JP2001302550A - 医薬組成物、試薬、及び、医薬活性成分又は標識化物質の脳内への送達法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 医薬活性成分が脳内に容易に移行し得る医薬
組成物、標識化物質が脳内に容易に移行し得る試薬、及
び、医薬活性成分又は標識化物質を脳内に送達する方法
を提供する。 【解決手段】 医薬活性物質又は標識化物質を冬眠特異
的タンパク質と結合させて結合体として用いる。結合体
を甲状腺ホルモン類又はその分泌を促進する物質ととも
に投与することにより、医薬活性成分又は標識化物質が
脳内に送達される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医薬組成物、試
薬、及び、医薬活性成分又は標識化物質を血液から脳内
に送達する方法等に関する。

【０００２】

【従来の技術】冬眠特異的タンパク質は、シマリスなど
の血中に存在し冬眠に同期して存在量が変化するタンパ
ク質として見い出された(J. Biol. Chem., 267, 473-47
8 (1992))。冬眠特異的タンパク質は４種のタンパク質
（HP-20、HP-25、HP-27及びHP-55）で構成され、HP-2
0、HP-25及びHP-27は、N-末端アミノ酸の約４０残基に
コラーゲン様配列（Gly-X-Yの繰り返し）を含む互いに
類似した構造を持ち、HP-55は、エラスターゼに対して
阻害活性を有するα1-アンチトリプシン様のセルピンス
ーパーファミリーに属する（特開平９−１５７２９
９）。何れもシマリスなどの肝臓で特異的に発現し、血
中に分泌されている。血中では、HP-20、HP-25及びHP-2
7は、コラーゲン様三重ラセン構造と、その両端に存在
する半シスチン残基間での分子間ジスルフィド結合とに
よりヘテロトリマー（HP-20c：分子量約80 kDa）を形成
し、それにHP-55（分子量約60 kDa）が非共有結合し複
合体を形成している。

【０００３】冬眠特異的タンパク質は、シマリスの場
合、冬眠に同期して年周性にその量が変動し、非冬眠期
に血中に多く、冬眠中に著しく減少することが分かって
いる。さらに、脳脊髄液中（すなわち脳内）では、これ
とは逆に、冬眠期に著しく増加する。しかも、脳脊髄液
中の冬眠特異的タンパク質は、HP-20cとHP-55とに解離
している。脳脊髄液中に冬眠特異的タンパク質が少ない
非冬眠期では、冬眠特異的タンパク質濃度は血中の1/10
00〜1/2000とわずかである。冬眠特異的タンパク質の脳
内への輸送は、チロキシン（10〜250μg/kg）の生体へ
の投与によって誘導され、投与後１日以内に脳脊髄液中
の冬眠特異的タンパク質濃度が増加し、数日以内に40〜
50倍に達する。さらに、チロキシン投与の中止により、
元の状態に戻る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】脳内に医薬活性成分又
は標識化物質を投与しようとする場合、血液から脳内へ
の物質輸送が厳密に制限されているため、血中投与など
の簡便な方法により投与できる物質は制限されている。
医薬活性成分又は標識化物質を脳内に簡便な方法により
投与できる方法が提供されれば、生体レベルで脳内に医
薬活性成分又は標識化物質を輸送することが容易にな
り、また、脳疾患などの診断、薬物の脳神経系に対する
効果の試験、脳神経系に有効な新薬の開発、脳機能の解
明の研究などのために極めて有用である。

【０００５】本発明は、医薬活性成分が脳内に容易に移
行し得る医薬組成物、標識化物質が脳内に容易に移行し
得る試薬、及び、医薬活性成分又は標識化物質を血液か
ら脳内に送達する方法を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記課題を解
決すべく鋭意検討を重ねた結果、チロキシンを投与し
た、冬眠特異的タンパク質を産生しない非冬眠動物に、
冬眠特異的タンパク質を含むシマリス血漿を静脈内投与
することにより、その動物の脳脊髄液中において冬眠特
異的タンパク質濃度が増加すること、及び、冬眠特異的
タンパク質複合体の形成には各構成タンパク質の部分ペ
プチドの存在で十分であることを見出し、本発明を完成
するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、冬眠特異的タンパク
質と医薬活性成分との結合体を含む医薬組成物（以下、
「本発明医薬組成物」ともいう）、及び、冬眠特異的タ
ンパク質と標識化物質との結合体を含む試薬（以下、
「本発明試薬」ともいう）を提供する。

【０００８】本発明医薬組成物又は本発明試薬は、さら
に甲状腺ホルモン類又はその分泌を促進する物質を含む
ことが好ましい。

【０００９】本発明医薬組成物又は本発明試薬におい
て、冬眠特異的タンパク質は、それぞれ単独の冬眠特異
的タンパク質又はそれらの部分ペプチドでもよいし、そ
れらから構成される複合体、例えば、ＨＰ−２０ｃとＨ
Ｐ−５５との複合体、又は、ＨＰ−２０ｃの部分ペプチ
ドとＨＰ−５５との複合体、ＨＰ−２０ｃとＨＰ−５５
の部分ペプチドとの複合体、若しくは、ＨＰ−２０ｃの
部分ペプチドとＨＰ−５５の部分ペプチドとの複合体で
あってもよい。

【００１０】本発明組成物において、医薬活性成分又は
標識化物質は、ＨＰ−２０ｃ又はその部分ペプチドとＨ
Ｐ−５５又はその部分ペプチドとのいずれか一方に結合
していてもよいし、両方に結合していてもよい。

