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JP2001501190A - Polyethylene glycol conjugated nanoerythrosome, method for producing the same and use thereof - Google Patents

Polyethylene glycol conjugated nanoerythrosome, method for producing the same and use thereof

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JP2001501190A
JP2001501190A JP10514033A JP51403398A JP2001501190A JP 2001501190 A JP2001501190 A JP 2001501190A JP 10514033 A JP10514033 A JP 10514033A JP 51403398 A JP51403398 A JP 51403398A JP 2001501190 A JP2001501190 A JP 2001501190A
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JP
Japan
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neryt
peg
nanoerythrosome
group
conjugate
Prior art date
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Pending
Application number
JP10514033A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
ガードロールト，レネ
ベルメア，フランソワ
Original Assignee
ダイアグノキュア インコーポレイティド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ダイアグノキュア インコーポレイティド filed Critical ダイアグノキュア インコーポレイティド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）であるナノエリスロソームに関する。さらに、本発明はナノエリスロソームの新規の製造方法に関する。さらに、本発明は、免疫原性ポテンシャルの低減を有するナノエリスロソーム組成物に、そして診断及び治療的方法におけるその使用に関する。本発明はさらに、哺乳類における予定症状を診断又は予後判定するための本発明のナノエリスロソーム組成物を用いるバイオアッセイに、並びに本発明のこれらのナノエリスロソーム組成物を含有するキットに関する。   (57) [Summary] The present invention relates to a drug delivery system (DDS) nanoerythrosome. Furthermore, the present invention relates to a novel method for producing nanoerythrosomes. Furthermore, the present invention relates to nanoerythrosome compositions having reduced immunogenic potential and their use in diagnostic and therapeutic methods. The present invention further relates to bioassays using the nanoerythrosome compositions of the invention for diagnosing or prognosing the intended condition in mammals, as well as kits containing these nanoerythrosome compositions of the invention.

Description

【発明の詳細な説明】 ポリエチレングリコール抱合ナノエリスロソーム、その製造方法及びその使用 産業上の利用分野 本発明は、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）であるナノエリスロソーム に関する。さらに、本発明はナノエリスロソームの新規の製造方法に関する。さ らに、本発明は、免疫原性ポテンシャルの低減を有するナノエリスロソーム組成 物に、そして診断及び治療方法におけるその使用に関する。本発明はさらに、哺 乳類における予定症状を診断又は予後判定するための本発明のナノエリスロソー ム組成物を用いるバイオアッセイに、並びに本発明のこれらのナノエリスロソー ム組成物を含有するキットに関する。 発明の背景 ナノエリスロソーム（ｎＥｒｙｔ）は、その含有ヘモグロビンを除去するため に低塩溶液中で処理される赤血球から産生される小胞である。その後、これらの ヘモグロビン無含有赤血球（ゴースト）は押し出されて（真空濾過を邪魔する） 、約１００ｎｍの平均直径を有する小胞を形成する（米国特許第５，６５３，９ ９９号）。ナノエリスロソームは本質的に、リポソームから類推して、リポプロ テオソーム（脂質とタンパク質とで構成される小胞）と考えられる。にもかかわ らず、それらは、ほとんど専ら脂質ベースのリポソームと比較して、全体的に別 個の科学領域を示す。ナノエリスロソームは、表面対容積比が高い（親赤血球の 約８０倍）ために長期間懸濁液中に残存する浮揚性小胞である。ナノエリスロソ ームは、種々 の種類の分子、例えば血流を通って種々の標的に運搬される薬物又はペプチドを 保有し得る。それらは例えば、細胞への選択的供給のために抗体又はペプチド配 位子に結合される。さらに、ナノエリスロソームは生物学的関連物質を被包し得 るか、あるいは生物学的関連分子がそれに結合される。したがって、ナノエリス ロソームは非常に多面的な生物活性薬物担体又はドラッグデリバリーシステム（ ＤＤＳ）である。 ナノエリスロソームは、その他のＤＤＳを上回る利点を有することが示されて おり、生物薬理学における突破口を形成し得る。例えば、多数の薬物は、長期間 、その血中濃度を最適治療レベルに保持するために、繰り返し投与されねばなら ない。そうするために、アルブミンミクロスフェア、アクリルミクロスフェア、 リポソーム、磁性ポリマー、レクチン及びｍＡｂといったようないくつかの方法 が今日試験中である。これらの技術はほとんどが、未だ開発中であり、その用途 は、多かれ少なかれ、抗新生物薬といったような特定の製品群に、および／また は標的器官、例えば肝臓又は膵臓に限定される。これらの薬物担体のいくつかを 用いて得られた結果は有望であるけれども、それらの担体を構成する物質はしば しば、免疫系により異物又はハプテンと認識され、その結果、それらはついには 有害な免疫学的反応を誘発する。 さらに、これらの担体のいくつかは肝臓又は腎臓に迅速に捕獲され、破壊され る。すると薬物がそれらの器官中に直接、高濃度で遊離され、しばしば、毒性作 用をもたらす。 ナノエリスロソームの利点としては：１）それらは、肝臓又は腎臓を経てそれ らの排泄を防止することによりそれらが運搬する薬物の代謝を有意に修飾し；２ ）多数の生物学的関連分子又は生物活性物質を被包又は結合することができ；３ ）数種類の分子、例えば抗 新生物薬、光線療法薬及びペプチドのための漸進性薬物放出システムとして用い て、長期間、血流中の薬物の最適濃度を保持し；そして４）血流中への大量の薬 物の高用量即時投与の必要性を低減し、それにより高血中濃度の有毒薬物により 引き起こされる悪心及び嘔吐といった有害作用を低減し得る、ということが挙げ られる（米国特許第５，６５３，９９９号）。 しかしながら、ナノエリスロソームは、他の担体と比較して低レベルにではあ るが、しかし哺乳類の免疫反応を依然として引き出し得る。さらに、それらは胃 液により破壊され、したがって経口投与用には非修飾形態では有効に用い得ない 。 ナノエリスロソームは、本来、脂質とタンパク質とで構成される。ナノエリス ロソーム（ｎＥｒｙｔ）中のタンパク質及び脂質、例えばホスファチジルセリン の存在は、非自系用途に用いる場合（哺乳類は、自系投与と対照したものとして 別の非適合性哺乳類からのナノエリスロソームを受容しており、それにより血液 ドナー及びレシピエントは同一であるか、又は少なくともドナーとレシピエント は適合性である）、レシピエント哺乳類の免疫学的反応を引き起こす。それらの 望ましくないタンパク質−タンパク質相互作用は、ナノエリスロソームを基礎に した治療的、診断的及び商業的用途に関する可能性を重度に制限し得る。例えば 治療的用途では、ナノエリスロソームは有害免疫反応を誘発する。さらに、診断 用途に用いる場合には、それらは高バックグラウンドに関与する。したがって、 その望ましくない反応を妨げる戦略を見出す必要は依然として存在する。さらに 、低ｐＨ条件で（例えば胃のような）より安定なｎＥｒｙｔ組成物を提供する必 要も依然として存在する。 タンパク質の免疫原性を低減するためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の 使用は、過去に報告されており、当業界で十分公知で ある（米国特許第５，５９５，７３２号）。リポソームをコーティングするため のＰＥＧの使用も報告されている（米国特許第５，５９３，６２２号及び米国特 許第５，６２０，６８９号）。しかしながら、ナノエリスロソームが崩壊を伴わ ずにＰＥＧ結合に耐え得るか否か、あるいはそれらがその生物学的活性を保持し 得るか否かは、未だ確定されていない。したがって、免疫学的ポテンシャルは低 減しているが、しかしドラッグデリバリーシステムとしてのその生物学的活性は 保持するナノエリスロソーム組成物を提供する必要は、依然としてある。 ＤＤＳを抗体により認識される特定部位に対する特異的標的とするための、抗 体のドラッグデリバリーシステムとの結合が報告されている。例えば、米国特許 第５，６２０，６８９号は、ＣＤ−１９抗体結合リポソームを教示する。抗体の ｎＥｒｙｔとの結合がｎＥｒｙｔの完全性を保持するか否かは、今までのところ 確定されていない。 したがって、そこに抱合する配位子により細胞又は組織に対して特異的に標的 とされるｎＥｒｙｔ組成物を提供する必要が、依然としてある。 本発明は、これらのそしてその他の必要を満たそうと試みる。 本発明の説明は多数の実例を示すが、その記載内容は参照により本明細書中に 含まれる。 発明の要約 本発明は、診断的又は治療的道具としてのナノエリスロソームに関する。さら に本発明は、配位子に特異的な受容体、例えば抗原（抗体により認識される）に 対するナノエリスロソームのターゲッティングを可能にするために、配位子、例 えば抗体又はその一部に結 合されたナノエリスロソームに関する。生物学的関連物質をこのようなナノエリ スロソームにさらに結合することにより、あるいはナノエリスロソームと結合し た配位子中に生物学的関連物質を被包することにより、ナノエリスロソームに結 合した配位子により認識される受容体に対する生物学的関連物質のターゲッティ ングがここで可能になる。一実施態様において、本発明は癌抗原ｇｐ５４／ＴＲ ＯＰ−２を認識する抗体と結合したナノエリスロソームを包含するｎＥｒｙｔ組 成物、即ち生物活性薬を被包する抗体結合ナノエリスロソームに関する。特定の 実施態様では、抗体結合抗体は蛍光色素を被包する。特定の好ましい実施態様で は、ｎＥｒｙｔを結合する抗体は、抗癌分子を被包する。 本発明はさらに、このような配位子結合ナノエリスロソームおよび／または生 物学的関連物質を被包する配位子結合ナノエリスロソームの製造方法に関する。 特定の実施態様では、本発明は生物学的関連又は生物活性物質を被包する又は 被包しない抗体結合ｎＥｒｙｔ組成物の製造方法に関する。 本発明はさらに、抗体又はその一部と結合するナノエリスロソームを包含する 複合体であって、抗体又はその一部が、抗体又はその一部により認識される抗原 に対してナノエリスロソームを標的にする複合体に関する。 さらに、本発明は、熱衝撃のサイクルから成る、ナノエリスロソーム中に生物 学的関連物質を被包する方法に関する。一実施態様では、被包又は捕獲方法は、 氷、ドライアイス又はその他の寒剤（例えば、氷−塩化ナトリウム（約−２０℃ ）、アセトン−ドライアイス（−７８℃））上での、好ましくは液体窒素中での 凍結融解のサイクルを包含する。 本発明はさらに、免疫原性ポテンシャルを有意に低減されたナノエリスロソー ム組成物に関する。さらに、本発明はｎＥｒｙｔ−ＰＥＧ組成物に関する。 さらに本発明は、経口投与され得るｎＥｒｙｔ組成物に関する。さらに、本発 明は、経口投与され得るＰＥＧ−ｎＥｒｙｔ組成物に関する。 本発明の好ましい実施態様が特異的抗体に関して、並びに特異的生物学的関連 物質に関して実証される場合でも、本発明の方法は抗体又はその一部を含めた多 数の種類の配位子の結合に適応され得ると、当業者は認識するため、本発明はそ れだけに限定されない。したがって、「配位子」という用語は、受容体に対する 高親和性を有する物質と、広義に解釈されるべきである。多数の種類の配位子が 当業者に十分公知である。同様に、多数の異なる生物学的関連物質が、本発明の ナノエリスロソーム中に被包され、および／または本発明のナノエリスロソーム と結合し得る。 意外にも、ポリエチレングリコール誘導体の抱合は、ｎＥｒｙｔ小胞の生物学 的活性を阻害することなくｎＥｒｙｔの免疫原性ポテンシャルを低減するのに有 用である、ということが判明した。前に述べたように多数の出版物及び特許がタ ンパク質又はリポソームに結合するＰＥＧの論題に関して存在するが、しかし本 出願は先ず、ｎＥｒｙｔ小胞の完全性を有意に危うくせずにナノエリスロソーム がＰＥＧと結合し得る、ということを示す。ｎＥｒｙｔ−ＰＥＧ結合技術は、多 数のパラメーターが関係するため、開発するのが困難であったことを指摘しなけ ればならない。 ｎＥｒｙｔ−ＰＥＧ結合の努力の複雑さにしたがって枠組みの設定に役立てる ために、ＰＥＧの以下の一般式及びその説明を示す。 「Ｚ」は、ＰＥＧとｎＥｒｙｔ膜中に存在するタンパク質との抱合に関与する 基である。その反応基の組成物は、利用可能な反応基、例えばアミノ基、例えば リシン残基とのＰＥＧ抱合の動力学の制御のために非常に重要である。ｉ）活性 化エステル、例えばスクシ ＳＨ基（即ち、システイン残基又はリシンのイミノチオラン誘導体）のために、 タンパク質上に存在する２つの族の求核性試薬をターゲッティングする２種類の 反応基が用いられた。ｎＥｒｙｔ膜は、当業者により、公知の方法で修飾されて 、ＰＥＧ又はその他の物質を抱合する相手として役立ち得る反応基を提供および ／または修飾する。 好ましい実施態様では、Ｚは、ＹＱ＝ＣＨ＝ＣＨ又は−Ｃ（Ｒ”）＝ＣＨ2で ある場合には、ＣＯＯＨ、ＨＯ（アルデヒド）、Ｈ、ＯＨ（ヒドロキシル）、Ｎ Ｈ2、ＳＨから成る群から選択される一成員である。Ｙ＝−Ｃ＝（Ｏ）−である 場合、Ｚ＝Ｈ、Ｎ3、ＯＨ、ＣＨ3、−ＮＨ−ＮＨ2、無水物、混合無水物又は「 活性化エス テル」であって、これは当業者に公知であり、M．Bodansky（「Principles of p eptides synthesis:chapter II，Activation and coupling」Haftner et al.，1 984，Eds．Springer-Verlag，New York．Pp9-52）により例示されている。 ＰＥＧをｎＥｒｙｔに結合するのに有用な活性化基のいくつかの例を以下に示 す： 臭化シアン（ＢｒＣＮ）、脱アミノ酸エステル（Zalipsky et al.，1984，「J ．Macromol．Sci．Chem．」A21:8339;Mutter et al.，1979，「The Peptides」G ross et al.，eds.，2，p.285，Academic Press，New York）、ヒドラジン誘導 体（Rubinstein，1978，米国特許第４，１０１，３８０号；Davis et al.,1979, 米国特許第４，１７９，３３７号及びPersson et al.，1988，「J．Chromatog」457 ：183）、炭酸スクシンイミダジル誘導体（Miron et al.，1993，「Bioconju gate Chem」4:568;Zalipsky et al.，1993，「Bioconjugate Chem．」4:296及び Zalipsky et al.，1991，「Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems」Dunn et al.，編.，ACS，Washington，DC）、オキシカルボニルイミジダゾール誘導 体（Allen et al．，1991，「Biochem．Biophys．Acta」1066:29;及びTondelli et al.，1985，「J．Controlled Release」1:25）、炭酸ニトロフェニル誘導体 （Satore et al.，1991，「Appl．Biochem．Biotech．」27:45）、トレシレート 誘導体（Klibanov et al.，1991，「Biochem．Biophys．Acta」1062:142;Delgad o et al.，1990，「Biotech．Appl．Biochem．」12:119）、マレイミド誘導体（ Kogan，1992，「Synthetic Commun．」22:2417及びRomani et al.，1984，「Che mistry of Peptides and Proteinsl Volter et la.,編．2．p29，Walter de Gru yter，Berlin）。 分子の「ＹＱ」部分は、ＰＥＧのタンパク質との抱合を可能にす る結合腕である。ＹＱとして用いられる基は、好ましくは（ＣＨ2）n（式中、ｎ ＝１〜８個の炭素原子、好ましくは２〜５個の炭素原子）から成る。特定のｎの 使用は、所望の特定のｎＥｒｙｔ−ＰＥＧ組成物及びその使用によって、当業者 には容易に適応され得る。概して、ｎは８より大きく、分子は過脂質可溶性であ る傾向がある。ＹＱ基は、ポリエチレングリコールのＯＨ基をタンパク質に直接 抱合するには非常に少数の方法しかないために、重大な基である。１つの例外は 、予備実験で用いられたシアヌリルクロリド誘導体である。 好ましい実施態様では、ＹＱは：ＣＨ＝ＣＨ、−Ｃ（Ｒ”）＝ＣＨ2（ここで 、Ｒ”は１〜５個の炭素原子を有する低級アルキルである）、塩化シアヌル、ハ ロゲン化シアン（Ｂｒ又はＣｌ）及びその他のＯＨ「活性化剤」、例えばメシル 、トシル基から成る群から選択される一成員である。Ｙが低級アルキル［（ＣＨ2 ）n；ｎ＝１〜７］の群から選択される一成員である場合には；Ｑ＝−Ｃ＝（Ｏ ）、Ｎ、Ｓである。 「Ｘ」原子は、酸素（エーテル）、硫黄（チオエーテル）原子、又は−Ｏ−Ｃ （Ｏ）（エステル）、−Ｎ−Ｃ（Ｏ）（アミド）及び−Ｓ−Ｃ（Ｏ）（チオエス テル）である。チオアルキル、アルコキシ結合及びアミド生物学的に安定である が、しかしながら、エステル及びチオエステル結合は、それらが多少迅速な動力 学を用いて生物学的媒質中で加水分解されるため、非常に不安定である。加水分 解動力学は、ＹＱ部分の長さに関連する。しかしながら、それらは 、徐放装置として用いられるｎＥｒｙｔの設計に非常に有用であると立証される 。ｎＥｒｙｔと生物学的関連分子又は生物活性剤との間の結合が安定であるか不 安定であるかは、当業者により確定される。概して、安定結合が好ましいけれど も、不安定結合に関する実用性の例としては、ｎＥｒｙｔ組成物を特定位置に標 的化した後に、ｎＥｒｙｔの貪食作用がそれをＰＥＧ分子に連結する結合の破壊 により免疫原性にする、そしておそらくはマクロファージにより生物活性剤を被 包するのが望ましい情況が挙げられるが、これに限定されない。 分子の（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）m部分は、ポリエチレングリコールそれ自体であ る。ｍは、１〜５００のいずれかである。したがって、３５０〜１０，０００の 分子量、好ましくは１，０００〜１０，０００、さらに好ましくは２，０００〜 ５，０００の分子量を有するＰＥＧが用いられる。 最後に、［（ＣＨ2）n−Ｗ−Ｒ］基は、ｎＥｒｙｔ周囲の媒質に面する。この 基の性質が本発明の用途にとって決定的であることは明らかである。例えば、（ ＣＨ2）n−Ｗ−Ｒは、ｎＥｒｙｔが簡単な担体（ＤＮＡワクチン）として、又は 粘膜（肺、小腸）を介した吸収のために包含される用途においては、免疫反応を 妨げるために、好ましくは不活性基、例えばＯＣＨ3（ＷＲ）であるべきである 。しかしながら、電場（マイクロチップ）におけるｎＥｒｙｔの特異的置換を要 する診断用途に関しては、（ＣＨ2）n−Ｗ−Ｒは正電荷（即ち、−ＮＨ2）又は 負電荷（即ち、−ＣＯＯＨ）荷電基でなければならない。（ＣＨ2）n−Ｗ−Ｒは さらに、ポリエチレングリコール誘導体が生物学的関連分子、例えば抗体を細胞 又は特定の器官を標的にするために結合し、その一方でｎＥｒｙｔの固有の免疫 原正を阻害するのに必要とされる場合には、ＳＨ、２−チ オピリジル又はマレイミドのような基である。前記の点から見て、［（ＣＨ2）n −Ｗ−Ｒ］基の性質は特定の用途又は使用の特別な必要性を満たすよう適応され る、ということは、当業者には容易に明らかになる。好ましくは、ｎ＝１〜７個 の炭素原子である。 Ｗは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、−Ｃ（＝Ｏ）から成る群から選択される一成員である。 Ｗ＝−Ｏ−である場合、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有する低級アルキル 又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ（ここで、Ｒはポリアミン誘導体、例え ばスペルミン、スペルミジン又はプトレセインである）から成る群から選択され る一成員である。 Ｗ＝−Ｎ−である場合には、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有する低級アル キル又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ（ここで、Ｒはスペル ミン、スペルミジン又はプトレセインから得られるポリアミンである）、１個又 は２個のＣＯＯＨ、ＳＯ3Ｈ又はＰＯ4基を保有する１〜６個の炭素原子の低級ア ルキルから成る群から選択される一成員である。 Ｗ＝−Ｓ−である場合、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有する低級アルキル 又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ（ここで、Ｒはスペルミン 、スペルミジン又はプトレセインから得られるポリアミンである）から成る群か ら選択される一成員である。 Ｗ＝−Ｃ（＝Ｏ）−である場合、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有する低級 アルキル又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ（ここで、Ｒはスペルミン、ス ペルミジン又はプトレセインから得られるポリアミンである）から成る群から選 択される一成員である。 ＷＲは、ＣＯＯＨ、ＰＯ4、ＳＯ3Ｈから成る群から選択される一成員である。 ｎＥｒｙｔ修飾の情況で用いられるＰＥＧの選択が複雑であるということは、 前記から明らかである。さらに、修飾ＰＥＧをｎＥｒｙｔと反応させた場合、最 も重要なその他のパラメーターが考慮されねばならないが、その一例としては、 膜上に存在する利用可能な反応基（即ち、ＮＨ2および／またはＳＨ基）の数に 関連したＰＥＧ置換のパーセンテージが挙げられる。置換が多すぎると、ｎＥｒ ｙｔはそれ自体で崩壊するか、又はｎＥｒｙｔによる生物活性剤の捕獲又は抱合 といったようなさらなる仕事の役に立たなくなる。逆に、置換が少なずぎると、 ｎＥｒｙｔも免疫原性のまま（治療的用途では有害と確定され得る）であるか、 又は標的に対して担体を非特異性にする（診断的相互作用において望ましくない ）望ましくない種々の種類の相互作用に対して保護されない。ＰＥＧにより置換 されるｎＥｒｙｔ膜上の反応基（即ち、ＳＨ又はＮＨ2）のパーセンテージは、 ここで本発明を認識した当業者により容易に適応され得る。好ましくは、ｎＥｒ ｙｔの膜の反応基の２〜３０％が、さらに好ましくは２〜１５％がＰＥＧで置換 される。 ｎＥｒｙｔは、種々の哺乳類供給源（マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ 、ウマ、ブタ、ヒト等）からの血液から調製される。血液は、抗凝固薬（ヘパリ ン、ＥＤＴＡ、クエン酸塩等）上に収集される。本発明の一実施態様によれば、 血液を遠心分離し、血漿及びバッフィーコートを捨てる。圧縮された赤血球をリ ン酸緩衝液（ＰＢＳ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５．０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2 ＰＯ4、ｐＨ７．４）中に再懸濁して、血液の初期容積にする。赤血球を４回洗 浄し、２ｘ１０9細胞／ｍｌの濃度で再懸濁する。 懸濁液中の赤血球は、過去に米国特許第５，６５３，９９９号に記載されてい るように、そのヘモグロビンを枯渇させ得る。しかしながら、本発明は、ゴース ト調製のさらに有効で、定量的で、簡単 で且つ容易に軽量可能な方法を提供する。それにより、懸濁液中の赤血球は、Wo od（1987，「Methods in Enzymol．」149:271-280及び米国特許第５，６５３， ９９９号）の従来のプロトコールに関しては有意の修飾である二および／または 三価陽イオンを用いずに、低張（２〜５ｍＭ）水性緩衝液，ｐＨ８〜１１を用い て、高分解能を有する適切なクロマトグラフィー用ゲルであるセファロースＣＬ ６Ｂ又はセファクリルＳ４００を含有するカラム上でのサイズ排除クロマトグラ フィーにより、そのヘモグロビンを枯渇される。赤血球からのホワイトゴースト の回収は、ほぼ定量的である。 次の製造工程は、米国特許第５，６５３，９９９号と比較して、ナノエリスロ ソームの製造方法の有意の修飾を提供しつつある。ホワイトゴーストの低張懸濁 液のｐＨを７．４に持っていくことは、本発明の方法における低張条件及び陽イ オンの非存在の本質的役割を指示するには重要である。これらの要件に応じるこ とができなければ、ｎＥｒｙｔの製造は全体的に危うくなる。懸濁液を、約０． ４５μｍのフィルターに通して濾過し、その直後に約０．２２μｍのフィルター に通して濾過する。特に、本発明の方法では、押出しを用いない。さらに、１μ ｍフィルターを通す多重押出しは必要でない。実際、フィルターを通してゴース トを押し出すために懸濁液に圧力を掛ける代わりに、それぞれ約０．４５及び０ ．２２μｍの２つのフィルター（即ちテフロン）を通して懸濁液を真空濾過させ る。ｎＥｒｙｔの回収率もほぼ定量的である。最大１０％のｎＥｒｙｔが失われ るので、好ましくは５％未満とする。米国特許第５，６５３，９９９号の方法を 用いた場合、２０％又はそれより多くのｎＥｒｙｔが失われる。操作はすべて、 好ましくは滅菌条件下で実行する。 当業者には一般的に公知のいくつかの手段により、例えばｉ）水 性溶液の又はトレハロース、スクロース勾配での遠心分離（即ち、２０，０００ ｘ２０分）；ｉｉ）分子量２００，０００〜１ｘ１０6の切断片を用いた酢酸セ ルロース管中での透析；ｉｉｉ）アミコン（Amicon）系を用いた濃縮；ｉｖ）ト レハロース、スクロース又はラフィノース溶液を用いた凍結乾燥（ｎＥｒｙｔ［ タンパク質］の糖のｍｇ比は１〜１００：１である）により、希釈懸濁液（１０12 ｎＥｒｙｔ／ｍｌ）を濃縮する。これらの技術は、未修飾ｎＥｒｙｔ、そこに 閉じ込められた生物活性剤を有するｎＥｒｙｔ、そこに共有結合された生物活性 剤を有するｎＥｒｙｔ、並びにそこに閉じ込められた生物活性剤を有し且つそこ に共有結合された生物活性剤を有するｎＥｒｙｔに適用可能である。 本明細書中で用いる場合、「被包された」「閉じ込められた」及び「捕獲」と いう用語は、生物活性剤に関する場合には、「処理」後に生物活性剤が特定的に どこに置かれたかを査定するのが非常に難しいので、広範に定義される。実際、 生物活性剤がｎＥｒｙｔの内側にあるのか膜に深く結合しているのかを査定する のは困難である。それでも、実験（即ち、ＤＮＡを用いて）は、ＤＮＡが分解し ないよう保護されていることを実証するため（下記参照）、生物活性剤はｎＥｒ ｙｔに閉じ込められる／捕獲されると考えられる。 閉じ込め／捕獲手順は簡単である：ｎＥｒｙｔを、閉じ込められる生物活性剤 の考え得る最高濃度を含有する陽イオン無含有溶液（二および／または三価）で ある低張又は等張溶液中に懸濁する。分子の捕獲は、室温で低速で起こる。好ま しくは、ｎＥｒｙｔ−生物活性剤溶液を急速冷凍し、室温に暖めることにより、 より効率よく、迅速に実行される。当業者に十分公知の凍結氷、ドライアイス又 はその他の寒剤上に、ｎＥｒｙｔ−生物活性剤溶液を置く。寒剤の例としては、 氷−塩化ナトリウム（約−２０℃）、アセトン−ドラ イアイス（約−７８℃）等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは 、寒剤は液体窒素である。次に遊離生物活性剤を、その化学的性質により適用さ れる種々の方法（遠心分離−洗浄サイクル、排除クロマトグラフィー、透析等） 、そして当業者に適応可能な種々の方法により、捕獲されたものから分離させる 。捕獲分子を有するｎＥｒｙｔは、濃縮される（凍結乾燥）か、又はその後の工 程、例えばその膜表面へのＰＥＧ、配位子、抗体の抱合に用いられる。懸濁液中 に二価および／または三価の陽イオン、例えばＭｇ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃａ等が存在 しないようにすることは、最も重要なことである。このような陽イオンが存在す るとｎＥｒｙｔの膜が閉ざされ、したがって生物活性剤の捕獲がほとんどの場合 に低減される。ｎＥｒｙｔ膜上の二価および／または三価陽イオンのこの「封止 」特性が、ｎＥｒｙｔにおける生物活性剤捕獲の漏洩をさらに低減するために、 ある条件で有益に用いられるということは、当業者には認識される。捕獲拡散配 列を有するこの種の封止ｎＥｒｙｔも、本発明の範囲内である。 種々の生物学的に重要な分子、例えば抗体を含めた配位子、及びポリエチレン グリコール又は化学的改質剤、例えばイミノチオランは、ここで、ｎＥｒｙｔの 膜表面に抱合される。診断的用途の好ましい実施態様では、モノクローナル抗体 、例えば４８−１２７及びＭ３４４がｎＥｒｙｔに抱合され得る。抗体は、ｎＥ ｒｙｔ膜上のリシン残基に存在する−ＮＨ2基、又はシステイン残基の−ＳＨ基 を用いて、前記のように抱合され得る。抱合は、ヘテロ二官能価結 （式中、ｎ＝２〜１００）のヘテロ二官能価ＰＥＧを用いる多数の技法により起 こり得る。 前記のように、ｎＥｒｙｔの化学的性質は膜中に存在するタンパク質の修飾を 可能にする。例えば、ｉ）イミノチオランはＳＨ基を膜に付加し得る。その反応 は、求電子性基、例えばマレイミドを用いてＰＥＧ又は抗体を抱合させる（例え ば、ＳＭＣＣ及びヘテロ二官能価ＰＥＧ）。ｉｉ）例えば、無水物、例えばコハ ク酸、シスアコニチン酸、シトラコン酸無水物のｎＥｒｙｔへの付加は、表面に 負の電荷をもたらす−ＣＯＯＨ基を付加する。これは、結合ｎＥｒｙｔからの未 結合ｎＥｒｙｔの分離を実施するために電場の使用を必要とする診断的用途に有 用である。ｉｉｉ）例えば、ポリアミン誘導体、例えばスペルミン、プトレシン 、スペルミジン又はポリリシン誘導体のｎＥｒｙｔへの付加は、結合ｎＥｒｙｔ からの未結合ｎＥｒｙｔの分離を実施するために電場の使用を必要とする診断的 用途に有用である表面に負電荷をもたらす−ＮＨ2基を付加する。このような化 学的作用は、Ｒ2基（ここで、Ｒ2＝−ＣＯＯＨ、ＰＯ4 2-、ＳＯ3Ｈ、ＮＨ2）を 有するか、又は多価陰イオン又は多価カチオン分子、例えばスペルミン、ヘパリ ン等で置換されるＰＥＧを抱合することにより可能である（ＰＥＧの一般式参照 ）。 概して、本発明のポリエチレングリコール誘導体は、以下の一般式により示さ れる： Ｚ-（ＹＱ）-Ｘ-（ＣＨ2-ＣＨ2-Ｏ）m-（ＣＨ2）n-Ｗ-Ｒ （式中、ＹＱはＣＨ＝ＣＨ、−Ｃ（Ｒ”）＝ＣＨ2（ここで、Ｒ’＝１〜５個の 炭素原子を有する低級アルキル）、塩化シアヌル、ハロゲン化シアン（Ｂｒ又は Ｃｌ）及びその他のＯＨ「活性化剤」、例えばメシル、トシル基から成る群から 選択される一成員である。 Ｙが低級アルキル［（ＣＨ2）n；ｎ＝１〜７］の群から選択される一成員である 場合には；Ｑ＝−Ｃ＝（Ｏ）、Ｎ、Ｓであり； Ｚは、ＹＱ＝ＣＨ＝ＣＨ又は−Ｃ（Ｒ”）＝ＣＨ2である場合には、ＣＯ ＯＨ、ＨＯ（アルデヒド）、Ｈ、ＯＨ（ヒドロキシル）、ＮＨ2、ＳＨから成る 群から選択される一成員である。Ｙ＝−Ｃ＝（Ｏ）−である場合、Ｚ＝Ｈ、Ｎ3 、ＯＨ、ＣＨ3、−ＮＨ−ＮＨ2、無水物、混合無水物又は「活性化エステル」で あって、これは当業者に公知であり、M．Bodansky（「Principles of peptides synthesis:chapter II，Activation and coupling」Haftner et al.，1984，編 ．Springer-Verlag，New York．Pp9-52）により例示されている）； ＰＥＧをｎＥｒｙｔに結合するのに有用な活性化基のいくつかの例を以下に示 す：臭化シアン（ＢｒＣＮ）、脱アミノ酸エステル（Zalipsky et al.，1984， 「J．Macromol．Sci．Chem．」A21:8339;Mutter et al.，1979，「The Peptides 」Gross et al.，編.，2，p.285，Academic Press，New York）、ヒドラジン誘 導体（Rubinstein，1978，米国特許第４，１０１，３８０号；Davis et al.，19 79,米国特許第４，１７９，３３７号及びPersson et al.，1988，「J．Chromato g．」457:183）、炭酸スクシンイミダジル誘導体（Miron et al.，1993，「Bioc onjugate Chem．」4:568;Zalipsky et al.，1993，「Bioconjugate Chem．」4:2 96及びZalipsky et al.，1991，「Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems 」Dunn et al.，編.，ACS，Washington，DC）、オキシカルボニルイミジダゾー ル誘導体（Allen et al.，1991「Biochem．Biophys．Acta」1066:29;及びTondel li et al.，1985，「J．Controlled Release」1:25）、炭酸ニトロフェニル誘導 体（Satore et al.，1991，「Appl．Biochem．Biotech．」27:45）、トレシレー ト誘導体（Klibanov et al.， 1991，「Biochem．Biophys．Acta」1062:142;Delgado et al.，1990，「Biotech ．Appl．Biochem．」12:119）、マレイミド誘導体（Kogan，1992，「Synthetic Commun．」22:2417及びRomani et al.，1984，「Chemistry of Peptides and Pr oteins」Volter et la.，編．2．p29，Walter de Gruyter，Berlin）； Ｏ（ＣＨ2−ＣＨ2Ｏ）mはポリエチレングリコールであり（この場合、ｍ ＝２〜５００）； ｎ＝１〜７炭素原子； Ｗは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、−Ｃ（＝Ｏ）から成る群から選択される一成員であり ； Ｗ＝−Ｏ−である場合、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有する低級アル キル又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ（ここで、Ｒはポリアミン誘導体、 例えばスペルミン、スペルミジン又はプトレセインである）から成る群から選択 される一成員であり； Ｗ＝−Ｎ−である場合には、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有する低級 アルキル又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ（ここで、Ｒはス ペルミン、スペルミジン又はプトレセインから得られるポリアミンである）、１ 個又は２個のＣＯＯＨ、ＳＯ3Ｈ又はＰＯ4基を保有する１〜６個の炭素原子の低 級アルキルから成る群から選択される一成員であり； Ｗ＝−Ｓ−である場合、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有する低級アル キル又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ（ここで、Ｒはスペル ミン、スペルミジン又はプトレセインから得られるポリアミンである）から成る 群から選択される一成員であり； Ｗ＝−Ｃ（＝Ｏ）−である場合、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有する 低級アルキル又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ （ここで、Ｒはスペルミン、スペルミジン又はプトレセインから得られるポリア ミンである）から成る群から選択される一成員であり； ＷＲは、ＣＯＯＨ、ＰＯ4、ＳＯ3Ｈから成る群から選択される一成員であ る。 前記の一般式中、Ｙａは、多数の反応基、例えばシアヌリルクロリド誘導体、 アルデヒド、スクシンイミド、ベンズイミダゾール、対称ジスルフィド、ヘテロ 二官能価ＰＥＧである。 本開示から、「生物学的関連物質」及び「生物活性剤」とは、薬物、分子、ペ プチド、タンパク質、核酸配列及び蛍光色素又はその他の標識分子、及びＰＥＧ を包含するよう広義に用いられるが、これらに限定されない、と理解される。「 ＰＥＧ」という用語は、ＰＥＧ誘導体を含むよう意図される、と理解される。 本発明のｎＥｒｙｔは、生物活性剤と結合して、このような薬物のための担体 を形成する。特に、小胞は生物活性剤、例えば薬物と結合して、生物活性剤が必 要な身体の位置に有効に供給されるように生物活性剤の投与のための担体を提供 し得る。小胞は、天然物質、生分解性、非免疫原性又は中等度の免疫原性ポテン シャルを有する、非毒性及び非発熱性、血液と完全相溶性、及び自系投与に適応 性である。本明細書中及び添付の請求の範囲において、自系投与という用語は、 哺乳類に投与されるナノエリスロソームが相溶性赤血球又は血液供給から得られ る赤血球から調製されていた（同一哺乳類；即ち同一患者への及びそれからの投 与を含む）ことを意味すると解釈されるべきである。ナノエリスロソームの非自 系投与を意図する場合、ｎＥｒｙｔの免疫原性ポテンシャルを低減するのが好ま しいけれども、免疫抑制又は非免疫抑制哺乳類へのその免疫反応性を低減するた めの処置を伴わないｎＥｒｙｔの投与も、ある情況で は意図される。 結合は、小胞の反応部位と反応する一次基、及び生物活性剤上の反応基と反応 する二次基を有するカップリング剤を用いて成し遂げられる。生物活性剤をナノ エリスロソームに結合する多数の方法が存在し、当業界で十分公知である。これ らの例としては、十分公知の架橋試薬、例えばホモ二官能価又はヘテロ二官能価 型の二官能価試薬が挙げられるが、これらに限定されない。その例を以下に示す ： アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシ スクシンイミド； Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−［２’−ピリジル ジチオ］プロピオンアミド； ｐ−アジドフェニル グリオキサル一水和物； ４−［ｐ−アジドサリチルアミド］ブチルアミン； １−［ｐ−アジドサリチルアミド］−４−［ヨードアセトアミド］ブタン； ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド； ビスマレイミドヘキサン； ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート； ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシ）エチル］スルホン； ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホ ン； Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミドエステル； Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシ−スルホスクシンイミドエステル； Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート； Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート； ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル； ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル； ４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド ・ＨＣｌ； ４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド・ＨＣｌ； Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸； Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸； スルホスクシンイミジル［４−アジドサリチルアミド］ヘキサノエート； ３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジド； ｐ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオネート ； ２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオニルクロリド； Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］１，３’−ジチオプロピオネー ト； スルホスクシンイミジル［４−アジドフェニルジチオ］プロピオネート； スルホスクシンイミジル２−［７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセト アミド］エチル−１，３’−ジチオプロピオネート； スルホスクシンイミジル−２−［ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド］エチ ル−１，３’−ジチオプロピオネート； Ｎ−スクシンイミジル−６−［４’−アジド−２’−ニトロフェ ニルアミノ］ヘキサノエート； スルホスクシンイミジル−６−［４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ ］ヘキサノエート； スルホスクシンイミジル−２−［ｐ−アジドサリチルアミド］エチル−１，３ ’−ジチオプロピオネート； Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−２，３−ジブロモプロピオネート； Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート； スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート； スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボ キシレート； スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１− カルボキシレート； スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート； スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート； ４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−ａ−［２−ピリジルジチオ ］トルエン； スルホスクシンイミジル６−［ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トル アミド］ヘキサノエート； Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート； スクシンイミジル６−［３−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド］ヘキ サノエート； スルホスクシンイミジル６−［３−［２−ピリジルジチオ］プロ ピオンアミド］ヘキサノエート； スルホスクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート； 及び スルホスクシンイミジル４−［ｐ−アジドフェニル］ブチレート。 多数の基を用いて、生物活性剤をナノエリスロソームに結合し得る、と理解さ れるべきである。このような基は、ＮＨ2、ＣＯＯＨ、ＳＨ及びＯＨ基を包含し 、これらはナノエリスロソームの成分中に豊富に見出されるが、これらに限定さ れない。 カップリング剤は、生物活性剤の活性を有害に妨害すべきでなく、宿主に対す る複合毒性となるべきでない、と理解される。 多数の生物活性剤は本発明のナノエリスロソームに抱合されるか又はその中に 閉じ込められ得るため、本明細書及び添付の請求の範囲から、生物活性剤という 用語は、感光性化合物、薬物、抗生物質、抗新生物薬、抗炎症薬、タンパク質又 はその一部、酵素、ヌクレオチド配列、核酸又はその一部、オリゴヌクレオチド 、アンチセンス、遺伝子、ベクター、発現ベクター、放射性同位元素、アミノ酸 類似体又はヌクレオシド類似体、並びにその他の医学的又は獣医学的に有用な薬 剤、例えば対比物質（例えば、染料）及び診断物質、並びに成長因子、ホルモン 、例えばコルチコステロイド等を含めるよう意図されるが、これらに限定されな い、と理解される。