性化した細胞調製物における機能的活性の程度を示す棒グラフである。図６は、ヒト同種異系活性化された細胞調製物による、サイトカインIL-2およびIFN-γの分泌レベルを示す棒グラフである。図７は、複数の異なる刺激細胞を用いることによるヒトリンパ球の同種異系活性化の増強を示す棒グラフである。図８は、応答/刺激細胞の比に依存する、異なるヒト同種異系活性化細胞調製物の機能的活性の程度を示す棒グラフである。図９は、ヒト細胞の培養；応答体単独、刺激体単独、または10：１の応答体/ 刺激体比の混合培養中への20μg/mLのヒスチジン(濃い影)またはシメチジン(薄い影)を含めることの効果を示す棒グラフである。図１０は、混合リンパ球培養細胞および自己腫瘍細胞の組合せでワクチン化したヒト患者のハーフトーンで再生した写真であり、４つの注入部位における即時超感度反応を示す。用量は以下の通りである：100×10⁶細胞(右上)；50×10⁶細胞(左上)；25×10⁶細胞(右下)；10×10⁶細胞(左下)。図１１は、同じヒト患者の２日後に撮ったハーフトーンで再生した写真であり、４つの注入部位における遅延した超感度反応を示す。この反応は、この患者が、ワクチン組成物の成分に反応していることを確証する。詳細な説明本発明の細胞ワクチンの中心となる特徴は、宿主内に入ると協調して作用し、所望の効果を生成する複数成分の使用である。換言すれば、この戦略は、養子免疫移入に他ならない。このワクチンの１つの成分は腫瘍抗原であり、好ましくは、処置されるべき患者の腫瘍により共有される複数の腫瘍関連抗原を発現する癌細胞の形態で提供される。先に確立された腫瘍細胞株がこの目的のために用いられ得るが、外科的切除、生検、血液サンプリング、または他の適切な技術のいずれかにより、処置されるべき患者から得られる細胞を用いるのが特に簡便である。他の成分は、活性化されている(または活性化され得る)、そして結果として宿主中で増大した免疫応答を刺激し得るリンパ球を含む細胞の混合物である。特定の好適な実施態様では、この細胞混合物は、処置されるべき被験体から得られる細胞を用いて刺激された同種異系細胞の混合リンパ球培養である。この戦略は、ヒトにおける癌免疫療法に対する以前のアプローチから顕著に離れている。刺激されたリンパ球は、実験的ヒト治療で用いられているが、養子療法の一部としてであり、リンパ球は、当初は被験体または緊密に適合したドナーから得られたものである。本発明では、刺激されたリンパ球は、被験体に対して同種異系である。刺激されたリンパ球は、同時に注入された腫瘍関連抗原に対する応答を惹起する潜在的な免疫刺激を提供する。結果として、この腫瘍に対して特異的である細胞免疫応答が生じ、そして単に患者の腫瘍細胞またはその誘導体を投与することにより達成され得るよりかなり強力である。本発明は、腫瘍床中に直接移植された混合リンパ球が腫瘍増殖を制限または後退さえさせるという観察と組合せて開発された。これらの実験およびこれらから得られた観察は以下の実施例１、および米国特許出願第08/406,388号の一部継続出願である、同一人により所有される同時係属中の米国特許出願第08/616,880号に記載され、この両方は、本明細書によって、本明細書中に参考として援用される。腫瘍塊に対する効果は、少なくとも部分的には、宿主起源の活性な免疫学的反応に起因しているようである。１人の患者では、たとえ広範な腫瘍壊死の組織学的証拠が存在したとしても、残存する同種異系リンパ球の証拠はなかった。さらに、この効果は、長期間継続するようである。１つの移植を受けた幾人かの患者は、数年間続いたそれらの症状の解決を経験した。移植物中の同種異系リンパ球により刺激された移植抗原の増加した発現が、腫瘍部位近傍のリンパ系細胞の確実な漸贈を生じたと仮定された。局所の、移植物-対-腫瘍、移植物-対-宿主、宿主-対-移植物、またはこの種の反応の特定の組合せのいずれかが生成され、そしてそうでなければ貧弱な免疫原性腫瘍抗原に対する免疫学的ウインドウが開放され、細胞仲介抗腫瘍免疫応答を開始した。移植プロトコルおよび種々のタイプのガンについての動物モデルが開発されている。転移性ガンのモデルとして、MADB 10⁶L^-1乳ガン細胞株を用いて、Fisher 344ラットの正中肝葉に原発性腫瘍を点滴注入した。一旦腫瘍が充分に樹立されたら、これらに、１：１の比で予め培養された同系スティミュレーターリンパ球および異系レスポンダーリンパ球を移植した。処置された動物は、生存腫瘍細胞を与えたが移植しなかった動物より平均してほぼ２倍長く生存した。長期生存者は、通常は致死的な用量の親の乳ガン細胞で免疫されて再チャレンジされた。混合リンパ球を一緒に予め培養することが、完全な効果を得る際に重要であることが見出された（実施例３、下記を参照のこと）。これらの研究の組み合わせた結果は、以下の結論を示唆した：ａ）混合リンパ球移植ストラテジーは、少なくとも２つの異なるガン（グリオーマおよび転移性乳ガンモデル）および少なくとも２つの異なる位置（脳および肝臓）において生存を改善するのに有効である；ｂ）生存者は、親の腫瘍細胞での再チャレンジに耐性である；そしてｃ）効果は、宿主抗腫瘍免疫の免疫活性化を介して媒介され得る。２つの連続した移植で処置した特定の神経膠芽細胞腫患者は、適切に応答せず、そして移植物は外科的に除去された。次いで、患者は、外科手順から回収し低温保存した腫瘍細胞で処置され、なお別の調製された同種異系および自己のリンパ球の培養物と混合された。混合物を、腫瘍床ではなく、腫瘍から離れた皮下部位に投与した（実施例４および６）。本実験手順は、全身的抗腫瘍応答を生じるのに驚くほど良好に働いた。本患者は腫瘍内移植を有さないとしても、この患者は、腫瘍内移植を有するのと同様に応答する。結論としては、自己腫瘍細胞および混合リンパ球の末端での投与は、おそらく腫瘍の免疫原性を増加させる強力な能力に起因して、有効なガン処置方法であることである。本発明の細胞性ワクチンの特徴は、効果が、腫瘍細胞単独、または先に用いられたアジュバントもしくは補因子と混合された腫瘍細胞を用いて得られた効果よりも実質的に大きいことである。腫瘍細胞と、ワクチンの刺激されたリンパ球との相互作用は、おそらく複雑である。いずれか１つの理論に束縛されることを望まないが、腫瘍細胞（または腫瘍関連抗原）は、実質的に、活性化されたリンパ球により刺激された宿主において生じた免疫学的反応において傍観者であることが可能であるようである。活性化されたリンパ球は、１つ以上の以下の方法で関与し得る。第１に、これらはサイトカインを提供するようである。サイトカインは、宿主免疫細胞の相互作用を補充、活性化、または刺激するのに有効である。産生されるサイトカイン混合物は、単離形態で、または形質導入細胞を介して提供されるサイトカインよりも部分的に優れている。なぜなら、サイトカイン混合物は、因子のカクテルであるからである。カクテルにおける個々のサイトカインは、協調してまたはさらに相乗的に作用して、単一のサイトカインにより信頼できる様式で刺激され得る活性を超えて、種々の活性を刺激し得る。このカクテルはまた、依然として同定または単離されていないサイトカインを含み得る。第２に、活性化されたリンパ球はまた、腫瘍抗原提示において直接的な役割を果たし得る。第３に、活性化されたリンパ球（特に同種異系リンパ球）は、宿主の免疫細胞を刺激するのに接触役割を果たし得、その間に腫瘍抗原は、傍観者として関与し得る。ワクチンの投与から生じる免疫学的応答は、体液性および細胞性の両方の成分を含み得るが、細胞性応答が特に好ましい。細胞性免疫（細胞傷害性リンパ球または他のエフェクター機構を補充するヘルパーインデューサー細胞のいずれか）は、標的新生物の細胞に対して特定の効果を提供するのに重要であると考えられる。免疫学的応答の存在は、標準的な免疫学的技術によりモニターされ得る。しかし、ヒト治療において、最初の目的は、患者の臨床状態の改善である。それゆえ、臨床的結果は、ガン処置に指向される場合の、本発明の組成物および方法の有効性についての優れたアッセイである。本発明は、以前に使用されたかまたは示唆されたストラテジーよりも優れている。本発明のワクチン組成物の利点は、以下の通りである：・本ワクチンは、ヒトのガン患者の臨床状態または予後を改善する。ガン患者中に存在している腫瘍細胞はそれ自体の見かけ上免疫原性が乏しいとしても、これは真実である。・応答はおそらく腫瘍関連抗原により媒介されるが、処置された被験体の腫瘍における任意の特定の抗原の存在を確認する必要性はない。患者自体の腫瘍細胞の使用は、関連する抗原の範囲を確実にする。・患者の細胞を遺伝的に改変するか、または患者のDNAを使用してワクチンの細胞を遺伝的に変更する必要性はない。事実、遺伝的に改変された細胞は、応答を得るために必要とされない（だが、これらは、以下に記載されるように、本発明の特定の実施態様に含まれ得る）。・本ストラテジーは、全身性免疫応答を生じることを目指し、それゆえ原発性腫瘍に対してだけでなく、腫瘍抗原を原発性腫瘍と共有する転移性細胞に対しても有効であり得る。・腫瘍細胞の最初のサンプリングの可能な例外では、本プロトコルは、最小の侵襲性手順で行われ得る。ワクチン組成物は、好ましくは、腫瘍とは離れた部位に投与される。皮下経路の投与が好ましい。・効果は、長期間存続し、少なくとも約２ヶ月間持続する。ワクチン接種手順は宿主の免疫系を刺激するように設計されるので、せいぜい偶然の補充を必要とするにすぎないはずである。これは、養子移植法を超えるかなりの進歩である。本発明のワクチン組成物を調製および使用するための好ましい方法のさらなる説明は、以下の節に提供される。定義用語「ワクチン」、「免疫原」、または「免疫原性組成物」は、本明細書中では、ヒトまたは動物被験体に投与した場合にある程度の特異的免疫を適切に与え得る化合物または組成物をいうために使用される。本開示において使用される「細胞ワクチン」または「細胞免疫原」は、必要に応じて不活化された少なくとも１つの細胞集団を有効成分として含む組成物をいう。本発明のワクチン、免疫原、および免疫原性組成物は、活性なワクチンであり、これは、これらが少なくとも部分的に宿主の免疫系により媒介される、特異的免疫応答（例えば、抗腫瘍抗原または抗ガン細胞応答）を刺激し得ることを意味する。免疫応答は、抗体、免疫反応性細胞（例えば、ヘルパー／インデューサーまたは細胞傷害性細胞）、またはそれらの任意の組合せを含み得、そして好ましくは、処置が指向される腫瘍上に存在する抗原に対して指向される。応答は、被験体において、単回または多回用量の投与により惹起または再刺激され得る。組成物にワクチンとしての資格を与えるために、他に明記しない限り、組成物にこれ以上何も必要でない。化合物または組成物は、以下のいずれかが可能である場合、「免疫原性」である：a)ナイーブ個体における抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する免疫応答を生じる；またはb)個体における免疫応答を、化合物または組成物が投与されない場合に生じる免疫応答を超えて再構成、ブースト、または維持する。単回用量または多回用量で投与される場合にこれらの基準のいずれかを達成し得るならば、組成物は、免疫原性である。免疫または免疫学的応答を「刺激する」とは、宿主の免疫系が標的物質（例えば、外来分子、同種異系細胞、または腫瘍細胞）と他の状態で生じるよりも高いレベルで反応する能力を開始、ブースト、または維持する化合物または組成物の投与をいう。「一次」免疫応答を刺激するとは、本明細書中では、例えば、標的抗原への曝露がないこと、標的に対する無反応性、または免疫抑制に起因して、以前に反応性が検出されなかった被験体における特異的免疫反応性を惹起することをいう。「二次」応答を刺激するとは、例えば、自然免疫、自然免疫化、または１つまたはいくつかの組成物または手順を用いる処置に起因して、以前に反応性が検出された被験体における反応性を再開、ブースト、または維持することをいう。「細胞株」または「細胞培養物」は、インビトロで増殖または維持された高等真核生物細胞を表す。細胞の派生物が、親細胞と（形態学的、遺伝子型的、または表現型的のいずれかで）完全に同一でないかもしれないことが理解される。細胞の「不活化」は、本明細書中で、細胞が、細胞分裂して子孫を形成し得ないようにされていることを示すために用いられる。細胞は、それにもかかわらず、刺激に応答し得るか、またはサイトカインのような細胞産物を生合成および／または分泌し得る。不活化の方法は、当該分野で公知である。不活化の好ましい方法は、マイトマイシンＣのような毒素での処置または照射である。固定または膜透過性にされ、そして分裂し得ない細胞もまた、不活化細胞の例である。「混合されたリンパ球反応」、「混合されたリンパ球培養物」、「MLR」、および「MLC」は、アロタイプが異なる最小２つの異なる細胞集団を含む混合物を言及するために交換可能に用いられる。アロタイプが異なる細胞の少なくとも１つは、リンパ球である。細胞は、リンパ球の刺激をもたらす期間、それに適切な条件下で一緒に培養される。MLCの頻繁な目的は、リンパ球の増殖を開始させ得るような同種異系刺激を提供することである；しかし、示さない限り、培養の間の増殖は必要とされない。適切な状況下では、これらの用語は、このような培養物に由来する細胞の混合物を二者択一的に言及し得る。MLCからの細胞がヒトへ、特に腫瘍床へボーラスとして投与される場合、これは「細胞移植（cytolmpian t）」と言及される。「遺伝的改変」は、遺伝的エレメントが有糸分裂または減数分裂以外により細胞に導入されるプロセスをいう。エレメントは、細胞に対して異種であり得るか、または既に細胞中に存在するエレメントのさらなるコピーもしくは改善版であり得る。遺伝的改変は、例えば、当該分野で公知の任意のプロセス（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈澱、またはポリヌクレオチド-リポソーム複合体と接触させること）を介して、細胞に組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドを形質導入することによりもたらされ得る。遺伝的改変はまた、例えば、DNAまたはRNAウイルスまたはウイルスベクターでの形質導入または感染によりもたらされ得る。遺伝的改変が細胞の子孫に遺伝し得ることが好ましいが、これは一般的に、特に、改変された細胞がさらなる増殖を伴わずに薬学的組成物において用いられる場合、本発明の実施のために要求されない。用語「腫瘍細胞」または「ガン細胞」は、単数形もしくは複数形のいずれかにおいて使用され得、宿主生物に対して細胞を病原性にする悪性の形質転換を受けた、細胞をいう。原発性ガン細胞（すなわち、悪性の形質転換の部位の近くから得られる細胞）は、十分に確立された技術、特に、組織学的試験によって、非ガン性の細胞から容易に区別され得る。本明細書中で使用される、ガン細胞の定義は、原発性ガン細胞だけではなく、ガン細胞祖先に由来する任意の細胞を含む。これは、転移されたガン細胞、ならびにガン細胞に由来するインビトロでの培養物および細胞株を含む。本明細書中で使用される、用語「腫瘍関連性の抗原」あるいは「TAA」は、同じ組織型の非腫瘍細胞によるよりも、腫瘍細胞によって高い頻度または密度で発現される、分子または複合体をいう。腫瘍関連性の抗原は、宿主によって通常発現されない抗原であり得；これらは、変異され得るか、短縮され得るか、誤って折り畳まれ得るか、またはそうでなければ宿主によって通常発現される分子の異常な発現であり得；これらは、通常発現される分子に同一であり得るが、異常に高いレベルで発現され得；またはこれらは、異常である状況もしくは環境において発現され得る。腫瘍関連性の抗原は、例えば、タンパク質もしくはタンパク質のフラグメント、複合体炭水化物、ガングリオシド、ハプテン、核酸、またはそれらのもしくは他の生物学的分子の任意の組合せであり得る。特定の腫瘍関連性の抗原の存在または特徴の知見は、本発明を実施するために必ずしも必要ではない。本明細書中で使用される、「処置」は、処置される個体または細胞の自然の進行を変化するための試みにおける臨床学的介入をいい、臨床学的病理学の予防のために、またはその進行の間のいずれかで行われ得る。所望の効果としては、疾患の出現または再発の防止、症状の緩和、疾患の任意の直接的なもしくは間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患進行の速度の遅延、疾患状熊の改善または軽減、および鎮静または改善された予後が挙げられる。疾患状態に関連する「病理」は、健康、正常の生理学、または罹患された個体の生命の質を弱める任意の状態である。これらとしては、以前は罹患されされていない領域への罹患された組織の破壊的な進入、正常な組織機能を犠牲にする増殖、不規則なまたは抑制された生物学的活性、炎症応答または免疫学的応答の増大または抑制、他の病原性生物または因子に対する増加された感受性、および非所望の臨床学的症状（例えば、疼痛、熱、吐き気、疲労、気分の変化）、ならびに付き添いの医師によって決定され得るような他の特徴が挙げられる（がこれらに制限されない）。「有効量」は、有益なもしくは所望の臨床学的結果（特に、免疫応答の発生）、または臨床学的状態における顕著な改善を達成するのに十分な量である。免疫原性量は、処置される被験体群（病気であるかまたは病気ではない）において、免疫学的応答（これは、体液性応答、細胞性応答、またはその両方のいずれかを含み得る）を誘発するのに十分な量である。新生物性の疾患を保有する被験体についての臨床学的応答に関して、有効量は、疾患の進行を、軽減、改善、安定化、逆転、もしくは遅延するのに、またはそうでなければ疾患の病理学的結果を低減するのに十分な量である。有効量は、単一のまたは分割された用量で与えられ得る。有効量における使用のために好ましい量および細胞比率は、本開示の他の場所に与えられる。「個体」または「被験体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。非ヒト哺乳動物としては、農場動物、スポーツ動物、およびペットが挙げられるが、これらに制限されない。一般的技術本発明の実施は、他に示さない限り、分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を用い、これは当業者の範囲内である。このような技術は、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」第２版（Sambrookら、1989）；「Ollygonucleotide Synthesis」（M.J．Gait編、1984）；「Animal Cell Culture」（R.I．Freshney編、1987）；「Methods in Enzymology」（Acad emic Press、Inc．）；「Handbook of Experimental Immunology」（D.M．Weir & C.C．Blackwell編）；「Gene Transfer Vectors for Mammmalian Cells」（J. M．