【００１１】本発明は、また、甲状腺ホルモン類又はそ
の分泌を促進する物質を有効成分とする、脳内移行性タ
ンパク質又は脳内移行性タンパク質と医薬活性成分若し
くは標識化物質との結合体の脳内への送達生起剤（以
下、「本発明送達生起剤」ともいう）を提供する。

【００１２】本発明は、さらに、医薬活性成分又は標識
化物質を冬眠特異的タンパク質に結合させて結合体を
得、結合体を甲状腺ホルモン類又はその分泌を促進する
物質とともに投与することにより、医薬活性成分又は標
識化物質を脳内に送達する方法（以下、「本発明送達方
法」ともいう）を提供する。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て、詳細に説明する。

【００１４】＜１＞本発明医薬組成物 本発明医薬組成物は、冬眠特異的タンパク質と医薬活性
成分との結合体（以下、これを単に「医薬結合体」とい
うことがある）を含む。

【００１５】本発明において冬眠特異的タンパク質（以
下、これを「ＨＰ」ということがある）とは、例えばシ
マリスで見い出された冬眠に特異的な４種の冬眠特異的
タンパク質や、それらの部分ペプチド、又は、該タンパ
ク質若しくはそれらの部分ペプチドから構成される複合
体を意味する。４種のタンパク質は、それぞれ、HP-2
7、HP-25、HP-20及びHP-55と呼ばれており、それぞれ、
代表的なそれらのアミノ酸配列を配列番号１〜４に示
す。これらのタンパク質は配列番号１〜４に示すアミノ
酸配列を有するものに限定されず、それらの同種変異体
も包含される。

【００１６】HP-27、HP-25及びHP-20は、血中では、コ
ラーゲン様三重ラセン構造と、その両端に存在する半シ
スチン残基間での分子間ジスルフィド結合とによりヘテ
ロトリマー（HP-20c：分子量約80 kDa）を形成する。こ
れにHP-55（分子量約60 kDa）が非共有結合し複合体を
形成している。上記部分ペプチドとは、このような複合
体を形成する能力を有し、そして、その複合体が血液か
ら脳内へ移行する能力を有する限り、特に限定されず、
部分分解などにより得られる、上記４種のタンパク質の
部分ペプチドを包含する。また、ＨＰが投与される生体
に何らかの活性を有し影響を及ぼす場合には、これらの
活性中心を削除あるいは不活化することが有効である。
複合体を形成する能力及び血液から脳内へ移行する能力
は後記実施例に記載したような方法によって評価でき
る。

【００１７】ＨＰ複合体は、HP-20cとHP-55との複合体
であってもよいし、又は、HP-20cとHP-55のいずれか一
方若しくは両方が部分ペプチドである複合体であっても
よい。HP-20cの部分ペプチドとは、HP-20cを構成するタ
ンパク質の少なくとも一つが部分ペプチドである複合体
を意味する。

【００１８】医薬活性成分は、脳細胞に対して医薬的作
用を及ぼす物質であり、本発明の医薬活性成分とＨＰ複
合体との結合体として血液から脳内に移行できる限り、
特に限定されない。また、後述する標識化に使用される
物質を結合させることによりラベル化したものでもよ
い。本発明に用いられる医薬活性成分の作用としては、
脳内の疾患治療、具体的には例えば、抗腫瘍（癌）薬、
抗生物質、後天性免疫不全症候群(autoimmune deficien
cy syndrome: AIDS)治療薬、パーキンソン病(Parkinso
n's disease)、退行性神経症(neuro degenerative dise
ase)、多発性硬化症(multiple sclerosis)、アルツハイ
マー病(Arzheimer's disease)、うつ病(depression)等
の神経疾患治療薬、鎮痛剤、偏頭痛治療薬、てんかん治
療薬等が挙げられる。

【００１９】また、このような作用を有する本発明に使
用される医薬活性成分としては、それ自体では血中から
脳内へ到達することのできない、高分子化合物や親水性
物質、あるいは極性官能基を多数有する化合物等が挙げ
られる。具体的には例えば、抗腫瘍薬としては、メトト
レキセート(methotrexate)、アドリアマイシン(adriamy
cin)、シスプラチン(cisplatin)、サイクロフォスファ
ミド(cyclophosphamide)、エトポシド(etoposide)、カ
ルボプラチン(carboplatin)等が挙げられ、抗生物質と
しては、アムフォテリシンＢ(amphotericin B)、ゲンタ
マイシン(gentamycin)等が挙げられる。また神経疾患治
療薬としては、神経栄養因子としてＮＧＦ(nerve growt
h factor)、ＢＤＮＦ(brain-derived neurotrophine fa
ctor)、ＣＮＴＦ(ciliary neurotrophic factor)、ＧＤ
ＮＦ(glial cell line-derived neurotrophic facto
r)、ＮＴ−３(neurotrophin 3)、ＮＴ−４(neurotrophi
n 4)、ＮＴ−５(neurotrophin 5)、ｂＦＧＦ(basic fib
roblast growth factor)、ａＦＧＦ(acidic fibroblast
growth factor)、ＥＦＧ(epithelial growth factor)
等が挙げられ、神経系に作用するサイトカインとして、
インターフェロンα(interferon α)、インターフェロ
ンβ(interferon β)、インターフェロンγ(interferon
γ)、ＩＬ−１(interleukin 1)、ＩＬ−２(interleuki
n 2)、ＩＬ−３(interleukin 3)、ＩＬ−４(interleuki
n 4)、ＩＬ−５(interleukin 5)、ＩＬ−６(interleuki
n 6)、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ(granulocyte macrophage
colony stimulating factor)、Ｇ−ＣＳＦ(granulocyte
colony stimulating factor)、Ｍ−ＣＳＦ(macrophage
colony stimulating factor)、ＰＤＧＦ(platelet-der
ivedgrowth gactor)等、またホルモンあるいは神経伝達
物質の拮抗薬及び作用薬として、ソマトスタチン(somat
ostatin)、オキシトシン(oxytocin)、バソプレッシン(v
asopressin)、グアラニン(guaranine)、ＶＩＰ（vasoac
tive intestinal polypeptide）、副腎皮質刺激ホルモ
ン(adorenocorticotrophic hormone)、コレシストキニ
ン(cholecystokinin: CCK)、サブスタンスＰ(substance
P)、ボンベシン(bombesin)、モチリン(motilin)、グリ
センチン(glicentin)、グルカゴン(glucagon)、グルカ
ゴン様ペプチド(glucagon-like peptide)、ドーパミン
βヒドロキシラーゼ(dopamine decarboxylase)、トリコ
サンチン(tricosanthin)、アデノシン等が挙げられる。
さらに神経伝達物質として、ドーパミン(dopamine)、γ
−アミノ酪酸(GABA)、アセチルコリン、セロトニン、ノ
ルアドレナリン等、さらに各種の神経ペプチド等が挙げ
られる。AIDS治療薬としては、抗ＨＩＶ活性を有する核
酸誘導体が挙げられ、核酸誘導体としては、アジドチミ
ジン(azidethymidine: AZT)や、ジデオキシイノシン(di
deoxyinosine)、ジデオキシシトシン(dideoxycytosine)
等が挙げられる。

