JP2001509010A

JP2001509010A - Ｂｍｐ―４プロモーターならびに骨粗鬆症の予防および／または治療用の治療剤のスクリーニングにおけるその用途

Info

Publication number: JP2001509010A
Application number: JP52429798A
Authority: JP
Inventors: デイケマ，レイン; フアン・デン・ウエインガールト，アルトウル
Original assignee: アクゾ・ノベル・エヌ・ベー
Priority date: 1996-11-22
Filing date: 1997-11-20
Publication date: 2001-07-10
Also published as: US6159696A; AU5558498A; WO1998023740A1; EP0937145A1; CA2272345A1; BR9713130A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒト骨形成因子-4(BMP-4)プロモーター領域およびその断片、該プロモーター領域を含むベクター、および該プロモーター領域またはベクターを含む宿主細胞に関する。本発明はさらに、骨粗鬆症の予防および／または治療に使用するための治療剤の同定方法であって、a）レポーター遺伝子に作動的に結合したBMP-4プロモーター領域またはその断片を含む第１発現ベクターと、エストロゲン受容体をコードするDNAを含む第２発現ベクターとを細胞内に導入し、b）該細胞を潜在的治療剤と接触させ、c）該レポーター遺伝子にコードされるタンパク質の発現をモニターする工程を含んでなる方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】BMP-4 プロモーターならびに骨粗鬆症の予防および／または治療用の治療剤のスクリーニングにおけるその用途本発明は、骨粗鬆症の予防および／または治療用の治療剤のスクリーニング方法に関する。本発明は、哺乳動物骨形成因子-4をコードする遺伝子のプロモーター領域の単離およびクローニング、ならびに組換え発現ベクターの構築のための、該プロモーター領域の用途に関する。本発明はまた、該プロモーター領域がレポーター遺伝子に作動的に結合している組換え発現ベクターを含んでなる細胞に関する。さらに、本発明は、骨粗鬆症の予防および／または治療用の治療剤の同定方法に関する。骨粗鬆症は、骨量の減少により特徴づけられる骨障害であり、ヒトの骨の脆弱化および多孔化をもたらす。その結果、骨粗鬆症に罹患した患者では、骨折のリスクが増加する。特に閉経後の女性では、骨粗鬆症は、卵巣によるエストロゲン産生の減少から生じる主要症候群の１つである。一般に、閉経後の女性の骨の減少は、エストロゲン置換により予防または治療する。エストロゲンは、低レベルで投与される場合には、骨の減少に対して有利な影響を及ぼす。しかしながら、いわゆるエストロゲン置換療法の欠点は、子宮内膜上のエストロゲンの望ましくない副作用、すなわち乳癌のリスクの増加、ならびに子宮内膜癌のリスクの増加につながる子宮内膜刺激および／または過形成である。これらの重篤な副作用を考慮すると、エストロゲンを使用しなくて済む骨粗鬆症の代替的治療法が大いに必要とされている。骨粗鬆症の予防および／または治療のためのそのような代替的で安全な方法を提供することが、本発明の目的である。骨形成因子（BMP）は、de novo軟骨および骨形成を誘導しうる一群のタンパク質であり、哺乳動物の胚形成中の骨格発生に必須であるらしい（Wang，Trends B iotechnol．11，379，1993）。BMPは、その骨誘導特性のため、臨床的に関心が持たれることがある。最近、骨形成因子-4(BMP-4)の濃度が骨折治癒過程の初期に劇的に増加することが明らかとなった（Nakaseら，J．Bone Miner.Res.９,651 ,1994およびBostromら,J.Orthopaed．Res．13，357，1995）。インビボ実験は、 BMP-4の転写のアップレギュレーションが、実際に、哺乳動物において骨治癒を促進することを示している(Fangら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA． 93，5753，1966）。これらの観察は、骨リモデリングおよび骨折治癒におけるBM P-4の重要な役割を示唆している。 BMP-4の役割は、発生の多数の段階において決定的に重要と考えられるが、BMP -4遺伝子の特異的発現の基礎となる調節機構は知られていない。BMP-4転写産物は、ノーザンブロット分析およびin situハイブリダイゼーションにより示されるとおり、いくつかの特異的組識内で発現される。コード領域においては完全に同一であるが5'非コード領域においては異なる２つのヒトBMP-4転写産物が同定されている。両転写産物の細胞系依存的発現が、これまでの研究で示されている。