Miller & M.P．Calos編、1987）；「Current Protocols in Molecular Biolo gy」（F.M.Ausubelら編、1987）；「PCR:The Polymerase Chain Reaction」（Mi llisら編、1994）；「Current Protocols in Immunology」（J.E．Coliganら編、1991）のような文献において十分に説明される。また、混合されたリンパ球培養における技術の説明については、Gatelyら、Leeら、およびZarlingら（下記）を参照のこと。薬学的組成物の調製および投与についての一般的な手順は、Remington's Phar maceutical Sciences第18版(1990)、E.W．Martin編、Mack Publishing Co.，PA において概説される。本発明の組成物および方法を試験および調整するために使用され得る、ガンについての多くの動物モデルが存在する。あるモデルは、樹立された同系の腫瘍株を注入される同系動物が含まれる。腫瘍は、潜在的な治療学的組成物とともに同時注入され得、治療が開始される前に樹立することを許容されるか、またはネイティブな動物のワクチン接種後、ある時点での抗原投与として投与され得る。実施例の節において、説明が提供される。また、有用なものは、米国特許第5,663, 481号、同第5,602,305号、および同第5,476,993号；欧州特許出願第379,554号；ならびに国際特許出願WO 91/01760に記載される、キメラ動物モデルである。上記および下記の両方で、本明細書中に記載される全ての特許、特許出願、文献、および刊行物は、本明細書中に参考として援用される。細胞性ワクチンの調製本発明の細胞性ワクチンは、典型的に、適切な様式における各細胞集団またはそれらの等価物を調製し、成分を合わせ、そして必要に応じて、被験体への投与の前に、細胞混合物を共存培養または保存することによって、アセンブリされる。腫瘍関連性の抗原：腫瘍関連性の抗原の供給源は、最も通常は、患者が処置される腫瘍細胞または細胞株に表現型が近い、腫瘍細胞または腫瘍細胞株である。同じ組織型からのおよび類似の組織学的特徴を有する腫瘍は、腫瘍関連性の抗原を共有する傾向にある。抗原の完全な範囲は、個体の腫瘍間で変わり得るが、少なくとも１つが共有される実質的な潜在性が存在する。好ましくは、腫瘍細胞は、処置される被験体と組織適合性である。一般に、患者起源の腫瘍細胞を得ることが可能である場合、これらの細胞は、関連の腫瘍関連性の抗原の完全な相補をより保有するようであるので、好ましい。白血病およびリンパ腫のような循環する腫瘍は、末梢血から容易にサンプリングされ得る。そうでなければ、腫瘍細胞は、一般に、外科的手順（バイオプシー、または外科的切除もしくは脱バルキング（debulking）を含むがこれらに制限されない）によって、サンプリングされる。腫瘍細胞はまた、転移部位から回収され得る。固体腫瘍は、物理的操作によって（必要に応じてコラゲナーゼのようなプロテアーゼを用いる酵素学的処理と合わせて）、別々の細胞に解離され得る。次いで、細胞は、新鮮な生理学的培地に移される。細胞は、例えば、液体N₂中で凍結することによって、さらなる使用まで、保存され得る。必要に応じて、および元来の腫瘍細胞マスが小さな場合は特に、十分な供給を確実にするために腫瘍細胞集団を増殖することが許容され得る。細胞は、必要に応じて増殖因子が補充される増殖に適切である増殖培地において、培養される。好ましくは、腫瘍細胞の特徴を含む安定な細胞集団が、さらなる形質転換を伴うことなく得られるが、必要とされる場合、さらなる形質転換が許容される。細胞集団は、必要に応じて、その安定を増強するためにまたはその特徴を純化するためにクローン化され得るが、これは一般に必ずしも必要ではない。多様な腫瘍型から、短期培養物を確実に樹立するための、および少なくとも10⁸細胞を得るための条件は、Dillman ら(1993)J．Immunother．14:65-69によって記載される。可能であれば、元来の腫瘍細胞調製物が、増殖を伴うことなく使用される。臨床学的腫瘍抗原が、増殖プロセスを介して失われるからである。記載されるように得られたガン細胞または細胞株は、ワクチンの別の成分と、直接合わせられ得る。しかし、一旦被験体に投与されれば、さらなる増殖を防止するために、ガン細胞を不活性化することが好ましい。不活性化の任意の物理的、化学的、または生物学的手段が使用され得、照射（好ましくは、少なくとも約 5,000cGy、より好ましくは少なくとも約10,000cGy、より好ましくは少なくとも約20,000cGyで）；またはマイトマイシンＣでの処理（好ましくは少なくとも10 μg/mL；より好ましくは、少なくとも約50μg/mLで）を含むがこれらに制限されない。あるいは、腫瘍抗原供給源として使用するためのガン細胞は、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、またはホルマリンのような薬剤で固定され得る。これらはまた、イオン性または非イオン性の界面活性剤（例えば、デオキシコール酸もしくはオクチルグルコシド中に可溶化され得るか、または例えば、ワクシニアウイルスを用いて溶解され得る。所望であれば、可溶化された細胞懸濁液は、清浄化されるか、または任意の多くの標準的な生化学的分離手順に供され、特定の腫瘍関連性の抗原を富化または単離し得る。ワクチンの他の成分との組合せの前に、調製物は、例えば、固定された細胞を遠心分離および洗浄することによって、または可溶化された懸濁液の透析によって、これを処理するために使用された薬剤を涸渇される。腫瘍細胞集団のこのような処理、特に不活性化以外は、随意であり、特に要求されない限り、本発明の実施態様の実施に不必要であるとみなされ得る。同種異系細胞：本発明の細胞性ワクチンはまた、第２の細胞集団を含み、その少なくとも一部分は、処置される被験体に対して同種異系であり、および同種異系の刺激に対して特異的に反応し得る細胞である。これは、一般に、リンパ球細胞またはリンパ球系統の細胞、特にＴ細胞を意味する。CD4抗原を発現するリンパ球（CD4+細胞）、およびCD8抗原を発現する細胞（CD8+細胞）はともに、Ｔリンパ球の定義に含まれ、いずれかまたは両方がワクチンにおいて含まれ得る。好ましくは、第２の細胞集団における同種異系細胞は、少なくとも10%のCD4+細胞または10%のヘルパー/インデューサー細胞であり；より好ましくは、同種異系細胞は、少なくとも約20％のCD4+またはヘルパ／インデューサー細胞であり；さらにより好ましくは、部分は、少なくとも約30%であり；なおより好ましくは、部分は、少なくとも約50%である。CD4+細胞は、蛍光活性化計数と関連して、OKT4 のような市販の特異的な抗体を用いて、簡便に定量され得る。細胞は一般に、細胞が同種反応を刺激するのに十分な表現型の差異を保有する場合、同種異系であるとして記載される。本開示の状況において、用語「同種異系」の使用は、主要組織適合複合体（MHC）抗原の表現型における差異に制限される。同じ種の細胞間のMHCアロタイプの同一性における任意の質的な差異は、それらが同種異系細胞であることを意味する。ヒトにおいて、任意のHLA-A、B、 C、D、DP、DQ、およびDR遺伝子座での差異は、本発明に関連するアロタイプな差異を構成する。HLA-A、B、C、D、DP、DQ、およびDRの同一性は、典型的に、アロタイプ特異的抗原を用いて、細胞傷害性技術または免疫蛍光技術において決定される。本発明の目的のために好ましいアロタイプの差異は、HLAクラスII抗原に関連する。推定の同種異系細胞と処置される被験体の細胞との間のDP、DQ、およびDR遺伝子座のクラスII抗原を比較して、好ましくは、少なくとも１つの、および漸増して、より好ましくは２つ、３つ、４つ、５つ、またはさらに６つの遺伝子座が、同種異系細胞間で異なる。クラスII抗原はまた、分類された細胞を用いる、混合されたリンパ球の応答によって、D遺伝子座にて決定され得る。同種異系細胞のドナーは、一般に、試験される被験体に関連せず、MHCミスマッチの数を最大にする。クラスII領域のミスマッチの数は、関連するが、同種異系性の機能的な決定の次にである。スティミュレーター細胞として処置される被験体の不活性化された単核細胞を用いる、１方向MLRにおいて、同種異系細胞が強力な増殖応答を示す場合、同種異系細胞は、本発明における使用に特に適切である。被験体と同じ遺伝子型のスティミュレーター細胞に、特に強い応答を生じることが知られる細胞のドナーは、特に適切である。異なる同種異系細胞のパネルは、最も強い応答を誘発する細胞を決定するために、患者の細胞に対して試験され得る。同種異系細胞集団は、単一のドナーから得られる細胞集団に必ずしも制限されない。２人、３人、またはそれよりも多い複数のドナーが、必要に応じて、同種異系細胞の回収を容易にするために、同種異系細胞の刺激を増加するために、抗 -アロタイプ応答の顕現を最小にするために、またはそうでなければ、細胞性ワクチンの効力を増強するために、使用され得る。同種異系細胞は、被験体への投与の前に、好ましくは活性化もしくは刺激されるか、または一旦投与されたら活性化または刺激し得る。この状況における「活性化」は、誘導されて増殖することを意味する。増殖は、細胞計数によって、または少なくとも約18時間の培養の間の、標準的な[³H]-チミジン取り込みアッセイによって、測定され得る。PHAのようなマイトジェンでの細胞の刺激は、最大の増殖を示し、そして誘導化剤を伴わない細胞の培養は、ベースラインの増殖を測定する。実質的に増殖する細胞は、ベースラインレベルを実質的に超える取り込みを示す。この状況における「刺激」は、外部因子によって誘導されて、代謝の変化、特に、生物学的に関連する分子（例えば、サイトカインまたは他の可溶性メディエーター）の合成および／もしくは分泌の増加、静止期のリンパ球からリンパ芽球への形態学的変化、または細胞における生物学的活性の増加（エンドサイトーシス、エキソサイトーシス、食作用、または外部環境からの分子の細胞内輸送およびプロセシングの増加を含むが、これらに制限されない）を受ける。多くの生物学的アッセイが、活性化および刺激の測定に適切であり、増殖アッセイおよび細胞傷害性アッセイ、組織学的試験、細胞表面マーカーの密度の測定、細胞によって合成されるおよび／または排出されるメディエーター（特にサイトカイン）の測定、またはエフェクター細胞（例えば、好中球、好塩基球、肥満細胞、単球、マクロファージ、好酸球、および他のリンパ球）を補充する増加された能力の測定が挙げられる。アッセイが、誘導の不在下で観察される変化を上回る、誘導の際に測定される特徴における変化を示す場合、刺激が生じる。特に適切な刺激の形態は、免疫学的応答においてこのような特徴を保有する細胞の関与の増加される頻度と相関する形態である。このような特徴としては、特定の抗原に応答するにおける芽球化、増殖、または細胞傷害性、およびメディエーターのIL-2、IL-4 、IL-6、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、M-CSF、またはGM-CSFの増加された分泌が挙げられる。刺激を測定するための所定のアッセイが、実施例５に提供される。リンパ球は、本発明での使用のために、任意の適切な組織から回収され得るが、同種異系ドナーの血液から最も簡便に得られる。ドナーは、好ましくは、十分なリンパ球数を有するドナーを同定し、そして新生物状態または伝染性の感染を有するドナーを排除するためにプレスクリーニングされる。回収は、全血の供与、その後の血球集団の分離によって、またはより簡便には白血球搬出によって、行われ得る。十分な血液がプロセスされて、約100〜500mL（好ましくは少なくとも200mL）の白血球搬出懸濁液が、得られる。血液は、クエン酸またはEDTAのような抗凝集剤中に回収される。例えば、白血球搬出は、Cobe 2997（COBE SPECTR Aetrics（Braintree MA）血球分離器を用いて行われ得る。２〜４時間の約40〜50 mL/分の流速は、１mL未満の赤血球を有する、約200〜250mLの白血球搬出懸濁液を生じ、個々のドナーおよび使用される装置の間で異なる。任意の適切な方法によって調製された白血球は、一般に、血小板を除去するために洗浄され、そして適切な培地（例えば、２%の不活性化胎児細胞血清を補充されたAIM V）中に再懸濁される。所望であれば、細胞はさらに、白血球、特にＴ細胞を富化するために、亜集団に分離され得る。ポジティブ選択法およびネガティブ選択法の両方が使用され得る。適切な手順としては、FICOLL^TMまたはHIST O ニングのようなアフィニティー分離、または関連の細胞表面マーカーに対する抗体を用いる、蛍光セルソーターにおけるソーティングが挙げられる。簡便さのために、操作工程の数を減少することが好ましくあり得る。例えば、より良好な白血球搬出分離は、FICOLL^TMでのその後の分離の必要性を除去し得る。同種異系細胞は、関連の腫瘍関連性抗原に対する免疫応答を強化する任意の様式において刺激され得る。LAK細胞およびTIL細胞は、刺激化された同種異系細胞の定義の中に含まれる。LAKおよびTIL細胞は、当該分野において公知の技術に従って、生成および分離され得；本発明における使用のための主要な差異は、意図される受容者に対して、これらが同種異系であることである。本発明は、同種異系細胞の活性化および刺激の任意の手段を含み、ドナー起源でも患者起源でもない細胞との予備培養、生きた（不活性化されていない）腫瘍細胞との予備培養、ドナー起源の栄養細胞との予備培養、単離されたサイトカインもしくは組換えサイトカイン、もしくはそれらの混合物との予備培養、ConＡのようなマイトジェンとの予備培養、または列挙される技術の任意組合せが挙げられるが、これらに制限されない。免疫細胞を刺激するための方法、および刺激を測定するためのアッセイは、とりわけ、米国特許第5,569,585号において見出される。刺激の特に好ましい方法は、当該分野において知られ、および本明細書中でさらに記載されるように、混合された白血球培養物によってである。スティミュレーター：同種異系白血球を刺激するための好ましい方法は、これらと、適切な刺激を提供し得る細胞とを合わせることである。このような細胞は、本明細書中で「スティミュレーター」細胞と呼ばれる。同種異系白血球は、この方法において刺激される場合、「応答因子」細胞と呼ばれる。好ましいスティミュレーター細胞は、応答因子細胞に同種異系である細胞である。本発明のある実施態様において、スティミュレーター細胞の供給源は、処置される被験体に遺伝的に類似する個体であり；さらにより好ましくは、スティミュレーター細胞は、MHC抗原に関して被験体に類似するかまたは同一である個体に由来し、さらにより好ましくは、細胞は被験体に対して自己由来である。ある場合において、被験体は、腫瘍または以前の処置による刺激に起因して、腫瘍関連性の抗原に対して以前の免疫応答を有してい得る。本発明の他の実施態様において、スティミュレーター細胞は、処置される被験体に由来するのではなく、別のドナーまたは複数のドナーに由来する。被験体の細胞を使用する利点は、投与後、受容因子が、被験体の同種抗原からの刺激を受け続けることである。しかし、第３者のスティミュレーターの使用は、それ自身の利点のセットを有する。例えば、刺激された細胞のバッチは、いくつかの異なる患者における使用について好ましくあり得る。一例として、処置される被験体以外のいくつかの異なるドナーからの白血球搬出細胞は、プールされ、そして刺激について十分な条件下でともに培養される。次いで、培養された細胞のアリコートは、各患者の腫瘍関連性の抗原に対して調整される細胞性ワクチンを形成するために、各個々の患者由来の腫瘍細胞と合わせられる。本発明のさらなる実施態様において、異なる個体（処置される被験体を含んでも含まなくてもよい）からの複数のスティミュレーター細胞が使用される。スティミュレーター細胞としての使用について適切な細胞型は、高い密度の組織適合性抗原、特にクラスII抗原を保有する細胞型である。リンパ節細胞が好ましいが、より有用な供給源は、末梢血である。リンパ球あるいは白血球は、白血球搬出によって被験体の循環から回収され得る；しかし、全血の回収がより通常であり、必要とされるスティミュレーター細胞の数は、応答因子細胞の数よりも非常に低いので、通常より簡便である。適切な抗凝固剤中の静脈穿刺によって回収される、200〜400mLの末梢血は、典型的にワクチンを調製するための十分な細胞を提供する。上記の分離手順は、一般に、被験体の全血サンプルからスティミュレーター細胞を救出するために用いられ得る。Ｂ細胞および単球のような集団からのクラス II組織適合性抗原を発現する細胞を富化する、または少なくとも涸渇しないことが望ましい。細胞の拡張されたサブ画分化は、通常必要とされず、そしてサンプル末梢血単核細胞集団（PBMC）は、ほとんどの目的について適切である。混合された白血球培養物：ドナーの同種異系白血球と刺激物質細胞とは、使用される場合、患者への投与の直前に合わせられ得、同種異系刺激がインビトロで生じることが予測される。しかし、実施例３に提供されるデータは、投与の前の２つの細胞の共存培養が、組成物の効果を増強することを示した。本発明は、同種異系細胞を刺激するための方法として、２方向の混合された白血球培養物の使用を含む。しかし、スティミュレーター細胞として、腫瘍の患者の白血球を使用する場合、１方向のMLCが好ましい。１方向のMLCを行うために、被験体のスティミュレーター細胞は、例えば、約10⁷細胞/mLを、50μg/mLのマイトマイシンＣで処理し、次いで洗浄することによって不活性化される。同種異系白血球は、適切な培地（一般に、胎児ウシ血清またはそれについての置換物が補充され、そして必要に応じて、他の増殖因子を含む）において、スティミュレーター細胞と合わせられる。応答因子細胞：スティミュレーター細胞の比率は、好ましくは約100：１〜１：10であり；より好ましくは約50：１〜１：１であり、；なおより好ましくは、約20：１〜５：１であり、そしてさらにより好ましくは約10：１である。１方向のMLCにおいて、複数のスティミュレーター細胞または応答因子細胞が存在する場合、応答因子：スティミュレーターの同じ近似の比率が維持される。従って、２つの不活性化されたスティミュレーターを使用する場合、比率は、約９：(１：１)であり得；３つの不活性化されたスティミュレーターを使用する場合、比率は、約８：(１：１：１)であり得る。同様に、複数の応答因子を使用する場合、比率は、(５：５)：１または(３：３：３)：１であり得る。ともに培養される場合、複数の応答因子組成物は、多方向のMLC になる。複数の応答因子の１方向の活性化は、各応答因子集団について約10：１の比率で、別々の培養を行い、次いで使用する直前に異種活性化された細胞を合わせられる。所望の比率で一旦合わせられたら、細胞は、適切な雰囲気（例えば、約37℃で、95% O₂、５% CO₂）中で、適切な密度で培養される。