さらに、生物活性剤という用語は、少なくとも２つの生物活 性剤の組合せを含めるよう、広義に解釈されるべきである、と理解される。 本明細書及び添付の請求の範囲から、医薬のという用語は、本発明のナノエリ スロソームが哺乳類における多数の種類の治療、予防又は診断に適しているため 、獣医学を含めると理解されるべきである。 本発明のナノエリスロソームは、診断手段としても役立ち得る。特定の種類の 組織または細胞を標的するために、多くの種類の生物活性剤が、本発明のナノエ リスロソーム、例えば抗体に結合される。標的の検出は、例えば、ナノエリスロ ソームに閉じ込められた、放射性又はそうでない標識、あるいは染料の使用を含 めた、公知の方法により査定される。本発明のナノエリスロソームの診断的使用 の多数の例の一つは、転移の存在を検出、定量又は分析するために、腫瘍性抗原 に特異的な抗体を介して、この抗原を標的することである。 生物活性剤の選定、及びそれがナノエリスロソーム中に閉じ込められるか又は それに抱合されるかは、所望の用途、供給の目的、供給経路、標的、及びナノエ リスロソームの使用に関連したその他のパラメーターによる。 供給の目的によって、ナノエリスロソームは多数の経路により投与され得る： ヒト及び動物では、これらの例としては、注射（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉 内、皮下、耳内、乳房内、尿道内等）、局所適用（例えば罹患領域）、及び上皮 又は粘膜皮膚の内層（例えば、眼上皮、口腔粘膜、直腸及び膣上皮内層、気道内 層、鼻咽頭粘膜、小腸粘膜等）を介した吸収によるものが挙げられるが、これら に限定されない。 調製物の投与方式は、化合物が供給される生体中の部位及び細胞を確定し得る 。ナノエリスロソームは単独で投与され得るが、しかし一般的には意図された投 与経路及び標準製薬実施に関して選定される医薬担体との混和物で投与される。 このような製剤は、非傾向的に、例えば腹腔内、動脈内又は静脈内に注入され得 る。製剤はさらに、口腔、皮下、筋肉内、そしてもちろん、臓器内経路を介して 投与される。非経口投与に関しては、それらは、その他の溶質、例 えば溶液を等張にするのに十分な塩又はグルコースを含有する滅菌水性溶液の形 態で、投与される。製剤の特別な特性によるその他の使用も、当業者により意図 され得る。エアロゾルによるナノエリスロソーム処方物の供給も、投与の一方法 として意図される。 疾病状態の治癒的治療におけるヒトを含めた哺乳類への投与に関しては、処方 する医療専門家が、投与対象のための適切な用量を確定し、これは、薬物、体重 及び動物の反応、並びに疾患の性質及び重症度によって変わると予測される。同 一成分を、ナノエリスロソームの診断的使用に適用し得る。ナノエリスロソーム 処方物中の生物活性剤の用量は、本発明にしたがって、遊離生物活性剤に関して 用いられるより低くされる。しかしながら、いくつかの場合には、等用量又はよ り高い用量を投与する必要がある。周期的治療又は異なる周期の治療が有益であ ることも意図される。 ナノエリスロソームの供給経路は、身体中のその分布に影響を及ぼす。ナノエ リスロソームの受動的供給には、種々の経路の投与、例えば静脈内、皮下及び局 所投与が含まれる。各経路は、ナノエリスロソームの局在化に差を生じる。ナノ エリスロソーム及び生物活性剤の選定標的領域に対するターゲッティングも意図 される。 本発明の核酸配列は、天然糖−リン酸塩主鎖、並びに修飾主鎖、例えばホスホ ロチオエート、ジチオネート、アルキルホスホネート及びヌクレオチド等を用い 得る。修飾糖−リン酸塩主鎖は一般に、Miller，1988，「Ann．Reports Med．Ch em．」23：295及びMoranet al.，1987，「Nucleic acid molecule．Acids Res． 」14：5019により教示される。ある実施態様では、核酸配列は、特に放射線治療 を可能にするために、放射能標識され得る。 本明細書中で用いる場合、「遺伝子」という用語は当業者には十分公知であり 、単一タンパク質又はポリペプチドを限定する核酸配 列に関する。「構造遺伝子」とは、ＲＮＡに転写され、特定のアミノ酸配列を有 するタンパク質に翻訳されて、それにより特定のポリペプチド又はタンパク質を 生じるＤＮＡ配列を限定する。本発明の核酸配列が当業界で十分公知の多数の確 立されたキットフォーマットのいずれかに取り込まれ得ることは、当業者には容 易に認識される。 「ベクター」とは、当業界で一般に公知であって、プラスミドＤＮＡ、ファー ジＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ等を限定し、本発明のＤＮＡがその中でクローニング され得るＤＮＡビヒクルとして役立つ。多数の種類のベクターが存在し、当業界 で十分公知である。 「発現」という用語は、構造遺伝子がｍＲＮＡに転写され（転写）、次にｍＲ ＮＡが１つ又はそれ以上のポリペプチド（又はタンパク質）に翻訳される（翻訳 ）工程を示す。 「発現ベクター」という用語は、前記のベクター又はビヒクルを限定するが、 しかし宿主細胞中への形質転換後の挿入配列の発現を可能にすることを示す。ク ローン化遺伝子（挿入配列）は、通常は制御素子配列、例えばプロモーター配列 の制御下に置かれる。このような制御配列下のクローン化遺伝子の配置は、しば しば、制御素子又は配列と操作可能に結合されると言及される。 発現制御配列は、ベクターが原核生物又は真核生物宿主又はその両方（シャト ルベクター）において操作可能な結合遺伝子を発現するよう意図され、転写素子 、例えばエンハンサー素子、終止配列、組織特異性素子および／または翻訳開始 及び終結部位を付加的に含有し得る。 別の実施態様では、本発明は、本発明にしたがってナノエリスロソーム組成物 を含有する少なくとも１つの容器手段を包含する本発明のナノエリスロソームを 含有するキットに関する。好ましい実施 態様では、キットは１つ又はそれ以上の以下の試薬、即ち洗浄試薬、検出試薬等 を含入するその他の容器を包含する。 本明細書中で用いる場合、「抗体」という用語は、モノクローナル及びポリク ローナル抗体、並びにその断片、一本鎖抗体、イディオタイプの特定の分子及び 抗体断片を含有する抗体断片を含む。したがって、抗体という用語は、本明細書 中で用いる場合、Ｆ（ＡＢ’）2断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）断片及び Ｆｖ断片も含む。概して、抗体を調製及び修飾するための技術は、当業界で十分 公知である（Harlow et al.，1988，「Antibody-A Laboratory Manual，CSH Lab oratories」Campbell，1984，「Monoclonal Antibody Technology:Laboratory T echniques in Biochemistry and Molecular Biology」，Elsevier Science Publ isher，Amsterdam，The Netherlands）。 ナノエリスロソーム組成物が広範な治療的用途を有することは、本発明から明 らかである。このような用途の一例としては、核酸セグメントが患者に移され得 る遺伝子療法が挙げられるが、これに限定されない。一実施態様では、本発明の ナノエリスロソーム組成物は器官、組織または細胞に向けられる特定の配位子に よりこの器官、組織または細胞の特異的ターゲッティングを可能にする。 本発明のナノエリスロソーム組成物が遺伝し生成物のアゴニスト及びアンタゴ ニストを供給し得る、ということは明らかである。 本発明のナノエリスロソーム組成物を用いたアンチセンス分子の供給も意図さ れる。アンチセンスの特異的設計及びその安定性を増大するためのその修飾は、 当業界で十分公知である。 適切な医薬担体、賦形剤及び治療的又は診断的組成物は、概して、「Remingto n's Pharmaceutical Sciences」1980，第16版，a standatd reference in this particular fieldに記載されている。 広範囲の細胞毒性剤及び薬物が本発明にしたがって用いられる、ということは 、当業者には明らかである。細胞毒性剤の例としては、毒素、例えばジフテリア 毒素が挙げられるが、これに限定されない。さらに、前記のように、放射性核種 も本発明のナノエリスロソーム組成物に結合されて、細胞の局所的照射による細 胞毒性作用を発揮して、放射線治療をなし得る。放射線治療に用い得る放射性核 種は当業界で十分公知であって、特別な臨床的又は診断的情況に容易に適応され る。 図面の簡単な説明 好ましい実施態様を説明するために示した添付の図面を参照しながら、一般的 に説明してきた本発明をさらに説明する。 図１は、診断的および／または治療的用途に用いられるナノエリスロソームを 製造するために用いられる方法の要約を示す。 図２は、産生された異なるＰＥＧ分子を示す。 図３は、ｎＥｒｙｔ組成物の免疫原性ポテンシャルの有意の低減を実証する直 接凝集試験を示す。 図４は、Ｔ２４（ＡＢ）及びＥＦＦＲＯＮ細胞（ＣＤ）の位相差顕微鏡Ａ及び Ｂ及び蛍光顕微鏡写真Ｂ−Ｄを示す。 本発明のその他の対象、利点及び特徴は、添付の図面を参照しながら以下の好 ましい実施態様の説明を読めば、明らかになるが、実施態様はそれらに限定され ず、単に例示のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。 好ましい実施態様の説明 図１は、診断的または治療的用途に用いられるナノエリスロソームを製造する ために用いられる方法の要約を示す。 ナノエリスロソームの製造技法は、非経口的又は経腸的経路によるその投与を さらに調べることによる手法をとった。非経口経路に関しては、ナノエリスロソ ームをうまく用いて、それらが膀胱の癌細胞を同定し得ることを示した。端的に 言えば、遠心分離によりナノエリスロソームを濃縮し、デキストラン−フルオレ セインイソチオシアネートの濃縮溶液（デキストラン−ＦＩＴＣ：分子量４００ ０〜２ｘ１０6）中で混合した。液体窒素中で凍結融解を１ラウンド終えた後、 デキストラン−ＦＩＴＣを被包したナノエリスロソームを、セファデックス又は セファロースを用いるゲルのサイズ排除による濾過（即ち、Ｇ−２５又はＰＤ１ ０）により、あるいは洗浄−遠心分離を４サイクルおこなって、精製した。ＳＰ ＤＰとの一次反応により、ナノエリスロソーム膜を修飾した。多数の膀胱癌に認 められる抗原である癌抗原ＴＲＯＰ−２を認識する選定抗体、この場合はモノク ローナル抗体４８−１２７を先ずＳＰＤＰで修飾し、その後還元剤、例えばＤＴ Ｔ（ジチオトレイトール）で処理して、遊離ＳＨ基を遊離させる。最後に、前記 からの修飾ナノエリスロソーム、及びこれも修飾済みのモノクローナル抗体４８ −１２７を、ナノエリスロソーム−デキストラン−ＦＩＴＣ−４８１２７と呼ば れる組成物の生成を促すために、生理学的緩衝液中で一緒に混合した。この複合 体を用いた生物学的検定は、４８−１２７により認識されるＴＲＯＰ−２抗原を 保有する細胞が複合体により非常に選択的に装飾されたが、一方非ＴＲＯＰ−２ 保有細胞はそうではなかった。 デキストランを光線療法薬、例えばフタロシアニンオクタカルボン酸に置換し た同様の種類の実験により、第一段階で、フタロシアニンは、本明細書中に記載 した熱衝撃療法を用いて、ナノエリスロソームにより容易に捕獲されたことが示 された。第二段階では、４ ８−１２７抗体のナノエリスロソーム−フタロシアニンとの結合が実行された。 この結合後、細胞の標識化の評価、並びにin situでの膀胱の癌治療の点から見 たフタロシアニンの光線療法特性を利用するための関連試験を実行する。この２ 種類の複合体（ナノエリスロソーム−フタロシアニン−４８−１２７）は癌細胞 に及ぼす有意の抑制効果を示すと予測される。 第三組の実験では、ナノエリスロソーム−シュードモナス毒素−４８１２７複 合体が高特異性を有する細胞毒性供給系として有意に用いられるということを示 すために、免疫毒素、例えばシュードモナス属毒素がナノエリスロソーム中に被 包されている。これら後者の２種類の複合体は、種々の膀胱癌の嚢内治療に有用 であることが示される。このような複合体は、薬物と標的化膀胱細胞とが非常に 短期間接触される（これは、腎臓が生成した尿の膀胱中での急速な蓄積により引 き起こされる）一般的に用いられる治療技法によりもたらされる主な問題を克服 し得る。 併せて考えると、本発明は、ナノエリスロソームが、本発明の方法を用いて、 分子量約１０００（フタロシアニンオクタカルボン酸）〜２ｘ１０6（デキスト ラン）の分子をを被包し得るということを示す。したがって、ナノエリスロソー ムは非常に多面的なドラッグデリバリーシステムである。さらに、デキストラン 及びフタロシアニン分子は、６ヶ月以上もの間、ナノエリスロソームに安定に被 包されることが示されている。 治療的経腸用途に関しては、ナノエリスロソームは、生物学的関連物質、例え ば薬物、酵素、タンパク質（即ち、インスリン）、免疫調節化合物、ペプチド又 は胃腸系に感受性のその他の物質の経口的投与を結果的に可能にし得る。このよ うな修飾デリバリーシステムを得るために用いられる戦略は、前記の熱衝撃治療 法下でナノエ リスロソーム内部に生物学的関連物質を被包することにある。第二工程では、ポ リエチレングリコールの誘導体（ＰＥＧ−シアヌリルクロリド等）をナノエリス ロソームに抱合する。このようなポリエチレングリコール誘導体は、タンパク質 及び酵素の抗原性を阻害し、生物学的半減期を増大することが知られている。し たがって、このような系は、非自系及び非相同性ナノエリスロソームの使用を可 能にする。 本発明は、多数のその他のＰＥＧ誘導体を用い得るために、ＰＥＧ−シアヌリ ルクロリドに限定されない、ということに留意すべきである。このような誘導体 は当業者には十分公知である。このようなＰＥＧ誘導体の例としては、活性化エ ステルを有するＰＥＧ誘導体が挙げられるが、これに限定されない。当然の帰結 として、当業者は、本発明の教示をその他の種類のＰＥＧ誘導体に適応し得る。 好ましい実施態様では、ナノエリスロソームはＰＥＧ−５０００−シアヌリル クロリドに抱合される。分子量約３５０〜１０，０００のＰＥＧ誘導体が本発明 にしたがって用いられるが、しかし約１，０００〜７，０００、さらに好ましく は約２，０００〜１０，０００の分子量を有するＰＥＧ誘導体を用いるのが好ま しい、と理解されるべきである。ＰＥＧ修飾ナノエリスロソームの安定性は、一 般に、デキストラン−ＦＩＴＣ被包ナノエリスロソームを用いて試験される。イ ンスリン−Ｉ１２５の被包及び安定性を立証し、種々の異なる種類の投与（静注 、腹腔内及び経口）後の動物におけるこのようなナノエリスロソームの生物薬剤 学的パラメーターを評価するために、実験が進行中である。さらに、経口投与し た場合の薬理学的反応を誘導するインスリン又はホルモン、例えばＬＨＲＨを含 有するナノエリスロソーム−ＰＥＧの能力が試験される。 これらの実験はすべて、ナノエリスロソームの多面性及び有用性 を実証する、と予測される。消化性物質、したがって胃液な導入感受性の物質は 、ナノエリスロソームにより保護された場合、その生物学的活性を保持するとい うことの実証は、概して、感受性物質の経口投与に大きな影響を及ぼし得る。 以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はそれらに限定 されない。 実施例１ 血漿及びバッフィーコート（白血球）の除去 哺乳類ドナー（ウマ、ウシ、ブタ、ヒト等）からの血液（２ｘ３０ｍｌ）を５ ００×ｇ（１５００ｒｐｍ）で４℃で１０分間、遠心分離した。血漿及びバッフ ィーコートを吸引により除去した。液体を除去して、４℃で等容量のリン酸緩衝 食塩水（ＰＢＳ）（５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ７．４）と置き換えた。試験管を何度か逆さにして、混合物を静かに均質にした 。次に、血液を５００×ｇで４℃で１０分間、再遠心分離した。ここに記載した 一連の手順を３回繰り返した。 以下のプロトコールは各々、滅菌条件下で実行した。 実施例２ 赤血球ゴースト低張衝撃物の調製 方法２．１ 実施例１に記載したように処理した血液５ｍｌを３５ｍｌ（５０ｍｌ Nalgen eTM試験管中）の低張緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム）、ｐＨ７．４に付加し た。赤血球懸濁液を、２５，０００×ｇで４℃で２０分間、遠心分離した。 上清を吸引し、捨てた。除去した低張緩衝液の容量を同一容量の新鮮な緩衝液 に置き換えて、懸濁液を再び遠心分離した。上清がわ ずかに着色するまで、この手順を３回繰り返した。ペレットを５ｍｌのＰＢＳ緩 衝液、ｐＨ７．４中、４℃に懸濁した。ホワイトゴースト懸濁液をプールし、２ ０分間の遠心分離（２０，０００×ｇ）により濃縮して、必要になるまで４℃で 保持した。 方法２．２ 実施例１で処理したような７０ｍｌの血液を、低張リン酸又は炭酸緩衝液（２ ．５ｍＭ）（２ｍＭ Ｎａ3ＰＯ4；氷酢酸を用いてｐＨ調整）、ｐＨ１０〜１１ を用いて、セファロースＣＬ６Ｂ（ＣＬ４Ｂも）又はセファクリルＳ４００カラ ム（例えば、１０ｃｍ×３０ｃｍ）でクロマトグラフィー処理した。ホワイトゴ ーストを先ず収集し（死容量）、次にヘモグロビンをカラム上に保持した。酢酸 を用いてｐＨを７．４とし、前記のような遠心分離によりゴーストを濃縮した。 クロマトグラフィー処理により、ヘモグロビンを含有しないホワイトゴースト７ ０ｍｇを得た（１ｍｇ／ｍｌの「洗浄血液」）。 実施例３ ナノエリスロソーム（ｎＥｒｙｔ）の調製 方法３．１ 米国特許第５，６５３，９９９号に記載されているようにして、ナノエリスロ ソームを調製した。約１μｍの孔を有するポリカルボネートフィルターを通して ゴーストが押し出される、ということを指摘することは重要である。ポリカルボ ネートフィルターは、ナノエリスロソームに粘着しないという利点を有する。ゴ ーストを等張懸濁液から、窒素圧下で押し出した。懸濁液は、好ましくは４回押 し出される。 方法３．２ この手法は、前記の３．１とは有意に異なる。それは、より速く 、且つナノエリスロソームのより良好な収率を生じるという利点を提供する。さ らに、それは大規模生産により容易に利用可能である。 低張ＰＢ（ｐＨ７．４）中のホワイトゴーストの低張懸濁液（０．２ｍｇ／ｍ ｌ）を、直ちに約０．４５μｍの孔を有するポリカルボネート（ナイロン又はポ リエーテルスルホン）フィルターに、その直後に約０．２２μｍの孔を有するポ リカルボネート（ナイロン又はポリエーテルスルホン）フィルターに通して、真 空濾過した。操作は、低張緩衝液（二価および／または三価陽イオン無含有）中 で実行されねばならない。この基本的要件に応じなければ、フィルターはすぐに 塞がり、使用不可能となる。この方法を用いる場合、フィルターを１回通すだけ でよく、この工程で失われるナノエリスロソームは５〜１０％に過ぎない。方法 ３．１により得られたナノエリスロソームは、１００〜２００ｎｍの平均直径を 有した。方法３．２により調製したｎＥｒｙｔ懸濁液を用いた光散乱実験で、ｎ Ｅｒｙｔは３つの集団に分けられた：ａ）４０〜５０ｎｍ；ｂ）１００ｎｍ、及 びｃ）２００ｎｍのさらに小さい亜集団。しかしながら、方法３．２により調製 されたｎＥｒｙｔ懸濁液の平均直径は、依然として約１００〜２００ｎｍであっ た。 実施例４ ナノエリスロソーム懸濁液の濃縮 ｎＥｒｙｔ懸濁液（０．２ｍｇタンパク質／ｍｌで３５０ｍｌ）を、アミコン 濃縮機（モデル８４００、５０００００より小さい分子切断片（例えばＺＭ５０ ０及びＹＭ１００）を有する膜）を用いて１０ｐｓｉの窒素圧下で、静かに攪拌 しながら、容積を５０ｍｌとした。 実施例５ ｎＥｒｙｔによる分子の閉じ込め（捕獲） 一般プロトコールを用いて、生物活性剤、例えばタンパク質（即ち、インスリ ン）、光力学的作用剤（即ち、ポルフィリン様分子）、フルオロフォア（即ち、 デキストリン（分子量４，０００〜２，０００，０００）−フルオレセインイソ チオシアネート（ＦＩＴＣ））、ヌクレオチド（即ち、ＤＮＡ）、糖タンパク質 、多糖類（即ち、イヌリン）、ビタミン、薬物（即ち、ブレオマイシン）等を捕 獲（閉じ込め）し得る。 エッペンドルフ試験管中で、ｎＥｒｙｔの懸濁液（１．５ｍｌ、１〜２ｍｇ／ ｍｌ）を１６，０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離した(microfugeTM)。上清 を取り出し、捨てた。ペレットのタンパク質含量を、十分公知の方法（即ち、市 販キット）で確定した。捕獲（閉じ込め）される物質の濃縮溶液１ｍｌをペレッ トに付加した。試験管を７回逆さにして懸濁液を静かに均質にして、４℃の室温 で１０分間保持した。その後、懸濁液を液体窒素中で２分間凍結させて、２５℃ の水浴中で融解した。ポルフィリン様分子、ＤＮＡのような分子のいくつかの捕 獲が、室温で３０分間インキュベーション後に観察されたことを指摘するのは重 要である。しかし、熱衝撃処理は、生物活性剤の捕獲を有意に改良した。熱衝撃 の必要性は、−７０℃又は−２０℃での凍結も用い得るので、−１８０℃工程に よるものではない、ということに留意すべきである。ある種の生物活性剤に関し ては、氷（０℃）でも十分であったが、とはいえ、特に−１８０℃での凍結と同 様に有効であるというわけではない。 実施例６ 捕獲（閉じ込め）分子を有するｎＥｒｙｔの精製 方法６．１ 捕獲処理後、１ｍｌの冷（４℃）ＰＢＳ（等張、ｐＨ７．４）で ３〜５回希釈し、１６，０００×ｇで８分間遠心分離して、上清を取り除き、Ｐ ＢＳで再び希釈して、ｎＥｒｙｔを未閉込め分子から遊離した。 方法６．２ 捕獲処理後、十分公知の方法により適切なセファデックス又はセファクリルカ ラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーにより、遊離分子を遅延させ、ｎＥ ｒｙｔの溶離を迅速にして、未閉じ込め分子からｎＥｒｙｔを遊離させた。捕獲 （閉じ込め）物質を、適切な洗剤を用いてｎＥｒｙｔを可溶化後に、通常の方法 （閉じ込められている分子に適応）により評価した。 安定性 捕獲により、デキストラン−ＦＩＴＣ−ｎＥｒｙｔの懸濁液が、４℃で保持さ れると少なくとも７ヶ月間安定であるという事実によって立証されたように、安 定なナノエリスロソーム−生物活性剤組成物が形成された。さらに、ＤＮＡの閉 じ込めを実行した。手短に言えば、ＰＢＳ（５００μｌ）中に懸濁した２００ｎ ｇのｎＥｒｙｔを、ＴＫＮ緩衝液（リン酸塩を排除するために）で３回洗浄した 。ＴＫＮ緩衝液（１０〜３００μｌ）中のＤＮＡ（３０〜３２０ｎｇ）を懸濁液 に付加し、静かにホモジナイズした。懸濁液を４℃で１０分間インキュベートし 、液体窒素中で２分間凍結し、その後２５℃で４分間インキュベートした。ＴＫ ＮＭ緩衝液を用いて、前記のように懸濁液を処理した。 ＤＮアーゼ（０．１Ｕ／μｌのＤＮアーゼＩ溶液１００μｌ）を含有する反応 混合物をインキュベートして、余分のＤＮＡを迅速に除去した。Ｍｇ2+（１０ｍ Ｍ）又はＭｎ2+ｆ（１ｍＭ）を混合物に付加した。 ＤＮアーゼで清浄にした後、ＰＣＲの慣用的プロトコールを用い てｎＥｒｙｔ−ＤＮＡを増幅し、ｎＥｒｙｔ内のベクターの存在を確証した。 表１ 本明細書中に記載した技術を用いて、これらの例は、ｎＥｒｙｔによる捕獲の 典型的結果を説明するが、これは同様の濃度の小型及び大型分子を反映する。 初期濃度 ｎＥｒｙｔ 捕獲分子 デキストラン−４０００FITC （mg／ml） （μｇ／ｍｇナノ） （mg／ml） 2.6 1.3 15.6 2.6 2.6 13.4 2.6 3.9 12.1 ＤＮＡ（μｇ／ml）* 1.3 4 0.003 13 4 0.066 65 4 0.153 *線状（３ｋｂ）又は超螺旋ＤＮＡに関して、同様の結果が得られた。 したがって、表１は、ｎＥｒｙｔによる捕獲の典型的結果を説明するこれらの 例を示す。これは同様の濃度の小型及び大型分子を反映している。 実施例７ ｎＥｒｙｔの凍結乾燥のための標本の調製 典型的調製は、ｐＨ７．４の低張ＰＢ又は等張ＰＢＳ中のｎＥｒｙｔ（又は、 捕獲生物活性剤を有するｎＥｒｙｔ、あるいは捕獲生物活性剤又はその表面のｎ Ｅｒｙｔ抗体を有するＰＥＧ結合ｎＥｒｙｔ）の懸濁液１ｍｌ（１ｍｇのタンパ ク質）を付加することから 成る。５００μｌの以下の溶液凍結乾燥溶液（Ｌｙｏ溶液）［（スクロース（２ ６３．％ ｐ／ｖ（７７０ｍＭ））、ポリビニルピロリドン（分子量＝１０，０ ００、１８．１％ ｐ／ｖ；（１８ｍＭ））、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢 酸 三ナトリウム塩）；１ｍＭ＝Ｌｙｏ溶液）をＰＢＳ又はＰＢにｐＨ７．４で 溶解］を付加した。ｎＥｒｙｔが等張溶液中にある場合には、Ｌｙｏ溶液は低張 で、逆の場合はｎＥｒｙｔは低張溶液中にある。ｎＥｒｙｔ標本は、−２０℃で の凍結（１２時間）−２５℃での融解（１６時間）、最後に４０℃で１８時間加 熱のサイクルを７回繰り返しても安定であった。 凍結乾燥 １０ｍｌバイアル中の前記で調製したようなｎＥｒｙｔの懸濁液１．５ｍｌか ら成る典型的調製物を、液体窒素中で２分間凍結させた。次に懸濁液を、凍結乾 燥機FreezemobileTM 12EL Virtis（Virtis Company）を用いて、６〜１２時間 凍結させた。水中又はＰＢＳ中の緩衝スクロース溶液（スクロース２５．５％ ｐ／ｖ（７４５ｍＭ））を凍結乾燥ｎＥｒｙｔに付加すると、３７℃で１時間、 懸濁液をインキュベート後、閉じ込め分子のその機能を保持するｎＥｒｙｔが生 じた。すでに閉じ込め分子、例えばデキストラン−ＦＩＴＣを有するｎＥｒｙｔ は依然として機能性で、非常に小さな癒合が顕微鏡で観察された。 実施例８ ポリエチレングリコール及びモノクローナル抗体とナノエリスロソームとの抱 合 以下の構造を有するＰＥＧを、公知の方法により実験室で調製した： メトキシＰＥＧ−Ｓ−スクシンイミジルコハク酸エステル（分子 量＝２０００）（ＭＰＥＧ−Ｓｓｕｃ−ｓｕｃ−２０００）のｎＥｒｙｔとの抱 合。 最終容量７５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のｎＥｒｙｔ １．５ｍｇの懸 濁液にＭＰＥＧ−Ｓｓｕｃ−ｓｕｃ−２０００を付加して、１．８３ｎＭ（２． ７ｍｇ）の最終濃度を得た。懸濁液を室温で１時間保持し、懸濁液を一定速度で 転倒させることにより静かにホモジナイズした。混合物を、セファロースＣＬ６ Ｂカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。抱合の収率を評 価した結果、ＭＰＥＧ−Ｓｓｕｃ−ｓｕｃ−２０００のｎＥｒｙｔとの抱合は１ １％と示された（LJ．Karr，DL．Donnelly，A．Kozlowski and J．Milton-Harri s，1994，「Methods in Enzymology」228:377）。 メトキシＰＥＧ−Ｓ−スクシンイミジルコハク酸エステル（分子量＝２０００ ）（ＭＰＥＧ−Ｓｓｕｃ−ｓｕｃ−５０００）のｎＥｒｙｔとの抱合。 最終容量５００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のｎＥｒｙｔ ０．５ｍｇの懸 濁液に、ＭＰＥＧ−Ｓｓｕｃ−ｓｕｃ−５０００を付加して、５．７９ｎＭ（１ ４．４７ｍｇ）の最終濃度を得た。懸濁液を室温で１時間保持し、懸濁液を一定 速度で転倒させることにより静かにホモジナイズした。混合物を、セファロース ＣＬ６Ｂカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。抱合の収 率を評価した結果、ＭＰＥＧ−Ｓｓｕｃ−ｓｕｃ−５０００のｎＥｒｙｔとの抱 合は１４％と示された（LJ．Karr，DL．Donnelly，A．Kozlowski and J．Milton -Harris，1994，「Methods in Enzymology」228:377）。 メトキシＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＯＯＳスクシンイミジルプロピオン酸エステル （分子量＝５０００）（ＭＰＥＧ−Ｏ−ＳＰＡｓｕｃ −５０００）のｎＥｒｙｔとの抱合。 最終容量５００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のヒトｎＥｒｙｔ ０．５ｍｇ の懸濁液に、ＭＰＥＧ−Ｏ−ＳＰＡ−５０００を付加して、０．０３Ｍの最終濃 度を得た。懸濁液を室温で１時間保持し、懸濁液を一定速度で転倒させることに より静かにホモジナイズした。混合物を、セファロースＣＬ６Ｂカラム上でのサ イズ排除クロマトグラフィーにより精製した。フルオレスカミンを用いて抱合の 収率を評価した結果、ｎＥｒｙｔとの抱合は３０％と示された（LJ．Karr，DL． Donnelly，A．Kozlowski and J．Milton-Harris，1994，「Methods in Enzymolo gy」228:377）。 実施例９ ＰＥＧ結合ｎＥｒｙｔの免疫原性 実施例８のＭＰＥＧ−Ｓｓｕｃ−ｓｕｃ−５０００と結合したｎＥｒｙｔ調製 物の免疫原性をモニタリングするために、等量の親ウマ赤血球（ＨＲＢＣ）、非 ＰＥＧ抱合ｎＥｒｙｔ（ｎＥｒｙｔ）及びＰＥＧ抱合ｎＥｒｙｔ（ｎＥｒｙｔ− ＰＥＧ）により誘導された抗体反応を分析した。 各々３匹のマウスを含有する４群を、２５０ｍｇまで（ブタの）の又は２００ ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の用量に対して２ｘ１０ｕ．ｃＨＲＢＣ、ｎ Ｅｒｙｔ（ＰＥＧと抱合したもの又はしていないもの）で、腹腔内注入で免疫化 した。３回目の免疫処置から１週間後、各マウスから血清を採取して、直接及び 間接凝集試験で親ＨＲＢＣに対する抗体の存在に関して試験した。 各血清標本をＰＢＳ中で滴定し、各々の希釈液２５ｍｌを、９６ウエルプレー ト（丸底）の個々のウエル中のＨＲＢＣの１０％溶液２５ｍｌに付加した。これ らを室温で１５〜２５分間インキュベートし、倒立顕微鏡を用いて凝集を採点し た。 図３に示したように、親ＨＲＢＣで免疫化したマウスは約１：３００血清希釈 で５０％の最大凝集を示した。ｎＥｒｙｔで免疫化したマウスは、１：１００の 血清希釈で５０％最大凝集を示し、ｎＥｒｙｔ−ＰＥＧで免疫化したマウスは、 １：１０の血清希釈で５０％最大凝集を示した。したがって、ｎＥｒｙｔ−ＰＥ Ｇによる最大凝集は、非免疫対照マウス（血中抗原群に対する天然抗体の存在を 反映）の場合と区別できないという結果が示された。 間接凝集試験は、ＩｇＭ抗体の存在を有効に測定した。ＩｇＭ抗体を測定する ために、抗マウスイムノグロブリンを、前記の直接試験で用いたＨＲＢＣに、Ｐ ＢＳ ２００ｍｌ中でＨＲＢＣを３回洗浄し、各洗浄の間に上清を吸引した後、 付加した。抗マウスイムノグロブリンは、１：１００の濃度で用いた。室温で１ ５分間インキュベート後、倒立顕微鏡を用いて、凝集を再び採点した。この分析 からの結果は、ｎＥｒｙｔの１：１００希釈液中及びｎＥｒｙｔ−ＰＥＧの１： １０希釈液及び対照血清中で、凝集がここでも検出されたというものであった。 したがって、ｎＥｒｙｔ−ＰＥＧは、ｎＥｒｙｔ−ＰＥＧによる凝集の負荷が対 照血清に匹敵するため、非免疫原性であった。 実施例１０ ヘテロ二官能性ＰＥＧを用いたモノクローナル抗体のｎＥｒｙｔとの抱合 イミノチオランのｎＥｒｙｔとの抱合 先ず、イミノチオラン（ＩＴ）の新鮮な溶液を、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（５ｍＭ Ｋ2ＰＯ4、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中に調製し た（４．７Ｍ）。溶液を氷上に保持した。４ｍｇのｎＥｒｙｔを冷ＰＢＳ−ＥＤ ＴＡ緩衝液中に懸濁し、ＩＴ溶液を付加して、６２７ｍＭ（ＩＴ）の最終溶液中 のｎＥｒｙ ｔ １ｍｇ当たりＩＴ １００μｍｏｌという比が得られた。混合物を９０分間 静かに攪拌しながら暗室中で４℃に保持した。インキュベーション後、混合物を セファデックスＧ−２５（ＰＤ−１０）上で精製した。端的に述べると、使用前 に、クロマトグラフィーカラムを２０ｍｌの冷ＰＢＳ−ＥＤＴＡで平衡させた。 混合物をカラム上に適用し、冷ＰＢＳ−ＥＤＴＡで溶離した。先ず２．５ｍｌを 捨て（死容量）、ｎＥｒｙｔをその下の２．５ｍｌ分画中に収集した。次の反応 前に、標本を氷上に保持した。ｎＥｒｙｔ−ＩＴは不安定であり、その場で調製 される必要がある。 実施例１１ ヘテロ二官能性ＰＥＧのモノクローナル抗体４８−１２７への抱合 先ず、ＰＥＧ２０００ＮＨＳ−ＭＡＬ： の新鮮な溶液を調製した。つぎに、４．７ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中の ４８−１２７（０．８ｍｇ／ｍｌ）の溶液を調製した。２００ｎｍｏｌのＰＥＧ ２０００ＮＨＳ−ＭＡＬを０．４ｍｇの４８−１２７に付加した（ＰＥＧの最終 濃度は０．４ｍＭ）。モノクローナル抗体４８−１２７は、Ｔ１６とは異なるエ ピトープでのｇｐ５４癌マーカーを認識する。溶液を、攪拌しながら３０℃で３ ０分インキュベートした。混合物を、０．５％のウシ血清アルブミンを含有する ＰＢＳ ５ｍｌを用いて予め平衡させたＰＤ−１０カラム上で分離させ、冷ＰＢ Ｓ−ＥＤＴＡ緩衝液 ２０ｍｌで洗浄した。混合物をカラムに適用し、冷ＰＢＳ −ＥＤＴＡで溶離した。最初の２．５ｍｌを捨て（死容量）、その下の２．５ｍ ｌ分画中にｎＥｒｙｔを収集した。次の反応まで、標本を氷上に保持した。 実施例１２ 修飾４８−１２７のｎＥｒｙｔ−ＩＴ誘導体との抱合 冷ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液（６００μｌ）中のｎＥｒｙｔ−ＩＴ（９６０μｇ ）の懸濁液に、ＰＥＧで修飾した４８−１２７の１６０ｐｇ（１ｍｌのＰＢＳ− ＥＤＴＡ中）を付加した。混合物を、静かに攪拌しながら４℃で１８時間インキ ュベートした。溶離液として冷ＰＢＳを用いてセファロースＣＳ６Ｂカラム上で 、混合物を分離した。 実施例１３ 結合腕としてＳＭＣＣを用いたモノクローナル抗体のｎＥｒｙｔとの抱合 イミノチオランのｎＥｒｙｔとの抱合 先ず、イミノチオラン（ＩＴ）の新鮮な溶液を、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ中に調製し た（２Ｍ）。溶液を氷上に保持した。ｎＥｒｙｔを冷ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液中 に懸濁し、ＩＴ溶液を付加して、ｎＥｒｙｔ１ｍｇ当たりＩＴ １００μｍｏｌ という比が得られた（３２０μｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡ中にｎＥｒｙｔ ３ｍｇ、 ６７７μｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡ中に１５１μｌのＩＴ）。混合物を９０分間静か に攪拌しながら暗室中で４℃に保持した。インキュベーション後、混合物をセフ ァデックスＧ−２５（ＰＤ−１０）上で精製した。端的に述べると、使用前に、 クロマトグラフィーカラムを２０ｍｌの冷ＰＢＳ−ＥＤＴＡで平衡させた。混合 物をカラム上に適用し、冷ＰＢＳ−ＥＤＴＡで溶離した。最初の２．５ｍｌを捨 て（死容量）、ｎＥｒｙｔをその下の２．５ｍｌ分画中に収集した。次の反応前 に、標本を氷上に保持した。ｎＥｒｙｔ−ＩＴは不安定であり、その場で調製さ れる必要がある。 ＳＭＣＣのモノクローナル抗体４８−１２７との抱合 先ず、ＤＭＳＯ中にスクシンイミジル４−（ｎ−マレイミドメチル）シクロヘ キサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、３．２５ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯ（１ ０ｍＭ））の新鮮溶液を調製した。溶液を室温に保持した。４．７ｍＭ ＥＤＴ Ａを含有するＰＢＳ（７００μｌ）中の４８−１２７（１ｍｇ）の溶液を調製し た。１２５ｎｍｏｌのＳＭＣＣを付加し、反応物の容量を７１２μｌとした。溶 液を攪拌しながら３０℃で３０分間インキュベートした。０．５％ウシ血清を含 有するＰＢＳ ５ｍｌを用いて予め平衡させたＰＤ−１０カラム上で、混合物を 分離させ、冷ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液２０ｍｌで洗浄した。混合物をカラム上に 載せ、冷ＰＢＳ−ＥＤＴＡで溶離した。最初の２．５ｍｌを捨て（死容量）、ｎ Ｅｒｙｔをその下の２．５ｍｌ分画中に収集した。次の反応前に、標本を氷上に 保持した。 修飾４８−１２７のｎＥｒｙｔ−ＩＴ誘導体との抱合 冷ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液（２．５ｍｌ）中のｎＥｒｙｔ−ＩＴ（３ｍｇ）の 懸濁液に、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液（１．６ｍｌ）中のＳＭＣＣで修飾された４ ８−１２７を０．６６ｍｇ付加した。混合物を静かに攪拌しながら４℃で２４時 間インキュベートした。溶離液として冷ＰＢＳを用いてセファロースＣＳ６Ｂカ ラム上で、混合物を精製した。 実施例１４ ｎＥｒｙｔ−ＳＭＣＣ−４８１２７組成物を用いた免疫蛍光検査法 モノクローナル抗体４８−１２７が反応するｇｐ５４抗原を保有する細胞、又 はｇｐ５４を発現しないＥＦＦＲＯＮ細胞（陰性対照）を、周知の方法により、 免疫蛍光検査のために調製した。 ｎＥｒｙｔ−ＳＭＣＣ−４８１２７組成物を、前記（実施例６） のように処理した。その結果生じたｎＥｒｙｔ（ＦＩＴＣ）−ＳＭＣＣ−４８１ ２７組成物（１５ｍｇ／ｍｌ）を、公知の方法により、Ｔ２４細胞及びＥＦＦＲ ＯＮ細胞とともにインキュベートした。 端的に述べると、Ｔ２４細胞及びＥＦＦＲＯＮ細胞は、それぞれ１２０継代及 び５０継代培養後に用いた。細胞を５日間増殖、合流させて、２％ＥＤＴＡ及び ２％デキストロースを含有するＰＢＳを用いて培養皿を取り外した。５×１０5 個の細胞を、６ウエルの皿の底にある２２ｃｍ2の滅菌スライドに移した。使用 した培地は、７．５％植物血清及び抗生物質を含有するＭＥＭであった。細胞を 、５％ＣＯ2の存在下で３７℃で４日間増殖させた。７．５％ＣＡＶ血清及び５ ％血餅血清を含有するＭＥＭを用いた非特異的部位の遮断後、ｎＥｒｙｔ−デキ ストラン−ＦＩＴＣ４８１２７組成物を細胞上に固定した（１５μｇ／ｍ）。細 胞及びナノエリスロソーム組成物を、５％ＣＯ2存在下で３７℃で１時間インキ ュベートした。スライドを、ＣＡＶ血清を含有するＭＥＭ（３ｍｌ）及びＰＢＳ （２×３ｍｌ）で洗浄した。スライドを顕微鏡スライドガラスの上に載せ、２ｍ ｌのＰＢＳですすいだ。 図４は、免疫蛍光検査結果を示す。簡単に述べると、図４Ａ及び４Ｃは、それ ぞれＴ２４及びＥＦＦＲＯＮ細胞の位相差顕微鏡写真（４００倍）である。図４ Ｂ及び２Ｄは、蛍光顕微鏡下での４Ａ及び４Ｃと同じ顕微鏡視野を示す。明示さ れているように、ｎＥｒｙｔ−デキストリン−ＦＩＴＣ−４８１２７（ＳＭＣＣ ）組成物は、円形の小胞により観察されるｎＥｒｙｔの完全性、並びにｇｐ５４ Ａｇ−発現細胞（Ｔ２４）を特異的に認識する４８−１２７抗体の生物学的活性 を保存している。したがって、この結果は、ｎＥｒｙｔの特定細胞に対する標的 可能性を実証する。実施例６の捕獲方法にしたがって我々が次に試験したｎＥｒ ｙｔ−ＳＭＣＣ−４８１２ ７を用いて同様の結果がえられた、ということに留意すべきである。 実施例１５ 結合腕としてＳＰＤＰを用いたモノクローナル抗体のｎＥｒｙｔとの抱合 Ｎ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤ Ｐ）のｎＥｒｙｔとの抱合 先ず、Ｎ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ ＳＰＤＰ、２０ｍＭ（１ｍｇ ＳＰＤＰ））の新鮮な溶液を、メタノール（１６ ０μｌ）中に調製した。３ｍｇのｎＥｒｙｔをｐＨ７．４のＰＢＳ ５００μｌ 中に懸濁し、１５０μｌ（１μｍｏｌ）のＳＰＤＰを付加した。懸濁液を静かに 攪拌しながら３０℃で３０分間インキュベートした。混合物を、２０ｍｌの冷Ｐ ＢＳ、ｐＨ７．４で予め平衡させておいたＰＤ−１０カラム上で精製した。混合 物をカラム上に載せて、冷ＰＢＳで溶離した。最初の２．５ｍｌを捨て（死容量 ）、ｎＥｒｙｔをその下の２．５ｍｌ分画中に収集した。次の反応前に、標本を 氷上に保持した。 ＳＰＤＰのモノクローナル抗体４８−１２７との抱合 先ず、メタノール（１６０μｌ）中にＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジ ルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ、２０ｍＭ（１ｍｇ ＳＰＤＰ））の新鮮 溶液を調製した。溶液を室温に保持した。ＰＢＳ（４２５μｌ）中の４８−１２ ７（２．５ｍｇ）の溶液を調製した。１２０ｎｍｏｌのＳＰＤＰ（１７μｌ）を ４８−１２７溶液に付加した。溶液を攪拌しながら３０℃で３０分間インキュベ ートした。冷酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム１００ｍＭ；ＮａＣｌ１４５ｍＭ、ｐ Ｈ４．５）２０ｍｌを用いて予め平衡させておいたＰＤ−１０カラム上で、混合 物を分離させた。混合物をカラム上に 載せ、冷酢酸緩衝液で溶離した。最初の２．５ｍｌを捨て（死容量）、ｎＥｒｙ ｔをその下の２．５ｍｌ分画中に収集した。次の反応前に、標本を氷上に保持し た。分子のジチオピリジル部分を、１９０μｌのＤＴＴ溶液（酢酸緩衝液、ｐＨ ４．５中のジチオトレイトールの１Ｍ溶液）とともにカラムから収集した４８− １２７−ＳＰＤＰの懸濁液（３．６ｍｌ）を室温で２０分間インキュベートする ことにより還元的に切断した。１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ及び１４５ｍＭ ＮａＣｌ 、ｐＨ７．４を含有する冷緩衝溶液で平衡させたＰＤ−１０カラム上で、混合物 を精製した。 修飾４８−１２７のｎＥｒｙｔ−ＩＴ誘導体との抱合 冷ＰＢＳ（２．５ｍｌ、ｐＨ７．４）中のｎＥｒｙｔ−ＳＰＤＰ（３ｍｇ）の 懸濁液に、ＳＰＤＰで修飾された４８−１２７を１ｍｇ付加した。混合物を静か に攪拌しながら４℃で１８時間インキュベートした。溶離液として冷ＰＢＳ、ｐ Ｈ７．４を用いてセファロースＣＬ６Ｂカラム上で、混合物を分離した。 これらの反応は、「捕獲」デキストラン−ＦＩＴＣ（分子量４０００〜２，０ ００，０００）を有するｎＥｒｙｔを用いて実行されたが、修飾ｎＥｒｙｔ組成 物は依然として活性且つ安定であることが示された。 結論 したがって、本発明は、ナノエリスロソームの調製のための簡単、有効、且つ 定量的方法を教示する。米国特許第５，６５３，９９９号の教示にしたがって、 それにより精製されたナノエリスロソームは、種々の生物活性剤を閉じ込めるか 又は捕獲し得る。ナノエリスロソームによる生物活性剤の新規の捕獲方法も開示 される。生物活性剤を閉じ込めるか又はそれと結合する本発明のナノエリスロソ ームは、ＰＥＧ化（ＰＥＧ誘導体によるナノエリスロソームの膜上 の基の置換）によりさらに修飾される。いくつかのＰＥＧ誘導体が調製され、ナ ノエリスロソームと抱合された。このようなナノエリスロソーム−ＰＥＧ置換組 成物は、ナノエリスロソームの免疫原性を無くすることが示された。さらに、モ ノクローナル抗体を保有するヘテロ二官能性ＰＥＧは、閉じ込めデキストラン− 蛍光色素抱合体を有するナノエリスロソームと抱合されたが、in vitroの結果は 、このモノクローナル抗体保有ＰＥＧ−ナノエリスロソーム組成物が、抗体によ り認識された抗原を発現する細胞を特異的に装飾することを示した。 その好ましい実施態様により本発明を前記で説明してきたが、添付の請求の範 囲に定義された本発明の精神及び性質を逸脱しない限り、本発明は修正され得る 。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Polyethylene glycol conjugated nanoerythrosome, method for producing the same and use thereof Industrial applications   The present invention relates to a drug delivery system (DDS), a nanoerythrosome. About. Furthermore, the present invention relates to a novel method for producing nanoerythrosomes. Sa Additionally, the present invention provides a nanoerythrosome composition having reduced immunogenic potential And to its use in diagnostic and therapeutic methods. The invention further relates to Nanoerythrosome of the present invention for diagnosing or prognosing expected symptoms in mammals Bioassays using the same composition as well as these nanoerythrosomes of the invention. A kit containing the composition. Background of the Invention   Nanoerythrosome (nEryt) is used to remove its contained hemoglobin Vesicles produced from erythrocytes treated in a low salt solution. Then these Hemoglobin-free red blood cells (ghosts) are extruded (disturb vacuum filtration) To form vesicles having an average diameter of about 100 nm (US Pat. No. 5,653,9 No. 99). Nanoerythrosomes are essentially analogous to liposomes, It is considered a teosome (a vesicle composed of lipids and proteins). Anyway And they are totally separate compared to almost exclusively lipid-based liposomes. Shows one scientific area. Nanoerythrosomes have a high surface-to-volume ratio (of parental red blood cells). Buoyant vesicles that remain in suspension for extended periods of time. Nanoerythroso Various Types of molecules, such as drugs or peptides delivered to various targets through the bloodstream Can hold. They can be used, for example, for antibody or peptide delivery for selective delivery to cells. Bound to the ligand. In addition, nanoerythrosomes can encapsulate biologically relevant substances Or a biologically relevant molecule is attached to it. Therefore, Nano Ellis Losomes are highly versatile bioactive drug carriers or drug delivery systems ( DDS).   