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JP2001316298A - タンパク質中空ナノ粒子とそれを用いた物質運搬体、ならびに細胞への物質導入方法 - Google Patents

タンパク質中空ナノ粒子とそれを用いた物質運搬体、ならびに細胞への物質導入方法

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JP2001316298A
JP2001316298A JP2001031308A JP2001031308A JP2001316298A JP 2001316298 A JP2001316298 A JP 2001316298A JP 2001031308 A JP2001031308 A JP 2001031308A JP 2001031308 A JP2001031308 A JP 2001031308A JP 2001316298 A JP2001316298 A JP 2001316298A
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JP
Japan
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substance
cell
hbsag
protein
cells
Prior art date
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JP2001031308A
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Shunichi Kuroda
俊一 黒田
Katsuyuki Tanizawa
克行 谷澤
Shoji Senoo
昌治 妹尾
Akihiko Kondo
昭彦 近藤
Masakazu Ueda
政和 上田
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Japan Science and Technology Agency
Original Assignee
Japan Science and Technology Corp
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 目的とする細胞や組織に、物質（遺伝
子、タンパク質、化合物等）を特異的、かつ安全に運
搬、導入するための汎用的な方法を提供する。 【解決手段】 粒子形成能を有するタンパク質に生体認
識分子が導入されていることを特徴とする中空ナノ粒子
とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、粒子形成
能を有するタンパク質に生体認識分子が導入されている
中空ナノ粒子に関するものである。さらに詳しくは、こ
の出願の発明は、特定の細胞および組織に物質を導入す
るための運搬体として使用することができる中空ナノ粒
子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】近年、医学の分野において、
患部に直接作用し、高い効果を示す副作用の少ない薬品
の開発が盛んに行われている。とくに、ドラッグデリバ
リーシステム（ＤＤＳ）と呼ばれる方法は、目的細胞、
あるいは、目的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分
を運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのでき
る方法として注目されている。
【０００３】また、最近の分子細胞生物学の分野におい
ても特定細胞への遺伝子導入は必要不可欠な技術として
盛んに研究されている。さらに、ヒトゲノム計画の進展
により各種疾患の遺伝的な背景が明らかになりつつある
現在、このような細胞および組織に対する特異性の高い
遺伝子導入法が確立されれば遺伝子治療の分野での応用
も可能となる。
【０００４】細胞に遺伝子を導入する方法としては、こ
れまでに、遺伝子を巨大分子化してエンドサイトーシス
によって遺伝子を取込ませる方法（リン酸カルシウム
法、リポフェクタミン法）や、電気パルス刺激により、
細胞膜に穿孔を開け、遺伝子を流入させる方法（エレク
トロポレーション法、遺伝子銃法）が知られており、い
ずれも今日では分子生物学的実験において、一般的に実
施されている手法である。
【０００５】これらの方法は簡便であるが、細胞を直
接、物理的に傷つけ、遺伝子導入部位を外科的に露出さ
せる必要があるため、生体内部の細胞や組織には容易に
適用できない。また、１００％近い導入率を得ることは
難しい。
【０００６】一方、安全性の高い物質導入方法としては
リポソーム法が知られている。この方法は、細胞を傷つ
けることがないため、生体内部の細胞や組織にも適用す
ることが可能である。しかし、単純な脂質であるリポソ
ームに高度な細胞および組織特異性を付与することは困
難であり、さらに、in vivoでの遺伝子導入率は、要求
される値に比べてはるかに低いという問題がある。
【０００７】最近になって、ウィルスＤＮＡに目的の遺
伝子を組み込み、感染性ウィルスを生成して遺伝子導入
を行う技術が開発された。この方法は導入部位を露出す
る必要がなく、個体にも応用でき、導入効率も１００％
近い画期的な方法として注目されるが、ウィルスが広範
囲の細胞に非特異的に感染するため目的の細胞以外にも
遺伝子が導入されてしまうという重大な問題がある。ま
た、ウィルスゲノム本体が染色体に組み込まれ、将来予
期できぬ副作用を引き起こす可能性があるため、実際に
は疾病の初期治療等には用いられず、末期症状の患者に
適用されるに留まっているのが現状である。
【０００８】そこで、この出願の発明は、以上のとおり
の事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点
を解消し、目的とする細胞や組織に、物質（遺伝子、タ
ンパク質、化合物等）を特異的、かつ安全に運搬、導入
するための汎用的な方法を提供することを課題としてい
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記
の課題を解決するものとして、まず第１には、粒子形成
能を有するタンパク質に生体認識分子が導入されている
ことを特徴とする中空ナノ粒子を提供する。
【００１０】第２には、この出願の発明は、真核細胞で
タンパク質を発現させて得られるタンパク質粒子に生体
認識分子が導入されていることを特徴とする中空ナノ粒
子を提供する。
【００１１】第３には、この出願の発明は、真核細胞が
酵母または遺伝子組換え酵母のいずれかから選択される
こと、および第４には、真核細胞が昆虫細胞であること
を前記第２の発明の中空ナノ粒子の態様として提供す
る。
【００１２】また、第５には、この出願の発明は、粒子
を形成するタンパク質がＢ型肝炎ウィルス表面抗原タン
パク質である前記のいずれかの中空ナノ粒子を提供す
る。さらに、この出願の発明は、第６には、該Ｂ型肝炎
ウィルス表面抗原タンパク質が抗原性を減少させたＢ型
肝炎ウィルス表面抗原タンパク質である前記の中空ナノ
粒子を提供する。
【００１３】この出願の発明は、また、第７には、生体
認識分子が細胞機能調節分子であること、第８には、生
体認識分子が抗原であること、第９には、生体認識分子
が抗体であること、第１０には、生体認識分子が糖鎖で
あることを前記のいずれかの中空ナノ粒子の態様として
提供する。
【００１４】第１１に、この出願の発明は、さらに、前
記のいずれかの中空ナノ粒子に細胞導入物質が内包され
ていることを特徴とする物質運搬体をも提供する。
【００１５】また、この出願の発明は、第１１の発明の
物質運搬体において、第１２には、細胞導入物質が遺伝
子であること、第１３には、細胞導入物質がタンパク質
であること、第１４には、細胞導入物質が細胞内で細胞
傷害性を示すＲＮａｓｅであること、第１５には、細胞
導入物質が化合物であることを態様として提供する。
【００１６】さらに、この出願の発明は、前記第１１な
いし第１５の発明のいずれかの物質運搬体の製造方法と
して、第１６には、前記第１ないし第１０のいずれかの
中空ナノ粒子に、エレクトロポレーション法により細胞
導入物質を内包させること、第１７には、超音波法によ
り細胞導入物質を内包させること、第１８には、単純拡
散法により細胞導入物質を内包させること、第１９に
は、電荷を有する脂質を用いて細胞導入物質を内包させ
ることを提供する。
【００１７】そして、第２０には、この出願の発明は、
前記第１から第１０の発明のいずれかの中空ナノ粒子を
用いることを特徴とする細胞または組織への物質導入方
法を、第２１には、前記第１１から第１５のいずれかの
物質運搬体を用いることを特徴とする細胞または組織へ
の物質導入方法を提供する。
【００１８】そしてさらに、第２２には、この出願の発
明は、少なくとも前記のいずれかの物質導入方法を用い
て、特定細胞または組織へ物質を運搬する操作を含む疾
患の治療方法をも提供する。
【００１９】
【発明の実施の形態】この出願の発明の中空ナノ粒子
は、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子を導
入することによって、目的細胞あるいは目的組織に特異
的に物質を運搬することを可能とするものである。この
ような粒子形成能を有するタンパク質としては、種々の
ウィルスから得られるサブウィルス粒子を適用すること
ができる。具体的には、Ｂ型肝炎ウィルス（Hepatitis
B Virus:ＨＢＶ）表面抗原タンパク質等が例示される。
【００２０】また、このような粒子形成能を有するタン
パク質からなるタンパク質粒子としては、真核細胞でタ
ンパク質を発現させることにより得られるものが挙げら
れる。つまり、真核細胞で粒子形成能を有するタンパク
質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タ
ンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出される
のである。このとき、真核細胞としては、酵母や遺伝子
組換え酵母、昆虫細胞等が適用できる。
【００２１】発明者らは、後述の実施例に示すとおり、
遺伝子組換え酵母で前記ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質を
発現させることにより、発現されたＨＢＶ表面抗原Ｌタ
ンパク質から酵母由来の脂質二重膜に多数の同タンパク
質が埋め込まれた短径約２０ｎｍ、長径約１５０ｎｍの
楕円状中空粒子が形成されることを見出し、報告してい
る（J. Bio. Chem., Vol.267, No.3, 1953-1961, 199
2）。このような粒子は、ＨＢＶゲノムやＨＢＶタンパ
ク質を全く含まないので、ウィルスとしては機能せず、
人体への安全性が極めて高い。また、ＨＢＶの肝細胞へ
の極めて高い感染力を担う肝細胞特異的レセプターを粒
子表面に提示しているため、肝細胞に対して特異的に物
質を運搬する運搬体としての効果も高いのである。
【００２２】このように遺伝子組換え酵母を用いてタン
パク質粒子を形成する方法は、菌体内の可溶性タンパク
質から高効率で粒子が生産される点で好適である。
【００２３】一方、昆虫細胞は、酵母よりも高等動物に
近い真核細胞であるといえ、酵母では再現しきれない糖
鎖等の高次構造をも再現できる点で異種タンパク質の大
量生産において好ましい方法といえる。従来の昆虫細胞