興味深いことに、複数の転写産物の存在が、BMP-4遺伝子調節における重要な相違を示唆している。さらに、BMP-4 mRNAの短い半減期は、該遺伝子が主に転写レベルで調節されることを示唆している（Rogersら，Cell．Growth．Differ．7 ，115，1996）。本発明において、BMP-4の調節が、骨折治癒のための及び骨粗鬆症の予防または治療のための代替的治療方法につながることが見出された。BMP-4の局所産生は、骨形成の誘導において、組換えタンパク質の外因的運搬より効率的であるらしいため、本発明による治療は、骨芽細胞におけるBMP-4の組識特異的局所発現のモジュレーションに基づく。驚くべきことに、BMP-4遺伝子の発現が、タモキシフェンおよびラロキシフェンにより誘導および／または刺激されうることが見出された。これらのよく知られている抗骨粗鬆症剤は、骨の減少を妨げ、それ自体で骨密度を維持する一方、子宮または乳房に対する影響は少ないか又は全くない。さらに、これらの化合物が、ER媒介性遺伝子転写モジュレーションにおける17β-エストラジオールの作用に対して子宮または乳房細胞レベルで拮抗することが、インビトロおよびインビボの両方で確認されている。これらの抗骨粗鬆症剤が、BMP-4遺伝子発現のER媒介性調節を介してそれらの有益な活性を現すことが、初めて本発明で確認された。本発明によれば、ある種の化合物に結合しているER（それにより化合物／ER複合体を形成する）が、BMP-4遺伝子の発現を調節する。しかしながら、17-β-エストラジオールなどのエストロケンは、BM P-4遺伝子の発現に対する有意な転写効果を示さなかった。このことは、タモキシフェンおよびラロキシフェンがそれらの抗骨粗鬆症活性を示す際のメカニズムとは異なるメカニズムで、エストロケンがその抗骨粗鬆症活性を現すことを示している。したがって、BHP-4遺伝子を転写レベルで骨組識特異的に調節する因子の同定は、骨折治癒を制御し骨の減少を妨げる治療剤の同定につながる。 BMP-4遺伝子のER媒介性発現をモジュレーションする治療剤の同定方法であって、該モジュレーションが骨粗鬆症の予防および治療における有益な効果をもたらして、該治療剤が乳房または子宮に対する望ましくない副作用を示さないことを特徴とする方法を提供することが、本発明の目的である。また、本発明のこの方法で使用可能な物質を提供することも、本発明の目的である。１つの態様では、本発明は、ヒトBMP-4プロモーター領域および該プロモーター領域の断片を提供する。プロモーター領域は、ヒトBMP-4遺伝子の発現をモジュレーションし制御する、ヒトBMP-4遺伝子のコード配列の上流領域の核酸配列と理解される。好ましくは、BMP-4プロモーター領域は、プロモーター1（P1）領域またはプロモーター2（P2）領域である。より好ましくは、本発明のBMP-4プロモーター領域は、配列番号１または配列番号２に示す核酸配列またはそれらの断片（ただし、該断片は、遺伝子の下流コード配列の発現をモジュレーションおよび／または制御する）を有する。本発明のプロモーター領域の断片は、例えば、図5aに示すプロモーター領域１のヌクレオチド配列のヌクレオチド断片-1166〜+173、ヌクレオチド断片-697〜+173、ヌクレオチド断片-323〜+ 173、ヌクレオチド断片-323〜+33、ヌクレオチド断片-323〜+16およびヌクレオチド断片-323〜-42、または図5bに示すプロモーター2領域のヌクレオチド配列のヌクレオチド断片-1212〜+70、ヌクレオチド断片-247〜+70である。もう１つの態様において、本発明は、遺伝子（好ましくは、レポーター遺伝子）に作動的に結合しているヒトBMP-4プロモーター領域を含んでなる組換え発現ベクターを提供する。好ましくは、本発明のベクターは、プロモーター1（P1）領域またはプロモーター2（P2）領域を含む。より好ましくは、本発明のベクターは、配列番号１または配列番号２に示す核酸配列またはそれらの断片を有するプロモーター領域を含む。本発明の適当な発現ベクターとしては、例えば、細菌または酵母プラスミド、広い宿主領域のプラスミドおよびベクター(プラスミドおよびファージまたはウイルスDNAの組合せに由来するもの)が挙げられる。染色体DNA由来のベクターも含まれる。さらに、複製起点および／またはドミナント選択マーカーが、本発明のベクター中に存在することが可能である。本発明のベクターは、宿主細胞を形質転換するのに適している。本発明の適当な宿主細胞としては、細菌宿主細胞、酵母および他の真菌、植物または動物宿主（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはサル細胞）が挙げられる。したがって、本発明のDNAまたは発現ベクターを含む宿主細胞も、本発明の範囲内に含まれる。