Nanoerythrosomes have been shown to have advantages over other DDS And can form a breakthrough in biopharmacology. For example, many drugs are Must be administered repeatedly to maintain blood levels at optimal therapeutic levels Absent. To do so, albumin microspheres, acrylic microspheres, Some methods such as liposomes, magnetic polymers, lectins and mAbs Is being tested today. Most of these technologies are still under development and their applications May or may not be more or less specific product groups, such as antineoplastic drugs, and / or Is limited to the target organ, such as the liver or pancreas. Some of these drug carriers Although the results obtained with use are promising, the substances that make up these carriers are often Often recognized by the immune system as foreign or hapten, so that they are eventually Induces adverse immunological reactions.   In addition, some of these carriers are rapidly captured and destroyed by the liver or kidney. You. The drug is then released in high concentrations directly into those organs, often resulting in toxic effects. Bring for you.   The advantages of nanoerythrosomes are: 1) they can pass through the liver or kidney Significantly modifies the metabolism of the drugs they carry by preventing their excretion; 2 3) can encapsulate or bind a number of biologically relevant molecules or biologically active substances; ) Several types of molecules, such as anti Used as a gradual drug release system for neobiotics, phototherapy drugs and peptides And maintain an optimal concentration of the drug in the bloodstream for a long period of time; and 4) a large amount of drug in the bloodstream Reduces the need for high-dose immediate administration of products, thereby increasing blood levels of toxic drugs Can reduce adverse effects such as nausea and vomiting caused (US Pat. No. 5,653,999).   However, nanoerythrosomes are at lower levels compared to other carriers. However, the immune response of the mammal can still be elicited. Furthermore, they are stomach Destroyed by liquids and therefore cannot be used effectively in unmodified form for oral administration .   Nanoerythrosomes are originally composed of lipids and proteins. Nano Ellis Proteins and Lipids in Rosomes (nEryt), eg Phosphatidylserine Is used for non-autologous use (in mammals, as opposed to autologous administration). Has received nanoerythrosomes from another incompatible mammal, Donor and recipient are identical or at least donor and recipient Is compatible), causing an immunological response in the recipient mammal. Them Unwanted protein-protein interactions are based on nanoerythrosomes The potential for improved therapeutic, diagnostic and commercial uses can be severely limited. For example In therapeutic applications, nanoerythrosomes elicit an adverse immune response. In addition, diagnostics When used in applications, they contribute to a high background. Therefore, There is still a need to find strategies that prevent that unwanted response. further Need to provide a more stable nEryt composition at low pH conditions (eg, like the stomach). The point still exists.   Polyethylene glycol (PEG) for reducing the immunogenicity of proteins Use has been reported in the past and is well known in the art. (U.S. Pat. No. 5,595,732). For coating liposomes The use of PEG has also been reported (US Pat. No. 5,593,622 and US Pat. No. 5,620,689). However, nanoerythrosomes are disrupted Whether or not they can withstand PEG conjugation without Whether or not to obtain it has not yet been determined. Therefore, the immunological potential is low But its biological activity as a drug delivery system is There remains a need to provide a nanoerythrosome composition that retains.   In order to target DDS specifically to a specific site recognized by an antibody, Binding to the body's drug delivery system has been reported. For example, US Patent No. 5,620,689 teaches CD-19 antibody-conjugated liposomes. Antibody Whether binding to nEryt preserves the integrity of nEryt has so far been Not finalized.   Therefore, the ligand conjugated thereto specifically targets cells or tissues. There remains a need to provide nEryt compositions.   The present invention seeks to meet these and other needs.   The description of the present invention provides a number of illustrative examples, the contents of which are incorporated herein by reference. included. Summary of the Invention   The present invention relates to nanoerythrosomes as diagnostic or therapeutic tools. Further In addition, the present invention relates to ligand-specific receptors, such as antigens (recognized by antibodies). To enable targeting of nanoerythrosomes to ligands, examples For example, binding to an antibody or part thereof The combined nanoerythrosomes. Biologically relevant substances are By further binding to the sulosome or to the nanoerythrosome Encapsulating biologically relevant substances in ligands that bind to nanoerythrosomes Targeting biologically relevant substances to receptors recognized by combined ligands Is possible here. In one embodiment, the invention relates to the cancer antigen gp54 / TR. NEryt group comprising nanoerythrosome bound to an antibody recognizing OP-2 The invention relates to an antibody-conjugated nanoerythrosome encapsulating a bioactive agent. specific In embodiments, the antibody-binding antibody encapsulates a fluorescent dye. In certain preferred embodiments The antibody that binds nEryt encapsulates an anticancer molecule.   The present invention further relates to such ligand-bound nanoerythrosomes and / or The present invention relates to a method for producing a ligand-bound nanoerythrosome encapsulating a physically related substance.   In certain embodiments, the present invention encapsulates a biologically relevant or bioactive agent or The present invention relates to a method for producing an unencapsulated antibody-bound nEryt composition.   The invention further includes nanoerythrosomes that bind to the antibody or a portion thereof. An antigen, wherein the antibody or part thereof is recognized by the antibody or part thereof; To a complex that targets nanoerythrosomes.   In addition, the present invention provides a method for bio- A method of encapsulating a biologically relevant substance. In one embodiment, the encapsulation or capture method comprises: Ice, dry ice or other cryogens (eg, ice-sodium chloride (about -20 ° C) ), Acetone-dry ice (-78 ° C)), preferably in liquid nitrogen. Includes freeze-thaw cycles.   The present invention further provides nanoerythrosomes having significantly reduced immunogenic potential. The composition. Furthermore, the present invention relates to nEryt-PEG compositions.   The invention further relates to nEryt compositions that can be administered orally. In addition, The present invention relates to PEG-nEryt compositions that can be administered orally.   Preferred embodiments of the invention relate to specific antibodies, as well as to specific biological relevance. Even when demonstrated for a substance, the method of the invention may involve many antibodies, including parts thereof. The person skilled in the art will recognize that it can accommodate the binding of several types of ligands, so the present invention It is not limited to this. Thus, the term "ligand" refers to the It should be broadly interpreted as a substance having a high affinity. Many types of ligands It is well known to those skilled in the art. Similarly, a number of different biologically relevant substances are Nanoerythrosome encapsulated in and / or according to the invention Can be combined with   Surprisingly, conjugation of polyethylene glycol derivatives is a key to nEryt vesicle biology. To reduce the immunogenic potential of nEryt without inhibiting biological activity It was found that it was. As mentioned earlier, numerous publications and patents have been published. Exists on the topic of PEG binding to proteins or liposomes, but The application firstly filed nanoerythrosomes without significantly compromising the integrity of the nEryt vesicles. Can bind to PEG. nEryt-PEG conjugation technology Point out that it was difficult to develop because of the number of parameters involved. I have to.   Help set the framework according to the complexity of nEryt-PEG conjugation efforts For this purpose, the following general formula of PEG and its description are shown.  "Z" is involved in the conjugation of PEG with proteins present in the nEryt membrane Group. The composition of the reactive groups may include any available reactive groups, e.g., amino groups, e.g., It is very important for controlling the kinetics of PEG conjugation with lysine residues. i) activity Ester, such as sushi For SH groups (ie, cysteine residues or iminothiolane derivatives of lysine): Two types of targeting of two families of nucleophiles present on proteins Reactive groups were used. The nEryt membrane can be modified by those skilled in the art in a known manner. Provide reactive groups that can serve as partners for conjugating PEG or other substances and And / or modify.   In a preferred embodiment, Z is YQ = CH = CH or -C (R ") = CHTwoso In some cases, COOH, HO (aldehyde), H, OH (hydroxyl), N HTwo, SH, is a member selected from the group consisting of: Y = -C = (O)- In the case, Z = H, NThree, OH, CHThree, -NH-NHTwo, Anhydride, mixed anhydride or " Activation S Ter ", which is known to those skilled in the art, Bodansky ("Principles of p eptides synthesis: chapter II, Activation and coupling, Haftner et al., 1 984, Eds. Springer-Verlag, New York. Pp9-52).   Some examples of activating groups useful for attaching PEG to nEryt are shown below. You:   Cyanogen bromide (BrCN), deamino acid ester (Zalipsky et al., 1984, "J . Macromol. Sci. Chem. "A21: 8339; Mutter et al., 1979, "The Peptides" G ross et al., eds.,Two, P.285, Academic Press, New York), hydrazine induction Body (Rubinstein, 1978, U.S. Patent No. 4,101,380; Davis et al., 1979, U.S. Patent No. 4,179,337 and Persson et al., 1988, "J. Chromatog".457 : 183), succinimidazyl carbonate derivatives (Miron et al., 1993, "Bioconju gate Chem "Four: 568; Zalipsky et al., 1993, "Bioconjugate Chem."Four: 296 and Zalipsky et al., 1991, "Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems" Dunn  et al., Ed., ACS, Washington, DC), oxycarbonylimidazole induction (Allen et al., 1991, "Biochem. Biophys. Acta" 1066: 29; and Tondelli et al., 1985, "J. Controlled Release"1: 25), Nitrophenyl carbonate derivative (Satore et al., 1991, Appl. Biochem. Biotech.)27: 45), tresylate Derivatives (Klibanov et al., 1991, “Biochem. Biophys. Acta”1062: 142; Delgad o et al., 1990, "Biotech. Appl. Biochem."12: 119), maleimide derivative ( Kogan, 1992, "Synthetic Commun."twenty two: 2417 and Romani et al., 1984, "Che mistry of Peptides and Proteinsl Volter et la., Ed.Two. p29, Walter de Gru yter, Berlin).   The “YQ” portion of the molecule allows for conjugation of PEG to proteins Connecting arm. The group used as YQ is preferably (CHTwo)n(Where n = 1-8 carbon atoms, preferably 2-5 carbon atoms). Specific n Use will depend on the particular nEryt-PEG composition desired and its use, Can be easily adapted. Generally, n is greater than 8, and the molecule is hyperlipid soluble Tend to YQ group directly binds OH group of polyethylene glycol to protein It is a significant group because there are very few ways to conjugate. One exception is And cyanuryl chloride derivatives used in preliminary experiments.   In a preferred embodiment, YQ is: CH = CH, -C (R ") = CHTwo(here , R "is lower alkyl having 1 to 5 carbon atoms), cyanuric chloride, ha Cyanogen hydride (Br or Cl) and other OH "activators" such as mesyl , A member selected from the group consisting of tosyl groups. Y is a lower alkyl [(CHTwo )nN = 1-7], Q = -C = (O ), N, S.   An “X” atom is an oxygen (ether), sulfur (thioether) atom, or —O—C (O) (ester), -NC (O) (amide) and -SC (O) (thioes Ter). Thioalkyl, alkoxy bonds and amides are biologically stable However, the ester and thioester linkages have some It is very unstable because it is hydrolyzed in biological media using microscopy. Water content Solution kinetics is related to the length of the YQ portion. However, they are Proved to be very useful in the design of nEryt used as a sustained release device . The binding between nEryt and the biologically relevant molecule or bioactive agent is stable or Whether stable is determined by a person skilled in the art. Generally, stable bonds are preferred Again, as an example of the utility for labile bonds, the nEryt composition is marked at a specific location. Phagocytosis of nEryt disrupts the linkage linking it to the PEG molecule To make it more immunogenic, and possibly to bioactive agents by macrophages. There are situations where it is desirable to include, but are not limited to.   The molecule (CHTwo-CHTwo-O)mThe part is polyethylene glycol itself You. m is any of 1 to 500. Therefore, 350 to 10,000 Molecular weight, preferably 1,000 to 10,000, more preferably 2,000 to PEG with a molecular weight of 5,000 is used.   Finally, [(CHTwo)nThe -WR] group faces the medium around nEryt. this It is clear that the nature of the group is critical for the use of the present invention. For example, ( CHTwo)n-WR is an nEryt simple carrier (DNA vaccine) or In applications encompassed for absorption through the mucosa (lung, small intestine), the immune response To prevent, preferably an inert group such as OCHThreeShould be (WR) . However, specific replacement of nEryt in an electric field (microchip) is required. (CHTwo)n-WR is a positive charge (i.e., -NHTwo) Or Must be a negatively charged (ie, -COOH) charged group. (CHTwo)n-WR is In addition, polyethylene glycol derivatives can be used to transfer biologically relevant molecules, Or binds to target specific organs while nEryt's unique immunity SH, 2-H, if required to inhibit primadium Groups such as opidyl or maleimide. In view of the above, [(CHTwo)n -WR] group is adapted to meet the specific needs of a particular application or use. Will be readily apparent to those skilled in the art. Preferably, n = 1 to 7 Is a carbon atom.   W is a member selected from the group consisting of O, N, S, -C (= O).   When W = —O—, R is: H, lower alkyl having 1 to 7 carbon atoms. Or cycloalkyl, -C (= O) -R (where R is a polyamine derivative, for example, Selected from the group consisting of, for example, spermine, spermidine or putrescein). Is a member.   When W = -N-, R is: H, lower alkyl having 1 to 7 carbon atoms. Kill or cycloalkyl, -C (= O) -C (= O) -R (where R is a spelling A polyamine obtained from min, spermidine or putrescein) Is two COOH, SOThreeH or POFourA lower radical of 1 to 6 carbon atoms bearing a group A member selected from the group consisting of Lucil.   When W = -S-, R is: H, lower alkyl having 1 to 7 carbon atoms. Or cycloalkyl, -C (= O) -C (= O) -R (where R is spermine , Spermidine or polyamines obtained from putrescein). Member selected from   When W = —C (＝ O) —, R is: H, lower having 1 to 7 carbon atoms. Alkyl or cycloalkyl, -C (= O) -R (where R is spermine, Permidine or a polyamine obtained from putrescein). Member of choice.   WR is COOH, POFour, SOThreeH is a member selected from the group consisting of:   The complexity of the choice of PEG used in the context of the nEryt modification means that It is clear from the above. Furthermore, when the modified PEG was reacted with nEryt, Other important parameters must also be taken into account, one example being Available reactive groups present on the membrane (ie, NHTwoAnd / or SH groups) The percentage of the relevant PEG substitution is included. If there is too much substitution, nEr yt decay by itself or capture or conjugation of bioactive agent by nEryt It is useless for further work such as. Conversely, if the substitution is too small, Whether nEryt also remains immunogenic (can be determined to be harmful for therapeutic use) Or make the carrier non-specific for the target (unwanted in diagnostic interactions ) It is not protected against various kinds of undesired interactions. Replaced by PEG Reactive groups on the nEryt film (ie, SH or NHTwo) Percentage is Here, it can be easily adapted by those skilled in the art who have recognized the present invention. Preferably, nEr 2-30%, more preferably 2-15% of the reactive groups on the membrane of yt are replaced by PEG Is done.   nEryt is available from a variety of mammalian sources (mouse, rat, rabbit, sheep, bovine). , Horses, pigs, humans, etc.). Blood is an anticoagulant (Hepari , EDTA, citrate, etc.). According to one embodiment of the present invention, Centrifuge blood and discard plasma and buffy coat. Remove compressed red blood cells Acid buffer (PBS: 150 mM NaCl, 5.0 mM KTwoHPOFour/ KHTwo POFour, PH 7.4) to the initial volume of blood. Wash red blood cells four times Clean, 2x109Resuspend at a concentration of cells / ml.   Red blood cells in suspension have previously been described in US Pat. No. 5,653,999. As such, the hemoglobin may be depleted. However, the present invention More efficient, quantitative and easy to prepare And a method that can be lightened easily. As a result, red blood cells in the suspension become Wo od (1987, "Methods in Enzymol."149: 271-280 and U.S. Pat. No. 999), which is a significant modification with respect to the conventional protocol. Using a hypotonic (2-5 mM) aqueous buffer, pH 8-11, without using trivalent cations , A suitable chromatography gel with high resolution, Sepharose CL Size exclusion chromatography on a column containing 6B or Sephacryl S400 Fees deplete the hemoglobin. White ghost from red blood cells Recovery is almost quantitative.   The next manufacturing step is described in US Pat. No. 5,653,999, compared to Nanoerythro. It is providing a significant modification of the method of producing thesome. Hypotonic suspension of white ghost Bringing the pH of the solution to 7.4 is necessary for hypotonic conditions and positive conditions in the method of the present invention. It is important to indicate the essential role of ON non-existence. Meet these requirements Failure to do so would jeopardize the production of nEryt. The suspension is added to about 0. Filter through a 45 μm filter, immediately followed by a 0.22 μm filter Filter through. In particular, the method of the present invention does not use extrusion. Furthermore, 1μ Multiple extrusion through an m-filter is not required. In fact, ghost through the filter Instead of applying pressure to the suspension to extrude the . The suspension was vacuum filtered through two 22 μm filters (ie Teflon) You. The recovery of nEryt is also almost quantitative. Up to 10% nEryt is lost Therefore, it is preferably less than 5%. U.S. Pat. No. 5,653,999. When used, 20% or more nEryt is lost. All operations are It is preferably performed under sterile conditions.   By several means generally known to those skilled in the art, for example, i) water Centrifugation of neutral solutions or trehalose, sucrose gradients (ie, 20,000) ii) molecular weight 200,000-1 × 106Acetate using a cut piece of Dialysis in a roulose tube; iii) concentration using Amicon system; iv) Lyophilization using rehalose, sucrose or raffinose solution (nEryt [ The protein [sugar] mg ratio is between 1 and 100: 1), depending on the dilution suspension (10%).12 nEryt / ml). These techniques are based on unmodified nEryt, NEryt with entrapped bioactive agent, bioactivity covalently attached thereto NEryt with an agent, as well as a bioactive agent encapsulated therein and therewith Applicable to nEryt with bioactive agent covalently attached to.   As used herein, "encapsulated", "trapped" and "captured" The term, when referring to a bioactive agent, specifically identifies the bioactive agent after "treatment". It is very difficult to assess where it is located, so it is widely defined. In fact, Assess if bioactive agent is inside nEryt or deeply associated with membrane It is difficult. Nevertheless, experiments (ie, with DNA) show that DNA In order to demonstrate that it is protected against contamination (see below), the bioactive agent was nEr It is believed to be confined / captured at yt.   