培養期間は、好ましくは、少なくとも約12時間、より好ましくは約24時間と72時間との間である。さらなる刺激は、３〜５日間培養することによって得ることができるが、これは一般に好ましくない。なぜなら、初めの48〜72時間の培養の間のサイトカインのレベルが、通常高いからである。実施者は、応答因子細胞の増殖または刺激について、条件が適切であるか否かを、以前にまたは実施例５に記載されるように、これらの特性についてのバイオアッセイを行うことによって、決定し得る。別の方法において、TNF-α、LT、および／またはIFN-γのレベルが、培養上清において測定される。刺激は、50〜150U/mL、または500〜3500pg/mLの生物学的活性のレベルによって示される。好ましい培養物は、テトラゾリウム還元アッセイ（XTT）によるか、もしくはフローサイトメトリー（CD69もしくは細胞内エラスターゼ）によるか、またはその両方によって測定されるように、最初の３日間の培養物内の未刺激のドナーコントロール値を10%以上超える活性化のレベルを示す培養物である。好ましい細胞供給源、細胞比率、培養条件、および他の特徴の、本開示内での詳説は、実施者の補助として意図され、明示的に必要とされない限り、本発明の範囲を制限することを意味しない。任意の個々のパラメーターに関して、何の制限も意図されない。なぜなら、種々の他のパラメーターの組合せは、所望の機能的効果を有する細胞集団を生成するからである。混合された白血球培養物は、一般に、同種異系応答因子細胞および被験体のスティミュレーター細胞を用いて、腫瘍細胞の添加の前に行われ得る。通常、スティミュレーター細胞は、ガンの患者に由来するが、それ自身非ガン性である。しかし、腫瘍細胞がMLCの間に存在することが許容される。ときおり、スティミュレーター細胞および腫瘍細胞は、例えば、白血病の処置において、同じであり得る。機能的効果の至適化：動物モデル実験における経験は、全ての第３者のドナーが、特に、異なる第３者のドナーがスティミュレーター細胞として使用される場合、同じ程度の異種活性化を提供するわけではないことを示す。多様性がドナー細胞依存性である限り、培養物において観察される異種活性化の程度、および臨床学的結果の両方に関して、経験に従って、ドナーは選択され得る。活性化の特定のレベルを示す機能的基準（例えば、テトラゾリウム還元アッセイ（XTT）、フローサイトメトリー、またはELISAによって測定されるあるリンホカインの分泌のレベル）は、臨床学的経験に依存して、結果を十分に予測し得る。一旦首尾よいドナーが同定されれば、免疫原性組成物を提供するサービス機関によって供給される通例のドナーのパネル中に構成され得る。多様性が、ドナーと患者との間の適合性に依存する限り、いくつかの他の選択基準がまた、使用され得る。あるドナー−患者の組合わせの効力は、組織適合性に従って移動するので、所望であれば、ドナーは組織適合性に基づいて選択され得る。特定のヒト組織適合型のドナーが、所望であれば、以前に列挙されたキメラ動物モデルの１つを用いて、特定の腫瘍との効力について試験され得る。より迅速なドナー同定試験は、患者からのPBLおよびインビトロアッセイにおける潜在的なドナーの選択からのPBLを用いて、行われ得る。１つのこのようなアッセイは、逆機能試験である。このアッセイにおいて、患者の細胞は、不活性化されたスティミュレーターとして異種活性化された細胞の潜在的なドナーを用いて、混合されたリンパ球培養物中に、応答因子として供給される。応答は、異種活性化された細胞によるサイトカインの分泌を含むと考えられるので、代替の予測（predictor）は、２段階の培養であり得る。このアプローチにおいて、応答因子培養物：スティミュレーター培養物は、予備培養における使用のために、試験される応答因子細胞およびスティミュレーター細胞を用いて、供給される。３日目に、培養物はマイトマイシンまたは致死下の照射で不活性化され、それによって細胞はさらにサイトカインを産生するが、複製はしない。次いで、患者からの白血球を添加し、そしてそれらの応答後、機能的アッセイ、サイトカイン分泌、またはＴ細胞増殖が行われる。このアプローチの変形において、不活性化された腫瘍細胞はまた、培養の第２の段階において提供され、読み出しは、第２の段階の終わりに、⁵¹Cr標識化腫瘍細胞の細胞溶解を測定することによって、決定される。これらのアッセイは、種々の方法において、特に、高い応答因子について富化されたドナーパネルを供給するにおいて、本発明の組成物を至適化することを望み得る読み取り者の利益のために記載される。本発明は、この節で概説されるさらなる改良を用いることなくなされ得ることが強調されるべきである。異種活性化の程度、または潜在的な治療学的結果はまた、利用可能でありおよび適切である場合、１つ以上の以下のストラテジーを用いることによって増強され得る：ａ）MLCにおける応答因子またはスティミュレーターとして、複数のドナー細胞を使用する；ｂ）MLCにおけるスティミュレーターとして、処置される患者からの細胞を使用する；ｃ）MLCの培養培地に、H2レセプターアンタゴニストを添加する。好ましいH2レセプターは、シメチジンであり、約５μg/mLと100 μg/mLとの間で、典型的に20μg/mLで、培養培地に添加される。シメチジンまたは複数のドナー細胞を使用する利益は、実施例６および実施例７に、それぞれ説明される。遺伝子改変された細胞：ワクチンにおいて使用される同種異系細胞は、ワクチンに対する免疫応答を増加する様式で遺伝子改変され得る。特に好ましいのは、上昇されたレベルでサイトカインを発現するように遺伝子改変された同種異系細胞である。リンパ球、特に同種異系混合物におけるリンパ球は、あるサイトカインの検出可能なレベルをすでに産生し得ることが認識される。遺伝子改変の結果として生じる発現の「上昇されたレベル」は、同じ方法において遺伝子改変されていないが、そうでなければ類似の細胞において観察されるレベルよりも高い。この目的のために任意のサイトカイン、特に、リンパ球または抗原提示系統の細胞を補充または刺激する、またはそうでなければ免疫応答の加速に関与する能力を有するサイトカインが使用され得る。好ましいサイトカインとしては、腫瘍壊死因子（TNF-αに例示される）；インターロイキン（IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、およびIL-10に例示される）；インターフェロン（IFNα、およびIFN-γに例示される）；造血因子；およびコロニースティミュレーター（GM-CSFおよびM-CSFに例示される）が挙げられるが、これらに制限されない。本発明とともに使用され得る潜在的なサイトカインの間で、GM-CSFは、特殊化された抗原提示細胞の成熟および機能における重要な役割のために、特に好ましい。上皮起源の腫瘍細胞のような多くの腫瘍細胞は、検出可能なMHCクラスII分子を発現しないので、GM-CSFは特に重要であると考えられる。IL-4はまた、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、ならびに造血細胞に対して、広範な範囲の刺激活性を与える多能性のサイトカインとして、特に好ましい。その役割としては、CD4+抗原提示細胞の補充および活性化、ならびに細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導が挙げられる。TNF-αは、免疫応答および炎症応答における効果の広範な範囲のためもあって、特に好ましい第３のサイトカインである。ヒトIL-4およびTNF-αのタンパク質およびDNAコード配列は、知られており、そしてコード配列を含有するベクターは利用可能である。IL-4配列およびベクターについて、米国特許第5,017,691号および欧州特許第230107号を参照のこと。遺伝子改変されたCHO細胞は、米国特許第5,034,133号に記載される。固体腫瘍を処置するにおける、IL-4の（単離された組換え体としての、または遺伝子改変された細胞におけるかのいずれかでの）使用は、米国特許第5,382,427号に記載される。TNFポリペプチド、コード配列、ベクター、および遺伝子改変された宿主細胞は、米国特許第5,288,852号、欧州特許第155549号、および米国特許第4,879 ,226号に記載される。TNFの改変体は、本発明においてまた使用され得、米国特許第4,677,063号に記載される。TNF-αおよびインターフェロンを含有する組成物は、欧州特許第131789号に教示される。ガン細胞増殖を阻害するにおけるTNF およびIL-4の共同作用は、WO 92/05805に記載される。遺伝子改変は、当該分野において公知の任意の方法によって達成され得る。典型的に、所望のサイトカインのコード配列は、標的細胞において構成的にまたは誘導的に活性である異種プロモーターに、転写およびタンパク質の翻訳に必要な他の制御エレメントおよびポリＡ配列とともに、作動可能に連結される。このように構成された発現カセットは、当該分野において公知の任意の方法（例えば、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性リポソームを用いる挿入）によって、または細胞について屈性のウイルスベクターを用いて、細胞に導入される。遺伝子改変の方法は、先述の段落において引用された特許文献に記載される。遺伝子改変の１つの好ましい方法は、実施例２において示されるような適切な発現カセットを含有する、LXSNレトロウイルスベクターの使用である。別の好ましい方法は、アデノウイルスベクター（M.Grafら、要約1994）の使用である。簡潔には、アデノウイルス組換え発現ベクターを、Microbix、Canadaによって供給されるプラスミドのような市販のプラスミドの遺伝子操作によって調製される。適切な感染条件および感染操作（MOI）は、β-ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子を使用する予備実験において決定され得、次いで、サイトカイン移入（Kammersheidt ら）のために使用される。ウイルスベクターを使用する利点は、ベクターが先ず複製され得、次いで完全な細胞の集団が感染および改変され得ることである。従って、遺伝子改変されたサイトカイン分泌細胞は、細胞株として樹立され得るか、または新鮮な白血球搬出調製物は、本発明のワクチンにおける使用の直前にデノボ改変される。後者の例において、ワクチンの調製はさらに、意図される受容者に同種異系の細胞の集団を、目的の特定のサイトカインのコード領域を含有するウイルスベクターで感染する工程を包含する。同種異系リンパ球の遺伝子改変は、処置される被験体からのリンパ球との共存培養の代替として、またはそれに加えて行われ得る。適切なサイトカインまたはサイトカインの混合物を産生する能力を付与することは、同種異系リンパ球が自己刺激することを許容し得、被験体白血球との共存培養についての必要性を除去する。より頻繁には、２つの効果が相補的であるかまたは共同的であり、そして両方を行うことが好ましくあり得る。例えば、主要なサイトカインを産生するように改変されたリンパ球は、次いで、被験体の白血球とともに共存培養され、次いでこれは、少ないが重要な量で他のサイトカインの産生を活性化し得る。同様の手順が、ワクチン組成物における使用のために原発性腫瘍株または腫瘍細胞株を遺伝子改変するために用いられ得、それによってこれらの細胞はサイトカインを産生する。このような改変された腫瘍細胞の記載は、実施例２に提供される。一般に、腫瘍細胞よりも同種異系リンパ球を遺伝し改変することが望ましい；腫瘍細胞は、典型的に被験体への投与の前に照射されるからでもある。それにもかかわらず、腫瘍細胞を改変することは、ある利点を付与し得る。特に、腫瘍細胞は、安定な細胞株を容易に形成し得る。このような株（特に、共通の腫瘍関連性の抗原の範囲を保有する株）は、複数の被験体を処置するためのワクチンにおける使用のために、標準的なサイトカインを分泌する細胞株を作製するために使用され得る。実施例２に示されるように、増殖を停止する放射の用量後、ある時間、遺伝子改変からのサイトカインを産生し続ける腫瘍株が作製され得る。本発明における使用について、これらの特性を有する株が、開発され得、そしてワクチンのアセンブリの直前まで、培養を増殖または維持される。腫瘍細胞の必要な数は、正確な用量で照射され、そして同種異系リンパ球と混合される；その間、生存する改変された腫瘍細胞の保存は、追加抗原投与のために必要とされる場合、保存液（reserve）中に維持される。ワクチンのアセンブリ：集団における種々の細胞の生存性を最大にするために、またはそれらの意図される機能を維持するために、投与の時間の近くでワクチンをアセンブリすることが好ましい。種々の細胞集団があらかじめ回収され得、そして、培養されるか、または細胞型およびワクチンにおける機能に一致する範囲に低温保存される。新鮮に得られた細胞が好ましい。混合されたリンパ球培養物からの細胞または完全なワクチンはまた、混合物として低温保存され得る。しかし、患者への投与のわずか前にMLCを行い、次いで腫瘍細胞を添加することが好ましい。同種異系細胞が、MLCによって刺激される場合、通常、３つの細胞集団がワクチン中に存在する：被験体の腫瘍細胞、スティミュレーター細胞、および同種異系応答因子細胞。スティミュレーター細胞の役割は、主に、インビトロで同種異系細胞を刺激することであり、そして最終的なワクチン組成物中にそれらを存在させる必要性はなくてもよい。従って、スティミュレーター細胞は、必要に応じて除去され得るが、これはいつも必要なわけではない。細胞を調製するにおいて、特にMLRにおいて使用される、被験体において所望しない影響を有し得るさらなる成分を除去することが重要である。特に、胎児ウシ血清、ウシアルブミン、または培養培地中の他の生物学的補充物は、典型的に、それらに対する免疫学的副作用を回避するために、除去される。典型的に、ワクチンの細胞成分は、例えば、反復される穏やかな遠心分離によって洗浄されて、適切な薬理学的に適合性の賦形剤中へ入れられる。適合性の賦形剤としては、等張性の生理食塩水(生理学的に適合性の緩衝液（例えば、リン酸、Hepes）、およびデキストロース生理学的に適合性のイオン、またはアミノ酸のような栄養分を含有するかまたは含有しない)、ならびにリンパ球集団で使用するための種々の培養培地（特に他の免疫原生成分を欠くもの）が挙げられる。アルブミンおよび血漿画分、ならびに非活性な濃稠化剤のようなキャリア試薬（carying reagen t）もまた使用され得る。非活性な生物学的成分は、これらが薬理学的調製物中に存在する限り、好ましくは、処置されるものと同じ種に由来し、そしてさらにより好ましくは、被験体からあらかじめ得られる。本発明のワクチン組成物は、必要に応じて、腫瘍関連抗原および活性化された同種異系細胞とは独立にまたはこれらと協調して作用するさらなる活性成分を含み得る。このような随意の成分としては、単離されたまたは組換えのサイトカイン(特に本明細書の開示において明示的に言及されるサイトカイン)、アジュバント、および他の細胞型が挙げられるが、これらに制限されない。本発明のワクチン組成物は、妥当で重要可能な基準により、ワクチン自身が、レシピエントにさらなる主要な病状を付与しないことを確認された場合、ヒトへの投与に「適切である」と考えられる。局所的炎症、硬化、もしくは疼痛のような副作用、または発熱応答は、回避され得なくてもよく、処置が患者の実質的な割合において、他の点では首尾よい場合、一般に、受容可能である。しかし、組成物は、ａ）特に、同種異系リンパ球のドナーからの無関係な病理学的感染因子または化学因子；ｂ）組織培養において生じ得るまたは増殖され得るような所望しない増殖（例えば、細菌、細菌性トキシン、マイコバクテリア、およびウイルス；ｃ）受容可能でないレベルの、処置される被験体に由来しない腫瘍形成因子または積極的に増殖するガン細胞；ならびにｄ）所望しない免疫応答、特にアナフィラキシー発作を開始または達成する傾向のある成分、を可能な限り(reasona bly)含まないべきである。使用され得る特定の試験は、本明細書の開示の実施例の節において列挙される。本発明の組成物、およびその亜成分(subcomponent)は、単位投薬量またはキットの形態で供給され得る。本発明のキットは、細胞性ワクチンの種々の成分を含み得るか、または薬学的組成物は別個の容器中に提供される。容器は、ともに混合される場合、本発明のワクチンを、単位投薬量または複数の投薬量の形態で構成するような、細胞および抗原を別々に含み得る。好ましいキットは、別々の容器中に以下を含む：ヒトと同種異系である刺激されたリンパ球、特に、同種異系リンパ球と自己の白血球との共存培養から得られる細胞；およびヒト由来の腫瘍関連抗原（特に、ヒトからの原発性腫瘍細胞、またはその子孫）。あるいは、キットは、１つの容器に細胞混合物を含み、そして別の容器に薬学的賦形剤を含み得る。このカテゴリーの好ましいキットは、第１の容器に、処置される被験体に対して同種異系である刺激されたリンパ球、特に混合されたリンパ球培養物からの細胞を、そして第２の容器中に、薬学的賦形剤を含む。使用者は、被験体からそれら自身の腫瘍細胞を調製するために賦形剤を用い得；次いで細胞は、被験体への投与のために刺激された同種異系リンパ球と合わせられる。本発明のパッケージングされた組成物およびキットは、典型的には、組成物の保存、調製、および投与のための説明書を含む。ガン処置における細胞性ワクチンの使用本発明の組成物は、被験体（特にヒト被験体であるが、これに制限されない）に投与され得る。本発明の組成物は、腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘発するために、またはガンを処置するために、特に有用である。処置の目的：ワクチンを投与する１つの目的は、免疫応答を誘発することである。免疫応答は、体液性成分もしくは細胞性成分、またはその両方を含み得る。体液性免疫は、処置される個体からの血清サンプル中の抗体レベルについての、標準的な免疫アッセイによって決定され得る。細胞性免疫は、ガンの免疫監視において重要な役割を果たすと考えられるので、細胞性免疫応答を生じさせることは、しばしば、処置の特定の目的である。本明細書中で使用されるように、「細胞性免疫応答」は、Ｔ細胞を含む、インビトロまたはインビボにおいて観察され得る応答である。一般的な細胞性免疫応答は、ワクチンの投与後に被験体からサンプリングされた細胞（特に、PBL）における、Ｔ細胞増殖活性として測定され得る。好ましくは、被験体に由来する不活化された腫瘍細胞は、スティミュレーターとして使用される。PHAのような非特異的マイトジェンは、ポジティブコントロールとして作用し；無関係なスティミュレーター細胞とのインキュベーションは、ネガティブコントローとして作用する。PBMCとスティミュレーターとの、適切な期間（典型的には５日）のインキュベーション後、[³H]チミジン取り込みが測定される。所望であれば、Ｔ細胞のどのサブセットが増殖しているかの決定は、フローサイトメトリーを用いて行われ得る。