の系はバキュロウイルスを用いた系で、ウイルス発現を
伴うものであったために、タンパク質発現に際して細胞
が死滅したり溶解したりした。その結果、タンパク質発
現を連続的に行ったり、死滅細胞から遊離したプロテア
ーゼによりタンパク質が分解したりするという問題があ
った。また、タンパク質を分泌発現させる場合には、培
地中に含まれる大量の牛胎仔血清が混入することで、折
角培地中に分泌されても精製が困難であった。しかし、
最近になって、バキュロウイルスを介さない昆虫細胞系
で、無血清培養可能なものがInvitrogen社により開発さ
れ、市販されている。したがって、このような昆虫細胞
を用いれば、精製が容易で高次構造をも再現されたタン
パク質粒子が得られる。
【００２４】この出願の発明のタンパク質中空ナノ粒子
では、以上のような種々の方法によって得られた粒子表
面のレセプターを任意の生体認識分子に改変したり、種
々の物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ぺプチド、お
よび薬剤等）を粒子内に導入することにより、肝細胞以
外にも、任意の細胞及び組織に極めて高い特異性で物質
を運搬、導入することが可能となる。
【００２５】もちろん、粒子形性能を有するタンパク質
は、前記のＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質に限ら
れるものではなく、粒子を形成することができるタンパ
ク質であれば、どのようなものでもよく、動物細胞、植
物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質
や、種々の合成タンパク質等が考慮される。また、例え
ばウィルス由来の抗原タンパク質等が生体内において抗
体を惹起する可能性がある場合などは、改変して抗原性
を減少させたものを生体認識分子として用いてもよい。
【００２６】粒子形成能を有するタンパク質に導入され
る生体認識分子としては、たとえば成長因子、サイトカ
イン等の細胞機能調節分子、細胞表面抗原、組織特異的
抗原、レセプターなどの細胞および組織を識別するため
の分子、ウィルスおよび微生物に由来する分子、抗体、
糖鎖、脂質などが好ましく用いられる。これらは、目的
とする細胞、あるいは組織に応じて適宜選択される。
【００２７】この出願の発明では、以上のとおりのタン
パク質中空ナノ粒子に、目的細胞または組織に導入した
い物質（細胞導入物質）を内包させることによって、細
胞特異性を有する物質運搬体が得られる。この物質運搬
体に内包される細胞導入物質とは、例えばＤＮＡ、ＲＮ
Ａなどの遺伝子、天然あるいは合成タンパク質、オリゴ
ヌクレオチド、ぺプチド、薬剤、天然あるいは合成化合
物など、どのようなものであってもよい。
【００２８】具体的には、既に発明者らにより報告され
たヒトＲＮａｓｅ１（Jinno H, Ueda M, Ozawa S, Iked
a T, Enomoto K, Psarras K, Kitajima M, Yamada H, S
enoM Life Sci. 1996;58(21):1901-8）またはＲＮａｓ
ｅ３（別名ＥＣＰ：eosinophil cationic protein ；Ma
llorqui-Fernandez G, Pous J, Peracaula R, AymamiJ,
Maeda T, Tada H, Yamada H, Seno M, de Llorens R,
Gomis-Ruth FX, CollM; J Mol Biol. 2000 Jul 28;300
(5):1297-307.）等が適用される。これらのタンパク質
は、細胞外で作用させても細胞傷害活性を示さないが、
細胞内に取り込まれると細胞傷害活性を示すことが分か
っている。そこで、これらのＲＮａｓｅを内包させた本
願発明の物質運搬体を用いれば、細胞や組織に選択的に
細胞傷害活性のあるタンパク質の強制発現を行うことが
でき、新しい癌治療方法として期待される。
【００２９】また、これらの細胞導入物質を上記の中空
ナノ粒子に導入する方法としては、通常の化学的、分子
生物学的実験手法で用いられる様々な方法が適用され
る。たとえば、エレクトロポレーション法、超音波法、
単純拡散法、あるいは電荷を有する脂質を用いる方法等
が好ましく例示される。
【００３０】そして、これらのタンパク質中空ナノ粒
子、あるいは物質運搬体を用いて、invivoあるいはin v
itroで細胞、または組織に特異的に物質を導入すること
が可能となる。さらには、前記のＲＮａｓｅを用いた例
のように、以上のとおりのタンパク質中空ナノ粒子や物
質運搬体を用いて、特定細胞または組織に物質を導入す
ることを各種疾患の治療法あるいは治療法の１ステップ
として行うことも可能になるのである。
【００３１】以下、添付した図面に沿って実施例を示
し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明す
る。もちろん、この発明は以下の例に限定されるもので
はなく、細部については様々な態様が可能であることは
言うまでもない。
【００３２】
【実施例】以下の実施例において、ＨＢｓＡｇとは、Ｂ
型肝炎ウィルス表面抗原（Hepatitis B virus surface
Antigen）を示す。ＨＢｓＡｇは、ＨＢＶの外被タンパ
ク質であり、図１の摸式図に示すように、ＨＢｓＡｇに
は、Ｓタンパク質、Ｍタンパク質、Ｌタンパク質の３種
類がある。このうち、Ｓタンパク質は、３種のタンパク
質に共通した、重要な外被タンパク質であり、Ｍタンパ
ク質は、Ｓタンパク質のＮ末端側に５５アミノ酸（pre-
S2 peptide）が付加したものである。また、Ｌタンパク
質は、Ｍタンパク質のＮ末端側に、１０８もしくは１１
９アミノ酸（pre-S1 peptide）が付加したものである。
【００３３】ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のPre-S領域（pr
e-S1, pre-S2）は、ＨＢＶが肝細胞に結合する際に、そ
れぞれ重要な役割を担うことが知られている。Pre-S1
は、肝細胞に直接結合する部位を持ち、pre-S2は、血中
の重合アルブミンを介して肝細胞に結合する重合アルブ
ミンレセプターを有するのである。
【００３４】真核細胞でＨＢｓＡｇを発現させると、同
タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、
蓄積される。ＨＢｓＡｇのＬタンパク質は、分子間で凝
集を起こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でル
ーメン側に粒子として放出される。
【００３５】以下の実施例では、ＨＢｓＡｇのＬタンパ
ク質を用いた。また、図２に以下の実施例に記載される
ＨＢｓＡｇ粒子の発現および精製操作の概略説明図を示
した。実施例Ａ 遺伝子組換え酵母によるＨＢｓＡｇ粒子の発
現 発明者らによって報告されたJ.Bio.Chem., Vol.267, N
o.3, 1953-1961, 1992記載の方法に基づいて、ｐＧＬＤ
ＬIIＰ３９−ＲｃＴを保持した遺伝子組換え酵母（Sacc
haromyces Cerevisiae AH22R-株）を、合成培地High-Pi
および8S5N-P400中で培養し、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質
粒子を発現させた。（図２ａ、ｂ）定常成長期（約７２
時間後）にある遺伝子組換え酵母から、Yeast Protein
Extraction Reagent（Pierce Chemical Co.製）を用い
て、whole cell extractを準備し、ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）を用いて分離して、銀染色によって試料中のＨＢ
ｓＡｇの同定を行なった。
【００３６】これより、ＨＢｓＡｇは分子量約５２ｋＤ
ａのタンパク質であることが明らかとなった。実施例Ｂ ＨＢｓＡｇ粒子の遺伝子組換え酵母からの精
製 （１）合成培地８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００で培養された遺伝子
組換え酵母（湿重量２６ｇ）をbuffer A溶液（７．５Ｍ
尿素、０．１Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５
ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１％ Ｔｗｅｅ
ｎ８０）１００ｍｌに懸濁し、グラスビーズを用いてビ
ードビーター（BEAD-BEATER）にて酵母を破砕した。破
砕後、上清を遠心分離により回収した。（図２ｃ、ｄ） （２）次に、上清を０．７５倍容の３３％（ｗ／ｗ）Ｐ
ＥＧ６０００と混合し、３０分間氷冷した。その後、遠
心分離（７０００ｒｐｍ、３０分間）を行い、ペレット
を回収した。同ペレットは、Ｔｗｅｅｎ８０を含まない
buffer A溶液中で再懸濁した。
【００３７】（３）再懸濁した液を、１０〜４０％の勾
配をかけたＣｓＣｌに重層し、２８０００ｒｐｍ、１６
時間の超遠心分離を行なった。遠心分離後の試料を１２
画分に分け、ウェスタンブロット法（Western Blottin
g）（１次抗体は、ａｎｔｉ−ＨＢｓＡｇモノクローナ
ル抗体）によりＨＢｓＡｇを含む画分を同定した。さら
に、ＨＢｓＡｇを含む画分をＴｗｅｅｎ８０を含まない
buffer A溶液で透析した。
【００３８】（４）（３）で得られた透析液（１２ｍ
ｌ）を５〜５０％の勾配をかけたショ糖に重層し、２８
０００ｒｐｍ、１６時間の超遠心分離を行なった。遠心
分離後、（３）と同様に、ＨＢｓＡｇを含む画分を同定
し、ＨＢｓＡｇを含む画分を尿素とＴｗｅｅｎ８０は含
まず、代わりに０．８５％のＮａＣｌを含むbuffer A溶
液で透析した。（（２）〜（４）：図２ｅ） （５）（４）と同様の操作を繰り返し、透析後の試料を
ウルトラフィルター（Ultra Filter） Ｑ２０００（ア
ドバンテック社製）を用いて濃縮し、使用する時まで４
℃にて冷蔵保存した。（図２ｆ）ＣｓＣｌ平衡遠心分離
後のウェスタンブロット（３）の結果から、ＨＢｓＡｇ
は、分子量５２ｋＤａでＳ抗原性を有するタンパク質で
あることが分かった。最終的に、培地２．５Ｌ由来、湿
重量２６ｇの菌体から、約２４ｍｇの精製ＨＢｓＡｇ粒
子を得た。
【００３９】一連の精製過程における画分を銀染色ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで解析した。また、精製により酵母由来の
プロテアーゼが除去されていることを確認するために、
（５）で得られたＨＢｓＡｇ粒子を３７℃で１２時間イ
ンキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色
により同定を行なった。
【００４０】その結果、酵母由来のプロテアーゼは、一
連の精製過程において完全に除去されていることが確認
された。実施例１ ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２におけるＨＢｓＡｇ
粒子による遺伝子導入 指数増殖期にあるヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２を１×１０5
cells/wellになるように、３．５ｃｍガラス底皿シャー
レに植菌し、３７℃、５％ＣＯ2存在下で１０％ウシ胎
児血清を含むD-MEMを用いて一晩培養した。翌日、ＨＢ