The confinement / capture procedure is simple: nEryt, a confined bioactive agent A cation-free solution (divalent and / or trivalent) containing the highest possible concentration of Suspend in some hypotonic or isotonic solution. Molecular capture occurs at room temperature and at a slow rate. Like Alternatively, by flash freezing the nEryt-bioactive agent solution and warming to room temperature, It is performed more efficiently and quickly. Frozen ice, dry ice or Put the nEryt-bioactive agent solution on top of the other cryogen. Examples of cryogens include: Ice-sodium chloride (about -20 ° C), acetone-dry But not limited thereto. Preferably The cryogen is liquid nitrogen. The free bioactive agent is then applied depending on its chemistry. Various methods (centrifugation-wash cycle, exclusion chromatography, dialysis, etc.) And separated from the captured by various methods applicable to those skilled in the art. . The nEryt with the capture molecule can be concentrated (lyophilized) or For example, it is used for conjugation of PEG, ligand and antibody to the membrane surface. In suspension A divalent and / or trivalent cation such as Mg, Mn, Zn, Ca, etc. Avoiding is the most important thing. Such cations are present This closes the nEryt membrane and therefore captures the bioactive agent in most cases To be reduced. This "sealing" of divalent and / or trivalent cations on the nEryt membrane To further reduce the leakage of bioactive agent capture in nEryt, Those skilled in the art will recognize that they can be used to advantage in certain conditions. Capture and spread This type of sealed nEryt with rows is also within the scope of the present invention.   Various biologically important molecules, such as ligands, including antibodies, and polyethylene Glycols or chemical modifiers, such as iminothiolane, are now available from nEryt. Conjugated to the membrane surface. In a preferred embodiment for diagnostic use, a monoclonal antibody For example, 48-127 and M344 can be conjugated to nEryt. The antibody is nE -NH present at lysine residue on ryt membraneTwoGroup or -SH group of a cysteine residue Can be conjugated as described above. Conjugation is heterobifunctional (Where n = 2 to 100) by a number of techniques using heterobifunctional PEGs. Can come.   As mentioned above, the chemistry of nEryt can modify proteins present in membranes. enable. For example, i) iminothiolane can add SH groups to the membrane. The reaction Is used to conjugate PEG or antibody using an electrophilic group, such as maleimide (eg, For example, SMCC and heterobifunctional PEG). ii) For example, anhydrides, such as koha Addition of citric acid, cis aconitic acid and citraconic anhydride to nEryt Add a -COOH group that results in a negative charge. This is the uncommitted Useful for diagnostic applications that require the use of an electric field to perform separation of bound nEryt It is for. iii) For example, polyamine derivatives such as spermine, putrescine , Spermidine or polylysine derivatives to nEryt can be linked to nEryt Diagnostics that require the use of an electric field to perform the separation of unbound nEryt from -NH to provide a negative charge on the surface that is useful for the applicationTwoAdd a group. This kind of The effect is RTwoGroup (where RTwo= -COOH, POFour 2-, SOThreeH, NHTwo) Having or multivalent anion or multivalent cation molecules such as spermine, hepari This is possible by conjugating a PEG substituted with a PEG (see the general formula of PEG). ).   Generally, the polyethylene glycol derivatives of the present invention are represented by the following general formula: Is:   Z- (YQ) -X- (CHTwo-CHTwo-O)m-(CHTwo)n-WR (Where YQ is CH = CH, -C (R ″) = CHTwo(Where R '= 1 to 5 Lower alkyl having a carbon atom), cyanuric chloride, cyanogen halide (Br or Cl) and other OH "activators" from the group consisting of mesyl, tosyl groups Member of choice. Y is a lower alkyl [(CHTwo)nN = 1 to 7]. If: Q = -C = (O), N, S;       Z is YQ = CH = CH or -C (R ") = CHTwo, CO OH, HO (aldehyde), H, OH (hydroxyl), NHTwoConsisting of SH A member selected from the group. When Y = -C = (O)-, Z = H, NThree , OH, CHThree, -NH-NHTwo, Anhydride, mixed anhydride or "activated ester" This is known to those skilled in the art and Bodansky ("Principles of peptides synthesis: chapter II, Activation and coupling, Haftner et al., 1984, ed. . Springer-Verlag, New York. Pp9-52));   Some examples of activating groups useful for attaching PEG to nEryt are shown below. C: cyanogen bromide (BrCN), deamino acid ester (Zalipsky et al., 1984, "J. Macromol. Sci. Chem."A21: 8339; Mutter et al., 1979, "The Peptides Gross et al., Ed.,Two, P.285, Academic Press, New York) Conductors (Rubinstein, 1978, U.S. Pat. No. 4,101,380; Davis et al., 19) 79, U.S. Patent No. 4,179,337 and Persson et al., 1988, "J. Chromato. g. "457: 183), succinimidazyl carbonate derivatives (Miron et al., 1993, "Bioc onjugate Chem. "Four: 568; Zalipsky et al., 1993, "Bioconjugate Chem."Four: 2 96 and Zalipsky et al., 1991, "Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems Dunn et al., Ed., ACS, Washington, DC), oxycarbonylimididazo. Derivatives (Allen et al., 1991 "Biochem. Biophys. Acta")1066:29; and Tondel li et al., 1985, "J. Controlled Release"1: 25), Nitrophenyl carbonate derived (Satore et al., 1991, Appl. Biochem. Biotech.)27: 45), Tresire Derivatives (Klibanov et al., 1991, "Biochem. Biophys. Acta"1062: 142; Delgado et al., 1990, "Biotech . Appl. Biochem. "12: 119), maleimide derivatives (Kogan, 1992, “Synthetic Commun. "twenty two: 2417 and Romani et al., 1984, "Chemistry of Peptides and Pr. oteins ”Volter et la., Ed.Two. p29, Walter de Gruyter, Berlin);       O (CHTwo-CHTwoO)mIs polyethylene glycol (in this case, m = 2-500);       n = 1 to 7 carbon atoms;       W is a member selected from the group consisting of O, N, S, -C (= O) ;       When W = —O—, R is: H, lower alkyl having 1 to 7 carbon atoms. Kill or cycloalkyl, -C (= O) -R (where R is a polyamine derivative, For example, spermine, spermidine or putrescein). A member of       When W = -N-, R is: H, lower having 1 to 7 carbon atoms. Alkyl or cycloalkyl, -C (= O) -C (= O) -R (where R is A polyamine obtained from permine, spermidine or putrescein), 1 Or two COOH, SOThreeH or POFourAs low as 1 to 6 carbon atoms A member selected from the group consisting of lower alkyl;       When W = -S-, R is: H, lower alkyl having 1 to 7 carbon atoms. Kill or cycloalkyl, -C (= O) -C (= O) -R (where R is a spelling A polyamine obtained from min, spermidine or putrescein) A member selected from the group;       When W = —C (＝ O) —, R is: H, having 1 to 7 carbon atoms Lower alkyl or cycloalkyl, -C (= O) -R (Where R is a polya obtained from spermine, spermidine or putrescein) A member selected from the group consisting of:       WR is COOH, POFour, SOThreeA member selected from the group consisting of H You.   In the above general formula, Ya represents a number of reactive groups, for example, a cyanuryl chloride derivative, Aldehyde, succinimide, benzimidazole, symmetric disulfide, hetero It is a bifunctional PEG.   From the present disclosure, “biologically related substances” and “bioactive agents” refer to drugs, molecules, Peptides, proteins, nucleic acid sequences and fluorescent dyes or other labeling molecules, and PEG Is broadly used to encompass, but is not limited to. " It is understood that the term "PEG" is intended to include PEG derivatives.   The nEryt of the present invention can be combined with a bioactive agent to provide a carrier for such drugs. To form In particular, vesicles bind bioactive agents, such as drugs, and require bioactive agents. Provides a carrier for the administration of a bioactive agent so that it can be effectively delivered to critical body locations I can do it. Vesicles are naturally occurring, biodegradable, non-immunogenic or moderately immunogenic. Non-toxic and non-pyrogenic, fully compatible with blood, and suitable for autologous administration with char Sex. As used herein and in the appended claims, the term self-administration The nanoerythrosome administered to the mammal is obtained from a compatible red blood cell or blood supply. (The same mammal; that is, the same patient) ). Non-self of nanoerythrosome When intended for systemic administration, it is preferable to reduce the immunogenic potential of nEryt. However, it has been shown to reduce its immunoreactivity to immunosuppressed or non-immunosuppressed mammals. The administration of nEryt without treatment for Is intended.   The bond reacts with a primary group that reacts with the reactive site of the vesicle and with a reactive group on the bioactive agent. This can be accomplished using a coupling agent having a secondary group. Nano bioactive agent Numerous methods of binding to erythrosomes exist and are well known in the art. this Examples of these include well-known crosslinking reagents, such as homobifunctional or heterobifunctional. But not limited to, bifunctional reagents of the type. An example is shown below. :   Azidobenzoyl hydrazide, N-5-azido-2-nitrobenzoyloxy Succinimide;   N- [4- (p-azidosalicylamido) butyl] -3 '-[2'-pyridyl Dithio] propionamide;   p-azidophenyl glyoxal monohydrate;   4- [p-azidosalicylamido] butylamine;   1- [p-azidosalicylamide] -4- [iodoacetamido] butane;   Bis- [β- (4-azidosalicylamido) ethyl] disulfide;   Bismaleimide hexane;   Bis [sulfosuccinimidyl] suberate;   Bis [2- (sulfosuccinimidooxy) ethyl] sulfone;   Bis [2- (sulfosuccinimidooxycarbonyloxy) ethyl] sulfo N;   N-γ-maleimidobutyryloxy-succinimide ester;   N-γ-maleimidobutyryloxy-sulfosuccinimide ester;   N-hydroxysuccinimidyl-4-azidobenzoate;   N-hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidobenzoate;   m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester;   m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester;   4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxyl hydrazide -HCl;   4- (4-N-maleimidophenyl) butyric acid hydrazide.HCl;   N-hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicylic acid;   N-hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidosalicylic acid;   Sulfosuccinimidyl [4-azidosalicylamide] hexanoate;   3- [2-pyridyldithio] propionyl hydrazide;   p-Nitrophenyl-2-diazo-3,3,3-trifluoropropionate ;   2-diazo-3,3,3-trifluoropropionyl chloride;   N-succinimidyl [4-azidophenyl] 1,3'-dithiopropione G;   Sulfosuccinimidyl [4-azidophenyldithio] propionate;   Sulfosuccinimidyl 2- [7-azido-4-methylcoumarin-3-acetate Amido] ethyl-1,3'-dithiopropionate;   Sulfosuccinimidyl-2- [m-azido-o-nitrobenzamide] ethyl Ru-1,3'-dithiopropionate;   N-succinimidyl-6- [4'-azido-2'-nitrofe Nylamino] hexanoate;   Sulfosuccinimidyl-6- [4'-azido-2'-nitrophenylamino Hexanoate;   Sulfosuccinimidyl-2- [p-azidosalicylamido] ethyl-1,3 '-Dithiopropionate;   N-hydroxysuccinimidyl-2,3-dibromopropionate;   N-succinimidyl [4-iodoacetyl] aminobenzoate;   Sulfosuccinimidyl [4-iodoacetyl] aminobenzoate;   Succinimidyl 4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carbo Xylate;   Sulfosuccinimidyl 4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1- Carboxylate;   Succinimidyl 4- [p-maleimidophenyl] butyrate;   Sulfosuccinimidyl 4- [p-maleimidophenyl] butyrate;   4-succinimidyloxycarbonyl-methyl-a- [2-pyridyldithio ]toluene;   Sulfosuccinimidyl 6- [a-methyl-a- (2-pyridyldithio) tolu Amide] hexanoate;   N-succinimidyl-3- [2-pyridyldithio] propionate;   Succinimidyl 6- [3- [2-pyridyldithio] propionamide] hex Sanoate;   Sulfosuccinimidyl 6- [3- [2-pyridyldithio] pro Pionamide] hexanoate;   Sulfosuccinimidyl 7-azido-4-methylcoumarin-3-acetate; as well as   Sulfosuccinimidyl 4- [p-azidophenyl] butyrate.   It is understood that a number of groups can be used to attach a bioactive agent to a nanoerythrosome. Should be. Such groups are represented by NHTwo, COOH, SH and OH groups Are found abundantly in components of nanoerythrosomes, but are not limited to Not.   Coupling agents should not deleteriously interfere with the activity of the bioactive agent and will not interfere with the host. It should be understood that there should be no combined toxicity.   A number of bioactive agents are conjugated to or contained in the nanoerythrosomes of the invention. Because it can be trapped, it is referred to herein and in the appended claims as a bioactive agent. The terms include photosensitive compounds, drugs, antibiotics, antineoplastic drugs, anti-inflammatory drugs, proteins and Is a part thereof, an enzyme, a nucleotide sequence, a nucleic acid or a part thereof, an oligonucleotide , Antisense, gene, vector, expression vector, radioisotope, amino acid Analogs or nucleoside analogs, and other medically or veterinarily useful drugs Agents, such as contrast agents (eg, dyes) and diagnostics, as well as growth factors, hormones , For example, but not limited to, corticosteroids and the like. It is understood that. Further, the term bioactive agent refers to at least two bioactive agents. It is understood that this should be interpreted broadly to include combinations of sex agents.   From the specification and the appended claims, the term medicament is intended to refer to the nano-area of the present invention. Sulosomes are suitable for many types of treatment, prevention or diagnosis in mammals Should be understood to include veterinary medicine.   The nanoerythrosome of the present invention can also serve as a diagnostic tool. A certain kind of Many types of bioactive agents can be used to target tissues or cells. It is attached to a lithrosome, eg, an antibody. Target detection can be performed, for example, using nano-erythro Including the use of radioactive or non-radioactive labels or dye Assessed by known methods. Diagnostic use of nanoerythrosomes of the invention One of many examples of the use of neoplastic antigens to detect, quantify or analyze the presence of metastases Targeting this antigen through an antibody specific to   Selection of the bioactive agent and whether it is confined in the nanoerythrosome or Whether it is conjugated to it depends on the desired use, supply purpose, supply route, target, Depends on other parameters associated with the use of lithrosomes.   Depending on the purpose of supply, nanoerythrosomes can be administered by a number of routes: In humans and animals, these include injections (eg, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, Internal, subcutaneous, intraaural, intramammary, intraurethral, etc.), topical application (eg, affected area), and epithelium Or mucocutaneous lining (eg, ocular epithelium, oral mucosa, rectum and vaginal epithelial lining, Layer, nasopharyngeal mucosa, small intestinal mucosa, etc.). It is not limited to.   The mode of administration of the preparation can determine the site and cells in the organism to which the compound is supplied . Nanoerythrosomes can be administered alone, but generally they are intended for administration. It is administered in admixture with a pharmaceutical carrier chosen for the route of administration and standard pharmaceutical practice. Such formulations may be injected in a non-progressive manner, for example, intraperitoneally, intraarterially or intravenously. You. The formulation can also be administered via the oral, subcutaneous, intramuscular and, of course, Is administered. For parenteral administration, they may contain other solutes, e.g. For example, in the form of a sterile aqueous solution containing enough salt or glucose to make the solution isotonic. Administered in a state. Other uses due to the special properties of the formulation are also intended by those skilled in the art. Can be done. Delivery of nanoerythrosome formulations by aerosol is also a method of administration Intended as   For administration to mammals, including humans, in the curative treatment of disease states, Your health care professional will determine the appropriate dose for the recipient, And the response of the animal, as well as the nature and severity of the disease. same One component may be adapted for diagnostic use of nanoerythrosomes. Nanoerythrosome The dose of the bioactive agent in the formulation will, according to the invention, be relative to the free bioactive agent. Lower than used. However, in some cases, Higher doses need to be administered. Periodic or different cycles of treatment are beneficial It is also intended to be.   The supply pathway of the nanoerythrosome affects its distribution in the body. Nanoe Various routes of administration, including intravenous, subcutaneous and topical, can be used for passive delivery of lithrosomes. Local administration is included. Each pathway makes a difference in the localization of the nanoerythrosome. Nano Intended for targeting erythrosomes and bioactive agents to selected target regions Is done.   The nucleic acid sequences of the present invention include natural sugar-phosphate backbones, as well as modified backbones, e.g. Using rothioate, dithionate, alkyl phosphonate and nucleotides obtain. Modified sugar-phosphate backbones are generally described in Miller, 1988, "Ann. Reports Med. Ch. em. "twenty three: 295 and Moranet al., 1987, "Nucleic acid molecule. Acids Res. "14: 5019. In one embodiment, the nucleic acid sequence is specifically Can be radiolabeled to allow for   As used herein, the term "gene" is well known to those of skill in the art. Nucleic acid sequences that define a single protein or polypeptide About the columns. “Structural gene” is transcribed into RNA and has a specific amino acid sequence. To a specific polypeptide or protein. Restrict the resulting DNA sequence. A number of known nucleic acid sequences of the invention are well known in the art. It can be incorporated into any of the established kit formats by those skilled in the art. It is easily recognized.   "Vector" is commonly known in the art and includes plasmid DNA, DiDNA, virus DNA, etc. are limited, and the DNA of the present invention is cloned therein. Serve as a DNA vehicle. There are many types of vectors, Are well known.   The term “expression” means that the structural gene is transcribed into mRNA (transcription) and then the mRNA NA is translated into one or more polypeptides (or proteins) (translation ) Shows the process.   The term "expression vector" defines the vector or vehicle described above, However, it does show that it allows expression of the inserted sequence after transformation into host cells. K The loan gene (insert sequence) is usually a regulatory element sequence, for example, a promoter sequence. Under the control of The arrangement of the cloned gene under such control sequences is often It is often referred to as being operatively associated with the control element or arrangement.   The expression control sequence may be used when the vector is a prokaryotic or eukaryotic host or both Vector, which is intended to express an operable binding gene in a Eg, enhancer elements, termination sequences, tissue-specific elements and / or translation initiation And termination sites.   In another embodiment, the present invention relates to a nanoerythrosome composition according to the present invention. A nanoerythrosome of the invention comprising at least one container means containing Related kits. Preferred practice In embodiments, the kit comprises one or more of the following reagents: a washing reagent, a detection reagent, etc. And other containers containing   As used herein, the term "antibody" refers to monoclonal and polyclonal antibodies. Lonal antibodies, and fragments thereof, single-chain antibodies, idiotype specific molecules and Antibody fragments containing antibody fragments are included. Thus, the term antibody is used herein to F (AB ')TwoFragments, F (ab ') fragments, F (ab) fragments and Also includes Fv fragments. In general, techniques for preparing and modifying antibodies are well-known in the art. (Harlow et al., 1988, "Antibody-A Laboratory Manual, CSH Lab oratories "Campbell, 1984," Monoclonal Antibody Technology: Laboratory T echniques in Biochemistry and Molecular Biology, ”Elsevier Science Publ isher, Amsterdam, The Netherlands).   It is clear from the present invention that nanoerythrosome compositions have a wide range of therapeutic uses. It is easy. One example of such an application is where nucleic acid segments can be transferred to a patient. Gene therapy, but is not limited thereto. In one embodiment, the present invention Nanoerythrosome compositions are specific ligands that are directed to organs, tissues or cells. It allows more specific targeting of this organ, tissue or cell.   