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JP2001509144A - 多糖類をタンパクに結合する方法 - Google Patents

多糖類をタンパクに結合する方法

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JP2001509144A JP52756498A JP52756498A JP2001509144A JP 2001509144 A JP2001509144 A JP 2001509144A JP 52756498 A JP52756498 A JP 52756498A JP 52756498 A JP52756498 A JP 52756498A JP 2001509144 A JP2001509144 A JP 2001509144A
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Abstract

(57)【要約】 次の式(1)で表わされるアミノ‐チオールリンカーを用いて、多糖類を他の生体高分子に共有結合する新規方法を提供する；式(1)：H2N-[(CH2)m-CHR1-CR2R3-A]q-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7、Ａは直接結合又は式：-{Z-(CH2)m-CHR1-CHR2R3}nZ-を持つ基であり、ｍは０から５までの整数、ｎは０から３までの整数である;ｐは０から２までの整数、ｑは０又は１の整数である；R1は、水素、又は必要に応じてアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、C1-C4アルコキシカルボニル、カルバモイル、モノ‐若しくはジ（C1-C4アルキル）カルバモイル若しくはＮ-（α-カルボキシアルキル）カルバモイルによって置換されたC1-C6アルキル、あるいはｍ≠０であれば、R1はヒドロキシル、アミノ又はペプチジルアミノである；R2とR3は独立して水素又はC1-C4アルキルであるか、若しくは両者でオキソ基を形成する；R4は水素、C1-C4アルキル、カルボキシル、C1-C4アルコキシカルボニル、カルバモイル、モノ‐又はジ（C1-C4アルキル）カルバモイル又はＮ-（α-カルボキシアルキル）カルバモイルである；R5は水素、メチル、ヒドロキシ又はC1-C7アルコキシである；R6は水素又はメチルである；R7は水素又はチオール保護基又は式：-S-CHR6-(CHR5)p-CHR4-[A-CR2R3-CHR1-(CH2)m]q-NH2を持つ基である；そしてｚはイミノ、メチルイミノ、酸素又は硫黄である。

Description

【発明の詳細な説明】 多糖類をタンパクに結合する方法 本発明は、複合ワクチンを調製する際のリンカーとしてのアミノチオール化合 物の使用に関する。 多糖類又は他のハプテンを免疫原性タンパク又はペプチド又は他の生体有機分 子に共有結合することは、例えばｂ型インフルエンザ菌(Haemophilus influenza e)(髄膜炎、中耳炎)、百日咳菌(Bordetella pertussis)(百日咳)、破傷風菌(Clo stridium tetani)(破傷風)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis、髄膜炎、中耳 炎)および肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae、肺炎、髄膜炎、中耳炎）のよ うな病原体に対する有効なワクチンを調製する適当な方法であることが証明され ている。そのような複合ワクチンは、例えば、米国特許第4,762,713号に述べら れている。この米国特許に従えば、多糖類と担体タンパク間の結合は、タンパク 中のアミノ基による多糖類のアルデヒドあるいはヘミアセタール官能基の還元的 アミノ化によって実現される。多糖類をタンパク物質に共有結合するもうひとつ の適当な方法は、ヒドロキシル官能基を活性化して、タンパクに結合することが できる官能基を含む側鎖を生じさせることである。このようにして、多糖類を活 性化し、その後システアミンのようなチオール含有基に結合して、それをタンパ ク中の活性化されたアミノ酸に結合することができる。オリゴ糖をタンパクに結 合するためのシステアミンの使用は、Verheulら(Infect.Immun.59(1991)843‐85 1)が記述している。この使用は、以下のスキームに従って、カルボキシル基をＮ ‐スクシニミジルエステル（NSu）に転換することによる糖類の活性化を含む： Ps-COOH+XONS→Ps-CO-ONSu+HOX (1) Ps-CO-ONSu+H2N-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2→ Ps-CO-NH-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2+HONSu (2) Ps-CO-NH-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2+DTT-rd→ →Ps-CO-NH-CH2-CH2-SH+HS-CH2-CH2-NH2+DTT-ox (3) Ps-CO-NH-CH2-CH2-SH+Br-CH2-CO-NH-Pr→ Ps-CO-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-NH-Pr+HBr (4) ここでPsは多糖類であり、Prはタンパクまたはペプチドを表わし、DTT-rdは還元 された（ジチオール）形態、DTT-oxは酸化された（１，２‐ジチアン）形態のジ チオトレイトールを表わす。