ｓＡｇ粒子と緑色蛍光タンパク質発現プラスミド（GFP
expression plasmid pTB701-hGFP）を混合し、エレクト
ロポレーションを行なった後、この試料をＨｅｐＧ２培
養液へ混合し、３７℃、５％ＣＯ2存在下で４日間培養
した。
【００４１】ＨｅｐＧ２内でのＧＦＰの発現の様子を共
焦点レーザー蛍光顕微鏡にて観察した。
【００４２】ＨｅｐＧ２を用いてＨＢｓＡｇ粒子の遺伝
子導入効率を評価した。間隔４ｍｍのキュベットを使用
して、１１０Ｖ、９５０μＦの条件でエレクトロポレー
ションを行なったＨＢｓＡｇ−プラスミドをＨｅｐＧ２
へ形質移入させ、３７℃、５％ＣＯ2存在下でＤ−ＭＥ
Ｍを用いて４日間培養した。
【００４３】ＨｅｐＧ２の共焦点レーザー写真を図３に
示した。図３（ａ）を図３（ｂ）、（ｃ）と比較する
と、図３（ａ）は図３（ｂ）の約２００倍の効率を示し
ており、ＨＢｓＡｇ粒子によるGFP expression plasmid
の導入効率は非常に高いものであることが分かった。実施例２ ＨｅｐＧ２以外のヒト肝癌細胞におけるＨＢ
ｓＡｇ粒子による遺伝子導入 実施例１に記載の方法に従って、ヒト肝癌由来細胞とし
てＨｕＨ−７（JCRB0403）およびＮＵＥ（防衛医科大学
校寄生虫学講座 多田隈卓史教授より分譲）を準備し
た。
【００４４】また、陰性対照として、ヒト大腸癌由来細
胞ＷｉＤｒ（ATCC CCL-218）、ＨＴ２９（ATCC HTB-3
8）、ＳＷ１１１６（ATCC CCL-233）、ヒト悪性黒色腫
由来細胞ＳＥＫＩ（JCRB0620）、ヒト扁平上皮癌由来細
胞Ａ４３１（JCRB9009）を、それぞれ３．５ｃｍガラス
底皿シャーレ上に培養し、ＧＦＰ発現プラスミド（pEGF
P-F（Clontech社））８ｎｇを含むＨＢｓＡｇ粒子を１
０5細胞に感染させ、４日間培養を継続した。その後、
各細胞内でのＧＦＰの発現の様子を共焦点レーザー蛍光
顕微鏡で観察した。
【００４５】その結果、ＨｕＨ−７及びＮＵＥ細胞で、
ＨｅｐＧ２細胞と同程度の蛍光が観察された（図４）。
【００４６】一方、ヒト肝臓由来でない細胞では、いず
れもＧＦＰの蛍光が観察されなかった。
【００４７】以上より、この発明のＨＢｓＡｇ粒子を用
いて、培養細胞レベルで、ヒト肝細胞に対して極めて高
い特異性と効率で遺伝子を導入できることが示された。実施例３ ヒト肝癌を移植したヌードマウスに対するＨ
ＢｓＡｇ粒子による遺伝子導入 胆癌マウスは、ヌードマウス（系統：BALB/c nu/nu、微
生物学的品質：ＳＰＦ、性別：オス５週齢）の両側背部
皮下に、実施例２で使用したヒト腫瘍株（ＨｕＨ−７及
びＷｉＤｒ）をそれぞれ１×１０7細胞皮下に注射し、
移植腫瘍が直径２ｃｍ程度の固形癌になるまで２〜６週
間生育させて得た。
【００４８】実施例２で記載した方法により得たＧＦＰ
発現プラスミド（pEGFP-F）２．５μｇを含むＨＢｓＡ
ｇ粒子１０μｇを、マウス腹腔内に２６Ｇ注射針を使用
して投与した。投与後４日目にマウスを屠殺し、腫瘍
部、肝臓、脾臓、腎臓、腸管を摘出し、ＧＦＰ用樹脂包
埋キット（Technovit7100）を用いて組織を固定・包埋
した。
【００４９】具体的には、固定は４％中和ホルムアルデ
ヒドに浸漬して行い、脱水は７０％ＥｔＯＨで室温２時
間、９６％ＥｔＯＨで室温２時間、１００％ＥｔＯＨで
室温１時間、予備浸漬は１００％ＥｔＯＨ／Technovit7
100等量混合液で室温２時間行った。その後、Technovit
7100で室温２４時間以内の浸漬を行い、取り出した後、
室温で１時間および３７℃で１時間静置して重合反応さ
せた。
【００５０】常法に従って、切片を作製し、同時にヘマ
トキシンエオリン染色（一般的な組織染色）を行って、
蛍光顕微鏡によりＨＢｓＡｇ粒子投与群と非投与群のＧ
ＦＰによる蛍光を比較した（図５）。
【００５１】図５より、ヒト肝癌由来ＨｕＨ−７細胞に
よる胆癌マウスの腫瘍部にＧＦＰに由来する蛍光を認め
た。しかし、同マウスより同時に摘出した肝臓、脾臓、
腎臓、腸管には蛍光を認めなかった。さらに、ヒト大腸
癌由来ＷｉＤｒ細胞による胆癌マウスの腫瘍、肝臓、脾
臓、腎臓、腸管及び、ＨＢｓＡｇ粒子非投与群にも蛍光
を認めなかった。
【００５２】以上より、ＨＢｓＡｇ粒子を用いることに
より、実験動物レベルでも、ヒト肝細胞に対して極めて
高い特異性と効率で遺伝子導入が可能であることが示さ
れた。したがって、この発明の物質運搬体は、極めて有
効であることが確認された。 実施例Ｃ 生体認識分子提示用汎用型ＨＢｓＡｇ粒子
（ＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子）の作製 ＨＢｓＡｇ粒子はヒト肝細胞特異的に感染することがで
きるが、その高い感染性を担う同粒子表面に提示されて
いる肝細胞認識部位は、pre-S1領域の３から７７アミノ
酸残基に含まれていることが判明している（Le Seyec
J, Chouteau P,Cannie I, Guguen-Guillouzo C, Gripon
P., J. Virol. 1999, Mar; 73(3): 2052-7）。
【００５３】ここでは、ＨＢｓＡｇ粒子の粒子形成能を
保ちながら、肝細胞に対する高い感染能を欠失し、かつ
任意の生体認識分子を粒子表面に提示することができる
改変ＨＢｓＡｇ粒子（以降ＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子と
呼称）の作製法を記す。
【００５４】実施例Ａに記載されたｐＧＬＤＬIIＰ３９
−ＲｃＴプラスミドのヒト肝細胞認識部位をコードする
遺伝子領域を欠失させ、同時に制限酵素NotIサイト（gc
ggccgc）を挿入するために、配列番号１のオリゴヌクレ
オチドと配列番号２のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ用プ
ライマーとして使用して、QuickChangeTM Site-Directe
d Mutagenesis Kit （Stratagene社）を用いたＰＣＲ法
をｐＧＬＤＬIIＰ３９−ＲｃＴプラスミドに対して行っ
た。
【００５５】具体的には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと
してPfu DNA polymerase (Stratagene) を用い、ＰＣＲ
スケジュールは、９５℃３０秒間の変性、５５℃１分間
のアニーリング、６８℃３０分間の合成反応を３０回繰
り返した。その後、ＰＣＲ産物を制限酵素DpnIで処理
し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、出現コロニーからベ
クターＤＮＡを抽出し、塩基配列から変異導入されたｐ
ＧＬＤＬIIＰ３９−ＲｃＴプラスミドを選抜した。（以
下、ｐＧＬＤＬIIＰ３９−ＲｃＴ（ｎｕｌｌ）と呼
ぶ）。
【００５６】実施例Ａ記載の方法で、ｐＧＬＤＬIIＰ３
９−ＲｃＴ（ｎｕｌｌ）プラスミドを形質転換し、合成
培地High-Pi及び8S5N-P400中で培養し、ＨＢｓＡｇ−Ｎ
ｕｌｌ粒子を発現させた。
【００５７】定常成長期（培養開始から７２時間後）に
ある遺伝子組換え酵母から、YeastProtein Extraction
Reagent （Pierce Chemical社製）を用いて菌体粗抽出
液を作製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、銀染色
並びに抗Ｓモノクローナル抗体（フナコシ社）を用いる
Western法によりＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌの同定を行っ
た。
【００５８】これより、ＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌは分子量
約４２ｋＤａのタンパク質であることが明らかになっ
た。
【００５９】さらに、実施例Ｂに記載の方法に従って、
培地２．５Ｌ由来の上記菌体（約２６ｇ）から、約３ｍ
ｇの精製ＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子を得た。ＨＢｓＡｇ
の粒子構造のみを検出することができるAuszyme II EIA
キット（ダイナボット社）を用いて、ＨＢｓＡｇ粒子及
びＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子のＳ抗原性（ＨＢｓＡｇの
粒子化度合い）を測定したところ、両者とも同等の値が
観察された。実施例４ ヒト由来癌細胞におけるＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌ
ｌ粒子による遺伝子導入 実施例２に記載の方法に従って、実施例Ｃで得られた
肝細胞に対する高い感染能を欠失し、かつ任意の生体認
識分子を粒子表面に提示することができるＨＢｓＡｇ−
Ｎｕｌｌ粒子内部にＧＦＰ発現用プラスミド（pEGFP-F
（Clontech社））を封入し、ＨｅｐＧ２細胞と実施例２
に記載した各種ヒト由来癌細胞への遺伝子導入を培養細
胞レベルで行った。
【００６０】しかし、いずれの細胞からもＧＦＰによる
蛍光は観察されなかった。このことから、ＨＢｓＡｇ−
Ｎｕｌｌ粒子がヒト肝臓由来細胞に対する高い感染能を
消失していることが示された。実施例５ ヒト由来癌細胞を移植したヌードマウスに対
するＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子による遺伝子導入 実施例３に記載の方法に従って、ヒト腫瘍株（ＨｕＨ−
７及びＷｉＤｒ）を移植した胆癌マウスを作製し、ＧＦ
Ｐ発現プラスミド（pEGFP-F（Clontech社））を含むＨ
ＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子を投与したが、腫瘍部、及び全
ての主要臓器においてＧＦＰによる蛍光は観察されなか
った。
【００６１】このことから、ＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子
があらゆる臓器に対して感染性を有さないことが確認さ
れた。実施例Ｄ 上皮成長因子（ＥＧＦ： Epidermal Growth
Factor）提示型ＨＢｓＡｇ粒子（ＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒
子）の作製 ＥＧＦ受容体は極めて多くの細胞が細胞表層に発現して
いることが知られており、特にある種の癌（食道癌、大
腸癌等）の憎悪に関係していることが分かっている。そ
こで、ＥＧＦ受容体を標的とするＨＢｓＡｇ粒子を作製
すれば、ＥＧＦ受容体を発現する癌組織に対する有効な
治療手段になると考えられる。
【００６２】ここでは、実施例Ｃ記載の方法によるＨＢ
ｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子を基にした、ＥＧＦ提示型ＨＢｓ
Ａｇ粒子（ＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子）の作製法を記す。
ヒト由来ＥＧＦ前駆体ｃＤＮＡ断片（Bell GI, Fong N
M, Stempien MM, Wormsted MA, Caput D, Ku LL, Urdea
MS, Rall LB, Sanchez-Pescador R Nucleic Acids Res
1986 Nov 11;14(21):8427-46）を鋳型として、成熟型
