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JP2001500019A - Granulocyte chemoattractant protein 2 mutant - Google Patents

Granulocyte chemoattractant protein 2 mutant

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Publication number
JP2001500019A
JP2001500019A JP10513829A JP51382998A JP2001500019A JP 2001500019 A JP2001500019 A JP 2001500019A JP 10513829 A JP10513829 A JP 10513829A JP 51382998 A JP51382998 A JP 51382998A JP 2001500019 A JP2001500019 A JP 2001500019A
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JP
Japan
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ngcp
sequence
seq
polypeptide
expression
Prior art date
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Pending
Application number
JP10513829A
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Japanese (ja)
Inventor
バンドマン、オルガ
コールマン、ロジャー
マリー、リン・イー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Incyte Corp
Original Assignee
Incyte Pharmaceuticals Inc
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Filing date
Publication date
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なヒト顆粒球走化性タンパク質２変異体（ＮＧＣＰ）を同定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。本発明は、ＮＧＣＰをコードする核酸配列を含む遺伝子組換え発現ベクター及び宿主細胞を提供する。本発明はまた、癌性細胞における細胞分裂を止める医薬品組成物にて実質的に精製されたＮＧＣＰの利用することや、その製造方法を提供する。本発明はまた、ＮＧＣＰをコードする転写物とハイブリッド形成するポリヌクレオチド及びＮＧＣＰに特異的に結合する抗ＮＧＣＰ抗体を利用する診断検査法についても記述している。 (57) SUMMARY The present invention provides a polynucleotide that identifies and encodes a novel human granulocyte chemotactic protein 2 variant (NGCP). The present invention provides a recombinant expression vector and a host cell comprising a nucleic acid sequence encoding NGCP. The present invention also provides the use of NGCP substantially purified in a pharmaceutical composition for stopping cell division in cancerous cells and a method for producing the same. The present invention also describes a diagnostic test that utilizes a polynucleotide that hybridizes to a transcript encoding NGCP and an anti-NGCP antibody that specifically binds to NGCP.

Description

【発明の詳細な説明】 顆粒球走化性タンパク質２変異体技術分野 本発明は、αインタークリンと共通の特徴を有する新規な顆粒球走化性タンパ ク質２変異体の核酸及びアミノ酸配列、及び疾病の診断、研究、予防、及び治療 におけるこれらの配列の利用に関するものである。背景技術 ケモカインは、通常約７０〜１００アミノ酸からなる長さを有し、分子量が６ 〜１１ｋＤで、１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で活性である小形のポリペプチ ドである。ケモカインは、初めに炎症性組織から単離され精製されて、その生理 活性について特性化された。最近になって、ケモカインは分子クローニング技術 を用いて発見され、生成できるようになってきており、機能的解析のみならず構 造的解析によって特性化されてきている。 ケモカインは、異なる炎症性の状態における白血球輸送に関係する化学誘因物 質因子の勾配形成に関与する。ケモカインは、内皮細胞上の特定の接着分子の発 現を媒介し、特定の細胞型の増殖を刺激し、且つ特定のレセプターを有する細胞 の活性化を調節する。 このケモカインはシステインモチーフに基づいて近縁関係にあり、通常３つの ファミリー、即ちＣＸＣケモカイン(α)、ＣＣケモカイン(β)、及びＣケモカイ ンに分類される（g;Graves DT and Y Jiang(1995)Crit Rev Oral Biol Med 6:10 9-118 and Kelner G等(1994)Science 266:1395-99）。ＣＸＣケモカインには、 よく研究された血小板因子４と共に、非血小板性ケモカイン上皮由来好中球誘因 物質７８（ＥＮＡ−７８）や顆粒球透過性タンパク質２（ＧＣＰ−２）が含まれ る。ケモカインは通常炎症誘発性サイトカインに応答して発現され、分泌される 。 このような炎症誘発性サイトカインには、インターロイキン１Ｂ及び腫瘍壊死因 子、内毒素、分裂促進因子、粒子状の細菌又はウイルスがある。 ＥＮＡ−７８は７６個のアミノ酸からなり、８３５７の分子量を有する（Walz A等(1991)J Exp Med 174:1355-62）。内皮細胞がＥＮＡ−７８を発現し分泌す るとき、このＥＮＡ−７８は好中球、走化性、増大した細胞内カルシウム、及び エキソサイトーシスを刺激する。ＥＮＡ−７８のゲノムのＤＮＡは、Corbett等 により、ヒト染色体４から、４つのエキソンと３つのイントロンを含む２．２ｋ ｂの断片としてクローン化された（1994;Biochem Biophys Res Commun 205:612- 17）。３４２個のヌクレオチドのオープンリーディングフレームは、１１４個の アミノ酸からなるタンパク質をコードする。上流の隣接領域には、核因子κＢに 対するプロモータ結合部位が含まれる（Chang M等(1994)J Biol Chem 269:41:25 277-82）。 ＧＣＰ−２はヒトＭＧ６３骨肉腫細胞の上清から単離された６ｋＤのタンパク 質である。Proost等（(1993)J Immunol 150:1000-10）は、アミノ酸シークエン シングによりこのＣＸＣケモカインを同定し、ＨＰＬＣ分離を用いて、ＧＣＰ− ２が４つの異なるＮ末端形態で存在しているらしいということを報告している。 ３〜１０ｎＭの濃度で、ＧＣＰ−２は、in vitroで好中球を誘引して活性化し、 in vivoで顆粒球集積を引き起こし、また単球には作用しない。 ケモカインとその化学誘引活性についての研究により、種々の病理学的過程に おける分子レベルでの介入のための手段や、よりよい理解が得られる。Hirose等 （1995;Br J Cancer 72:708-714）は、ヌードマウスの腫瘍細胞にケモカインの 遺伝子をトランスフェクトすることにより腫瘍形成能が低下することを示した。 この抗腫瘍性活性の原因は、その癌の部位に対する好中球の顆粒球の動員及び活 性のためである。 Broxmeyer HE等（1995;Ann Hematol 71:235-24）は、骨髄及び臍帯血前駆体細 胞集団に対するケモカインの骨髄抑制性効果を評価した。アセトニトリル内にお いて有効なケモカインをプレインキュベートすることにより、顆粒球−マクロフ ァージ、赤血球系及び多分化能前駆体細胞の抑制が増強された。このような実験 結果から、毎日のケモカインによる治療が、急性又は慢性の白血病の患者の治療 に役立ち得ることが示唆された。 これに対し、ケモカイン発現及び分泌の抑制は、心筋組織における病因の予防 において役立ち得る。Seino Y等（1995;Cytokine 7:301-304）はＰＣＲを利用し て、特発性拡張型心筋症の患者からの心内膜心筋生検組織における白血球ＣＣ及 びＣＸＣ走化性サイトカインの発現を示した。このことは、この部位に動員され る白血球の細胞障害性作用が、炎症性心筋疾患の原因となり得ることを示唆して いる。 新規なＣＸＣケモカインの発見により、種々の形態の癌や心臓病に介入するた めの効果的な治療法を開発し、且つこれらの病理過程における各段階についての 知識の拡張の機会が得られる。発明の開示 本発明は、白血球、特定の好中球及び顆粒球の化学誘因及び活性化に関与する 他のαインタークリンと共通の特徴を有する、新規な顆粒球走化性タンパク質２ 変異体（以下ＮＧＣＰと表記する）を開示する。従って、本発明は、配列番号： １のアミノ酸配列に示すような実質的に精製されたＮＧＣＰを提供する。 本発明の或る実施例は、ＮＧＣＰをコードする単離され、実質的に精製された ポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例では、このポリヌクレオチドは配列 番号：２のヌクレオチド配列を有する。更に、本発明は、厳密な条件の下で、配 列番号：２の配列とハイブリッド形成するポ リヌクレオチド配列を提供する。 本発明は更に、ＮＧＣＰをコードする核酸配列、オリゴヌクレオチド、ペプチ ド核酸、その断片、一部分、又はアンチセンス分子に関するものである。また本 発明はその一部として、宿主細胞又は生物体の形質転換に用いることができる発 現ベクターへのＮＧＣＰをコードする核酸配列の組込みにも関連する。本発明は また、癌、特に黒色腫、サイトカイン感受性腫瘍、免疫不全、又は過剰免疫応答 に関連する細胞又は組織の治療的形質転換も提供する。 本発明はまた、ＮＧＣＰ又はその断片の製造方法にも関連する。本発明におい ては、精製されたＮＧＣＰを単体で、若しくは製薬学的に許容される賦形剤に入 れて、癌細胞又は組織に送達することも試みられる。また、本発明の範囲には、 ＮＧＣＰに特異的に結合し、サイトカイン感受性腫瘍及び免疫系疾患の試験のモ ニタリングに用いることができる抗体もその範囲に含まれる。図面の簡単な説明 第１Ａ図及び第１Ｂ図は、新規な顆粒球走化性タンパク質２変異体のアミノ酸 配列（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）を示した図である。配列の アライメントはMacDNAsisTMソフトウエア（Hitachi Software Engineering Co L td,San Bruno CA）を用いて作製した。 第２図は、顆粒球走化性タンパク質２変異体（配列番号：１）、ＥＮＡ−７８ （GI 607031；配列番号：３；Walz等，前出）、ＧＣＰ−２（GI 462170；配列番 号：４；Proost等，前出）、及びＧＣＰ−２（GI 415589；配列番号：５；Proos t等(1993)Biochemistry 32:10170-77）の間のアミノ酸配列アライメントを示し た図である。これらのアライメントは、DNAStarTMのマルチシーケンスアライメ ントプログラム(DNAStar Inc,Madison WI)を用いて作製した。 第３図は、配列番号：２の顆粒球走化性タンパク質２変異体の疎水性プロット （MacDNAsisソフトウエア）を示した図であって、Ｘ軸はアミノ酸の位置を表し 、Ｙ軸は負の方向に疎水性のレベルを表す。 第４図は、ＥＮＡ−７８（配列番号：３）についての疎水性プロットを示した 図である。 第５図は、顆粒球走化性タンパク質２変異体（配列番号：１）に対する等電点 プロットを示した図である（MacDNAsisソフトウエア）。 第６図は、ＥＮＡ−７８（配列番号：４）に対する等電点プロットを示した図 である。 第７Ａ図及び第７Ｂ図は、顆粒球走化性タンパク質２変異体の核酸配列と、顆 粒球走化性タンパク質２に類似した５"として注釈付けられたヒトＥＳＴとの間 の核酸配列アライメントを示した図である（GI 973875;Hillier L等(1995)Unpub lished;DNAStarTMソフトウエア）。発明の実施の形態 定義 本明細書において、「核酸配列」とは、一本鎖か二本鎖の、センス鎖、又はア ンチセンス鎖であるゲノムの若しくは合成起源のＤＮＡ、ＲＮＡや、オリゴヌク レオチド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びその断片又は一部分を意 味する。同様に、本明細書において「アミノ酸配列」とは、ペプチド若しくはタ ンパク質配列を意味する。 本明細書において「コンセンサス」とは、（１）再度シークエンシングされて 不要な塩基が分離された核酸配列、（２）XL-PCR（Perkin Elmer）を用いて５’ 方向または３’方向に延長されて、再度シークエンシングされた核酸配列、（３ ）GCGフラグメントアセンブリシステム（GCG,Madison WI）を用いて２以上のイ ンサイト社クローン重複した配列を元に組み合わせられた核酸配列、若しくは（ ４）延長と組み合わ せの双方によって形成された核酸配列を意味する。 本明細書において「ペプチド核酸」とは、リジンのようなアミノ酸残基及びア ミノ基が加えられたオリゴマーを含む分子を意味する。これらの小分子は、抗遺 伝子剤とも称され、核酸のこれらの相補的な（鋳型の）鎖に結合することにより 転写物の伸張を停止させる（Nielsen PE等(1993)Anticancer Drug Des 8:53-63 ）。 本明細書において「欠失」とは、１または２以上のヌクレオチド若しくはアミ ノ酸残基が欠ける、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化として定 義される。 本明細書において「挿入」或いは「付加」とは、自然発生のＮＧＣＰと比較し て、結果的に１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ酸残基の加わるような ヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。 本明細書において「置換」とは、１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ 酸を異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置換することによって生ずる変化を指 す。 本明細書で用いられるとき、ＮＧＣＰとは、任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブ タ、マウス、ウマ、及び好ましくはヒトを含む哺乳類から得られた、天然の、合 成の、半合成の、又は組換え体を起源とする実質的に精製されたＮＧＣＰのアミ ノ酸配列を意味する。 ＮＧＣＰの「変異体」は、１又は２箇所以上のアミノ酸の「置換」により異な るものとなったアミノ酸配列を有し得るものである。この変異体は「保存的」変 化を含むものであり得、この保存的変化においては例えばロイシンをイソロイシ ンで置き換える場合のように置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性 を有する。稀に、変異体が「非保存的」に変化する場合もあり、この非保存的変 化では例えばグリシンがトリプトファンで置換される。類似した小変化には、ア ミノ酸の欠失、挿 入、若しくはその両方も含まれ得る。例えばDNAStarソフトウエアのような従来 より周知のコンピュータプログラムを用いて、生物学的或いは免疫学的活性を損 なわずに、置換、挿入、又は除去できるアミノ酸及びそのアミノ酸の数を決定す ることができる。 用語「生物学的に活性」とは、自然発生のＮＧＣＰの構造的機能、調節機能、 又は生化学的機能を有するＮＧＣＰを意味する。同様に「免疫学的活性」とは、 天然の、組換えの、又は合成のＮＧＣＰ、若しくはその任意のオリゴペプチドが 適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体に結合する能力 として定義される。 本明細書において、「誘導体」なる用語は、化学的に修飾されたＮＧＣＰをコ ードする核酸、又はコードされたＮＧＣＰを意味する。このような修飾の例には 、水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換がある。核酸誘導体は 、天然ＮＧＣＰの必須の生物学的特性を保持しているポリペプチドをコードする 。 本明細書において、「実質的に精製」なる用語は、この天然の環境から取り除 かれ、天然にはそれが結合して存在する少なくとも１つの他の成分から単離又は 分離されて、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは 少なくとも９０％遊離した核酸配列又はアミノ酸配列を有する分子を意味する。 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）」は 「核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する過程」（Coombs J（1994）Dict ionary of Biotechnolgy ,Stockton Press社,New York）を含む概念である。増幅 とは、核酸配列の複製を作り出すこととして定義され、通常周知のポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）法により実行される（Dieffenbach CW and GS Dveksler(199 5),PCR Primer,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press社,New york） 。 「厳密性」とは、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃下）か らＴｍの約２０〜２５℃下の範囲で発生する。当業者には理解できるように、厳 密性のあるハイブリダイゼーションでは、同一のポリヌクレオチド配列を同定、 つまり検出したり、或いは類似の、すなわち近縁なポリヌクレオチド配列を同定 、つまり検出するために用いることができる。説明 ここに開示するコンセンサスヌクレオチド配列は、新規な顆粒球走化性タンパ ク質２変異体の，１１４個のアミノ酸残基（配列番号：１）をコードする。この コンセンサス配列は、インサイト社クローンＮｏ．949299（PANCNOT05）及びイ ンサイト社クローンＮｏ．1321776（BLADNOT04）の延長及び組み合わせに基づく ものである。 ＮＧＣＰの核酸及びアミノ酸アライメントは第１Ａ図及び第１Ｂ図に示されて いる。第２図は、ＮＧＣＰと、近縁なケモカインであるＥＮＡ−７８（GI 60703 1；配列番号：３）と、ＧＣＰ−２（GI 462170；配列番号：４及びGI 415589； 配列番号：５）との間のアライメントを示し、保存的システイン残基Ｃ19、Ｃ49 、Ｃ51、Ｃ75、及びＣ91を示した図である。ＮＧＣＰの疎水性プロット（第３図 ）及びＥＮＡ−７８の疎水性プロット（第４図）は類似しているが、第２図に示 すように、これらの分子のリーダー配列及び成熟タンパク質配列を含む実際の残 基の間には有意な違いが存在する。更に、ＮＧＣＰとＥＮＡ−７８の等電点は、 それぞれ１０．３４及び９．１０である。第７Ａ図及び第７Ｂ図に示すのは、Ｎ ＧＣＰと、顆粒球走化性タンパク質２と類似の５"として注釈付けられたヒトＥ ＳＴ（GI 973875；配列番号：６）の核酸配列間のアライメントを示した図であ って、７０％の同一性を示している。この配列の初めの１８０ヌクレオチドの３ つのフレーム翻訳から、いくつか のフレームシフトが分かり、公表されたＥＮＡ−７８ペプチドに対する正確なリ ーダー配列が推定される。ＮＧＣＰは、通常、明確なＮグリコシル化部位を有し ていないことが分かっている。 ＮＧＣＰコーディング配列 ＮＧＣＰの核酸配列及び推定アミノ酸配列は、第１Ａ図及び第１Ｂ図に示され ている。本発明によれば、ＮＧＣＰをコードする核酸配列を用いて、ＮＧＣＰを 発現する組換え体分子を作り出すことができる。ここに開示する特定の実施例で は、ＮＧＣＰをコードする部分的配列は、初めに膵臓ｃＤＮＡライブラリー（PA NCNOT05）からインサイト社クローンＮｏ．949299として単離された。 遺伝暗号の縮重の結果、既知の又は自然発生の遺伝子のヌクレオチド配列に対 して最小限の相同性しか有していないものも含まれる多数のＮＧＣＰコード化ヌ クレオチド配列が作り出され得る、ということは当業者には明らかであろう。本 発明は、特に、可能なコドン選択に基づく組み合わせの選択によりなされ得る全 ての可能な核酸配列の変化をその範囲に含んでいる。それらの組み合わせは、自 然発生のＮＧＣＰのヌクレオチド配列に当てはまる標準的なトリプレット遺伝暗 号に基づいて作り出されるものであり、このような全ての変異は、ここに具体的 に示されたものと考えられたい。 ＮＧＣＰ及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は適切に選択された厳 密性の条件の下で、自然発生配列のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能な ものであるのが好ましいが、概ね異なるコドン使用を有するＮＧＣＰ又はその変 異体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。コドン選 択は、特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従って、特定の原核細胞の 、或いは真核細胞の発現宿主においてペプチドが発現する速度を高めるように選 択され得る。ＮＧ ＣＰ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を、コードされるアミノ酸配 列を変更することなく実質的に変更する理由は、例えば天然配列から作り出され る転写物よりより長い半減期のようなより望ましい特性を有するＲＮＡ転写物の 産生のためである。 現在では、ＮＧＣＰ又はその誘導体をコードするＤＮＡ配列、若しくはその一 部分を、完全に合成ケミストリにより作製して、その後、その合成遺伝子を任意 の入手可能なＤＮＡベクター及び細胞系に、この出願時点において周知の試薬を 用いて挿入することができる。更に、合成ケミストリを用いてＮＧＣＰをコード する配列又はその任意の部分に突然変異を誘発させることができる。 また本発明の範囲に含まれるものとして、種々の厳密性の条件の下で、第１図 のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なポリヌクレオチド配列がある。ハ ィブリダイゼーション条件は、Berger及びKimmel(1987,Guide to Molecular Clo ning Techniques Methods in Enzymology ,Vol 152,Academic Press,San Diego C A）に記載されているように、核酸結合複合体またはプローブの融点（Ｔｍ）に 基づいており、定義された「厳密性」で用いられる基準を与える。上記文献は本 明細書と一体に引用されたものである。 本発明において用いられ得るＮＧＣＰをコードする変異核酸配列は、異なるヌ クレオチド残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に同一の、または機能的 に等価のＮＧＣＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとなるものである 。そのタンパク質も、サイレント変化を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに 置換を含み、結果的に機能的に等価なＮＧＣＰとなる。慎重なアミノ酸置換は、 ＮＧＣＰの生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度 、疎水性、親水性並びにまた両親媒性についての類似性に基づいてなされ得る。 例えば負 に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電し たアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、同じ親水値を持つ荷電していな い極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン 、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニ ン並びにチロシンが含まれる。 本発明の範囲に含まれるものとして、ＮＧＣＰのアレルがある。ここで用いる 「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＮＧＣＰの別形態である。アレルは変異 、すなわち核酸配列の変化によって生じ、一般に変化したｍＲＮＡ或いはポリペ プチドを生成するが、そのｍＲＮＡ或いはポリペプチドの構造或いは機能は変更 される場合もあれば、されない場合もある。遺伝子によっては、アレル形態が存 在しないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するものがある。アレルを生 じる変異は一般に、アミノ酸の自然な欠失、付加並びに置換に起因する。このタ イプの変化はそれぞれ単独で、或いは他の遺伝子の組み合わせて、与えられた配 列内の１又は２以上の位置で生じ得る。 ＤＮＡ配列決定のための方法は周知であり、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ，Se quenase（商標）のクラノウフラグメント（US Biochemical社,Cleveland OH）、 Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer社,Norwalk CT）、熱安定性Ｔ７ポリメラー ゼ（Amersham社,Chicago IL）、或いはGibco BRL（Gaithersburg MD）Methods社 から市販されているELONGASE増幅システムのような組換えポリメラーゼとプルー フリーディングエキソヌクレアーゼとの組み合わせのような酵素を使用する。好 ましくは、この処理は、Hamilton Micro Lab2200(Hamilton社,Reno NV）、Pelti er Thermal Cycler（PTC200；MJ Reserch社,Watertown MA）並びにABI377DNAシ ーケンサ（Perkin Elmer社）のような装置を用いて自動化される。 ポリヌクレオチド配列の延長 ＮＧＣＰをコードするポリヌクレオチド配列は、部分的なヌクレオチド配列と 、プロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当業者には 周知の様々な方法とを用いて延長することができる。Gobinda等（1993;PCR Meth ods Appllc 2:318-22）は既知の部位に隣接する未知の配列を検索するために汎 用プライマーを用いる直接的な方法として「制限部位」ポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）法を開示している。ここでは、まずゲノムＤＮＡが、既知の領域に対し て特異的なプライマー及びリンカー配列に対するプライマーの存在下で増幅され る。増幅された配列は、その同じリンカープライマー及び最初のプライマーの内 部に含まれる別の特異的プライマーを用いてＰＣＲの２巡目にかけられる。ＰＣ Ｒの各回の生成物は、適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素 を用いて配列決定される。 逆ＰＣＲ法を用いて、既知領域に基づく多様なプライマーを利用した配列の増 幅、または延長を行うことができる（Triglia等(1988)Nucleic Acids Res16:818 6）。プライマーは、OLIGO（登録商標）4.06(National Biosciences社,Plymouth MN)或いは別の適切なプログラムを用いて設計され、長さが２０〜３０ヌクレオ チドで、５０％以上のＧＣ含有率を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列 にアニールする。この方法ではいくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域 の適当なフラグメントを生成する。次いでこのフラグメントは分子内ライゲーシ ョンにより環状にされ、ＰＣＲ用の鋳型として使用される。 キャプチャＰＣＲ法（Lagerstrom M等（1991）PCR Methods Applic 1:111-19 ）は、ヒト及び酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ内の既知の配列に隣接するＤ ＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を行うための方法である。またキャプチャＰＣＲ では、多重制限酵素消化及びライゲーション によってＰＣＲ前にＤＮＡ分子の未知の部分に、組換え二本鎖配列を配置する必 要がある。 未知の配列を検索するために用いることができる別の方法は、Parker JD等の 方法である（1991:Nucleic Acids Res 19:3055-60）。更に、ＰＣＲ、ネスト化 プライマー並びにPromoterFinderのライブラリーを用いて、ゲノムＤＮＡ内を歩 行させることができる（PromoterFinder（登録商標）、Clontech社（Palo Alto CA））。このプロセスは、ライブラリーをスクリーニングする必要がなく、イン トロン／エクソン接合部を探し出すのに有用である。 完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするための好適なライブラリーは、サイズ選 択された、より大きなｃＤＮＡを含むライブラリーである。またランダムプライ ミングした（rondom primed）ライブラリーは、遺伝子の５′及び上流領域を含 むより多くの配列を含むという点で好適である。ランダムプライミングしたライ ブラリーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを生成しない場合、 特に有用である。またゲノムライブラリーは、プロモータ結合領域の５’まで延 長するために有用である。 サイズを分析したり、或いは配列決定やＰＣＲ処理の産物のヌクレオチド配列 を確認するための新しい方法はキャピラリー電気泳動法である。迅速な配列決定 のためのシステムは、Perkin elmer社、Beckman Instruments社（Fullerton CA ）並びに他の企業から入手できる。キャピラリー電気泳動法では、電気泳動分離 のための流動性ポリマー、レーザで活性化される４つの異なる蛍光色素（各ヌク レオチドに対して１つ）を使用し、ＣＣＤカメラにより放射線の波長の検出を行 う。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えばPerkin elmer社製のGenotyper （登録商標）及びSequence Navigator（登録商標））を用いて電気信号に変 換され、サンプルの負荷からコンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程 がコンピュータ制御される。キャピラリー電気泳動法は特定のサンプルの限定さ れた量の中に存在するＤＮＡの小片の配列決定に特に適している。この方法によ り３０分間でＭ１３ファージＤＮＡの３５０ｂｐを再現可能な形で配列決定でき たことが報告されている（Ruiz-Martinez MC等（1993）Anal Chem 65:2851-8） 。 ヌクレオチド配列の発現 本発明により、ＮＧＣＰ、そのポリペプチドの断片、融合タンパク質或いはそ の機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列を、適切な宿主細胞内でのＮ ＧＣＰの発現を誘導する組換えＤＮＡ分子を生成するために用いることができる 。遺伝暗号固有の縮重のために、概ね同一か或いは機能的に等価なアミノ酸配列 をコードする他のＤＮＡ配列も、ＮＧＣＰのクローニングや発現のために用いる ことができる。当業者には理解できるように、非自然発生コドンを有するＮＧＣ Ｐコード化ヌクレオチド配列を生成することは有益であり得る。特定の原核細胞 或いは真核細胞の宿主において好適なコドン(Murray E等(1989);Nucleic Acids Res 17:477-508)を選択して、例えば、ＮＧＣＰ発現率を増大させたり、或いは 自然発生配列から生成された転写産物より長い半減期のような望ましい特性を有 する組換えＲＮＡ転写産物を生成することができる。 本発明のヌクレオチド配列は、様々な目的でＮＧＣＰをコードする配列を改変 するべく組換えられ得るが、このような改変には、限定はしないが遺伝子生成物 のクローニング、プロセシング並びにまた発現を修飾する改変が含まれる。例え ば、特定部位突然変異誘発のような当業者には周知の技術を用いて突然変異を誘 発させることによって、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、 コドン選好の変化等をもたらすことができる。 本発明の別の実施例では、天然ＮＧＣＰコーディング配列、修飾ＮＧＣＰコー ディング配列或いは組換えＮＧＣＰコーディング配列を異種の配列に結合して、 融合タンパク質をコードする配列にする。例えば、ＮＧＣＰ活性のインヒビター を選別すべくペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体に より認識される異種のペプチドを発現するキメラＮＧＣＰタンパク質をコード化 することが役立ち得る。融合タンパク質はＮＧＣＰ配列と異種のタンパク質配列 との間の位置に切断部位を包含するように設計することもでき、これによってＮ ＧＣＰを切断して、異種の部分から分けて実質的に精製することが可能となる。 本発明の別の実施例では、ＮＧＣＰコーディング配列は、当業者によく知られ た化学的方法（Caruthers等（1980）Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223、Crea, Horn（1980）Nuc Acids Res 9:2331、Matteucci,Caruthers（1980）Tetrahedron Lett 21:719、Chow,Kempe（1981）Nuc Acids Res 9:2807-2817参照）を用いて 、全体的に、或いは部分的に合成することができる。別法では、ＮＧＣＰアミノ 酸配列を、全体的に或いは部分的に合成する化学的方法を用いてタンパク質自体 を生成することができる。例えば、種々の固相技術(Roberge JY等(1995)Science 269:202-204）でペプチド合成を行うことができ、合成の自動化は、例えばABI4 31Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を製造者の指示に従って用いること により達成することができる。 この新たに合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィにより精 製することができる（例えばCreighton（1983）Proteins Structure And Molecu lar Principles ,WHF reeman and Co,New York参照）。合成されたペプチドの組 成は、アミノ酸解析或いは配列決定処理により確認することができる（例えばth e Edman degradation procedure;Creighton，上述）。さらにＮＧＣＰのアミノ 酸配列、或い はその任意の部分を、その直接の合成の際に改変したり、また他の細胞内メディ エータ或いはその任意の部分に由来する配列と化学的方法を用いて結合して、変 異体ポリペプチドを生成することができる。 発現系 生物学的に活性のＮＧＣＰを発現するために、ＮＧＣＰコーディングヌクレオ チド配列或いは機能的等価物は、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコー ド化配列の転写及び翻訳に必要不可欠な要素を含むベクターに挿入される。 ＮＧＣＰコーディング配列及び適切な転写や翻訳の制御エレメントを含む発現 ベクターを構成するために当業者に周知の方法が用いられる。 これらの方法には、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo組換 え、即ち遺伝子組換え技術が含まれる。このような技術は、Sambrook等（1989）Molecular Cloning,A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Press,Planview NY及びAusubel FM等Current Protoclin Molecular Biolgy,John Wilky &Sons,Ne w Yorkに記載されている。 種々の発現ベクター／宿主系を、ＮＧＣＰコード化配列を保持し、かつ発現す るために利用することができる。このようなものには、限定はされないが、組換 えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転 換した細菌、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌、ウイルス発現ベクター （例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（ 例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMV、タバコモザイクウイルスTMV）をト ランスフェクトした、或いはバクテリア発現ベクター（例えばTi、或いはpBR322 プラスミド）で形質転換した植物細胞系、或いは動物細胞系が含まれる。 これらの系の「制御エレメント」或いは「調節配列」は、その力及び 特異性は様々で、ベクターの非翻訳領域、エンハンサー、プロモータ及び３’非 翻訳領域であり、これらは転写及び翻訳を実行するために宿主細胞のタンパク質 と相互作用する。利用されるベクター及び宿主に応じて、構成的及び誘導性プロ モータを含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントが用いられ得る。例えば 、バクテリア系においてクローニングする際には、Bluescript（登録商標）ファ ージミド（Stratagene社，LaJolla CA）のハイブリッドlacZプロモータ及びptrp -lacハイブリッド並びに同様の誘導性プロモータが用いられる。バキュロウイル スポリヘドリンプロモータは昆虫細胞において用いられる。植物細胞のゲノム（ 例えば熱ショック，ＲＵＢＩＳＣＯ及びストレージタンパク質遺伝子）に由来す る、或いは植物ウイルス（例えばウイルス性プロモータ或いはリーダー配列）に 由来するプロモータ或いはエンハンサはベクターにクローン化され得る。哺乳動 物細胞では、哺乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルス由来のプロモータが最適で ある。ＮＧＣＰの多数の複製を含む株細胞を生成する必要がある場合には、SV40 或いはEBVに基づくベクターを、適切な選択マーカーと共に用いる。 細菌系では、ＮＧＣＰの発現の用途に応じて多数の発現ベクターが選択され得 る。例えば抗体を誘発するために大量のＮＧＣＰが必要とされる場合は、容易に 精製される融合タンパク質を高濃度で発現できるベクターが望まれる。そのよう なベクターには、限定はしないが、大腸菌クローニングベクター及び発現ベクタ ーBluescript（Stratagene社）（このベクターでは、ＮＧＣＰコード化配列が、 アミノ基末端メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列を備え たフレーム内においてベクターに結合されてハイブリッドタンパク質が生成され る）や、pINベクター（Van Heeke&Schuster（1989）J Biol Chem 264:5503-5509 ）等が含まれる。またpGEXベクター(Promage社、Madison WI) も、グルタチオンＳ−トランスファーゼ（GST）を有する融合タンパク質として 異種ポリペプチドを発現するため用いられる。一般に、そのような融合タンパク 質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへの吸着に続き、遊離グルタ チオンの存在下における溶出により溶解した細胞から容易に精製できる。その系 において生成されたタンパク質はヘパリン、トロンビン或いはＸＡ因子プロテア ーゼ切断部位を含むように設計され、対象となるクローン化ポリペプチドは随意 にGST部分から放出され得る。 酵母菌、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因 子、アルコールオキシダーゼ及びPGHのような構成的或いは誘導性プロモータを 含む多数のベクターが用いられる。再検討する場合には、Ausubel等（前出）及 びGrant等（1987）Methods Enzymol 153:516-544を参照されたい。 植物発現ベクターを用いる場合には、ＮＧＣＰをコードする配列の発現は、多 数の任意のプロモータにより促進される。例えばCaMVの35S及び19Sプロモータ（ Brisson等（1984）Nature 310:511-514）のようなウイルス性プロモータは、単 独で、或いはTMV(Takamatsu等(1987)EMBO J 6:307-311)からのオメガ−リーダー 配列と共に用いられる。別法では、RUBISCO（Coruzzi等（1984）EMBO J 3:1671- 1680）、Broglie等（1984）Science 224:838-843）の小サブユニット、或いは熱 ショックプロモータ（Winter J及びSinibaldi RM(1991)Results Probl Cell Dif fer 17:85-105）のような植物プロモータが用いられる。これらの構成は直接Ｄ ＮＡ形質転換或いは病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞内に導入さ れる。そのような技術を再検討する場合には、Hobbs S及びMurry LE、McGraw Hi ll Yearbook of Science and Technology（1992）McGraw Hill NY,pp191-196及 びWeissbach and Weissbach（1988）Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press NY,p p421-463を参照されたい。 ＮＧＣＰを発現するために用いることができる別の発現系は昆虫系である。そ のような系の一つでは、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV） がベクターとして用いられ、Spodoptera frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの 幼虫において外来遺伝子を発現する。