本発明の発現ベクターを構築するために使用しうる適当なレポーター遺伝子としては、例えば、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT ）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子およびβ-ガラクトシダーゼ遺伝子が挙げられる。本発明の好ましいベクターとしては、pSLA4.1EX、pSLA4.1PX、pSLA4.1NX、pSL A4.1N+33、pSLA4.1N+16、pSLA4.1N-42、pSLA4.2PNおよびpSLA4.2NNが挙げられる。本発明のDNAまたはベクターの製造および該DNAまたはベクターによる宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションのための技術は、標準的なものであり、当該技術分野でよく知られている。例えば、Sambrookら，Molecular Cloning:A laboratory Manual．第２版，Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor，NY，1989を参照されたい。本発明のBMP-4プロモーター領域および発現ベクターは、BMP-4遺伝子の発現をモジュレーションする化合物のインビトロでの同定に使用することかでき、そのような化合物は、骨粗鬆症の予防または治療において使用するための潜在的治療剤である。したがって、もう１つの態様において、本発明は、骨粗鬆症の予防または治療に使用するための治療剤の同定方法であって、 a)レポーター遺伝子に作動的に結合したBMP-4プロモーター領域を含む第１発現ベクターと、エストロゲン受容体をコードするDNAを含み該エストロゲン受容体を発現しうる第２発現ベクターとを宿主細胞内に導入し、 b)可能な治療活性を有する化合物と該細胞とを接触させ、 c)該レポーター遺伝子にコードされるタンパク質の発現をモニターすることを含んでなる方法を提供する。好ましくは、該宿主細胞は哺乳動物由来、より好ましくはヒト由来である。最も好ましいのは、ヒト骨芽細胞系に由来する宿主細胞である。好ましくは、第１発現ベクターは、プロモーター1領域またはプロモーター2領域、より好ましくは、配列番号１もしくは配列番号２に示す核酸配列またはそれらの断片(ただし、該断片は、該レポーター遺伝子の発現をモジュレーションおよび／または制御する)を含む。試験化合物がエストロケン受容体（ER）に対して親和性を示す場合には、それは、第２発現ベクターにより発現されるERに結合することになる。生成した化合物／ER複合体がBMP-4プロモーター領域に結合し、該BMP-4プロモーター領域の制御下でレポーター遺伝子の発現を誘導する場合には、該レポータータンパク質の存在は、該化合物がBMP-4プロモーターを活性化してBMP-4遺伝子の発現を調節する可能性を示す。本発明の方法で試験した17β-エストラジオールは、レポーター遺伝子の発現を誘導しなかった。このことは、17β-エストラジオール／ER複合体がBMP-4プロモーターを活性化しないことを示している。タモキシフェンおよびラロキシフェンは、本発明の方法で試験した場合、レポーター遺伝子の発現を誘導することが見出された。一方、レポーター遺伝子が、エストロゲン応答要素（ERE）を含むプロモーターの制御下にある場合には、これらの化合物はいずれも、レポーター遺伝子の発現を誘導することができなかった。したがって、本発明は、骨粗鬆症の予防および／または治療用の治療剤をスクリーニングするための迅速かつ経済的な方法を提供する。本発明の方法はさらに、骨に対して有益な影響を及ぼす一方、乳房または子宮に対する影響が少ないか又は全くない治療剤の選択をもたらす。本発明の方法は、多数の潜在的化合物の高処理量スクリーニングのための使用に特に適している。したがって、本発明のもう１つの態様においては、本発明の方法で同定した化合物を、BMP-4産生を刺激するための医薬組成物の製造に使用することができる。より詳しくは、本発明の方法で同定した化合物を、骨の減少の予防および／または治療用の医薬組成物の製造に使用することができる。より詳しくは、本発明の方法で同定した化合物を、骨粗鬆症の予防および／または治療用の医薬組成物の製造に使用することができる。驚くべきことに、ICI 164384がBMP-4のER媒介性発現をモジュレーションすることが見出された。ICI 164384は抗癌剤としてよく知られている。しかしながら、該化合物を本発明方法で試験したところ、それは、レポーター遺伝子の相当な発現を引き起こした。したがって、インビボにおいて、ICI 164384は BMP-4遺伝子の発現をモジュレーションし、それ自体で骨形成を刺激すると結論することができた。このことから、ICI 164384は、抗骨粗鬆症療法での使用に適したものと言える。したがって、本発明は、骨粗鬆症の予防および／または治療用の医薬の製造における、ICI 164384の使用を提供する。図面の説明図１ヒトBMP-4遺伝子の構造および制限地図。５個のエキソンを含有する遺伝子の一部だけが示されている。