Ｔ細胞の細胞傷害性（CTL）もまた、測定され得る。この試験において、被験体からの富化されたＴ細胞集団が、標準的な⁵¹Cr 放出アッセイにおけるエフェクターとして使用される。腫瘍細胞は、約200μCi のNa₂ ⁵¹CrO₄を用いて、60分間、37℃にて、標的として放射性標識され、次いで洗浄される。次いで、Ｔ細胞および標的細胞（約１×10⁴/ウェル）は、96ウェルのＵ底プレートにおいて、種々のエフェクター：標的の比率で合わせられる。プレートは、100×gで、５分間遠心分離されて、細胞接触を開始し、そして、４〜 16時間、37℃で、５% CO₂と共にインキュベートされる。⁵¹Crの放出は、上清において測定され、そしてＴ細胞の不在下でインキュベートされた標的と（ネガティブコントロール）または0.1％ TRITON^TM X-100と（ポジティブコントロール）、比較される。ワクチンを投与する別の目的は、新生物性疾患、特にガンの処置のためである。ワクチンの有益な効果は、一般に、少なくとも部分的に免疫媒介されるが、免疫応答は、他で必要とされない限り、組成物および処置方法が本発明の範囲内にあるために、明確に実証される必要性はない。適切な被験体：本発明の組成物は、ヒトおよび非ヒト脊椎動物の両方への投与のために使用され得る。これらは、特に異系交配された集団において、および特に自発性の腫瘍において、以前に利用可能な組成物に比して利点を提供する。獣医学の適用は、本発明の範囲内であることが意図される。細胞性ワクチンは、ヒト被験体において試験されており、そしてヒト処置に特に適切である。ワクチンは、管理する医師の裁量を伴って、任意のヒト被験体に与えられ得る。典型的には、被験体はガンを有するか、ガンを発症する実質的な危険性があるかのいずれかである。治療のための典型的なヒト被験体は、２つの群を含み、これは臨床学的基準によって区別され得る。「進行性疾患」または「高い全身腫瘍組織量」を伴う患者は、臨床学的に測定可能な腫瘍を保有する患者である。臨床学的に測定可能な腫瘍は、（例えば、触診、MRI、CATスキャン、Ｘ線、または放射性シンチグラフィーによって）腫瘍塊に基づいて検出され得る腫瘍である（それら自身のポジティブな生化学的または組織病理学的マーカーは、この集団を同定するのに不十分である）。本発明に含まれるワクチン組成物は、進行性疾患を伴う患者に、それらの状態を軽減することを目的として投与される。理想的には、腫瘍塊の減少が、結果として生じるが、任意の臨床学的改善が、利益を構成する。臨床学的改善としては、進行の危険性もしくは速度の減少、または腫瘍の病理学的結果の軽減が挙げられる。適切な被験体の第２の群は、「アジュバント群」として当該分野において知られる。これらは、ガンの病歴を有しているが、治療の別の態様に反応性であった個体である。以前の治療としては、外科的切除、放射線療法、伝統的な化学療法、および免疫療法の他の態様が挙げられ得る（がこれらに制限されない）。結果として、これらの個体は、上述の定義による臨床学的に測定可能な腫瘍を有しない。しかし、それらは、元の腫瘍部位の近くに、または転移によるかのいずれかで、疾患の再発または進行の危険性があると推測される。アジュバント群はさらに、高い危険性の個体と低い危険性の個体とにさらに細分類され得る。細分別は、最初の処置の前または後に観察される特徴に基づいてなされる。これらの特徴は、臨床学的分野において公知であり、そして各異なるガンについて適切に規定される。高い危険性の亜群に典型的な特徴は、腫瘍が近隣組織を侵襲している特徴、またはリンパ節の関与を示す特徴である。本発明に含まれるワクチン組成物は、主に再発に対する予防的な手段として、抗ガン応答を誘発するために、アジュバント群の患者に投与される。理想的には、組成物はガンの再発を遅延するか、より好ましくは再発の危険性を減少する（すなわち、治癒速度を改善する）。このようなパラメーターは、他の患者集団および他の治療態様と比較して決定され得る。もちろん、２つの患者群の間の交差が生じ、そして本発明のワクチン組成物は、適切な任意の時間に投与され得る。例えば、治療は、高い全身腫瘍組織量を有する患者の伝統的な治療の前または間に行われ得、そして治療が臨床学的に検出不可能になった後に続けられ得る。治療は、最初はアジュバント群であったが再発の兆候を示している患者において続けられ得る。本発明の組成物および方法によって処置され得る腫瘍の例としては、以下が挙げられる：膵臓腫瘍（例えば、膵臓腺管ガン）；肺ガン（例えば、小細胞および大細胞腺ガン、偏平上皮細胞ガン腫、および気管支肺胞(brionchoakveolar)ガン腫）；結腸腫瘍（例えば、上皮腺ガンおよびその転移）；ならびに肝臓腫瘍（例えば、ヘパトーマおよび胆管ガン）が挙げられる。また、挙げられるものは、乳ガン（例えば、腺管および小葉腺ガン）；産婦人科学の腫瘍（例えば、子宮頸の鱗および腺ガン、および子宮および卵巣上皮腺ガン；前立腺腫瘍（例えば、前立腺腺ガン）；膀胱腫瘍（例えば、伝統的な偏平上皮細胞腺ガン）；RES系の腫瘍（例えば、結節性または分散性のＢまたはＴ細胞リンパ腫、プラズマ細胞腫、および急性または慢性白血病）；皮膚腫瘍（例えば、悪性黒色種）；ならびに柔組織腫瘍（例えば、柔組織肉腫および平滑筋肉腫）である。特に目的のものは、脳腫瘍（例えば、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫、髄芽腫、および初期の神経外胚葉腫瘍である。このカテゴリーに含まれるものは、神経膠腫、神経膠芽腫、および神経膠肉腫である。個体の免疫状態は、以下のいずれでもあり得る：個体は、組成物に存在するある腫瘍関連抗原に関して免疫学的にナイーブであり得、この場合、組成物は、抗腫瘍応答の成熟を開始または促進するために与えられ得る。個体は、抗腫瘍免疫を現在は発現していなくてもよいが、ワクチン中に含まれる腫瘍関連抗原に関連する免疫学的記憶、特にＴ細胞記憶を有し得、この場合、組成物は、記憶応答を刺激するために与えられ得る。個体はまた、ワクチン中に含まれる腫瘍関連抗原に対して、活性な免疫（体液性免疫もしくは細胞性免疫、またはその両方のいずれか）を有し得、この場合、組成物は、応答を維持、亢進(boost)、もしくは成熟化するか、または免疫系の他の兵器を動員するために与えられ得る。被験体は、少なくとも部分的に免疫応答性であるべきであり、それによって病理学的範囲の対宿主性移植片応答を最小にする。しかし、ガン患者はしばしは、所定の程度の免疫抑制を示すことが認識され、そしてこれは、本発明の組成物が安全にそして効果的に与えられ得る限り、本発明の組成物の使用を必ずしも妨げない。被験体における免疫応答性は、宿主起源であり得るか、または同時の養子移入処置によって提供され得る。投与の態様および用量：本発明の組成物は、任意の部位、特に、原発性腫瘍に対して「遠位の」、または原発性腫瘍から「遠い」部位で、被験体に投与され得る。薬学的組成物の投与の経路は、非経口、筋肉内、皮下、皮膚内、腹腔内、鼻腔内、静脈内（留置カテーテルを介してを含む）、求心性リンパ管を介してであり得るか、または処置される腫瘍および被験体の状態を考慮して適切である別の経路によってであり得る。投与後数日間に生じ得る低いレベルの炎症または硬化のために、比較的非侵襲性の方法、特に皮下経路が好ましい。与えられる用量は、所望の治療効果（免疫応答の刺激、本開示の他の場所で規定されるようなガンの処置）をもたらすにおいて「有効な」量である。本発明の薬学的組成物について、有効用量は、典型的に、約10⁵〜10¹¹細胞（同種異系リンパ球、ならびに存在する場合、処置される被験体からの腫瘍細胞および他の細胞を含む）の範囲にある。好ましくは、約10⁵〜10¹⁰の間の細胞が使用され；より好ましくは、約１×10⁷と２×10⁹との間の細胞が使用され；より好ましくは、約５×10⁷と２×10⁹との間の細胞が使用され；さらにより好ましくは約１×10⁸ と１×10⁹との間の細胞が使用される。所望される効果を達成するために組合わせて使用される場合の複数の用量は、それぞれ有効用量の規定の範囲内にある。細胞性ワクチンの種々の成分は、「有効な組合せ」で存在し、これは、ワクチンを有効にするためのそれぞれの成分の十分な量が存在することを意味する。好ましくは、少なくとも約10⁶の、より好ましくは少なくとも約10⁷の、しかし10¹⁰ を超えない同種異系リンパ球が存在する。好ましくは、少なくとも約10⁵の、より好ましくは少なくとも約10⁶の、そしてなおさらに好ましくは約10⁷の、しかし一般に10⁸未満の、そして典型的には５×10⁷未満の腫瘍細胞、腫瘍細胞子孫、またはそれらの等価物が存在する。自己のまたは第三者のスティミュレーター白血球が存在する場合、好ましくは、約10⁵と10⁸との間で存在する。同種異系リンパ球：スティミュレーター白血球の比率は、一般に1：1と100：１との間であり、通常約５：１と約25：１との間であり、典型的には約10：1である。しかし、ワクチンが全体として有効である限り、任意の数の成分細胞および他の構成要素が使用され得る。これはまた、ワクチンを調製するために使用された方法（例えば、投与の前に同種異系リンパ球と自己の白血球とが共存培養されたか否か）に依存する。組成物の有効性は、おそらく、一度被験体に投与された、刺激されたリンパ球および腫瘍抗原の近接性に関連する。投与の前に成分を予め混合することが最も簡便であるが、被験体のほぼ同じ付近への別々の投与によって、類似の効果が達成され得ることが容易に認識される。従って、本発明の実施態様は、成分が予め混合されている組成物のみならず、刺激されたリンパ球（例えば、ヒト患者に対して同種異系の異種活性化されたリンパ球）および腫瘍抗原（例えば、ヒト患者からの原発性腫瘍細胞、またはその子孫）を含む、外科的手術もしくは治療によるヒトの処置の方法における、同時の、別々の、または連続の使用のための（特に被験体における腫瘍を処置するか、または抗腫瘍応答を誘発するための）、組合わされた組成物を含む。本発明の薬学的組成物は、被験体における免疫応答の生成またはガンの処置に関連する他の治療に、続いて、先立って、代わって、または組合わせて、与えられ得る。例えば、被験体は、事前にまたは同時に、化学療法、放射線療法、ならびに免疫療法の他の形態および養子移入によって処置され得る。このような様式で使用される場合、これらは、本発明の組成物の免疫原性を妨げない、方法または時間で、好ましくは用いられる。被験体はまた、免疫応答を刺激するために別のワクチンまたは他の組成物を投与されていてもよい。このような代替の組成物としては、腫瘍抗原ワクチン、腫瘍抗原をコードする核酸ワクチン、抗イディオ型ワクチン、および他の型の細胞性ワクチン（サイトカインを発現する腫瘍細胞株を含む）が挙げられ得る。本発明のある実施態様は、組合せ療法に関し、抗腫瘍免疫学的応答を提供することを目的される別のストラテジーと組合わせた、本明細書中に記載される細胞性ワクチンの組合わせの施行を含む。１つの好ましい組合せ療法において、被験体は、刺激された同種異系リンパ球および自己の腫瘍細胞を含有する組成物を用いる、腫瘍から遠い部位での処置の前、間、または後のいずれかで、刺激された同種異系リンパ球の腫瘍内移植を与えられる。別の好ましい組合せ療法において、被験体は、刺激された同種異系リンパ球および自己の腫瘍細胞を含有する組成物を用いる処置の前、間、後のいずれかで、代替の細胞性ワクチン組成物を用いて、腫瘍から遠い部位で処置される。この目的のために好ましい代替の組成物は、上昇されたレベルでサイトカインを発現するように遺伝子改変されている同種異系細胞（特に腫瘍細胞）と混合された自己の腫瘍細胞を含む。複数の異なる組成物または投与の態様が、治療の過程を通して用いられる場合、処置の各要素の順番およびタイミングは、免疫刺激または抗腫瘍効果を至適化するように選択される。本発明の組成物の投与のタイミングは、管理する医師の判断の内にあり、患者の臨床学的状態、処置の目的、およびこれもまた施行される同時の治療に依存する。典型的に、患者の管理における適切な時間で、第１の用量が与えられ、そして患者は、免疫学的応答または臨床学的応答のいずれか、しばしばその両方についてモニターされる。免疫学的モニタリングの適切な手段としては、患者のPBL を応答因子として、そして原発性腫瘍細胞をスティミュレーターとして用いる、１方向MLRが挙げられる。免疫学的反応はまた、注入部位での遅延される炎症応答によって明らかにされ得る。腫瘍のモニタリングの適切な手段としては、腫瘍の型および特徴に依存して選択され、そしてCTスキャン、磁気共鳴画像化（MRI ）、適切な画像化剤を用いる放射性シンチグラフィー、循環する腫瘍マーカー抗原のモニタリング、および被験体の臨床学的応答が挙げられ得る。さらなる用量が、所望の効果が達成されるまで、月または週基準で与えられ得る。その後、および特に免疫学的および臨床学的利点がおさまるような場合、さらなる追加免疫のまたは維持の用量が、必要に応じて与えられ得る。細胞性ワクチンの複数の用量が同じ患者に与えられる場合、ワクチン中の同種異系リンパ球が抗アロタイプ応答を生じ得るという可能性に対して、いくつらかの注意を払うべきである。複数のドナーからの同種異系細胞の混合物の使用、および各用量の異なる同種異系細胞集団の使用は、両方とも、抗アロタイプ応答の出現を最小することを補助し得るストラテジーである。治療の過程の間、被験体は、注入部位での副作用、または発熱応答のような一般的な副作用について通常の基準を基に評価される。副作用は、適切な援助的な臨床学的看護を伴って管理される。以下に示される実施例は、当業者へのさらなる手引きとして提供され、そしていか様にも制限することを意味されない。実施例実施例１：混合されたリンパ球の移植を伴うガン処置この実施例は、混合されたリンパ球培養物において刺激された同種異系リンパ球が進行した脳ガンの腫瘍床に移植された、ヒト研究を記載する。結果として、局所の環境は、刺激されたリンパ球および任意の残余の自己の腫瘍細胞の両方を含んだ。この処置は、腫瘍進行を制限または逆転するにおいて、および処置された幾人かの被験体の生存を改善するのに有効であった。一致する観察は、本発明；特に被験体自身の抗腫瘍応答の明らかな能動的な改善を支持する。臨床学的試行を、再発性の高いグレードの星状細胞腫を伴う患者に対して行い、混合されたリンパ球培養物により患者の自己抗原に対して活性化された、同種異系リンパ球の直接的な腫瘍内移植に関連する、実行可能性、寛容性、および毒性を評価した。結果は、再発性の高いグレードの神経膠腫を伴う患者におけるML C活性化された同種異系リンパ球の直接的な腫瘍内移植は、実行可能および安全であり、ならびに臨床学的利益を提供するようであることを示す。バイオプシーで高グレードの星状細胞腫（Daumas-DuportのグレードIIIまたは IV）が証明された、９人の患者を、標準的な治療後のそれらの星状細胞腫の再発または進行後、MLC-活性化された同種異系リンパ球の腫瘍内移植についてランダムに選択した。試行は、Institutional Review Board of the Hospital of The Good Samaritan，Los Angels，CAによって許可された。全ての患者を、インフォームドコンセントを伴って登録した。患者の年齢は、24〜67歳（平均50歳）に及び、そして男性４人および女性５人であった。８人の患者は、グレードIVの星状細胞腫（神経膠芽腫多型、GBM）を有し、および１人の患者は、グレードIIIの星状細胞腫（未分化星状細胞腫）を有した。全ての患者は、以前の、減量（debulk ing）外科的手術、放射線療法、化学療法、および免疫療法（自己のLAK細胞およびIL-2）を受け、そして漸進的に増殖する腫瘍を示した。Kamofsky性能（perfor mance）スコアは、免疫療法時に、60〜80（平均72.6）に及んだ。患者の特徴を表１に列挙する：予備のスケールの混合されたリンパ球の培養を、以下のように行った。移植の３日前に、遺伝子的に関連のないドナーを同定し、そして白血球搬出して所望の数の白血球を得た。約2.5時間の白血球搬出は、日常的に、10×10⁹までの単核細胞を提供した。同時に、血液のユニットを患者から得、そして軟膜を遠心分離によって得た。次いで、ドナーおよび患者からの単核細胞を、FICOLL^TM-Hypaque勾配（密度＝1.077）での遠心分離によって得た。患者の単核細胞を、１時間、37 ℃にて、10μg/mlのマイトマイシンＣ（MC、Mutamycin）で処理することによって不活性化し、そして洗浄して過剰な薬物を除去した。次いで、ドナーの単核細胞を、MC処理した患者の単核細胞と10：1〜20：１の比率で、AIM V培地中で混合した（全細胞密度＝２×10⁶細胞/ml）。細胞をプラスチックの培養バッグ（Baxt er）に分散させ、そして、加湿された、５% CO₂/95%空気のインキュベーターでにおいて、37℃にて置いた。３日間のインキュベーション後、生存可能な細胞を遠心分離によって回収し、計数し、４〜５mlの患者の滅菌血漿に懸濁し、手術室に運んだ。移植の際、グルコン酸カルシウムを凝固を開始するために添加した。次いで、凝塊を、滅菌金属ディッシュにおいて細かく切り刻んだ。腫瘍を可能な場所で切除し、腫瘍床によって境界付けられる腔を形成した。刺激された、同種異系リンパ球を含有する、細かく切り刻んだ凝塊を、腔内に、および腫瘍が残存する任意の場所の内またはその隣りに、置いた。 MLC活性化同種異系リンパ球の腫瘍内移植に関連する臨床学的毒性を、表２に提供する。各投薬量レベルで、幾人かの患者は、グレード１および２の毒性を経験した。しかし、これらは一過性の影響であり、これらが免疫療法または外科的切除の影響であったか否かは不明である。各投薬量レベルでの脳水腫の程度を、デキサメタゾンの中程度の用量（８mg/日と24mg/日との間）の投与によって、制御し、これを数ヶ月間まで維持した。６×10⁹細胞までのより高い投薬量の細胞移植で、毒性は増加しないようであった。ドナーからのリンパ球を得るにおける物理的制限に起因して、移植された最大の投薬量は、６×10⁹細胞を超えなかった。臨床学的応答を、３つの基準によって評価した：ａ）最大の増強化直径の３軸測定を伴う、コントラスト増強剤を用いる、連続的なMRIスキャン；ｂ）Kamofsk y性能スコア；およびｃ）生存。試行において登録された９人の患者についての連続的なMRIスキャンからの腫瘍容量を、図１に示す。同種移植に対する腫瘍応答性のMRI形跡（ガドリニウム増強され、T1加重されたMRI画像によって評価される）が、９人の患者のうち３人において見られた。10〜130週間の観察期間にわたって、２人の患者において完全な腫瘍退行があり、および１人の患者において部分的な腫瘍退行（50％よりも高い収縮）があった。５人の患者において、連続的なMRIスキャンは、腫瘍サイズの安定化を示し、８〜20週間の観察期間にわたって、本質的に腫瘍は増殖しなかった。わずか１人の患者が、同種移植後、前進的な腫瘍増殖を示した。