【００２０】上記した医薬活性成分はいずれもその誘導
体も本発明における医薬活性成分として用いることがで
きる。

【００２１】ＨＰと医薬活性成分との結合体の形成は、
一般にタンパク質と医薬活性成分とを結合する方法とし
て公知の方法によりＨＰと医薬活性成分とを結合させる
ことにより行うことができる。ＨＰに対する医薬活性成
分の結合の様式や部位は、生じた結合体が血液から脳内
へ移行できる限り、制限されない。血液から脳内に移行
する能力は後記実施例に記載したような方法によって評
価できる。ＨＰと医薬活性成分との結合は、具体的に
は、必要な場合は医薬活性成分の活性に影響を及ぼさな
い部位に適当な官能基を導入し適当な架橋剤等を用いる
ことにより行うことができる。架橋剤としては、ペプチ
ド結合を形成するものとして例えばＥＤＡＣ(1-ethyl-3
-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)等が挙げら
れ、ジスルフィド結合を形成するものとしてＳＰＤＰ(N
-succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionate)、シスタ
ミン(cystamine)等が挙げられるがこれに限られるもの
ではない。また、スペーサー等の機能が付加されたタン
パク質架橋剤を用いてもよく、グルタルアルデヒド(glu
taraldehyde)、ＤＩＰＳ(4,4'-diisothiocyanostylbene
-2,2'-disulfonic acid)、ＥＭＣＳ(N-(E-maleimidocap
royloxy)succinimide)、ＧＭＢＳ(N-(gamma-maleimidob
utyloxy)succinimide)、ＤＳＰ(dithiobis(succinimidy
lpropionate)、ＤＴＢＰＡ(4,4'-dithiobis-phenylazai
de)等が挙げられる。また、ＨＰ複合体の形成と医薬活
性成分の結合の順序も制限されない。例えば、(1)HP-20
cとHP-55との複合体に医薬活性成分を結合させる、(2)H
P-20cに医薬活性成分を結合させ、次いでHP-55と会合さ
せる、(3)HP-55に医薬活性成分を結合させ、次いでHP-2
0cと会合させるなどのいずれでもよい。さらに、医薬活
性成分は、HP-20c又はその部分ペプチドとHP-55又はそ
の部分ペプチドとのいずれか一方に結合していてもよい
し、両方に結合していてもよい。また、ＨＰ又はその部
分ペプチドに対する医薬活性成分の結合部位について
は、ＨＰ−２０ｃとＨＰ−５５は、後述する通り複合体
を形成しているため、ＨＰ−２０ｃ又はその部分ペプチ
ドとＨＰ−５５又はその部分ペプチドとの結合を阻害し
ない部位で、できるだけタンパク質の立体構造上表面に
露出していない部位が好ましい。また、ＨＰ−２０ｃ又
はその部分ペプチドとＨＰ−５５又はその部分ペプチド
との結合部位の近傍が好ましい。具体的には、例えばＨ
Ｐ−２０ｃの場合、配列番号３の７１ＣｙｓよりＣ末端
側が好ましく、さらには１１１Ｃｙｓは遊離スルフドリ
ル基であるので特に好ましい。ＨＰ−５５では、例えば
配列番号４の２７８ＭｅｔよりＣ末端側が好ましく、３
７９Ｇｌｎから４１３Ｇｌｎまでがさらに好ましい。結
合させる医薬活性成分とＨＰ又はその部分ペプチド分子
との割合については、ＨＰ又は部分ペプチドの活性基の
全てにタンパク質架橋剤等を用いて医薬活性成分を結合
させてもよいし、活性基の一部に結合させてもよい。あ
る部位特異的活性基に医薬活性成分を結合させたい場合
には、他の部位の同一の活性基をマスキングすること等
により行うことができる。また、複数の種類の医薬活性
成分を一つのＨＰ又はその部分ペプチドに結合させるこ
ともできる。このようにして結合させて作成した医薬組
成物は、これを後記実施例に記載したような方法によっ
て脳内への移行能力を評価したり、医薬活性成分の活性
や結合体そのものがアクティブフォームを有しているか
等をそれ自体既知の方法により評価することにより、本
発明の医薬組成物として最もよいものをスクリーニング
することができる。