ＮＧＣＰコード化配列は、ポリヘドリン遺 伝子のような、ウイルスの非必須領域にクローニングされ、ポリヘドリンプロモ ータの制御下に置かれる。ＮＧＣＰの挿入が成功した場合には、ポリヘドリン遺 伝子が不活性にされ、コートタンパク質膜が欠如した変異体ウイルスが生成され る。次いで、この変異体ウイルスは、S.frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの幼 虫への感染させるために用いられ、その中でＮＧＣＰが発現される（Smith等（1 983）J Virol 46:584、Engelhard EK等（1994）Proc Nat Acad Sci 91:3224-7） 。 哺乳類宿主細胞では、多数のウイルス性発現系を利用することができる。発現 ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、ＮＧＣＰのコード化配列 は、後期プロモータ及び三連リーダ配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳物 複合体内に結合される。ウイルス性ゲノムの非必須領域への挿入により、感染し た宿主細胞でＮＧＣＰを発現することができる生存可能なウイルスになる（Loga n及びShenk（1984）Proc Nat Acad Sci 81:3655-3659）。さらにラウス肉腫ウイ ルス（RSV）エンハンサのような転写エンハンサを哺乳類宿主細胞内の発現を増 加させるために用いることができる。 また、ＮＧＣＰ配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要で ある。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接の配列が含まれる。ＮＧ ＣＰ及びその開始コドン及び上流配列が適切な発現ベ クター内に挿入される場合には、追加の翻訳制御シグナルは不要である。しかし ながらコード化配列、或いはその一部のみが挿入される場合には、ATG開始コド ンを含む外来の翻訳制御シグナルが与えられなければならない。さらに、開始コ ドンは正しい読み枠内にある必要があり、全インサートの転写を確実に行わなけ ればならない。外来転写エレメント及び開始コドンは、自然及び合成両方の様々 な起源に由来するものであり得る。発現の効果は、その細胞系に適切なエンハン サを含めることにより強化される（Scharf等（1994）Results Probl Cell Diffe r 20:125-62、Bitter等（1987）Methods Enzymol 153:516-544）。 さらに宿主細胞株は、挿入された配列を望ましい形に改変したり、発現したタ ンパク質のプロセシングを行う能力で選択される。このようなポリペプチドの修 飾は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化 、脂質化（lipidation）並びにアシル化を含む。またタンパク質の「プレプロ」 形態を切り離す、翻訳後プロセシングは、正しい挿入、折り畳み、並びにまた機 能の発揮のために重要である。CHO,HeLa,MDCK,293,WI38等のような異なる宿主細 胞は、そのような翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特徴的な機構を有して おり、導入される外来タンパク質の修飾やプロセシングを確実に実行するべく選 択される。 長期間にわたって高収率の変異体タンパク質の生産を確保するためには、安定 した発現が望ましい。例えばＮＧＣＰを安定的に発現する株細胞は、ウイルス由 来の複製物、或いは内在性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を含む発現ベ クターを用いて形質転換される。ベクターの導入に続いて、細胞は、選択培地に 切り替えられる前に、濃縮培地内で１〜２日間成長させられる。選択マーカーは 選択物への耐性を与え、導入された配列をＤＮＡ内に安定的に結合する細胞を同 定できるようにす る。安定的に形質転換された細胞の耐性凝集塊はその細胞型に適切な組織培養技 術を用いて増殖することができる。 形質転換された株細胞を回収するために任意の数の選択系を用いることができ る。限定はしないが、選択系は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler 等（1977）Cell 11:223-32）及びアデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ （Lowy等（1980）Cell 22:817-23）遺伝子を含み、それぞれtk-及びaprt-細胞に おいて用いられる。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の 基礎として用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を 与え（Wigler等(1980)Natl Acad Sci 77:3567）、nptはアミノグリコシッド剤、 ネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え（Colberre-Garapin等（1981）J Mol Biol 150:1）、als或いはpatはクロルスルフロン（chlorsulfuron）、フォスフ ィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinotricin acetyltransferas e）に対する耐性を与える（上記Murry）。さらに選択可能な遺伝子として、例え ば細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするtrpB、細 胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるようにするhi sDが記載されている（Hartman及びMulligan（1988）Proc Nalt Acad Sci 85:804 7）。最近になって、形質転換体を同定するためばかりではなく、特定ベクター 系による一過性の或いは安定なタンパク質発現の量を定量するために広く用いら れるβ−グルクロニダーゼ、アントシアニン及びルシフェリンのような標識によ る可視標識が非常によく用いられるようになった（Rhodes CA等（1995）Methods Mol Biol 55:121-131）。 本発明のポリヌクレオチド配列を含む形質転換体の同定 マーカー遺伝子発現の存在／不存在は、対象の遺伝子も存在することを示唆す るが、その存在及び発現は確認されるべきである。例えばＮＧ ＣＰがマーカー遺伝子配列内に挿入されるなら、ＮＧＣＰを含む組換え細胞がマ ーカー遺伝子の機能の存在により同定できる。別法ではマーカー遺伝子は、単一 プロモータの制御下でＮＧＣＰ配列と直列に配置することができる。誘導または 選択に応じてのマーカー遺伝子の発現は、通常さらにＮＧＣＰの発現をも示す。 この他、ＮＧＣＰのコーディング配列を含み、さらにＮＧＣＰを発現する宿主 細胞が、当業者には周知の様々な手順により同定できる。これらの手順は、限定 はしないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及び 、核酸及びタンパク質の検出並びにまた定量するための膜、溶液或いは破片ベー スの技術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイを含む。 ＮＧＣＰポリヌクレオチド配列の存在は、ＮＧＣＰのプローブ、一部、或いは フラグメントを用いるＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーシ ョン或いは、増幅により検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイでは 、ＮＧＣＰ配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーを使用し、ＮＧＣ ＰのＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形質転換体を検出する。本明細書において「オリ ゴヌクレオチド」或いは「オリゴマー」とは、プローブ或いは、ＰＣＲで増幅さ れるセグメントであるアンプリマーとして用いることができる、少なくとも１０ ヌクレオチド、多い場合には６０ヌクレオチド、好適には１５〜３０ヌクレオチ ド、より好適には２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列を指す。 このタンパク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいず れかを用いてＮＧＣＰポリペプチドの発現を検出し、測定するための種々のプロ トコルが当業者には周知である。このようなプロトコルの例としては、酵素結合 免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光表示式細 胞分取器法（ＦＡＣＳ）を含む。Ｎ ＧＣＰポリペプチド上で２つの非干渉なエピトープに対して反応するモノクロー ナル抗体を利用する二部位モノクローナルベースイムノアッセイ（two-site,mon oclonal-based immunoassay）は好適ではあるが、競合的結合アッセイも用いら れる。これらアッセイの並びに他のアッセイは、Hampton R等（1990,Serologivc al Methods,a Laboratory Manual,APS Press,St Paul MN）及びMaddox DE等（19 83,I Exp Med 158:1211）等に記載されている。 さらに多くの標識及び結合技術は当業者には周知であり、種々の核酸及びアミ ノ酸検査法において用いることができる。ＮＧＣＰに関連する配列を検出するた めの標識されたハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプローブを生成するための 手段には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、末端標識化或いは標識 化ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅などがある。別法では、ＮＧＣＰ配列、或い はその任意の部分が、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクターにクローニング される。そのようなべクターは当分野では周知であり、市販されており、Ｔ７， Ｔ３或いはＳＰ６並びに標識されたヌクレオチドのような適切なＲＮＡポリメラ ーゼの付加により、in vitroでのＲＮＡプローブ合成のために用いることができ る。 Pharmacia Biotech社（Piscataway NJ）、Promega社（Madison WI）並びにUS Biochemical社（Cleveland OH）のようないくつかの企業がこれらの手順に対す る商用のキット及びプロトコルを提供している。適切なリポーター分子、すなわ ち標識には、放射性核種、酵素、蛍光性剤、化学ルミネセンス剤或いは色素生成 剤や、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子或いはそれに類似のものが含ま れる。そのような標識の使用について記載している特許には、米国特許第3,817, 837号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第 4,275,149号並びに第4,336,241号がある。また、組換え免疫グロブリンの製造に ついては米国特許第4,816,567号に記載の方法を用いることができ、本明細書と ともに参照されたい。 ＮＧＣＰの精製 ＮＧＣＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培 地からコード化タンパク質を発現及び回収するために適切な条件下で培養される 。組換え細胞により生成されるタンパク質は、用いられる配列並びにまたベクタ ーに応じて、細胞内に分泌、つまり含有されるようにすることができる。当業者 には理解されるように、ＮＧＣＰをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベク ターは、原核細胞か、真核細胞の細胞膜を通してのＮＧＣＰの分泌を誘導するシ グナル配列を含むように設計される。他の組換え体作製物では、ＮＧＣＰを、可 溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオ チド配列に結合することができる（Kroll DJ等（1993）DNA Cell Biol 12:441-5 3、融合タンパク質を含むベクターに関する上記論議も参照されたい）。 またＮＧＣＰは、タンパク質精製を容易にするために加えられた１または２以 上の付加的なポリペプチドドメインを備えた組換えタンパク質として発現される 。そのような精製を容易にするドメインには、限定はしないが、固定化金属上で の精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュールのような金属キレート ペプチド（Porath J（1992）Protain Expr Purif 3:263-281）、固定化免疫グロ ブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、並びにＦＬＡＧＳ延長／ アフィニティ精製システムにおいて用いられるドメイン（Immunex社、Seattle W A）が含まれる。精製ドメイン及びＮＧＣＰ間に第ＸＡ因子或いはエンテロキナ ーゼ（Invitrogen,San Diego CA）のような切断可能なリンカー配列を 含めるのは精製を促進するのに役立つ。このような発現ベクターの１つは、ＮＧ ＣＰを含む融合タンパク質の発現を提供し、かつ６個のヒスチジン残基、それに 続くチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位をコードする核酸を含む。ヒ スチジン残基によりＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラ フィー、Porathら（1992）Protein Expression and Purification 3:263-281に 記載）上での精製を促進すると共にエンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク 質からの目的タンパク質の精製のための手段となる。 組換え体の産生に加えて、ＮＧＣＰのフラグメントは、固層技術を用いた直接 のペプチド合成で形成することもできる。（Stewartら（1969）Solid-Phase Pet ide Synthesis,WH Freeman Co,San Francisco;Merrifield J（1963）J Am Chem Soc 85:2149-2154を参照されたい）。in vitroタンパク質合成は手作業で行える が、自動化することもできる。自動的な合成は、例えば、Applied Biosystem 43 1Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer,Foster City CA）を製造者の指示に従 って用いて行うことができる。ＮＧＣＰの種々のフラグメントを個別に化学的に 合成し、化学的方法を用いて結合して完全長分子を作り出すことができる。 ＮＧＣＰの使用 ＮＧＣＰの発見により、種々の病理学的過程における分子レベルでの介入のた めの手段、及びそのよりよい理解を得るための機会が得られた。ＮＧＣＰ又はそ の誘導体は、白血病や他の癌、免疫不全、又は過剰免疫応答のような疾病状態の 利用において治療的に用いることができる。 １分量（minute amounts）のＮＧＣＰを腫瘍細胞にトランスフェクトすること により、腫瘍形成能が低下し得る。精製されたＮＧＣＰを投与して、腫瘍退行を 引き起こす好中球の顆粒球のタンパク分解活性を誘導することができる。 哺乳類におけるＮＧＣＰの発現（Broxmeyer，前出）は、フィードバック機構 により調節されると考えられることから、ＮＧＣＰを、骨髄前駆体細胞集団に骨 髄抑制性作用を及ぼすべく患者に投与することができる。ＮＧＣＰは、アセトニ トレル内でプレインキュベートしてもしなくても、顆粒球−マクロファージ、赤 血球系、及び多分化能前駆体細胞を抑制することが期待され、従って、毎日のケ モカインを用いた治療は、急性又は慢性の白血病の患者の治療に役立ち得る。 ＮＧＣＰを含む治療用組成物は、免疫系を損なう疾病状態にある患者の予防や 治療の用途に応用することができる。このような疾病状態には、限定されないが 、ＨＩＶ感染、ヨブ−バックレイ症候群、怠けもの白血球症候群、後天性無顆粒 球症、及びチェディアック−東症候群がある。これらの疾病の病因は異なってい るが、共通の特徴には、免疫系の機能障害と、それに伴う感染症に対する素因が 含まれる。ＮＧＣＰを１分量投与することにより、全身性防衛のための特定部位 に対する白血球の誘因及び活性化が期待され得る。 これに対し、アンチセンス技術は、アンタゴニスト、インヒビター、又は抗Ｎ ＧＣＰ抗体の導入による、ＮＧＣＰ発現の抑制は、病因の予防において役立ち得 る。このような状態において、細胞破壊がもたらす過剰な白血球の化学誘因及び 活性を防止することは重要である。このような疾病状態には、特発性拡張型心筋 症、肺気腫、ループス、重症筋無力症、膵炎、及び慢性関節リウマチが含まれる 。 ＮＧＣＰの抗体 ＮＧＣＰ特異的抗体は、ＮＧＣＰの発現が関係する病気や疾病の診断のために 役立つ。このような抗体には、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モノクロ ーナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント並びにＦａｂ発現ライブ ラリにより生成されるフラグメントが含まれ る。中和抗体、すなわちＮＧＣＰポリペプチドの生物活性を抑制する抗体は、特 に診断及び治療に好適である。 抗体誘発のためのＮＧＣＰは生物学的活性を有している必要はないが、そのタ ンパク質断片、つまりオリゴペプチドは抗原性でなければならない。特異的抗体 を誘発するために用いられるペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸、好ましく は少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。これらの配列は 、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一のものであり、小さい自然発生の 分子の全アミノ酸配列を含み得る。ＮＧＣＰアミノ酸の短いストレッチを、キー ホールリンペットヘモシアニン及びキメラ分子に対して産生された抗体のような 他のタンパク質の配列に融合することができる。ＮＧＣＰに対する抗体の生成の ために、当分野においてよく知られる手順が用いられる。 抗体を産生するために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む種々の宿主は 、免疫学的特性を保持するＮＧＣＰ或いはその任意の部分、フラグメント或いは オリゴペプチドを注入することにより免疫することができる。宿主の種に応じて 、種々のアジュバントが免疫学的反応を促進するために用いられる。そのような アジュバントには、限定はしないが、フロイントのアジュバント、水酸化アルミ ニウムのような無機質ゲルアジュバント、リゾレシチンのような表面活性物質ア ジュバント、プルロニックポリオルアジュバント、ポリアニオンアジュバント、 ペプチドアジュバント、油性乳剤アジュバント、キーホールリンペットヘモシニ アンアジュバント並びにジニトロフェノールアジュバントが含まれる。ＢＣＧ（ カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウムパルヴム（Corynebacterium parvum）は有用なヒトアジュバントである。 ＮＧＣＰに対するモノクローナル抗体は、培地中の連続株細胞によって抗体分 子の産生を行うための任意の技術を用いて調製される。これら は、限定はしないが、Koehler及びMilstein(1975,Nature 256:495-497)に当初掲 載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor等（1983 ）Immunol Today 4:72、Cote等（1983）Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030）及 びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cote等（1985）Monoclonal Antibodies and Ca ncer Therapy ,Alan R Liss Inc,pp77-96）を含む。 さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための「キメラ 抗体」の生成、即ちヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングのた めに開発された技術が用いられる（Morrison等（1984）Proc Natl Acad Sci 81: 6851-6855）、Neuberger等（1984）Nature 312:604-608、Takeda等（1985）Natu re 314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のための周知技術（米国特許第 4,946,778号）を、ＮＧＣＰ特異的一本鎖抗体を生成するために適用する。 また抗体は、リンパ球集団におけるin vivo産生を誘導することにより、或い はOrlandi等（1989,Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837）並びにWinter G及びMil stein C（1991,Nature 349:293-299）に開示されているような組換え免疫グロブ リンライブラリー、または高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングす ることによっても生成することができる。 ＮＧＣＰに対する特異結合部位を含む抗体フラグメントも生成することができ る。例えばこのようなフラグメントには、限定はしないが、抗体分子のペプシン 消化により生成することができるＦ（ａｂ’）2フラグメント及びＦ（ａｂ’）2 フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるＦａ ｂフラグメントが含まれる。別法では、所望の特異性を有するモノクローナルＦ ａｂフラグメントを迅速に、しかも容易に同定できるように、Ｆａｂ発現ライブ ラリーを構築す る（Huse WD等（1989）Science 256:1275-1281）。 確立された特異性を有するポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のい ずれかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射定量測定法のための種々のプ ロトコルが当分野ではよく知られている。そのようなイムノアッセイでは、一般 に、ＮＧＣＰとその特異的抗体（或いは類似のＮＧＣＰ結合分子）との間の複合 体の形成、並びに複合体形成の測定が行われる。特異的ＮＧＣＰタンパク質上の ２つの非干渉性エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部 位モノクローナル用イムノアッセイが好適ではあるが、競合結合アッセイも用い られる。これらの検査法はMaddox DE等（1983,J Exp Med 158:1211）に記載され ている。 ＮＧＣＰ特異的抗体を用いる診断検査法 特定のＮＧＣＰ抗体は、ＮＧＣＰの発現の誘発によって特性化される病気或いは 疾病の診断や、ＮＧＣＰで治療されている患者のモニタリングのためのアッセイ において役立つ。ＮＧＣＰについての診断アッセイは、ヒトの体液、細胞或いは 組織の抽出物において、ＮＧＣＰを検出するための抗体或いは標識を利用する方 法を含む。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾の有無に拘わらず用いること ができる。多くの場合、ポリペプチド及び抗体は、共有結合、或いは非共有結合 かのいずれかでそれらをリポーター分子と結合することにより標識される。種々 のリポーター分子が周知となっており、その幾つかについては上記した。 それぞれのタンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体或いはモノクロー ナル抗体を用いて、ＮＧＣＰポリペプチドを測定するための種々のプロトコルが 当分野では周知である。その例として、酵素結合免疫測定法（ELISA）、ラジオ イムノアッセイ（RIA）並びに蛍光表示式細胞分取器法（FACS）がある。ＮＧＣ Ｐポリペプチド上の２つの非干 渉性エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクロ ーナル用イムノアッセイは好適ではあるが、競合的結合アッセイも用いられる。 これらのアッセイは、他にもあるが、Maddox DE等（1983,I Exp Med 158:1211） に記載されている。 疾病の診断の基礎を提供するために、ＮＧＣＰ発現についての通常の値、すな わち標準値が確立されなければならない。これは複合体形成のために適切な条件 下で、ヒト或いは動物どちらでもよいが、正常の被験者から得られる体液或いは 細胞抽出物と、ＮＧＣＰに対する抗体とを結合することにより得ることができる が、これは当分野ではよく知られた技術である。標準的な複合体形成量は、一連 のポジティブコントロールの希釈系とそれを比較することにより定量され、抗体 の既知の量が既知の濃度の精製ＮＧＣＰと結合される。その後正常サンプルから 得られた標準値を、ＮＧＣＰが関係する疾患を潜在的に患う被験者からのサンプ ルから得られた値と比較する。標準値と対象値との偏差によって疾病の存在を確 認できる。 薬物スクリーニング ＮＧＣＰ、その触媒作用性または免疫原性フラグメント或いはオリゴペプチド は、種々の任意の薬物スクリーニング技術において治療用化合物のスクリーニン グのために用いることができる。そのような試験において用いられるフラグメン トは、溶液、固体支持体への付着、細胞表面への付着、或いは細胞内への定着に おいて制限はない。ＮＧＣＰと試験される薬剤との間の結合複合体形成が測定さ れる。 薬物スクリーニングのための別の方法は、ＮＧＣＰポリペプチドへの安定的な 結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを可能にするもので あり、１９８４年９月１３日公告の欧州特許出願第84/03564号（Guysen）に詳細 に記載されている。この文献を本明細書 に一体に参照されたい。概要としては、多数の別々の小ペプチド試験用化合物を プラスチックピン或いはいくつかの他の表面のような、固体基質上で合成する。 ポリペプチド試験化合物をＮＧＣＰフラグメントと反応させ、洗浄する。次いで 結合ＮＧＣＰを当分野で周知の方法により検出する。また精製ＮＧＣＰを前述の 薬物スクリーニング技術において使用するために、プレート上に直接コーティン グすることもできる。別法では、ペプチドを捕捉し、固形支持体上にペプチドを 固定するために非中和抗体を用いる。 また本発明は、ＮＧＣＰに結合し得る中和抗体特性が、ＮＧＣＰとの結合につ いて特に試験化合物と競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの使用も意図 している。このようにして、抗体を用いて１または２以上の抗原性決定基をＮＧ ＣＰと共通に有する任意のペプチドの存在を検出することができる。 ＮＧＣＰコーディングポリヌクレオチドの使用 ＮＧＣＰポリヌクレオチド、或いはその一部が診断並びにまた治療目的で用い られる。診断目的の場合、本発明のＮＧＣＰは、ＮＧＣＰの発現が関与する生検 組織における遺伝子発現を検出し、かつ定量するために用いられる。診断試験は 、ＮＧＣＰが存在、不存在、及び過剰発現の何れの状態にあるかを区別したり、 治療的介入の際にＮＧＣＰ濃度の調節をモニタリングするのに役立つ。本発明の 範囲には、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及び ＰＮＡが含まれる。 本発明の別の側面は、ＮＧＣＰまたは近縁な分子をコードするゲノム配列を含 むポリヌクレオチド配列を検出できるハイブリダイゼーションプローブ或いはＰ ＣＲプローブを提供することである。そして、そのプローブの特異性、すなわち 非常に高度な保存領域（例えば５’調節領域における１０個の独特のヌクレオチ ド）か、低度に保存的な領域（例え ば特に３’領域におけるシステイン残基の間の領域）の何れに由来するのかとい うことや、ハイブリダイゼーション或いは増幅の（高度の、中程度の或いは低度 の）厳密性によって、そのプローブが自然発生ＮＧＣＰのみを同定するものであ るか、或いはアレル配列や近縁な配列も同定するものであるかが決まってくる。 プローブは近縁なインヒビターをコードする配列を検出するためにも用いるこ とができ、好ましくは、これらのＮＧＣＰの任意のものをコードする配列から得 られるヌクレオチドを少なくとも５０％含むべきである。本発明のハイブリダイ ゼーションプローブは、配列番号：２のヌクレオチド配列か、プロモータ、エン ハンサエレメント及び自然発生ＮＧＣＰのイントロンを含むゲノムの配列に由来 するものであり得る。ハイブリダイゼーションプローブは種々のリポータ分子に より標識することができ、この標識には、32Ｐや35Ｓのような放射性核種、アビ ジン／ビオチン結合系によりプローブに結合するアルカリホスファターゼのよう な酵素標識等が含まれる。 ＮＧＣＰのＤＮＡに対する特異的ハイブリダイセーションプローブの生成のた めの他の手段は、ｍＲＮＡプローブ産生用のベクターにＮＧＣＰやＮＧＣＰ誘導 体をコードする核酸配列をクローン化することである。このようなベクターは周 知であって市販されており、Ｔ７やＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのような適切な ＲＮＡポリメラーゼや適切な放射性標識ヌクレオチドを付加することにより、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。診断的利用 ＮＧＣＰをコードするポリヌクレオチド配列を、ＮＧＣＰの発現が関与する病気 や疾病の診断のために用いることができる。例えば、ＮＧＣＰをコードするポリ ヌクレオチド配列を、ＮＧＣＰ発現を検出するため の生検組織や体液の、ハイブリダイゼーションアッセイ或いはＰＣＲアッセイに おいて用いることができる。そのような定性的及び定量的方法の形態には、サザ ンブロット法或いはノーザンブロット法、ドットブロット法或いは他の膜用技術 、ＰＣＲ技術、ディップスティック試験法（試験紙法）、ピン或いはチップ技術 及びELISA技術が含まれる。これらの技術は全て、当分野ではよく知られており 、実際に市販されている多くの診断キットの基礎となっている。 ここに開示したＮＧＣＰヌクレオチド配列は、炎症や疾病に関係する活性化や 誘導を検出するアッセイのための基礎を提供する。ＮＧＣＰヌクレオチド配列は 、既知の方法により標識され得、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した 条件の下で、患者の体液や組織のサンプルに加えられる。インキュベーション時 間の経過後、このサンプルを、ヌクレオチドが酵素で標識されている場合には所 望に応じて色素（または他の展開剤を要する標識）を含む適合性の液体で洗浄す る。この適合性の液体をリンスした後、色素を定量して標準値と比較する。生検 サンプルや抽出サンプルにおける色素の量が、比較用対照サンプルの色素量を著 しく上回っている場合には、このヌクレオチド配列はサンプルのヌクレオチド配 列とハイブリッド形成しており、サンプル内に著しく高い濃度のＮＧＣＰヌクレ オチド配列が存在していることは、関連する炎症及び／または疾病が存在してい ることを示している。 このようなアッセイは、特定の治療行為の有効性を評価するため、動物実験、 臨床試験、或いは個々の患者の治療をモニタリングする際に用いることができる 。疾患を診断するための基礎を与えるために、ＮＧＣＰ発現に対する正常な或い は標準的なプロフィールが確立されなければならない。この標準プロフィールは 、正常な被験者、すなわち動物或いはヒトから得られる体液或いは細胞抽出物を 、ハイブリダイゼーション 或いは増幅に適切な条件下で、ＮＧＣＰ或いはその一部と結合することにより確 立される。標準的なハイブリッド形成は、正常被験者に対して得られる値と、既 知の実質的に精製されたＮＧＣＰの量が用いられる同一の実験におけるポジティ ブコントロール希釈系列で得られる値とを比較することにより定量することがで きる。正常なサンプルから得られた標準値は、ＮＧＣＰ発現に関連する障害或い は疾患を潜在的に患っている被験者からのサンプルから得られる値と比較される 。標準値と被験者値との偏差から疾病の存在が確認される。 ひとたび疾患が確認されると、現存する治療用薬剤が投与され、治療プロファ イルが作成される。このようなアッセイは、その数値が正常すなわち標準パター ンに向かって回復しているか否かを評価するために規則的に繰り返される。継続 的な治療プロファイルを用いて数日間或いは数ヶ月の期間にわたる治療効果を示 すことができる。 米国特許第4,683,195号、第4,800,195号並びに第4,965,188号に記載のような ＰＣＲ法により、ＮＧＣＰ配列に基づくオリゴヌクレオチドの追加の使用法が提 供される。このようなオリゴマーは一般には化学的に合成されるが、酵素を用い て発生させたり、或いは組換え体を起源として生成することもできる。一般にオ リゴマーは、通常特定の遺伝子或いは状態を同定するために最適な条件下で用い られる２つのヌクレオチド配列、即ちセンス方向（５’→３’）のヌクレオチド 及びアンチセンス方向（３’←５’）のヌクレオチドからなる。同一の２つのオ リゴマー、入れ子オリゴマーの組、或いはオリゴマーの縮重プールでさえ、近縁 なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出や定量のためのより低い厳密性の条件下であっ ても用いることができる。 さらに特定の分子の発現を定量するための方法には、放射性標識（radiolabel ing）(Melby PC等 1993 J Immunol Methods 159:235-44) 或いはビオチン標識（Duplaa C等 1993 Anal Biochem 229-36）ヌクレオチドの 利用、制御核酸の同時増幅（coamplification）の利用、並びに実験結果を補完 して書かれた標準的なグラフ曲線の利用が含まれる。多数のサンプルの定量は、 ＥＬＩＳＡ形式のアッセイを実行することにより迅速に行うことができ、対象の オリゴマーが様々な希釈溶液中に現れ、分光光度分析或いは比色分析反応により 迅速に定量することができる。このタイプの確定診断により、健康の専門家が患 者の積極的治療を開始したり、病状の悪化を防ぐことが可能となる。同様に、当 業者に周知のアッセイを用いて、患者の治療の際に、その病状の進行をモニタリ ングすることができる。また、まだ開発されていない分子生物学的技術でも、そ の新技術が既知のヌクレオチド配列の性質、例えばトリプレット遺伝暗号、特異 的塩基対形成等に基づくものであれば、ここに開示したヌクレオチド配列をそれ に利用することができる。治療的利用 ＥＭＡＰ−ＩＩに対するその相同性、及びその発現プロファイルに基づき、こ こに開示するＮＧＣＰをコードするポリヌクレオチドは、免疫不全疾患の治療に おいて役立ち得る。 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルスに由来 する発現ベクター、或いは細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の 器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられる。当 業者によく知られた方法は、アンチＮＧＣＰを発現する組換えベクターを構築す るために用いることができる。例えばManiatis等（上記）及びAusubel等（上記 ）に記載された技術を参照されたい。 完全長ｃＤＮＡ配列、並びにまたその調節エレメントを含むポリヌクレオチド により、研究者は遺伝子機能のセンス調節（Youssoufian H及 びHF Lodish 1993 Mol Cell Biol 13:98-104）、或いはアンチセンス調節（Eguc hi等（1991）Annu Rev Biochem 60:631-652）の調査用のツールとしてＮＧＣＰ を用いることができる。このような技術は、現在当分野ではよく知られており、 センス或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きなフラグメント を、コーディング領域或いは制御領域に沿った様々な位置から設計することがで きる。 所望のＮＧＣＰコーディング断片を高度に発現する発現ベクターを細胞または 組織にトランスフェクトすることにより、ＮＧＣＰをコードする遺伝子の機能を 停止させることができる。このような作製物は、翻訳不可能なセンス或いはアン チセンス配列とともに細胞から溢れ出し得る。ＤＮＡへの組み込みがない場合で すら、このようなベクターは、全ての複製物が内在性ヌクレアーゼにより分解さ れるまで、ＲＮＡ分子を転写し続ける。このような一過性の発現は、非複製ベク ター（Mettler I,personal communication）でも１ヶ月以上、適当な複製エレメ ントがベクター系の一部である場合には更に長い期間継続し得る。 上述のように、ＮＧＣＰの制御領域、例えばプロモータ、エンハンサ或いはイ ントロンに対するアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを設計するこ とにより遺伝子発現を修飾することができる。転写開始部位、例えばリーダー配 列の＋１０〜−１０領域の間に由来するオリゴヌクレオチドが好適である。また アンチセンス分子は、転写産物がリボソームへの結合するのを防止することによ り、ｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計される。同様に、抑制は、「三重らせ ん」塩基対合法を用いて達成することができる。三重らせん対合は、二重らせん が、ポリメラーゼ、転写因子、或いは調節分子を結合するべく十分に開かないよ うにする。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療法は、Gee JEら(HuberBE and B I Carr(1994)Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co,Mt Kisco NY)により記載されている。 リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子で ある。リボザイムの作用の仕組みでは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の 配列特異的ハイブリダイゼーションが行われ、その後エンドヌクレアーゼによる 切断（endonucleolytic cleavage）がなされる。発明の範囲内には、ＮＧＣＰの エンドヌクレアーゼによる切断を、特異的に及び効果的に触媒し得る、人工合成 のハンマーヘッド型リボザイム分子も含まれている。 任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位の最初の同定は、 配列ＧＵＡ、ＧＵＵ並びにＧＵＣが後続するリボザイム切断部位に対する標的分 子を走査することにより行われる。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝 子の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列は、 そのオリゴヌクレオチドの機能を停止させる２次構造の特徴について評価される 。また候補の標的の適切性の評価は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相 補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に対する接触性を試験すること により行われる。 本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、ＲＮＡ分子を合成するのための 当分野で周知の方法により調製することができる。これらの技術には、固相ホス ホラミダイト（phosphoramidite）化学合成のような化学合成オリゴヌクレオチ ドの技術が含まれる。別法では、ＲＮＡ分子を、ＮＧＣＰをコードするＤＮＡ配 列のin vivo及びin vitro転写により生成することができる。このようなＤＮＡ 配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを有す る多種のベクターに組み込まれる。別法では、構造的に或いは誘導的にアンチセ ンスＲＮＡを合成するアンチ七ンスｃＤＮＡ構成物が、株細胞、細胞或いは組織 内に導入される。 ＲＮＡ分子は細胞内安定性を高め及び半減期を長くするために修飾することが できる。実行可能な修飾には、限定はしないが、その分子の５’並びにまた３’ 末端のフランキング配列の付加、或いは分子のバックボーン内にホスホジエステ ラーゼ連鎖ではなくホスホロチオネート（phosphorothioate）或いは２’Ｏ−メ チルを使用することを含む。このコンセプトは、ＰＮＡの産生において固有のも のであり、内在性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデニン、グア ニン、シチジン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び 類似の修飾形態とともに、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブト シン（Wybutosine）のような従来あまり用いられなかった塩基を含めることによ って、これら全ての分子に拡張することができる。 細胞或いは組織内にベクターを導入するための方法には、以下に議論される方 法が含まれ、これらの方法は、in vivo、in vitro、及びex vivo治療法に対して も適切なものである。ex vivo治療法の場合には、患者から採取された幹細胞に ベクターを導入し、自家移植のためにクローンとして増殖して同じ患者に戻す方 法が、ここで引用されている米国特許第5,399,493号及び第5,437,994号に記載さ れている。トランスフェクションによる送達、リポソームによる送達は、当分野 でよく知られているものである。 更に、ここに開示するＮＧＣＰのヌクレオチド配列は、新技術、即ち、限定は しないが、それがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対合相互作用のような特 性を含む、現在周知のヌクレオチド配列の特性に依存する技術であれば、まだ開 発されていない分子生物学的技術においても用いることができる。 近縁なポリヌクレオチド配列の検出及びマッピング ＮＧＣＰの核酸配列は、自然発生のゲノム配列のマッピングのためのハイブリ ダイゼーションプローブを生成するために用いることができる。この配列は、よ く知られた技術を用いて、特定の染色体或いはその染色体の特定領域に対してマ ッピングすることができる。