エキソン（実線）は、1〜5の数字で示されている。コード領域（陰影付きの枠）は、エキソン４内の提案されている翻訳開始部位の位置（矢印）と共に示されている。この物理的地図に関連した制限部位だけが示されている：E，EcoRI;X，XhoI;P，PstIおよびN，NcoI。図２ BMP-4遺伝子のエキソン−イントロン境界。各イントロン／エキソン境界のヌクレオチド配列および各エキソンおよびイントロンのサイズが示されている。エキソン１および２の5'部位は、この図には示されていない（より詳しい情報は、図５を参照されたい）。エキソン５の3'部位は、そのポリ(A+)追加部位が不明のため、示されていない。図３２個のBMP-4転写産物に関するプライマーの位置。各エキソンの第１ヌタレオチドの位置（数字）と共に、イントロンの位置（垂直の線）が示されている。コード領域（陰影付きの枠）およびエキソン（太字の数字）が示されている。第1B MP-4転写産物(BMP-4.1)は、エキソン1、3、4および５を含有するHSBMP2B（Gen E MBL，gcg受託番号M22490）と同一である。第２転写産物（BMP4.2）からは、HSBM P2B配列（Gen EMBL，gcg受託番号M22490）のヌクレオチド262位でエキソン3、4 および５にスプライシングされるエキソン２の長さだけが示されている（Chenら，Biochim．Biophys．Acta 1174，286，1993）。両転写産物のエキソン3、4および５の配列は全く同一である。プライマー（矢じり）が、リバース（R）およびフォワード（F）として示されている。図４ヒトBMP-4遺伝子を表す図。エキソン（実線）は数字1〜5で示されている。コード領域（陰影付きの枠）が、エキソン内、エキソン１およびエキソン２の両方に由来する転写産物（それぞれBMP4.1およびBMP4.2）内に示されている。プロモーター断片のクローニングに関連した制限部位だけが示されている：E，EcoRI;X，XhoI;P，PstI，N，NcoI およびN:*，NciI。２個のプロモーター領域（P1およびP2）の位置が太線で表されている。図５ BMP-4プロモーター1領域（図5a、配列番号１）およびBMP-4プロモーター2領域（図5b、配列番号２）の核酸配列。塩基の番号づけは、最初に見出された転写開始部位（+1）に基づく（後に、もう１つの転写開始部位が−69で見出された）。プライマー伸長（＃）およびRACE-PCR（*）により見出された転写開始部位が示されている。イントロンは、通常の文字で示されている。プライマー伸長で使用するプライマーEX1REVAおよびEX2REVAの位置には、下線が付されている。図６エストロゲン応答要素含有プロモーター（pERE₃TATA-Luc）またはBMP-4由来プロモーター1領域（pSLA4.1EX）（ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流）に基づくレポーター構築物に対する17β-エストラジオールおよびラロキシフェンの差次的ER媒介性効果を示すヒストグラム。個々のレポーター構築物を、ヒトエストロゲン受容体（pKCRE-ER）用の発現プラスミドと共に、骨肉腫細胞系U-2 OS内に一過性にトランスフェクトした。図７ pSLA4.1EX中には存在しpSLA4レポーター中には存在しないBMP-4プロモーター1 領域に依存するラロキシフェンのER媒介性効果を示すヒストグラム。図８個々のBMP-4プロモーター領域を含有するレポーターの両方に存在するラロキシフェンのER媒介性効果を示すヒストグラム。図９ BMP-4プロモーター領域を含有するレポーターの両方に対するラロキシフェン、4-OH-タモキシフェンおよびICI 164.384のER媒介性効果を示すヒストグラム。実施例細胞培養胚性腫瘍細胞系Tera-2（Mosselmanら,Cancer Res.54,220，1994）および骨肉腫細胞系U-2 OS（ATCC HTB 96）を含むいくつかのヒト細胞系を使用した。U-2 OSの培養には、Dulbecco改変培地(DMEM)およびHam F12培地(10％(v/v)ウシ胎仔血清(FCS)で補足されているもの)の１：１混合物を使用した。Tera-2には、37℃で7.5％ CO₂雰囲気の存在下、MEMおよび10％ FCSを使用した。ヒトBMP-4遺伝子の単離ラムダgt10 8^1/2日C57BLマウスcDNAライブラリー（Vanderbilt University，N ashville，TNのB.L.M．Hogan博士からの贈呈品）上、ヒトBMP-4 cDNA配列HSBMP2 B（Gen EMBL，gcg受託番号M22490）に基づくプライマーF4（5'-CGCGGATCCCAAGTT TGTTCAAGATTGGCT-3';配列番号３）およびR4（5'-CGCGGATCCGCCTGATCTCAGCGGCACC C-3';配列番号４）を使用するPCRにより、1.3kbのマウス完全長BMP-4 cDNA断片（mmBMP4）を得た。