しかし、このアプローチは多糖類中にカルボキシル 基が存在する必要があるが、多くの生物学的に興味深い多糖類はカルボキシル基 を含まない。 多糖類は、以下のスキームに従った臭化シアンによる活性化により、ヒドロキ シル基以外の官能基が存在する必要なしにシステアミン様のリンカーに有効に結 合しうることが認められた。 Ps-OH+Br-CN→Ps-O-CN+HBr (5) Ps-O-CN+H2N-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2→ →Ps-O-C(=NH)-HN-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2 (6) 反応(5)は、環状イミドカルボネートを生じる第二のヒドロキシル基との反応 を含む副反応を伴い、反応(6)と同様にアミノ基との結合をもたらしうる。 それ故、本発明は、多糖類を別の生体高分子に結合する方法であって、ハロゲ ン化シアンで該多糖類を活性化し、該活性化された多糖類を式１のアミノチオー ルリンカー H2N-[(CH2)m-CHR1-CR2R3-A]q-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 １ (ここでＡ、ｍ、ｐ、ｑ、R1、R2、R3、R4、R5、R6、及びR7は、添付の請求項１ に定義されている通りである)と反応させて、式２のチオール化多糖類 Ps-O-C(=NH)-NH-[(CH2)m-CHR1-CR2R3-A]q-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 ２ （Psは多糖類残基であり、Ａ、ｍ、ｐ、ｑ、R1、R2、R3、R4、R5、R6、及びR7は 上に定義した通りである）を産生せしめ、その後、必要に応じて保護基R7を除去 し、チオール化多糖類を活性化生体高分子と反応させる方法に関する。好ましい リンカーは、請求項3〜8に定義されている通りである。リンカーの適当な例は、 システアミンあるいはその酸化形態であるシスタミンである。 この方法は、ほとんどの細菌多糖類を含めた大部分の多糖類に対して満足に作 用する。しかし、１９Ｆ型肺炎球菌莢膜多糖類のような一部の多糖類とは有用な 度合の結合が認められない。 本発明者は特定の理論に拘泥することを望むものではないが、システアミン結 合の不完全性あるいは失敗について考えられるひとつの説明は、いったん形成さ れたシステアミン付加物が分子内置換によって元の物質に戻ってしまうのではな いかということである。 さらに、式３のアミノ‐チオールリンカー（式１でq=1の場合） H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3-A-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 ３ （ここで、Ａ、ｍ、R1、R2、R3、R4、R5、R6及びR7は添付の請求項２に定義され ている通りである）を用いることにより、不十分な結合という問題が解決できる ことが認められ、好ましい実施態様が添付の請求項の中に述べられている。これ らのリンカーは、システアミン結合の収率が改善されており(反応(6)および(3)) 、任意の多糖類と有効な結合をもたらす。 式３に記載のアミノ‐チオールリンカーは、4-アミノブタンチオール、5-アミ ノペンタンチオール、2-(2-アミノエチルアミノ)エタンチオール等の、鎖中に少 なくとも４個の炭素原子と必要に応じて１個以上の複素原子を持った直鎖又は分 枝α,ω-アミノチオール誘導体であり得る。好ましい化合物は、H2N-(CH2)m-CHR1 -CR2R3-が、グリシン、アラニン、β‐アラニン、セリン、グルタミン、γ‐ア ミノ酪酸、リシン及びε‐アミノカプロン酸のようなアミノ酸、又はＮα‐グリ シル‐リシンのようなオリゴペプチドならびにＮα-ペプチジル-α,ω-ジアミノ 酸のより高級な同族化合物である。H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3-A-基は、グリシルグ リシンのような直鎖オリゴペプチドでもよい。 式１及び３の両リンカーにおいて、A-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7基は、例えば、 2-アミノエタンチオール（システアミン）、2-メルカプトエタノール、1,2-エタ ンジチオール、2-アミノ-2-メチルプロパンチオール、3-アミノプロパンチオー ル、2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンチオール、モノチオ‐及びジチオ‐トレイ トールまたは‐エリトリトール、システイン、ホモシステイン、ならびにそれら のエステル又はアミド等から誘導されうる。