このような技術には、染色体を展着物（chromosoma l spreads）についてのin situハイブリダイゼーション（Verma等（1988）Human Chromosomes:A Manual of Basic Technique,Pergaｍon Press，NewYork）、フ ローソーティング（flow-sorted）染色体調製法、或いは酵母菌人工染色体（Ｙ ＡＣｓ）、細菌性人工染色体（ＢＡＣｓ）、細菌性Ｐ１構造体或いはPrice CM（ 1993;Blood Rev 7:127-34）及びTrask BJ（1991;Trends Ganet 7:149-54）に概 要が示されている単染色体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体構造が含まれ る。 染色体展着物についての蛍光in situハイブリダイゼーションの技術は、“Ver ma等（1988）Human Chromosomes:A Manual of Basic Technioue,Pergamon Press ， NewYork”に記載されている。染色体調製物の蛍光in situハイブリダイゼー ション及び他の染色体マッピング技術は、追加の遺伝子地図データと関係を有す る。遺伝子地図データの例は、1994 Genome Issue of Science(265:1981f)に見 ることができる。物理的染色体地図上でのＮＧＣＰの位置と、特定の失敗（また は特定の疾病の素因）との相関関係を助けとして、ある遺伝病が関係するＤＮＡ の領域を限界決定することができる。本発明のヌクレオチド配列を、健常者と、 キャリアまたは患者との遺伝子配列の違いを検出するために用いることができる 。 染色体調製物のin situハイブリダイセーション及び確定された染色体マーカ ーを用いる連鎖解析のような物理的地図作成技術は、遺伝子地図を延長する際に 大変重要である。ヒトゲノムのＳＴＳに基づく地図の 最近の例は、Whitehead-MIT Center for genomic Reserch（Hudson TJら(1995)S cience 270:1945-1954）から最近出版されている。多くの場合、特定のヒト染色 体の数或いはアームが未知であっても、マウスのような別の哺乳動物種の染色体 上の遺伝子の配置から、関連する標識を明らかにすることができる。新しい配列 は、染色体の腕、或いはその一部への物理的マッピングにより割当てることがで きる。これは位置クローニング或いは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を 調査する研究者に貴重な情報を提供する。ひとたび毛細血管拡張性運動失調（Ａ Ｔ）のような疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばＡＴ〜11q22-23（ Gatti等（1988）Nature 336:577-580）への遺伝子連鎖により粗く局所化されれ ば、その領域にマッピングされる任意の配列は、さらなる研究のための関連する 遺伝子、或いは調節遺伝子を表すことができる。本発明のヌクレオチド配列は、 正常者とキャリアまたは患者との間の、転座、逆位等による染色体位置の違いを 検出するために用いることもできる。 医薬品組成物 本発明は、ヌクレオチド、タンパク質、抗体、アンタゴニスト、またはインヒ ビターを、単独で、或いは安定化化合物のような少なくとも１つの他の薬剤とと もに含んでいる医薬品組成物を、その範囲に含む。この医薬品組成物は、任意の 無菌の生体適合性製薬用担体に含めて投与されるが、このような担体には、限定 はしないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水が含まれる。これらの 分子は、患者に対して、単体で、或いは他の薬品やホルモンと結合して、賦形剤 或いは製薬学的に許容される担体と混合される他の薬品組成物に入れて投与され 得る。本発明の一実施例では、製薬学的に許容される担体とは、製薬学的に不活 性なものである。医薬品組成物の投与 医薬品組成物は経口投与、或いは非経口投与される。非経口投与の方法には、 局所的投与、動脈内（腫瘍への直接の）投与、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与 、くも膜下内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与或いは鼻腔内投与が含 まれる。活性成分に加えて、これらの薬品組成物は、薬学的に用いられ得る調合 物内への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び補助剤を含む適切な製薬学的 に許容される担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、“Reming ton's Pharmaceutical Sciences”（Mack Publishing Co,Easton PA）の最新版 において見出すことができる。 経口投与用の医薬品組成物は、当分野でよく知られる製薬学的に許容される担 体を用いて適切な剤形に製剤される。このような担体により、薬品組成物は、治 療を受ける患者による経口及び鼻腔摂取のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、液 体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤或いは類似の剤形として処方さ れる。 経口投与するための医薬品調製物は、活性化合物と固形の賦形剤とを結合する ことによって得ることができるが、所望に応じて、必要なら適切な補助剤を添加 した後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、錠剤或いは糖衣剤 核を得ることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、サクロース、マンニトー ル或いはソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク質充填剤、とうも ろこし、小麦、米、じゃがいも等からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキ シプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムの ようなセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントのようなゴム、並びにゼラ チン或いはコラーゲンのようなタンパク質である。必要ならば、架橋結合したポ リビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなア ルギン酸或いはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような、崩壊剤或いは可 溶化剤が加えられる。 糖衣剤核は、濃縮砂糖溶液のような適切な錠皮を与えられるが、溶液はアラビ アゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤、ポリエチレングリ コール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混 合物が含み得る。錠剤の識別のため、すなわち活性化合物の量、すなわち投与量 を特徴付けるために染料或いは色素が錠剤或いは糖衣錠皮に加えられてもよい。 経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル及びゼラ チンからなる柔らかい、密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビ トールのような錠皮を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはで んぷんのような充填剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムの ような潤滑剤、並びに付加的には安定剤と混合された活性処方組成物を含み得る 。柔らかいカプセルでは、活性化合物は、安定剤があるなしにかかわらず、脂肪 油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或 いは懸濁される。 非経口投与用の剤形は、水溶性の活性化合物の水溶液を含む。注射用として、 本発明の薬品組成物を水溶液、好適にはハンクの溶液、リンガー溶液或いは生理 緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液に入れて製剤することができる。 水性の注入懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール 或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性 成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁剤として調製される。適切な親油性の溶媒 或いは媒介物は、胡麻油のような脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド 或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。また懸濁剤は、所望に応 じて、それにより溶解度を増加し、非常に濃縮された溶液の調製ができるように なる適切な安定剤或いは薬剤を含んでもよい。 局所的投与または経鼻投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸透 剤を用いて調合が行われる。このような浸透剤は、一般的に周知である。製造と保管 本発明の薬品組成物は周知の方法、例えば従来の混合処理、溶解処理、顆粒化 処理、糖衣形成処理、研和処理、乳化処理、封入処理(entrapping)処理或いは凍 結乾燥処理により製造される。 この医薬品組成物は塩類として提供されることもあり、限定はしないが、塩酸 、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む、多くの酸とともに 形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性或いはプロトニ ック溶剤において、より可溶性が高くなる傾向がある。他の場合には、好適な製 剤は、１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のショ糖、使用前に緩衝 剤と結合させたｐＨ範囲４．５〜５．５にある２％〜７％のマンニトールにおけ る凍結乾燥粉末である。 製薬学的に許容される担体内に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調 製された後、適切な容器内に入れられて、さらに提示した疾病状態の治療のため にラベル付けされる。ＮＧＣＰの投与のため、このようなラベルには、投与の量 、頻度、方法が表示される。治療上効果的な投与量 本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、活性成分を所望の目的 を達成するに効果的な量だけ含む組成物である。効果的な投与量の決定は、当業 者の能力の範囲内で行うことができる。 任意の化合物について、治療的に有効な投与量は、初めに、新生物細 胞、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞 培地のアッセイから推定される。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおい て効果的な投与量や投与経路を決定することができる。 治療的に有効な投与量とは、疾病状態を寛解するタンパク質、その抗体、アン タゴニスト、またはインヒビターの量である。そのような化合物の毒性及び治療 有効性は、例えばＬＤ５０（個体群の５０％の致死投与量）及びＥＤ５０（個体 群の５０％において治療的に有効な投与量、５０％有効量）を決定するための、 細胞培地或いは実験動物における標準的な製薬学的手順により決定することがで きる。毒性と治療有効性との間の投与量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５ ０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい 。これらの細胞培地のアッセイ及び付加的な動物研究から得られるデータは、ヒ トへの使用に対する投与量の範囲を決める際に用いることができる。そのような 化合物の投与量は、毒性がほとんど或いは全くなく、ＥＤ５０を達成する循環濃 度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並 びに投与経路に応じてこの範囲内で変化する。 正確な投与量は治療されるべき患者を考慮して個々の医師により選択される。 投与量及び投薬量は、十分なレベルの活性部分を与え、かつ所定の効果を維持す るために調整される。考慮すべき付加的な要因は、疾患状態の重症度、または患 者の年齢、体重並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感 受性、並びに治療への耐性／反応を含む。長期的に作用する薬品組成物は３〜４ 日毎に、１週間毎に、或いは半減期及び特定の処方のクリアランス速度に応じて ２週間に１度投与してもよい。 通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲にあって、全投与量は最大 約１ｇであり、投与経路に応じて変化する。特定の投与量或い は供給の方法に関するガイダンスは、文献において見出すことができる。米国特 許第4,657,760号、第5,206,344号或いは第5,225,212号を参照されたい。当業者 は、ヌクレオチドに対しては、タンパク質やインヒビター用の剤形とは異なる剤 形を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は 、特定の細胞、状態、位置等によって決まってくる。 例えば、癌細胞又は組織を破壊する目的で、顆粒球を癌に誘因するための治療 用分子としてＮＧＣＰを用いることができる。 以下に本発明の実施例を示す。但し、以下の実施例は単なる例示であって、本 発明をこの実施例に限定しようとするものではない。 産業上の応用 １ ｃＤＮＡライブラリーの構築 PANCNOT05ｃＤＮＡライブラリーはヒト膵臓組織から作製された。ドナーは無 酸素症で死亡した２歳のヒスパニック系の男子であった。冷凍組織を、Brinkman n Homogenizer Polytron PT-3000（Brinkmann Instruments,Westbury NJ）を用 いてホモジナイズし、グアニジウムイソチオシアネート溶液に溶解した。このラ イセートを、Beckman L8-70M Ultracentrifuge（Beckman Instruments）でBeckm an SW28ロータを用いて、５．７Ｍの塩化セシウムクッションを通して、周囲温 度で１８時間、２５，０００ｒｐｍで遠心分離処理した。ＲＮＡをｐＨ４．０の 酸性フェノールで抽出し、０．３Ｍの酢酸ナトリウム及び２．５倍量のエタノー ルを用いて沈殿させ、ＲＮアーゼを含まない水に再懸濁し、３７℃で１５分間Ｄ Ｎアーゼ処理した。ｐＨ４．０の酸性フェノールでＲＮＡ抽出を反復し、前回と 同様酢酸ナトリウムとエタノールで沈殿させた.次にQiagen Oligotex kit（QIAG EN Inc,Chatsworth CA）を用いてＲＮＡを単離し、これをｃＤＮＡライブラリー の作製に用いた。 このｍＲＮＡは、SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plas mid Cloning（Cat.#18248-013;G1bco/BRL）に組み込んで、その推奨プロトコル に従って取り扱った。ｃＤＮＡは、Sepharose CL4B column（Cat.#275105-01;Ph armacia）上で分画化し、これらのｃＤＮＡで４００ｂｐを超えるものをpSport Iにリゲートした。次にこのプラスミドpSport IをDH5a（商標）コンピテント細 胞（Cat.#18258-012;Gibco/BRL）に入れて形質転換させた。 ２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡは細胞から放出され、REAL Prep 96 Plasmid Kit for Rapid Extraction Alkaline Lysis Plasmid Minipreps（Catalogue #26173;QIAGEN,In c）を用いて精製した。このキットは、マルチチャネル試薬ディスペンサを用い て、９６穴ブロックにおいて、９６個のサンプルの同時精製を行うことができる 。以下の変更点を除いて、推奨プロトコルを用いた。（１）細菌の培養は、２５ ｍｇ／Ｌのカルベニシン及び０．４％のグリセロールを有する滅菌Terrific Bro th（Catalogue #22711,LIFE TECHNOLOGIES（商標））の１ｍｌにおいて行った。 （２）接種の後培地を１９時間インキュベートし、インキュベーションの終了時 に、細胞を０．３ｍｌの溶解緩衝液に溶解した。（３）イソプロパノール沈殿の 後、プラスミドＤＮＡペレットを、０．１ｍｌの蒸留水に再度懸濁した。プロト コルの最終ステップの終了後、サンプルを４℃で貯蔵するため９６穴ブロックに 移送した。 ｃＤＮＡの配列決定は、Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton,Reno NV)を、Pel tier Thermal Cyclers(PTC200 from MJ Research,Watertown MA)及びApplied Bi osystems 377または373 DNA Sequencing Systems(Perkin Elmer)と組み合わせて 用いるSangerＦ及びAR Coulson(1975:J Mol Biol 94:441f)の方法より行い、読 み枠を決 定した。 ３ ｃＤＮＡクローン及びそれらの推定タンパク質の相同性検索 Applied Biosystems社で開発された検索アルゴリズムを、INHERIT（商標）670 Sequence Analysis Systemに組み込んで用いて、各ｃＤＮＡの配列をGenBankの 配列と比較した。このアルゴリズムでは、Pattern Specification Language（TR W社、LosAngeles CA）を用いて相同な領域を決定した。配列の比較をどのように 行うかを決定する３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセッ ト、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの組を用いて、対象の配 列に対して相同な領域を含む配列をＤＮＡデータベースから検索し、適切な配列 には、初期値とともにスコアが付けられた。これによって、これらの相同な領域 をドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、相同な領域と偶然の 一致とを区別した。相同性検索の結果は、Smith-Watermanアライメントを用いて 表示した。 ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、INHERIT（商標）670配列解析システ ムをＤＮＡ配列の相同性検索で用いたのと同様に用いて確かめた。Pattern Spec ification Language及びパラメータウインドウを用いて、タンパク質データベー スから相同性領域を含む配列を検索し、その結果には初期値とともにスコアを付 けられた。ドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、有意な相同 性を有する領域と偶然の一致とを区別した。 BLASTは、Basic Local Alignment Search Tool（AltschulSF(1993)JMol Evol3 6:290-300;Altschul,SF等(1990)J Mol Biol215:403-10）の略称であり、これを 用いて局部的な配列アライメントを検索した。BLASTはヌクレオチド及びアミノ 酸配列の両方のアライメントを生成して配列類似性を求める。そのアライメント の局所性のために、BLASTは厳密 な一致、すなわちホモログを求める際に特に有効である。BLASTは間隙を含まな い一致を求めるのに役立つ。BLASTアルゴリズム出力の基本的な単位は、High-sc oring Segment Pair（HSP）である。 HSPは２つの配列フラグメントからなり、両フラグメントは任意ではあるが、 そのアライメントが局所的に最大となっている等しい長さものであり、そのアラ イメントスコアはユーザにより設定された閾値すなわちカットオフスコアを満足 、即ち、カットオフスコアを超えている。BLASTアプローチは問い合わせ配列と データベース配列との間のHSPを見つけ出すものであり、見出された任意の一致 の統計的有意性を評価し、そのユーザが設定した有意性の閾値を満足する一致の みを報告するものである。パラメータＥはデータベース配列一致を知らせるため の統計的に有意な閾値を確定するパラメータである。Ｅは全データベース検索の 情況においてHSP（或いはHSPの組）の発生の機会の期待される頻度の上側の境界 として解釈される。その一致がＥを満足する任意のデータベース配列がプログラ ム出力において報告される。 ４ ノーザン法による解析 ノーザン解析は、標識されたヌクレオチド配列と特定の細胞型または組織に由 来するＲＮＡが結合したメンブランとのハイブリッド形成を伴う、遺伝子の転写 物の存在を検出するために用いられる実験技術である（Sambrookら、上述）。 類似のコンピュータ技術で、BLAST（Altschul SF 1993 and 1990,上述）を用 いてGenBankまたはLIFESEQ（商標）データベース（Incyte,Palo Alto CA）のよ うなデータベースにおける同一のまたは近縁な分子を検索した。この解析は、多 数の膜式ハイブリダイゼーションより非常に短時間で行うことができる。更に、 コンピュータ検索の感度を変更して、ある一致が正確な一致か、相同的であるか の分類を決定することが できる。 検索の基準値は、プロダクトスコアであり、これは以下の式で定義されるもの である。 （配列の一致（％）×最大BLASTスコア（％））／１００ このプロダクトスコアは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致 の双方を考慮している。例えば、プロダクトスコアが４０の場合は、一致は誤差 が１〜２％の範囲で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相 同な分子は、通常プロダクトスコアとして１５〜４０を示すものを選択すること により同定されるが、スコアの低いものは近縁関係にある分子として同定される 。 ５ 完全長まで、又は調節エレメントを回復するまでのＮＧＣＰの延長 完全長ＮＧＣＰの核酸配列（配列番号：２）は、部分的ヌクレオチド配列を完 全長まで延長するため、或いはゲノムライブラリから５’配列を得るためのオリ ゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いることができる。一方のプライ マーはアンチセンス方向（ＸＬＲ）の延長を開始するために合成され、他方のプ ライマーはセンス方向（ＸＬＦ）に配列を延長するために合成される。これらの プライマーにより、周知のＮＧＣＰ配列を「外側に」延長し、対象の制御領域の 新しい未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成できるようになった（ １９９５年６月７日出願の米国特許出願第08/487,112号を本明細書と一体に参照 されたい）。初期プライマーは、Oligo（登録商標）4.06（National Bioscience s社、Plymouth MN）、或いは他の適切なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ ヌクレオチドで５０％以上のＧＣ含有率を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標 的配列にアニールするように設計することができる。結果的にヘアピン構造及び プライマー−プライマー二量体化を生じる任意のヌクレオチドのストレッチの延 長はが回避される。 元の選択されたｃＤＮＡライブラリーか、ヒトゲノムライブラリーを用いて、 配列を延長する。後者のライブラリーは、５’上流配列を得るために最も役立つ 。必要なら、既知領域をさらに延長するために追加のプライマーの組が設計され る。 XL-PCRキット（Perkin Elmer社）のための指示に従って、酵素と反応混合物と を完全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られる。４０pmolの各プラ イマーと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始する場合 、ＰＣＲはPeltier Thermal Cycler（PTC200;MJ Reserch社、Watertown MA）を 用いて、以下のパラメータで実行される。 ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（その温度を保持） 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）ア ガロースミニゲルにおける電気泳動で解析して、反応物が配列を延長することに 成功したか否かを決定する。最も大きな生成物或いは バンドを選択して、ゲルから切り出した。さらなる精製には、QIAQuick（登録商 標）(QIAGEN社)のような市販のゲル抽出法を用いる。ＤＮＡ回収の後、クレノウ 酵素を用いて一本鎖ヌクレオチドの延び出しを切り取り、再結合及びクローニン グを容易にする平滑末端を作った。 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌのリゲーション緩衝液内に再溶解し、 １μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチド キナーゼを加えて、その混合物を、室温で２〜３時間、或いは１６℃で一昼夜イ ンキュベートする。コンピテントな大腸菌細胞（４０μｌの適切な溶媒内にある ）を、３μｌのリゲーション混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培地 （Sembrook J等、上記）で培養する。３７℃で１時間のインキュベーションの後 、全ての形質転換混合物を、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertani（ＬＢ）寒天上 にのせる。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択し、適切な 市販の無菌の９６穴マイクロタイタープレートの個々のウェル内に入れられた１ ５０μｌの液状ＬＢ／２ｘＣａｒｂ培地で培養する。さらに後日、５μｌの各オ ーバーナイト培養物を非無菌９６穴プレート内に移し、水で１：１０に希釈した 後、各５μｌのサンプルをＰＣＲアレイ内に移す。 ＰＣＲ増幅の場合、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの４単位を含む１８μｌの濃 縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以 下の条件に従って行う。 ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動 させる。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクロ ーンを選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行う。 ６ ハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 配列番号：２の配列に基づくハイブリダイゼーションプローブは、ｃＤＮＡ、 ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングするために用いられる。約２０の 塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、大きなｃＤＮＡ フラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、５０ｐ ｍｏｌの各オリゴマーと、２５０ｍＣｉの[γ-32Ｐ]アデノシン三リン酸（Amers ham社,Chicago IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN（商標）、 Boston MA）とを組み合わせて用いて標識する。標識されたオリゴヌクレオチド を、SephadexG-25超精細樹脂カラム（Pharmacia社）を用いて精製する。それぞ れ毎分１０7カウントを含む各部分を、以下のエンドヌクレアーゼ（AseI,Bgl II ,EcoRI,Pst I,Xba1或いはPvuII;DuPont NEN（商標））の１つを用いて消化され るヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ハイブリダイゼーション解析において用いる。 切断した各ＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画化して、ナイロン膜（ Nytran Plus,Schleicher&Schuell,Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーション は４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くために、ブロット は、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムま で段階的に厳密性が増す条件下で、室温にて順次洗浄される。XOMAT AR（登録商 標）フィルム（Kodak, Rochester NY）を、数時間かけてPhosphoimager cassette（Molecular Dynamics ,Sunnyvale CA）においてブロットに露光された後、ハイブリダイゼーションパ ターンが視覚的に比較される。 ７ アンチセンス分子 ＮＧＣＰをコードする配列或いはその任意の一部は、自然発生の配列のin viv oまたはin vitro発現を抑制するために用られる。約２０塩基対からなるアンチ センスオリゴヌクレオチドの使用について特に記すが、より大きなｃＤＮＡフラ グメントの場合でも概ね同じ手順を用いることができる。第１Ａ図及び第１Ｂ図 に示すようなＮＧＣＰのコード化配列に基づく相補的なオリゴヌクレオチド用い て、自然発生ＮＧＣＰの発現を抑制することができる。この相補的なオリゴヌク レオチドを第１Ａ図及び第１Ｂ図に示す最も独特な５’配列から設計し、これを 用いてプロモーターが結合するのを阻害することにより転写を抑制したり、リボ ソームが転写物に結合するのを阻害してＮＧＣＰ転写物の翻訳を抑制することが できる。配列番号：２のリーダー配列及び５’配列の適切な部分を用いることに より、効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、第１Ａ図及び第１Ｂ図に示 すヌクレオチドのなかの、ポリペプチドのシグナル配列または初めの方のコーデ ィング配列に翻訳される領域全体にわたる１５〜２０個のヌクレオチドを含むよ うになる。 ８ ＮＧＣＰの発現 ＮＧＣＰの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクター内にサブクローニングし、その ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって行われる。クローニン グ用のpBluescriptベクターを、大腸菌株であるXL1-BlueMRF（商標）(Stratagen e)においてＮＧＣＰを発現するのに用いる。クローニング部位の上流には、β− ガラクトシダーゼに対するプロモータが存在し、その後ろにはアミノ基末端メチ オニン及びβ− ガラクトシダーゼの７残基が存在する。直後に続くこれら８つの残基は、転写に 役立つバクテリオファージプロモーターであり、多くの独特の切断部位を含むリ ンカーである。 単離されたＩＰＴＧトランスフェクト菌株を標準的な方法を用いて誘導するこ とにより、初めのβガラクトシダーゼの７残基、約５〜１５残基のリンカー、及 び完全長ＮＧＣＰからなる融合タンパク質を作り出す。このシグナル配列は、後 の行う活性のアッセイにおいて直接用いることができる菌培地へのＮＧＣＰの分 泌を誘導する。 ９ ＮＧＣＰの活性 ＮＧＣＰの走化性活性は、Nelson等（1975:J Immunol 115:1650）の方法に従 ってアガロースを用いて測定する。単核細胞又は顆粒球を、組換え体ＮＧＣＰを 発現する細胞が成長した媒地又はコントロール媒地の段階希釈にかける。３７℃ で２時間インキュベーションの後、細胞を固定し染色する。種々の細胞タイプに ついて、試験サンプルへの移動とコントロールサンプルへの自発的移動とを比較 する。 化学誘因の特異性は、特定の細胞の集団に対してアガロースアッセイを行うこ とにより決定する。静脈穿刺から得られた血液細胞を、密度勾配遠心分離法によ り分画化し、好中球、末梢血単核細胞、顆粒球、単球、及びリンパ球の高濃度集 団についてＮＧＣＰの走化性活性を試験する。所望に応じて、このような高濃度 細胞集団を、ＣＤ４+及びＣＤ８+高濃度Ｔ細胞集団のネガティブ選択用にそれぞ れＣＤ８+及びＣＤ４+特異的抗体を用いて分画化することができる。 １０ ＮＧＣＰ特異的抗体の産生 標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化及び抗体の産生には、ＰＡＧＥ電 気泳動法（Sambrook前出）を用いて精製されたＮＧＣＰを用いる。ＮＧＣＰから 翻訳されたアミノ酸配列をDNAStarソフトウエア （DNASTAR社）を用いて解析して免疫抗原性の高い領域を決定し、対応するオリ ゴペプチドを当業者には周知の手段により合成して、当業者に周知の方法で抗体 をを産生するために用いる。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピ トープのような、適切なエピトープを選択するための解析法は、Ausubel FM等（ 上記）の論文に記載されており、第４図及び第５図に示されている。 通常、約１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペ プチドシンセサイザーModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法ケミストリにより合成し、 Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ： Ausubel FM等、上記）を用いた反応によりキーホールリンペットヘモシニアン（ ＫＬＨ、Sigma）に結合する。フロイントの完全アジュバントにおけるオリゴペ プチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫する。得られた抗血清の抗ペプチド 活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、１％BSAを用い てブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識され たヤギ抗ウサギＩｇＧに反応させる。 １１ 特異的抗体を用いる自然発生ＮＧＣＰの精製 自然発生ＮＧＣＰ或いは組換えＮＧＣＰは、ＮＧＣＰに対する特異的な抗体を 用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより精製することができる。イ ムノアフィニティーカラムは、CnBr活性化Sepharose（Pharmacia Biotech社）の ような活性化クロマトグラフレジンとＮＧＣＰ抗体とを共有結合させることによ り構成される。結合後、そのレジンを製造者の指示に従って、ブロックし洗浄す る。 ＮＧＣＰを発現する細胞から得られた膜分画を、周知の方法によって調製する 。別の方法として、適切なシグナル配列を含む組換え体ＮＧＣＰ断片を、トラン スフェクト細胞が成長する媒地に有用な量だけ分泌さ せることができる。 ＮＧＣＰを含む培地をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをＮＧ ＣＰを優先的に吸収できる条件下で（例えば界面活性剤の存在下において高イオ ン強度緩衝剤で）洗浄する。このカラムを、抗体／ＮＧＣＰ結合を切るような条 件下（例えばｐＨ２〜３の緩衝剤、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イ オンのようなカオトロピックイオン）で溶離させ、ＮＧＣＰを回収する。 上記のすべての刊行物及び特許明細書は、本明細書と一体に参照されたい。本 発明の記載した方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は、本発明の範囲及 び精神から逸脱しないことは当業者には明らかであろう。本発明は特に好適な実 施例に関連して記載されているが、本発明の請求の範囲は、そのような特定の実 施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際には、本発明を 実施するために記載された方法の種々の変更例は、分子生物学或いは関連する分 野の当業者には明らかなように、以下の請求項の範囲内に含まれるものである。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                      Granulocyte chemoattractant protein 2 mutantTechnical field   The present invention relates to a novel granulocyte chemotactic tamper having features in common with α-intercrine. Nucleic acid and amino acid sequence of protein 2 mutant, and diagnosis, research, prevention and treatment of disease On the use of these sequences.Background art   Chemokines usually have a length of about 70-100 amino acids and a molecular weight of 6 Small polypeptides that are active in the concentration range of 1-100 ng / ml at １１11 kD Is. Chemokines were first isolated and purified from inflammatory tissues, Characterized for activity. Recently, chemokines have been developed using molecular cloning technology. Have been discovered and can be generated using It has been characterized by structural analysis.   Chemokines are chemoattractants involved in leukocyte trafficking in different inflammatory conditions Involved in quality factor gradient formation. Chemokines activate specific adhesion molecules on endothelial cells. Cells that mediate expression, stimulate the growth of specific cell types, and have specific receptors Regulates the activation of   This chemokine is closely related based on the cysteine motif, and usually has three The families, CXC chemokines (α), CC chemokines (β), and C chemokines (G; Graves DT and Y Jiang (1995) Crit Rev Oral Biol Med 6:10 9-118 and Kelner G et al. (1994) Science 266: 1395-99). CXC chemokines include: Non-platelet chemokine epithelial-derived neutrophil trigger with well-studied platelet factor 4 Contains substance 78 (ENA-78) and granulocyte permeable protein 2 (GCP-2) You. Chemokines are normally expressed and secreted in response to pro-inflammatory cytokines . Such pro-inflammatory cytokines include interleukin 1B and tumor necrosis Progeny, endotoxins, mitogens, particulate bacteria or viruses.   ENA-78 consists of 76 amino acids and has a molecular weight of 8357 (Walz  A et al. (1991) J Exp Med 174: 1355-62). Endothelial cells express and secrete ENA-78 When activated, this ENA-78 is associated with neutrophils, chemotaxis, increased intracellular calcium, and Stimulates exocytosis. ENA-78 genomic DNA was obtained from Corbett et al. From human chromosome 4 to 2.2k containing 4 exons and 3 introns b) (1994; Biochem Biophys Res Commun 205: 612- 17). The open reading frame of 342 nucleotides contains 114 Encodes a protein consisting of amino acids. In the adjacent region upstream, nuclear factor κB Promoter binding site (Chang M et al. (1994) J Biol Chem 269: 41: 25). 277-82).   GCP-2 is a 6 kD protein isolated from the supernatant of human MG63 osteosarcoma cells Quality. Proost et al. ((1993) J Immunol 150: 1000-10) This CXC chemokine was identified by sourcing, and GCP- 2 report that they appear to exist in four different N-terminal forms. At concentrations of 3-10 nM, GCP-2 attracts and activates neutrophils in vitro, Causes granulocyte accumulation in vivo and does not act on monocytes.   