このプローブを使用して、ヒトゲノムコスミドライブラリー（Ouwelandら，Biochim．Biophys．Acta 825，140，1985;University of Nijmeg en，The NetherlandsのJ．van Groningen氏からの贈呈品）をスクリーニングした。５ｘSSC、５ｘデンハルト液、0.5% SDS、100μg/mlの変性ニシン精子DNA中の非ストリンジェンシーな条件下、65℃で一晩、³²P標識 mmBMP4プローブで約３ｘ10⁵個のコスミドクローンをスクリーニングし、オートラジオグラフィーの前に、フィルターを65℃で0.1ｘSSC/0.1% SDSまで洗浄した。さらに、38kbの挿入断片を有する陽性コスミドクローンの１つを精製し、分析した。ゲノムクローンのマッピングおよびDNA配列決定分析コスミドDNAを精製し、適当なendRで消化した後、サザンブロット分析に付して、物理的地図を作製した。該DNAをHybond-Nメンブレン（Amersham）上にトランスファーし、mmBMP4断片またはBMP-4特異的プライマー(F4およびR4)でプローブして、該遺伝子の配向およびエキソンのおよその位置を決定した（図１）。これらのプローブとハイブリダイズした断片を、pBluescript II KS(-)(Stratagen e)中にサブクローニングし、T7-Sequencing Kit（Pharmacia）を使用するDNA配列分析により分析した。また、BMP-4遺伝子のスプライス部位を同定するために、可能なスプライス部位付近の内部プライマーを選択した。これらのプライマーを、dsDNA Cycle Sequencing System（GibcoBRL）による直接コスミドDNA配列決定に使用した。得られたゲノム配列を、コンピューター分析(Fasta，Caos Camms a，NL)によりマウスBMP-4遺伝子(Gen EMBL、gcg受託番号X56840) およびいくつかのヒトBMP-4 cDNA配列と比較したところ、その38kbのゲノムクローンが、完全なBMP-4遺伝子を含有していることが示された。スプライス部位の厳密な局在および配列を図２に示す。スプライス部位を定めるエキソン／イントロン境界のすべてが、3'スプライス受容部位のAGおよび5'スプライス供与部位の GTのコンセンサス配列と一致する。ヒトBMP-4転写産物の5'-cDNA末端の迅速な増幅 5'-AmpliFinder Raceキット（Clontech）を使用して、ヒトBMP-4転写産物の完全長5'末端を含有するcDNAを単離した。オリゴdT_12-18（Gibco）とTera-2細胞由来の２μｇのポリA+とを使用し、供給業者の仕様書に従い、第1cDNA鎖を合成した。特別に設計した一本鎖アンカーオリゴヌタレオチド（キットで提供されるもの）を、T4 DNAリガーゼを使用してcDNAの3'末端に連結した。アンカー連結の後、該アンカーに相補的なプライマーとエキソン４内のプライマー（R1D;5'-GCATT CGGTTACCAGGAATCATGG-3';配列番号５）とを使用して、該cDNAの一部をPCRにより増幅した。PCR産物をプラスミドpGEM-T（Promega）中にサブクローニングし、T7 -Sequencing Kit（Pharmacia）を使用して配列決定した。配列分析は、一方の転写産物が、骨肉腫細胞系（Gen EMBL，gcg受託番号M22490）由来の既に記載されているcDNAと同一であること、およびもう一方の転写産物が、前立腺癌細胞系（ Chenら,Biochim.Biophys．Acta 1174，286，1993）由来のcDNAと同一であることを示した。また、両転写産物と該ゲノム構造との比較は、一方の転写産物がエキソン1、3、4および5（BMP4.1と称される）を含有し、もう一方の転写産物がエキソン2、3、4および5（BMP4.2と称される）を含有することを示した。両転写産物、プライマーの位置およびイントロンのヌクレオチドの位置を、図３に示す。プロモーター1およびプロモーター2の5'隣接領域の配列決定ヒトBMP-4遺伝子は５個のエキソンからなり、最初の３個のエキソンは非コードエキソンであり（エキソン1、2および３）、一方、エキソン４および５は、BMP-4タンパク質をコードしている。BMP4.1（エキソン-1-3-4-5）およびBMP4.2（エキソン-2-3-4-5 ）は、P1およびP2と称される２個の推定プロモーター領域から生じる。部分制限地図およびそれらの２個の推定プロモーター領域を、図４に図示する。両領域を機能的に特徴づけるために、本発明者らは、プロモーターP1およびP2をクローニングし、配列決定した。上流プロモーターとエキソン１コード領域の一部とを含む1.3kbのendoR EcoRI/XhoIプロモーター1断片、および上流プロモーターと完全エキソン２コード領域とを含む1.3kbのendoR PstIプロモーター2断片を、ゲノムBMP-4コスミドDNAの消化により得た。