式３に記載の最も好ましい化合物は 、Ｎ‐グリシル‐システアミン及びそのジスルフィド前駆体N,N'-ジグリシル‐ シスタミンである。 Ｎ,Ｎ'-ジグリシルシスタミンおよびＮ-アラニル-Ｓ-アセチルシステアミンの よ うな、式１および３の化合物の大半は、放射線防護物質として第WO85/00167号か ら既知である。 本発明の方法によって複合できる生体高分子には、ヒドロキシル、アミノ及び /又はメルカプト基を含む任意の高分子（分子量＞１ｋＤａ）天然又は天然様化 合物が含まれる。特に、そのような生体高分子には、天然又は修飾多糖類、天然 、修飾又は合成ペプチド及びタンパク、リポタンパク、糖タンパク及び核酸が含 まれる。最も好ましくは、本発明のリンカーは１個以上の多糖類をタンパク又は ペプチドに複合するために使用される。 複合できる多糖類には、デンプン様のセルロース物質が含まれるが、本方法は 特に、ハプテン又は免疫原である微生物多糖類を複合するのに適している。その 例は、たとえばデンマーク式1、3、4、6A、6B、7S、9V、14、18C、19F及び23Fを 含む様々なタイプの肺炎球菌莢膜多糖類、Ｂ型連鎖球菌多糖類、肺炎杆菌の莢膜 多糖類、ｂ型を含むインフルエンザ菌多糖類、髄膜炎菌(グループＡ及びＣ)、緑 膿菌又は大腸菌である。本明細書で用いる「多糖類」なる語には、糖を含有する ポリマー及びオリゴマーが含まれ、これらはグリコシド結合のみを含有している か、ホスホジエステル結合若しくは他の結合も含有している。多糖類は同時に、 酸性基、リン酸基、アミノ基、糖アルコールおよびアミノ酸のような非糖部分を 含んでいてもよく、またそれらは解重合されいてもよく、解重合されていなくて もよい。例示として、肺炎球菌莢膜多糖類6B、14、19F及び23型並びにｂ型イン フルエンザ菌莢膜多糖類の反復単位を以下に示す Pn6B →2)-α-D-Galp-(1→3)-α-D-Glcp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→4)-D-リビト ール-5-(PO4 -→ Pnl4 →4)-β-D-Glcp-(1→6)-β-D-Glcp*NAc-(1→3)-β-D-Galp-(1→ *:β-D-Galp(1→4)側鎖基を持つ Pn19F→4)-β-D-ManpNAc-(1→4)-α-D-Glcp-(1→2)-α-L-Rhap-(1-PO4 -→ Pn23F→4)-β-D-Glcp#-(1→4)-β-D-Galp&-(1→4)-β-L-Rhap-(1→ #:ホスホグリセリル‐(→3)側鎖基を持つ&:α-L-Rhap-(1→2)側鎖基を持つ Hib →3)-β-D-Ribf-(1→1)-D-リビトール-5-(PO4 -→ 対象となる細菌多糖類のレビューは次の文献中に認められる：Lennart Kenne とBengt Lindberg、“Bacterial polysaccharides”in The polysaccha-rides,V ol.2,Ed.G.O.Aspinall,1983,Ac.Press,p.287‐363。 本発明の方法によって複合できるタンパクとペプチドは、免疫原性および非免 疫原性タンパクを含む。その例は、血清アルブミン、ならびにジフテリア毒素、 破傷風トキソイド、肺炎球菌溶血毒素、ニューモライソイド(pneumolysoid)のよ うな種々の細菌毒素及びトキソイド、シュードモナス、ブドウ球菌、百日咳菌、 大腸菌のような他の微生物の毒素、必要に応じて無毒化されたいわゆる交叉反応 物質（たとえばCRM197）およびヘモシアニンである。また髄膜炎菌又は百日咳菌 のような生物の外膜タンパクもその例である。タンパクはまた、別のバイオマテ リアルを所望の部位に運搬するために使用される抗体でもよい。タンパクとペプ チドは独立した免疫原として使用することができ、あるいはハプテン等の他の物 質の免疫原性を高めるためにも使用できる。それらは天然又は無毒化又は突然変 異型のいずれでもよい。タンパクは一般にペプチドよりも分子量の高い物質を意 味するが、本明細書においては、「ペプチド」と「タンパク」の語は、区別せず に用いる。 式３のリンカーは、第EP‐Ａ‐131500号に述べられているもののような、それ 自体公知の方法によって調製できる。例えば、リンカー化合物は、Ａ基の性質に 従って、2-アミノエタンチオール(システアミン)、3-アミノプロパンチオール又 はシステインのような適当なアミノ‐チオール、ジチオールあるいはメルカプト アルコール（ここで、チオール基は、例えば、アシル基又はジスルフィド基によ って保護されていることが好ましい）から調製できる。Ａ基が-(Z-CHR1-CR2Ｒ3- )n-の式を持つ鎖を含んでいれば、これを適当な条件下で、例えばエチレンイミ ン、酸化プロピレンと反応させることによって導入し、所望する数値のｎを持つ 付加物を得ることができる。あるいは、-(Z-CHR1-CR2R3-)n-がオリゴペプチド鎖 であれば、従来のペプチド合成法によってこの基を導入することができる。末端 基H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3-は、適当な活性化された化合物を前駆体HA-CHR4-(CHR5 )p-CHR6-S-R7と反応させることによって導入できる。