Agonists of the nanoerythrosome composition of the present invention and products thereof and antago It is clear that a nyst can be supplied.   Delivery of antisense molecules using the nanoerythrosome composition of the present invention is also contemplated. It is. The specific design of the antisense and its modification to increase its stability, It is well known in the art.   Suitable pharmaceutical carriers, excipients and therapeutic or diagnostic compositions are generally described in Remingto n's Pharmaceutical Sciences "1980, 16th edition, a standatd reference in this It is described in particular field.   A wide range of cytotoxic agents and drugs may be used in accordance with the present invention. It will be apparent to those skilled in the art. Examples of cytotoxic agents include toxins such as diphtheria Include, but are not limited to, toxins. Further, as described above, radionuclides Is also bound to the nanoerythrosome composition of the present invention and It exerts cystotoxic effects and can be used for radiation therapy. Radioactive nuclei that can be used for radiation therapy Species are well known in the art and are readily adapted to particular clinical or diagnostic situations. You. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Referring to the accompanying drawings, which are shown to illustrate preferred embodiments, The present invention described above will be further described.   FIG. 1 shows nanoerythrosomes used for diagnostic and / or therapeutic applications. 1 shows a summary of the methods used for manufacturing.   FIG. 2 shows the different PEG molecules produced.   FIG. 3 directly demonstrates a significant reduction in the immunogenic potential of the nEryt composition. 3 shows a contact cohesion test.   FIG. 4 shows phase contrast microscopes A and T24 (AB) and EFFRON cells (CD). B and fluorescence micrographs BD are shown.   Other objects, advantages and features of the present invention are described below with reference to the accompanying drawings. Reading the description of the preferred embodiments will become apparent, however, and the embodiments are not limited thereto. Instead, they are merely for illustration and do not limit the scope of the present invention. Description of the preferred embodiment   FIG. 1 produces nanoerythrosomes for use in diagnostic or therapeutic applications Here is a summary of the methods used for:   Nanoerythrosome manufacturing techniques may allow for its administration by parenteral or enteral routes. Further investigation was taken. For parenteral routes, nano-erythrosome Team has been shown to be able to identify bladder cancer cells. Simply In other words, nanoerythrosomes were concentrated by centrifugation and dextran-fluorescein was concentrated. Concentrated solution of ceine isothiocyanate (dextran-FITC: molecular weight 400 0-2x106). After one round of freezing and thawing in liquid nitrogen, Dextran-FITC-encapsulated nanoerythrosomes were treated with Sephadex or Filtration by size exclusion of the gel using Sepharose (ie, G-25 or PD1 Purification was carried out according to 0) or by washing-centrifugation for 4 cycles. SP The primary reaction with DP modified the nanoerythrosome membrane. Approved for many bladder cancers A selected antibody that recognizes the cancer antigen TROP-2, Lonal antibody 48-127 is first modified with SPDP and then a reducing agent such as DT Treatment with T (dithiothreitol) liberates free SH groups. Finally, Nanoerythrosomes and monoclonal antibodies 48 also modified from -127 is called nanoerythrosome-dextran-FITC-48127 Were mixed together in a physiological buffer to facilitate the formation of the resulting composition. This composite A biological assay using the body recognizes the TROP-2 antigen recognized by 48-127. The retaining cells were very selectively decorated by the complex, while the non-TROP-2 Retaining cells were not.   Replace dextran with a phototherapy drug, such as phthalocyanine octacarboxylic acid By a similar type of experiment, in a first step, phthalocyanine was described herein. Was easily captured by nanoerythrosomes using a modified heat shock therapy Was done. In the second stage, 4 The binding of the 8-127 antibody to nanoerythrosome-phthalocyanine was performed. After this conjugation, cell labeling may be evaluated, as well as in situ for treatment of bladder cancer. Perform relevant tests to take advantage of the phototherapy properties of phthalocyanine. This 2 Kinds of complexes (nanoerythrosome-phthalocyanine-48-127) are Is expected to show a significant inhibitory effect on   In the third set of experiments, the nanoerythrosome-pseudomonas toxin-48127 Demonstrates that conjugation can be used significantly as a highly specific cytotoxic delivery system To this end, an immunotoxin, such as a Pseudomonas toxin, is coated in the nanoerythrosome. Is wrapped. These latter two complexes are useful for intracapsular treatment of various bladder cancers Is shown. Such a conjugate is very effective when the drug and targeted bladder cells Short-term contact (this is caused by the rapid accumulation of urine produced by the kidneys in the bladder) Overcome major problems posed by commonly used treatment techniques I can do it.   Taken together, the present invention provides that nano-erythrosomes Molecular weight about 1000 (phthalocyanine octacarboxylic acid) to 2 × 106(Dext Run) can be encapsulated. Therefore, nanoerythroso Is a very versatile drug delivery system. In addition, dextran And phthalocyanine molecules are stably exposed to nanoerythrosomes for more than 6 months. It is shown to be wrapped.   For therapeutic enteral applications, nanoerythrosomes are biologically relevant substances, such as Drugs, enzymes, proteins (ie, insulin), immunomodulatory compounds, peptides or May consequently allow oral administration of other substances sensitive to the gastrointestinal system. This The strategy used to obtain such a modified delivery system is based on the thermal shock treatment described above. Nanoe under the law It consists in encapsulating biologically relevant substances inside the lithrosome. In the second step, Derivatives of ethylene glycol (eg, PEG-cyanuryl chloride) Conjugate to the losome. Such polyethylene glycol derivatives are proteins And it is known to inhibit the antigenicity of the enzyme and increase the biological half-life. I Thus, such systems allow the use of non-autologous and heterologous nanoerythrosomes. Make it work.   The present invention provides for the use of a number of other PEG derivatives, It should be noted that it is not limited to luchloride. Such derivatives Is well known to those skilled in the art. Examples of such PEG derivatives include activated Examples include, but are not limited to, PEG derivatives having a stell. Natural consequences As such, one skilled in the art may apply the teachings of the present invention to other types of PEG derivatives.   In a preferred embodiment, the nanoerythrosome is PEG-5000-cyanuryl Conjugated to chloride. The present invention relates to PEG derivatives having a molecular weight of about 350 to 10,000. But preferably from about 1,000 to 7,000, more preferably Preferably use a PEG derivative having a molecular weight of about 2,000 to 10,000. Should be understood. The stability of PEG-modified nanoerythrosomes Generally, dextran-FITC encapsulated nanoerythrosomes are tested. I Demonstrates the encapsulation and stability of Surin-I125, and a variety of different types of administration (iv (Intraperitoneal and oral) in animals after such nanoerythrosome biopharmaceuticals Experiments are ongoing to evaluate the biological parameters. In addition, oral administration Insulin or hormones that induce a pharmacological response when The ability of nanoerythrosome-PEG to have is tested.   All these experiments demonstrate the versatility and utility of nanoerythrosomes It is expected to demonstrate Digestive substances, and therefore gastrointestinal sensitive substances, Retains its biological activity when protected by nanoerythrosomes Demonstration can generally have a significant effect on oral administration of susceptibles.   The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto. Not done. Example 1   Removal of plasma and buffy coat (white blood cells)   Blood (2 × 30 ml) from a mammalian donor (e.g., horse, cow, pig, human) Centrifuged at 00 × g (1500 rpm) at 4 ° C. for 10 minutes. Plasma and buff The icoat was removed by suction. Remove liquid and equal volume phosphate buffer at 4 ° C Saline (PBS) (5 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, pH 7.4). Invert the tube several times to gently homogenize the mixture . The blood was then re-centrifuged at 500 × g at 4 ° C. for 10 minutes. Described here The series was repeated three times.   The following protocols were each performed under sterile conditions. Example 2   Preparation of erythrocyte ghost hypotonic impactor   Method 2.1   5 ml of blood treated as described in Example 1 was 35 ml (50 ml Nalgen) eTM(In a test tube) to hypotonic buffer (5 mM sodium phosphate), pH 7.4. Was. The erythrocyte suspension was centrifuged at 25,000 xg for 20 minutes at 4 ° C.   The supernatant was aspirated and discarded. Remove the volume of the hypotonic buffer to the same volume of fresh buffer And the suspension was centrifuged again. Supernatant This procedure was repeated three times until a faint coloration occurred. Pellet 5 ml PBS buffer The suspension was suspended at 4 ° C. in a buffer solution, pH 7.4. Pool the white ghost suspension and add 2 Concentrate by centrifugation (20,000 xg) for 0 minutes and at 4 ° C until needed. Held.   Method 2.2   70 ml of blood as treated in Example 1 was added to hypotonic phosphate or carbonate buffer (2 . 5 mM) (2 mM NaThreePOFourPH adjustment using glacial acetic acid), pH 10 to 11 Using Sepharose CL6B (also CL4B) or Sephacryl S400 color Chromatography (eg, 10 cm × 30 cm). White go The host was first collected (dead volume) and then hemoglobin was retained on the column. Acetic acid Was used to adjust the pH to 7.4, and the ghost was concentrated by centrifugation as described above. By the chromatographic treatment, hemoglobin-free white ghost 7 0 mg was obtained (1 mg / ml "washed blood"). Example 3   Preparation of nanoerythrosome (nEryt)   Method 3.1   Nanoerythro as described in US Pat. No. 5,653,999. Sosomes were prepared. Through a polycarbonate filter with about 1 μm pores It is important to point out that ghosts are extruded. Polycarbo Nate filters have the advantage that they do not stick to nanoerythrosomes. Go The paste was extruded from the isotonic suspension under nitrogen pressure. The suspension is preferably pressed four times. Be sent out.   Method 3.2   This approach is significantly different from 3.1 above. It's faster And yields the advantage of producing better yields of nanoerythrosomes. Sa Moreover, it is readily available for large-scale production.   A hypotonic suspension of white ghost in hypotonic PB (pH 7.4) (0.2 mg / m l) is immediately replaced with a polycarbonate (nylon or polycarbonate) having pores of about 0.45 μm. (Polyethersulfone) filter immediately after the filter with a hole of about 0.22 μm. Pass through a carbonate (nylon or polyethersulfone) filter Empty filtration. The procedure was performed in a hypotonic buffer (without divalent and / or trivalent cations). Must be performed in If you do not meet this basic requirement, the filter will It becomes blocked and unusable. When using this method, just pass the filter once And only 5-10% of the nanoerythrosomes are lost in this step. Method The nanoerythrosome obtained by 3.1 has an average diameter of 100 to 200 nm. I had. In a light scattering experiment using the nEryt suspension prepared according to method 3.2, n Eryt was divided into three populations: a) 40-50 nm; b) 100 nm, and And c) 200 nm smaller subpopulation. However, prepared according to method 3.2 The average diameter of the prepared nEryt suspension is still about 100-200 nm. Was. Example 4   Concentration of nanoerythrosome suspension   nEryt suspension (350 ml at 0.2 mg protein / ml) was added to Amicon Concentrator (Model 8400, molecular cut pieces smaller than 500,000 (eg ZM50 Gently under a nitrogen pressure of 10 psi using a membrane having 0 and YM100). While the volume was made up to 50 ml. Example 5   Confinement (capture) of molecules by nEryt   Using a general protocol, a bioactive agent, such as a protein (ie, ), A photodynamic agent (ie, a porphyrin-like molecule), a fluorophore (ie, Dextrin (molecular weight 4,000 to 2,000,000) -fluorescein iso Thiocyanate (FITC)), nucleotides (ie, DNA), glycoproteins Captures polysaccharides (ie, inulin), vitamins, drugs (ie, bleomycin), etc. Can be caught (confined).   In an Eppendorf tube, a suspension of nEryt (1.5 ml, 1-2 mg / ml) was centrifuged at 16,000 × g at 4 ° C. for 10 minutes (microfugeTM). Supernatant Was removed and discarded. The protein content of the pellet is determined by well known methods (ie, Sales kit). 1 ml of a concentrated solution of the substance to be captured (trapped) Added to the list. The suspension is gently homogenized by inverting the tube seven times and room temperature at 4 ° C. For 10 minutes. Thereafter, the suspension was frozen in liquid nitrogen for 2 minutes and In a water bath. Porphyrin-like molecules, some capture of molecules such as DNA It is important to note that catch was observed after 30 minutes incubation at room temperature. It is important. However, thermal shock treatment significantly improved the capture of the bioactive agent. Thermal shock Need to freeze at -70 ° C or -20 ° C. It should be noted that this is not the case. For certain bioactive agents Although ice (0 ° C) was sufficient, it was, however, especially the same as freezing at -180 ° C. Is not as effective. Example 6   Purification of nEryt with capture (confinement) molecule   Method 6.1   After capture, use 1 ml of cold (4 ° C) PBS (isotonic, pH 7.4). Dilute 3-5 times and centrifuge at 16,000 × g for 8 minutes to remove the supernatant, Dilution with BS again released nEryt from unconfined molecules.   Method 6.2   After capture, appropriate Sephadex or Sephacrylka can be obtained by well-known methods. The free molecules are retarded by size exclusion chromatography using Rapid elution of ryt released nEryt from unconfined molecules. capture (Confinement) After solubilizing the nEryt using a suitable detergent, (Adapted to trapped molecules).   Stability   By capture, the dextran-FITC-nEryt suspension was kept at 4 ° C. As evidenced by the fact that it is stable for at least seven months A defined nanoerythrosome-bioactive agent composition has been formed. In addition, DNA closure I performed a squeeze. Briefly, 200n suspended in PBS (500 μl) g of nEryt were washed three times with TKN buffer (to eliminate phosphate) . Suspension of DNA (30-320 ng) in TKN buffer (10-300 μl) And gently homogenized. Incubate the suspension at 4 ° C for 10 minutes , Frozen in liquid nitrogen for 2 minutes and then incubated at 25 ° C for 4 minutes. TK The suspension was treated with NM buffer as described above.   Reaction containing DNase (100 μl of 0.1 U / μl DNase I solution) The mixture was incubated to quickly remove excess DNA. Mg2+(10m M) or Mn2+f (1 mM) was added to the mixture.   After cleaning with DNase, using a conventional protocol for PCR NEryt-DNA was amplified to confirm the presence of the vector in nEryt.   Table 1   Using the techniques described herein, these examples demonstrate the capture of nEryt. Illustrating typical results, this reflects similar concentrations of small and large molecules.       Initial concentration nEryt Capture molecule Dextran-4000 FITC (mg / ml) (μg / mg nano)       (Mg / ml)           2.6 1.3 15.6           2.6 2.6 13.4           2.6 3.9 12.1 DNA (μg / ml)*            1.3 4 0.003           13 4 0.066           65 4 0.153   *Similar results were obtained with linear (3 kb) or supercoiled DNA.   Thus, Table 1 illustrates these results, which illustrate typical results of capture by nEryt. Here is an example. This reflects similar concentrations of small and large molecules. Example 7   Preparation of Specimens for Lyophilization of nEryt   A typical preparation is nEryt (or alternatively) in hypotonic PB or isotonic PBS at pH 7.4. NEryt with capture bioactive agent, or n of capture bioactive agent or its surface 1 ml of suspension of PEG-conjugated nEryt with Eryt antibody (1 mg of tamper Quality) Become. 500 μl of the following solution lyophilized solution (Lyo solution) [(sucrose (2 63. % P / v (770 mM)), polyvinylpyrrolidone (molecular weight = 10,0 00, 18.1% p / v; (18 mM)), EDTA (ethylenediaminetetravinegar) Acid (trisodium salt); 1 mM = Lyo solution) in PBS or PB at pH 7.4 Dissolution] was added. When nEryt is in an isotonic solution, the Lyo solution is hypotonic. In the opposite case, nEryt is in the hypotonic solution. nEryt specimens at -20 ° C Freezing (12 hours)-thawing at 25 ° C (16 hours), and finally heating at 40 ° C for 18 hours. It was stable even after repeating the heat cycle 7 times.   freeze drying   1.5 ml of a suspension of nEryt as prepared above in a 10 ml vial A typical preparation consisting of was frozen in liquid nitrogen for 2 minutes. The suspension is then lyophilized FreezemobileTM  6-12 hours using 12EL Virtis (Virtis Company) Frozen. Buffered sucrose solution in water or in PBS (sucrose 25.5% p / v (745 mM)) was added to the lyophilized nEryt for 1 hour at 37 ° C. After incubating the suspension, nEryt is generated which retains its function of the trapped molecule. I did NEryt already with a confinement molecule, eg dextran-FITC Was still functional, and very little fusion was observed under the microscope. Example 8   Conjugation of polyethylene glycol and monoclonal antibodies with nanoerythrosomes Combination   PEG having the following structure was prepared in the laboratory by known methods:   Methoxy PEG-S-succinimidyl succinate (molecular Amount = 2000) (MPEG-Ssuc-suc-2000) with nEryt Go.   A 1.5 mg suspension of nEryt in a final volume of 750 μl PBS (pH 7.4) MPEG-Ssuc-suc-2000 was added to the suspension to obtain 1.83 nM (2. A final concentration of 7 mg) was obtained. Hold the suspension at room temperature for 1 hour, It was homogenized gently by falling. Mix the mixture with Sepharose CL6 Purified by size exclusion chromatography on a B column. Assess conjugation yield As a result, the conjugation of MPEG-Ssuc-suc-2000 with nEryt was 1 1% (LJ. Karr, DL. Donnelly, A. Kozlowski and J. Milton-Harri s, 1994, "Methods in Enzymology"228: 377).   Methoxy PEG-S-succinimidyl succinate (molecular weight = 2000 ) Conjugation of (MPEG-Ssuc-suc-5000) with nEryt.   A suspension of 0.5 mg of nEryt in a final volume of 500 μl PBS (pH 7.4) MPEG-Ssuc-suc-5000 was added to the suspension to give 5.79 nM (1 A final concentration of 4.47 mg) was obtained. Hold suspension at room temperature for 1 hour Homogenized gently by tipping over at speed. Mix the Sepharose Purified by size exclusion chromatography on a CL6B column. Consolidation As a result of evaluation of the rate, it was found that MPEG-Ssuc-suc-5000 had 14% (LJ. Karr, DL. Donnelly, A. Kozlowski and J. Milton -Harris, 1994, "Methods in Enzymology"228: 377).   Methoxy PEG-O-CHTwoCOOS succinimidyl propionate (Molecular weight = 5000) (MPEG-O- SPAsuc -5000) with nEryt.   0.5 mg of human nEryt in a final volume of 500 μl of PBS (pH 7.4) To the suspension, MPEG-O-SPA-5000 was added to give a final concentration of 0.03M. I got a degree. Keep the suspension at room temperature for 1 hour and invert the suspension at a constant speed. Homogenized more gently. Mix the mixture on a Sepharose CL6B column. Purified by size exclusion chromatography. Conjugated with fluorescamine Evaluation of the yield indicated that conjugation with nEryt was 30% (LJ. Karr, DL. Donnelly, A. Kozlowski and J.S. Milton-Harris, 1994, "Methods in Enzymolo gy "228: 377). Example 9   Immunogenicity of PEG-conjugated nEryt   Preparation of nEryt conjugated with MPEG-Ssuc-suc-5000 of Example 8 To monitor the immunogenicity of the product, an equal amount of parental horse red blood cells (HRBC) PEG-conjugated nEryt (nEryt) and PEG-conjugated nEryt (nEryt- The antibody response induced by PEG) was analyzed.   Four groups, each containing three mice, were given up to 250 mg (of pig) or 200 2 × 10 u.m. for a dose of 0.1 ml phosphate buffered saline (PBS). cHRBC, n Immunization by intraperitoneal injection with Eryt (with or without PEG) did. One week after the third immunization, serum was collected from each mouse and The indirect agglutination test tested for the presence of antibodies to the parent HRBC.   