Studies on chemokines and their chemoattractant activity have led to various pathological processes. Means for intervention at the molecular level and better understanding. Hirose, etc. (1995; Br J Cancer 72: 708-714) reported that chemokine was It was shown that transfection of the gene reduced tumorigenicity. The cause of this antitumor activity is the recruitment and activity of neutrophil granulocytes to the site of the cancer. It is for sex.   Broxmeyer HE et al. (1995; Ann Hematol 71: 235-24) The myelosuppressive effect of chemokines on the blast population was evaluated. In acetonitrile Pre-incubation of active and effective chemokines allows granulocyte-macrophages Erythroid and pluripotent precursor cells were enhanced. Experiments like this The results show that daily treatment with chemokines can help treat patients with acute or chronic leukemia. It was suggested that it could be helpful.   On the other hand, suppression of chemokine expression and secretion prevents prevention of pathogenesis in myocardial tissue. Can be useful in Seino Y et al. (1995; Cytokine 7: 301-304) use PCR. And leukocyte CC in endocardial myocardial biopsy tissue from patients with idiopathic dilated cardiomyopathy. And CXC chemotactic cytokine expression. This is mobilized in this part Suggest that the cytotoxic effects of leukocytes can cause inflammatory myocardial disease I have.   The discovery of new CXC chemokines has led to the intervention of various forms of cancer and heart disease. To develop effective therapies for each and every step in these pathological processes Opportunities are provided for expanding knowledge.Disclosure of the invention   The present invention involves chemoattraction and activation of leukocytes, specific neutrophils and granulocytes Novel granulocyte chemoattractant protein 2 with features common to other alpha intercrine Mutants (hereinafter referred to as NGCP) are disclosed. Thus, the present invention provides A substantially purified NGCP as set forth in SEQ ID NO: 1 is provided.   Certain embodiments of the present invention are directed to isolated, substantially purified NGCP encoding A polynucleotide is provided. In certain embodiments, the polynucleotide has the sequence It has the nucleotide sequence of No. 2. In addition, the present invention provides delivery under strict conditions. Pos. Hybridizing with the sequence of SEQ ID NO: 2 Provide a nucleotide sequence.   The invention further relates to nucleic acid sequences encoding NGCP, oligonucleotides, peptides. Nucleic acids, fragments, portions thereof, or antisense molecules. Also book The invention is, in part, an invention that can be used to transform host cells or organisms. It also relates to the integration of a nucleic acid sequence encoding NGCP into the current vector. The present invention Also cancer, especially melanoma, cytokine sensitive tumors, immunodeficiency, or hyperimmune response Also provided is the therapeutic transformation of cells or tissues associated with   The invention also relates to a method for producing NGCP or a fragment thereof. In the present invention In some cases, purified NGCP is used alone or in a pharmaceutically acceptable excipient. Delivery to cancer cells or tissues. Also, within the scope of the present invention, Specific binding to NGCP, a mode for testing cytokine-sensitive tumors and immune system disorders Antibodies that can be used for nitration are also included in the scope.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   1A and 1B show amino acids of a novel granulocyte chemoattractant protein 2 mutant FIG. 2 shows a sequence (SEQ ID NO: 1) and a nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 2). Array of Alignment is MacDNAsisTMSoftware (Hitachi Software Engineering Co L td, San Bruno CA).   FIG. 2 shows a granulocyte chemotactic protein 2 mutant (SEQ ID NO: 1), ENA-78. (GI 607031; SEQ ID NO: 3; Walz et al., Supra), GCP-2 (GI 462170; SEQ ID NO: No .: 4; Proost et al., Supra), and GCP-2 (GI 415589; SEQ ID NO: 5; Proos (1993) Biochemistry 32: 10170-77). FIG. These alignments are based on DNAStarTMMulti-sequence alignment Sample program (DNAStar Inc, Madison WI).   FIG. 3 is a hydrophobicity plot of granulocyte chemoattractant protein 2 mutant of SEQ ID NO: 2. (MacDNAsis software), where the X-axis represents amino acid positions , The Y axis represents the level of hydrophobicity in the negative direction.   FIG. 4 shows a hydrophobicity plot for ENA-78 (SEQ ID NO: 3). FIG.   FIG. 5 shows the isoelectric point for the granulocyte chemoattractant protein 2 mutant (SEQ ID NO: 1). FIG. 2 is a diagram showing a plot (MacDNAsis software).   FIG. 6 shows an isoelectric point plot for ENA-78 (SEQ ID NO: 4). It is.   7A and 7B show the nucleic acid sequence of granulocyte chemoattractant protein 2 mutant and the condyle. Between human ESTs annotated as 5 "similar to granulocyte chemotactic protein 2 FIG. 3 is a diagram showing a nucleic acid sequence alignment of (GI 973875; Hillier L et al. (1995) Unpub. lished; DNAStarTMSoftware).Embodiment of the Invention Definition   As used herein, the term “nucleic acid sequence” refers to a single-stranded or double-stranded sense strand or a single strand. DNA or RNA of genomic or synthetic origin Leotide, nucleotide, or polynucleotide, and fragments or portions thereof. To taste. Similarly, the term “amino acid sequence” used herein refers to a peptide or protein. Means protein sequence.   As used herein, “consensus” refers to (1) re-sequenced Nucleic acid sequence from which unnecessary bases have been separated, (2) 5 'using XL-PCR (Perkin Elmer) Resequenced nucleic acid sequence extended in the 3 or 3 'direction, (3 ) Using a GCG fragment assembly system (GCG, Madison WI) Nucleic acid sequence combined based on duplicated sequences of Cysteine, or ( 4) Combination with extension Means a nucleic acid sequence formed by both.   As used herein, “peptide nucleic acid” refers to amino acid residues such as lysine and amino acids. A molecule containing an oligomer to which a mino group has been added is meant. These small molecules are Also called gene agents, by binding to these complementary (template) strands of nucleic acid Stop transcript elongation (Nielsen PE et al. (1993) Anticancer Drug Des 8: 53-63 ).   As used herein, "deletion" refers to one or more nucleotides or amino acids. Amino acid residue is defined as a change in nucleotide or amino acid sequence. Is defined.   As used herein, "insertion" or "addition" refers to a naturally occurring NGCP. As a result of the addition of one or more nucleotides or amino acid residues Refers to changes in the nucleotide or amino acid sequence.   As used herein, “substitution” refers to one or more nucleotides or amino acids A change caused by replacing an acid with a different nucleotide or amino acid. You.   As used herein, NGCP refers to any species, particularly cattle, sheep, and horses. Native, synthetic, mammalian, including human, mouse, horse, and, preferably, human. Of substantially purified NGCP of native, semi-synthetic, or recombinant origin Noic acid sequence.   “Variants” of NGCP differ by “substitution” of one or more amino acids. Can have the amino acid sequence of This variant is a “conservative” In this conservative change, for example, leucine is replaced with isoleucine Amino acids that are replaced have similar structural and chemical properties, such as when replaced with Having. In rare cases, a variant may change "non-conservatively," For example, glycine is replaced with tryptophan. Similar minor changes include Deletion and insertion of amino acid Or both. Conventional, such as DNAStar software Impair biological or immunological activity using more well-known computer programs. Determine the number of amino acids that can be substituted, inserted, or removed without Can be   The term “biologically active” refers to the structural, regulatory, Or NGCP having a biochemical function. Similarly, "immunological activity" Natural, recombinant or synthetic NGCP, or any oligopeptide thereof, Ability to elicit a specific immune response in the appropriate animal or cell and bind to a specific antibody Is defined as   As used herein, the term “derivative” refers to chemically modified NGCP. Nucleic acid to be encoded, or encoded NGCP. Examples of such modifications include , Hydrogen to an alkyl group, an acyl group, or an amino group. Nucleic acid derivatives Encodes a polypeptide that retains essential biological properties of natural NGCP .   As used herein, the term "substantially purified" refers to removal from this natural environment. Or isolated from at least one other component with which it is naturally associated. Separated, at least 60%, preferably at least 75%, most preferably A molecule having a nucleic acid or amino acid sequence that is at least 90% free.   As used herein, the term “hybridization (hybridization)” "The process by which a nucleic acid strand binds to a complementary strand through base pairing" (Coombs J (1994))Dict ionary of Biotechnolgy , Stockton Press, New York). amplification Is defined as creating a copy of a nucleic acid sequence and is commonly known as a polymerase. Performed by the chain reaction (PCR) method (Dieffenbach CW and GS Dveksler (199 Five),PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New york) .   "Strictness" typically refers to about Tm-5 ° C (5 ° C below the Tm of the probe). It occurs in the range of about 20 to 25 ° C. below Tm. As will be understood by those skilled in the art, Dense hybridization identifies identical polynucleotide sequences, That is, detect or identify similar or closely related polynucleotide sequences That is, it can be used for detection.Description   The consensus nucleotide sequence disclosed herein is a novel granulocyte chemotactic protein. It encodes 114 amino acid residues (SEQ ID NO: 1) of the cytoplasmic mutant. this The consensus sequence was obtained from Incyte Clone No. 949299 (PANCNOT05) and b Incyte Clone No. Based on extension and combination of 1321776 (BLADNOT04) Things.   The NGCP nucleic acid and amino acid alignments are shown in FIGS. 1A and 1B. I have. FIG. 2 shows NGCP and its related chemokine ENA-78 (GI 60703). 1; SEQ ID NO: 3) and GCP-2 (GI 462170; SEQ ID NO: 4 and GI 415589; 5 shows an alignment between SEQ ID NO: 5) and the conserved cysteine residue C19, C49 , C51, C75, And C91FIG. NGCP hydrophobicity plot (Figure 3 ) And ENA-78 (FIG. 4) are similar, but are shown in FIG. As such, the actual residues including the leader and mature protein sequences of these molecules There are significant differences between the groups. Furthermore, the isoelectric points of NGCP and ENA-78 are They are 10.34 and 9.10, respectively. FIGS. 7A and 7B show N GCP and human E annotated as 5 "analogous to granulocyte chemotactic protein 2 FIG. 9 is a view showing alignment between nucleic acid sequences of ST (GI 973875; SEQ ID NO: 6). Thus, it shows 70% identity. 3 of the first 180 nucleotides of this sequence From one frame translation, some Frame shifts, and an accurate reassembly for the published ENA-78 peptide. The leader sequence is deduced. NGCP usually has a distinct N-glycosylation site I know not. NGCP coding sequence   The nucleic acid sequence and deduced amino acid sequence of NGCP are shown in FIGS. 1A and 1B. ing. According to the present invention, NGCP is converted using a nucleic acid sequence encoding NGCP. Recombinant molecules to be expressed can be created. In certain embodiments disclosed herein, Shows that the partial sequence encoding NGCP was first obtained from a pancreatic cDNA library (PA NCNOT05) from Insight Clone No. Isolated as 949299.   As a result of the degeneracy of the genetic code, the nucleotide sequence of a known or naturally occurring gene Many NGCP-encoded nucleic acids, including those with minimal homology It will be apparent to one skilled in the art that nucleotide sequences can be created. Book The invention is particularly directed to all combinations that can be made by selecting combinations based on possible codon choices. All possible nucleic acid sequence variations are included in the scope. Their combination is Standard triplet genetic code applicable to the nucleotide sequence of naturally occurring NGCP And all such variants are specifically described here. Please think that it was shown in.   Nucleic acid sequences encoding NGCP and its variants are carefully selected Can hybridize to naturally occurring nucleotide sequences under tight conditions NGCPs or variants thereof with generally different codon usage It may be beneficial to create a nucleotide sequence that encodes a variant. Codon selection The choice depends on the frequency of particular codons used by the host, Or to increase the rate of peptide expression in eukaryotic expression hosts. Can be selected. NG The nucleotide sequence encoding CP and its derivatives is replaced with the encoded amino acid sequence. The reason for substantially changing the column without changing it is that RNA transcripts with more desirable properties, such as longer half-life For production.   At present, DNA sequences encoding NGCP or its derivatives, or Parts are made entirely by synthetic chemistry, and then DNA reagents and cell lines available from Can be used to insert. In addition, code NGCP using synthetic chemistry Can be mutagenized to the sequence or any portion thereof.   Also, as included within the scope of the present invention, FIG. There is a polynucleotide sequence that can hybridize with the nucleotide sequence of C The hybridization conditions were as described in Berger and Kimmel (1987,Guide to Molecular Clo ning Techniques Methods in Enzymology , Vol 152, Academic Press, San Diego C As described in A), the melting point (Tm) of the nucleic acid binding complex or probe It is based on, and gives a criterion used in a defined "rigidity". The above document is a book It is cited integrally with the specification.   The mutated nucleic acid sequence encoding NGCP that can be used in the present invention is a different nucleic acid sequence. Including deletions, insertions and substitutions of nucleotide residues, resulting in identical or functional And a polynucleotide encoding an NGCP polypeptide equivalent to . The protein also has deletions, insertions, and deletions of amino acid residues that cause silent changes. Including substitutions, resulting in a functionally equivalent NGCP. Careful amino acid substitutions Residue polarity, charge, solubility, as long as the biological activity of NGCP is retained , Hydrophobicity, hydrophilicity as well as similarity for amphipathicity. For example negative Charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid and are positively charged Amino acids include lysine and arginine and are not charged with the same hydrophilic value. Amino acids with polar head groups include leucine, isoleucine, valine, and glycine , Alanine, asparagine, glutamine, serine, threonine, phenylalanine And tyrosine.   NGCP alleles are included within the scope of the present invention. Used here “Allele” or “allele sequence” is another form of NGCP. Allele mutated That is, an mRNA or polypeptide that is generally altered by a change in the nucleic acid sequence. Generates a peptide, but alters the structure or function of its mRNA or polypeptide It may or may not be done. Some genes have allelic forms Some do not exist, some exist, or many exist. Raw allele Subsequent mutations generally result from natural deletions, additions and substitutions of amino acids. This Each change in the type, alone or in combination with other genes, It can occur at one or more positions in the row.   Methods for DNA sequencing are well known and include, for example, DNA polymerase I, Se. quenase (TM) Klanou fragment (US Biochemical, Cleveland OH), Taq polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), thermostable T7 polymerer Ze (Amersham, Chicago IL) or Gibco BRL (Gaithersburg MD) Methods Recombinant polymerases such as the ELONGASE amplification system commercially available from An enzyme is used, such as in combination with a free exonuclease. Good Preferably, this process is performed by Hamilton Micro Lab2200 (Hamilton, Reno NV), Pelti er Thermal Cycler (PTC200; MJ Reserch, Watertown MA) and ABI377 DNA Automated using equipment such as a sequencer (Perkin Elmer). Extension of polynucleotide sequence   The polynucleotide sequence encoding NGCP has a partial nucleotide sequence One skilled in the art for detecting upstream sequences, such as, promoters and regulatory elements It can be extended using various well-known methods. Gobinda et al. (1993; PCR Meth ods Appllc 2: 318-22) is a general purpose search for unknown sequences adjacent to known sites. As a direct method using primers for “restriction site” polymerase chain reaction ( PCR) method. Here, first, the genomic DNA is Amplified in the presence of specific primers and primers for the linker sequence You. The amplified sequence is identical to that of the same linker primer and the first primer. The second round of PCR is performed using another specific primer included in the part. PC The product of each round of R is transcribed using an appropriate RNA polymerase and reverse transcriptase The sequence is determined using   Sequence amplification using various primers based on known regions using inverse PCR Width or extension can be done (Triglia et al. (1988) Nucleic Acids Res 16: 818 6). The primer was OLIGO® 4.06 (National Biosciences, Plymouth)  MN) or another suitable program, 20-30 nucleobases in length And a target sequence having a GC content of 50% or more and a temperature of about 68-72 ° C. Annealing. In this method, several restriction enzymes are used to obtain a known region of a gene. To generate the appropriate fragment. This fragment is then used for intramolecular ligations. And used as a template for PCR.   Capture PCR method (Lagerstrom M et al. (1991) PCR Methods Applic 1: 111-19 ) Is a DNA sequence adjacent to a known sequence in human and yeast artificial chromosome (YAC) DNA. This is a method for performing PCR amplification of an NA fragment. Also capture PCR Now, multiple restriction enzyme digestion and ligation Must place the recombinant double-stranded sequence in an unknown portion of the DNA molecule before PCR. It is necessary.   Another method that can be used to search for unknown sequences is that of Parker JD or similar. Method (1991: Nucleic Acids Res 19: 3055-60). Furthermore, PCR, nesting Step through genomic DNA using primers and PromoterFinder library. (PromoterFinder®, Clontech (Palo Alto) CA)). This process eliminates the need to screen libraries and Useful for locating tron / exon junctions.   Suitable libraries for screening full-length cDNAs are available in size selection Selected libraries containing larger cDNAs. Also random ply A random primed library contains the 5 'and upstream regions of the gene. This is preferred in that it includes more sequences. Random primed rye The library states that if the oligo d (T) library does not produce full-length cDNA, Particularly useful. The genomic library extends to 5 'of the promoter binding region. Useful to lengthen.   