H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3- がグリシン、アラニンあるいはリシンのようなアミノ酸残 基である場合には、やはり従来の方法によって結合することができる。 アミノ‐チオールリンカーの使用は必要に応じて活性化された第一の生体高分 子、特に多糖類に、好ましくはチオール官能基上に保護基を持つリンカーを結合 することを含む。活性化は、多糖類のカルボキシル基（存在する場合には）を、 例えばカルボジイミドによって活性化すること、又は、例えば酸化によってアル テヒド基を導入することのような公知の方法を用いて実施することができる。好 都合なことには、臭化シアンとの反応によって結合が行われる。これは反応性イ ソシアネート基の存在を生じさせ、この反応性イソシアネート基はリンカーのア ミノ官能基と容易に反応してイソウレウム(isoureum)結合を生じる。CNBrによる 活性化は、反復単位(RU)（多糖類では：反復モノ又はオリゴ糖単位）当り少なく とも0.1活性化部位が導入されるようにして実施される。結合は、好ましくは1-1 0RU当り１アミノ官能基を与える。 チオール保護基が存在する場合には、続いて、例えば、保護ジスルフィドを還 元剤、例えば2-メルカプトエタノール若しくはジチオトレイトールのようなメル カプタン、又はトリアルキルホスフィンと反応させることによって除去する。還 元は、好ましくは5-15RU当り１チオール基を生じる。チオール官能基はその後、 好ましくはタンパクのリシン残基に結合した、ブロモアシル基、ヨードアシル基 、ピリジルジチオ基又はマレイミド‐アルキル（又は‐アリール又は‐シクロア ルキル）基のような第二の生体高分子の活性な官能基と反応することができる。 活性化された官能基は、N-スクシニミジル‐ブロモアセテート若しくはN-(ω-( マレイミドアルキルオキシ)スクシニミドとの反応のようなタンパクの化学的な ポスト修飾によって、又は既に活性な官能基を含む１個以上のアミノ酸前駆体を 用いたペプチド合成によって導入することができる。 中間産物と最終複合体は、クロマトグラフィー(イオン交換、疎水的相互作用 あるいはアフィニティー)、ゲル濾過、透析、膜濾過、硫化アンモニウムまたは アルコール等を用いた選択的沈降反応等のようなそれ自体公知の方法を用いて、 必要に応じて精製することができる。 複合体は、適当なアジュバント、希釈剤、安定剤、緩衝剤等を用いて、予防接 種の分野において公知の方法でワクチン製剤に組み込むことができる。ワクチン は、病原体からヒトを保護する、又は動物を保護するのに使用することができる 。あるいは、適当な生体高分子の複合体は、ヒト若しくは動物の治療において、 又は診断薬として使用することもできる。 本発明の方法のもうひとつの有益な用途は、例えばアフィニティークロマトグ ラフィーによる抗原、抗体および他の生物学的に関連する分子の精製を目的とし た、又は免疫測定法等における使用を目的とした、デキストランアガロース、セ ファロースのような多糖類へのタンパクおよびペプチドの固定に関する。 例 例では次の略語を使用する Boc tert-ブチルオキシカルボニル BrAC ブロモアシル DTE ジチオエリトリトール EDTA エチレンジアミン四酢酸 Gly グリシル GP(C) ゲル浸透（クロマトグラフィー） HPLC 高速液体クロマトグラフイー m.w． 分子量 Nsu N-スクシニミジル ONSu N-オキシスクシニミジル PBS リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水中10mMリン酸ナトリウム、 pH7.2 Pn 肺炎球菌／肺炎球菌の PS 多糖類 RP 逆相 RU 多糖類の反復単位 TNBS トリニトロベンゼンスルホン酸 TTd 破傷風トキソイド 注：肺炎球菌血清型の分類にはデンマーク式命名法を使用する；アメリカ式命名 法を括弧内に示す。 例１ リンカーの調製 N,N'-ビス[tert-ブチルオキシカルボニルグリシル]シスタミン(N,N'-ビス[Boc-G ly]シスタミン) N,N-ジメチルアセトアミド(42mL)とN,N-ジイソプロピルエチルアミン(14.6mL 、83.8mmol)を、N'-スクシニミジルN-(tert-ブチルオキシカルボニル)グリシネ ート、Boc-Gly-ONSu(11.4g、41.9mmol)及びシスタミンジヒドロクロリド(3.77g 、16.7mmol)の混合物に加えた。懸濁液を室温で一晩撹拌した(シスタミンジヒド ロクロリドは徐々に数時間で溶解した)。透明な溶液を水(16.7mL)で希釈し、相 の分離を生じさせた。１時間撹拌した後、ジエチルエーテル(170mL)を加え、得 られた混合物を水(170mL)で洗浄した。相の分離後、水相をジエチルエーテル(85 mL)で抽出した。有機相を集めて、1M NaHCO3(3×85mL)、水(3×85mL)および1M N aH2PO4(3×85mL)で連続的に洗浄し、MgSO4で乾燥した。MgSO4を濾過によって除 去し、濾液を真空中で濃縮し、N,N'-ビス[Boc‐Gly]シスタミン(4.81g、62％)を ガラス状固体として生成した。RP‐HPLCは単一の鋭いピークを示す。 