全配列を得るために、該プロモーター断片の一部をpBluescript中にサブクローニングし、T7-Sequen cing Kit（Pharmacia）を用いて両方向に配列決定した。直接コスミド配列決定（前記のとおり）により、エキソン１の3'部位と該イントロンの一部とを配列決定した。両プロモーター領域の配列を図５に示す。転写開始部位両プロモーターは、TATAを含有していないが、転写開始中に関与すると考えられるいくつかのコンセンサス配列（例えば、GCに富む配列）を含有する。BMP-4 遺伝子内で転写が開始する位置を決定するために、本発明者らは、プライマー伸長およびRACE-PCR増幅により、この領域を分析した。 cDNA末端の迅速な増幅(RACE-PCR)を用いて、ヒトBMP-4 mRNAの5'末端をクローニングし、特徴づけた。図５に示すとおり、RACE-PCR（前記のとおり）で見出されたBMP-4 mRNAは、エキソン１またはエキソン２の5'位の種々の位置で終結するものであった。両mRNAの5'-UTRがエキソン１またはエキソン２と同一であるという知見は、両方のBMP-4転写産物が、実際に、それらの２個のクローン化プロモーター領域から転写されることを示すものであった。オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するプライマー伸長系（Promega ）により、プライマー伸長分析を行なった。この実験で使用したプライマーは、 BMP-4遺伝子のエキソン１またはエキソン２内のアンチセンス配列に対応するものであった［それぞれEX1REVA（5'-CAGCTCGGATGCCACACTCAC-3';配列番号６）およびEX2REVA（5'-CATGTTCCCGGAGTCGAG-3';配列番号７）、詳細は図５を参照されたい］。T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび[γ-³²P]ATPで、各プライマーを末端標識し、約５ｘ10⁵cpmのプライマーを500ngのU-2 OSポリA+RNA、250ngのTera- 2ポリA+RNAまたは10μgの酵母tRNAと混合した。該プライマー／RNA混合物を95℃ で変性させ、55℃で１時間インキュベートして、該プライマーをアニーリングさせた。逆転写酵素としてSuperscript II(Gibco)を使用して、プライマー伸長を5 0℃で１時間で完了させた。プライマー伸長産物のサイズを、公知DNA配列との比較により配列決定ゲル上で分析した。まず、最も顕著なプライマー伸長産物は、RACE-PCRにより決定された位置および公開されているBMP-4 cDNAの最も5'側のUTRと符合することが判明した。ここに記載する結果は、両プロモーターが、複数の転写開始部位を、GCに富む領域内の一群の位置に有することを示している。最も上流の開始部位を、特に根拠なく +1位と割り当てた（図５）。異なるEX1REVAプライマーを使用して、プロモーター領域１内のより上流の転写部位を同定し、それは‐69位であることが判明した（図5a）。 BMP-4プロモーター構築物 BMP-4プロモーター領域構築物を、標準的なクローニング法（Sambrookら，Mol ecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版,Cold Spring Harbor Laboratory ,Cold Spring Harbor,NY,1989）で作製した。プロモーター領域の断片を、クレノウおよびデオキシヌクレオチド三リン酸で平滑末端化し、endoR SmaIで消化されたpSLA4ルシフェラーゼレポータープラスミド（Afinkら，Oncogene 10，1667 ，1995）中にサブクローニングした。構築物pSLA4.1EXは1.3kbのendoR EcoRI/Xh oIプロモーター1断片（-1166/+173）を含有し、構築物pSLA4.1PXは0.9kbのendoR PstI/XhoIプロモーター1断片（-697/+173）を含有し、構築物pSLA4.1NXは0.5kbのendoR NcoI/XhoIプロモーター1断片（-323/+173）を含有する（図5a）。構築物pSLA4.2PNは1.3kbのendoR PstI/NciIプロモーター2断片（-1212/+70）を含有し、構築物pSLA4.2NNは0.3kbのendoR NciI/NciIプロモーター2断片（-247/+70）を含有する（図5b）。プロモーター領域１の追加的な断片を、進行性エキソヌクレアーゼIII消化（Erase-a-base Kit,Promega）により作製し、クレノウおよびデオキシヌクレオチド三リン酸で平滑末端化し、endoR SmaIで消化されたpSLA4ルシフェラーゼレポータープラスミド中にサブクローニングした。