ヒトＥＧＦ領域（５３アミノ酸残基）をコードする遺伝
子断片をＰＣＲ法により常法どおり増幅した。
【００６３】用いた２種類のＰＣＲプライマーは、セン
ス側が配列番号３のオリゴヌクレオチド、アンチセンス
側が配列番号４のオリゴヌクレオチドで、両方とも５’
末端側に制限酵素NotIサイト（gcggccgc）を有するよう
に設計した。
【００６４】ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で分離し
た後、目的のｃＤＮＡを含むバンド（約１７０ｂｐ）を
回収し、TOPO TA Cloning kit（Invitrogen社）を用い
てpCR2.1-TOPOベクター（Invitrogen社）にサブクロー
ニングした。塩基配列を確認した後、制限酵素NotIで切
断して、約１７０ｂｐの目的ＤＮＡ断片を回収し、ｐＧ
ＬＤＬIIＰ３９−ＲｃＴ（ｎｕｌｌ）を制限酵素NotIで
開裂させたものとTaKaRaLigation kit ver.2（TaKaRa
社）を用いて閉環結合させ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換
した。
【００６５】塩基配列解析により選抜を行い、挿入した
ＥＧＦ遺伝子がＨＢｓＡｇ遺伝子と読み取り枠が一致し
て融合したものを選抜し、プラスミドをｐＧＬＤＬＩＩ
Ｐ３９−ＲｃＴ−ＥＧＦと命名した。
【００６６】実施例Ａの方法に基づいて、ｐＧＬＤＬII
Ｐ３９−ＲｃＴ−ＥＧＦプラスミドを形質転換し、合成
培地High-Pi及び8S5N-P400中で培養して、ＨＢｓＡｇ−
ＥＧＦ粒子を発現させた。
【００６７】定常成長期（培養開始から７２時間後）に
ある遺伝子組換え酵母から、YeastProtein Extraction
Reagent (Pierce Chemical社製)を用いて、菌体粗抽出
液を作製し、SDS-PAGEを用いて分離して、銀染色並びに
抗ヒトＥＧＦポリクローナル抗体（Santa Cruz社）を用
いるWestern法によりＨＢｓＡｇ−ＥＧＦの同定を行っ
た。
【００６８】これより、ＨＢｓＡｇ−ＥＧＦは分子量約
５０ｋＤａのタンパク質であることが明らかになった。
【００６９】実施例Ｂに記載の方法に従って、培地２．
５Ｌ由来の上記菌体（約２６ｇ）から、約３ｍｇの精製
ＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子を得た。ＨＢｓＡｇの粒子構造
のみを検出することができるAuszyme II EIAキット（ダ
イナボット社）を用いて、ＨＢｓＡｇ粒子およびＨＢｓ
Ａｇ−ＥＧＦ粒子のＳ抗原性（ＨＢｓＡｇの粒子化度合
い）を測定したところ、両者とも同等の値が観察され
た。
【００７０】したがって、ＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子がＨ
ＢｓＡｇ粒子と同様に得られていることが示された。実施例６ ヒト由来癌細胞におけるＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ
粒子による遺伝子導入 実施例２に記載の方法に従って、ＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒
子内部にＧＦＰ発現用プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｆベクタ
ー（Clontech社）を封入し、ＨｅｐＧ２細胞及び実施例
２に記載した各種ヒト由来癌細胞への遺伝子導入を培養
細胞レベルで行った。
【００７１】その中で、ＥＧＦレセプターを大量に細胞
表面に発現しているＡ４３１細胞においてＧＦＰによる
強い蛍光を観察することができた。
【００７２】これより、ＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子がＥＧ
Ｆレセプター発現細胞に対する高い感染能を有すること
が確認された。また、培養細胞レベルで改造ＨＢｓＡｇ
粒子に任意の生体認識能を付与できることが示された。実施例７ ヒト由来癌細胞を移植したヌードマウスに対
するＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子による遺伝子導入 実施例３に記載の方法に従って、ヒト腫瘍株（Ａ４３
１、ＨｕＨ−７、ＷｉＤｒ）を移植した胆癌マウスを作
製し、ＧＦＰ発現プラスミド(ｐＥＧＦＰ−Ｆ（Clontec
h社）)を含むＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子を投与したとこ
ろ、Ａ４３１による腫瘍部に強力なＧＦＰによる蛍光が
観察された。一方、他細胞による腫瘍部及び主要臓器に
おいてはＧＦＰによる蛍光は観察されなかった。
【００７３】これより、ＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子がＥＧ
Ｆレセプターを著量発現している細胞に特異的に感染で
きること、および主要臓器に対しては感染性を有してい
ないことが確認された。
【００７４】したがって、任意の生体認識分子を融合も
しくは付加したＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子は、実験動物
レベルでも、あらゆる組織及び臓器に物質を特異的に運
搬できる粒子となることが示された。実施例Ｅ ベータセルリン（ＢＴＣ：Betacellulin）提
示型ＨＢｓＡｇ粒子（ＨＢｓＡｇ−ＢＴＣ粒子）の作製 ＢＴＣはＥＧＦファミリーの一種であるが、発現部位は
ＥＧＦと異なる。特に、血糖調節機構に重要な役割を担
う膵臓内ランゲルハンス島β細胞の分化に重要な役割を
担うことが判明している。そこで、ＢＴＣ受容体を標的
とするＨＢｓＡｇ粒子を作製すれば、ＢＴＣ受容体を発
現する組織に対する有効な物質運搬手段とすることがで
き、β細胞に起因する糖尿病の治療にも役立つことが期
待される。
【００７５】ここでは、実施例Ｃ記載の方法によって作
製されたＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子を基に、ＢＴＣ提示
型ＨＢｓＡｇ粒子（ＨＢｓＡｇ−ＢＴＣ粒子）の作製法
を記す。
【００７６】ヒト由来ＢＴＣ前駆体ｃＤＮＡ断片（Sasa
da R, Ono Y, Taniyama Y, Shing Y, Folkman J, Igara
shi K; Biochem.Biophys. Res.Commun. 1993 Feb 15;19
0(3):1173-9.）を鋳型として、ＢＴＣ受容体に結合能を
示すことが知られている部分（GHFSR------VDLFYの４８
アミノ酸残基）をコードする遺伝子断片をＰＣＲ法によ
り常法どおり増幅した。
【００７７】用いた２種類のＰＣＲプライマーは、セン
ス側が配列番号５のオリゴヌクレオチド、アンチセンス
側は配列番号６のオリゴヌクレオチドで、両方とも５’
末端側に制限酵素NotIサイト（gcggccgc）を有するよう
に設計した。
【００７８】ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で分離し
た後、目的のｃＤＮＡを含むバンド（約１６０ｂｐ）を
回収し、TOPO TA Cloning kit（Invitrogen社）を用い
てpCR2.1-TOPOベクター（Invitrogen社）にサブクロー
ニングした。塩基配列を確認した後、制限酵素NotIで切
断して、約１６０ｂｐの目的ＤＮＡ断片を回収し、ｐＧ
ＬＤＬIIＰ３９−ＲｃＴ（ｎｕｌｌ）を制限酵素NotIで
開裂させたものとTaKaRaLigation kit ver.2（TaKaRa
社）を用いて閉環結合させ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換
した。塩基配列解析により選抜を行い、挿入したＢＴＣ
遺伝子がＨＢｓＡｇ遺伝子と読み取り枠が一致して融合
したものを選抜し、プラスミドをｐＧＬＤＬIIＰ３９−
ＲｃＴ−ＢＴＣと命名した。
【００７９】実施例Ａと同様の方法でｐＧＬＤＬＩＩＰ
３９−ＲｃＴ−ＢＴＣプラスミドを形質転換し、合成培
地High-Pi及び8S5N-P400中で培養し、ＨＢｓＡｇ−ＢＴ
Ｃ粒子を発現させた。
【００８０】定常成長期（培養開始から７２時間後）に
ある遺伝子組換え酵母から、YeastProtein Extraction
Reagent （Pierce Chemical社製）を用いて、菌体粗抽
出液を作製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、銀染
色並びに抗ＢＴＣポリクローナル抗体（岡山大工学部妹
尾氏作製）を用いるWestern法によりＨＢｓＡｇ−ＢＴ
Ｃの同定を行った。
【００８１】これより、ＨＢｓＡｇ−ＢＴＣは分子量約
５０ｋＤａのタンパク質であることが明らかになった。
【００８２】実施例Ｂに記載の方法に従って、培地２．
５Ｌ由来の上記菌体（約２６ｇ）から、約３ｍｇの精製
ＨＢｓＡｇ−ＢＴＣ粒子を得た。ＨＢｓＡｇの粒子構造
のみを検出することができるAuszyme II EIAキット（ダ
イナボット社）を用いて、ＨＢｓＡｇ粒子及びＨＢｓＡ
ｇ−ＢＴＣ粒子のＳ抗原性（ＨＢｓＡｇの粒子化度合
い）を測定したところ、両者とも同等の値が観察され
た。実施例８ ヒト由来癌細胞におけるＨＢｓＡｇ-ＢＴＣ
粒子による遺伝子導入 実施例２に記載の方法に従って、ＨＢｓＡｇ−ＢＴＣ粒
子内部にＧＦＰ発現用プラスミド（ｐＥＧＦＰ−Ｆ（Cl
ontech社））を封入し、ＢＴＣレセプター発現している
ラット膵臓由来細胞ＡＲ４２Ｊ、ＢＴＣレセプターを発
現していないヒト肺癌由来Ｈ６９細胞、さらには、実施
例２に記載した各種ヒト由来癌細胞への遺伝子導入を培
養細胞レベルで行った。
【００８３】その中で、ＢＴＣレセプターを大量に細胞
表面に発現しているＡＲ４２Ｊ細胞においてＧＦＰによ
る強い蛍光を観察することができた。これより、ＨＢｓ
Ａｇ−ＢＴＣ粒子がＢＴＣレセプター発現細胞に対する
高い感染能を有することが確認された。実施例Ｆ 塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ：basi
c fibroblast growth factor）提示型ＨＢｓＡｇ粒子
（ＨＢｓＡｇ−ｂＦＧＦ粒子）の作製 個体内での癌組織の増殖において、癌細胞は周辺組織に
対し血管誘導を促すシグナルを発することが知られてい
る（血管新生またはangiogenesis）。これには、数多く
の成長因子（別名angiogenesis factor）が関与するこ
とが知られているが、その中心的な役割を担っているの
がｂＦＧＦであり、周辺組織ではｂＦＧＦレセプターが
亢進しているとの報告もある（Li VW, Folkerth RD, Wa
tanabe H, Yu C, Rupnick M, Barnes P, Scott RM, Bla
ck PM, Sallan SE, Folkman J Lancet 1994 Jul 9; 344
(8915): 82-6.）。
【００８４】そこで、ｂＦＧＦ受容体を標的とするＨＢ
ｓＡｇ粒子を作製すれば、ｂＦＧＦ受容体を発現する組
織に対する有効な物質運搬手段になると考えられ、癌周
辺組織における血管新生現象の抑制を効果的に誘導する
治療に役立たせることも可能である。
【００８５】ここでは、実施例Ｃ記載の方法によって作
製されたＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子を基に、ｂＦＧＦ提