【００２２】また、医薬活性成分と後述する標識化に使
用される物質とを一つのＨＰ又はその部分ペプチドに結
合させたもの、医薬活性成分と標識化に使用される物質
のそれぞれを、ＨＰ複合体を形成する別個のタンパク質
又はその部分ペプチドに結合させたものを共に含むも
の、及び、これらを組み合わせたものも本発明の医薬組
成物に含まれ得る結合体に包含される。

【００２３】本発明医薬組成物は、さらに、甲状腺ホル
モン類又はその分泌を促進する物質を含むことが好まし
い。本明細書において、甲状腺ホルモン類とは、甲状腺
ホルモン、甲状腺ホルモン様作用を有する物質、甲状腺
ホルモン構造類似体等を意味する。

【００２４】甲状腺ホルモンは、好ましくは、チロキシ
ン又はトリヨードサイロニンである。

【００２５】甲状腺ホルモン様作用を有する物質、及
び、甲状腺ホルモン構造類似体は、本発明においての甲
状腺ホルモンと同等の作用を有する物質を意味し、ＨＰ
と医薬活性成分との結合体を血液から脳内へ移行させる
作用を有する限り、特に限定されない。

【００２６】甲状腺ホルモン類の分泌を促進する物質と
しては、甲状腺による甲状腺ホルモン産生・分泌を促す
物質が挙げられ、具体例としては、甲状腺刺激ホルモン
（ＴＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲ
Ｈ）などが挙げられる。

【００２７】本発明医薬組成物は、医薬結合体及び甲状
腺ホルモン類の他に、医薬的に許容可能な担体等を含ん
でいてもよい。

【００２８】本発明医薬組成物の投与方法及び投与量は
後記の本発明送達方法に関して説明する医薬結合体の投
与方法及び投与量に準じる。

【００２９】本発明医薬組成物の剤形、医薬結合体の含
有量などは、投与方法及び投与量などに従って、当業者
が適宜決定できる。本発明医薬組成物が医薬結合体と甲
状腺ホルモン類又はその分泌を促進する物質とを含む場
合には、それらは必ずしも混合されている必要はなく、
それらが個別に収納されて一体にされているものも本発
明医薬組成物に包含される。

【００３０】＜２＞本発明試薬 本発明試薬は、冬眠特異的タンパク質と標識化物質との
結合体（以下、これを単に「標識化結合体」ということ
がある）を含み、脳造影剤や、脳疾患などの診断、脳機
能解明のための探索などに用いられる。

【００３１】冬眠特異的タンパク質及び冬眠特異的タン
パク質複合体は、上記本発明医薬組成物について記載さ
れたものと同様である。

【００３２】標識化物質とは、通常標識化に使用される
物質により標識された物質であればいかなるものでもよ
い。標識化に使用される物質としては、蛍光物質、放射
性同位体元素、色素、ビオチンなどがあげられる。ま
た、抗体なども用いることができる。

【００３３】冬眠特異的タンパク質と標識化物質との結
合体の形成方法、順序、及び標識化結合体の構成につい
ては、上記本発明医薬組成物の医薬結合体について記載
されたものと同様である。

【００３４】本発明試薬は、さらに甲状腺ホルモン類又
はその分泌を促進する物質を含むことが好ましい。甲状
腺ホルモン類又はその分泌を促進する物質については、
上記本発明医薬組成物について記載されたものと同様で
ある。

【００３５】本発明試薬は、標識化結合体及び甲状腺ホ
ルモン類又はその分泌を促進する物質の他に、通常注射
剤などに用いられる溶媒や、生理学及び製剤学的に許容
可能な担体などを含んでいてもよい。

【００３６】本発明試薬の投与方法及び投与量は、探索
の目的などに応じ適宜選択することができる。

【００３７】本発明試薬の成形、標識化結合体の含有量
などは、投与方法、投与量、及び、探索の目的などに従
って、当業者が適宜選択できる。本発明試薬が、標識化
結合体と甲状腺ホルモン類又はその分泌を促進する物質
とを含む場合には、それらは必ずしも混合されている必
要はなく、それらが個別に収納されて一体にされている
ものも本発明試薬に包含される。

【００３８】＜３＞本発明送達生起剤 本発明送達生起剤は、甲状腺ホルモン類又はその分泌を
促進する物質を有効成分とし、脳内移行性タンパク質又
は脳内移行性タンパク質と医薬活性成分又は標識化物質
との結合体の脳内への送達を生起するものである。

【００３９】甲状腺ホルモン類又はその分泌を促進する
物質、医薬活性成分及び標識化物質は、上記本発明医薬
組成物及び本発明試薬について記載したのと同様であ
る。

【００４０】脳内移行性タンパク質とは、甲状腺ホルモ
ン類又はその分泌を促進する物質の投与により血液から
脳内へ移行し得るタンパク質を意味する。血液から脳内
へ移行する能力は後記実施例に記載したような方法によ
って、甲状腺ホルモン又はその分泌を促進する物質の投
与の有無により、脳血液内又は脳脊髄液内の脳内移行性
タンパク質の量を、後記実施例に記載した方法により測
定することなどにより評価できる。