このようにして、ヌクレオチド断片-323/+33を含有するpSLA4.1N+33 、ヌクレオチド断片-323/+16を含有するpSLA4.1N+16およびヌクレオチド断片-32 3/-42を含有するpSLA4.1N-42のような構築物を得た（図5a）。 Qiagen tip-100カラムを製造業者の指示に従い使用して、プラスミドを精製した。pSLA4ベクターに関する全挿入断片のセンス配向を、DNA配列決定により確認した。 EREプロモーター構築物エストロゲン応答要素（ERE）を含有するプロモーター構築物は、pBL-CAT6（B oshartら，Gene 110，129，1992）に基づくものであった。それを、pBL CAT6（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする情報を含有する）のendoR XhoI/StyI断片をpXP2（ルシフェラーゼをコードする情報を含有する；Nordeenら，Biotechniques 6，454，1988）のendoR XhoI/StyI断片で置換することにより、ルシフェラーゼ（Luc）レポーター構築物中に修飾した。配列5'-GGGTATATAAT-3'（配列番号８）を有する最小プロモーター／TATA要素を、endoR XbaI部位とendoR BamHI部位との間に挿入して、プラスミドpTATA-Lucを得た。コア配列5'-AGGTCACAGTGACCT-3'(配列番号９)を有する三重エストロゲン応答要素（ERE）をendoR HindIII部位中に挿入して、プラスミドpERE₃TATA-Lucを得た。ヒトER発現構築物ヒトエストロゲン受容体（ER）を含有する哺乳動物発現構築物pKCRE-ERを、以下のとおりに構築した。ヒトER-cDNAを、G.Greene(Ben May Laboratory for Can cer Research,University of Chicago)から入手した。それは、アミノ酸400位においてバリンの代わりにグリシンをコードしている(G.Greeneら，Science 231， 1150，1986およびToraら，EMBO．J，8，1981，1989)。該ER-cDNAを、ヌクレオチド-30〜+1800位を含むendoR SphI/EcoRI断片として単離した。この断片をT4-DNAポリメラーゼで平滑末端化し、哺乳動物発現構築物pKCR(O'Haraら,Proc．Natl．Acad．Sci．USA，78，1527， 1981)の平滑末端化されたendoR BamHI部位内に挿入した。後者のプラスミドを以下のとおり修飾した：endoR EcoRI/BgIIIでの消化、フィルインおよび再連結、およびpBR327配列でのpBR322配列の置換により、ウサギβ-グロビン遺伝子の最終エキソン領域を除去した(ヌクレオチド1122-1196位；Van Ooyenら，Science 2 06，337，1979)。試験化合物 17β-エストラジオールとは別に、ラロキシフェン、4OH-タモキシフェンおよびICI 164.384を含む多数のエストロゲン類似体を使用した。それらの化学構造はすべて、既に記載されている（Evansら，Bone 17，183S，1995）。一過性トランスフェクション個々のプロモーター領域構築物の種々のエストロゲン類似体によるER媒介性レポーター遺伝子モジュレーションを、骨肉腫細胞（U-2 OS）の一過性トランスフェクションによりアッセイした。トランスフェクションの１日前に、U-2 OS細胞を10⁵細胞/ウェル（６ウェル組識培養プレート；Nunc）の密度で播いた。この場合、該細胞は、FCSの代わりに10％(v/v)木炭除去（charcoal-stripped）ウシ胎仔血清（csFCS）を含有する、フェノールレッドを含まない培地に播いた。供給業者（Gibco，BRL）が記載しているリポフェクション法を用いて、DNAを導入した。これに関しては、該DNA（250μLのOptimen，Gibco BRL中の１μgの受容体構築物、１μgのレポーター構築物および250ngのトランスフェクション対照構築物;別の実験では、pKCREを使用してトランスフェクト化DNAの全量を一定に維持した）を、等容量のLipofectin Reagent（Gibco，BRL）と混合し、室温で30 分間放置した。これに500μLのOptimen（RT）を加え、この混合物を該細胞（該細胞を無血清培地で予め洗浄しておいた）に加えた。37℃で５時間のインキュベーションの後、該細胞を、フェノールレッドを含まない無血清培地で洗浄し、示されている濃度の試験化合物を含有しフェノールレッドを含有しない10％ csFC S培地中で一晩インキュベートした。ライセートの調製の前に、細胞をPBS(7.6mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ pH7.4および0.12M NaCl)で洗浄した。該細胞に200μLの溶解緩衝液(0.1Mリン酸ナトリウム pH7.8および0.2% Triton X-100)を加えることにより、細胞抽出物を調製し、室温で５分間放置した。