免疫療法の時間から測定された各投薬量レベルでの、患者についての全体の平均の生存は、２ ×10⁹細胞で24週間（範囲18〜24週間）、４×10⁹細胞で64週間（範囲10〜135週間）、および６×10⁹細胞で72週間（範囲20〜140週間）であった。重要なことに、２人の長期の生存者が存在した：４×10⁹細胞の投薬量（BTP-006、125週間を超える）での生存者、および６×10⁹細胞の投薬量（BTP-008、135週間を超える）での生存者。腫瘍内細胞移植に関連する臨床学的毒性を、表３に列挙する。毒性は、以下の基準に従って類別した：クレード０＝頭痛なし、発熱なし、発作なし；グレード１＝軽度の頭痛；グレード２＝頭痛、軽度の水腫（MRI）；グレード３＝重度の頭痛、中程度の水腫（MRI）：グレード４＝重度の頭痛、重度の水腫（MRI）、神経学的変化。不可逆性のグレード３またはグレード４の毒性は、用量制限的であった。これらの患者のそれぞれは、Karnofsky性能スコアにおいて、80（移植前）から100に改善された。２人の患者は現在生存しており、そして快適な生活を送っている。患者BTP-006の連続的なMRIスキャンはまた、24ヶ月間の期間にわたって、連続的な腫瘍の退行を示した。患者BTP-008の連続的なMRIスキャンはまた、24 ヶ月間の観察期間にわたって、腫瘍サイズの、緩慢な、持続性の減少を示した。移植部位の組織学は、移植後60日で死亡した患者に対して行われた剖検後、決定された。免疫組織化学を、10％の中性に緩衝化されたホルマリン中に固定化された組織切片に対して行った。５μmの切片を、シリコン処理されたガラススライド上に調製し、クロモゲンとしてDABを用いるアビジン−ビオチン複合体法を構成する、TECHMATE^TM自動化免疫染色システム（Biotech solutions Inc.、Sant a Barbara，CA）を用いて、異なる細胞性抗原に対する一次抗体で染色した。使用した一次抗原は、抗CD68（HAM56、マクロファージ）、L26（CD20，Ｂ細胞）、 UCHL-1（Ｔ細胞）およびGFAP（膠細胞）を含んだ。免疫染色後、組織切片をヘマトキシリンで対比染色し、そして免疫ポジティブな細胞について、顕微鏡で評価した。他の炎症細胞型および組織壊死の範囲の同定を、標準的なヘマトキシリン／エオシン染色された組織切片を用いる組織学的基準によって、平衡して決定した。同種移植片が置かれた手術部位近くで、嚢胞性の腔が見出され、フィブリンおよび組織化された血塊のみで充填された。顕微鏡で、残余の移植されたリンパ系細胞の形跡はなにも存在しなかった。しかし、移植部位から1.5cm離れた、腫瘍の周囲から採られた切片は、CD68+マクロファージおよび拡散されたリンパ球による腫瘍組織の広範囲の浸潤、および拡張された腫瘍壊死の形跡を示した。興味深いことに、多数のCD68+マクロファージ（小膠細胞）が同定され、正常な脳実質における近接の管から末期の腫瘍組織の領域へ明らかに移動した。この研究は、MLC-活性化同種異系リンパ球の腫瘍内移植が、実施可能であり、および患者によって十分に寛容されることを実証する。同種移植に関連する毒性は、時折の頭痛、低い程度の発熱、およびグルココルチコイドの投与によって制御される脳水腫を含んだ。長期の生存する患者は、移植後、数ヶ月間、ステロイドを残したが、最終的に非常に低い維持投薬量に減少した。手順は、連続的なMR Iスキャンに対して記される腫瘍応答によって測定されるように、有意な数の応答を伴い、そして最も重要なことに、患者の生存を延長した。実施例２：サイトカインの発現に対する細胞の遺伝子改変本発明のある実施態様において、サイトカインを上昇されたレベルで発現するように、１つの細胞集団または別の細胞集団が、遺伝子改変される。この実施例は、どのように細胞集団がサイトカインを発現するように遺伝子改変され得るのかの２つの制限されない説明を提供する。説明は代替的に、Maloneyマウス白血病ウイルスに由来するpLXSNプラスミドまたはLNCXレトロウイルス発現ベクターを利用する。細胞分裂または照射後であっても、安定な様式で、所望の産物を発現する遺伝子改変された細胞が生成される。 IL-4を分泌する細胞株：ヒト卵巣ガン細胞株を、IL-4をコードする構築物を含むレトロウイルスベクターを使用して、IL-4を分泌するように遺伝子改変した。細胞株は安定であり、放射の不活性化用量の後であっても、IL-4生合成し得た。細胞株はMHCクラスI抗原およびHer-2/neu抗原を発現するが、MHCクラスII抗原、 ICAM-1、CA-125、またはIL-4レセプターを発現しない。このような細胞株を生成するために有用な技術の詳細は、他の場所（Santinら、1995ｂおよびｃ）に記載される。簡潔には、ヒト卵巣細胞株UCI-107を、卵巣の原発性III期漿液性乳頭状腺ガン(primary Stage III serous papillary adeno carcinoma)を伴う、以前は未処置の患者から樹立した。UCI-101およびUCI-107細胞株は、Gamboa-Vujiclcらによって以前に特徴づけされており、およびAlberto Manetta博士（University of Callfornia、Irvine Medical Center）によって好意的に提供された。細胞を、RPMI 1640（Gibco Life Technologies）、10%胎児ウシ血清（FBS、Gemini Bioproducts、Calabassas、CA）、および１%のペニシリン／ストレプトマイシンサルフェート（Irvine Scientific、Santa Ana、CA）を含有する完全培地（CM）中、37℃、５% CO₂で維持した。レトロウイルスベクターを、以下のように構築した：pLXSNプラスミドは、A． Dusty Miller博士（Fred Hutchinson Cancer Center，Seattle WA）から好意的に提供された。このプラスミドは、Maloneyマウス白血病ウイルス（MMLV）に由来し、SV40エンハンサー／プロモーターによってその構成的な発現が駆動されるネオホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有し、組込まれたベクターの５'レトロウイルスLTRは、挿入された遺伝子の発現を駆動する。ヒトIL-4 cDNAを、ATCC から、OkalamaのおよびBergp CDクローニングベクターにおいて得られ、そしてB amHI制限酵素を使用して切り出した。次いで、cDNAをpLSXNのマルチクローニング領域におけるBamHI制限部位にクローン化した。cDNAの適正な方向を、診断的な制限エンドヌクレアーゼ消化によって決定した。一旦構築したら、次いで、レトロウイルスプラスミドDNAは、CsCl勾配密度遠心分離によって精製した。精製されたレトロウイルスプラスミドDNA（LXSN/IL-4）を使用して、リン酸カルシウム法によって、マウス内斜視パッケージング細胞株GP-E86を形質導入した。次いで、これらの細胞からの48時間の上清を使用して、マウス両種性パッケージング細胞株のPA317を感染した。PA-317パッケージング細胞株は、ATCCから得られ、そしてCM中で維持した。形質導入されたPA317細胞を、G418に対する耐性によって選択した。単離されたクローンを増殖し、アリコートに分け、そして主要な細胞バンクにおいて液体窒素下で凍結した。形質導入されたPA317クローンからの上清は、感染性の、複製不全なレトロウイルスを含み、これを使用してヒトガン腫細胞株を感染した。簡潔には、ヒト卵巣ガン腫細胞株を、100mmの組織培養ディッシュに、10ml CM中１×10⁶細胞の密度で播種し、そして４時間、37℃ 、５% CO₂で、インキュベートして付着させた。インキュベーション後、培地を吸引し、そして５mlのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）（Aldrich Chemical Co． Inc.Milwaukee，WI）中の２%ポリブレンで置換えた。37℃、５% CO₂で30分後、1 0mlのレトロウイルス上清を添加し、そしてレトロウイルス媒介性遺伝子移入を一晩のインキュベーションによって達成した。次いで、上清を吸引し、そしてCM で置換えた。37℃、５% CO₂でのさらなる48時間のインキュベーション後、形質導入されたクローンの選択を、0.075% G418（ゲネチシン、Gibco Life Techonol ogies）を含有するCMにおける培養によって達成した。14日後、滅菌の８×８の８mmクローニング注射器（Belco Glass，Inc.、Vineland，NJ）を用いて、クローンを単離し、そしてG418を含有するCM中で、３週間増殖した。親細胞株をG418 耐性についてのポジティブコントロールとして使用した。G418におけるクローン選択後、形質導入された細胞株を発現および研究のためにCMに戻した。細胞を、100mm組織培養ディッシュにおいて、0.5×10⁶細胞/10mlの密度で、CM 中に樹立した。細胞計数を、12、24、48、72、および96時間毎に行い、そして生存細胞の数を、トリパンブルー排除を用いて測定した。非形質導入（親の）腫瘍細胞株および形質導入された腫瘍細胞株の増殖を比較するための、および経時的なサイトカイン産生のレベルを評価するための実験を行った。上清を回収し、そして-20℃で凍結し（その後の、サイトカインレベルのELISA評価のために）、そして培養ディッシュをトリプシン処理して、細胞数および生存性を測定した。親のIL-4形質導入体、およびベクターコントロール細胞を、100mm組織培養ディッシュ（Corning）において、10mM CM中の１×10⁶細胞/mlの密度で播種した。 37℃、５% CO₂での48時間のインキュベーションの後、上清を吸引し、1,500rpm で10分間の遠心分離によって、無細胞にし、次いで-20℃で保存した。次いで、I L-4濃度を、市販のキット（Research & Diagnostic Systems、Minneapolis、Min nesota）を用いて、ELISAにより測定した。表４は、遺伝子改変されたヒト漿液性乳頭状卵巣ガン細胞の個々のクローンからのインターロイキン-4の分泌のレベルを示す。予想されるように、ベクターだけで形質導入された各親株および細胞は、検出可能なレベルのIL-4を産生しなかった。UCI 107E IL-4 GSと呼ばれる最良のIL-4 産生クローンを拡大し、そしてさらなる試験および広範囲にわたる特徴付けのためのマスター細胞バンクを形成するために使用した。親細胞株UCI 107は、インビトロで増殖させた卵巣の上皮細胞の特徴的な形態を有する。LXSNベクターだけで形質導入したか、またはIL-4遺伝子を含むLXSNで形質導入したUCI 107細胞の形態は、親107細胞の形態と区別できなかった。親、ベクターコントロール、およびUCI 107E IL-4 GS細胞の倍加時間を、それぞれ、 15.3、15.7、および18.6hrと決定した。これらの細胞の増殖速度においては、インビトロでの35継代および６ヶ月の培養にわたって、変化は観察されなかった。IL-4産生のレベルは、一貫して、６ヶ月の継代の間、900〜1300pg/ml/10⁵細胞/48時間の範囲であった。UCI 107E IL-4 GSのマスター細胞バンク（MCB）について行った広範な試験は、この株がマイコプラズマ、細菌、および感染性ウイルスを含まないことを明らかにした。サザン分析を、Neo^R遺伝子を、UCI 107E IL-4および親UCI 107株をプローブするために使用して行った。簡潔には、組織培養細胞の濃縮した懸濁物を、0.5％のSDSを含有するTNE緩衝液（10mM Tris、100mM NaCl、１mM EDTA、pH7.5）中で溶解させ、50μg/mlのプロテイナーゼＫで一晩37℃にて処理し、次いで、フェノールおよびクロロホルムで抽出した。DNA溶液を、100％のエタノール中で沈殿させ、糸状に巻き取り、そして10mM Tris、0.1mM EDTA（pH8）中に再懸濁した。10 μgの高分子量のDNAをSstI（GIBCO/BRL、Grand Island、New York）で消化し、0 .8％のアガロースゲル上での電気泳動によって分離し、そしてGene Screen Plus （Dupont NEN，Boston，Massachusetts）転移した。転移、ハイブリダイゼーション、および洗浄を、製造業者の説明書に従って行った。ランダムプライマーIL -4プローブを、TaborおよびStruhl（1988）（Current Protocols in Molecular Biology，第１巻、2.2.1−2.2.3）の方法によって調製した。結果から、20回の継代後、UCI 107E IL-4がなおベクターDNAを含んでいたことを確認した。照射後のIL-4分泌の安定性を、以下のように試験した：細胞をCM中の15mlのコニカルチューブ中で、室温にてガンマ線（¹³⁷Cs）を200rad/分の線量速度で照射した。照射の直後、細胞をペトリ皿培養プレートに、10mlのCM中に１×10⁶細胞の密度で播種した。1,000から10,000radの試験線量を適用した。照射した細胞を 37℃にて５％のCO₂雰囲気下で培養し、そして全ての皿において培地を4日ごとに完全に入れ替えた。48時間ごとに、サイトカイン産生のための皿から培養上清を回収し、そして生存している細胞の数を、トリパンブルー排除により光学顕微鏡によって評価した。この実験の結果を、図２に示す。2,500から10,00radの間で照射した細胞は、約８日間の間生存性を維持したが、全ての細胞が３週目までに死滅した。1,000r adで照射した細胞を再び捕捉し、そして増殖させ続けた。サイトカイン産生のレベルは、全ての線量で８日間検出可能であり、そして生存している細胞の数は密接に相似した。パネルＢは、これらの別々の実験における5,000rad（□）または 10,000rad（■）での照射後の、IL-4産生を示す。パネルＣは、２つの別々の実験における5,000radまたは10,000radでの照射後の、UCI 107E IL-4 GS細胞による、pg/ml/10⁵細胞/48時間で標準化したIL-4産生を示す。生存性において、２日目（p＝0.72）、４日目（p＝0.14）、６日目（p＝0.10）、および８日目（p＝0. 3）に、2、500、5、000、および10、000radで照射した細胞間で、統計学的に有意な差異は見られなかった。まとめると、これらの結果は、UCI 107E IL-4 GS細胞が安定なIL-4分泌細胞株を構成することを示す。これらの細胞は、効率的に複製を停止し、なお１週間までの間IL-4の産生を維持するように照射され得る。 TNF-α分泌細胞株：ヒトTNF-αをコードする配列は、ラットの神経膠芽腫株を遺伝的に変更するために使用され、そしていくつかの異なる膠腫株に対する保護を与えることが示されている。Grafら（1994）Soc．Neuroscience（要約）。簡潔には、TNF-αをコードする配列を、TNFに非感受性FischerラットT9の神経膠芽腫細胞株に、LNCXレトロウイルス発現ベクターを使用するレトロウイルス媒介性遺伝子形質導入によって挿入した。生物学的に活性なTNFを2,000pg/106細胞 /48時間のレベルで分泌する、T9/LNCT2と命名したクローンを単離した。形質導入した細胞、T9親細胞、およびベクターだけで形質導入した細胞（T9/LNCXと命名）の増殖速度を同定した。T9/LNCT2株は、まる1年にわたって、TNF分泌能力を欠失することなく維持された。親細胞またはベクターコントロールT9細胞を、Fischerラットの脇腹に皮下注射した場合、腫瘍が確立され、そして動物が死亡するまで増殖した。対照的に、皮下注射したT9/LNCT2細胞は最初に増殖したが、３〜４週間で40〜50％の動物で退行した。TNFは、この期間の間、皮下のT9/LNCT2細胞によって分泌された。生き残った動物は、１年後でさえ、親のT9での頭蓋内の再チャレンジに全体的に耐性であった。さらに、これらの動物はまた、同系の膠腫細胞株9Lでのチャレンジに対して耐性であった。実施例３：細胞移植（cytoimplant）での処理後の再チャレンジに対する耐性ガンの処置のためのラットモデルを、転移性の乳ガン細胞株（MADB）10⁶L^-1を Fisher 344同系交配ラット株の肝臓の中葉に注射することによって作製した。腫瘍を通常通りに測定し、そして処置前の14日間に確立させた。混合したリンパ球培養物を、１：１の比で、不活化したFisher 344スティミュレーターリンパ球とWistar-Furth（W/F）同種レスポンダーリンパ球とを使用して調製した。培養開始の３日後、80×10⁶個の細胞を、確立させた連続的に増殖している腫瘍に直接注射した。5匹のラットの群を、以下のように処置した：1群は注射をしなかった；２群は腫瘍に直接、感作されていない同種W/Fリンパ球を注射した；３群は、混合したリンパ球反応物から得た細胞で同様に注射した。生存性におけるMLC処置の効果を、表５に示す： MLC処置した群は、長期間生存する唯一の群であった。生存している動物は、親の腫瘍細胞での再チャレンジに対して耐性であった。混合したリンパ球培養物を介して刺激した同種リンパ球の直接的な腫瘍内移植が、有意な生存性の利点を付与すると、結論づけられた。この効果は、活性化されたリンパ球および局所的な腫瘍の微環境におけるサイトカイン産生に応答して、宿主の抗腫瘍免疫性の免疫活性化を通じて媒介され得る。実施例４：腫瘍から離れた部位での細胞ワクチン化本実施例は、マウスのモデルにおける、同系腫瘍細胞と混合した刺激した同種リンパ球を含む細胞ワクチンの使用を確立し、そして免疫学的応答の生成および腫瘍耐性の付与に有効な量を同定する。一般的な材料および手順は以下のとおりである。代表的には、約１〜２×10⁸ の脾臓細胞を単一のマウスの脾臓から採集する。レスポンダー脾臓細胞とスティミュレーター脾臓細胞とを混合し、そして10％のウシ胎児血清および１mLのBME を補充した１mLのRPMI培地中で、CO₂インキュベーター中で37℃にて３日間培養する。培養上清を、ELISAによって、IL-2、TNF、IFN-γ、およびIL-4について分析する。培養した細胞中の細胞表面のCDマーカーを、フローサイトメトリー分析によって決定する。細胞をまた、小さなリンパ球、乳房細胞、およびアポトーシス体の数を決定するために形態学的基準によってモニターする。混合したリンパ球培養物由来の必要な数の細胞を、腫瘍細胞と、約100μLの最終的な注射容量でリン酸緩衝化生理食塩水中で合わせる。この組成物を、右側の脇腹への皮下注射によって投与する。注射部位を、炎症の兆候について試験し、そして脾臓細胞を、免疫学的基準の決定のために定期的に回収する。生検サンプルおよび解剖サンプルを、標準的な形態学的基準および免疫組織学の両方によって試験する。 J588Lは、Balb/cマウスにおける自発性腫瘍に由来するプラズマ細胞腫細胞株である。10⁶の生存性のJ588L細胞の皮下注射によって、細胞性の塊死によって達成された、約12日以内に処置された組織適合性マウスの100％において、５mmより大きい直径の触診できる腫瘍が形成される。