N,N'-ビスグリシルシスタミン（ビストリフルオロアセテート） 前の段階で得られたN,N'-ビス[Boc‐Gly]シスタミン(4.81g、10.3mmol)をジク ロロメタン(16.7mL)に溶解した。溶液を撹拌し、トリフルオロ酢酸(16.7mL)を加 えた。約５分間イソブテンと二酸化炭素の形成が肉眼で認められた。合計30分の 期間後、反応混合物を、ジエチルエーテル(170mL)とペンタン(170mL)を強く撹拌 した混合物に一滴ずつ加えた。撹拌を終了し、沈降物を５分間沈降させた。傾瀉 してジエチルエーテル／ペンタンを除去し、ジエチルエーテル(50mL)とペンタン (50mL)の混合物で固形物を洗浄した。再び傾瀉してジエチルエーテル／ペンタン を除去した。吸湿性固形物を水(40mL)に溶解した。室温で真空下に極微量のジエ チルエーテル／ペンタンを除去した。その後、溶液を凍結乾燥してN,N'-ビスグ リシルシスタミンビストリフルオロアセテート (4.93g、97％)を生成した。最後に、化合物を1.0Mの濃度で水に溶解し、-20℃で 凍結保存した。RP‐HPLCは単一の鋭いピークを示す。 実施例２ N,N'-ビスグリシルシスタミンを用いたPn PS 19F/TTd複合ワクチンの調製Pn PS 19Fの部分的解重合 肺炎球菌多糖類の部分的解重合のために、音波破砕工程を使用した。肺炎球菌 多糖血清型19F（アメリカ式19、RIVM、ロット番号19FEXP2A/S13；275mg、乾燥重 量）を水20mLに溶解し、約15分間ずつ合計125分間、1/4”マイクロチップ（Bran son Sonifier250、出力レベル7、50％デューティサイクル）で音波破砕した。PS の分子量は約980から49kDa（約1660〜83RU）に低下した。 溶液を0.45μｍ膜で濾過し、PSの回収率は94％であった(アントロンアッセイ)。 N,N'-ビスグリシルシスタミンによるPn PS 19F(49kD)の修飾 修飾のために、PS 19F水溶液3.25mL(6.15mg/mL)を等量の1M炭酸ナトリウム溶 液(pH〜12)と混合した。混合物を約2℃に冷却した。撹拌しながら、CNBr試薬（ アセトニトリル中100mg/mL）250μＬを加えた。10分後、溶液を約4℃でSephadex G25M(Pharmacia)でのゲル濾過に供した(溶出剤：0.2M炭酸‐重炭酸ナトリウム 緩衝液pH9.25)。PS含有分画を、予め冷却しておいた0.2M炭酸-重炭酸ナトリウム 緩衝液pH9.25/1.0M N,N'-ビスグリシルシスタミン(ビストリフルオロアセテート )、1/1、v/v溶液4.73mLと混合した。pHが6.5に低下し、6M水酸化ナトリウムで9. 3に再調整した。１時間半の間、時々pHを調べ、必要に応じて再調整した。その 後、混合物を約4℃で一晩放置した。最後に、サンブルを、５ｍＭ EDTAを含む0. 1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH8と緩衝液交換し、Centriprep‐10(Amicon)濃縮 器で2mLの容量に濃縮した。アミノ基を分析すると1NH2/4.2RUを示した(TNBSアッ セイ)。 N,N'-ビス［グリシル］シスタミン修飾Pn PS 19Fの還元 N,N'-ビス［グリシル］シスタミン修飾Pn PS 19F(5mM EDTAを含む0.1Mリン酸 ナトリウム緩衝液1.75mL、pH８中131ng)を、11倍モル過剰の DTE（PSに導入されたアミノ基の数に基づく）を加えて還元した。室温で一晩イ ンキュベーションした後、5ｍＭ EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH７を 溶出剤として用いて、サンプルをSephadex G25M(Pharmacia)でのゲル濾過に供し 、Centriprep‐10で3.5mLの容量に濃縮した。スルフヒドリル基についての分析 は1SH/8.5RUを示した(エルマンアッセイ)。 破傷風トキソイドのブロモアセチル化 破傷風トキソイド(RIVM)をSephadex G25Mでゲル濾過して緩衝液交換した(溶出 剤：5ｍＭ EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH8)。タンパク中のリシンの 側鎖のアミノ基を、６倍過剰（TTd内のリシンの数に基づく）のN-スクシニミジ ルブロモアセテートを加えて修飾した。混合物を室温で１時間半インキュベーシ ョンし、Sephadex G25Mのカラムに充填した(溶出剤５ｍＭ EDTAを含む0.1Mリン 酸ナトリウム緩衝液、pH7)。タンパク含有分画を分析すると、アミノ基の40％（ 当初量：33.5NH2/モルTTd）が修飾されたことを示した(TNBSアッセイ)。 N-（グリシル）システアミン修飾Pn PS 19Fとブロモアセチル化破傷風トキソイ ドの複合 N-（グリシル）システアミン修飾Pn PS 19F(11.5mg)を室温でBrAcTTd(5mg)と 、PS/TTdモル比7:1で混合した。GP‐HPLC分析によって複合をモニターした(Shod ex OHpak KB-805及び804をシリーズで、PBSを溶出剤とし、1mL/分で35℃におい て)。