Each serum sample was titrated in PBS, and 25 ml of each dilution was added to a 96-well plate. (Round bottom) was added to 25 ml of a 10% solution of HRBC in each well. this Incubated at room temperature for 15-25 minutes and scored for aggregation using an inverted microscope. Was.   As shown in FIG. 3, mice immunized with parental HRBC had a serum dilution of about 1: 300. Showed a maximum aggregation of 50%. Mice immunized with nEryt had a 1: 100 Mice immunized with nEryt-PEG showed 50% maximal aggregation at serum dilution, A 1:10 serum dilution showed 50% maximal aggregation. Therefore, nEryt-PE The maximum agglutination by G was observed in non-immune control mice (presence of natural antibodies against blood antigen group). (Reflection) was indistinguishable from the result.   Indirect agglutination tests effectively measured the presence of IgM antibodies. Measure IgM antibody For this purpose, anti-mouse immunoglobulin was added to the HRBC used in the direct test described above. After washing the HRBC three times in 200 ml of BS and aspirating the supernatant between each wash, Added. Anti-mouse immunoglobulin was used at a concentration of 1: 100. 1 at room temperature After 5 minutes incubation, aggregation was re-scored using an inverted microscope. This analysis Results from a 1: 100 dilution of nEryt and a 1: 100 dilution of nEryt-PEG. Aggregation was again detected in 10 dilutions and control serum. Therefore, nEryt-PEG is less susceptible to aggregation loading by nEryt-PEG. It was non-immunogenic because it was comparable to control serum. Example 10   Conjugation of monoclonal antibodies with nEryt using heterobifunctional PEG   Conjugation of iminothiolane with nEryt   First, a fresh solution of iminothiolane (IT) was added to PBS-EDTA (5 mM KTwoPOFour, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.4). (4.7M). The solution was kept on ice. 4 mg nEryt in cold PBS-ED Suspend in TA buffer, add IT solution and add 627 mM (IT) in final solution NEry A ratio of 100 μmol IT / mg t was obtained. Mix for 90 minutes Maintained at 4 ° C. in the dark with gentle stirring. After incubation, mix the mixture Purified on Sephadex G-25 (PD-10). In short, before use On the other hand, the chromatography column was equilibrated with 20 ml of cold PBS-EDTA. The mixture was applied on the column and eluted with cold PBS-EDTA. First, 2.5 ml Discard (dead volume), nEryt was collected in 2.5 ml fractions below. Next reaction Before, the specimens were kept on ice. nEryt-IT is unstable and prepared in situ Need to be done. Example 11   Conjugation of heterobifunctional PEG to monoclonal antibodies 48-127   First, PEG2000NHS-MAL: A fresh solution of was prepared. Next, in PBS containing 4.7 mM EDTA A solution of 48-127 (0.8 mg / ml) was prepared. 200 nmol PEG 2000 NHS-MAL was added to 0.4 mg of 48-127 (final of PEG Concentration 0.4 mM). Monoclonal antibodies 48-127 are different from T16. Recognizes the gp54 cancer marker at the pitope. The solution is stirred at 30 ° C. for 3 hours. Incubated for 0 minutes. The mixture contains 0.5% bovine serum albumin Separate on a pre-equilibrated PD-10 column with 5 ml of PBS and add cold PB Washed with 20 ml of S-EDTA buffer. Apply the mixture to the column and add cold PBS -Eluted with EDTA. Discard the first 2.5ml (dead volume), 2.5m below nEryt was collected during fractionation. Specimens were kept on ice until the next reaction. Example 12   Conjugation of modified 48-127 with nEryt-IT derivatives   NEryt-IT (960 μg) in cold PBS-EDTA buffer (600 μl) ) Was added to 160 pg of 48-127 modified with PEG (1 ml of PBS- (In EDTA). Incubate the mixture for 18 hours at 4 ° C. with gentle stirring. Was added. On Sepharose CS6B column using cold PBS as eluent The mixture was separated. Example 13   Conjugation of monoclonal antibodies with nEryt using SMCC as binding arm   Conjugation of iminothiolane with nEryt   First, a fresh solution of iminothiolane (IT) was prepared in PBS-EDTA. (2M). The solution was kept on ice. nEryt in cold PBS-EDTA buffer And the IT solution is added thereto, and 100 μmol of IT per 1 mg of nEryt is added. (NEryt 3 mg in 320 μl of PBS-EDTA, 151 μl IT in 677 μl PBS-EDTA). Mix the mixture for 90 minutes And kept at 4 ° C. in a dark room with stirring. After incubation, mix the mixture The product was purified on Adex G-25 (PD-10). In short, before use, The chromatography column was equilibrated with 20 ml of cold PBS-EDTA. mixture The material was applied on the column and eluted with cold PBS-EDTA. Discard the first 2.5 ml (Dead volume), nEryt was collected in the 2.5 ml fraction below. Before the next reaction At the same time, the specimens were kept on ice. nEryt-IT is unstable and is prepared in situ. Need to be done.   Conjugation of SMCC with monoclonal antibodies 48-127   First, succinimidyl 4- (n-maleimidomethyl) cyclohexane was added in DMSO. Xan-1-carboxylate (SMCC, 3.25 mg / ml DMSO (1 0 mM)). The solution was kept at room temperature. 4.7 mM EDT Prepare a solution of 48-127 (1 mg) in PBS (700 μl) containing A Was. 125 nmol of SMCC was added to bring the reaction volume to 712 μl. Dissolution The solution was incubated at 30 ° C. for 30 minutes with stirring. Contains 0.5% bovine serum Mix the mixture on a PD-10 column pre-equilibrated with 5 ml of PBS Separated and washed with 20 ml of cold PBS-EDTA buffer. Mix on column Load and elute with cold PBS-EDTA. Discard the first 2.5 ml (dead volume), n Eryt was collected in the 2.5 ml fraction below. Samples on ice before next reaction Held.   Conjugation of modified 48-127 with nEryt-IT derivatives   NEryt-IT (3 mg) in cold PBS-EDTA buffer (2.5 ml) The suspension was treated with SMCC modified 4 in PBS-EDTA buffer (1.6 ml). 0.67 mg of 8-127 was added. 24 hours at 4 ° C. with gentle stirring of the mixture For a while. Using cold PBS as eluent, Sepharose CS6B The mixture was purified on a ram. Example 14   Immunofluorescence method using nEryt-SMCC-48127 composition   Cells carrying the gp54 antigen to which the monoclonal antibodies 48-127 react, or EFFRON cells that do not express gp54 (negative control) were isolated by well-known methods. Prepared for immunofluorescence testing.   nEryt-SMCC-48127 composition was prepared as described in Example 6 above. Treated as follows. The resulting nEryt (FITC) -SMCC-481 27 composition (15 mg / ml) was prepared by a known method using T24 cells and EFFR. Incubated with ON cells.   Briefly, T24 cells and EFFRON cells were each passaged for 120 passages. And after 50 subcultures. The cells are grown for 5 days and allowed to confluent, 2% EDTA and The culture dish was removed using PBS containing 2% dextrose. 5 × 10Five Individual cells were placed at the bottom of a 6-well dish at 22 cmTwoTo sterile slides. use The culture medium was MEM containing 7.5% plant serum and antibiotics. Cells , 5% COTwoWere grown for 4 days at 37 ° C in the presence of 7.5% CAV serum and 5 After blocking nonspecific sites with MEM containing% clot serum, nEryt-dex Strand-FITC48127 composition was immobilized on the cells (15 μg / m). Fine Vesicle and nanoerythrosome compositionTwo1 hour ink at 37 ° C in the presence Was added. Slides were prepared with MEM containing CAV serum (3 ml) and PBS. (2 × 3 ml). Place the slide on a microscope slide glass, 2m Rinse with 1 l PBS.   FIG. 4 shows the results of the immunofluorescence test. Briefly, FIGS. 4A and 4C illustrate It is a phase contrast microscope photograph (400 times) of T24 and EFFRON cells, respectively. FIG. B and 2D show the same microscopic field under fluorescent microscope as 4A and 4C. Explicit As described, nEryt-dextrin-FITC-48127 (SMCC )) The composition shows the integrity of nEryt as observed by circular vesicles, as well as gp54 Biological activity of 48-127 antibody specifically recognizing Ag-expressing cells (T24) Has been saved. Thus, this result indicates that nEryt is a target for specific cells. Demonstrate the possibilities. The nEr we next tested according to the capture method of Example 6 yt-SMCC-4812 It should be noted that similar results were obtained with 7. Example 15   Conjugation of monoclonal antibodies with nEryt using SPDP as binding arm   N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPD Conjugation of P) with nEryt   First, N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate ( A fresh solution of SPDP, 20 mM (1 mg SPDP) was added to methanol (16 0 μl). 3 mg of nEryt was added to 500 μl of pH 7.4 PBS. And 150 μl (1 μmol) of SPDP was added. Gently suspend the suspension Incubate for 30 minutes at 30 ° C. with stirring. Mix the mixture with 20 ml of cold P Purified on a PD-10 column that had been pre-equilibrated with BS, pH 7.4. mixture The material was loaded on the column and eluted with cold PBS. Discard the first 2.5 ml (dead volume ), NEryt was collected in the 2.5 ml fraction below. Before the next reaction, remove the specimen Keep on ice.   Conjugation of SPDP with monoclonal antibody 48-127   First, N-succinimidyl 3- (2-pyridyl) was dissolved in methanol (160 μl). Rudithio) propionate (SPDP, 20 mM (1 mg SPDP)) A solution was prepared. The solution was kept at room temperature. 48-12 in PBS (425 μl) A solution of 7 (2.5 mg) was prepared. 120 nmol of SPDP (17 μl) 48-127 solution. Incubate the solution at 30 ° C for 30 minutes while stirring. I did it. Cold acetate buffer (100 mM sodium acetate; 145 mM NaCl, p H4.5) Mix on a PD-10 column pre-equilibrated with 20 ml Things were allowed to separate. Mix on column Load and elute with cold acetate buffer. Discard the first 2.5 ml (dead volume), nEry t was collected in the 2.5 ml fraction below. Keep the samples on ice before the next reaction. Was. The dithiopyridyl portion of the molecule was added to a 190 μl DTT solution (acetate buffer, pH 48-) collected from the column together with a 1M solution of dithiothreitol in 4.5). Incubate the 127-SPDP suspension (3.6 ml) for 20 minutes at room temperature This resulted in reductive cleavage. 10 mM Hepes and 145 mM NaCl The mixture was mixed on a PD-10 column equilibrated with a cold buffer solution containing pH 7.4. Was purified.   Conjugation of modified 48-127 with nEryt-IT derivatives   NEryt-SPDP (3 mg) in cold PBS (2.5 ml, pH 7.4) 1 mg of SPDP-modified 48-127 was added to the suspension. Quiet the mixture And incubated at 4 ° C. for 18 hours with stirring. Cold PBS as eluent, p The mixture was separated on a Sepharose CL6B column using H7.4.   These reactions are based on the “capture” dextran-FITC (molecular weight 4000-2.0). (000,000), but with a modified nEryt composition The product was still shown to be active and stable.   Conclusion   Accordingly, the present invention provides a simple, effective, and effective method for preparing nanoerythrosomes. Teach a quantitative method. According to the teachings of US Pat. No. 5,653,999, Does the purified nanoerythrosome trap various bioactive agents? Or may be captured. A novel method for capturing bioactive agents by nanoerythrosomes is also disclosed Is done. Nanoerythrosomes of the invention that entrap or bind a bioactive agent Is PEGylated (on the membrane of nanoerythrosome by PEG derivative) Further substitution). Several PEG derivatives have been prepared and Conjugated with Noerythrosome. Such a nanoerythrosome-PEG substituted group The product has been shown to abolish the immunogenicity of nanoerythrosomes. In addition, Heterobifunctional PEGs carrying noclonal antibodies can be used to encapsulate dextran- Conjugated to nanoerythrosomes with fluorescent dye conjugates, but in vitro results The PEG-nanoerythrosome composition containing the monoclonal antibody was It was shown that cells expressing the recognized antigen were specifically decorated.   Having described the invention in terms of its preferred embodiments, the appended claims The invention may be modified without departing from the spirit and nature of the invention as defined in the box. .

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１１月６日（１９９８．１１．６） 【補正内容】 小胞の生物学的活性を阻害することなくｎＥｒｙｔの免疫原性ポテンシャルを低 減するのに有用である、ということが判明した。前に述べたように多数の出版物 及び特許がタンパク質又はリポソームに結合するＰＥＧの論題に関して存在する が、しかし本出願は先ず、ｎＥｒｙｔ小胞の完全性を有意に危うくせずにナノエ リスロソームがＰＥＧと結合し得る、ということを示す。ｎＥｒｙｔ−ＰＥＧ結 合技術は、多数のパラメーターが関係するため、開発するのが困難であったこと を指摘しなければならない。 ｎＥｒｙｔ−ＰＥＧ結合の努力の複雑さにしたがって枠組みの設定に役立てる ために、ＰＥＧの以下の一般式及びその説明を示す。 「Ａ」は、ＰＥＧとｎＥｒｙｔ膜中に存在するタンパク質との抱合に関与する 基である。その反応基の組成物は、利用可能な反応基、例えばアミノ基、例えば リシン残基とのＰＥＧ抱合の動力学の制御のために非常に重要である。ｉ）活性 化エステル、例えばスクシ ＳＨ基（即ち、ジステイン残基又はリシンのイミノチオラン誘導体）のために、 タンパク質上に存在する２つの族の求核性試薬をターゲッティングする２種類の 反応基が用いられた。ｎＥｒｙｔ膜は、当業者により、公知の方法で修飾されて 、ＰＥＧ又はその他の物質を抱合する相手として役立ち得る反応基を提供および ／または修飾する。 好ましい態様では、Ａは塩化シアヌル、シアノーゲンハライド（ＢｒまたはＣ ｌ）及びメシル基及びトシル基を含むＯＨ−活性化剤から成る群から選択される 。 他の好ましい態様では、ＡはＺ−Ｃ（Ｒ’）＝ＣＨ2またはＺ−ＣＨ＝ＣＨで も表わすことができ、ＺはＣＯＯＨ、ＨＯ（アルデヒド）、Ｈ、ＯＨ（ヒドロキ シル）、ＮＨ2及びＳＨから成る群から選択される一成員であって、Ｒ’は１〜 ５の炭素原子の低級アルキルである。 他の好ましい態様では、ＡはＤ−Ｃ（＝Ｏ）−でも表わすことができ、ＤはＨ 、Ｎ3、ＯＨ、ＣＨ3、−ＮＨ−ＮＨ2、無水物、混合無水物または活性化エステ ル、たとえば、当業者に知られており、M．Bodanskyにより、「Principles of p eptides synthesis:chapter II，Activation and coupling」（Haftner他、1984 年、Springer-Verlag編、ニューヨーク、pp．９〜52）において定義及び例示さ れているもの、からなる群から選択される一成員である。 他の好ましい態様では、ＡはＱ−（ＣＨ2）oでも表わすことができ、式中、Ｑ ＝−Ｃ＝（Ｏ）、Ｎ、ＳでＯ＝１〜８の炭素原子、好ましくは２〜５の炭素原子 である。特定の０使用は、所望の特定のｎＥｒｙｔ−ＰＥＧ組成物及びその用途 に依存して、熟練者に より容易に適応し得る。一般に０が８より大であると、分子は過脂溶性になる傾 向がある。Ａ基はポリエチレングリコールのＯＨ基を直接にタンパク質に抱合化 する方法は非常に少ないから、重要な基である。１つの例外は、予備実験で用い られた塩化シアヌル誘導体である ＰＥＧをｎＥｒｙｔに結合するのに有用な活性化基のいくつかの例を以下に示 す： 臭化シアン（ＢｒＣＮ）、脱アミノ酸エステル（Zalipsky et al.，1984，「J ．Macromol．Sci．Chem．」A21:8339；Mutter et al.，1979，「The Peptides」 Gross et al.，eds.，2，p.285，Academic Press，New York）、ヒドラジン誘導 体(Rubinstein，1978，米国特許第４，１０１，３８０号；Davis et al.，1979 ，米国特許第４，１７９，３３７号及びPersson et al.，1988，「J．Chromatog 」457:183)、炭酸スクシンイミダジル誘導体（Miron et al.，1993，「Bioconju gate Chem」4:568;Zalipsky et al.，1993，「Bioconjugate Chem.」4:296及びZ alipsky et al.，1991，「Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems」Dunn et al.，編.，ACS，Washington，DC）、オキシカルボニルイミジダゾール誘導体 （Allen et al．，1991，「Biochem．Biophys．Acta」1066:29;及びTondelli et al.，1985，「J．Controlled Release」1:25）、炭酸ニトロフェニル誘導体（S atore et al.，1991，「Appl．Biochem．Biotech．」27:45)、トレシレート誘導 体（Klibanov et al.，1991，「Biochem．Biophys．Acta」1062:142;Delgado et al.，1990，「Biotech．Appl． Biochem．」12:119）、マレイミド誘導体（Kogan，1992，「Synthetic Commun． 」22:2417及びRomani et al.，1984，「Chemistry of Peptides and Proteins」 Volter et la.，編．2．p29，Walter de Gruyter，Berlin）。 その他のＯＨ「活性化剤」、例えばメシル、トシル基から成る群から選択される 一成員である。Ｙが低級アルキル［（ＣＨ2）n；ｎ＝１〜７］の群から選択され る一成員である場合には；Ｑ＝−Ｃ＝（Ｏ）、Ｎ、Ｓである。 「Ｘ」原子は、存在しないかまたは酸素（エーテル）、硫黄（チオエーテル） 原子、又は−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（エステル）、−Ｎ−Ｃ（Ｏ）（アミド）及び−Ｓ− Ｃ（Ｏ）（チオエステル）である。チオアルキル、アルコキシ結合及びアミド生 物学的に安定であるが、しかしながら、エステル及びチオエステル結合は、それ らが多少迅速な動力学を用いて生物学的媒質中で加水分解されるため、非常に不 安定である。加水分解動力学は、Ａ部分の長さに関連する。しかしながら、それ らは、徐放装置として用いられるｎＥｒｙｔの設計に非常に有用であると立証さ れる。ｎＥｒｙｔと生物学的関連分子又は生物活性剤との間の結合が安定である か不安定であるかは、当業者により確定される。概して、安定結合が好ましいけ れども、不安定結合に関する実用性の例としては、ｎＥｒｙｔ組成物を特定位置 に標的化した後に、ｎＥｒｙｔの貪食作用がそれをＰＥＧ分子に連結する結合の 破壊により免疫原性にする、そしておそらくはマクロファージにより生物活性剤 を被包するのが望ましい情況が挙げられるが、これに限定されない。 分子の（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）m部分は、ポリエチレングリコールそれ自体であ る。ｍは、１〜５００のいずれかである。したがって、３５０〜１０，０００の 分子量、好ましくは１，０００〜１０ ，０００、さらに好ましくは２，０００〜５，０００の分子量を有するＰＥＧが 用いられる。 最後に、［（ＣＨ2）n−Ｅ］基は、ｎＥｒｙｔ周囲の媒質に面する。この基の 性質が本発明の用途にとって決定的であることは明らかである。例えば、（ＣＨ2 ）n−Ｅは、ｎＥｒｙｔが簡単な担体（ＤＮＡワクチン）として、又は粘膜（肺 、小腸）を介した吸収のために包含される用途においては、免疫反応を妨げるた めに、好ましくは不活性基、例えばＯＣＨ3であるべきである。しかしながら、 電場（マイクロチップ）におけるｎＥｒｙｔの特異的置換を要する診断用途に関 しては、（ＣＨ2）n−Ｅは正電荷（即ち、−ＮＨ2）又は負電荷（即ち、−ＣＯ ＯＨ）荷電基でなければならない。（ＣＨ2）n−Ｅはさらに、ポリエチレングリ コール誘導体が生物学的関連分子、例えば抗体を細胞又は特定の器官を標的にす るために結合し、その一方でｎＥｒｙｔの固有の免疫原正を阻害するのに必要と される場合には、ＳＨ、２−チオピリジル又はマレイミドのような基である。前 記の点から見て、［（ＣＨ2）n−Ｅ］基の性質は特定の用途又は使用の特別な必 要性を満たすよう適応される、ということは、当業者には容易に明らかになる。 好ましくは、ｎ＝１〜７個の炭素原子である。 Ｅは、Ｈ、ＣＯＯＨ、ＰＯ4、ＳＯ3Ｈもしくは複素環またはＷＲ（式中、Ｗは Ｏ、Ｎ、Ｓ、−Ｃ＝Ｏから成る群から選択される一成員である）から成る群から 選択される一成員であり、式中、 Ｗ＝−Ｏ−である場合、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有する低級アルキル 又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ”（ここで、Ｒ”はポリアミン誘導体、 例えばスペルミン、スペルミジン又はプトレセインである）から成る群から選択 される一成員である。 Ｗ＝−Ｎ−である場合には、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有 する低級アルキル又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ”（ここ で、Ｒ”はスペルミン、スペルミジン又はプトレセインから得られるポリアミン である）、１個又は２個のＣＯＯＨ、ＳＯ3Ｈ又はＰＯ4基を保有する１〜６個の 炭素原子の低級アルキルから成る群から選択される一成員である。 Ｗ＝−Ｓ−である場合、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有する低級アルキル 又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ”（ここで、Ｒ”はスペル ミン、スペルミジン又はプトレセインから得られるポリアミンである）から成る 群から選択される一成員である。 Ｗ＝−Ｃ（＝Ｏ）−である場合、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有する低級 アルキル又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ”（ここで、Ｒ”はスペルミン 、スペルミジン又はプトレセインから得られるポリアミンである）から成る群か ら選択される一成員である。 Ｒ2基（ここで、Ｒ2＝−ＣＯＯＨ、ＰＯ4 2-、ＳＯ3Ｈ、ＮＨ2）を有するか、 又は多価陰イオン又は多価カチオン分子、例えばスペルミン、ヘパリン等で置換 されるＰＥＧを抱合することにより可能である（ＰＥＧの一般式参照）。 概して、本発明のポリエチレングリコール誘導体は、以下の一般式により示さ れる： Ａ-Ｘ-（ＣＨ2-ＣＨ2-Ｏ）m-（ＣＨ2）n-Ｅ Ａは、塩化シアヌル、ハロゲン化シアン（ＢｒまたはＣｌ）及びメシル基、ト シル基を含むＯＨ−活性化剤、Ｚ−Ｃ（Ｒ’）＝ＣＨ2またはＺ−ＣＨ＝ＣＨ〔 式中、ＺはＣＯＯＨ、ＨＯ（アルデヒド）、Ｈ、ＯＨ（ヒドロキシル）、ＮＨ2 及びＳＨから成る群から選択される一成員で、Ｒ’は炭素原子１〜５の低級アル キル〕、Ｄ−Ｃ（＝Ｏ）〔式中、ＤはＨ、Ｎ3、ＯＨ、ＣＨ3、−ＮＨ−ＮＨ2、 無水物、混合無水物または活性化エステル、たとえば、当業者に知られており、 M．Bodanskyにより、「Principles of peptides synthesis:chapter II，Activa tion and coupling」（Haftner他、1984年、Springer-Verlag編、ニューヨーク 、pp．９〜52）において定義及び例示されているもの、から成る群から選択され る一成員である〕、Ｑ−（ＣＨ2）o（式中、Ｏ＝１〜７でＱ＝−Ｃ＝Ｏ、Ｎ、Ｓ で、Ｏ＝１〜８炭素原子、好ましくは２〜５の炭素原子である）から成る群から 選択される一成員である。特定のＯの使用は所望の特定のｎＥｒｙｔ−ＰＥＧ組 成物及びその用途に依存して、熟練者により容易に適応し得る。一般にＯが８よ りも大きいと分子が過脂溶性になる傾向がある。 ＰＥＧをｎＥｒｙｔに結合するのに有用な活性化基のいくつかの例を以下に示 す：臭化シアン（ＢｒＣＮ）、脱アミノ酸エステル（Zalipsky et al.，1984， 「J．Macromol．Sci．Chem．」A21:8339;Mutter et al.，1979，「The Peptides 」Gross et al.，編.，2，p.285，Academic Press，New York）、ヒドラジン誘 導体（Rubinstein，1978，米国特許第４，１０１，３８０号；Davis et al.，19 79,米国特許第４，１７９，３３７号及びPersson et al.，1988，「J．Chromato g．」457:183）、炭酸スクシンイミダジル誘導体（Miron et al.，1993，「Bioc onjugate Chem．」4:568;Zalipsky et al.，1993，「Bioconjugate Chem．」4:2 96及びZalipsky et al.，1991，「Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems 」Dunn et al.,編.，ACS，Washington，DC）、オキシカルボニルイミジダゾール 誘導体（Allen et al.，1991「Biochem．Biophys．Acta」1066:29;及びTondelli et al.，1985，「J．Controlled Release」1:25）、炭酸二トロフェニル誘導体 （Satore et al.，1991，「Appl．Biochem．Biotech．」27:45）、トレシレート 誘導体（Klibanov et al.，1991，「Biochem．Biophys．Acta」1062:142;Delgad o et al.，1990，「Biotech．Appl．Biochem．」12:119）、マレイミド誘導体（ Kogan，1992，「Synthetic Commun．」22:2417及びRomani et al.，1984，「Che mistry of Peptides and Proteins」Volter et la.，編．2．p29，Walter de Gr uyter，Berlin）； Ｏ（ＣＨ2−ＣＨ2Ｏ）mはポリエチレングリコールであり（この場合、ｍ ＝２〜５００）； ｎ＝１〜７炭素原子； Ｅは、Ｈ、ＣＯＯＨ、ＰＯ4、ＳＯ3Ｈもしくは複素環またはＷＲ（式中、 ＷはＯ、Ｎ、Ｓ、−Ｃ＝Ｏから成る群から選択される一成員であり）から成る群 から選択される一成員であり、式中、 Ｗ＝−Ｏ−である場合、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有する低級アル キル又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ”（ここで、Ｒ”はポリアミン誘導 体、例えばスペルミン、スペルミジン又はプトレセインである）から成る群から 選択される一成員であり； Ｗ＝−Ｎ−である場合には、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有する低級 アルキル又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ”（ここで、Ｒ” はスペルミン、スペルミジン又はプトレセインから得られるポリアミンである） 、１個又は２個のＣＯＯＨ、ＳＯ3Ｈ又はＰＯ4基を保有する１〜６個の炭素原子 の低級アルキルから成る群から選択される一成員であり； Ｗ＝−Ｓ−である場合、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有する低級アル キル又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ”（ここで、Ｒ”はス ペルミン、スペルミジン又はプトレセインから得られるポリアミンである）から 成る群から選択される一成員であり； Ｗ＝−Ｃ（＝Ｏ）−である場合、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有する 低級アルキル又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ”（ここで、Ｒ”はスペル ミン、スペルミジン又はプトレセインから得られるポリアミンである）から成る 群から選択される一成員である。 前記の一般式中、Ａは、多数の反応基、例えばシアヌリルクロリド誘導体、ア ルデヒド、スクシンイミド、ベンズイミダゾール、対称ジスルフィド、ヘテロニ 官能性ＰＥＧであり、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）mは分子量約３５０〜約１０，０００で −（ＣＨ3）n＝ＣＨ3 である。 本開示から、「生物学的関連物質」及び「生物活性剤」とは、薬物、分子、ペ プチド、タンパク質、核酸配列及び蛍光色素又はその 他の標識分子、及びＰＥＧを包含するよう広義に用いられるが、これらに限定さ れない、と理解される。「ＰＥＧ」という用語は、ＰＥＧ誘導体を含むよう意図 される、と理解される。 本発明のｎＥｒｙｔは、生物活性剤と結合して、このような薬物のための担体 を形成する。特に、小胞は生物活性剤、例えば薬物と結合して、生物活性剤が必 要な身体の位置に有効に供給されるように生物活性剤の投与のための担体を提供 し得る。小胞は、天然物質、生分解性、非免疫原性又は中等度の免疫原性ポテン シャルを有する、非毒性及び非発熱性、血液と完全相溶性、及び自系投与に適応 性である。本明細書中及び添付の請求の範囲において、自系投与という用語は、 哺乳類に投与されるナノエリスロソームが相溶性赤血球又は血液供給から得られ る赤血球から調製されていた（同一哺乳類；即ち同一患者への及びそれからの投 与を含む）ことを意味すると解釈されるべきである。ナノエリスロソームの非自 系投与を意図する場合、ｎＥｒｙｔの免疫原性ポテンシャルを低減するのが好ま しいけれども、免疫抑制又は非免疫抑制哺乳類へのその免疫反応性を低減するた めの処置を伴わないｎＥｒｙｔの投与も、ある情況では意図される。 結合は、小胞の反応部位と反応する一次基、及び生物活性剤上の反応基と反応 する二次基を有するカップリング剤を用いて成し遂げられる。生物活性剤をナノ エリスロソームに結合する多数の方法が存在し、当業界で十分公知である。これ らの例としては、十分公知の架橋試薬、例えばホモ二官能価又はヘテロ二官能価 型の二官能価試薬が挙げられるが、これらに限定されない。その例を以下に示す アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシ スクシンイミド； Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−［２’−ピリジル ジチオ］プロピオンアミド； ｐ−アジドフェニル グリオキサル一水和物； ４−［ｐ−アジドサリチルアミド］ブチルアミン； １−［ｐ−アジドサリチルアミド］−４−［ヨードアセトアミド］ブタン； ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド； ビスマレイミドヘキサン； ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート； ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシ）エチル］スルホン； ビス「２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホ ン； 実施例１ 血漿及びバッフィーコート（白血球）の除去 哺乳類ドナー（ウマ、ウシ、ブタ、ヒト等）からの血液（２ｘ３０ｍｌ）を５ ００’×ｇ（１５００ｒｐｍ）で４℃で１０分間、遠心分離した。血漿及びバッ フィーコートを吸引により除去した。液体を除去して、４℃で等容量のリン酸緩 衝食塩水（ＰＢＳ）（５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐ Ｈ７．４）と置き換えた。試験管を何度か逆さにして、混合物を静かに均質にし た。次に、血液を５００×ｇで４℃で１０分間、再遠心分離した。