この型の実験においては、腫瘍が約10mmの直径に達した後にマウスを屠殺する。 1つの実験において、Balb/cマウスを、10⁶の細胞移植細胞と混合した10⁶のJ58 8Lプラズマ細胞腫細胞で皮下注射した。細胞移植のための細胞を、10：１の比で Balb/c脾臓細胞を含むC57BL/6脾臓細胞を３日間培養することによって生成した。注射部位での腫瘍の増殖を、細胞混合物で処置したマウスにおいて測定し、そしてコントロールとして、10⁶のC57BL/8脾臓細胞のみと混合した10⁶のJ588L細胞で注射したマウスのものと比較した。コントロール群の全ての15匹のマウスは、14 日以内に少なくとも１cmの直径の腫瘍を有した。しカル、前者の群の15匹のマウスのうちの11匹は、腫瘍の増殖を有さなかった；他の４匹のマウスは、コントロールよりもゆっくりと増殖する腫瘍を有した。この群の生存しているマウスを、さらなる追加用量のJ588L細胞で反対側の脇腹に皮下チャレンジして、腫瘍に対する進行中の全身性の免疫学的応答が存在するかどうかを決定した。10匹のマウスのうちの７匹が、再チャレンジに対して耐性であり、このことは、腫瘍の増殖がないこと、または制限された増殖、それに続く退行を示す。細胞移植の細胞と得られる応答との間の相関関係のさらなる特徴付けを、表６に示す組み合わせで試験することによって行う。 10⁶の培養細胞を10⁶のJ588L細胞と混合し、そしてBalb/cマウスに注射し、そしてそれらの応答を上記のようにモニターする。生存しているマウスを、進行中の免疫および腫瘍耐性について、10⁶のJ588L細胞だけでの皮下チャレンジによって試験する。実験の第2のセットは、ワクチン組成物中にモジュレーターを含むことの利点を決定することに関する。Ｔヘルパー細胞は、２つのサブセットに機能的に分類され得る。T_H1細胞は、IL-2、IFN、またはIL-12の存在下で構成され、そしてインビボでの細胞性細胞傷害性に好ましいと考えられている。T_H2細胞は、IL-4、I L-5、またはIL-10の存在下で構成され、そしてＢ細胞分泌に好ましいと考えられている。T_H1細胞は、IL-2の存在のために、代表的なインビトロの混合リンパ球培養の間に優性であり得る。T_H2細胞は、IgEの産生および好酸球媒介性腫瘍細胞融解の関与によって、強力な抗腫瘍免疫において役割を果たし得る。実験を行い、ここで、ワクチン組成物の刺激した同種リンパ球を提供するために使用される混合リンパ球培養物に、関連のモジュレーター（詳細には、IL-2、 IL-4、またはプレドニソン）を補充する。モジュレーターのレベルを、Piccinni ら（1995）J．Immunol．155:128ff．およびSpitsら（1988）J．Immunol．141:29 -36によって使用された範囲で、最初に試験する。Balb/c脾臓細胞を有するC57BL /6脾臓細胞を、培養の０日目の始めにそれぞれの試験モジュレーターを補充した培地中で、10：１の比で同時培養する。補充していない培養物と比較して、IL-2 は、T_H1細胞の集団を増強することが予想されるが、IL-4またはプレドニソンはT_H 2細胞の集団を増強することが予想される。各培養物の特徴を、イムノアッセイまたはバイオアッセイによって上清中のサイトカインレベル（例えば、IL-2（T_H 1によって分泌される）、IL-4、IL-5（T_H2によって分泌される）、IFN-γ、またはTNF-α）を測定することによって決定する。各培養物の特徴をまた、フローサイトメトリーにより細胞表面マーカー（例えば、CD45RB（T_H2よりもT_H1において高い）；CD-69、およびIL-2レセプター（活性化された細胞において上昇される））によって決定する。保護実験を、以下のように行う：10⁶の培養細胞を、10⁶のJ588L細胞と混合し、そしてBalb/cマウスに注射し、そしてそれらの応答を上記のようにモニターする。生存しているマウスを、進行中の免疫および腫瘍耐性について、10⁶のJ588L 細胞だけでの皮下チャレンジによって試験する。免疫学的応答の特異性を、無関係の腫瘍株で免疫マウスをチャレンジすることによって試験する。T_H1細胞について富化した培養物から作成したワクチンの効果を、T_H2細胞について富化した培養物から作成したワクチンと比較する。さらなる実験を行い、ここで、動物を両方の型の培養物とJ588Lプラズマ細胞腫細胞とを組み合わせた細胞を含む組成物で処置する。実施例５：異種活性化の程度の測定高品質の有効なMLC細胞の産生を確実にするために、異種活性化細胞の子孫を測定する方法を使用し得る。未刺激のコントロール細胞を超えるそれ以上の活性を有する細胞培養物のみを、臨床的に使用するべきである。種々の個体由来の単核細胞のベースライン活性が広範に変化するので、未刺激のコントロールと活性を比較することが有用である。いくつかの方法が、リンパ球活性化を測定するために有用である。未刺激の単核細胞と比較して、異種活性化細胞はホルマザン色素をさらに還元し、そしてより高いエステラーゼ活性を有する。XTT（ホルマザン色素）の転換は、470nm（対照650nm）比色定量分光測定法によって、96ウェルプレートで容易に示し得る。活性化細胞は、代表的には、コントロールよりも高い吸光度を示す。リンパ球活性化もまた、エステラーゼ基質であるフルオレセインジアセテート（FDA）を使用するエステラーゼ活性のフローサイトメトリー測定によって示し得る。高エステラーゼを有するＴ細胞は、FDAおよびフィコエリトリン標識CD3抗体を使用して決定されない。エステラーゼ活性を、より高い濃度のFDAを使用するプレートアッセイ、および96ウェルプレート形式で494nm（対照650nm）での分光測定法によるエステラーゼ活性の測定において正確に測定し得る。血清含有培地に固有のバックグラウンドのエステラーゼ活性を、競合エステラーゼインヒビター（約10mM ）（アルギニンメチルエステル）の添加によって阻害する。ほとんどの部分で、これらの測定値は、互いに、および胚発生と良好な相関を示す。１：MTTホルマザン還元アッセイこのアッセイを使用して、培養サンプルの、MTTをブルーグリーンホルマザン色素に還元する能力によって生細胞を計数する。そしてこのアッセイはまた、不活性な細胞から活性化された細胞を区別することを補助する。これは、事実上任意の培地で事実上任意の細胞に使用し得る。有用な細胞の範囲は、10⁵〜５×10⁶ ／mLの間の範囲である。試薬：・96ウェルプレート、平底（ELISAプレートではない）・５mg/ml MTT（Sigma）を含有するPBS（凍結）・20％ SDSを含有する45％ DMF、0.2N HCl（37℃に予め暖めた）手順：・二連または三連で96ウェルプレート中に細胞を含む100μlの培養培地を置く。コントロールについては100μLの培地のみを使用する。最初のカラムはあけておく。・各ウェルに10μLのMTTを添加する。プレートを軽くたたいて混合する。プレートを覆い、そして37℃にて４時間インキュベートする。・50μLのSDS溶液を、泡ができないように添加する。軽くたたいて混合する。泡がある場合は、表面に息を吹きかける。570nm（対照650nm）でプレートをカウントする。 II．XTTホルマザン還元アッセイこのアッセイを使用して、サンプルに対する培養物の、XTTをレッド-オレンジホルマザン色素に還元する能力によって生細胞を計数する。そしてこのアッセイはまた、不活性な細胞から活性化された細胞を区別することを補助する。これは、事実上任意の培地で事実上任意の細胞に使用し得る。有用な細胞の範囲は、10⁵ から５×10⁶／mLの間の範囲である。試薬：・96ウェルプレート、平底（ELISAプレートではない）・１mg/ml MTT（2,3-ビス（2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホ-フェニル-2 H-テトラゾリウム-5-カルボキシアニルニド塩、Sigma）を含有するPB S（新鮮）・1.53mg/mL PMS（フェニルメタンスルホニルフルオライド、Sigma）を含有するPBS（凍結、光から保護した）手順：・二連または三連で96ウェルプレート中に細胞を含む100μLの培養培地を置く。コントロールについては100μLの培地のみを使用する。最初のカラムはあけておく。・使用の直前にXTTとPMS（１mLのXTTあたり５μL）とを予め混合する。各ウェルに50μLのXTTを添加する。軽くたたいて混合する。・プレートを覆い、そして37℃にて４時間インキュベートする。470nm （対照650nm）でプレートをカウントする。 III：CD3/CD69またはCD3/FDAのフローサイトメトリーこれは、混合したリンパ球での異種活性化後のＴリンパ球活性化の測定である。CD69の発現またはエステラーゼ活性のような活性は、サイトカインの分泌と相関し、そしてリンパ球活性の測定の代替物として使用され得る。未刺激のリンパ球は表面のCD69を発現せず、そして低レベルの非特異的エステラーゼのみを有する。同種抗原または非特異的マイトジェンによって一旦活性化されると、CD69の発現は48時間以内に生じる（ピークは24時間）。エステラーゼ活性は、刺激後すぐに上昇し、そして数日間持続する。全てではないが、同種刺激リンパ球反応は、同じ速度論で進行し、そして培養の１、２、および３日目に活性を測定することが好ましい。サンプル：ドナー細胞および患者の細胞の試験サンプルを、２％のFCS-RPMI中の0.5×10⁶ 細胞/mLで少量の培養物中で混合する。これらの培養物を、試験するまで５％のC O₂インキュベーター中で37℃にて維持する。試薬：・モノクローナル抗体：・CD3-PE（Coulter) ・CD69-FITC（Becton-Dickinson）。使用しない場合は冷蔵し、そして光から保護して維持する。・フルオレセインジアセテート（Sigma）：ストック溶液を10mg/mL DMS Oで調製し、光から保護し、そして試験するアリコートを凍結ロット中で保存する。ストックをDMSOで１：100に希釈することによって毎週作業溶液を生成し、作業溶液を冷蔵し、そして光から保護して維持する。・D-PBS、0.5％のパラホルムアルデヒド-0.05％ TRITON^TM X-100を含有するPBS 手順：内部コントロールの未刺激の細胞、および活性化した単核細胞のサンプルを、必要とされる基準に基づいて産生する。大きなロットの試験されるバッチを、10 ％のDMSO凍結培地中の250μlのアリコート中に凍結する。健常なドナー由来の単核細胞を使用して、活性化したコントロール標本を産生し得る。これらの細胞を、２％のFCS-RPMI中に0.5×10⁶細胞/mLに置き、100mLにする。細胞を、２μg/mLのPHAレクチンの存在下または非存在下で、37℃にて２日間培養するか、または第２のドナー集団と10：１の比で混合する。細胞を350 ×gで５分間の遠心分離によって回収する。培地を除去し、そして１／10の容量のDMSO凍結培地で置き換え、そして凍結する。必要とされる場合は、コントロールの未刺激の細胞および刺激した細胞を迅速に融解し得、そしてPBSの９倍容量の添加によって元の容量に再懸濁する。コントロール細胞を、試験培養物由来のサンプルとともに以下のプロトコールに従って分析する。コントロール標本の二連での使用は、付加的な質的に確実な測定である。CD69細胞またはエステラーゼ陽性リンパ球の割合は、５％の変動内であるはずである。５μLのCD3-PE抗体（サンプルあたり）を、0.5mLのPBS（サンプルあたり）中に希釈する。10μLのCD69（サンプルあたり）または１μLのFDAの作業溶液（サンプルあたり）のいずれかを添加する。 12×75mmの標識したポリスチレンチューブに、0.5mLの希釈した抗体を移す。各チューブ（対照コントロール、未刺激のドナー細胞、および異種活性化細胞を含む）に100μLの十分に混合したサンプルを添加する。穏かにボルテックスし、そして室温で30分間インキュベートする。0.5mLの0.5％パラホルムアルデヒド-0 .05％ TRITON^TM X-100 PBSを添加し、そして混合する。計数を、適切に備えたフローサイトメーター（例えば、EPICS XL Coulter Flo w Cytometer）で行う。いずれのプロトコールのヒストグラム１（前方散乱対CD3 ）も、CD3+単核細胞周辺の豊富な(generous)ゲートを有するはずである。領域Ａは、適切な％Ｔリンパ球であるはずであり、そしてヒストグラム２にわたる（pa ss）はずである。ヒストグラム２では、側部の散乱対CD3の使用が、溶解していないPBS、RBC ghost、血小板凝集物、残存している顆粒球、および／または他の破片からのリンパ球（低い側部の散乱レベル）の区別を可能にする。ゲートは、リンパ球の周辺を取り囲む（例えば、ヒストグラム２を参照）。この第2のゲートは、ヒストグラム３にわたり、ここでCD3+ CD69+細胞、またはCD3+ FDA+細胞が提示される。ゲートを設定するために、最初にコントロール値を実施する（未刺激のコントロール）。ヒストグラム３の４倍のスタットカーソル（quad stat cursor）を配置し、その結果、CD69またはFDAのより高い値（Quad2）は２％である。刺激したサンプルを分析する場合は、このゲート設定をそのままにする。各サンプルについての少なくとも5,000のゲートを通過した細胞を、97％の信頼区間を得るためにカウントする。 IV：FDAプレートアッセイこのアッセイを使用して、培養サンプルの、エステラーゼ基質であるフルオレセインジアセテートを転換する能力によって生細胞を計数する。そしてこのアッセイはまた、不活性な細胞から活性化された細胞を区別することを補助する。このアッセイは、事実上任意の培地に使用し得る。有用な細胞の範囲は、10⁵と５ ×10⁶／mLとの間の範囲である。試薬：・96ウェルプレート、平底（ELISAプレートではない）・10mg/mL FDA（Sigma）を含有するDMSO（ストック、光から保護した）・10mg/mLアルギニンメチルエステル（Sigma）を含有するDMSO 手順：二連または三連で96ウェルプレート中に細胞を含む100μLの培養培地を置く。コントロールについては100μLの培地のみを使用する。新鮮なFDAの作業溶液を、ストックFDAのPBS１mLあたり10μLおよび１mLあたり 50μLのAMEストックを添加することによって生成する。20μLのFDA作業溶液を各ウェルに添加する。軽くたたいて混合する。プレートを覆い、37℃にて１時間インキュベートする。494nm（対照650nm）でプレートをカウントする。Ｖ．酸産生アッセイこのアッセイを使用して、培養物中の相対的な有機酸の産生を定量する。このアッセイは、細胞の活性化状態と相関する。このアッセイは、２％以下の血清を含有する培地の使用を必要とする。実質的な細胞の範囲は、24〜48時間インキュベートされた、１〜５×10⁶細胞／mLである。試薬：・96ウェルプレート、平底（ELISAプレートではない）・酸分析試薬。これは別々に生成し、そして４℃で保存する。滅菌水に 0.1mg/mLのブロモフェノールブルーを添加する。十分に濃縮したHCl を、適切な滴定点まで添加する。滴定を、96ウェルプレートのウェル中の100μLのRPMI２％ FCSに対して75μLの試薬を添加した後に黄緑色が得られるまで行う。手順：二連または三連で96ウェルプレート中に細胞を含む100μLの培養培地を置く。コントロールについては100μLの培地のみを使用する。各ウェルに75μLの試薬を添加する。プレートを軽くたたいて混合する。470nm （対照650nm）でプレートをカウントする。 VI．胚発生の定量このアッセイを使用して、７日後に培養物中に産生されるリンパ芽球の絶対的な数を定量する。このアッセイは、実質的な任意の培地中の末梢血単核細胞に使用され得る。有用な細胞の範囲は、１×10⁵と５×10⁶／mLとの間である。試薬：・Wright's Stain、およびDiff-Quick Stain 手順： Cytospinチャンバー中に１〜２滴の７日間培養物を入れ、そしてCytospinを行う。Wright's StainまたはDiff-Quick Stainのいずれかを用いて、乾燥させたガラススライドを染色する。リンパ芽球および他の細胞の数を、顕微鏡の浸透系10 0倍対物レンズ下でカウントする。300を超える全細胞をカウントする。実施例６：さらなる動物モデルの実験第三部スティミュレーターを使用して調製した異種活性化細胞の効率未刺激の同種細胞のみ、異種活性化同系細胞、同系活性化同種細胞、または異種活性化同種細胞（２つの異なる同種細胞）もしくは、全ての活性化された同種細胞（２つの異なる同種ドナー）のいずれかからなる細胞組成物を、調製した。マウス由来の脾臓細胞を使用して、10：１のレスポンダー細胞：スティミュレーター細胞の比で培養することによって、異種活性化細胞を産生した。脾臓細胞の組み合わせ物を、ペニシリン-ストレプトマイシンを３×10⁶／mLを補充した、RP MIおよび10％のウシ胎児血清（FCS）中で37℃にて３日間培養した。１×10⁶の生存しているJ588Lリンパ腫細胞を、10×10⁶の培養したマウス脾臓細胞とともに投与し、次いでBalb/cマウスの右側の脇腹の皮下組織に注射した。処置したマウスを、３週間、腫瘍の増殖について観察した。腫瘍を有さないマウスを、1ヶ月後に1×10⁶の生存しているリンパ腫細胞のみで、左の脇腹に皮下注射することによって再チャレンジし、そして腫瘍の増殖を観察した。図３は、これらの実験の結果を示す。活性化した同種細胞の存在は、続くインビボでの抗腫瘍宿主応答と相関する。処置した動物と同種である2つのドナーを使用して調製した細胞の集団を、抗腫瘍応答を誘導するための同系または自己の細胞の代わりに使用し得る。しかし、活性化した同種ドナー：ドナー細胞集団の全てが等しく効果的であるわけではない。レスポンダー細胞：スティミュレーター細胞の比の効率における効果種々の数の同系スティミュレーター細胞によって活性化した同種細胞からなる細胞の集団を、C57脾臓細胞をレスポンダーとして、およびBalb/c脾臓細胞をスティミュレーターとして使用して調製した。細胞を、リンパ腫細胞（J588L細胞）と混合し、そしてBalb/cマウスの脇腹に注射した。処置したマウスを、3週間、腫瘍の増殖について観察した。図４は、最初の腫瘍チャレンジ後に腫瘍を有さないマウスの割合を示す（群あたり６匹のマウス）。より低い細胞の比は、時折、マウスにおいて抗腫瘍応答を誘導するに良好であり得る。腫瘍保有マウス由来の脾臓細胞の使用の抗腫瘍効果における影響ネイティブなC57、またはBalb/cマウス、あるいは右の脇腹に１cmのリンパ腫を有するマウスから、脾臓細胞を採取した。細胞を３日間、単独で、またはRPMI -10％ FCS中の0.5×10⁶細胞／mLの濃度で、10：ｌの比でのBalb/c細胞との混合後に、培養した。リンパ球活性化を、フローサイトメトリーによってCD3+/エステラーゼ高集団の割合を分析することによって判断した。