供給業者（Promega;ルシフェラーゼアッセイ系E1501）が記載しているとおりに、細胞抽出物のルシフェラーゼ測定を行なった。これに関しては、30μLの細胞抽出物を60ウェルOptiplate（Packard）に加え、50μLのルシフェラーゼ基質と一緒にした。該プレートをTopsealフィルム（Packard）で密封し、Topcount（Pack ard）中で測定を行なった。このように、図６は、pERE₃TATA-Luc中のエストロゲン応答要素プロモーターおよびpSLA4.1EX中のBMP-4プロモーターに基づく２個のレポーター構築物に対する17β-エストラジオール（E2）およびラロキシフェンの差次的ER媒介性効果を示している。さらに、この図に示すER媒介性のラロキシフェンの効果は、pSLA4.1EXのBMP-4 プロモーター1領域の存在に基づく（図７）。また、そのER媒介性のラロキシフェンの効果は、BMP-4プロモーター領域１に特徴的であるばかりでなく、BMP-4プロモーター2領域を同様に評価した場合にも明らかであった（図８）。種々のBMP-4プロモーター領域１構築物を作製した場合には、固有のプロモーター活性は減少するが、ER媒介性のラロキシフェンの効果は変化しないことが示された。表１は、種々のBMP-4 プロモーター1領域構築物、およびそれらのa）ホルモンの不存在下のルシフェラーゼ活性の割合（％）（pSLA4.1EXを100％とみなす）で表されたプロモーター活性、およびb）示されている化合物の存在下および不存在下のルシフェラーゼ活性の比率として算出したエストラジオールおよびラロキシフェンの誘導倍率に関する挙動を示す。最後に、他の治療剤に関する分析では、前記のラロキシフェンの効果は、化合物4OH-タモキシフェンおよびICI 164384によっても達成することができる（図９）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１２月１７日（１９９８．１２．１７）【補正内容】請求の範囲１．配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とするヒト BMP-4プロモーター領域およびその断片（ただし、該断片は、遺伝子の下流コード配列の発現をモジュレーションおよび／または制御する）。２．請求項１または２に記載のBMP-4プロモーター領域またはその断片を含んでなるベクターであって、該プロモーター領域または断片が遺伝子（好ましくは、レポーター遺伝子）に作動的に結合していることを特徴とするベクター。３．請求項１もしくは２に記載のBMP-4プロモーター領域もしくはその断片または請求項３に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。４．骨粗鬆症の予防および／または治療用の治療剤の同定方法であって、 a)レポーター遺伝子に作動的に結合したBMP-4プロモーター領域またはその断片を含む第１発現ベクターと、エストロゲン受容体をコードするDNAを含む第２発現ベクターとを宿主細胞内に導入し、 b)該細胞を潜在的治療剤と接触させ、 c)該レポーター遺伝子にコードされるタンパク質の発現をモニターすることを特徴とする方法。５．骨粗鬆症の予防および／または治療用の医薬の製造のための、ICI 164384の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/68 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＺ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトBMP-4プロモーター領域およびその断片。２．該プロモーター領域が配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のBMP-4プロモーター領域。３．請求項１または２に記載のBMP-4プロモーター領域またはその断片を含んでなるベクターであって、該プロモーター領域または断片が遺伝子（好ましくは、レポーター遺伝子）に作動的に結合していることを特徴とするベクター。４．請求項１もしくは２に記載のBMP-4プロモーター領域もしくはその断片または請求項３に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。５．骨粗鬆症の予防および／または治療用の治療剤の同定方法であって、 a)レポーター遺伝子に作動的に結合したBMP-4プロモーター領域またはその断片を含む第１発現ベクターと、エストロゲン受容体をコードするDNAを含む第２発現ベクターとを宿主細胞内に導入し、 b)該細胞を潜在的治療剤と接触させ、 c)該レポーター遺伝子にコードされるタンパク質の発現をモニターすることを特徴とする方法。６．骨粗鬆症の予防および／または治療用の医薬の製造のための、ICI 164384の使用。