ここに記載し た一連の手順を３回繰り返した。 以下のプロトコールは各々、滅菌条件下で実行した。 実施例２ 赤血球ゴースト低張衝撃物の調製 方法２．１ 実施例１に記載したように処理した血液５ｍｌを３５ｍｌ（５０ｍｌ Nalgen eTM試験管中）の低張緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム）、ｐＨ７．４に付加し た。赤血球懸濁液を、２５，０００×ｇで４℃で２０分間、遠心分離した。 上清を吸引し、捨てた。除去した低張緩衝液の容量を同一容量の新鮮な緩衝液 に置き換えて、懸濁液を再び遠心分離した。上清がわずかに着色するまで、この 手順を３回繰り返した。ペレットを５ｍｌのＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中、４℃ に懸濁した。ホワイトゴースト懸濁液をプールし、２０分間の遠心分離（２０， ０００×ｇ）により濃縮して、必要になるまで４℃で保持した。 方法２．２ 実施例１で処理したような７０ｍｌの血液を、低張リン酸又は炭酸緩衝液（２ ．５ｍＭ）（２ｍＭ Ｎａ3ＰＯ4；氷酢酸を用いてｐＨ調整）、ｐＨ１０〜１１ を用いて、セファロースＣＬ６Ｂ（ＣＬ４Ｂも）又はセファクリルＳ４００カラ ム（例えば、１０ｃｍ×３０ｃｍ）でクロマトグラフィー処理した。ホワイトゴ ーストを先ず収集し（死容量）、次にヘモグロビンをカラム上に保持した。酢酸 を用いてｐＨを７．４とし、前記のような遠心分離によりゴーストを濃縮した。 クロマトグラフィー処理により、ヘモグロビンを含有しないホワイトゴースト７ ０ｍｇを得た（１ｍｇ／ｍｌの「洗浄血液」）。 実施例３ ナノエリスロソーム（ｎＥｒｙｔ）の調製 方法３．１ 米国特許第５，６５３，９９９号に記載されているようにして、ナノエリスロ ソームを調製した。約１μｍの孔を有するポリカルボネートフィルターを通して ゴーストが押し出される、ということを指摘することは重要である。ポリカルボ ネートフィルターは、ナノエリスロソームに粘着しないという利点を有する。ゴ ーストを等張懸濁液から、窒素圧下で押し出した。懸濁液は、好ましくは４回押 し出される。 方法３．２ この手法は、前記の３．１とは有意に異なる。それは、より速く、且つナノエ リスロソームのより良好な収率を生じるという利点を提供する。さらに、それは 大規模生産により容易に利用可能である。 実施例６ 捕獲（閉じ込め）分子を有するｎＥｒｙｔの精製 方法６．１ 捕獲処理後、１ｍｌの冷（４℃）ＰＢＳ（等張、ｐＨ７．４）で３〜５回希釈 し、１６，０００×ｇで８分間遠心分離して、上清を取り除き、ＰＢＳで再び希 釈して、ｎＥｒｙｔを未閉込め分子から遊離した。 方法６．２ 捕獲処理後、十分公知の方法により適切なセファデックス又はセファクリルカ ラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーにより、遊離分子を遅延させ、ｎＥ ｒｙｔの溶離を迅速にして、未閉じ込め分子からｎＥｒｙｔを遊離させた。捕獲 （閉じ込め）物質を、適切な洗剤を用いてｎＥｒｙｔを可溶化後に、通常の方法 （閉じ込められている分子に適応）により評価した。 安定性 捕獲により、デキストラン−ＦＩＴＣ−ｎＥｒｙｔの懸濁液が、４℃で保持さ れると少なくとも７ヶ月間安定であるという事実によって立証されたように、安 定なナノエリスロソーム−生物活性剤組成物が形成された。さらに、ＤＮＡの閉 じ込めを実行した。手短に言えば、ＰＢＳ（５００μｌ）中に懸濁した２００ｎ ｇのｎＥｒｙｔを、ＴＫＮ緩衝液（リン酸塩を排除するために）で３回洗浄した 。ＴＫＮ緩衝液（１０〜３００μｌ）中のＤＮＡ（３０〜３２０ｎｇ）を懸濁液 に付加し、静かにホモジナイズした。懸濁液を４℃で１０分間インキュベートし 、液体窒素中で２分間凍結し、その後２ ５℃で４分間インキュベートした。ＴＫＮＭ緩衝液を用いて、前記のように懸濁 液を処理した。 ＤＮアーゼ（０．１Ｕ／μｌのＤＮアーゼＩ溶液 １００μｌ）を含有する反 応混合物をインキュベートして、余分のＤＮＡを迅速に除去した。Ｍｇ2+（１０ ｍＭ）又はＭｎ2+（１ｍＭ）を混合物に付加した。 ＤＮアーゼで清浄にした後、ＰＣＲの慣用的プロトコールを用いてｎＥｒｙｔ −ＤＮＡを増幅し、ｎＥｒｙｔ内のベクターの存在を確証した。 表１ 本明細書中に記載した技術を用いて、これらの例は、ｎＥｒｙｔによる捕獲の 典型的結果を説明するが、これは同様の濃度の小型及び大型分子を反映する。 初期濃度 ｎＥｒｙｔ 捕獲分子 デキストラン−４０００FITC （mg／ml） （μｇ／ｍｇナノ） （mg／ml） 2.6 1.3 15.6 2.6 2.6 13.4 2.6 3.9 12.1 ＤＮＡ（μｇ／ml）* 1.3 4 0.003 13 4 0.066 65 4 0.153 *線状（３ｋｂ）又は超螺旋ＤＮＡに関して、同様の結果が得られた。 したがって、表１は、ｎＥｒｙｔによる捕獲の典型的結果を説明するこれらの 例を示す。これは同様の濃度の小型及び大型分子を反 映している。 請求の範囲 １．式 ｎＥｒｙｔ−Ａ−Ｘ−（ＣＨ2-ＣＨ2-Ｏ）m−（ＣＨ2）n−Ｅのナノエリスロ ソーム（ｎＥｒｙｔ）−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）抱合体であって、 式中、ａ）（ＣＨ2-ＣＨ2-Ｏ）mはポリエチレングリコール誘導体であって、 ｍは２〜５００の整数、 ｂ）ｎは０〜７の整数、 ｃ）Ａは反応性基及び／または結合腕、 ｄ）Ｘはないかまたは酸素原子、硫黄原子、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）、−Ｎ−Ｃ（Ｏ） 及び−Ｓ−Ｃ（Ｏ）から成る群から選択され、 ｅ）Ｅは媒体相互作用基及び／または標的基である、前記抱合体。 ２．前記Ａが活性化エステル基またはＳＨ基から選択される請求項１のナノエ リスロソーム−ポリエチレングリコール抱合体。 ３．Ａが前記ＰＥＧ及び前記ｎＥｒｙｔの複合化を可能にする結合腕である請 求項１または２のナノエリスロソーム−ポリエチレングリコール抱合体。 ４．請求項１，２または３のナノエリスロソーム−ポリエチレングリコール抱 合体であって、式中、Ａは、 − シアヌリルクロリド誘導体、ハロゲン化シアン（ＢｒまたはＣｌ）、メシ ル基及びトシル基を含むＯＨ−活性化剤、アルデヒド、スクシンイミド、スクシ ンイミドベンズイミダゾール、マレイミド、対称ジスルフィド及びヘテロ二官能 性ＰＥＧ、 − Ｚ−Ｃ（Ｒ’）＝ＣＨ2またはＺ−ＣＨ＝ＣＨで、式中、ＺはＣＯＯＨ、 ＨＯ（アルデヒド）、Ｈ、ＯＨ（ヒドロキシル）、ＮＨ2及びＳＨから成る群か ら選択される１成員であって、式中、Ｒ’は１〜５の炭素原子の低級アルキル基 、 − Ｄ−Ｃ（＝Ｏ）−、式中、ＤはＨ、Ｎ3、ＯＨ、ＣＨ3、−ＮＨ−ＮＨ2、 無水物、混合無水物または活性化エステルから成る群から選択される１成員であ る、及び − Ｑ−（ＣＨ2）o、式中、Ｏ＝１〜８でＱ＝−Ｃ＝Ｏ、Ｎ、Ｓ、 から成る群から選択される１成員である、前記抱合体。 ５．請求項１，２，３または４のナノエリスロソーム−ポリエチレングリコー ル複合体であって、Ｅは不活性基、正荷電した基、負荷電した基及び反応性基か ら成る群から選択される、前記抱合体。 ６．請求項１，２，３，４または５のナノエリスロソーム−ポリエチレングリ コール複合体であって、式中、Ｅは、 − Ｈ、ＣＯＯＨ、ＰＯ4、ＳＯ3Ｈ及び複素環、 − ＷＲ、式中、ＷはＯ、Ｎ、Ｓ、−Ｃ（＝Ｏ）から成る群から選択される１ 成員であり、 Ｗ＝−Ｏ−のとき、 −ＲはＨ、１〜７の炭素原子の低級アルキルまたはシクロアルキル、−Ｃ（＝ Ｃ）−Ｒ”から成る群から選択される１成員で、Ｒ”はポリアミン誘導体、たと えば、スペルミン、スペルミジンまたはプトレセインであり、 Ｗ＝−Ｎ−のとき、 − ＲはＨ、１〜７の炭素原子の低級アルキルまたはシクロアルキル、−Ｃ（ ＝Ｏ）− −Ｃ（＝Ｏ）Ｒ”から成る群から選択される１成員で、Ｒ”はスペル ミン、スペルミジンもしくはプトレセイ ン由来のポリアミンまたは１もしくは２のＣＯＯＨ、ＳＯ3ＨまたはＰＯ4基を保 有する１〜６の炭素原子の低級アルキル鎖、 Ｗ＝−Ｓ−のとき、 −ＲはＨ、１〜７の炭素原子の低級アルキルまたはシクロアルキル、−Ｃ（＝ Ｏ）− −Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ”から成る群から選択される１成員であり、Ｒ”はス ペルミン、スペルミジンまたはプトレセイン由来のポリアミンであり、 Ｗ＝−Ｃ（＝Ｏ）−のとき、 − ＲはＨ、１〜７の炭素原子の低級アルキルまたはシクロアルキル、−Ｏ− −Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ”で、Ｒ”はスペルミン、スペルミジンまたはプトレセイン である、 から成る群から選択される１成員である、前記抱合体。 ７．請求項１，２，３，４，５または６のナノエリスロソーム−ポリエチレン グリコール抱合体であって、Ａが塩化シアヌルで、（ＣＨ2−ＣＨ2Ｏ）mが分子 量約３５０〜約１０，０００を有し、−（ＣＨ2）n−Ｅ＝ＣＨ3である、前記抱 合体。 ８．（ＣＨ2−ＣＨ2Ｏ）mが分子量約１，０００〜約７，０００を有する請求 項７のナノエリスロソーム−ポリエチレングリコール抱合体。 ９．（ＣＨ2−ＣＨ2Ｏ）mが分子量約２，０００〜約５，０００を有する請求 項８のナノエリスロソーム−ポリエチレングリコール抱合体。 10．請求項１，２，３，４，５または６のナノエリスロソーム−ポリエチレン グリコール抱合体であって、Ａはシアヌリルクロリド誘導体、アルデヒド、スク シンイミド、スクシンイミドベンズイミダゾール、マレイミド、対称ジスルフィ ド及びヘテロ二官能性ＰＥＧから選択され、（ＣＨ2−ＣＨ2Ｏ）mが分子量約３ ５０〜約１ ０，０００を有しており、−（ＣＨ2）n−Ｅ＝ＣＨ3である前記抱合体。 11．請求項１，２，３，４，５，６，７，８，９または10のナノエリスロソー ム−ポリエチレングリコール抱合体であって、前記ナノエリスロソームが配位子 に結合しており、前記配位子は前記ナノエリスロソームを前記配位子のためのレ セプターに対して標的にする、前記抱合体。 12．有意に低減した免疫ポテンシャルを有するナノエリスロソーム組成物であ って、前記組成物は前記ナノエリスロソームに抱合されたＰＥＧ誘導体を含むこ とを特徴とする前記組成物。 13．哺乳動物からの赤血球からのナノエリスロソームの調製に適切なホワイト ゴーストを生産する方法であって、二価及び／または三価のカチオンを含まない 、pH約８〜約１１の低張水性緩衝溶液を用いて、適切なクロマトグラフィーを含 有するカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーを含む前記方法。 14．請求項13の方法であって、さらに、真空下、２つのフィルターを通して、 前記請求項13のホワイトゴーストを濾過し、それにより、ナノエリスロソームを 得、前記ナノエリスロソームを濃縮または凍結乾燥する工程を含む前記方法。 15．式 ｎＥｒｙｔ−Ｈ−Ｔのナノエリスロソーム抱合体であって、 式中、ａ）Ｈはヘテロ官能性結合腕で、 ｂ）Ｔは標的基である、前記抱合体。 16．ＡがＳＭＣＣ及びＳＰＤＰからなる群から選択される請求項15のナノエリ スロソーム抱合体。 17．請求項15または16のナノエリスロソーム複合体であって、式中、Ｔは配位 子で、前記配位子は前記ナノエリスロソームを前記配 位子のためのレセプターに対する標的にする、前記抱合体。 18．請求項15，16または17のナノエリスロソーム抱合体であって、さらに前記 ナノエリスロソームを前記標的基に結合する、結合腕を含む前記抱合体。 19．請求項15，16，17または18のナノエリスロソーム抱合体であって、さらに 前記ナノエリスロソームに結合されるかまたはそれに閉じ込められた生物活性剤 を含む前記抱合体。 20．請求項１，２，３，４，５，６，７，８，９，10，11または12のナノエリ スロソーム−ポリエチレングリコール抱合体であって、さらに前記ナノエリスロ ソーム結合されるか、またはそれに閉じ込められた生物活性剤を含む前記抱合体 。 21．請求項11のナノエリスロソーム−ポリエチレングリコール抱合体であって 、前記配位子が抗体またはその一部分であり、前記レセプターが前記抗体または その一部分により認識される抗原である、前記抱合体。 22．請求項17，18または19のナノエリスロソーム−ポリエチレングリコール抱 合体であって、前記配位子は抗体またはその一部分であって、前記レセプターが 前記抗体またはその一部分により認識される抗原である、前記抱合体。 23．請求項１，２，３，４，５，６，７，８，９，10，11，12，15，16，17， 18，19，20，21または22に記載のナノエリスロソーム抱合体といっしょに医薬と して許容し得る担体を含む医薬組成物。 24．請求項１，２，３，４，５，６，７，８，９，10，11，12，15，16，17， 18，19，20，21または22のナノエリスロソーム抱合体の動物における病気または 健康状態の防止または処置のための使用。 25．少なくとも１つの上記ナノエリスロソーム組成物を含む診断 キット。 26．動物における予定症状または健康状態を診断または予測するための上記ナ ノエリスロソーム組成物の１つを含むバイオアッセイ。[Procedure of Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Submission date] November 6, 1998 (1998. 11.6) [Correction contents] Reduces the immunogenic potential of nEryt without inhibiting vesicle biological activity Has been found to be useful in reducing emissions. Numerous publications as mentioned earlier And patents exist on the topic of PEG binding to proteins or liposomes However, the present application firstly described nanoemission without significantly compromising the integrity of the nEryt vesicles. Figure 4 shows that lithrosomes can bind to PEG. nEryt-PEG The technology was difficult to develop due to the large number of parameters involved Must point out.   Help set the framework according to the complexity of nEryt-PEG conjugation efforts For this purpose, the following general formula of PEG and its description are shown.   "A" is involved in the conjugation of PEG with proteins present in the nEryt membrane Group. The composition of the reactive groups may include any available reactive groups, e.g., amino groups, e.g., It is very important for controlling the kinetics of PEG conjugation with lysine residues. i) activity Ester, such as sushi For the SH group (ie, a distaine residue or an iminothiolane derivative of lysine) Two types of targeting of two families of nucleophiles present on proteins Reactive groups were used. The nEryt membrane can be modified by those skilled in the art in a known manner. Provide reactive groups that can serve as partners for conjugating PEG or other substances and And / or modify.   In a preferred embodiment, A is cyanuric chloride, cyanogen halide (Br or C l) and OH-activators containing mesyl and tosyl groups .   In another preferred embodiment, A is ZC (R ') = CHTwoOr with Z-CH = CH Wherein Z is COOH, HO (aldehyde), H, OH (hydroxy Sill), NHTwoAnd SH is a member selected from the group consisting of It is a lower alkyl of 5 carbon atoms.   In another preferred embodiment, A can also be represented by DC (= O)-and D is H , NThree, OH, CHThree, -NH-NHTwo, Anhydride, mixed anhydride or activated esthetic For example, as known to those skilled in the art, According to Bodansky, "Principles of p eptides synthesis: chapter II, Activation and coupling ”(Haftner et al., 1984) Year, Springer-Verlag, New York, pp. 9-52) Definitions and examples A member selected from the group consisting of:   In another preferred embodiment, A is Q- (CHTwo)oWhere Q is = -C = (O), N, S, O = 1-8 carbon atoms, preferably 2-5 carbon atoms It is. The specific 0 use is the specific nEryt-PEG composition desired and its use. Depends on the skilled person Can be more easily adapted. Generally, if 0 is greater than 8, the molecule will tend to be hyperlipidsoluble. There is a direction. A group conjugates OH group of polyethylene glycol directly to protein This is an important group because there are very few ways to do it. One exception is used in preliminary experiments Is a cyanuric chloride derivative  Some examples of activating groups useful for attaching PEG to nEryt are shown below. You:   Cyanogen bromide (BrCN), deamino acid ester (Zalipsky et al., 1984, "J . Macromol. Sci. Chem. "A21: 8339; Mutter et al., 1979, "The Peptides" Gross et al., Eds.,Two, P.285, Academic Press, New York), hydrazine induction Body (Rubinstein, 1978, U.S. Patent No. 4,101,380; Davis et al., 1979). U.S. Patent No. 4,179,337 and Persson et al., 1988, "J. Chromatog. "457: 183), succinimidazyl carbonate derivatives (Miron et al., 1993, "Bioconju gate Chem "Four: 568; Zalipsky et al., 1993, "Bioconjugate Chem."Four: 296 and Z alipsky et al., 1991, "Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems" Dunn et al., eds., ACS, Washington, DC), oxycarbonylimidazole derivatives (Allen et al., 1991, "Biochem. Biophys. Acta" 1066: 29; and Tondelli et al.  al., 1985, "J. Controlled Release"1: 25), Nitrophenyl carbonate derivative (S atore et al., 1991, "Appl. Biochem. Biotech."27: 45), tresylate induction (Klibanov et al., 1991, "Biochem. Biophys. Acta")1062: 142; Delgado et  al., 1990, "Biotech. Appl. Biochem. "12: 119), a maleimide derivative (Kogan, 1992, "Synthetic Commun. "twenty two: 2417 and Romani et al., 1984, Chemistry of Peptides and Proteins. Volter et la., Ed.Two. p29, Walter de Gruyter, Berlin). Other OH "activators", for example selected from the group consisting of mesyl, tosyl groups He is a member. Y is a lower alkyl [(CHTwo)nN = 1 to 7]. Q = -C = (O), N, S.   The "X" atom is absent or oxygen (ether), sulfur (thioether) Atom, or -OC (O) (ester), -NC (O) (amide) and -S- C (O) (thioester). Thioalkyl, alkoxy bond and amide Physically stable, however, the ester and thioester linkages Are very hydrolyzed in biological media using somewhat faster kinetics, It is stable. Hydrolysis kinetics is related to the length of the A portion. However, it Have proven very useful in the design of nEryt for use as a sustained release device. It is. Stable binding between nEryt and biologically relevant molecule or bioactive agent Whether it is unstable or not is determined by one skilled in the art. In general, if a stable bond is preferred However, as an example of the utility for labile bonds, nEryt compositions are After targeting to PEG, the phagocytosis of nEryt is Makes immunogenic by destruction, and probably bioactive by macrophages Include, but are not limited to, situations in which it is desirable to encapsulate   The molecule (CHTwo-CHTwo-O)mThe part is polyethylene glycol itself You. m is any of 1 to 500. Therefore, 350 to 10,000 Molecular weight, preferably 1,000-10 PEG having a molecular weight of 2,000, more preferably 2,000 to 5,000 Used.   Finally, [(CHTwo)nThe -E] group faces the medium around nEryt. Of this group It is clear that the properties are critical for the use of the present invention. For example, (CHTwo )n-E as nEryt as a simple carrier (DNA vaccine) or mucosa (pulmonary In applications that are included for absorption through the small intestine), they may interfere with the immune response. For example, preferably an inert group such as OCHThreeShould be. However, For diagnostic applications requiring specific replacement of nEryt in electric fields (microchips) Then, (CHTwo)n-E is a positive charge (ie, -NHTwo) Or negative charge (ie, -CO OH) It must be a charged group. (CHTwo)n-E is polyethylene glycol. Cole derivatives target biologically relevant molecules, such as antibodies, to cells or specific organs Required to bind to, while inhibiting the intrinsic immunogenicity of nEryt If so, it is a group such as SH, 2-thiopyridyl or maleimide. Previous In view of the above, [(CHTwo)n-E] group depends on the particular application or use. It will be readily apparent to one skilled in the art that it is adapted to meet the needs. Preferably, n = 1 to 7 carbon atoms.   E is H, COOH, POFour, SOThreeH or a heterocyclic ring or WR (where W is O, N, S, is a member selected from the group consisting of -C = O) A member to be selected, where:   When W = —O—, R is: H, lower alkyl having 1 to 7 carbon atoms. Or cycloalkyl, -C (= O) -R "(where R" is a polyamine derivative, For example, spermine, spermidine or putrescein). It is a member who is done.   When W = -N-, R is: H, having 1 to 7 carbon atoms. Lower alkyl or cycloalkyl, —C (＝ O) —C (＝ O) —R ″ (where And R ″ is a polyamine obtained from spermine, spermidine or putrescein One or two COOH, SOThreeH or POFour1 to 6 holding groups A member selected from the group consisting of lower alkyl of carbon atoms.   When W = -S-, R is: H, lower alkyl having 1 to 7 carbon atoms. Or cycloalkyl, -C (= O) -C (= O) -R "(where R" is a spelling A polyamine obtained from min, spermidine or putrescein) A member selected from the group.   When W = —C (＝ O) —, R is: H, lower having 1 to 7 carbon atoms. Alkyl or cycloalkyl, -C (= O) -R "(where R" is , Spermidine or polyamines obtained from putrescein). Member selected from   RTwoGroup (where RTwo= -COOH, POFour 2-, SOThreeH, NHTwo) Or Or substituted with a polyanion or a polycation molecule, such as spermine, heparin, etc. This is possible by conjugating the PEG (see the general formula of PEG).   Generally, the polyethylene glycol derivatives of the present invention are represented by the following general formula: Is:   AX- (CHTwo-CHTwo-O)m-(CHTwo)n-E   A represents cyanuric chloride, cyanogen halide (Br or Cl) and a mesyl group, OH-activator containing a sil group, ZC (R ') = CHTwoOr Z-CH = CH [ Wherein Z is COOH, HO (aldehyde), H, OH (hydroxyl), NHTwo And SH is a member selected from the group consisting of: Kill], DC (= O) [where D is H, NThree, OH, CHThree, -NH-NHTwo, Anhydrides, mixed anhydrides or activated esters, for example, as known to those skilled in the art, M. "Principles of peptides synthesis: chapter II, Activa tion and coupling ”(Haftner et al., 1984, Springer-Verlag, New York) , Pp. 9-52) selected from the group consisting of those defined and exemplified in ), Q- (CHTwo)o(Where O = 1-7 and Q = -C = O, N, S Wherein O = 1-8 carbon atoms, preferably 2-5 carbon atoms) Member of choice. The use of a particular O depends on the particular nEryt-PEG set desired. Depending on the product and its use, it can be more easily adapted by the skilled worker. Generally O is 8. If the molecular weight is too large, the molecules tend to be fat soluble.   Some examples of activating groups useful for attaching PEG to nEryt are shown below. C: cyanogen bromide (BrCN), deamino acid ester (Zalipsky et al., 1984, "J. Macromol. Sci. Chem."A21: 8339; Mutter et al., 1979, "The Peptides Gross et al., Ed.,Two, P.285, Academic Press, New York) Conductors (Rubinstein, 1978, U.S. Pat. No. 4,101,380; Davis et al., 19) 79, U.S. Patent No. 4,179,337 and Persson et al., 1988, "J. Chromato. g. "457: 183), succinimidazyl carbonate derivatives (Miron et al., 1993, "Bioc onjugate Chem. "Four: 568; Zalipsky et al., 1993, "Bioconjugate Chem."Four: 2 96 and Zalipsky et al., 1991, "Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems Dunn et al., Ed., ACS, Washington, DC), oxycarbonylimidazole. Derivatives (Allen et al., 1991 "Biochem. Biophys. Acta"1066: 29; and Tondelli  et al., 1985, "J. Controlled Release"1: 25), ditrophenyl carbonate derivative (Satore et al., 1991, Appl. Biochem. Biotech.)27: 45), tresylate Derivatives (Klibanov et al., 1991, “Biochem. Biophys. Acta”1062: 142; Delgad o et al., 1990, "Biotech. Appl. Biochem."12: 119), maleimide derivative ( Kogan, 1992, "Synthetic Commun."twenty two: 2417 and Romani et al., 1984, "Che mistry of Peptides and Proteins "Volter et la., Ed.Two. p29, Walter de Gr uyter, Berlin);       O (CHTwo-CHTwoO)mIs polyethylene glycol (in this case, m = 2-500);       n = 1 to 7 carbon atoms;       E is H, COOH, POFour, SOThreeH or a heterocyclic ring or WR (wherein W is a member selected from the group consisting of O, N, S, -C = O) A member selected from the formula:       When W = —O—, R is: H, lower alkyl having 1 to 7 carbon atoms. Kill or cycloalkyl, -C (= O) -R "(where R" is a polyamine derivative) The body, for example spermine, spermidine or putrescein). Member of choice;       When W = -N-, R is: H, lower having 1 to 7 carbon atoms. Alkyl or cycloalkyl, -C (= O) -C (= O) -R "(where R" Is a polyamine obtained from spermine, spermidine or putrescein) One or two COOH, SOThreeH or POFour1 to 6 carbon atoms carrying group A member selected from the group consisting of: lower alkyl;       When W = -S-, R is: H, lower alkyl having 1 to 7 carbon atoms. Alkyl or cycloalkyl, -C (= O) -C (= O) -R "(where R" is Is a polyamine obtained from permine, spermidine or putrescein) A member selected from the group consisting of:       When W = —C (＝ O) —, R is: H, having 1 to 7 carbon atoms Lower alkyl or cycloalkyl, -C (= O) -R "(where R" is A polyamine obtained from min, spermidine or putrescein) A member selected from the group.   In the above general formula, A represents a number of reactive groups, for example, a cyanuryl chloride derivative, Aldehyde, succinimide, benzimidazole, symmetric disulfide, heterodiene Functional PEG, (CHTwoCHTwoO)mHas a molecular weight of about 350 to about 10,000 − (CHThree)n= CHThree It is.   From the present disclosure, “biologically related substances” and “bioactive agents” refer to drugs, molecules, Peptides, proteins, nucleic acid sequences and fluorescent dyes or Used broadly to include, but is not limited to, other labeling molecules, and PEG Not understood. The term "PEG" is intended to include PEG derivatives Will be understood.   The nEryt of the present invention can be combined with a bioactive agent to provide a carrier for such drugs. To form In particular, vesicles bind bioactive agents, such as drugs, and require bioactive agents. Provides a carrier for the administration of a bioactive agent so that it can be effectively delivered to critical body locations I can do it. Vesicles are naturally occurring, biodegradable, non-immunogenic or moderately immunogenic. Non-toxic and non-pyrogenic, fully compatible with blood, and suitable for autologous administration with char Sex. As used herein and in the appended claims, the term self-administration The nanoerythrosome administered to the mammal is obtained from a compatible red blood cell or blood supply. (The same mammal; that is, the same patient) ). Non-self of nanoerythrosome When intended for systemic administration, it is preferable to reduce the immunogenic potential of nEryt. However, it has been shown to reduce its immunoreactivity to immunosuppressed or non-immunosuppressed mammals. Administration of nEryt without further treatment is also contemplated in some circumstances.   The bond reacts with a primary group that reacts with the reactive site of the vesicle and with a reactive group on the bioactive agent. This can be accomplished using a coupling agent having a secondary group. Nano bioactive agent Numerous methods of binding to erythrosomes exist and are well known in the art. this Examples of these include well-known crosslinking reagents, such as homobifunctional or heterobifunctional. But not limited to, bifunctional reagents of the type. An example is shown below.   Azidobenzoyl hydrazide, N-5-azido-2-nitrobenzoyloxy Succinimide;   N- [4- (p-azidosalicylamido) butyl] -3 '-[2'-pyridyl Dithio] propionamide;   p-azidophenyl glyoxal monohydrate;   4- [p-azidosalicylamido] butylamine;   1- [p-azidosalicylamide] -4- [iodoacetamido] butane;   Bis- [β- (4-azidosalicylamido) ethyl] disulfide;   Bismaleimide hexane;   Bis [sulfosuccinimidyl] suberate;   Bis [2- (sulfosuccinimidooxy) ethyl] sulfone;   Bis [2- (sulfosuccinimidooxycarbonyloxy) ethyl] sulfo N;   Example 1   Removal of plasma and buffy coat (white blood cells)   Blood (2 × 30 ml) from a mammalian donor (e.g., horse, cow, pig, human) Centrifuged at 00 '× g (1500 rpm) at 4 ° C. for 10 minutes. Plasma and The fee coat was removed by suction. Remove the liquid and dilute an equal volume of phosphoric acid at 4 ° C. Saline (PBS) (5 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, p H7.4). Invert the tube several times to gently homogenize the mixture. Was. The blood was then re-centrifuged at 500 × g at 4 ° C. for 10 minutes. Described here The above procedure was repeated three times.   