示型ＨＢｓＡｇ粒子（ＨＢｓＡｇ−ｂＦＧＦ粒子）の作
製法を記す。
【００８６】ヒト由来ｂＦＧＦ前駆体ｃＤＮＡ断片（Ku
rokawa T, Sasada R, Iwane M, Igarashi K FEBS Lett.
1987 Mar 9;213(1):189-94.）を鋳型として、ｂＦＧＦ
受容体に結合能を示すことが知られている部分（PALPED
-------PMSAKSの１４６アミノ酸残基）をコードする遺
伝子断片をＰＣＲ法により常法どおり増幅した。用いた
２種類のＰＣＲプライマーは、センス側が配列番号７の
オリゴヌクレオチドと、アンチセンス側が配列番号８の
オリゴヌクレオチドで、両方とも5'末端側に制限酵素No
t Iサイト（gcggccgc）を有するように設計した。
【００８７】ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で分離し
た後、目的のｃＤＮＡを含むバンド（約４５０ｂｐ）を
回収し、TOPO TA Cloning kit（Invitrogen社）を用い
てｃＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen社）に
サブクローニングした。塩基配列を確認した後、制限酵
素NotIで切断して、約４５０ｂｐの目的ＤＮＡ断片を回
収し、ｐＧＬＤＬIIＰ３９−Ｒｃｔ（ｎｕｌｌ）を制限
酵素NotIで開裂させたものとTaKaRa Ligation kit ver.
2（TaKaRa社）を用いて閉環結合させ、大腸菌ＤＨ５α
を形質転換した。塩基配列解析により選抜を行い、挿入
したｂＦＧＦ遺伝子がＨＢｓＡｇ遺伝子と読み取り枠が
一致して融合したものを選抜し、プラスミドをｐＧＬＤ
ＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−ｂＦＧＦと命名した。
【００８８】実施例Ａと同様の方法で、ｐＧＬＤＬＩＩ
Ｐ３９−ＲｃＴ−ｂＦＧＦプラスミドを形質転換し、合
成培地High-Pi及び8S5N-P400中で培養してＨＢｓＡｇ−
ｂＦＧＦ粒子を発現させた。
【００８９】定常成長期（培養開始から７２時間後）に
ある遺伝子組換え酵母から、YeastProtein Extraction
Reagent (Pierce Chemical社製)を用いて、菌体粗抽出
液を作製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、銀染色
並びに抗ｂＦＧＦモノクローナル抗体３Ｈ３（和光純
薬）を用いるWestern法によりＨＢｓＡｇ−ｂＦＧＦの
同定を行った。
【００９０】これより、ＨＢｓＡｇ−ｂＦＧＦは分子量
約５８ｋＤａのタンパク質であることが明らかになっ
た。
【００９１】実施例Ｂに記載の方法に従って、培地２．
５Ｌ由来の上記菌体（約２６ｇ）から、約２ｍｇの精製
ＨＢｓＡｇ−ｂＦＧＦ粒子を得た。ＨＢｓＡｇの粒子構
造のみを検出することができるAuszyme II EIAキット
（ダイナボット社）を用いて、ＨＢｓＡｇ粒子及びＨＢ
ｓＡｇ−ｂＦＧＦ粒子のS抗原性（ＨＢｓＡｇの粒子化
度合い）を測定したところ、両者とも同等の値が観察さ
れた。実施例９ ヒト由来癌細胞におけるＨＢｓＡｇ-ｂＦＧ
Ｆ粒子による遺伝子導入 実施例２に記載の方法に従って、ＨＢｓＡｇ−ｂＦＧＦ
粒子内部にＧＦＰ発現用プラスミド（ｐＥＧＦＰ−Ｆ
（Clontech社））を封入し、ｂＦＧＦレセプター発現し
ているヒト乳癌由来細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ｂＦＧ
Ｆレセプターを発現していないヒト扁平上皮癌由来Ａ４
３１細胞および実施例２に記載した各種ヒト由来癌細胞
への遺伝子導入を培養細胞レベルで行った。
【００９２】その中で、ｂＦＧＦレセプターを大量に細
胞表面に発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におい
てＧＦＰによる強い蛍光を観察することができた。これ
より、ＨＢｓＡｇ−ｂＦＧＦ粒子がｂＦＧＦレセプター
発現細胞に対する高い感染能を有することが確認され
た。実施例Ｇ ＨＢｓＡｇ粒子内部に封入するヒトＲＮａｓ
ｅ発現ベクターの構築 ここでは、前記ＲＮａｓｅを細胞内で発現させるベクタ
ーを構築した。まず、ヒトＲＮａｓｅ１遺伝子（Seno,
M., Futami,J., Kosaka,M., Seno,S. and Yamada,H. Bi
ochim. Biophys. Acta 1218 (3), 466-468 1994）を鋳
型にして配列番号９のオリゴヌクレオチド（XhoIサイト
ctcgagを有する）と配列番号１０のオリゴヌクレオチド
（HindIIIサイトaagcttを有する）をプライマーとして
用いたＰＣＲにより、シグナルペプチドを含んだヒトＲ
Ｎａｓｅ１（１５６アミノ酸残基）をコードする遺伝子
断片（RO断片）を増幅した。
【００９３】次に、ヒトＲＮａｓｅ１遺伝子を鋳型にし
て配列番号１１のオリゴぺプチド（XhoIサイトctcgagを
有する）と配列番号１２のオリゴぺプチド（HindIIIサ
イトaagcttを有する）を用いたＰＣＲにより、シグナル
ペプチドを含まないヒトＲＮａｓｅ１（１２８アミノ酸
残基）をコードする遺伝子断片（RM断片）を増幅した。
【００９４】また、ヒトＥＣＰ遺伝子（Rosenberg HF,
Ackerman SJ and Tenen DG. J. Exp. Med. 170 (1), 16
3-176 1989）を鋳型にして配列番号１３のオリゴぺプチ
ド（XhoIサイトctcgagを有する）と配列番号１４のオリ
ゴぺプチド（HindIIIサイトaagcttを有する）を用いた
ＰＣＲにより、シグナルペプチドを含んだヒトＥＣＰ
（１６０アミノ酸残基）をコードする遺伝子断片（EO断
片）を増幅した。
【００９５】さらに、ヒトＥＣＰ遺伝子を鋳型にして配
列番号１５のオリゴぺプチド（XhoIサイトctcgagを有す
る）と配列番号１６のオリゴぺプチド（HindIIIサイトa
agcttを有する）を用いたＰＣＲにより、シグナルペプ
チドを含まないヒトＥＣＰ（１３３アミノ酸残基）をコ
ードする遺伝子断片（EM断片）を増幅した。
【００９６】以上の操作により得られたRO,RM,EO,EM断
片を一度pGEM-Teasyベクター（Promega社）にサブクロ
ーニングした後、塩基配列を確認後、EcoRIとHindIIIで
切断して、上記断片を含むＤＮＡ断片を切り離し、アガ
ロース電気泳動を用いて回収した。一方、発現ベクター
pTriEx-1（Novagen社）をEcoRIとHindIIIで開裂させた
ものを用意し、上記断片をTaKaRa Ligation kit ver.2
（TaKaRa社）を用いて、それぞれ閉環結合させた。その
結果、得られたプラスミドを、pTriEx-1-RO, pTriEx-1-
RM, pTriEx-1-EO及びpTriEx-1-EMと命名した。実施例Ｈ 培養細胞を用いたヒトRNase発現ベクターに
よる細胞傷害効果 アフリカミドリサル腎臓由来ＣＯＳ−７細胞を１×１０
4細胞ずつ１６穴ウェルプレートの各ウェルに播種し、
３７℃、５％ＣＯ2存在下で１０％ウシ胎仔血清を含むD
-MEMを用いて一晩培養した。翌日、pTriEx-1-RO, pTriE
x-1-RM, pTriEx-1-EO及びpTriEx-1-EMの各プラスミドを
０，０．２，０．５，１．０，５．０μｇに分注し、３
μｌの遺伝子導入用脂質FuGene６（ロシュ社）と激しく
混合し、さらに、血清を含まないD-MEM培地１００μｌ
を加えたものを各ウェルに添加した。
【００９７】３７℃、５％ＣＯ2存在下で１０％ウシ胎
仔血清を含むD-MEMを用いて二晩培養した。その後、Ｍ
ＴＴ溶液[5mg/ml MTT（和光純薬）を含むPBS（リン酸食
塩バッファー）]を１００μｌずつ各ウェルに加え、３
７℃で４時間静置した後、さらに、溶解液[0.04N 塩酸
を含むイソプロパノール]を１ｍｌ加えて、室温で１時
間振盪し、５７０ｎｍと６３０ｎｍの吸光度を測定し
た。
【００９８】各サンプルは３連で用意し、５７０ｎｍで
の吸光度を６３０ｎｍでの吸光度で割った値を測定値と
した。結果を表１に示した。
【００９９】
【表１】
【０１００】その結果、全ての発現系において細胞傷害
誘導能が観察された。
【０１０１】これより、これらのＲＮａｓｅ発現用ベク
ターをこの出願の発明の各種のタンパク質中空ナノ粒子
に封入すれば、細胞特異的に前記のＲＮａｓｅが導入さ
れ、細胞内で細胞傷害効果を発揮して有効な疾患治療法
となることが期待できる。実施例Ｉ 無血清培養の昆虫細胞によるＨＢｓＡｇ粒子
作製 実施例Ａに記載されている遺伝子組換え酵母によるＨＢ
ｓＡｇ粒子の発現は、菌体内の可溶性タンパク質の約４
０％がＨＢｓＡｇとして産生される極めて高い効率のＨ
ＢｓＡｇ粒子生産法であるが、精製ＨＢｓＡｇ粒子を得
るためには実施例Ｂに示すような複雑な操作が必要であ
る。また、酵母は高等動物由来のタンパク質を発現する
に適している小胞体膜等のタンパク質合成系を有しては
いるが、下等真核生物であるため糖鎖等の高次構造は再
現できないことが知られている。
【０１０２】そこで、以下にバキュロウィルスを介さ
ず、無血清培養が可能な昆虫細胞系でＨＢｓＡｇ粒子を
作製する方法を説明する。
【０１０３】実施例Ａに記載されている酵母用ＨＢｓＡ
ｇ発現プラスミドｐＧＬＤＬIIＰ３９−ＲｃＴから、配
列番号１７のオリゴヌクレオチド（KpnIサイトggtaccを
有する）及び配列番号１８のオリゴヌクレオチド（SacI
Iサイトccgcggを有する）のプライマーを用いてＰＣＲ
により、ニワトリ由来リゾチーム分泌シグナルペプチド
融合型ＨＢｓＡｇ遺伝子断片を増幅した。
【０１０４】ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で分離
し、約１．３ｋｂｐの目的バンドを回収した後、TOPO T
A Cloning kit（Invitrogen社）を用いてpCR2.1-TOPO
（Invitrogen社）にサブクローニングし、大腸菌ＤＨ５
αに形質転換した。塩基配列解析により目的の遺伝子が
正しく組み込まれているプラスミドを選抜し、その後、
Kpn I及びSac IIで処理して、アガロース電気泳動で分
離後、約１．３ｋｂｐのKpnI-SacII断片をアガロース電
気泳動により回収した。
【０１０５】次に、昆虫細胞安定発現用ベクターｐＩＺ
Ｔ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Invitrogen社）のKpnIサイトとSacI
Iサイトの間に、上記遺伝子断片をTaKaRa Ligation kit
ver.2（TaKaRa社）を用いて、閉環結合させた。
【０１０６】塩基配列を確認した後、プラスミドを、ｐ
ＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＨＢｓＡｇと命名した。同様
に、実施例Ｃ記載のｐＧＬＤＬIIＰ３９−ＲｃＴ（ｎｕ
ｌｌ）及び実施例Ｄ記載のｐＧＬＤＬIIＰ３９−ＲｃＴ
−ＥＧＦのプラスミドから改変ＨＢｓＡｇ遺伝子を抜き
出し、ｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓに挿入し、それぞれ、ｐ
ＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ｎｕｌｌ及び ｐＩＺＴ／Ｖ５
−Ｈｉｓ−ＥＧＦと命名した。
【０１０７】一方、昆虫細胞High Five株（BTI-TN-5B1-