約110時間後、PS上の残りのチオール基を10倍モル過剰のブロモアセトアミ ド（還元前のPSに関して測定した、当初のアミノ基含量に基づく）により室温で ６時間キャップした。BrAc‐TTd上の残りのブロモアセチル基を2.5倍モル過剰の 2‐アミノエタンチオール（前に加えたブロモアセトアミドの量に基づく）によ り室温で一晩キャップした。複合体を、PBSを溶出剤として使用し、0.8mL/分の 流量で、SephacrylＳ‐400HR(Pharmacia)カラム(100×1.6cm)での低圧GPCにより 室温で精製した。適当な分画(8mL)を炭水化物とタンパク含量に関して分析し(ア ントロンおよびローリーアッセイ)、滅菌濾過して、4℃で保存した。 実施例３ シスタミンを用いたPn PS 6B/TTd複合ワクチンの調製 Pn PS 6Bの部分的解重合 肺炎球菌多糖類血清型6B（アメリカンタイプ26、ATCC、ロット番号2008862;10 7mg、乾燥重量）を水17mLに溶解し、15分間ずつ合計150分間、１／４”マイクロ チップ（Branson Sonifier 250、出力レベル6、50％デューティサイクル）で音 波破砕した。PSの分子量は約1350から46kDa(約2,000から65RU)に低下した。溶液 を0.45μｍ膜で濾過し、PSの回収率は80％であった(デュボワアッセイ)。 シスタミンによるPn PS 6B(46kD)の修飾 修飾のために、PS 6B溶液4mLを等量の1M炭酸ナトリウム溶液(pH〜12)と混合し た。混合物を約2℃に冷却した。撹拌しながら、CNBr試薬(アセトニトリル中100m g/mL)170μＬを加えた。10分間反応させた後、溶液を約4℃でSephadex G25Mでの ゲル濾過に供した(溶出剤：0.2M炭酸‐重炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.25)。PS含 有分画を、あらかじめ冷却しておいた0.2M炭酸‐重炭酸ナトリウム緩衝液、pH9. 25中0.5Mシスタミンジヒドロクロリド3.25mLと混合した。pHが8.7に低下し、0.3 M水酸化ナトリウムでpH9.25に再調整した。混合物を１時間半pH9.25に保持し、 必要に応じてpHを矯正した。その後、サンプルを約４℃で一晩放置した。サンプ ルを、5ｍＭ EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH８と緩衝液交換し、その 後Centriprep10(Amicon)濃縮器で2.2mLの容量に濃縮した。第一級アミノ基の分 析は1NH2／3RUを示した(TNBSアッセイ)。 シスタミン修飾Pn PS 6Bの還元 10倍モル過剰のDTE（PSに関して測定したアミノ基に基づく）を加えて、シス タミン変性Pn PS 6B（５ｍＭ EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH８中16m g）を還元した。室温で一晩インキュベーションした後、サンプルを、5ｍＭ EDT Aを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH７と緩衝液交換し、Centriprep-10で1.8m Lの容量に濃縮した。スルフヒドリル基についての分折は1SH/8RUを示した(エル マンアッセイ)。 破傷風トキソイドのブロモアセチル化 破傷風トキソイド(RIVM)を、Sephadex G25Mでのゲル濾過によって緩衝液交換 した(溶出剤：5ｍＭ EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH8)。タンパク中 のリシンの側鎖のアミノ基を、６倍過剰（TTd内のリシンの数に基づく）のBrAc ‐ONSuを加えて修飾した。該混合物を室温で２時間インキュベーションし、Seph adex G25Mのカラムにかけた(溶出剤：5ｍＭ EDTA0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH 7)。タンパク含有分画を分折すると、すべてのNH2基の55％が修飾されたことを 示した(TNBSアッセイ)。 システアミン修飾Pn PS 6Bとブロモアセチル化破傷風トキソイドの複合 システアミン修飾Pn PS 6B(12mg)を室温でBrAc‐TTd(5mg)と、PS/TTdモル比7. 5:1で混合した。GP‐HPLC分析によって複合をモニターした(Shodex OHpak KB-80 5および804をシリーズで、PBSを溶出剤とし、1mL/分で35℃において)。91時間後 、PS上に残存するチオール基を10倍モル過剰のブロモアセトアミド(還元前のPS に関して測定した、当初のアミノ基含量に基づく)により室温で６時間キャップ した。BrAc‐TTd上の残りのブロモアセチル基を2.5倍モル過剰の2-アミノエタン チオール（前に加えたブロモアセトアミドの量に基づく）により室温で一晩キャ ップした。溶出剤としてPBSを使用した、0.8mL／分の流量によるSephacryl S‐4 00HR(Pharmacia)カラム(100×1.6cm)での低圧ＧＰＣにより、室温で複合体を精 製した。適当な分画(8mL)を炭水化物とタンパク含量に関して分析し(デュボワお よびローリーアッセイ)、滅菌濾過して、４℃で保存した。