FDA陽性細胞の割合は、健常なBalb/cドナー由来のスティミュレーターを使用すると約3.5％であったが、腫瘍を有するドナー由来のスティミュレーターを使用すると約2.5％であった。ネイティブなBalb/cマウスまたはJ588L腫瘍を有するマウスのいずれかに由来するスティミュレーターで異種活性化した細胞の集団を、生存しているリンパ腫細胞（J588L細胞）と混合し、そしてネイティブなBalb/cマウスの脇腹に注射した。マウスを、３週間、腫瘍の増殖についてモニターした。次に、腫瘍を有さないマウスを、１×10⁶の生存しているリンパ腫細胞のみで左の脇腹に再度チャレンジし、そして腫瘍の増殖について観察した。２回目の腫瘍チャレンジ後の腫瘍を有さないマウスの割合は、両方の群において30％と40％との間であった。腫瘍チャレンジに続いて異種活性化リンパ球および照射した腫瘍細胞で免疫したマウスの耐性この実験によって、不活化した腫瘍細胞と混合した異種活性化リンパ球を含有する細胞ワクチンの免疫原性効果を試験した。 C57/BL6マウス（１群あたり３匹）を、10⁶を照射したB16黒色腫細胞のみで、1 0⁷のBalb/c×C57異種活性化リンパ球と混合するか、または10⁶のIL-4分泌J588L リンパ腫細胞（C57と同種）と混合して皮下注射した。異種活性化細胞を、RPMI1 0％ FCS中で３×10⁶／mLで10：１の比でC57脾臓細胞を含むBalb/c脾臓細胞を、３日間培養することによって調製した。細胞をPBS中で洗浄し、そしてネイティブなC57マウスの脇腹に皮下注射する。３週間後、マウスを５×10⁶のB16生存黒色腫細胞で、反対の脇腹に皮下で再チャレンジした。マウスを、腫瘍の形成について観察し、そして腫瘍が１cmの直径に達した後に屠殺した。異種活性化細胞で処置したマウスは、他の群よりも有意に長く生存した。２つの最も長く生存するマウスは、最終的には錐型の腫瘍を発達させ、これらは両方とも無核であった。他のマウスは潰瘍を発達させなかった。核が出現した２日後、両方のマウスを屠殺した。これらのマウスの解剖によって、極度に壊死性の腫瘍細胞の存在が明らかになり、これは、大量のDNAの蓄積の形成における最近の腫瘍細胞溶解の証拠を有する。この壊死は、ほとんどのリンパ球からなる炎症性の浸透によって達成された。感染の他の形態は、体のどこにおいても観察されなかった。肺転移が見られなかった。このことは、脇腹にB16黒色腫腫瘍を有するコントロールマウスにおける多数の肺転移とは対照的である。両方のマウスの両側の腎臓は、強い糸球体ネフローゼを示し、このことは、腫瘍溶解症候群による死を示唆する。他のマウスは、これらの変化を示さなかった。これらの結果は、続くチャレンジにおいて与えた生存しているガン細胞の多量の溶解を引き起こす、特異的な応答を生じる、異種活性化細胞ワクチンで処置したマウスと一致する。異なる腫瘍モデルを使用する別の実験において、C57/BL6マウス（１群あたり３匹）を、10⁶のLewis肺ガン腫細胞のみで、10⁷のBalb/c×C57異種活性化リンパ球細胞と混合して、または10⁶のIL-4分泌J588Lリンパ腫細胞（C57と同種）と混合して皮下注射した。異種活性化細胞を、RPMI 10％ FCS中で３×10⁶／mLで、10 ：１の比でC57脾臓細胞を含むBalb/c脾臓細胞を、３日間培養することによって調製した。全ての細胞をPBS中で洗浄し、そしてネイティブなC57マウスの脇腹に皮下注射した。マウスを、腫瘍の形成について観察し、そして腫瘍が１cmの直径に達した後に屠殺した。IL-4分泌細胞で処置したマウスは、他の群よりも有意に長く生存し、３匹のうちの２匹が長期生存性であった。異種活性化した細胞のみで処置した群は、長期間の生存性を有さなかった。機能的マーカーと抗腫瘍効果との相関関係インビトロでの機能的アッセイの結果と潜在的な治療利点との間の相関関係を決定するために、種々の程度の活性化を示す培養物を、マウスのリンパ腫処置モデルで試験する。混合したリンパ球培養物を、種々の同系交配したマウス株由来の脾臓細胞を使用して、10：１のレスポンダー細胞：スティミュレーター細胞の比で調製する。あるいは、培養物を、特定のレスポンダー株：スティミュレーター株の組み合わせで、しかし異なる細胞の比で調製する。３日間の培養後、活性を、XTTホルマザンアッセイおよびエステラーゼアッセイにおいて測定する。注射の直前に、必要であれば、培養細胞にさらなる脾臓細胞を補充して細胞比を標準化し、そして１×10⁵の、生存しているか、または照射したJ588Lリンパ腫細胞と混合する。調製物を、Balb/cマウスに注射し、そして生存性に対する効果をモニターする。マウスを、生存しているリンパ腫細胞の続く用量で再投与て、免疫学的応答の維持について試験し得る。次いで、生存性のデータを、培養期間中に測定した機能的活性と相関付ける。抗腫瘍効果に対する異種活性化細胞組成物の効果本開示に他に記載されるように、ヒスタミンは、機能性アッセイにおいて測定した場合に、リンパ球の培養の間に異種活性化を減少させる。H2レセプターアンタゴニストであるシメチジンは、異種活性化を促進する。本研究において、異種活性化培養物を、20μg/mLのヒスチジンまたはシメチジンの存在下または非存在下で調製し、そしてXTTホルマザンおよびエステラーゼアッセイにおいて試験し、次いでJ588Lリンパ腫細胞とともにBalb/cマウスに注射して効率と相関付ける。別の研究において、複数の異なるスティミュレーター細胞またはレスポンダー細胞が有する効果を試験する。C57：Balb/c脾臓細胞（10：１）を含有する標準的な培養物を、ａ）C57：Aj：Balb/c脾臓細胞（9：1：1、または5：5：1）；ｂ）C57：Aj：C3H脾臓細胞（9：1：1または5：5：1）；ｃ）C57：Aj：C3H：Balb/c 脾臓細胞（8：1：1：1または3：3：3：1）を含有する培養物でマウスのリンパ腫モデルにおける効力と比較する。実施例７：培養したヒト細胞での実験異種活性化細胞の機能性の基準異種活性化の程度（治療における効果の潜在的な反映）を、実施例５に詳述される機能的アッセイに従って測定し得る。この実施例は、アッセイによって明らかにされた活性化の程度を示す。ヒト末梢血単球を、多数の無関係なヒトボランティアから採取したサンプルより単離し、そして本開示に他に記載されない限りは、10：１のレスポンダー細胞：スティミュレーター細胞の比で一方向に混合したリンパ球培養物を調製した。アッセイを、培養の２〜３日後に行った。結果を、図５および６に示す。個々の個体を、固有の文字によって示し、レスポンダー細胞をスティミュレーター細胞の前に示す。従って、表記Ａ×Ｂは、個体Ａ由来の細胞を個体Ｂ由来の不活化した細胞とともに培養したことを意味する。未刺激の単核細胞と比較して、異種活性細胞は、より高いエステラーゼ活性を有し、そしてより多くのXTTを還元した（ホルマザン色素）。エステラーゼ活性もまた、エステラーゼ基質であるフルオレセインジアセテート（FDA）を使用するフローサイトメトリーによって測定し得る。高いエステラーゼ活性を有するＴ細胞を、FDAと結合させたフィコエリトリン標識CD3抗体によって同定し得る。これらの測定値は、胚発生（１週間の培養後に決定した）または上清中のIL-2もしくはIFN-γのレベルと十分に相関する。複数の同種スティミュレーター細胞を使用することの効果異種活性化ヒトリンパ球培養物を、ｌつ、２つ、３つ、または４つのいずれかの無関係なドナー由来の細胞を使用して産生した。３×10⁶細胞/mLを、２％のFC S-RPMI中で37℃にて２日間培養した。２つのドナーの集団を、レスポンダー細胞とスティミュレーター細胞とを10：１の比で混合することによって生成した。３つまたは４つのドナー細胞を含有する集団を、レスポンダー細胞と、２つまたは３つの異なるスティミュレーター細胞とを9：1：1または8：1：1：1の比で混合することによって生成した。図７は、フローサイトメトリーを使用して測定した細胞の特徴を示す。全ての値は、Coulter EPICS XL Cytometerで4000個の細胞をカウントした後の、明るい蛍光細胞の割合を示す。結果は、特定の条件下にあるドナーの集団由来のスティミュレーターで調製した培養物が高レベルの活性化に到達することを示す。レスポンダー細胞：スティミュレーター細胞の比を変更することの効果異種活性化ヒト末梢血単核細胞からなる混合したリンパ球培養物を、10：１、５：１、または１：１の比で同じ２つの無関係のドナー由来の細胞を使用して生成した。細胞を、２％のFCS-RPMI中で0.5×10⁶細胞/mLで３日間培養した。これらの培養物の強さを、XTTホルマザン還元アッセイを使用して測定した。結果を図８に示す。異種活性化に対するヒスタミンまたはシメチジンの効果ヒスタミンは、Ｔサプレッサー細胞の活性を誘導することが既知である。Ｔサプレッサー細胞が、MLRの活性制御することにおいて役割を果たし得るので、ヒスタミンの効果および強力なヒスタミン２型（H2）レセプター遮断薬物であるシメチジンの効果を、同種反応性細胞培養物中で試験した。異種活性化ヒト末梢血単核細胞からなる細胞の集団を、無関係なドナー由来の細胞を使用して生成した。全ての培養物は、0.5×10⁶細胞/mLで10：１の比のレスポンダー：スティミュレーター単核細胞を含む。いくつかの培養物中に、20μg/mLのヒスタミンまたは 20μg/mLのシメチジンを０日目に添加した。図９は、ホルマザン還元（XTT）アッセイを使用して測定した結果を示す。ヒスタミンは、異種活性化の抑制を誘導し、そして異種活性化の強さを低下させる。シメチジンは、おそらく抑制の発生をブロックすることによって活性を増強する。実施例８：細胞ワクチンの臨床適用この節では、皮下で与えた活性化したリンパ球および所定の自己のガン細胞を含む免疫学的組成物が、感作されたヒトレシピエントにおける免疫応答の刺激を成功することを示す例を提供する。ガン患者JTは、伝統的な形態のガン治療を通じて進行した、多様な攻撃的な神経膠芽腫を有する。彼女を、実施例1に従って1995年の８月および９月に腫瘍内移植で処置した。その後、JTが発達した検出可能な腫瘍特異的免疫性を有するかどうかを決定する研究を行った。最初に、安定な細胞株を、彼女の腫瘍から樹立した。外科的に取り出した腫瘍に由来する生存性の腫瘍細胞を研究室に移し、そして10％のウシ胎児血清（FCS）を含有するRPMI-1640培地中で培養した。細胞株をPGA-95と名づけた。生存性の腫瘍細胞をまた、続いて取り出した後頭骨の葉から回収し、そして第２の細胞株を生成するために使用し、PGA-96と名づけた。２つの細胞株は、同一の特徴ではない場合は、類似性を有する。 MLTC（混合したリンパ球−腫瘍細胞培養物）を、以下の様式で行った。８月の細胞移植の時点で回収し、そして凍結保存した末梢血リンパ球（PBL）を、生存性の増殖しつつあるPGA-95細胞とともに種々の比で、RPMI-1640/10％ FCS中で8 日間まで培養した。抗腫瘍活性は検出されなかった。しかし、1996年の１月に患者から得たPBLをPGA-95細胞とともに同じ様式で培養した場合、強力な抗腫瘍細胞活性を記録した。アッセイの終わりでの接着腫瘍細胞のクリスタルバイオレット染色によって決定した場合、腫瘍細胞の実質的に100％が、100：１のPBL：PGA -95の比での同時培養の７〜８日の間に死滅した。同様の結果が、50：１の比で得られ、そして腫瘍細胞の約50％の死滅が、10：１で観察された。重要なことに、無関係の（第３部の）PBLを代わりに同時培養で使用した場合、PGA-95細胞の死滅は生じなかった。 MLTCの最初の5日間、高レベルのIL-2（1000〜1500pg/mL）が産生され、次いで、８日までに非常に低いレベルに低下した。培養の８日間にはIL-4は検出されなかった。TNFは、わずか６日後に有意なレベルで産生され、そして８日までに400 〜500pg/mLまで増大し続けた。応答している細胞の表現型を、フローサイトメトリーでの分析によって決定し、そしてCD4+細胞とCD8+細胞との混合物であることを見出した。CD4+細胞は培養の初期に増殖し、続いてCD8+細胞が増殖した。CD8+ 細胞はIL-2を産生しなかった。従って、培養培地に200U/mLの組換えIL-2（Hoffm an-LaRoche）を補充し、そして約１×10⁹のCD8+細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）を約30日で生成した。生成したCTLの特異性を、標準的な⁵¹Cr放出アッセイによって決定した。PGA-9 6細胞に対して生成したCTLは、PGA-95およびPGA-96細胞の両方を効果的に死滅させたか（４〜６時間で30〜50％の溶解）、または以前には培養されなかった凍結保存した腫瘍細胞を効果的に死滅させた。CTLは、自己のPBLまたは自己の繊維芽細胞を死滅させなかった；それだけではなく、これらは、無関係のガン細胞（具体的には、神経膠腫細胞（U373またはACBT）、前立腺ガン細胞（LNCAP）、膀胱ガン細胞（BLT-2）、卵巣ガン細胞（UCI-107）、または白血病細胞（K562）をもまた死滅させた。 MLTCを使用して、進行した時点での患者JTの全身性抗腫瘍細胞性免疫をモニターした。1996年の1月に開始して、血液サンプルを２〜３週間毎に採集した。MTL Cアッセイにおいて、100：１および50：１のPBL：PGA比で、100％の腫瘍細胞が死滅させられ、より低い比では比例的に殺傷は減少した。４月には、100：１では25％の腫瘍細胞のみが死滅させられ、50：１では全く死滅させないところにまで、活性は劇的に減少した。患者が、後頭葉の切除を必要とする再発を発達させたのは、この時点のすぐ後であった。続いて、腫瘍細胞と組み合わせた混合したリンパ球からなる皮膚免疫を彼女に与えることによって、彼女の全身的な抗腫瘍活性を増大させることを試みることを決定した。元々の腫瘍に由来する凍結保存した細胞を、10、000cGyで不活化した。細胞移植細胞を、実施例１に従って、患者のスティミュレーター細胞のリンパ球培養物と、同種ドナーのレスポンダー細胞とを混合して調製した。ワクチンを、100、50、25、または10×10⁶の細胞移植細胞と、１×10⁷の照射した細胞とを混合することによって調製した。用量範囲を、実施例５に記載される動物実験から推定した。注射を、背中の4つの異なる部位に与えた。皮膚の反応を、全ての4つの部位で記録し、そして患者は、熱性の応答を生じた：図10は、４回の注射の投与のすぐ後の、患者の背中を撮影した写真の複製である。紅斑が、各注射部位に存在し：おそらく、MLC中で刺激した細胞中にすでに存在する可溶性のメディエーターに対する応答である。図11は、２日後に撮影した写真の複製であり、硬化の証拠を示す。マークは、測定した含まれる領域の大きさを示す。遅延型過敏性のこの証拠は特に重要である。なぜなら、このことは、リンパ球および／または抗原提示細胞が、刺激した同種細胞による注射の部位に補充されることを示唆するからである。同種細胞は、集まった宿主細胞を刺激することが予想され、これは次いで、この部位にまた存在する自己腫瘍細胞に対して反応するはずである。患者の病歴を表７に示す：ワクチンの皮膚投与の12日後に行ったMLTCアッセイは、１月〜３月に以前に記録されたレベルに対して、免疫応答の劇的な復帰を示した。MLTCの結果は、1996 年の７月14日に行った測定までほぼこのレベルで維持された。患者は、1996年９月ごろに死亡した。さらなる試行を、ワクチン接種プロトコールのパラメーターを証明するために行う。グレードIIIまたはIVの神経膠星状芽細胞腫を有する患者を、実施例1のように、適切な研究連盟団体（Institute Review Board）の賛助のもとで行った研究に集める。全ての患者は、インフォームドコンセントによって登録し、そして種々の処置群にランダムに分ける。腫瘍細胞を、外科手術時に各患者から凍結保存し、そして必要であれば、治療の予想される経過に十分な細胞を得るためにエキソビボで増殖させる。融解したかまたは培養した腫瘍細胞を、10,000radのガンマ照射に曝す。不活化した患者のスティミュレーター細胞およびドナー白血球を使用する、調製容量で混合したリンパ球の培養を、本質的に実施例１に記載されるように行う。 1つの試行において、患者に２週にの間隔を経て２回のワクチン接種を与える。各細胞ワクチンを調製するために使用する単核細胞を、２人の健常な無関係なドナーから得る。感染性の疾患についてのリスクを最小にするために、ドナーを予めスクリーニングし、そして試験陽性であるドナーを除く。スクリーニングは、以下について試験することを含む：HIV-1、HIV-2、HTLV-I、HTLV-II、Ｃ型肝炎、またはB型肝炎コアに特異的な抗体；HIV抗原、HBsAg、RPR、またはALTのような肝臓マーカーの評価。HLA-A、HLA-B、HLA-C、およびHLA-DRの型決定を、患者に対しておよび互いに同種のドナーを選択するために行う。遺伝的に異なるドナーを使用することによって、第２回目の投与の超急性の拒絶の可能性を減少させる。さらに、各注射を、予め形成させた抗体の存在について主要な交差適合（ cross- match、ドナー細胞と患者の血清）を試験することによって先に行う。血液型の適合は一般に、生殖年齢またはそれより若い年齢のRh-陰性の女性に対するRh陽性のドナー由来の細胞の存在が可能である場合は避けられる以外は、必要ではない。混合したリンパ球の培養を、ドナーおよび不活化した患者の末梢血単核細胞を、10：１の比で混合すること、ならびに２％のウシ胎児血清を補充したAIMV中で 3×10⁶細胞/mLで、３日間37℃にて培養することによって行う。１回の接種に必要とされる単核細胞の総数は、１×10⁹未満である。刺激した細胞を回収し、そして遠心分離によって洗浄し、次いで滅菌の注射可能な生理食塩水に再懸濁する。活性化した細胞の生成物の品質管理には、細胞の数および生存性をモニターすること、マイコプラズマおよび内毒素を試験すること、ならびに初期の活性化のマーカーを使用してリンパ球の活性化をモニターすることを含む。処置での使用の前に、異種活性化細胞の調製物をまた、機能的な放出基準に従って評価する。実施例５に記載するテトラゾリウム還元アッセイ（XTT）を、細胞サンプルについて行う。フローサイトメトリーを、蛍光抗体を使用してCD69の細胞表面発現を測定するため：または、フルオレセインジアセテートを使用して増大した細胞内エステラーゼ活性を測定するために行う。培養細胞を、これらのアッセイのいずれか1つで（または両方で）測定されたレベルが、任意の日数の培養期間で（１日、２日、または３日）、上記の未刺激のドナーコントロール値の≧10％である場合、十分に活性化されたと考える。一旦、培養物が基準を超えると、それ以降の日の試験は必要ではない。細胞を３日目に回収し、必要な数の初代または培養した主要細胞と混合し、そしてヒトへの投与のために調製する。２回の注射で３段階の投与量の１つを受容させた研究で最初に集めた患者を、２週までに分けた（10⁸MLC細胞：10⁶腫瘍細胞）：１群には、１×10⁸MLC細胞を与える；２群には、５×10⁶MLC細胞を与える；３群には、1×10⁹MLC細胞を与える。