4：Invitrogen社）を、約１ヶ月かけて次第に牛胎仔血
清入り培地から無血清培地（Ultimate Insect Serum-Fr
ee Medium：Invitrogen社）に馴化させた。次に、ｐＩ
ＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＨＢｓＡｇを遺伝子導入用脂質In
sectin-Plus（Invitrogen社）を用いて無血清培地に馴
化させたHigh Five株に形質転換した。その後、無血清
培地で27℃48時間培養し、抗生物質zeocin（Invitrogen
社）を400 μg/mL含有する無血清培地で更に細胞がconf
luentになるまで4〜7日間培養した。
【０１０８】1500×g、5分間遠心により培養上清を回収
し、AuszymeII EIAキット（ダイナボット社）により、
培地中のＨＢｓＡｇ粒子の発現測定したところ、ＨＢｓ
Ａｇ粒子が発現していることが確認された。
【０１０９】以上の様にして得られた培養上清１Ｌは、
限外濾過器（使用フィルターはUK-200：ADVANTEC社、排
除分子量２００Ｋ）で濃縮した後、陰イオン交換カラム
（DEAE-Toyopearl 650M、東洋ソーダ社）により均一な
ＨＢｓＡｇ粒子２ｍｇを精製することができた。実施例Ｊ 抗原性を減少させたＨＢｓＡｇ粒子の作製 ＨＢｓＡｇ粒子は接種されたヒトにおいて抗ＨＢｓＡｇ
抗体を惹起する可能性がある。そこで、ＨＢｓＡｇ粒子
内部の主要抗原であるＳタンパク質の抗原性を低下させ
た改変ＨＢｓＡｇ粒子を作製した。
【０１１０】具体的には、ＨＢワクチン接種者でありな
がらもＢ型肝炎を発症した患者から単離されたＨＢウイ
ルスの変異型（Carman WF, Zanetti AR, Karayiannis
P, Waters J, Manzillo G, Tanzi E, Zuckerman AJ, Th
omas HC; Lancet 1990 Aug 11;336 (8711):325-9; Chio
u HL, Lee TS, Kuo J, Mau YC, Ho MS J Gen Virol 199
7 Oct;78 (Pt 10):2639-45）をＨＢｓＡｇ粒子に導入し
た。
【０１１１】実施例Ａに記載されるｐＧＬＤＬＩＩＰ３
９−ＲｃＴプラスミドのＳタンパク質部分の１４５番目
Gly残基をArg残基に置換するため（変異部分は下線で表
示）に、5'-GCTGTACAAAACCTTCGGACAGAAACTGCA CTTGTATT
CC-3'（配列番号１９）とその相補配列5'-GGAATACAAG T
GCAGTTTCTGTCCGAAGGTTTTGTACAGC-3'（配列番号２０）を
コードするＰＣＲ用プライマー２種類を使用して、Quic
kChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit （Stratage
ne社）を用いたＰＣＲ法をｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−Ｒｃ
Ｔプラスミドに対して行った。
【０１１２】具体的には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと
してPfu DNA polymerase （Stratagene）を用い、ＰＣ
Ｒスケジュールは、９５℃３０秒間の変性、５５℃１分
間のアニーリング、６８℃３０分間の合成反応を３０回
繰り返した。その後、ＰＣＲ産物を制限酵素Dpn Iで処
理し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した後、出現コロニー
からベクターＤＮＡを抽出し、塩基配列から変異導入さ
れたｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴプラスミドを選抜し
た。（以下、ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ（Ｇ１４５
Ｒ）と呼ぶ。）実施例Ａと同様の方法でｐＧＬＤＬＩＩ
Ｐ３９−ＲｃＴ（Ｇ１４５Ｒ）プラスミドを形質転換
し、合成培地High-Pi及び8S5N-P400中で培養し、ＨＢｓ
Ａｇ（Ｇ１４５Ｒ）粒子を発現させた。
【０１１３】定常成長期（培養開始から７２時間後）に
ある遺伝子組換え酵母から、YeastProtein Extraction
Reagent (Pierce Chemical社製)を用いて、菌体粗抽出
液を作製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、銀染色
並びに抗Ｓモノクローナル抗体（フナコシ社）を用いる
Western法によりＨＢｓＡｇ（Ｇ１４５Ｒ）の同定を行
った。
【０１１４】これより、ＨＢｓＡｇ（Ｇ１４５Ｒ）は分
子量約５２ｋＤａのタンパク質であることが明らかにな
った。
【０１１５】実施例Ｂに記載の方法に従って、培地２．
５Ｌ由来の上記菌体（約２６ｇ）から、約２０ｍｇの精
製ＨＢｓＡｇ（Ｇ１４５Ｒ）粒子を得た。ＨＢｓＡｇの
Ｓ抗原性に基づいて粒子構造のみを検出することができ
るAuszyme II EIAキット（ダイナボット社）を用いて、
ＨＢｓＡｇ粒子及びＨＢｓＡｇ（Ｇ１４５Ｒ）粒子のＳ
抗原性を測定したところ、前者１に対し後者０．２であ
った。
【０１１６】上記ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ（Ｇ１
４５Ｒ）プラスミドのＳタンパク質部分の１２９番目Gl
n残基をコArg残基に置換するため（変異部分は下線で表
示）に、5'-GCACGATTCCTGCTCGAGGAACCTCTATG -3'（配列
番号２１）とその相補配列5'-CATAGAGGTTCCTCGAGCAGGAA
TCG TGC-3'（配列番号２２）をコードするＰＣＲ用プラ
イマー２種類を使用して、QuickChangeTM Site-Directe
d Mutagenesis Kit (Stratagene社)を用いたＰＣＲ法を
ｐＧＬＤＬIIＰ３９−ＲｃＴ（Ｇ１４５Ｒ）プラスミド
に対して行った。
【０１１７】具体的には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと
してPfu DNA polymerase (Stratagene) を用い、ＰＣＲ
スケジュールは、９５℃３０秒間の変性、５５℃１分間
のアニーリング、６８℃３０分間の合成反応を３０回繰
り返した。
【０１１８】その後、ＰＣＲ産物を制限酵素Dpn Iで処
理し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した後、出現コロニー
からベクターＤＮＡを抽出し、塩基配列から変異導入さ
れたｐＧＬＤＬIIＰ３９−ＲｃＴ（Ｇ１４５Ｒ）プラス
ミドを選抜した。（以下、ｐＧＬＤＬIIＰ３９−ＲｃＴ
（Ｑ１２９Ｒ，Ｇ１４５Ｒ）と呼ぶ。）実施例Ａと同様
の方法で、ｐＧＬＤＬIIＰ３９−ＲｃＴ（Ｑ１２９Ｒ，
Ｇ１４５Ｒ）プラスミドを形質転換し、合成培地High-P
i及び8S5N-P400中で培養し、ＨＢｓＡｇ（Ｑ１２９Ｒ，
Ｇ１４５Ｒ）粒子を発現させた。
【０１１９】定常成長期（培養開始から７２時間後）に
ある遺伝子組換え酵母から、YeastProtein Extraction
Reagent (Pierce Chemical社製)を用いて、菌体粗抽出
液を作製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、銀染色
並びに抗Ｓモノクローナル抗体（フナコシ社）を用いる
Western法によりＨＢｓＡｇ（Ｑ１２９Ｒ，Ｇ１４５
Ｒ）の同定を行った。
【０１２０】これより、ＨＢｓＡｇ（Ｑ１２９Ｒ，Ｇ１
４５Ｒ）は分子量約５２ｋＤａのタンパク質であること
が明らかになった。
【０１２１】実施例Ｂに記載の方法に従って、培地２．
５Ｌ由来の上記菌体（約２６ｇ）から、約２０ｍｇの精
製ＨＢｓＡｇ（Ｑ１２９Ｒ，Ｇ１４５Ｒ）粒子を得た。
ＨＢｓＡｇのＳ抗原性に基づいて粒子構造のみを検出す
ることができるAuszyme II EIAキット（ダイナボット
社）を用いて、ＨＢｓＡｇ粒子及びＨＢｓＡｇ（Ｑ１２
９Ｒ，Ｇ１４５Ｒ）粒子のＳ抗原性を測定したところ、
前者１に対し後者０．０１未満であった。
【０１２２】以上より、ＨＢｓＡｇ（Ｑ１２９Ｒ，Ｇ１
４５Ｒ）粒子は低抗原性であることが明らかになり、同
粒子を使用して生体内でも安定した有効な物質運搬手段
に適用できることが明らかになった。
【０１２３】
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って、細胞または組織に特異的に物質を運搬、導入する
運搬体として用いられる新しい中空ナノ粒子が提供され
る。この中空ナノ粒子は、特定細胞あるいは組織に対す
る強い感染機構を保持するものの、ウィルスゲノムを持
たないため、安全性が高く、遺伝子治療やＤＤＳとして
広く応用できる。また、大量発現系を用いて生産するこ
とができ、産業上の利用性も高い。
【０１２４】
【配列表】 <110> Japan Science and Technology Corporation <120> Protein hollow nano-particles, their use as specie carriers and me thod of introducing species to cell <130> 01-F-005PCT <160> 22 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 1 cgacaaggca tgggaggcgg ccgcagccct caggctcag 39 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 2 ctgagcctga gggctgcggc cgcctcccat gccttgtcg 39 <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 3 ggggcggccg catgaactct gattccg 27 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 4 gggcggccgc cacgcagttc ccaccatttc 30 <210> 5 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 5 gggcggccgc ggccacttct ctaggtgc 28 <210> 6 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 6 gggcggccgc cgtaaaacaa gtcaactc 28 <210> 7 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 7 ggggcggccg ccccgccttg cccgaggatg gc 32 <210> 8 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 8 gggcggccgc cgctcttagc agacattgga ag 32 <210> 9 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 9 ggctcgagat ggctctggag aagtctcttg 30 <210> 10 