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１２月２８日（１９９８．１２．２８） 【補正内容】 請求の範囲 １．多糖類を生体高分子に共有結合させる方法であって、臭化シアンで該多糖 類を活性化し、続いて該活性化された多糖類を式１のアミノチオールリンカー： H2N-[(CH2)m-CHR1-CR2R3-A]q-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 １ （ここでＡは直接結合又は式-{Z-(CH2)m-CHR1-CHR2R3}nZ-を有する基である； ｍは、0〜5の整数である； ｎは、0〜3の整数である； ｐは、0〜2の整数である； ｑは、０又は１の整数である； R1は、水素、又は必要に応じてアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、C1〜C4 アルコキシカルボニル、カルバモイル、モノ-若しくはジ-C1〜C4アルキルカル バモイル若しくはN-(α-カルボキシアルキル)カルバモイルで置換されたC1〜 C6アルキル、又はｍが０でなければ、R1はヒドロキシル、アミノ、若しくは ペプチジルアミノである； R2及びR3は、独立に、水素若しくはC1〜C4アルキルであるか、又は両者でオ キソ基を形成する； R4は、水素、C1〜C4アルキル、カルボキシル、C1〜C4アルコキシカルボニル、 カルバモイル、モノ-若しくはジ-C1〜C4アルキルカルバモイル若しくはN-(α- カルボキシアルキル)カルバモイルである； R5は、水素、メチル、ヒドロキシ、又はC1〜C7アシルオキシである； R6は、水素又はメチルである； R7は、水素又はチオール保護基又は式：-S-CHR6-(CHR5)q-CHR4-[A-CR2R3- CHR1-(CH2)m]q-NH2を有する基である； Ｚは、イミノ、メチルイミノ、酸素、又は硫黄である）と反応させて、式２Ps -O-C(=NH)-NH-[(CH2)m-CHR1-CR2R3-A]q-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 ２ （ここでPsは多糖類残基であり、Ａ、ｍ、ｐ、ｑ、R1、R2、R3、R4、R5、R6、及 びR7は上に定義した通りである）を有するチオール化多糖類を産生せしめた後、 必要に応じて保護基R7を除去し、該チオール化多糖類を活性化生体高分子と反応 させることを具備する方法。 ２．多糖類を生体高分子に共有結合させる方法であって、式３： H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3-A-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 ３ （ここで、Ａ、ｍ、ｐ、R1、R2、R3、R4、R5、R6及びR7は請求項１の定義通りで ある）で表わされるアミノーチオールリンカーを用いることを具備する方法。 ３．R7が、式:-S-CHR6-(CHR5)p-CHR4-[A-CR2R3-CHR1-(CH2)m]q-NH2を有する基 である請求項１又は２に記載の方法。 ４．前記チオール保護基R7が-C(=O)-R、-C(=S)-R、-C(=NR)-R、-C(=O)-SR、-C (=S)-NHR、-SO2-OR又は-P(=O)(OR)2のようなアシル、チオアシル又はイミノアシ ル基であり、Ｒが水素、又はメチル、ニチル、アリル、tert-ブチル、フェニル 、ベンジル等のC1-C7ヒドロカルビルである請求項１又は２に記載の方法。 ５.R1がα-アミノ酸の側鎖、特に水素、C1-C4アルキル又はα-ヒドロキシC1-C4 アルキルである、請求項１‐４のいずれかに記載の方法。 ６．R2とR3がオキソ基を形成している請求項1〜5の何れかに記載の方法。 ７．Ａが、-(NH-CHR1-CO)nNH-の式を持つ基であり、ｎが０から２までの整数 である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 ８．R4とR5が、水素又はメチル、好ましくは水素であり、p=0又は１である、 請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 ９．式:-C(=NH)-NH-[(CH2)m-CHR1-CR2R3-A]q-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-(ここで、 Ａ、ｍ、ｐ、ｑ、R1、R2、R3、R4、R5、R6は請求項1〜8の何れか１項で定義した とおりである)を有する基によって共有結合された２つの生体高分子の複合体。 １０．式:-NH-(CH2)m-CHR1-CR2R3-A-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-（ここで、Ａ、ｍ 、ｐ、R1、R2、R3、R4、R5及びR6は請求項1〜8の何れか１項で定義したとおりで ある）を有する基によって共有結合された２つの生体高分子の複合体。 １１．前記２つの生体高分子が多糖類とペプチド又はタンパクである、請求項 ９又は１０に記載の複合体。 １２．請求項９〜１１のいずれかに記載の複合体を含有するワクチン。