【００４１】脳内移行性タンパク質の例としては、ＨＰ
が挙げられる。脳内移行性タンパク質は、脳内への移行
が妨げられない限り、部分ペプチドであってもよい。脳
内移行性タンパク質と医薬活性成分又は標識化物質との
結合体の形成は、上記本発明医薬組成物及び本発明試薬
の説明において、ＨＰ又はその部分ペプチドと医薬活性
成分又は標識化物質との結合体の形成に関し説明したの
と同様にして行うことができる。

【００４２】本発明送達生起剤は、甲状腺ホルモン類又
はその分泌を促進する物質の他に、生理的又は製剤学的
に許容可能な担体等を含んでいてもよい。本発明送達生
起剤の投与方法及び投与量は後記の本発明送達方法に関
して説明する甲状腺ホルモン類又はその分泌を促進する
物質の投与方法及び投与量に準じる。具体的には本発明
送達生起剤の剤形、甲状腺ホルモン類又はその分泌を促
進する物質の含有量などは、投与方法、投与量または探
索の目的などに従って、当業者が適宜決定できる。

【００４３】＜４＞本発明送達方法 本発明送達方法は、医薬活性成分又は標識化物質をＨＰ
に結合させて結合体を得、この医薬結合体又は標識化結
合体を甲状腺ホルモン類又はその分泌を促進する物質と
ともに投与することにより、医薬活性成分又は標識化物
質を脳内に送達する方法である。

【００４４】医薬活性成分、標識化物質、ＨＰ及び甲状
腺ホルモン類又はその分泌を促進する物質は、本発明医
薬組成物及び本発明試薬について説明したのと同様であ
る。

【００４５】医薬活性成分又は標識化物質のＨＰへの結
合は、本発明医薬組成物及び本発明試薬の説明におい
て、ＨＰと医薬活性成分又は標識化物質との結合体の形
成に関し説明したのと同様にして行うことができる。

【００４６】本発明送達方法において、「医薬結合体又
は標識化結合体を甲状腺ホルモン類又はその分泌を促進
する物質とともに投与する」とは、結合体の脳内への移
行が生起するのに十分な医薬結合体又は標識化結合体及
び甲状腺ホルモン類又はその分泌を促進する物質のレベ
ルが達成されるように両方を投与することを意味し、医
薬結合体又は標識化結合体と甲状腺ホルモン類又はその
分泌を促進する物質とを同時に投与することに限定され
るものではない。従って、医薬結合体又は標識化結合体
の投与と甲状腺ホルモン類又はその分泌を促進する物質
の投与は、いずれを先に行ってもよく、また、両方を同
時に行ってもよい。好ましくは、甲状腺ホルモン類又は
その分泌を促進する物質の投与を先に行う。

【００４７】医薬結合体又は標識化結合体の投与方法は
特に制限されないが、血中に投与することが好ましい。
血中へは、例えば、静脈内注射により投与することがで
きる。投与量は、投与対象の体重、年齢及び状態、医薬
活性成分又は標識化物質の種類、探索の目的などによ
り、当業者であれば適宜定めることができる。

【００４８】甲状腺ホルモン類又はその分泌を促進する
物質の投与方法も特に限定されず、甲状腺ホルモン類又
はその分泌を促進する物質を医薬結合体又は標識化結合
体の血液から脳内への移行を生じさせるレベルに維持で
きれば、特に限定されない。例えば、上記医薬結合体と
共に医薬組成物として静脈内注射することもできるし、
単独で静脈内又は腹腔内投与することができる。甲状腺
ホルモン類又はその分泌を促進する物質の投与量は、甲
状腺ホルモン類又はその分泌を促進する物質の種類、投
与対象の体重、年齢及び状態などにより、当業者であれ
ば適宜定めることができる。

【００４９】なお、本発明は下記の知見に基づくもので
ある。ＨＰを産生しない非冬眠動物のラットに、ＨＰを
含むシマリス血漿（ＨＰ含有血漿）を静脈内投与した
後、血液中にＨＰを検出することができたが、脳脊髄液
中にＨＰを検出することはできなかった。ラットにチロ
キシン（250μg/kg）を毎日１週間投与した後、又は、
チロキシン（100μg/kg）を投与した１日後に、チロキ
シン処置前と同量のＨＰ含有血漿を投与することによ
り、投与から２〜３時間以内に脳脊髄液中にＨＰの増加
を検出できた。

【００５０】また、チロキシン処置（10〜250μg/kg/
日）により脳内のＨＰが増加したシマリスの脈絡叢上皮
細胞を抗HP-20c抗体を用いて免疫組織化学的に染色した
結果、細胞質に抗HP-20c抗体に対する強い陽性反応を検
出した。このことから、血中のＨＰが血液脳脊髄液関門
である脈絡叢を介して脳脊髄液中に輸送されることが示
された。

【００５１】以上から、ラットにとって異種タンパク質
であるＨＰが、ラットにおいて血液脳脊髄液関門を介し
て血中から脳脊髄液（脳内）に輸送されるという予期せ
ぬ結果が得られた。

【００５２】輸送に有効なＨＰの構造を決定するため、
複合体形成能を保持したHP-20c及びHP-55の構造を調べ
た。その結果、HP-20cでは、N末端側の約４０残基と、C
末端側の約１０残基のアミノ酸（図３の枠で囲まれた部
分）が限定分解されてもHP-55との会合能が保持されて
おり、HP-55ではMet255（図３に示すアミノ酸配列にお
けるアミノ酸番号（配列番号４ではアミノ酸番号279に
相当））からC末端側の約１５０残基（図３の枠で囲ま
れた部分以外）が存在すればHP-20cとの会合が可能であ
った。このことから、HP-20cとHP-55は、上記の構造を
持っていれば複合体を形成できることが判明した。従っ
て、血液から脳内への輸送にＨＰの全体の構造の維持は
必須ではないと考えられるので、ＨＰは、血液から脳内
への移行に影響を与えずに改変可能であると判断され
る。