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 10 ccaagctttt aggtagagtc ctccacag 28 <210> 11 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 11 ggctcgagat gaaggaatcc cgggccaag 29 <210> 12 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 12 ccaagctttt aggtagagtc ctccacag 28 <210> 13 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 13 ggctcgagat ggttccaaaa ctgttcac 28 <210> 14 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 14 ccaagctttt agatggtggt atccaggtg 29 <210> 15 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 15 ggctcgagat gagaccccca cagtttacg 29 <210> 16 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 16 ccaagctttt agatggtggt atccaggtg 29 <210> 17 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 17 ggggtaccat gagatctttg ttgatcttg 29 <210> 18 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 18 ggccgcggtt aaatgtatac ccaaagac 28 <210> 19 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 19 gctgtacaaa accttcggac agaaactgca cttgtattcc 40 <210> 20 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 20 ggaatacaag tgcagtttct gtccgaagg ttttgtacag c 41 <210> 21 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 21 gcacgattcc tgctcgagga acctctatg 29 <210> 22 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligopeptide <400> 22 catagaggtt cctcgagcag gaatcgtgc 29
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の実施例におけるＨＢｓＡｇ遺伝子の
各タンパク質領域を表す概略摸式図である。１〜８は、
表面抗原における各部位の働きを示している。
【図２】この発明の実施例における遺伝子組換え酵母を
用いたＨＢｓＡｇ粒子の発現および精製操作を例示した
概略説明図である。（ａ）遺伝子組換え酵母の作成、
（ｂ）Ｈｉｇｈ−Ｐｉ培地における培養、（ｃ）８Ｓ５
Ｎ−Ｐ４００培地における培養、（ｄ）破砕、（ｅ）密
度勾配遠心分離、（ｆ）ＨＢｓＡｇ粒子。
【図３】この発明の実施例において、ＧＦＰプラスミド
を導入したＨＢｓＡｇ粒子とＨｅｐＧ２を接触させた際
のＨｅｐＧ２の共焦点レーザー蛍光顕微鏡写真を示した
図である。（ａ）ＨＢｓＡｇ粒子使用（プラスミド量：
８ｎｇ）、（ｂ）脂質（リポソーム）使用（プラスミド
量：８００ｎｇ）、（ｃ）ベクターのみ（プラスミド
量：８００ｎｇ）。
【図４】ＧＦＰを封入されたＨＢｓＡｇ粒子によって、
ヒト肝癌由来細胞（ＮＵＥ）内においてもＨｅｐＧ２と
同程度にＧＦＰが発現されることを表す共焦点レーザー
蛍光顕微鏡写真を示した図である。（ａ）ＨｅｐＧ２細
胞、（ｂ）ＮＵＥ細胞。
【図５】ＨＢｓＡｇ粒子が、ヒト肝癌由来細胞（ＨｕＨ
−７）に極めて特異的にＧＦＰを導入できることを表す
共焦点レーザー蛍光顕微鏡写真を示した図である。
（ａ）ヒト肝癌由来細胞（ＨｕＨ−７）を移植された胆
癌マウスの腫瘍部（蛍光あり）、（ｂ）マウスの通常肝
臓（蛍光なし）。
【符号の説明】
１ 放出抑制 ２ レセプター ３ 糖鎖１ ４ 血清重合アルブミンレセプター ５ 膜貫通 ６ 安定化 ７ 糖鎖２ ８ 膜貫通 低重合化・分泌
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/02 Ｃ０７Ｋ 14/02 19/00 19/00 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 近藤 昭彦 兵庫県神戸市灘区篠原伯母野山町１−２− 806 (72)発明者 上田 政和 東京都新宿区納戸町６ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA03 BA33 CA04 DA02 DA12 EA04 GA11 GA14 HA20 4B064 AG13 AG33 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 4C076 AA65 AA95 CC27 CC29 EE41 FF02 4C084 AA13 NA13 NA14 ZB262 ZC022 4H045 AA11 AA30 BA10 BA41 CA02 DA20 DA21 DA86 EA20 EA34 EA65 FA74 GA10 GA15

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 粒子形成能を有するタンパク質に生体認
    識分子が導入されていることを特徴とする中空ナノ粒
    子。
  2. 【請求項２】 真核細胞でタンパク質を発現させて得ら
    れるタンパク質粒子に生体認識分子が導入されているこ
    とを特徴とする中空ナノ粒子。
  3. 【請求項３】 真核細胞が酵母または遺伝子組換え酵母
    のいずれかから選択される請求項２の中空ナノ粒子。
  4. 【請求項４】 真核細胞が昆虫細胞である請求項２の中
    空ナノ粒子。
  5. 【請求項５】 粒子を形成するタンパク質がＢ型肝炎ウ
    ィルス表面抗原タンパク質であることを特徴とする請求
    項１ないし４のいずれかの中空ナノ粒子。
  6. 【請求項６】 Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質が
    抗原性を減少させたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク
    質である請求項５の中空ナノ粒子。
  7. 【請求項７】 生体認識分子が細胞機能調節分子である
    ことを特徴とする請求項１ないし６のいずれかの中空ナ
    ノ粒子。
  8. 【請求項８】 生体認識分子が抗原であることを特徴と
    する１ないし６のいずれかの中空ナノ粒子。
  9. 【請求項９】 生体認識分子が抗体であることを特徴と
    する１ないし６のいずれかの中空ナノ粒子。
  10. 【請求項１０】 生体認識分子が糖鎖であることを特徴
    とする１ないし６のいずれかの中空ナノ粒子。
  11. 【請求項１１】 請求項１ないし１０の中空ナノ粒子に
    細胞導入物質が内包されていることを特徴とする物質運
    搬体。
  12. 【請求項１２】 細胞導入物質が遺伝子であることを特
    徴とする請求項１１の物質運搬体。
  13. 【請求項１３】 細胞導入物質がタンパク質であること
    を特徴とする請求項１１の物質運搬体。
  14. 【請求項１４】 細胞導入物質が細胞内で細胞傷害性を
    示すＲＮａｓｅである請求項１１の物質運搬体。
  15. 【請求項１５】 細胞導入物質が化合物であることを特
    徴とする請求項１１の物質運搬体。
  16. 【請求項１６】 請求項１ないし１０のいずれかの中空
    ナノ粒子に、エレクトロポレーション法により細胞導入
    物質を内包させることを特徴とする請求項１１ないし１
    ５記載のいずれかの物質運搬体の製造方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１ないし１０のいずれかの中空
    ナノ粒子に、超音波法により細胞導入物質を内包させる
    ことを特徴とする請求項１１ないし１５記載のいずれか
    の物質運搬体の製造方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１ないし１０のいずれかの中空
    ナノ粒子に、単純拡散法により細胞導入物質を内包させ
    ることを特徴とする請求項１１ないし１５記載のいずれ
    かの物質運搬体の製造方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１ないし１０のいずれかの中空
    ナノ粒子に、電荷を有する脂質を用いて細胞導入物質を
    内包させることを特徴とする請求項１１ないし１５記載
    の物質運搬体の製造方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１ないし１０のいずれかの中空
    ナノ粒子を用いることを特徴とする細胞または組織への
    物質導入方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１１ないし１５のいずれかの物
    質運搬体を用いることを特徴とする細胞または組織への
    物質導入方法。
  22. 【請求項２２】 少なくとも請求項２０または２１のい
    ずれかの物質導入方法を用いて特定細胞または組織へ物
    質を運搬する操作を含むことを特徴とする疾患の治療方
    法。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005095968A1 (ja) * 2004-03-31 2005-10-13 Toray Industries, Inc. センシングツール
JP2006519781A (ja) * 2003-02-17 2006-08-31 ブルクハルト，ペーター 医薬送達及び抗原提示システムとしてのペプチドナノ粒子
JP2009120532A (ja) * 2007-11-14 2009-06-04 Osaka Univ 糖及び糖鎖認識機構を利用する物質送達用及びバイオイメージング用バイオナノカプセル
WO2010137570A1 (ja) * 2009-05-29 2010-12-02 学校法人慶應義塾 抗ウイルス剤または抗癌剤
JP2013524811A (ja) * 2010-04-20 2013-06-20 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファンデーション インコーポレーティッド ナノザイム、ナノザイムの製造方法、およびナノザイムの使用方法
JP2014185090A (ja) * 2013-03-22 2014-10-02 Kyoto Univ リポソーム−エキソソームハイブリッドベシクル及びその調製法