Analyze size or nucleotide sequence of sequencing or PCR products A new method for confirming this is capillary electrophoresis. Rapid sequencing Systems for Perkin Elmer, Beckman Instruments (Fullerton CA ) As well as from other companies. In capillary electrophoresis, electrophoretic separation Flowable polymer for laser, 4 different fluorescent dyes activated by laser (each nucleus) Using one for leotide) and detecting the wavelength of radiation with a CCD camera. U. Output / light intensity is determined by appropriate software (eg Genotyper from Perkin Elmer) (Registered trademark) and Sequence Navigator (registered trademark)). The whole process from sample loading to computer analysis and electronic data display Is computer controlled. Capillary electrophoresis is limited to specific samples It is particularly suitable for sequencing small pieces of DNA that are present in a reduced amount. By this method Reproducible sequencing of 350 bp of M13 phage DNA in 30 minutes (Ruiz-Martinez MC et al. (1993) Anal Chem 65: 2851-8) . Expression of nucleotide sequence   According to the present invention, NGCP, a fragment of the polypeptide, a fusion protein or the like. A polynucleotide sequence encoding a functional equivalent of Can be used to generate recombinant DNA molecules that induce the expression of GCP . Amino acid sequences that are generally identical or functionally equivalent due to the inherent degeneracy of the genetic code Are also used for cloning and expression of NGCP be able to. As those skilled in the art will appreciate, NGCs with non-naturally occurring codons It may be beneficial to generate a P-encoding nucleotide sequence. Specific prokaryotic cells Alternatively, suitable codons in eukaryotic host cells (Murray E et al. (1989); Nucleic Acids Res 17: 477-508), for example, to increase the NGCP expression rate, or Has desirable properties such as longer half-life than transcripts generated from naturally occurring sequences To produce a recombinant RNA transcript.   The nucleotide sequence of the present invention is a modified NGCP-encoding sequence for various purposes Such modifications include, but are not limited to, the gene product Cloning, processing, and also alterations that modify expression. example For example, mutations may be induced using techniques well known to those skilled in the art, such as site-directed mutagenesis. Triggers the insertion of new restriction sites, changes in glycosylation patterns, This can result in changes in codon preference and the like.   In another embodiment of the invention, the native NGCP coding sequence, the modified NGCP Coding sequence or a recombinant NGCP coding sequence to a heterologous sequence, Make a sequence that encodes the fusion protein. For example, inhibitors of NGCP activity To screen a peptide library to select for Encoding a chimeric NGCP protein expressing a more recognized heterologous peptide Can be helpful. The fusion protein is a protein sequence heterologous to the NGCP sequence Can be designed to include a cleavage site at a position between The GCP can be cleaved and separated from the heterologous portion for substantial purification.   In another embodiment of the present invention, the NGCP coding sequence is well known to those skilled in the art. (Caruthers et al. (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 7: 215-223, Crea, Horn (1980) Nuc Acids Res 9: 2331, Matteucci, Caruthers (1980) Tetrahedron  Lett 21: 719, see Chow, Kempe (1981) Nuc Acids Res 9: 2807-2817). , Can be synthesized wholly or partially. Alternatively, NGCP amino The protein itself, using chemical methods to synthesize acid sequences, wholly or partially Can be generated. For example, various solid-phase techniques (Roberge JY et al. (1995) Science  269: 202-204), and the automation of the synthesis can be performed, for example, using ABI4 Use 31A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer) according to manufacturer's instructions Can be achieved.   This newly synthesized peptide is purified by high performance liquid chromatography for separation. (For example, Creighton (1983)Proteins Structure And Molecu lar Principles , WHF reeman and Co, New York). Set of synthesized peptides The formation can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (for example, th e Edman degradation procedure; Creighton, supra). NGCP amino Acid sequence, or Alters any part of it during its direct synthesis or modifies other intracellular media. The sequence derived from the eta or any part thereof can be combined with the chemical A variant polypeptide can be produced. Expression system   To express biologically active NGCP, the NGCP-encoding nucleo The peptide sequence or functional equivalent is inserted into a suitable expression vector, i.e. Inserted into a vector containing elements essential for the transcription and translation of the dosing sequence.   Expression including NGCP coding sequences and appropriate transcriptional and translational control elements Methods well known to those skilled in the art are used to construct the vector. These methods include in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo recombinant techniques. That is, the gene recombination technique is included. Such techniques are described in Sambrook et al. (1989).Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, Planview NY and Ausubel FM etc.Current Protoclin Molecular Biolgy, John Wilky & Sons, Ne w York.   Various expression vector / host systems retain and express the NGCP coding sequence. Can be used to Such as, but not limited to, Transform with bacteriophage, plasmid or cosmid DNA expression vector Bacteria, yeast transformed with yeast expression vector, virus expression vector (Eg baculovirus) infected insect cell lines, viral expression vectors ( For example, cauliflower mosaic virus CaMV, tobacco mosaic virus TMV) A transfected or bacterial expression vector (eg, Ti or pBR322) Plasmids) and plant cell lines or animal cell lines.   The "control elements" or "regulatory sequences" of these systems Specificity is variable, including untranslated regions, enhancers, promoters and 3 'non- Translation regions, which are proteins in the host cell that perform transcription and translation. Interacts with. Depending on the vector and host used, constitutive and inducible Any number of suitable transcription and translation elements, including motors, may be used. For example When cloning in a bacterial system, the Bluescript® Zymid (Stratagene, LaJolla CA) hybrid lacZ promoter and ptrp -lac hybrids and similar inducible promoters are used. Baculoyl The spolyhedrin promoter is used in insect cells. Plant cell genome ( Heat shock, RUBISCO and storage protein genes) Or a plant virus (eg, a viral promoter or leader sequence) The derived promoter or enhancer can be cloned into a vector. Feeding For mammalian cells, promoters derived from mammalian genes or mammalian viruses are optimal. is there. If it is necessary to generate a cell line that contains multiple copies of NGCP, SV40 Alternatively, an EBV-based vector is used with an appropriate selectable marker.   In bacterial systems, a number of expression vectors may be selected depending upon the use for the expression of NGCP. You. For example, if large amounts of NGCP are required to elicit antibodies, A vector that can express the fusion protein to be purified at a high concentration is desired. Like that Such vectors include, but are not limited to, E. coli cloning vectors and expression vectors. -Bluescript (Stratagene) (In this vector, the NGCP coding sequence is With the amino terminal methionine followed by a sequence of 7 residues of β-galactosidase Hybridized into a vector in the frame And pIN vector (Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264: 5503-5509) ) Etc. are included. PGEX vector (Promage, Madison WI) As a fusion protein having glutathione S-transferase (GST) Used to express a heterologous polypeptide. Generally, such fusion proteins The quality is soluble and free glutathione is absorbed following adsorption to glutathione agarose beads. It can be easily purified from lysed cells by elution in the presence of thione. The system Is a protein produced by heparin, thrombin or factor XA Cloned polypeptide of interest designed to include Can be released from the GST moiety.   In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the alpha factor Constitutive or inducible promoters such as codons, alcohol oxidase and PGH Numerous vectors are used, including: In case of reconsideration, Ausubel et al. And Grant et al. (1987) Methods Enzymol 153: 516-544.   When a plant expression vector is used, the expression of the sequence encoding NGCP is Promoted by any number of promoters. For example, the 35S and 19S promoters of CaMV ( Viral promoters such as Brisson et al. (1984) Nature 310: 511-514) are simply Omega-leader in Germany or from TMV (Takamatsu et al. (1987) EMBO J 6: 307-311) Used with arrays. Alternatively, RUBISCO (Coruzzi et al. (1984) EMBO J 3: 1671- 1680), small subunit of Broglie et al. (1984) Science 224: 838-843), or heat Shock promoter (Winter J and Sinibaldi RM (1991) Results Probl Cell Dif fer 17: 85-105). These configurations are directly D Introduced into plant cells by NA transformation or pathogen-mediated transfection It is. To review such technologies, see Hobbs S and Murry LE, McGraw Hi. llYearbook of Science and Technology(1992) McGraw Hill NY, pp191-196 and And Weissbach and Weissbach (1988)Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press NY, p See p421-463.   Another expression system that can be used to express NGCP is an insect system. So In one of the systems likeAutographa californicaNuclear polyhedrosis virus (AcNPV) Is used as a vector,Spodoptera frugiperdaCells orTrichoplusiaof Expresses foreign genes in larvae. The NGCP coding sequence is a polyhedrin residue Cloned into non-essential regions of the virus, such as the gene, Data control. If the NGCP is successfully inserted, the polyhedrin remains Mutant viruses are produced that have the gene inactivated and lack the coat protein membrane You. This mutant virus was thenfrugiperdaCells orTrichoplusiaYoung Used to infect insects, in which NGCP is expressed (Smith et al. (1) 983) J Virol 46: 584, Engelhard EK, etc. (1994) Proc Nat Acad Sci 91: 3224-7) .   In mammalian host cells, a number of viral expression systems are available. Expression If an adenovirus is used as the vector, the coding sequence of NGCP Is an adenovirus transcript / translate consisting of the late promoter and tripartite leader sequence Bound within the complex. Infection by insertion of a viral genome into a non-essential region Viable virus capable of expressing NGCP in damaged host cells (Loga n and Shenk (1984) Proc Nat Acad Sci 81: 3655-3659). Rous sarcoma Transcriptional enhancers, such as the Lus (RSV) enhancer, increase expression in mammalian host cells. Can be used to add   Specific initiation signals are also required for efficient translation of NGCP sequences. is there. These signals include the ATG start codon and adjacent sequences. NG CP and its initiation codon and upstream sequence should When inserted into the vector, no additional translation control signals are required. However However, if the coding sequence or only a part of it is inserted, the ATG start code Extraneous translation control signals, including translational signals, must be provided. In addition, Dons must be in the correct reading frame and all inserts must be transcribed. I have to. Foreign transcription elements and initiation codons can vary in both natural and synthetic From different origins. The effect of the expression should be (Scharf et al. (1994) Results Probl Cell Diffe r 20: 125-62, Bitter et al. (1987) Methods Enzymol 153: 516-544).   In addition, the host cell strain may be capable of altering the inserted sequence in a desired manner or expressing the expressed sequence. It is selected for its ability to process proteins. Repair of such polypeptides Decorations include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation , Lipidation and acylation. "Prepro" of protein Post-translational processing, which separates morphology, ensures correct insertion, folding, and also It is important for the performance of Noh. Different host cells such as CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, etc. The vesicle has specific cellular and characteristic mechanisms for such post-translational activity. Selection to ensure the modification and processing of the introduced foreign protein. Selected.   Stable to ensure high yields of mutant protein over long periods of time Desirable expression is desirable. For example, a cell line stably expressing NGCP is a virus-derived cell line. Expression vector containing an endogenous expression element and a selectable marker gene. It is transformed using a vector. Following the introduction of the vector, the cells are placed in a selective medium. Grow in concentrated media for 1-2 days before switching. The selection marker is A cell that confers resistance to the selection and stably binds the introduced sequence within the DNA. Be able to set You. The resistant clumps of stably transformed cells are treated with tissue culture techniques appropriate for the cell type. It can be propagated using surgery.   Any number of selection systems can be used to recover transformed cell lines. You. Without limitation, the selection system is herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler (1977) Cell 11: 223-32) and adenine phosphoribosyltransferase (Lowy et al. (1980) Cell 22: 817-23) Used in Also select for resistance to antimetabolites, antibiotics or herbicides Can be used as a basis. For example, dhfr is resistant to methotrexate (Wigler et al. (1980) Natl Acad Sci 77: 3567), npt is an aminoglycoside, Confer resistance to neomycin and G-418 (Colberre-Garapin et al. (1981) J Mol  Biol 150: 1), als or pat is chlorsulfuron, phosph Phosphinotricin acetyltransferas confer resistance to e) (Murry, supra). More selectable genes, for example TrpB, which allows cells to use indole instead of tryptophan, Hi allows the vesicles to use histinol instead of histidine sD has been described (Hartman and Mulligan (1988) Proc Nalt Acad Sci 85: 804). 7). More recently, specific vectors have been used not only to identify transformants, Widely used to quantify the amount of transient or stable protein expression by a system Labels such as β-glucuronidase, anthocyanins and luciferin Visible labels have become very popular (Rhodes CA et al. (1995) Methods  Mol Biol 55: 121-131). Identification of a transformant containing the polynucleotide sequence of the present invention   The presence / absence of marker gene expression suggests that the gene of interest is also present However, its presence and expression should be confirmed. For example, NG If CP is inserted within the marker gene sequence, recombinant cells containing NGCP are Can be identified by the presence of the protein gene function. Alternatively, the marker gene is a single It can be placed in series with the NGCP array under the control of a promoter. Induction or Expression of the marker gene in response to selection usually also indicates NGCP expression.   In addition, a host containing an NGCP coding sequence and further expressing NGCP Cells can be identified by various procedures well known to those skilled in the art. These steps are limited But not DNA-DNA or DNA-RNA hybridization and Membranes, solutions or fragment bases for the detection and / or quantification of nucleic acids and proteins Includes protein bioassays or immunoassays including biotechnology.   The presence of the NGCP polynucleotide sequence may be a probe of NGCP, a portion, or DNA-DNA or DNA-RNA hybridization using fragments Alternatively, it can be detected by amplification. In assays based on nucleic acid amplification Using oligonucleotides or oligomers based on the NGCP sequence, A transformant containing P DNA or RNA is detected. In this specification, "Gonucleotide" or "oligomer" is a probe or amplified by PCR. At least 10 segments that can be used as amplimers Nucleotides, often 60 nucleotides, preferably 15-30 nucleotides And more preferably a nucleic acid sequence of 20 to 25 nucleotides.   Whether polyclonal or monoclonal antibodies specific for this protein Various methods for detecting and measuring NGCP polypeptide expression using the Tocol is well known to those skilled in the art. Examples of such protocols include enzyme-linked Immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA) and fluorescence display Includes the vesicle sorter method (FACS). N Monochrome reacting against two non-interfering epitopes on GCP polypeptide Two-site, monoclonal-based immunoassay using a null antibody oclonal-based immunoassay) is preferred, but competitive binding assays may also be used. It is. These and other assays are described in Hampton R et al. (1990, Serologivc al Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul MN) and Maddox DE etc. (19 83, I Exp Med 158: 1211).   Many more labeling and conjugation techniques are well-known to those of skill in the art, and various nucleic acids and amino acids It can be used in the no acid test method. For detecting sequences related to NGCP To generate labeled hybridization or PCR probes for Means include oligo labeling, nick translation, end labeling or labeling PCR amplification using a modified nucleotide. Alternatively, the NGCP sequence, or Clones any part of it into a vector for the production of an mRNA probe Is done. Such vectors are well known in the art and are commercially available; Suitable RNA polymers such as T3 or SP6 and labeled nucleotides Can be used for RNA probe synthesis in vitro. You.   Pharmacia Biotech (Piscataway NJ), Promega (Madison WI) and US Several companies, such as Biochemical (Cleveland OH), have implemented these procedures. It offers commercial kits and protocols. The right reporter molecule, link Labels include radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents or dyes Includes agents, substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles or similar It is. Patents describing the use of such labels include U.S. Pat. No. 837, No. 3,850,752, No. 3,939,350, No. 3,996,345, No. 4,277,437, No. There are 4,275,149 and 4,336,241. In addition, for the production of recombinant immunoglobulins For this, the method described in U.S. Pat.No. 4,816,567 can be used. Please refer to both. Purification of NGCP   Host cells transformed with the nucleotide sequence encoding NGCP can be used in cell culture. Cultured under appropriate conditions to express and recover the encoded protein from the ground . The protein produced by the recombinant cell contains the sequence used and also the vector Can be secreted, that is, contained in the cell, depending on the type of cell. Skilled person As will be appreciated, expression vectors containing a polynucleotide encoding NGCP are disclosed. The modulator induces secretion of NGCP through the cell membrane of prokaryotic or eukaryotic cells. It is designed to include a signal sequence. In other recombinant products, NGCP is Nucleotide encoding a polypeptide domain that facilitates purification of soluble proteins (Kroll DJ et al. (1993) DNA Cell Biol 12: 441-5) 3, see also discussion above regarding vectors containing fusion proteins).   NGCP also contains one or two or more added to facilitate protein purification. Expressed as a recombinant protein with an additional polypeptide domain above . Domains that facilitate such purification include, but are not limited to, Chelates such as the histidine tryptophan module that enable purification of Peptide (Porath J (1992) Protain Expr Purif 3: 263-281), immobilized immunoglobulin Protein A domain allowing purification on flin, and FLAGS extension / Domains used in affinity purification systems (Immunex, Seattle W A) is included. Factor XA or enterokina between the purification domain and NGCP Cleavable linker sequences, such as lysease (Invitrogen, San Diego CA). The inclusion serves to facilitate purification. One such expression vector is NG Provides expression of a fusion protein comprising CP and comprises six histidine residues, and Includes nucleic acids encoding subsequent thioredoxin and enterokinase cleavage sites. Hi IMIAC (immobilized metal ion affinity chromatography) Fie, Porath et al. (1992) Protein Expression and Purification 3: 263-281. Described), and the enterokinase cleavage site is compatible with the fusion protein. It is a means for purifying the target protein from the quality.   