The following protocols were each performed under sterile conditions. Example 2   Preparation of erythrocyte ghost hypotonic impactor   Method 2.1   5 ml of blood treated as described in Example 1 was 35 ml (50 ml Nalgen) eTM(In a test tube) to hypotonic buffer (5 mM sodium phosphate), pH 7.4. Was. The erythrocyte suspension was centrifuged at 25,000 xg for 20 minutes at 4 ° C.   The supernatant was aspirated and discarded. Remove the volume of the hypotonic buffer to the same volume of fresh buffer And the suspension was centrifuged again. Until the supernatant is slightly colored, The procedure was repeated three times. Pellet at 4 ° C. in 5 ml PBS buffer, pH 7.4 Suspended in water. Pool the white ghost suspension and centrifuge for 20 minutes (20, 000 × g) and kept at 4 ° C. until needed.   Method 2.2   70 ml of blood as treated in Example 1 was added to hypotonic phosphate or carbonate buffer (2 . 5 mM) (2 mM NaThreePOFourPH adjustment using glacial acetic acid), pH 10 to 11 Using Sepharose CL6B (also CL4B) or Sephacryl S400 color Chromatography (eg, 10 cm × 30 cm). White go The host was first collected (dead volume) and then hemoglobin was retained on the column. Acetic acid Was used to adjust the pH to 7.4, and the ghost was concentrated by centrifugation as described above. By the chromatographic treatment, hemoglobin-free white ghost 7 0 mg was obtained (1 mg / ml "washed blood"). Example 3   Preparation of nanoerythrosome (nEryt)   Method 3.1   Nanoerythro as described in US Pat. No. 5,653,999. Sosomes were prepared. Through a polycarbonate filter with about 1 μm pores It is important to point out that ghosts are extruded. Polycarbo Nate filters have the advantage that they do not stick to nanoerythrosomes. Go The paste was extruded from the isotonic suspension under nitrogen pressure. The suspension is preferably pressed four times. Be sent out.   Method 3.2   This approach is significantly different from 3.1 above. It is faster and nanoe It offers the advantage of producing a better yield of lithrosome. Furthermore, it is It is easily available for large-scale production. Example 6   Purification of nEryt with capture (confinement) molecule   Method 6.1   After capture, dilute 3-5 times with 1 ml of cold (4 ° C) PBS (isotonic, pH 7.4) And centrifuged at 16,000 xg for 8 minutes to remove the supernatant, and diluted again with PBS. Upon release, nEryt was released from unconfined molecules.   Method 6.2   After capture, appropriate Sephadex or Sephacrylka can be obtained by well-known methods. The free molecules are retarded by size exclusion chromatography using Rapid elution of ryt released nEryt from unconfined molecules. capture (Confinement) After solubilizing the nEryt using a suitable detergent, (Adapted to trapped molecules).   Stability   By capture, the dextran-FITC-nEryt suspension was kept at 4 ° C. As evidenced by the fact that it is stable for at least seven months A defined nanoerythrosome-bioactive agent composition has been formed. In addition, DNA closure I performed a squeeze. Briefly, 200n suspended in PBS (500 μl) g of nEryt were washed three times with TKN buffer (to eliminate phosphate) . Suspension of DNA (30-320 ng) in TKN buffer (10-300 μl) And gently homogenized. Incubate the suspension at 4 ° C for 10 minutes Frozen in liquid nitrogen for 2 minutes, then Incubated at 5 ° C for 4 minutes. Suspend as above using TKNM buffer The liquid was processed.   Antibodies containing DNase (100 μl of 0.1 U / μl DNase I solution) The reaction mixture was incubated to quickly remove excess DNA. Mg2+(10 mM) or Mn2+(1 mM) was added to the mixture.   After cleaning with DNase, the nEryt was purified using routine protocols for PCR. -The DNA was amplified and the presence of the vector in nEryt was confirmed.   Table 1   Using the techniques described herein, these examples demonstrate the capture of nEryt. Illustrating typical results, this reflects similar concentrations of small and large molecules.       Initial concentration nEryt Capture molecule Dextran-4000 FITC (mg / ml) (μg / mg nano)       (Mg / ml)           2.6 1.3 15.6           2.6 2.6 13.4           2.6 3.9 12.1 DNA (μg / ml)*           1.3 4 0.003          13 4 0.066          65 4 0.153   *Similar results were obtained with linear (3 kb) or supercoiled DNA.   Thus, Table 1 illustrates these results, which illustrate typical results of capture by nEryt. Here is an example. This counteracts similar concentrations of small and large molecules. I am reflecting.                     The scope of the claims   1. formula   nEryt-AX- (CHTwo-CHTwo-O)m− (CHTwo)n-E nano erythro A sonosome (nEryt) -polyethylene glycol (PEG) conjugate,   Wherein a) (CHTwo-CHTwo-O)mIs a polyethylene glycol derivative, m is an integer of 2 to 500,   b) n is an integer from 0 to 7,   c) A is a reactive group and / or a binding arm,   d) X is absent or an oxygen atom, a sulfur atom, -OC (O), -NC (O) And -SC (O).   e) The conjugate, wherein E is a vehicle interacting group and / or a targeting group.   2. 2. The nanodye according to claim 1, wherein A is selected from an activated ester group or an SH group. Lithrosome-polyethylene glycol conjugate.   3. A is a binding arm that enables the complexation of the PEG and the nEryt. 3. The nanoerythrosome-polyethylene glycol conjugate of claim 1 or 2.   4. 4. The nanoerythrosome-polyethylene glycol conjugate according to claim 1, 2 or 3. Wherein A is   -Cyanuryl chloride derivatives, cyanogen halides (Br or Cl), OH-activators containing thiol and tosyl groups, aldehydes, succinimides, Imimidobenzimidazole, maleimide, symmetric disulfide and heterobifunctional Sex PEG,   -Z-C (R ') = CHTwoOr Z-CH = CH, wherein Z is COOH, HO (aldehyde), H, OH (hydroxyl), NHTwoGroup consisting of and SH Wherein R 'is a lower alkyl group of 1 to 5 carbon atoms. ,   -DC (= O)-, wherein D is H, NThree, OH, CHThree, -NH-NHTwo, A member selected from the group consisting of anhydrides, mixed anhydrides, and activated esters And   -Q- (CHTwo)oWhere O = 1-8 and Q = -C = O, N, S, The conjugate, wherein the conjugate is a member selected from the group consisting of:   5. The nanoerythrosome-polyethylene glycol of claim 1, 2, 3, or 4. Wherein E is an inert group, a positively charged group, a negatively charged group, or a reactive group. The conjugate selected from the group consisting of:   6. The nanoerythrosome-polyethylene glycol according to claim 1, 2, 3, 4, or 5. A call complex, wherein E is   -H, COOH, POFour, SOThreeH and a heterocyclic ring,   WR, wherein W is 1 selected from the group consisting of O, N, S, -C (= O) A member,   When W = -O-,   -R is H, lower alkyl or cycloalkyl of 1 to 7 carbon atoms, -C (= C) one member selected from the group consisting of -R ", wherein R" is a polyamine derivative, For example, spermine, spermidine or putrescein,   When W = −N−,   R is H, lower alkyl or cycloalkyl of 1 to 7 carbon atoms, -C ( = O)--C (= O) R "is a member selected from the group consisting of Min, spermidine or putresei Polyamines derived from phenol or one or two COOH, SOThreeH or POFourKeep the group A lower alkyl chain of 1 to 6 carbon atoms,   When W = -S-,   -R is H, lower alkyl or cycloalkyl of 1 to 7 carbon atoms, -C (= O) —— C (＝ O) —R ″ is a member selected from the group consisting of A polyamine derived from permine, spermidine or putrescein,   When W = -C (= O)-,   R is H, lower alkyl or cycloalkyl of 1 to 7 carbon atoms, -O-   -C (= O) -R ", where R" is spermine, spermidine or putrescein Is, The conjugate, wherein the conjugate is a member selected from the group consisting of:   7. 7. The nanoerythrosome-polyethylene of claim 1, 2, 3, 4, 5 or 6. A glycol conjugate wherein A is cyanuric chloride and (CHTwo-CHTwoO)mIs a molecule Having an amount of about 350 to about 10,000, and-(CHTwo)n-E = CHThreeIs the holding Coalescing.   8. (CHTwo-CHTwoO)mHas a molecular weight of about 1,000 to about 7,000 Item 7. The nanoerythrosome-polyethylene glycol conjugate of Item 7.   9. (CHTwo-CHTwoO)mHas a molecular weight of about 2,000 to about 5,000 Item 10. The nanoerythrosome-polyethylene glycol conjugate of Item 8.   Ten. 7. The nanoerythrosome-polyethylene of claim 1, 2, 3, 4, 5 or 6. Glycol conjugate, wherein A is a cyanuryl chloride derivative, an aldehyde, Cinimide, succinimide benzimidazole, maleimide, symmetric disulphide And heterobifunctional PEG, (CHTwo-CHTwoO)mHas a molecular weight of about 3 50 to about 1 000 and-(CHTwo)n-E = CHThreeThe above conjugate.   11． 11. The nanoerythrosome of claim 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10. A conjugate of polyethylene-glycol, wherein the nanoerythrosome is a ligand. The ligand binds the nanoerythrosome to the ligand for the ligand. The conjugate, wherein the conjugate is targeted to a sceptor.   12． A nanoerythrosome composition having a significantly reduced immune potential Thus, the composition comprises a PEG derivative conjugated to the nanoerythrosome. The above-mentioned composition, characterized in that:   13. Suitable white for the preparation of nanoerythrosomes from erythrocytes from mammals A method for producing ghosts, which does not contain divalent and / or trivalent cations And appropriate chromatography using a hypotonic aqueous buffer solution having a pH of about 8 to about 11. Such method comprising size exclusion chromatography on a column having   14. 14. The method of claim 13, further comprising passing the two filters under vacuum. Filtering the white ghost of claim 13, thereby filtering nanoerythrosomes Obtaining said nanoerythrosome, and concentrating or freeze-drying said method.   15． A nanoerythrosome conjugate of the formula nEryt-HT, comprising:   Wherein a) H is a heterofunctional linking arm,   b) The above conjugate, wherein T is a targeting group.   16． 16. The nanoarray of claim 15, wherein A is selected from the group consisting of SMCC and SPDP. Sulosome conjugate.   17． 17. The nanoerythrosome complex of claim 15 or 16, wherein T is a coordinator. And the ligand binds the nanoerythrosome to the ligand. Such a conjugate, wherein the conjugate is targeted to a receptor for the ligand.   18． 18. The nanoerythrosome conjugate of claim 15, 16, or 17, further comprising: The conjugate comprising a binding arm, which binds a nanoerythrosome to the targeting group.   19. 19. The nanoerythrosome conjugate of claim 15, 16, 17 or 18, further comprising: Bioactive agent bound to or entrapped in the nanoerythrosome The conjugate comprising:   20. The nano-area according to claim 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12. A sulosome-polyethylene glycol conjugate, further comprising the nanoerythro The conjugate comprising a bioactive agent that is sosomely bound or entrapped therein. .   twenty one. A nanoerythrosome-polyethylene glycol conjugate of claim 11, The ligand is an antibody or a portion thereof, and the receptor is the antibody or The conjugate, wherein the conjugate is an antigen recognized by a portion thereof.   twenty two. 20. The nanoerythrosome-polyethylene glycol conjugate of claim 17, 18 or 19. Wherein the ligand is an antibody or a portion thereof, wherein the receptor is The conjugate, wherein the conjugate is an antigen recognized by the antibody or a portion thereof.   twenty three. Claims 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 16, 17, A drug together with the nanoerythrosome conjugate according to 18, 19, 20, 21 or 22. A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.   twenty four. Claims 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 16, 17, Disease, or disease, in an animal of a 18, 19, 20, 21, or 22 nanoerythrosome conjugate; Use for prevention or treatment of health conditions.   twenty five. Diagnostics comprising at least one of the above nanoerythrosome compositions kit.   26. The above-mentioned tools for diagnosing or predicting expected symptoms or health conditions in animals A bioassay comprising one of the noerythrosome compositions.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，Ａ Ｚ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ベルメア，フランソワ カナダ国，ケベック ジー８ワイ ３ジー ２，トロワ―リビエール，カリクサ―ラバ ル 1600────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, S D, SZ, UG, ZW), AL, AM, AT, AU, A Z, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN , CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, HU, ID, IL, IS, JP, KE, K G, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT , LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, S G, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA , UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Belmere, François             Canada, Quebec G8 Y 3 G             2. Trois-Rivieres, Calixa-la-ba             Le 1600

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．次式： Ｚ-（ＹＱ）-Ｘ-（ＣＨ2-ＣＨ2-Ｏ）m-（ＣＨ2）n-Ｗ-Ｒ （式中、ａ）Ｚは、ＹＱ＝ＣＨ＝ＣＨ又は−Ｃ（Ｒ”）＝ＣＨ2である場合には 、ＣＯＯＨ、ＨＯ（アルデヒド）、Ｈ、ＯＨ（ヒドロキシル）、ＮＨ2、及びＳ Ｈから成る群から選択される一成員であり、あるいはＹ＝−Ｃ＝（Ｏ）−である 場合には、Ｈ、Ｎ3、ＯＨ、ＣＨ3、−ＮＨ−ＮＨ2、無水物、混合無水物又は活 性化エステルでから成る群から選択される一成員であり； ｂ）ＹＱはＣＨ＝ＣＨ、−Ｃ（Ｒ”）＝ＣＨ2（ここで、Ｒ’＝１〜５個の炭 素原子を有する低級アルキル）、塩化シアヌル、ハロゲン化シアン（Ｂｒ又はＣ ｌ）及びメシル、トシル基を含むＯＨ活性化剤成る群から選択される一成員であ り； ｃ）Ｏ（ＣＨ2−ＣＨ2Ｏ）mはポリエチレングリコール誘導体であり（この場 合、ｍ＝２〜５００）； ｄ）Ｗは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、−Ｃ（＝Ｏ）から成る群から選択される一成員である ） のナノエリスロソーム（ｎＥｒｙｔ）−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）抱合 体。 ２．Ｙが低級アルキル［（ＣＨ2）n；ｎ＝１〜７］の群から選択される一成員 であり；Ｑ＝−Ｃ＝（Ｏ）、Ｎ、Ｓである 請求項１のナノエリスロソーム（ｎＥｒｙｔ）−ポリエチレングリコール（ＰＥ Ｇ）抱合体。 ３．Ｗ＝−Ｏ−であり、Ｒは：Ｈ、１〜７個の炭素原子を有する低級アルキル 又はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ（ここで、Ｒ はポリアミン誘導体、例えばスペルミン、スペルミジン又はプトレセインである ）から成る群から選択される一成員である 請求項１又は２のナノエリスロソーム（ｎＥｒｙｔ）−ポリエチレングリコール （ＰＥＧ）抱合体。 ４．Ｗ＝−Ｎ−であり、ＲがＨ、１〜７個の炭素原子を有する低級アルキル又 はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ（ここで、Ｒはスペルミン、 スペルミジン又はプトレセインから得られるポリアミンである）、１個又は２個 のＣＯＯＨ、ＳＯ3Ｈ又はＰＯ4基を保有する１〜６個の炭素原子の低級アルキル から成る群から選択される一成員である 請求項１又は２のナノエリスロソーム（ｎＥｒｙｔ）−ポリエチレングリコール （ＰＥＧ）抱合体。 ５．Ｗ＝−Ｓ−であり、ＲはＨ、１〜７個の炭素原子を有する低級アルキル又 はシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ（ここで、Ｒはスペルミン、 スペルミジン又はプトレセインから得られるポリアミンである）から成る群から 選択される一成員である 請求項１又は２のナノエリスロソーム（ｎＥｒｙｔ）−ポリエチレングリコール （ＰＥＧ）抱合体。 ６．Ｗ＝−Ｃ（＝Ｏ）−であり、ＲはＨ、１〜７個の炭素原子を有する低級ア ルキル又はシクロアルキル、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ（ここで、Ｒはスペルミ ン、スペルミジン又はプトレセインから得られるポリアミンである）から成る群 から選択される一成員である 請求項１又は２のナノエリスロソーム（ｎＥｒｙｔ）−ポリエチレングリコール （ＰＥＧ）抱合体。 ７．ＷＲは、ＣＯＯＨ、ＰＯ4、ＳＯ3Ｈから成る群から選択される一成員であ る 請求項１又は２のナノエリスロソーム（ｎＥｒｙｔ）−ポリエチレングリコール （ＰＥＧ）抱合体。 ８．ＹＱが塩化シアヌルであり、（ＣＨ2−ＣＨ2Ｏ）mが約３５０〜約１０， ０００の分子量を有し、そして−（ＣＨ2）n＝ＣＨ3である請求項１のｎＥｒｙ ｔ−ＰＥＧ抱合体。 ９．ＹＱが塩化シアヌルであり、（ＣＨ2−ＣＨ2Ｏ）mが約１，０００〜約７ ，０００の分子量を有し、そして−（ＣＨ2）n＝ＣＨ3である請求項８のｎＥｒ ｙｔ−ＰＥＧ抱合体。 １０．ＹＱが塩化シアヌルであり、（ＣＨ2−ＣＨ2Ｏ）mが約２，０００〜約 ５，０００の分子量を有し、そして−（ＣＨ2）n＝ＣＨ3である請求項８のｎＥ ｒｙｔ−ＰＥＧ抱合体。 １１．ＹＱＺが（ＣＨ2）4−ＣＯＯＨ、（ＣＨ2−ＣＨ2Ｏ）m（ｍ＝７）、− （ＣＨ2）n（ｎ＝１）、（ＣＨ3）、（ＣＨ2）3−ＣＨＯ、（ＣＨ2−ＣＨ2Ｏ）m 、（ＣＨ2）3−ＣＨＯ、（ＣＨ2−ＣＨ2Ｏ）m及び（ＣＨ2−ＣＨ2Ｏ）mから成る 群から選択される請求項１のｎＥｒｙｔ−ＰＥＧ抱合体。 １２．ＹＱがシアヌルクロリド誘導体、アルデヒド、スクシンイミド、スクシ ンイミドベンズイミダゾール、対称ジスルフィド及びヘテロ二官能性ＰＥＧから 選択され、そして（ＣＨ2−ＣＨ2Ｏ）mが約３５０〜１０，０００の分子量を有 し、−（ＣＨ2）n＝ＣＨ3である請求項１のｎＥｒｙｔ−ＰＥＧ抱合体。 １３．前記ｎＥｒｙｔが抗体又はその一部と結合し、抗体又はその一部が前記 ナノエリスロソームを抗体又はその一部により認識される抗原に対する標的にす るｎＥｒｙｔ−配位子組成物。 １４．前記ナノエリスロソームに抱合されるＰＥＧ誘導体を包含する、免疫原 性ポテンシャルの有意の低減を有するナノエリスロソーム組成物。 １５．哺乳類からの赤血球からのナノエリスロソームの製造方法であって、二 価および／または三価陽イオンを含有しない低張水性緩衝液、ｐＨ８〜１を用い て、適切なクロマトグラフィーゲルを含有するカラム上でのサイズ排除クロマト グラフィーを包含する方法。[Claims]   1. The following formula:   Z- (YQ) -X- (CHTwo-CHTwo-O)m-(CHTwo)n-WR Wherein a) Z is YQ = CH = CH or -C (R ″) = CHTwoIf , COOH, HO (aldehyde), H, OH (hydroxyl), NHTwo, And S A member selected from the group consisting of H, or Y = -C = (O)- In case, H, NThree, OH, CHThree, -NH-NHTwo, Anhydride, mixed anhydride or active A member selected from the group consisting of a sexualizing ester;   b) YQ is CH = CH, -C (R ") = CHTwo(Where R '= 1 to 5 charcoals Lower alkyl having a nitrogen atom), cyanuric chloride, cyanogen halide (Br or C l) and an OH activator containing a mesyl or tosyl group. R;   c) O (CHTwo-CHTwoO)mIs a polyethylene glycol derivative. M = 2-500);   d) W is a member selected from the group consisting of O, N, S, -C (= O) ) Conjugation of Nano Erythrosome (nEryt) -Polyethylene Glycol (PEG) body.   2. Y is a lower alkyl [(CHTwo)n; N = 1 to 7]. Q = -C = (O), N, S The nanoerythrosome (nEryt) -polyethylene glycol (PE) of claim 1 G) Conjugate.   3. W = —O— and R is: H, lower alkyl having 1 to 7 carbon atoms Or cycloalkyl, -C (= O) -R (where R Is a polyamine derivative such as spermine, spermidine or putrescein A member selected from the group consisting of The nanoerythrosome (nEryt) -polyethylene glycol according to claim 1 or 2. (PEG) conjugate.   4. W = -N-, R is H, lower alkyl having 1 to 7 carbon atoms or Is cycloalkyl, -C (= O) -C (= O) -R (where R is spermine, One or two polyamines derived from spermidine or putrescein) COOH, SOThreeH or POFourLower alkyl of 1 to 6 carbon atoms bearing a group A member selected from the group consisting of The nanoerythrosome (nEryt) -polyethylene glycol according to claim 1 or 2. (PEG) conjugate.   5. W = -S-, R is H, lower alkyl having 1 to 7 carbon atoms or Is cycloalkyl, -C (= O) -C (= O) -R (where R is spermine, Which is a polyamine obtained from spermidine or putrescein) Be a member of choice The nanoerythrosome (nEryt) -polyethylene glycol according to claim 1 or 2. (PEG) conjugate.   6. W = —C (＝ O) —, and R is H, lower alkyl having 1 to 7 carbon atoms. Alkyl or cycloalkyl, -O-, -C (= O) -R (where R is , Spermidine or a polyamine obtained from putrescein) Is a member selected from The nanoerythrosome (nEryt) -polyethylene glycol according to claim 1 or 2. (PEG) conjugate.   7. WR is COOH, POFour, SOThreeA member selected from the group consisting of H To The nanoerythrosome (nEryt) -polyethylene glycol according to claim 1 or 2. (PEG) conjugate.   8. YQ is cyanuric chloride, and (CHTwo-CHTwoO)mIs about 350 to about 10, 000, and-(CHTwo)n= CHThree2. The nEry of claim 1, wherein t-PEG conjugate.   9. YQ is cyanuric chloride, and (CHTwo-CHTwoO)mIs about 1,000 to about 7 000, and-(CHTwo)n= CHThree9. The nEr of claim 8, wherein yt-PEG conjugate.   10. YQ is cyanuric chloride, and (CHTwo-CHTwoO)mIs about 2,000 to about Has a molecular weight of 5,000, and-(CHTwo)n= CHThree9. The nE of claim 8, wherein ryt-PEG conjugate.   11. YQZ is (CHTwo)Four-COOH, (CHTwo-CHTwoO)m(M = 7),- (CHTwo)n(N = 1), (CHThree), (CHTwo)Three-CHO, (CHTwo-CHTwoO)m , (CHTwo)Three-CHO, (CHTwo-CHTwoO)mAnd (CHTwo-CHTwoO)mConsisting of 2. The nEryt-PEG conjugate of claim 1 selected from the group.   12. YQ is a cyanuric chloride derivative, aldehyde, succinimide, succinimide From imidobenzimidazoles, symmetric disulfides and heterobifunctional PEGs Selected, and (CHTwo-CHTwoO)mHas a molecular weight of about 350 to 10,000 And-(CHTwo)n= CHThree2. The nEryt-PEG conjugate of claim 1, which is   13. The nEryt binds to an antibody or a part thereof, and the antibody or a part thereof Targeting nanoerythrosomes to antigens recognized by antibodies or portions thereof NEryt-ligand compositions.   14． An immunogen comprising a PEG derivative conjugated to the nanoerythrosome A nanoerythrosome composition having a significant reduction in sexual potential.   15. A method for producing nanoerythrosomes from erythrocytes from a mammal, comprising the steps of: Using a hypotonic aqueous buffer, pH 8-1 containing no valent and / or trivalent cations Size exclusion chromatography on a column containing the appropriate chromatography gel. A method that involves photography.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10000838B4 (en) * 2000-01-12 2005-03-17 Schott Ag Alkali-free aluminoborosilicate glass and its uses
ATE444984T1 (en) 2002-12-31 2009-10-15 Nektar Therapeutics Al Corp HYDROLYSIS-STABLE POLYMERS CONTAINING MALEIMIDE END GROUPS
US7432331B2 (en) 2002-12-31 2008-10-07 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
EP2015071A1 (en) * 2007-07-13 2009-01-14 FUJIFILM Corporation Carrier, process for producing same, bioreactor, and chip for surface plasmon resonance analysis
WO2011091154A2 (en) * 2010-01-21 2011-07-28 The Regents Of The University Of California Use of human erythrocytes for prevention and treatment of cancer dissemination and growth

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2150617C (en) * 1995-02-07 2001-10-30 Universite Laval Nanoerythrosome as bioactive agent carrier

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006501279A (en) * 2002-09-30 2006-01-12 ゲー２エム キャンサー ドラッグス アーゲー Antibody tools for diagnosis in medical therapy using inhibitors of histone deacetylase
US7858329B2 (en) 2002-09-30 2010-12-28 Topotarget Germany Ag Antibody tools for the diagnostic use in the medical therapy with inhibitors of histone deacetylases

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