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4212921B2 (ja) * 2002-03-29 2009-01-21 独立行政法人科学技術振興機構 抗体を提示するタンパク質中空ナノ粒子を用いる治療薬剤およびタンパク質中空ナノ粒子
JP2003286189A (ja) * 2002-03-29 2003-10-07 Japan Science & Technology Corp 中空ナノ粒子を形成するタンパク質に疾患治療用の細胞導入物質を融合させた薬剤
JP2003286198A (ja) * 2002-03-29 2003-10-07 Japan Science & Technology Corp 増殖因子等を提示するタンパク質中空ナノ粒子を用いる治療薬剤
JP2003286199A (ja) * 2002-03-29 2003-10-07 Japan Science & Technology Corp タンパク質中空ナノ粒子を用いる肝臓疾患治療用薬剤
US20060141042A1 (en) * 2002-06-28 2006-06-29 Shunichi Kuroda Hollow nanoparticle having modified cysteine residue and drug with the use thereof
JP2004175665A (ja) * 2002-11-22 2004-06-24 Japan Science & Technology Agency タンパク質中空ナノ粒子およびそれを用いた薬剤
JP2004277355A (ja) * 2003-03-17 2004-10-07 Beacle Inc 血友病治療用薬剤及びそれを用いた血友病治療方法
US8986736B2 (en) * 2003-06-24 2015-03-24 Baxter International Inc. Method for delivering particulate drugs to tissues
CA2540695A1 (en) * 2003-06-24 2004-12-29 Baxter International Inc. Specific delivery of drugs to the brain
RU2006130958A (ru) * 2004-01-29 2008-03-10 Бакстер Интернэшнл Инк. (Us) Наносуспензии антиретровирусных агентов для улучшенной доставки в центральную нервную систему
AU2005255039A1 (en) * 2004-06-15 2005-12-29 Baxter Healthcare S.A. Ex-vivo application of solid microparticulate therapeutic agents
US7935517B2 (en) * 2004-09-22 2011-05-03 Nanolab, Inc. Nanospearing for molecular transportation into cells
WO2006116065A1 (en) * 2005-04-21 2006-11-02 The Trustees Of Boston College Methods for molecular delivery into cells using nanotube spearing
CA2558601A1 (en) * 2005-09-14 2007-03-14 Japan Science And Technology Agency Substance carrier using hollow nanoparticle of hepatitis b virus protein and liposome, and method of introducing substance into cell
WO2008018555A1 (en) * 2006-08-11 2008-02-14 National University Corporation Okayama University HBsAg PARTICLE HAVING LOW ANTIGENICITY AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF
RU2496482C2 (ru) 2008-03-05 2013-10-27 Бакстер Интернэшнл Инк. Композиции и способы для доставки лекарственных средств
US10952965B2 (en) * 2009-05-15 2021-03-23 Baxter International Inc. Compositions and methods for drug delivery
JP2014530224A (ja) 2011-10-12 2014-11-17 アルファ−オー・ペプチドズ・アーゲーＡｌｐｈａ−Ｏ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ａｇ ノロウイルス感染に対するワクチンとしての自己集合ペプチドナノパーティクル
CN105713917A (zh) * 2016-02-20 2016-06-29 深圳市圣必智科技开发有限公司 基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法
JP2020510650A (ja) 2017-02-23 2020-04-09 アルファ−オ ペプティデス アクツィエンゲゼルシャフト 免疫刺激性核酸（ｎｕｃｌｅｉｄ ａｃｉｄｓ）を封入する自己集合タンパク質ナノ粒子
WO2018172447A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 Alpha-O Peptides Ag Self-assembling protein nanoparticles with built-in six-helix bundle proteins
CN110612118B (zh) 2017-06-05 2024-02-13 比科尔公司 用于引起针对hbv的免疫应答的病毒样粒子

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR732104A (fr) 1932-02-16 1932-09-13 Alfred Wiseman Ltd Mécanisme de pompage perfectionné pour moteurs à combustion interne du type diesel ou à allumage par compression
ZW18282A1 (en) * 1981-08-31 1983-03-23 Genentech Inc Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture
FR2560890B1 (fr) * 1984-03-07 1987-10-16 Grp Genie Genetique Composition utile pour la fabrication de vaccins contenant des particules portant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et le recepteur de l'albumine serique humaine polymerisee, cellules animales capables de produire de telles particules et procede pour leur obtention
US5098704A (en) * 1984-06-18 1992-03-24 Chiron Corporation Hepatitis surface antigen particle vaccine
FR2581394B1 (fr) * 1985-05-02 1988-08-05 Grp Genie Genetique Particules ayant les proprietes immunogenes de l'antigene hbs et portant un site antigenique etranger aux epitopes portes par l'antigene hbs, vecteurs et cellules animales pour la production de telles particules et compositions contenant de telles particules pour la production de vaccins mixtes
JPH10234383A (ja) * 1997-02-28 1998-09-08 Denka Seiken Co Ltd Ｅ型肝炎ウイルス中空粒子、それをコードする遺伝子及びそれらの遺伝子を含む組換えベクターの作製方法と利用方法
AU7350798A (en) 1997-04-29 1998-11-24 Universiteit Utrecht Corona virus-like particles as tools for vaccination and therapy
US6797505B2 (en) * 1998-05-27 2004-09-28 Cell Genesys, Inc. Recombinant AAV vectors for gene therapy of hemophilia A
US6740323B1 (en) * 1999-11-24 2004-05-25 Chiron Corporation HBV/HCV virus-like particle

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006519781A (ja) * 2003-02-17 2006-08-31 ブルクハルト，ペーター 医薬送達及び抗原提示システムとしてのペプチドナノ粒子
WO2005095968A1 (ja) * 2004-03-31 2005-10-13 Toray Industries, Inc. センシングツール
EP1757936A4 (en) * 2004-03-31 2008-05-21 Toray Industries SENSOR
JP2009120532A (ja) * 2007-11-14 2009-06-04 Osaka Univ 糖及び糖鎖認識機構を利用する物質送達用及びバイオイメージング用バイオナノカプセル
WO2010137570A1 (ja) * 2009-05-29 2010-12-02 学校法人慶應義塾 抗ウイルス剤または抗癌剤
JP2013524811A (ja) * 2010-04-20 2013-06-20 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファンデーション インコーポレーティッド ナノザイム、ナノザイムの製造方法、およびナノザイムの使用方法
JP2014185090A (ja) * 2013-03-22 2014-10-02 Kyoto Univ リポソーム−エキソソームハイブリッドベシクル及びその調製法

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