In addition to recombinant production, fragments of NGCP can be directly Can also be formed by peptide synthesis. (Stewart et al. (1969)Solid-Phase Pet ide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc 85: 2149-2154).in in vitroProtein synthesis can be done manually However, it can be automated. Automated synthesis is described, for example, in Applied Biosystem 43. 1A peptide synthesizer (Perkin Elmer, Foster City CA) according to manufacturer's instructions Can be used. Various fragments of NGCP can be chemically They can be synthesized and combined using chemical methods to create full-length molecules. Use of NGCP   The discovery of NGCP has led to interventions at the molecular level in various pathological processes. And the opportunity to gain a better understanding of it. NGCP or its Derivatives of leukemia and other cancers, immunodeficiencies, or disease states such as hyperimmune responses It can be used therapeutically in use.   Transfecting tumor cells with minute amounts of NGCP As a result, tumorigenicity may be reduced. Administer purified NGCP to reduce tumor regression It can induce the proteolytic activity of neutrophil granulocytes.   Expression of NGCP in mammals (Broxmeyer, supra) is a feedback mechanism NGCP is added to bone marrow precursor cell populations It can be administered to a patient to exert a myelosuppressive effect. NGCP is acetonitrile Granulocyte-macrophage, red, with or without preincubation in the trel It is expected to suppress the blood cell lineage and pluripotent precursor cells, and Treatment with mokines may help treat patients with acute or chronic leukemia.   Therapeutic compositions containing NGCP are useful for preventing patients with disease states that compromise the immune system. It can be applied to therapeutic uses. Such disease states include, but are not limited to, , HIV infection, Job-Bakley syndrome, lazy leukocyte syndrome, acquired agranular There is cocculopathy, and Chediak-Higashi syndrome. The etiology of these diseases is different However, common features include impairment of the immune system and its predisposition to infection. included. By administering NGCP in one dose, a specific site for systemic defense Triggering and activation of leukocytes for   In contrast, antisense technology uses antagonists, inhibitors, or anti-N Suppression of NGCP expression by introduction of GCP antibody may help in prevention of pathogenesis You. Under these conditions, cell destruction results in an excess of leukocyte chemoattraction and It is important to prevent activity. Such disease states include idiopathic dilated myocardium Disease, emphysema, lupus, myasthenia gravis, pancreatitis, and rheumatoid arthritis . NGCP antibodies   NGCP-specific antibodies are used to diagnose diseases and disorders related to NGCP expression. Useful. Such antibodies include, but are not limited to, polyclonal antibodies, monoclonal Live antibody, chimeric antibody, single chain, Fab fragment and Fab expression live Includes fragments generated by Rari You. Neutralizing antibodies, ie, antibodies that suppress the biological activity of an NGCP polypeptide, are particularly useful. It is suitable for diagnosis and treatment.   NGCP for antibody induction does not need to have biological activity, but The protein fragment, or oligopeptide, must be antigenic. Specific antibodies The peptide used to induce is preferably at least 5 amino acids, preferably Has an amino acid sequence consisting of at least 10 amino acids. These arrays , Which is identical to part of the amino acid sequence of the natural protein, It may include the entire amino acid sequence of the molecule. A short stretch of NGCP amino acids is key Such as antibodies raised against whole limpet hemocyanin and chimeric molecules It can be fused to sequences of other proteins. Generation of antibodies against NGCP For this, procedures well known in the art are used.   In order to produce antibodies, various hosts, including goats, rabbits, rats, mice, etc. NGCP retaining immunological properties or any part, fragment or Immunization can be performed by injecting an oligopeptide. Depending on the species of the host Various adjuvants are used to enhance the immunological response. like that Adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, aluminum hydroxide Inorganic gel adjuvants such as lithium and surfactants such as lysolecithin Adjuvant, pluronic polyol adjuvant, polyanion adjuvant, Peptide adjuvant, oily emulsion adjuvant, keyhole limpet hemosini Unadjuvants as well as dinitrophenol adjuvants are included. BCG ( Calmette-Guerin bacilli) and Corynebacterium parvum (Corynebacterium) parvum) is a useful human adjuvant.   Monoclonal antibodies to NGCP were detected by continuous cell lines in the medium. It is prepared using any technique for effecting offspring production. these Was originally published in, but not limited to, Koehler and Milstein (1975, Nature 256: 495-497). Hybridoma technology, human B-cell hybridoma technology (Kosbor et al. (1983 ) Immunol Today 4:72, Cote et al. (1983) Proc Natl Acad Sci 80: 2026-2030) and And EBV-hybridoma technology (Cote et al. (1985)Monoclonal Antibodies and Ca ncer Therapy , Alan R Liss Inc, pp77-96).   Furthermore, "chimeras" for obtaining molecules having appropriate antigen specificity and biological activity Antibody, that is, the splicing of the mouse antibody gene to the human antibody gene. (Morrison et al. (1984) Proc Natl Acad Sci 81: 6851-6855), Neuberger et al. (1984) Nature 312: 604-608, Takeda et al. (1985) Natu re 314: 452-454). Alternatively, known techniques for the production of single-chain antibodies (U.S. Pat. No. 4,946,778) is applied to generate NGCP-specific single chain antibodies.   Antibodies can also be used to induce in vivo production in lymphocyte populations. (1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837) and Winter G and Mil Recombinant immunoglobules as disclosed in Stein C (1991, Nature 349: 293-299) Screen a phosphorus library or panel of highly specific binding reagents Can also be generated.   Antibody fragments which contain specific binding sites for NGCP can also be generated. You. For example, such fragments include, but are not limited to, the pepsin of the antibody molecule. F (ab ') that can be produced by digestionTwoFragment and F (ab ')Two Fa that can be produced by reducing the disulfide bridges of the fragment b fragment. Alternatively, a monoclonal F having the desired specificity may be used. The Fab expression library was used to identify ab fragments quickly and easily. Build a rally (Huse WD et al. (1989) Science 256: 1275-1281).   Polyclonal or monoclonal antibodies with established specificity Various methods for competitive binding assays or immunoradiometric assays using Protocols are well known in the art. In such immunoassays, In addition, the complex between NGCP and its specific antibody (or similar NGCP binding molecule) Measurements of body formation as well as complex formation are made. On specific NGCP proteins Bipartite utilizing monoclonal antibodies reactive against two non-interfering epitopes Immunoassays for monoclonal antibodies are preferred, but competitive binding assays may also be used. Can be These tests are described in Maddox DE et al. (1983, J Exp Med 158: 1211). ing. Diagnostic test method using NGCP-specific antibody Certain NGCP antibodies are characterized by a disease or disease characterized by induction of NGCP expression. Assays for diagnosing disease and monitoring patients treated with NGCP Useful in Diagnostic assays for NGCP include human body fluids, cells or Those who use antibodies or labels for detecting NGCP in tissue extracts Including the law. Use the polypeptides and antibodies of the present invention with or without modification Can be. In many cases, polypeptides and antibodies will be bound covalently or non-covalently. Labeled by linking them to a reporter molecule. varied Are well known, some of which are described above.   Polyclonal antibody or monoclonal specific for each protein Various protocols for measuring NGCP polypeptides using null antibodies are available. It is well known in the art. Examples include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radio There are immunoassays (RIAs) as well as a fluorescence-activated cell sorter (FACS). NGC Two non-dried P polypeptides Two-Site Monoclonal Using Monoclonal Antibodies Reacting to Sensitive Epitopes Although a regional immunoassay is preferred, a competitive binding assay is also used. These assays include, among others, Maddox DE et al. (1983, I Exp Med 158: 1211). It is described in.   To provide a basis for the diagnosis of the disease, the normal values for NGCP expression, That is, a standard value must be established. This is the right condition for complex formation Below, either human or animal, but body fluids obtained from normal subjects It can be obtained by combining a cell extract with an antibody against NGCP. However, this is a technique well known in the art. Standard complex formation is a series Quantified by comparing it with the positive control dilution system Is bound to a known concentration of purified NGCP. Then from a normal sample The obtained standard values were used as samples from subjects potentially suffering from NGCP-related diseases. To the value obtained from the file. The deviation between the standard value and the target value confirms the presence of the disease. It can be recognized. Drug screening   NGCP, catalytic or immunogenic fragments or oligopeptides thereof Is the screening of therapeutic compounds in any of a variety of drug screening techniques. Can be used for logging. Fragments used in such tests Can be used to attach to solutions, solid supports, adhere to cell surfaces, or settle into cells. There are no restrictions. The binding complex formation between NGCP and the agent to be tested is measured. It is.   Another method for drug screening is the use of stable NGCP polypeptides. Enables high-throughput screening of compounds with binding affinity Yes, see European Patent Application No. 84/03564 (Guysen) published September 13, 1984 It is described in. This document Please refer to In summary, a number of separate small peptide test compounds were Synthesize on a solid substrate, such as a plastic pin or some other surface. The polypeptide test compound is reacted with the NGCP fragment and washed. Then Bound NGCP is detected by methods well known in the art. In addition, purified NGCP was Coating directly on plates for use in drug screening techniques You can also Alternatively, capture the peptide and place the peptide on a solid support. Use a non-neutralizing antibody to fix.   Also, the present invention provides a neutralizing antibody capable of binding to NGCP. And specifically intended to use competitive drug screening assays that compete with test compounds are doing. In this way, one or more antigenic determinants may be identified using the antibody as NG. The presence of any peptide in common with CP can be detected. Use of NGCP encoding polynucleotide   NGCP polynucleotide, or part thereof, used for diagnostic and / or therapeutic purposes Can be For diagnostic purposes, the NGCP of the present invention may be a biopsy involving NGCP expression. Used to detect and quantify gene expression in tissues. Diagnostic tests NGCP is present, absent, or overexpressed, It helps to monitor regulation of NGCP levels during therapeutic intervention. Of the present invention The scope includes oligonucleotide sequences, antisense RNA and DNA molecules, and PNA is included.   Another aspect of the invention includes a genomic sequence encoding NGCP or a closely related molecule. Hybridization probe or P that can detect polynucleotide sequences The purpose is to provide a CR probe. And the specificity of the probe, Very highly conserved regions (e.g., 10 unique nucleotides in the 5 'regulatory region) Area) or a less conservative area (eg Region particularly between the cysteine residues in the 3 'region). Hybridization, amplification or (high, medium or low) Stringency), the probe identifies only naturally occurring NGCP. Or identify allele sequences or closely related sequences.   Probes can also be used to detect sequences encoding closely related inhibitors. And preferably from sequences encoding any of these NGCPs. At least 50% of the nucleotides used. Hybridization of the present invention The lysis probe may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, Derived from genomic sequence including Hansa element and intron of naturally occurring NGCP It can be. Hybridization probes to various reporter molecules Can be more labeled,32P and35Radionuclide such as S, Avi Like alkaline phosphatase bound to the probe by a gin / biotin binding system Enzyme labels and the like.   Generation of Specific Hybridization Probe for NGCP DNA Other means for NGCP or NGCP induction in the vector for mRNA probe production Cloning a nucleic acid sequence that encodes the body. Such vectors are Known and commercially available, suitable T7 and SP6 RNA polymerase By adding RNA polymerase or appropriate radiolabeled nucleotides,  It can be used to synthesize RNA probes in vitro.Diagnostic use NGCP-encoding polynucleotide sequences can be used in diseases involving NGCP expression. And for the diagnosis of diseases. For example, a poly that encodes NGCP Nucleotide sequence to detect NGCP expression For hybridization or PCR assays of biopsied tissues and body fluids Can be used. Such forms of qualitative and quantitative methods include Blots, Northern blots, dot blots or other membrane technologies , PCR technology, dipstick test method (test paper method), pin or chip technology And ELISA technology. All of these techniques are well known in the art. It is the basis for many diagnostic kits that are actually commercially available.   The NGCP nucleotide sequences disclosed herein may be used for activation or activation associated with inflammation or disease. It provides the basis for an assay to detect induction. The NGCP nucleotide sequence is Can be labeled by known methods and are suitable for forming hybridization complexes. Under conditions, it is added to a sample of a patient's body fluid or tissue. During incubation After a period of time, remove the sample if nucleotides are labeled with an enzyme. Wash with a compatible liquid containing dye (or label requiring other developing agents) if desired You. After rinsing the compatible liquid, the dye is quantified and compared to a standard value. biopsy The amount of dye in the sample or extracted sample is significantly The nucleotide sequence of the sample. NGCP nuclei that are hybridized with the The presence of the otide sequence indicates that the associated inflammation and / or disease is present. Which indicates that.   Such assays can be used in animal studies, Can be used in clinical trials or to monitor individual patient treatment . To provide a basis for diagnosing the disease, the normal or normal A standard profile must be established. This standard profile A body fluid or cell extract obtained from a normal subject, ie, an animal or a human. , Hybridization Alternatively, it can be confirmed by binding to NGCP or a part thereof under conditions suitable for amplification. Is set up. Standard hybridization is the value obtained for normal subjects and Positive in the same experiment where the amount of known substantially purified NGCP is used Can be quantified by comparing with values obtained with Wear. Standard values obtained from normal samples are indicative of disorders associated with NGCP expression or any Is compared to values obtained from samples from subjects potentially suffering from the disease . The presence of the disease is confirmed from the deviation between the standard value and the subject value.   Once the disease is confirmed, existing therapeutic agents are administered and treatment profiles are administered. File is created. Such assays have normal or standard patterns. It is repeated regularly to assess whether it is recovering toward the target. Continue Demonstrate the effectiveness of treatment over a period of days or months using a typical treatment profile Can be   As described in U.S. Pat.Nos. 4,683,195, 4,800,195 and 4,965,188. The PCR method offers additional uses for oligonucleotides based on NGCP sequences. Provided. Such oligomers are generally synthesized chemically, but using enzymes Or it can be produced from a recombinant. In general Rigomers are usually used under optimal conditions to identify a particular gene or condition. Two nucleotide sequences, ie, nucleotides in the sense direction (5 '→ 3') And nucleotides in the antisense direction (3 '← 5'). The same two Rigomers, nested oligomer sets, or even degenerate pools of oligomers are closely related Under lower stringency conditions for the detection and quantification of Can also be used.   Methods for further quantifying the expression of specific molecules include radiolabels. ing) (Melby PC et al. 1993 J Immunol Methods 159: 235-44) Alternatively, biotin-labeled (Duplaa C, etc. 1993 Anal Biochem 229-36) nucleotides Use, use of co-amplification of control nucleic acids, and complement experimental results Includes the use of standard graph curves written as: For quantification of many samples, It can be performed quickly by performing an ELISA format assay, Oligomers appear in various dilute solutions and can be analyzed by spectrophotometric or colorimetric It can be quantified quickly. This type of definitive diagnosis can help health professionals It is possible to start aggressive treatment of the elderly and prevent the deterioration of the medical condition. Similarly, Monitor the progress of the patient as he treats it using assays well known to the vendor. Can be Also, molecular biology techniques that have not yet been developed New technologies have known nucleotide sequence properties, such as the triplet genetic code, Nucleotide sequence disclosed herein, if it is based on Can be used forTherapeutic use   Based on its homology to EMAP-II and its expression profile, The polynucleotides encoding NGCP disclosed herein are useful for treating immunodeficiency disorders. Can help.   From retrovirus, adenovirus, herpes or vaccinia virus Expression vector, or an expression vector derived from a bacterial plasmid, Used for delivery of nucleotide sequences to an organ, tissue, or group of cells. This A method well known to those skilled in the art is to construct a recombinant vector that expresses anti-NGCP. Can be used to For example, Maniatis et al. (Above) and Ausubel et al. (Above) )).   Full length cDNA sequences, and also polynucleotides containing regulatory elements thereof Allows researchers to control the sense of gene function (Youssoufian H and And HF Lodish 1993 Mol Cell Biol 13: 98-104) or antisense regulation (Eguc NGCP as a tool for investigation of hi et al. (1991) Annu Rev Biochem 60: 631-652) Can be used. Such techniques are now well-known in the art, Sense or antisense oligonucleotides or larger fragments Can be designed from various locations along the coding or control region. Wear.   