【００５３】以上の結果より、ＨＰと医薬活性成分又は
標識化物質との結合体の血中への投与と甲状腺ホルモン
類の投与によって血液から脳内へ医薬活性成分又は標識
化物質を輸送する系が確立された。

【００５４】ＨＰと甲状腺ホルモン類又はその分泌を促
進する物質とを用いる本発明の方法で、任意の医薬活性
成分又は標識化物質などの脳内投与を人為的に制御でき
る。すなわち、ＨＰに希望の医薬活性成分又は標識化物
質を結合させ血中に投与し、甲状腺ホルモンによる血液
から脳内への輸送能力の活性化を介して、任意の特定時
期に任意の医薬活性成分又は標識化物質を脳内に輸送す
ることが可能になる。また、ＨＰは血液中で複合体を形
成し、脳内では解離するので、この方法により送達され
る医薬活性成分などは、血中に存在する場合には効果を
発揮せず、脳内でのみ効果を発揮するようにすることも
できる。

【００５５】

【実施例】以下に、実施例によってさらに具体的に説明
する。

【００５６】

【実施例１】（１）血中のＨＰのラット脳脊髄液への輸
送 １２週齢のラットに、非冬眠期の成獣シマリスから採取
した血漿（HP-20cとHP-55の複合体を含む。以下、ＨＰ
含有血漿という。）0.4 mlを静脈内投与した。投与の２
〜３時間後に血液及び脳脊髄液を採取し、これらの試料
中のＨＰを、抗ＨＰ抗体（HP-20、HP-25、HP-27及びHP-
55のそれぞれに対するウサギ抗体）を用いたウェスタン
ブロット法により検出した。血漿0.13μl、脳脊髄液20
μlを解析に用いた。この結果、血液中にＨＰを検出す
ることができたが、脳脊髄液中にＨＰを検出することは
できなかった（図１のａ）。ラットにチロキシン（250
μg/kg）を毎日１週間腹腔内投与した後、上記と同様に
ＨＰ含有血漿を投与し、血液及び脳脊髄液中のＨＰを検
出した。この結果、投与から２〜３時間以内に脳脊髄液
中にＨＰの増加を検出できた。２時間後の結果を図１の
ｂに示す。また、ラットにチロキシン（100μg/kg）を
１回腹腔内投与した１日後、上記と同様にＨＰ含有血漿
を投与した場合も、同様の結果が得られた。

【００５７】（２）輸送の機構 チロキシンを10〜250μg/kg/日の用量で６日間、非冬眠
期の成獣シマリスに腹腔内投与した。このチロキシン処
置シマリスから脳内の脈絡叢上皮細胞を採取した。この
試料を抗HP-20c抗体を用いて免疫組織化学的に染色し
た。この結果、細胞質に抗HP-20c抗体に対する強い陽性
反応を検出した（図２）。このことから、血中のＨＰが
血液脳脊髄液関門である脈絡叢を介して脳脊髄液中に輸
送されることが示された。

【００５８】（３）ＨＰの改変可能部位の決定 HP-20c及びHP-55の構造において複合体形成能を有する
部位を調べた。生理食塩水（phosphate buffered salin
e、PBS）に溶解したHP-20cとHP-55の複合体を重量比
２：１でコラゲナーゼと混合し、37℃で３時間インキュ
ベートし、消化物をゲルろ過クロマトグラフィー（GPC)
分離し、限定分解されたＨＰ（Ｃ−ＨＰ）を単離した。
4 mgのＣ−ＨＰを1 mgのリシルエンドペプチダーゼ(lys
ylendopeptidase)と混和し、37℃で５時間インキュベー
トし、さらに限定分解した後、分解物をGPC分離し、複
合体を形成している限定分解されたＨＰを単離した。得
られた限定分解ＨＰを4 M尿素存在下、50 mMトリス塩酸
緩衝液(pH 8.5)中で、再度リシルエンドペプチダーゼに
より消化し、消化物を逆相HPLCにて分離し、各ピークを
分取した後、同様に作製したHP-20c及びHP-55のペプチ
ドマップと比較し、各ピークの帰属を行い、複合体形成
能を有する部位を決定した。

【００５９】その結果、HP-20cでは、N末端側の約４０
残基と、C末端側の約１０残基のアミノ酸（図３の枠で
囲まれた部分）が限定分解されてもHP-55との会合能が
保持されており、HP-55ではMet255（図３に示すアミノ
酸配列におけるアミノ酸番号（配列番号４ではアミノ酸
酸番号279に相当））からC末端側の約１５０残基（図３
の枠で囲まれた部分以外）が存在すればHP-20cとの会合
が可能であった。このことから、HP-20cとHP-55は、図
４に記載の部分構造を持っていれば複合体を形成できる
ことが判明した。

【００６０】以上の結果より、HP-20cとHP-55を用い、
血液から脳内への移行に影響しない形態で医薬活性成分
又は標識化物質などを結合させた結合体を作成し、この
結合体をラットの静脈内に投与することにより、チロキ
シン処置によって血液から脳内へ医薬活性成分などを輸
送する系が確立された。

【００６１】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
医薬活性成分が脳内に容易に移行し得る医薬組成物、及
び、標識化物質が脳内に容易に移行し得る試薬が提供さ
れる。これらは、脳疾患の治療、予防又は診断などに有
効な手段となる。さらに本発明によれば、医薬活性成分
や標識化物質の脳内への送達を、血中への投与により容
易に行うことができる。また、これにより、生体レベル
で脳内に各種物質を送達することが容易になり、薬物の
脳神経系に対する効果や脳機能の解明などの研究、脳神
経系に有効な新薬の開発などのために、新たな手法が提
供される。