MLC細胞を、各接種のために、入手可能な数に依存して患者由来の１×10⁶〜１×10⁷の間の腫瘍細胞と混合する。可能な場合は、１×10⁷になるようにする。接種物を、20〜21ゲージ針を使用して、反対側の部位の中腿部の鼠径部の靭帯の 10cm下方に、皮下投与する。最大寛容投与量（MDT）を、以下のように決定する：所定の細胞の組み合わせを受容した３人の患者の少なくとも１人が、可逆性のグレード３または不可逆性のグレード２の毒性を生じる場合、３人までのさらなる患者に、同じ用量でを与える。第２の患者が同程度の毒性またはより高い毒性を生じる場合、その細胞の組み合わせをMTDとして定義する。そうでなければ、投与量を最大レベルに到達するまで増大させる。臨床的な応答を、いくつかの基準（注射部位の局所的な硬化、掻痒症、または壊死；熱、倦怠感、頭痛、および変化した血液学的パラメーターまたは腎臓パラメーターのような全身的な影響；ならびにMRIのような基準によって検出される腫瘍の容量）によってモニターする。MRIによる結果を、注意深く解釈する。増殖しつつある腫瘍塊(進行性の疾患の特徴)または局所的な白血球の硬化（可能性のある、良好な処置の特徴）の両方が、MRIの拡大した部分として現れ得る。しかし、この領域の硬化は、縮小する腫瘍塊および良好な処置と一致する。処置した患者における細胞性の免疫応答の存在を、いくつかの基準でモニターする。接種の前および後に得た患者のリンパ球を、ドナー起源もしくは第3部（抗アロタイプ応答について）からの照射した同種細胞、または照射した患者の腫瘍細胞、または第3部の腫瘍細胞（抗腫瘍応答に特異的な）とともに培養する。培養物中の患者のリンパ球の応答を、細胞分裂についての代替マーカーとして、 MTTの還元または他の機能的アッセイの1つを使用して増殖を測定することによって決定する。CD69の発現を、PE標識抗体を使用するイムノフルオロサイトメトリーによって決定する。必要であれば、応答性Ｔ細胞を、ヘルパーもしくはサプレッサーサブセットを同定するためにCD4、CD8、もしくはCD31について同時染色するか、またはT_H2細胞からT_H1を区別するためにCD45RFについて同時染色する。培養物中に分泌されたサイトカインIL-2、IL-4、IFN-γ、およびTNF-αを、ELISAによって定量する。IL-2およびIFN-γはT_H1活性と相関し、IL-4はT_H2活性と相関し、そしてTNF-α は両方の活性と相関する。患者のPBLをまた、自己の腫瘍細胞に応答するそれらの能力について本実施例中に上記のように試験する。PBLを、腫瘍細胞の存在下または非存在下で培養し、次いで応答性の程度について試験する。一般的なＴ細胞活性化を、実施例５に記載する機能的アッセイによって測定し得る。［³H］チミジンの取り込み、または胚発生、細胞傷害性Ｔ細胞活性を、⁵¹Cr標識した細胞の細胞溶解として測定し得る。処置した患者における、有効な遅延型過敏性（DTH）抗腫瘍応答を、５×10⁵ の自己の腫瘍細胞、流行性耳下腺炎、白癬症（tricophyton）、またはPPD抗原の皮内投与の48時間の応答を、処置前の同じ一連のものと比較することによって測定する。続く試行において、ワクチン療法を、移植療法と組み合わせる。外科的に小さくする（debulk）時に、自己のスティミュレーター細胞で刺激した同腫異系リンパ球の移植物を、実施例１に記載に記載のような腫瘍のベッドに置く。除去した腫瘍細胞を凍結し、そして／または細胞のワクチンの調製のために培養する。患者に対して同種である２人のドナーを選択し、そして好ましくはそれらは互いにおよび移植のための細胞ドナーに対して同種である。各ドナーの細胞を使用して、本実施例に上記のようにワクチンのMLC成分を調製し、次いで患者の腫瘍細胞と混合する。１つのワクチンを移植の４週間後に投与する；６週間後に２回目の投与をする。選択した投与量は、以前の試行で確立したMTD以下である。臨床的基準および免疫学的基準を、以下のようにモニターする。組み合わせ治療を受ける患者の応答を、頭蓋内移植のみを受容した患者の応答と比較して、ワクチン接種の前に移植の有効性を増強する程度を決定する。別の研究を、ステージIV（転移性）の結腸ガンを有する患者について行う。患者を、インフォームドコンセントのもとで研究に組みいれ、そして標準的な結腸切除を受けさせた。約１週間後（彼らが病院から退院する頃）、彼らを4つのコースのワクチンの注射を開始する。ワクチン組成物は、本質的に、腫瘍細胞と混合した異種活性化細胞の集団からなる。患者に、3つの異なる用量の１つを与える：入手可能性に依存して、１×1 0⁷の不活化した腫瘍細胞と混合した、１×10⁸のMLC細胞；３×10⁸のMLC細胞；または１×10⁹のMLC細胞。同じ用量を、１週間毎のスケジュールで4回与える。最初の研究を、最大寛容用量（MTD）を決定するために優先的に行う。注射部位での所望されない臨床的な副作用として、受容できないレベルの硬化、炎症、または潰瘍化が挙げられる。一旦、MTDが決定されると、４週間のワクチン接種スケジュールのみ、および腫瘍塊への直接の移植によって開始するワクチン接種過程との間で比較を行う。移植群を、肝臓のかなり大きい転移性腫瘍塊中に注射針を導入するために超音波を使用して、結腸切除の２日目から１週間処置する。転移部位を、10×10⁹のMLC 異種活性化細胞のみの調製物で注射し、最少容量の生理食塩水に再懸濁する。最後の１週間の始めに、この群の患者に４週間の過程のMLC腫瘍細胞ワクチンを与える。患者を、治療後少なくとも３ヶ月間、臨床的応答および免疫学的応答の程度についてモニターする。免疫学的基準は、上記に従う。臨床的基準は、肝臓に存在する腫瘍の転移の容量を探知することに、一部従う。ACスキャンを、通常の間隔で行う。各転移部位の容量を計算し、そして容量を処置前に得た測定値と比較する。疾患の進行を、転移の容量の増大によって示すか、または転移部位の数の増加によって示す。良好な結果を、退行によって示すか、または同じグレードの結腸ガンを有する患者についての代表的な結果と比較して遅い進行によって示す。実施例９：異種活性化細胞組成物の商業的な産生このプロトコールは、混合したリンパ球培養物の産生のための全アプローチを記載する。この方法論の設計は、優良医薬品製造基準（GMP）および優良実験室基準（GLP）を考慮し、そして米国の連邦規制（Federal Regulation）のCode 21 の要件に従う。患者の末梢血単核細胞（少なくとも、２×10⁹細胞）を処置される患者から、改変した白血球泳動（leukapheresis）によって回収する。細胞の単離を、肝細胞回収手順を使用してBaxter Fenwallアフェレーシス機または同等の機械で行う。さいぼうを、氷上（４〜10℃）のBaxter型成分バッグで輸送する。輸送温度を、MONITOR-MARK^TM Time/Temperature Tagを使用してモニターする。ドナーの末梢血単核細胞（少なくとも、10×10⁹細胞）を、健常な個体から改変した白血球泳動によって回収する。細胞の単離を、Baxter Fenwallアフェレーシス機または同等のもので、肝細胞回収手順を使用して行う。ドナーは、予めスクリーニングしたドナーから選んだ、無関係の、匿名の、そしてランダムな個体である。ドナーの予備スクリーニングは、HIV、肝炎、海綿状脳症、または結核についての危険因子に陰性を示すはずである。各細胞成分を、HIV 1/2 Ab、HIV Ag、CM V Ab、HTLV I/II Ab、HCV Ab、HBcAb、HBsAgおよびRPRについて陰性を試験する。細胞を、Baxter型成分バッグ中で氷上（４〜10℃）で輸送する。受容の際に、各成分を、滅菌性、適切な細胞数、および生存性について試験する。成分を、使用するまで４〜10℃で維持し、そして回収の72時間以内に使用または凍結する。融解した凍結物質を2時間以内に使用し、再凍結はしない。予備臨床研究は、ACD抗凝固血漿中で４℃で保存した成分またはDMSO含有培地中で凍結した物質が、有効な細胞成分の産生に適切であることを示す。血漿を遠心分離によってドナーおよび患者の成分の両方から取り出す。ドナーの血漿を甲斐朱子、そして培地補充物としての使用のために熱不活化し得る。成分細胞を、少量のPBSに再懸濁し、そして適切な容量の各懸濁物を混合して、AIM V培地中に10：１〜20：１の比（ドナー細胞：患者細胞）で３×10⁶の単核細胞／ mlを含む培養物を産生する。熱不活化したドナーの血漿を、２％の最終濃度まで添加する。混合した細胞を、Fenwallの３リットルの気体透過性培養バッグに、F enwall溶液ポンプの使用によって汲み入れ、そして滅菌状態にする。成分細胞のサンプルをまた、リンパ球の活性化のために小さい培養チューブ中に調製し得る。機能的活性の試験を、未刺激のドナー細胞のみを含むコントロール培養物と比較する。細胞混合物を、ISO-°9000 Formaの37℃のインキュベーター中で、５％の湿気、およびHEPA濾過したCO₂を用いて３日間培養し、そして厳密にモニターする。細胞を遠心分離後に採集する。サンプルを、品質保証アッセイのために採取する。各調製物を、最終的な滅菌、適切な細胞数、適切な生存性、および機能的活性について試験する。細胞調製物を、滅菌した25％ヒトアルブミン中に再懸濁し、そして輸送のために滅菌の注射可能なバイアルに入れる。各調製物に、期限日（expiration date ）および時間をラベルし、これは、パッケージング後30時間に行われ、そして適切な指示、特定の結果の開放、およびMONITOR MarK^TM Time/Temperature Tagによって達成される。細胞調製物をパッケージングし、そして一晩の宅配便（cour ier）サービスによって輸送する。すぐに使用しない場合は、細胞を冷蔵庫で４〜10℃で保存する。期限日までに移植されなかった任意の調製物を、廃棄した。生成物の一貫性を測定する試験は、プロセスにおいて以下を包含する：・予備スクリーニング感染性疾患試験；・進行中および最終産物の滅菌性試験；・最終産物のマイコプラズマおよびエンドトキシン；・進行中および最終産物の細胞を計数する；進行中および最終産物の生存性（≧85％）細胞はまた、十分な機能的基準を満たさねばならない。これらの任意の条件を満たさない調製物は、患者の処置には使用しない。 ^*患者は、HBcAbまたはCMV Abについて陽性であり得、そして成分も同様にラベルする。CMV陰性のドナー成分が入手不可能な場合、CMV陰性患者に対してさえも CMV Ab陽性のドナー成分を使用し得る。上記の発明は、明確化および理解の目的のために説明および例示によっていくらか詳細に記載されているが、特定の変更および改変が行われ得ることが、当業者に容易に明らかである。従って、記載および実施例は、添付の請求の範囲によって説明される本発明の範囲を限定をするとは解釈されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 37/04 37/04 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者グランジャー，ゲイルエイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 92714, ラグナビーチ，サンタローザ 31562

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトへの投与に適切な免疫原性組成物であって、以下： a）ヒトに対して同種の刺激されたリンパ球；および b）ヒト由来の腫瘍関連抗原、の有効な組み合わせを含む、免疫原性組成物２．前記腫瘍関連抗原が、前記ヒト由来の初代腫瘍細胞に含まれるか、またはエキソビボで腫瘍細胞を培養することにより得られたこのような腫瘍細胞の子孫である、請求項１に記載の免疫原性組成物。３．前記腫瘍関連抗原が、前記ヒト由来の初代腫瘍細胞の抽出物中に含まれるか、該ヒト由来の初代腫瘍細胞の子孫であるか、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の免疫原性組成物。４．前記刺激されたリンパ球が、該リンパ球に対して同種のリンパ球と培養することによって刺激される、請求項１〜３に記載の免疫原性組成物。５．前記刺激されたリンパ球が、組換え的に産生されたサイトカイン、マイトジェンとともに、または上昇したレベルでサイトカインを分泌するように遺伝的に改変された細胞とともに培養することによって刺激される、請求項１〜３に記載の免疫原性組成物。６．ヒトへの投与に適切な免疫原性組成物であって、以下； a）該ヒトに対して同種のリンパ球； b）該リンパ球に対して同種の白血球；および c）本質的に該ヒトから得られた初代腫瘍細胞またはこのような細胞の子孫からなる不活化された腫瘍細胞集団、の有効な組み合わせを含む、免疫原性組成物。７．前記白血球が前記ヒトに対して自己である、請求項６に記載の免疫原性組成物。８．前記白血球が前記ヒトに対して同種である、請求項６に記載の免疫原性組成物。９．少なくとも３人の異なるヒトドナー由来の白血球を含む、請求項６に記載の免疫原性組成物。１０．前記不活化腫瘍細胞集団が、黒色腫、膵臓ガン、肝臓ガン、大腸ガン、前立腺ガン、および乳ガンの細胞からなる群から選択される、請求項６に記載の免疫原性組成物。１１．前記白血球が不活性化されている、請求項６に記載の免疫原性組成物。１２．前記リンパ球が、上昇したレベルでサイトカインを発現するように遺伝的に改変されている細胞を含む、請求項６に記載の免疫原性組成物。１３．前記白血球および前記リンパ球が、前記腫瘍細胞集団との組み合わせの前に、該リンパ球の同種の刺激に十分な時間および条件下で同時培養される、請求項６に記載の免疫原性組成物。１４．前記同時培養が、リンパ球により上昇したサイトカイン分泌を刺激するのに十分な時間および条件下である、請求項６に記載の免疫原性組成物。１５．用量におけるリンパ球に対して同種の前記リンパ球の数が約１×10⁸と２ ×10⁹との間である、請求項６〜１４に記載の免疫原性組成物の単位用量。１６．用量における不活化された腫瘍細胞集団が約１×10⁶と５×10⁷細胞との間である、請求項６〜１４に記載の免疫原性組成物の単位用量。１７．請求項１に記載の免疫原性組成物を産生するための方法であって、以下： a）前記ヒトに対して同種の刺激されたリンパ球；を b）該ヒト由来の腫瘍関連抗原、と混合する工程を包含する、方法。１８．請求項１に記載の免疫原性組成物を産生するための方法であって、以下： a）前記ヒトに対して同種のリンパ球および該リンパ球に対して同種の白血球の同時培養から得られる細胞；を b）該ヒト由来の初代腫瘍細胞またはその子孫、と混合する工程を包含する、方法。１９．請求項１に記載の免疫原性組成物を産生するためのキットであって、別々の容器中に以下： a）前記ヒトに対して同種の刺激されたリンパ球；および b）該ヒト由来の腫瘍関連抗原、を含む、キット。２０．請求項１に記載の免疫原性組成物を産生するためのキットであって、別々の容器中に以下： a）前記ヒトに対して同種のリンパ球および該リンパ球に対して同種の白血球の同時培養から得られる細胞；および b）該ヒト由来の初代腫瘍細胞またはその子孫、を含む、キット。２１．ヒトにおいて抗腫瘍免疫学的応答を誘導するための方法であって、該ヒトに対して請求項１〜５のいずれかに記載の免疫原性量の免疫原性組成物を投与する工程を包含する、方法。２２．ヒトにおいて抗腫瘍免疫学的応答を誘導するための方法であって、該ヒトに対して請求項６〜１４のいずれかに記載の免疫原性量の免疫原性組成物を投与する工程を包含する、方法。２３．ヒトにおいて抗腫瘍免疫学的応答を刺激するための方法であって、以下： a）腫瘍細胞を含む第１の細胞集団と、リンパ球に対して同種の該リンパ球を含む第２の細胞集団とをエキソビボで混合して、細胞混合物を生成する工程；および b）免疫原性量の該細胞混合物を該ヒトに投与する工程、を包含する、方法。２４．前記腫瘍細胞が、黒色腫、膵臓ガン、肝臓ガン、大腸ガン、前立腺ガン、および乳ガンからなる群から選択される細胞を含む、請求項２３に記載の方法。２５．前記第２の細胞集団が、前記リンパ球に対して同種の白血球をさらに含む、請求項２３に記載の方法。２６．前記第２の細胞集団が、少なくとも３人の異なるヒトドナー由来の白血球を含む、請求項２３に記載の方法。２７．前記白血球が前記ヒトに対して自己である、請求項２３に記載の方法。２８．前記白血球が前記ヒトに対して同種である、請求項２３に記載の方法。２９．前記免疫学的応答が一次的応答である、請求項２３に記載の方法。３０．前記免疫学的応答が二次的応答である、請求項２３に記載の方法。３１．前記ヒトが、該ヒトにおける固形腫瘍、または固形腫瘍もしくはその一部が除去されている部位で、あるいはその周辺への、異種活性化された同種リンパ球の投与により以前に処置されている、請求項２３に記載の方法。３２．ヒトにおける神経形成性疾患を処置するための方法であって、請求項１〜１４のいずれかに記載の有効量の前記免疫原性組成物を、該ヒトに投与する工程を包含する、方法。３３．ヒトにおいて神経形成性疾患を処置するための方法であって、以下の工程： a）腫瘍細胞を含む第１の細胞集団と、リンパ球に対して同種の該リンパ球を含む第２の細胞集団とをエキソビボで混合して、細胞混合物を生成する工程：および b）有効量の該細胞混合物を該ヒトに投与する工程、を包含する、方法。３４．前記第２の細胞集団が、前記リンパ球に対して同種のリンパ球をさらに含む、請求項３３に記載に記載の方法。３５．手術または治療によるヒトの処置方法において使用するための、以下： a）ヒト患者に対して同種の異種活性化されたリンパ球；および b）該ヒト患者またはその子孫由来の初代腫瘍細胞；を含む細胞集団。３６．前記リンパ球が、前記ヒト患者由来のリンパ球に対して異種活性化されている、請求項３５に記載の細胞集団。３７．前記リンパ球が、前記ヒト患者に対して同種の白血球に対して異種活性化されている、請求項３５に記載の細胞集団。３８．ヒト患者において腫瘍を処置するかまたは抗腫瘍免疫学的応答を惹起するための医薬品の製造のための、以下： a）該ヒト患者に対して同種の異種活性化されたリンパ球；および b）該ヒト患者またはその子孫由来の初代腫瘍細胞；を含む細胞集団の使用。３９．前記リンパ球が、前記ヒト患者由来の白血球に対して異種活性化されている、請求項３８に記載の使用。４０．前記リンパ球が、前記ヒト患者に対して同種の白血球に対して異種活性化されている、請求項３８に記載の細胞。４１．手術または治療によるヒトの処置方法における同時か、別々か、または連続的な使用のための、以下： a）該ヒト患者に対して同種の異種活性化されたリンパ球； b）該ヒト患者またはその子孫由来の初代腫瘍細胞；を含む、組み合わされた調製物。４２．ヒト患者において腫瘍を処置するかまたは抗腫瘍免疫学的応答を惹起するための同時、別々、または連続的な使用のための、以下： a）該ヒト患者に対して同種の異種活性化されたリンパ球； b）該ヒト患者またはその子孫由来の初代腫瘍細胞；を含む、組み合わされた調製物。