An expression vector that highly expresses the desired NGCP coding fragment By transfecting the tissue, the function of the gene encoding NGCP can be changed. Can be stopped. Such a product would have a non-translatable sense or It can spill out of the cell with the chisense sequence. Without integration into DNA Even such vectors have all replicates digested by endogenous nucleases. Until the RNA molecule is transcribed. Such transient expression can be attributed to non-replicating vectors. (Mettler I, personal communication) for more than one month If the part is part of a vector system, it may last longer.   As described above, NGCP control regions, such as promoters, enhancers, or Design antisense molecules, DNA, RNA or PNA This can modify gene expression. Transcription initiation site, eg, leader arrangement Oligonucleotides derived between the +10 and -10 regions of the row are preferred. Also Antisense molecules prevent transcripts from binding to ribosomes. And is designed to prevent translation of mRNA. Similarly, suppression is "triple Can be achieved using the base-pairing method. A triple helix pair is a double helix Does not open sufficiently to bind polymerase, transcription factors, or regulatory molecules To do. Recent treatments using triple helix DNA are described by Gee JE et al. (HuberBE and B I Carr (1994)Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co, Mt Kisco NY).   Ribozymes are enzymatic RNA molecules that can catalyze the specific cleavage of RNA is there. The mechanism of ribozyme action involves the transfer of ribozyme molecules to complementary target RNA. Sequence-specific hybridization followed by endonuclease An endonucleolytic cleavage is made. Within the scope of the invention, NGCP Artificial synthesis that can specifically and effectively catalyze endonuclease cleavage Hammerhead ribozyme molecules are also included.   Initial identification of a specific ribozyme cleavage site in any potential RNA target Targets for ribozyme cleavage sites followed by sequences GUA, GUU and GUC This is done by scanning the child. Once identified, the target gene containing the cleavage site The short RNA sequence between 15-20 ribonucleotides corresponding to the offspring region is: Evaluated for features of secondary structure that stop the function of the oligonucleotide . Evaluation of the suitability of a candidate target is also validated using a ribonuclease protection assay. Testing accessibility to hybridization with complementary oligonucleotides It is performed by   The antisense molecules and ribozymes of the present invention are used to synthesize RNA molecules. It can be prepared by a method well known in the art. These technologies include solid-state hosts. Chemically synthesized oligonucleotides such as phosphoramidite chemical synthesis Includes technology. Alternatively, the RNA molecule is replaced with a DNA sequence encoding NGCP. It can be produced by in vivo and in vitro transcription of the sequence. Such DNA The sequence has a suitable RNA polymerase promoter such as T7 or SP6 Integrated into various types of vectors. Alternatively, structurally or inductively The anti-native cDNA construct that synthesizes RNA can be used for cell lines, cells or tissues. Introduced within.   RNA molecules can be modified to increase intracellular stability and increase half-life it can. Possible modifications include, but are not limited to, the 5 'and also 3' of the molecule. Add terminal flanking sequences or add phosphodiesters in the backbone of the molecule. Phosphorothioate or 2'O-medium Including using chill. This concept is unique to the production of PNA. Adenine and guar are not readily recognized by endogenous endonucleases. Acetyl-, methyl-, thio-, and nin-, cytidine, thymine, and uridine Inosine, queosine, and wibuto with similar modifications By including rarely used bases such as Wybutosine, Thus, it can be extended to all these molecules.   Methods for introducing vectors into cells or tissues include those discussed below. Methods, which are useful for in vivo, in vitro, and ex vivo treatments. Is also appropriate. In the case of ex vivo therapy, stem cells collected from the patient Those who have introduced the vector, grown as a clone for autologous transplantation, and returned to the same patient The method is described in U.S. Patent Nos. 5,399,493 and 5,437,994, which are incorporated herein by reference. Have been. Delivery by transfection, delivery by liposome Is well known in   In addition, the nucleotide sequence of NGCP disclosed herein is a new technology, However, it does not include features such as the triplet genetic code and specific base-pairing interactions. Any technology that depends on the characteristics of currently known nucleotide sequences, including It can also be used in molecular biology techniques that have not been issued. Detection and mapping of closely related polynucleotide sequences   NGCP nucleic acid sequences can be used to map naturally occurring genomic sequences. It can be used to generate a hybridization probe. This array is Use well-known techniques to map specific chromosomes or specific regions of those chromosomes. Can be pinged. Such techniques include chromosome spreading (chromosoma l spreads) in situ hybridization (Verma et al. (1988) Human  Chromosomes: A Manual of Basic Technique, Pergamon Press, New York) Raw-sorted (chromosome) preparation method or artificial yeast chromosome (Y ACs), bacterial artificial chromosomes (BACs), bacterial P1 constructs or Price CM ( 1993; Blood Rev 7: 127-34) and Trask BJ (1991; Trends Ganet 7: 149-54). Includes artificial chromosome structures such as the monosomic cDNA library shown You.   The technology of fluorescence in situ hybridization for chromosome spreads is described in “Ver. ma et al. (1988)Human Chromosomes: A Manual of Basic Technioue, Pergamon Press , New York ”. Fluorescent in situ hybridization of chromosomal preparations And other chromosome mapping techniques have implications for additional genetic map data You. Examples of genetic map data can be found in the 1994 Genome Issue of Science (265: 1981f). Can be The location of the NGCP on the physical chromosome map and the specific failure (and Is a predisposition to a particular disease), and the DNA associated with a genetic disease Can be limited. The nucleotide sequence of the present invention, a healthy person, Can be used to detect differences in gene sequence from carrier or patient .   In situ hybridization of chromosome preparations and defined chromosome markers Physical mapping techniques, such as linkage analysis, can be used to extend genetic maps. It is very important. Of the STS-based map of the human genome A recent example is the Whitehead-MIT Center for genomic Research (Hudson TJ et al. (1995) S cience 270: 1945-1954). Often a specific human stain Chromosomes from another mammalian species, such as a mouse, even if the number or arms of the body are unknown From the arrangement of the genes above, the relevant markers can be revealed. The new array Can be assigned by physical mapping to chromosome arms, or parts thereof. Wear. This uses disease cloning or other gene discovery techniques to identify disease genes. Provide valuable information to investigators. Once ataxia telangiectasia (A A disease or syndrome, such as T), is associated with a specific genomic region, for example, AT-11q22-23 ( Coarsely localized by genetic linkage to Gatti et al. (1988) Nature 336: 577-580) If any sequence maps to that region, the relevant sequence for further study It can represent a gene, or a regulatory gene. The nucleotide sequence of the present invention comprises Differences in chromosomal location between normal subjects and carriers or patients due to translocation, inversion, etc. It can also be used to detect. Pharmaceutical composition   The invention relates to nucleotides, proteins, antibodies, antagonists or inhibitors. Bitter alone or with at least one other agent, such as a stabilizing compound; Pharmaceutical compositions that also include within its scope. This pharmaceutical composition may be any It is administered in sterile, biocompatible pharmaceutical carriers, but such carriers include, but are not limited to But not saline, buffered saline, glucose or water. these The molecule can be administered to the patient alone or in combination with other drugs or hormones, Alternatively, it may be administered in another pharmaceutical composition that is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. obtain. In one embodiment of the invention, the pharmaceutically acceptable carrier is a pharmaceutically inert Sexual things.Administration of pharmaceutical compositions   The pharmaceutical composition is administered orally or parenterally. Parenteral administration methods include: Local, intraarterial (direct to tumor), intramuscular, subcutaneous, intramedullary Including intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal or intranasal administration I will. In addition to the active ingredient, these pharmaceutical compositions contain pharmaceutically usable formulations Suitable pharmaceuticals, including excipients and adjuvants that facilitate the processing of the active compound into the product. May be included. For more information on dispensing or dosing techniques, see “Reming ton's Pharmaceutical Sciences ”(Mack Publishing Co, Easton PA) Can be found in   Pharmaceutical compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable carriers well known in the art. It is formulated into appropriate dosage forms using the body. With such a carrier, the pharmaceutical composition can be cured. Tablets, pills, capsules, and liquids for oral and nasal ingestion by the patient being treated Formulated as a body, gel, syrup, slurry, suspension or similar It is.   Pharmaceutical preparations for oral administration combine the active compound with solid excipients However, if necessary, a suitable auxiliary may be added if necessary. After that, the resulting mixture is pulverized, the mixture of granules is processed, and tablets or sugar-coated You can get a nucleus. Suitable excipients are lactose, sucrose, mannitol Carbohydrates or protein fillers, such as sugar containing sugar or sorbitol, corn Starch, methylcellulose, hydroxy from scale, wheat, rice, potatoes, etc. Cypropylmethylcellulose or sodium carboxymethylcellulose Cellulose, gum such as gum arabic or tragacanth, and zera Proteins such as chin or collagen. If necessary, cross-link Such as vinyl pyrrolidone, agar, sodium alginate Disintegrants or salts such as luginic acid or a salt thereof such as sodium alginate; A solubilizer is added.   Dragee cores are provided with suitable tablets, such as a concentrated sugar solution, Agam, talc, polyvinylpyrrolidone, carbopol gel, polyethylene glycol Coal and also titanium dioxide, lacquer solutions and suitable organic solvents or solvent mixtures Compounds can include. For the identification of the tablets, i.e. the amount of active compound, i.e. the dosage Dyestuffs or pigments may be added to the tablets or dragees to characterize the drug.   Preparations that can be administered orally include push-fit capsules made of gelatin and Zera Soft, sealed capsules of chin and glycerol or sorby Includes tablet skin like tall. Push-fit capsules are available in lactose or Fillers or binders such as starch, talc or magnesium stearate Such lubricants, as well as, optionally, active formulation compositions mixed with stabilizers . In soft capsules, the active compound is treated with or without fat Dissolved or in a suitable liquid such as oil, liquid paraffin, liquid polyethylene glycol Or suspended.   Dosage forms for parenteral administration include aqueous solutions of the active compounds in water-soluble form. For injection An aqueous solution, preferably a Hank's solution, a Ringer's solution, or a physiological solution It can be formulated in a physiologically compatible buffer such as buffered saline. Aqueous injection suspensions include sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol Alternatively, they may contain substances that increase the viscosity of the suspension, such as dextran. Furthermore, the activity Suspensions of the components are prepared as appropriate oily injection suspensions. Suitable lipophilic solvent Alternatively, the vehicle may be a fatty oil such as sesame oil, ethyl oleate, or triglyceride. Alternatively, it contains a synthetic fatty acid ester such as a liposome. Suspensions may be used if desired. To increase the solubility and allow the preparation of highly concentrated solutions. Any suitable stabilizer or agent may be included.   For topical or nasal administration, appropriate penetration for the particular barrier to be permeated The preparation is carried out using an agent. Such penetrants are generally known.Manufacturing and storage   The pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared by any known method, for example, by conventional mixing, dissolving, or granulating. Processing, sugar coating formation processing, grinding processing, emulsification processing, entrapping processing or freezing Manufactured by freeze drying.   The pharmaceutical composition may be provided as salts, including but not limited to hydrochloric acid With many acids, including sulfuric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, malic acid, succinic acid, etc. Can be formed. Salts can be prepared in the corresponding free base form, aqueous or protonic. In solvent solvents, the solubility tends to be higher. In other cases, a suitable product Agents are 1 mM to 50 mM histidine, 0.1% to 2% sucrose, buffered before use 2% to 7% mannitol in the pH range 4.5 to 5.5 combined with the agent Lyophilized powder.   Compositions comprising a compound of the present invention formulated in a pharmaceutically acceptable carrier are prepared Once manufactured, it is placed in an appropriate container for further treatment of the indicated disease state. Labeled. For the administration of NGCP, such a label may include the dosage , Frequency and method are displayed.Therapeutically effective dosage   Pharmaceutical compositions suitable for use in the present invention provide an active ingredient for a desired purpose. A composition comprising an effective amount to achieve Determining effective dosages is an art It can be done within the ability of the person.   For any given compound, a therapeutically effective dose will initially be Vesicles or cells of any animal model, usually mice, rabbits, dogs, pigs Estimated from medium assay. Then, using such information, To determine effective doses and routes of administration.   A therapeutically effective dose refers to a protein that ameliorates a disease state, its antibodies, The amount of a agonist or inhibitor. Toxicity and treatment of such compounds Efficacy can be assessed, for example, by LD50 (lethal dose of 50% of the population) and ED50 ( To determine a therapeutically effective dose in 50% of the groups, a 50% effective amount). It can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell culture media or laboratory animals. Wear. The dose ratio between toxic and therapeutic effects is the therapeutic index and the LD50 / ED5 It can be expressed as a ratio of 0. Pharmaceutical compositions that exhibit large therapeutic indices are preferred . Data from these cell culture assays and additional animal studies are Can be used in formulating a range of dosage for use in medicine. like that The dose of the compound is circulating to achieve an ED50 with little or no toxicity. Desirably within the range of degrees. The dosage depends on the dosage form used, And will vary within this range depending on the route of administration.   The exact dose will be chosen by the individual physician, taking into account the patient to be treated. Dosage and administration provide sufficient levels of the active moiety and maintain the desired effect. Adjusted for. Additional factors to consider are the severity of the disease state, or Age, weight and gender of the individual, diet, time and frequency of administration, concomitant medications, feeling of reaction Includes receptivity, as well as tolerance / response to treatment. 3-4 long-acting chemical compositions Daily, weekly, or depending on half-life and clearance rate of a particular formulation It may be administered once every two weeks.   Normal doses are in the range of 0.1-100,000 μg, with total doses up to Approximately 1 g, depending on the route of administration. A specific dose or Guidance on how to supply can be found in the literature. US special See Nos. 4,657,760, 5,206,344 or 5,225,212. Skilled person Is a different agent for nucleotides than for protein or inhibitor Will adopt the shape. Similarly, delivery of a polynucleotide or polypeptide , Specific cells, states, locations, etc.   For example, a treatment for inducing granulocytes to cause cancer in order to destroy cancer cells or tissues NGCP can be used as a molecule for use.   Hereinafter, examples of the present invention will be described. However, the following examples are merely examples, It is not intended that the invention be limited to this embodiment.                               Industrial applications 1 Construction of cDNA library   The PANCNOT05 cDNA library was generated from human pancreatic tissue. No donor He was a 2-year-old Hispanic boy who died of oxygen. Frozen tissue, Brinkman n Use Homogenizer Polytron PT-3000 (Brinkmann Instruments, Westbury NJ) And homogenized, and dissolved in a guanidium isothiocyanate solution. This la Use a Beckman L8-70M Ultracentrifuge (Beckman Instruments) for Beckm Ambient temperature through a 5.7M cesium chloride cushion using an SW28 rotor And centrifuged at 25,000 rpm for 18 hours. RNA at pH 4.0 Extract with acidic phenol, 0.3 M sodium acetate and 2.5 times the volume of ethanol And resuspend in RNase-free water at 37 ° C. for 15 minutes. Nase treated. Repeat RNA extraction with pH 4.0 acidic phenol, Similarly, precipitation was performed using sodium acetate and ethanol. Then, use the Qiagen Oligotex kit (QIAG RNA was isolated using EN Inc., Chatsworth CA) and this was used as a cDNA library. Used for the production of   This mRNA is obtained from the SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid. Incorporated into mid Cloning (Cat. # 18248-013; G1bco / BRL) and its recommended protocol Handled according to The cDNA was prepared on a Sepharose CL4B column (Cat. # 275105-01; Ph armacia), and those cDNAs exceeding 400 bp were pSport Ligated to I. This plasmid, pSport I, is then transformed into DH5a ™ competent cells. # 18258-012; Gibco / BRL for transformation. 2. Isolation and sequencing of cDNA clones   Plasmid DNA is released from the cells and the REAL Prep 96 Plasmid Kit for Rapid  Extraction Alkaline Lysis Plasmid Minipreps (Catalogue # 26173; QIAGEN, In Purified using c). This kit uses a multichannel reagent dispenser Thus, simultaneous purification of 96 samples can be performed in a 96-well block. . The recommended protocol was used, except for the following changes. (1) Culture of bacteria is 25 Sterile Terrific Bro with mg / L carbenicin and 0.4% glycerol th (Catalogue # 22711, LIFE TECHNOLOGIES ™). (2) After inoculation, incubate the medium for 19 hours, and at the end of the incubation Next, the cells were lysed in 0.3 ml of lysis buffer. (3) Isopropanol precipitation Thereafter, the plasmid DNA pellet was resuspended in 0.1 ml of distilled water. Proto After completion of the final step of the col, the samples are stored in 96-well blocks for storage at 4 ° C. Transferred.   