【００６２】

【配列表】 <110> 財団法人神奈川科学技術アカデミー(Kanagawa Academy of Science and T echnology) 三菱化学株式会社(Mitsubishi Chemical Corporation) <120> 医薬組成物、試薬、及び、医薬活性成分又は標識化物質の脳内への送達法 <130> P-8577 <150> JP 2000-41303 <151> 2000-02-18 <160> 4 <210> 1 <211> 215 <212> PRT <213> Tamias asiaticus <400> 1 Met Tyr Glu Ala Gly Lys Arg Ala Ser Phe Met Gly Gly Ala Gly Ile 1 5 10 15 Trp Ile Leu Ala Leu Ser Val Leu Met His Val Val Cys Ser Glu Thr 20 25 30 Gln Gly Asn Pro Glu Ser Cys Asn Val Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro 35 40 45 Gly Met Arg Gly Pro Pro Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Pro Gly 50 55 60 Trp Asn Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Met 65 70 75 80 Thr Val Asn Cys His Ser Lys Gly Thr Ser Ala Phe Ala Val Lys Ala 85 90 95 Asn Glu Leu Pro Pro Ala Pro Ser Gln Pro Val Ile Phe Lys Glu Ala 100 105 110 Leu His Asp Ala Gln Gly His Phe Asp Leu Ala Thr Gly Val Phe Thr 115 120 125 Cys Pro Val Pro Gly Leu Tyr Gln Phe Gly Phe His Ile Glu Ala Val 130 135 140 Gln Arg Ala Val Lys Val Ser Leu Met Arg Asn Gly Thr Gln Val Met 145 150 155 160 Glu Arg Glu Ala Glu Ala Gln Asp Gly Tyr Glu His Ile Ser Gly Thr 165 170 175 Ala Ile Leu Gln Leu Gly Met Glu Asp Arg Val Trp Leu Glu Asn Lys 180 185 190 Leu Ser Gln Thr Asp Leu Glu Arg Gly Thr Val Gln Ala Val Phe Ser 195 200 205 Gly Phe Leu Ile His Glu Asn 210 215 <210> 2 <211> 215 <212> PRT <213> Tamias asiaticus <400> 2 Met Pro Ala Gln Arg Gly Gly Ala Leu Ser Met Gly Ala Ala Gly Phe 1 5 10 15 Trp Ile Leu Val Leu Ser Ile Thr Ser Ala Leu Ala Asp Ser Asn Asn 20 25 30 Gln Gly Asn Ser Glu Pro Cys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 35 40 45 Gly Ile Pro Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Ala Leu Gly Pro Pro Gly 50 55 60 Pro Pro Gly Val Pro Gly Ile Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Asp 65 70 75 80 Val Glu Lys Cys Ser Ser Arg Pro Lys Ser Ala Phe Ala Val Lys Leu 85 90 95 Ser Glu Arg Pro Pro Glu Pro Phe Gln Pro Ile Val Phe Lys Glu Ala 100 105 110 Leu Tyr Asn Gln Glu Gly His Phe Asn Met Ala Thr Gly Glu Phe Ser 115 120 125 Cys Val Leu Pro Gly Val Tyr Asn Phe Gly Phe Asp Ile Arg Leu Phe 130 135 140 Gln Ser Ser Val Lys Ile Arg Leu Met Arg Asp Gly Ile Gln Val Arg 145 150 155 160 Glu Lys Glu Ala Gln Ala Asn Asp Ser Tyr Lys His Ala Met Gly Ser 165 170 175 Val Ile Met Ala Leu Gly Lys Gly Asp Lys Val Trp Leu Glu Ser Lys 180 185 190 Leu Lys Gly Thr Glu Ser Glu Lys Gly Ile Thr His Ile Val Phe Phe 195 200 205 Gly Tyr Leu Leu Tyr Gly Lys 210 215 <210> 3 <211> 196 <212> PRT <213> Tamias asiaticus <400> 3 Met Thr Asp Val Trp Arg Leu Ala Ile Phe Val Leu Met Val Asn Val 1 5 10 15 Leu Asn Asp Gln Val Ser Cys Ser Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Tyr 20 25 30 Pro Gly Val Pro Gly Val Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Gly Ala Ala Gly Arg Pro Gly Asp Pro Gly Pro Lys Gly Pro Ser Val 50 55 60 Lys Cys Pro Cys Arg Glu Arg Ser Ala Phe Thr Val Lys Phe Ser Gly 65 70 75 80 Arg Leu Pro Pro Pro Ser Glu Pro Val Val Phe Thr Glu Val Leu Tyr 85 90 95 Asn Thr Gln Arg Asp Leu Lys Glu Ser Thr Gly Val Phe Asn Cys Val 100 105 110 Glu Pro Gly Asn Tyr His Phe Ser Phe Asp Val Glu Leu Tyr His Cys 115 120 125 Lys Val Lys Ile Gly Leu Met Lys Asn His Ile Gln Val Met Glu Lys 130 135 140 His Gln Leu Ser Lys Asn Glu Tyr Glu Asn Ala Ser Gly Ala Met Ile 145 150 155 160 Met Pro Leu Arg Gln Gly Asp Lys Val Trp Leu Glu Ala Asp Val Glu 165 170 175 Thr Glu Glu Pro Asp Gln Ala Lys Val Val Ile Tyr Phe Ser Gly Phe 180 185 190 Leu Ile Ser Ser 195 <210> 4 <211> 413 <212> PRT <213> Tamias asiaticus <400> 4 Met Pro Ser Ser Ile Ser Trp Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Gly Pro Gly Ser Leu Ala Gln Asp Ala Gln Glu Thr Glu Ala 20 25 30 Ser Lys Gln Asp Gln Glu His Pro Ala Ser His Arg Ile Ala Pro His 35 40 45 Leu Ala Glu Phe Ala Leu Ser Leu Tyr Arg Val Leu Ala Arg Gln Ser 50 55 60 Asn Thr Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Ser Ala Leu 65 70 75 80 Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Gly Asp Thr His Thr Gln Ile Leu 85 90 95 Glu Gly Leu Asp Phe Asn Leu Thr Glu Met Ala Glu Ala Asp Ile His 100 105 110 Gln Gly Phe Gln Asn Leu Leu Gln Thr Leu Asn Arg Pro Asn Thr Gln 115 120 125 Leu Gln Leu Thr Ser Gly Asn Val Leu Phe Ile His Gln Asn Leu Lys 130 135 140 Leu Leu Asp Lys Phe Leu Glu Asn Ile Lys Ser Leu Tyr His Ser Gly 145 150 155 160 Ala Phe Pro Thr Asn Phe Thr Asn Thr Glu Glu Ala Arg Gln Gln Ile 165 170 175 Asn Ser Tyr Val Glu Gln Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Glu Leu Val 180 185 190 Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Leu Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe 195 200 205 Phe Lys Gly Lys Trp Leu Lys Pro Phe Asn Val Lys Asn Ile Arg Glu 210 215 220 Glu Asp Phe His Val Asp Glu Ala Thr Thr Val Arg Val Pro Met Met 225 230 235 240 Tyr Arg Val Gly Met Phe Pro Val His Tyr Cys Arg Thr Leu Ala Ser 245 250 255 Leu Val Leu Gln Met Asp Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Leu 260 265 270 Leu Pro Asp Lys Gly Lys Met Gln His Leu Glu Asp Thr Ile Ser Thr 275 280 285 Glu Ile Leu Ser Lys Leu Leu Lys Asp Arg Gln Thr Ser Lys Tyr Gln 290 295 300 Val Tyr Phe Pro Arg Val Ser Ile Ser Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Asp 305 310 315 320 Val Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Arg Val Phe Ser Arg Val Ala Asp 325 330 335 Leu Ser Gly Val Thr Glu Asp Ala Pro Leu Thr Val Ser Lys Val Leu 340 345 350 His Lys Ala Val Leu Asp Met Asp Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ala Gly 355 360 365 Gly Thr Val Leu Gly Ala Glu Ala Met Leu Gln Ala Pro Ile Met Lys 370 375 380 Phe Asp Arg Pro Phe Leu Val Val Ile Tyr Glu His Asn Thr Lys Ser 385 390 395 400 Pro Leu Phe Val Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Gln 405 410