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．多糖類を生体高分子に共有結合させる方法であって、臭化シアンで該多糖 類を活性化し、続いて該活性化された多糖類を式１のアミノチオールリンカー： H2N-[(CH2)m-CHR1-CR2R3-A]q-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 1 （ここでＡは直接結合又は式-{Z-(CH2)m-CHR1-CHR2R3}nZ-を有する基である； ｍは、0〜5の整数である； ｎは、0〜3の整数である； ｐは、0〜2の整数である； ｑは、０又は１の整数である； R1は、水素、又は必要に応じてアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、C1〜 C4アルコキシカルボニル、カルバモイル、モノ-若しくはジ-C1〜C4アルキル カルバモイル若しくはN-(α-カルボキシアルキル)カルバモイルで置換された C1〜C6アルキル、又はｍが０でなければ、R1はヒドロキシル、アミノ、若し くはペプチジルアミノである； R2及びR3は、独立に、水素若しくはC1〜C4アルキルであるか、又は両者で オキソ基を形成する； R4は、水素、C1〜C4アルキル、カルボキシル、C1〜C4アルコキシカルボニル、 カルバモイル、モノ-若しくはジ-C1〜C4アルキルカルバモイル若しくはN-(α- カルボキシアルキル)カルバモイルである； R5は、水素、メチル、ヒドロキシ、又はC1〜C7アシルオキシである； R6は、水素又はメチルである； R7は、水素又はチオール保護基又は式：-S-CHR6-(CHR5)p-CHR4-[A-CR2R3- CHR1-(CH2)m]qNH2を有する基である； Ｚは、イミノ、メチルイミノ、酸素、又は硫黄である）と反応させて、式２ Ps-O-C(=NH)-NH-[(CH2)m-CHR1-CR2R3-A]q-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 2 （ここでPsは多糖類残基であり、Ａ、ｍ、ｐ、ｑ、R1、R2、R3、R4、R5、R6、及 びR7は上に定義した通りである）を有するチオール化多糖類を産生せしめた後、 必要に応じて保護基R7を除去し、該チオール化多糖類を活性化生体高分子と反応 させることを具備する方法。 ２．多糖類を生体高分子に共有結合させる方法であって、式３ H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3-A-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 3 （ここで、Ａ、ｍ、ｐ、R1、R2、R3、R4、R5、R6及びR7は請求項１の定義通りで ある）で表わされるアミノ‐チオールリンカーを用いることを具備する方法。 ３．R7が、式：-S-CHR6-(CHR5)p-CHR4-[A-CR2R3-CHR1-(CH2)m]q-NH2を有する 基である請求項１又は２に記載の方法。 ４．前記チオール保護基R7が-C(=O)-R、-C(=S)-R、-C(=NR)-R、-C(=O)-SR、-C (=S)-NHR、-SO2-OR又は-P(=O)(OR)2のようなアシル、チオアシル又はイミノアシ ル基であり、Ｒが水素、又はメチル、エチル、アリル、tert-ブチル、フェニル 、ベンジル等のC1-C7ヒドロカルビルである請求項１又は２に記載の方法。 ５．R1がα-アミノ酸の側鎖、特に水素、C1-C4アルキル又はα-ヒドロキシC1- C4アルキルである、請求項１‐４のいずれかに記載の方法。 ６．R2とR3がオキソ基を形成している請求項1〜5の何れかに記載の方法。 ７．Ａが、-(NH-CHR1-CO)nNH-の式を持つ基であり、ｎが０から２までの整数 である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 ８．R4とR5が、水素又はメチル、好ましくは水素であり、p=0又は１である、 請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 ９．式：-C(=NH)-NH-[(CH2)m-CHR1-CR2R3-A]q-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-（ここで 、Ａ、ｍ、ｐ、ｑ、R1、R2、R3、R4、R5、R6は請求項1〜8の何れか１項で定義し たとおりである）を有する基によって共有結合された２つの生体高分子の複合体 。 １０．式：-NH-(CH2)m-CHR1-CR2R3-A-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-（ここで、Ａ、ｍ 、ｐ、R1、R2、R3、R4、R5及びR6は請求項1〜8の何れか１項で定義したとおりで ある）を有する基によって共有結合された２つの生体高分子の複合体。 １１．前記２つの生体高分子が多糖類とペプチド又はタンパクである、請求項 １０又は１１に記載の複合体。 １２．請求項９〜１１のいずれかに記載の複合体を含有するワクチン。
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