For sequencing of cDNA, Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno NV) was tier Thermal Cyclers (PTC200 from MJ Research, Watertown MA) and Applied Bi osystems 377 or 373 DNA Sequencing Systems (Perkin Elmer) Read and perform according to the method of Sanger F and AR Coulson (1975: J Mol Biol 94: 441f). Decide the frame Specified. 3. Homology search of cDNA clones and their putative proteins   A search algorithm developed by Applied Biosystems is used for INHERIT ™ 670  By incorporating and using the Sequence Analysis System, the sequence of each cDNA can be Compared to the sequence. This algorithm uses the Pattern Specification Language (TR The homologous region was determined using W company, LosAngeles CA). How to compare arrays The three parameters that determine whether to do this are window size and window offset. And error tolerance. Using the set of these three parameters, Search the DNA database for a sequence containing a region homologous to the Were scored with initial values. This allows these homologous regions Were assayed using dot matrix homology blotting and homologous regions Matched and distinguished. The results of the homology search were determined using Smith-Waterman alignment. displayed.   Peptide and protein sequence homology was determined by the INHERIT ™ 670 sequence analysis system. Was used in the same manner as used in the homology search of DNA sequences. Pattern Spec protein language using the ification language and parameter window Search for sequences containing the homology region, and score the results with initial values. Was beaten. Tested using dot matrix homology blot method and found significant homology A distinction was made between sexual regions and coincidence.   BLAST uses the Basic Local Alignment Search Tool (AltschulSF (1993) JMol Evol3 6: 290-300; Altschul, SF et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10). To search for local sequence alignments. BLAST is nucleotide and amino Generate both alignments of the acid sequence to determine sequence similarity. Its alignment BLAST is strict because of the locality of This is particularly effective when finding a perfect match, that is, a homolog. BLAST does not include gaps Useful for seeking a match. The basic unit of BLAST algorithm output is High-sc oring Segment Pair (HSP).   HSP consists of two sequence fragments, both fragments being optional, If the alignment is of equal length with local maximum, Sentence score satisfies the threshold set by the user, that is, the cutoff score That is, it exceeds the cutoff score. BLAST approach uses query sequence Finds the HSP between the database sequence and any matches found Is evaluated, and matches that meet the significance threshold set by the user are evaluated. Report only. Parameter E is to signal a database sequence match Is a parameter for determining a statistically significant threshold value of. E is for all database search The upper boundary of the expected frequency of occurrence of HSP (or set of HSPs) in the context Is interpreted as Any database sequence whose match satisfies E Reported in the system output. 4 Analysis by Northern Method   Northern analysis is based on labeled nucleotide sequences and specific cell types or tissues. Gene transcription with hybridization to incoming RNA-bound membrane An experimental technique used to detect the presence of an object (Sambrook et al., Supra).   Similar computer technology using BLAST (Altschul SF 1993 and 1990, supra) GenBank or LIFESEQ ™ database (Incyte, Palo Alto CA) Identical or closely related molecules were searched in such databases. This analysis is It can be performed in a much shorter time than several membrane hybridizations. Furthermore, Change the sensitivity of computer searches to determine if a match is an exact or homologous match Can determine the classification of it can.   The reference value of the search is the product score, which is defined by the following formula It is.   (Sequence match (%) x maximum BLAST score (%)) / 100 This product score is a measure of the degree of similarity between the two sequences and the matching of the sequence lengths Both are considered. For example, if the product score is 40, the match is an error Is accurate in the range of 1 to 2%, and when the score is 70, they match exactly. phase For the same molecule, usually select a product score of 15 to 40. , But those with low scores are identified as closely related molecules . 5 Extension of NGCP to full length or to restore regulatory elements   The nucleic acid sequence of full length NGCP (SEQ ID NO: 2) completes the partial nucleotide sequence. Orientation to extend to full length or obtain 5 'sequence from genomic library It can be used to design oligonucleotide primers. One ply The primer is synthesized to initiate the extension of the antisense direction (XLR) and the other Primers are synthesized to extend the sequence in the sense direction (XLF). these Primers extend the well-known NGCP sequence "outward" and extend the control region of interest. Amplicons containing new unknown nucleotide sequences can now be generated ( See US patent application Ser. No. 08 / 487,112, filed Jun. 7, 1995, incorporated herein by reference. I want to.) The initial primer is Oligo® 4.06 (National Bioscience) company, Plymouth MN) or other suitable program, and Has a GC content of 50% or more in nucleotides and is labeled at a temperature of about 68-72 ° C. Can be designed to anneal to the target sequence. As a result, the hairpin structure and Primer-extension of any nucleotide stretch that results in primer-dimerization The length is avoided.   Using the original selected cDNA library or human genomic library, Extend the array. The latter library is most useful for obtaining 5 'upstream sequences . If necessary, additional primer sets are designed to extend the known region further. You.   Follow the instructions for the XL-PCR kit (Perkin Elmer) with the enzyme and reaction mixture. , A high fidelity amplification is obtained. 40 pmol of each plastic Starting amplification with the immer and all other components of the kit at the recommended concentrations , PCR using Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown MA) And with the following parameters: Step 1 1 minute at 94 ° C (initial denaturation) Step 2 at 65 ° C for 1 minute Step 3 at 68 ° C for 6 minutes Step 4 at 94 ° C for 15 seconds Step 5 1 minute at 65 ° C Step 6 at 68 ° C for 7 minutes Step 7 Repeat steps 4 to 6 for another 15 cycles Step 8 15 seconds at 94 ° C Step 9 1 minute at 65 ° C Step 10 7 minutes 15 seconds at 68 ° C Step 11 Repeat steps 8 to 12 for 12 cycles Step 12 8 minutes at 72 ° C Step 134 4 ° C. (Keep the temperature)   Aliquot 5-10 μl of the reaction mixture to low concentration (about 0.6-0.8%) Analyze by electrophoresis on a galose minigel and find that the reactants extend the sequence. Determine if successful. The largest product or Bands were selected and cut from the gel. For further purification, use QIAQuick (registered trademark) A commercially available gel extraction method such as (marker) (QIAGEN) is used. After DNA recovery, Klenow The single-stranded nucleotide extension is cut off using an enzyme, recombined and cloned. A blunt end was created to facilitate logging.   After ethanol precipitation, the product was redissolved in 13 μl of ligation buffer, 1 μl T4-DNA ligase (15 units) and 1 μl T4 polynucleotide Kinase is added and the mixture is incubated at room temperature for 2-3 hours or at 16 ° C overnight. Incubate. Competent E. coli cells (40 μl in a suitable solvent) ) Was transformed with 3 μl of the ligation mixture and 80 μl of SOC medium (Sembrook J et al., Supra). After 1 hour incubation at 37 ° C , All transformation mixtures on Luria Bertani (LB) agar containing 2xCarb Put on. At a later date, several colonies are randomly selected from each plate and 1 placed in each well of a commercially available sterile 96-well microtiter plate Incubate in 50 μl of liquid LB / 2 × Carb medium. At a later date, 5 μl of each o -Barnite cultures were transferred into non-sterile 96-well plates and diluted 1:10 with water Later, each 5 μl sample is transferred into a PCR array.   For PCR amplification, 18 μl of the concentrate containing 4 units of rTth DNA polymerase PCR reaction mixture (3.3x), vector primers, and extension reaction One or both of the resulting gene-specific primers are added to each well. Amplification is Perform according to the following conditions. Step 1 94 ° C for 60 seconds Step 2 at 94 ° C for 20 seconds Step 3 55 ° C for 30 seconds Step 4 at 72 ° C for 90 seconds Step 5 Repeat steps 2 to 4 for another 29 cycles Step 6 180 seconds at 72 ° C Step 7 4 ° C (keep as it is)   Aliquots of PCR reactions are run on agarose gels with molecular weight markers Let it. Compare the size of the PCR product with the original partial cDNA and The sequence is selected, ligated to the plasmid and sequenced. 6 Labeling and use of hybridization probes   The hybridization probe based on the sequence of SEQ ID NO: 2 is cDNA, Used for screening mRNA as well as genomic DNA. About 20 Special mention is made of the labeling of oligonucleotides consisting of base pairs. The same procedure is generally used for fragments. Oligonucleotide to 50p mol of each oligomer and 250 mCi of [γ-32P] Adenosine triphosphate (Amers ham, Chicago IL) and T4 polynucleotide kinase (DuPont NEN ™), Boston MA). Labeled oligonucleotide Is purified using a Sephadex G-25 ultra-fine resin column (Pharmacia). Each 10 per minute7Each part including the count was replaced with the following endonucleases (AseI, Bgl II , EcoRI, Pst I, Xba1 or PvuII; DuPont NEN ™) Used in a typical membrane hybridization analysis of human genomic DNA.   Each of the cut DNAs was fractionated on a 0.7% agarose gel, and was subjected to nylon membrane ( Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH). Hybridization Is carried out at 40 ° C. for 16 hours. Blot to remove non-specific signals Is 0.1% sodium citrate saline and 0.5% sodium dodecyl sulfate. , And sequentially washed at room temperature under conditions of increasing stringency. XOMAT AR (registered merchant Mark) film (Kodak, Rochester NY) for several hours using a Phosphoimager cassette (Molecular Dynamics After exposure to blots in Sunnyvale CA). The turns are compared visually. 7 Antisense molecules   The NGCP-encoding sequence or any portion thereof may be a naturally occurring sequence in vivo. Used to suppress o or in vitro expression. Anti-comprising about 20 base pairs Special mention is made of the use of sense oligonucleotides, but with larger cDNA fragments. The same procedure can be used in the case of a cement. FIG. 1A and FIG. 1B Using complementary oligonucleotides based on the coding sequence of NGCP as shown in Thus, the expression of spontaneous NGCP can be suppressed. This complementary oligonucleotide Leotide was designed from the most unique 5 'sequence shown in FIGS. 1A and 1B, To inhibit transcription by inhibiting promoter binding, Suppresses NGCP transcript translation by inhibiting the binding of somes to transcripts it can. Using the leader sequence of SEQ ID NO: 2 and the appropriate portion of the 5 'sequence More effective antisense oligonucleotides are shown in FIGS. 1A and 1B. Signal sequence of the polypeptide or the early code Contains 15 to 20 nucleotides over the entire region translated into the Swell. 8 Expression of NGCP   NGCP expression is achieved by subcloning the cDNA into an appropriate vector and This is accomplished by transfecting the vector into a host cell. Clonin The pBluescript vector for ligation was transferred from the E. coli strain XL1-BlueMRF ™ (Stratagen Used to express NGCP in e). Upstream of the cloning site, β- There is a promoter for galactosidase, followed by an amino-terminal methyl group. Onin and β- There are 7 residues of galactosidase. These eight residues that immediately follow A useful bacteriophage promoter that contains many unique cleavage sites. It is a car.   Deriving the isolated IPTG transfected strain using standard methods By the first 7 residues of β-galactosidase, a linker of about 5 to 15 residues, and And a fusion protein consisting of full-length NGCP. This signal sequence is Of NGCP to the bacterial medium that can be used directly in the assay of activity performed by Induces secretion. 9 NGCP activity   The chemotactic activity of NGCP was determined according to the method of Nelson et al. (1975: J Immunol 115: 1650). Measurement using agarose. Mononuclear cells or granulocytes, recombinant NGCP Serial dilutions of the medium in which the expressing cells have grown or the control medium. 37 ° C After incubation for 2 hours, cells are fixed and stained. For various cell types Comparison of transfer to test and spontaneous transfer to control sample I do.   The specificity of the chemoattractant can be determined by performing an agarose assay on a particular population of cells. To be determined. Blood cells obtained from venipuncture are collected by density gradient centrifugation. High concentration of neutrophils, peripheral blood mononuclear cells, granulocytes, monocytes, and lymphocytes The gangs are tested for chemotactic activity of NGCP. If desired, such high concentrations The cell population was CD4+And CD8+Each for negative selection of high concentration T cell population Re CD8+And CD4+Fractionation can be performed using a specific antibody. 10. Production of NGCP-specific antibodies   Immunization of rabbits and production of antibodies using standard protocols involves PAGE NGCP purified using the electrophoresis method (Sambrook, supra) is used. From NGCP Translated amino acid sequence into DNAStar software (DNASTAR) to determine the region with high immunogenicity, A gopeptide is synthesized by a method known to those skilled in the art, and the antibody is synthesized by a method known to those skilled in the art. Is used to produce Epi in the vicinity of the C-terminus or in the adjacent hydrophilic region Analytical methods for selecting appropriate epitopes, such as topps, are available from Ausubel FM and others ( 4) and 5).   Usually, oligopeptides having a length of about 15 residues are obtained from Applied Biosystems Synthesized by fmoc method chemistry using a peptide synthesizer Model 431A, M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS: Keyhole limpet hemocyanin (Ausubel FM, etc.) KLH, Sigma). Oligope in Complete Freund's Adjuvant Rabbits are immunized with the peptide-KLH complex. Antipeptide of the obtained antiserum To test activity, for example, bind the peptide to plastic and use 1% BSA Block, react with rabbit antiserum, wash, and add radioactive iodine To goat anti-rabbit IgG. 11 Purification of naturally occurring NGCP using specific antibodies   Spontaneous NGCP or recombinant NGCP raises specific antibodies against NGCP. It can be purified by the immunoaffinity chromatography used. I The MunoAffinity column is available on CnBr-activated Sepharose (Pharmacia Biotech). Such an activated chromatographic resin is covalently bonded to an NGCP antibody. Is configured. After binding, block and wash the resin according to the manufacturer's instructions. You.   Membrane fractions obtained from cells expressing NGCP are prepared by well known methods . Alternatively, a recombinant NGCP fragment containing the appropriate signal sequence is Secreted by the useful medium into the medium in which the infected cells grow Can be made.   The medium containing NGCP is passed through an immunoaffinity column, and the column is Under conditions that can preferentially absorb CP (e.g., high ion (With strength buffer). The column is run under conditions that will break the antibody / NGCP binding. (E.g., a buffer of pH 2-3 or a high concentration of urea or thiocyanate Eluting with a chaotropic ion such as on) and recovering NGCP.   All publications and patent specifications mentioned above are incorporated herein by reference. Book Various modifications and variations of the described method and system are within the scope and spirit of the invention. It will be apparent to those skilled in the art that they do not depart from the spirit. The present invention is a particularly suitable implementation. Although described in connection with the examples, the claims of the invention are intended to cover such specific implementations. It should be understood that the examples should not be unduly limited. In practice, the invention Various modifications of the described method for performing the same may be used in molecular biology or related art. As will be apparent to those skilled in the art, they are within the scope of the following claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＵＳ (72)発明者 マリー、リン・イー アメリカ合衆国カリフォルニア州94028・ ポルトラバレー・ロストランコスロード 1124──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 1/15 C12N 1/19 1/19 1/21 1/21 C12P 21/02 C5 / 10 C12Q 1 / 68 A C12P 21/02 C12N 5/00 A C12Q 1/68 A61K 37/02 // (C12P 21/02 C12R 1:19) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES , FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN , TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AT, AU , BR, CA, H, CN, DE, DK, ES, FI, GB, IL, JP, KR, MX, NO, NZ, RU, SE, SG, US (72) Inventor Marie, Lin E Portola Valley, California 94028, United States of America・ Los Trancos Road 1124

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．配列番号：１のアミノ酸、又はその断片を含む実質的に精製されたポリペプ チド。 ２．請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製されたポリヌクレオチド 配列。 ３．配列番号：２の核酸配列又はその変異体を含む単離されたポリヌクレオチド 配列。 ４．配列番号：２の配列に対して相補的な配列からなる単離されたポリヌクレオ チド配列。 ５．厳密な条件の下で、配列番号：２の配列とハイブリッド形成する単離された ポリヌクレオチド配列。 ６．配列番号：２の配列、又はその断片を含むハイブリダイゼーションプローブ 。 ７．請求項３のポリヌクレオチド配列を含む組換え体発現ベクター。 ８．請求項７の発現ベクターを含む組換え体宿主細胞。 ９．配列番号：１のポリペプチド又はその断片を生成する方法であって、 （ａ）該ポリペプチドの発現に適した条件の下で、請求項８の宿主細胞を培養 する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から該ポリペプチドを回収する過程とを含むことを 特徴とする配列番号：１のポリペプチド又はその断片の生成方法。 １０．配列番号：１のポリペプチドを、製薬学的に許容される賦形剤と共に含む 医薬品組成物。 １１．癌の治療に十分な量の請求項１０の医薬品組成物を患者に投与する過程を 含む癌の治療方法。 １２．請求項１のポリペプチドに特異的に結合する精製された抗体。[Claims] 1. A substantially purified polypeptide comprising the amino acid of SEQ ID NO: 1, or a fragment thereof Chid. 2. An isolated and purified polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1. Array. 3. An isolated polynucleotide comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a variant thereof Array. 4. An isolated polynucleotide consisting of a sequence complementary to the sequence of SEQ ID NO: 2 Pseudo sequence. 5. Under stringent conditions, the isolated hybridizes to the sequence of SEQ ID NO: 2 Polynucleotide sequence. 6. Hybridization probe containing the sequence of SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof . 7. A recombinant expression vector comprising the polynucleotide sequence of claim 3. 8. A recombinant host cell comprising the expression vector of claim 7. 9. A method for producing a polypeptide of SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof,   (A) culturing the host cell of claim 8 under conditions suitable for expression of the polypeptide; The process of   (B) recovering the polypeptide from the culture medium of the host cell. A method for producing a characteristic polypeptide of SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof. 10. Comprising the polypeptide of SEQ ID NO: 1 together with a pharmaceutically acceptable excipient Pharmaceutical composition. 11. Administering to the patient an amount of the pharmaceutical composition of claim 10 sufficient to treat cancer. Methods for treating cancer, including: 12. A purified antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 1.
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