【図面の簡単な説明】

【図１】 チロキシン処置ラットへのシマリス血漿投与
後の血中及び脳脊髄液中のＨＰを示す、HP-22、HP-25、
HP-27及びHP-55のそれぞれに対するウサギ抗体を用いた
ウェスタンブロットの結果を示す。

【図２】 チロキシン処置シマリスの脳の脈絡上皮細胞
内に取り込まれたＨＰの免疫組織化学的解析の結果を示
す。

【図３】 HP-20c及びHP-55の構造を示す。図中、二つ
のＣを結ぶ線は、それらの間でシスチンが形成されてい
ることを示し、ＣＨＯは糖鎖の付加を示す。また、枠で
囲んだ部分は、欠失しても、HP-20cとHP-55との会合能
が維持される部分を示す。図に示したHP-27、HP-25、HP
-20及びHP-55の構造は、それぞれ、配列番号１に示すア
ミノ酸配列のアミノ酸番号31〜215、配列番号２に示す
アミノ酸配列のアミノ酸番号29〜215、配列番号３に示
すアミノ酸配列のアミノ酸番号24〜196、及び、配列番
号４に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号25〜413に相当
する。

【図４】 会合能を保持するHP-20c及びHP-55の部分構
造を示す。図中、二つのＣを結ぶ線は、それらの間でシ
スチンが形成されていることを示す。また、ＳＨは遊離
スルフヒドリル基、ＣＨＯは糖鎖の付加を示す。なお、
図に示したHP-27、HP-25、HP-20及びHP-55のの部分構造
は、それぞれ、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ
酸番号76〜205、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミ
ノ酸番号76〜205、配列番号３に示すアミノ酸配列のア
ミノ酸番号61〜186、配列番号４に示すアミノ酸配列の
アミノ酸番号279〜413に相当する。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 冬眠特異的タンパク質と医薬活性成分と
   の結合体を含む医薬組成物。
2. 【請求項２】 さらに甲状腺ホルモン類又はその分泌を
   促進する物質を含む請求項１に記載の医薬組成物。
3. 【請求項３】 冬眠特異的タンパク質が、ＨＰ−２０ｃ
   とＨＰ−５５との複合体である請求項１又は２に記載の
   医薬組成物。
4. 【請求項４】 冬眠特異的タンパク質が、ＨＰ−２０ｃ
   の部分ペプチドとＨＰ−５５との複合体、ＨＰ−２０ｃ
   とＨＰ−５５の部分ペプチドとの複合体、又は、ＨＰ−
   ２０ｃの部分ペプチドとＨＰ−５５の部分ペプチドとの
   複合体である請求項１又は２に記載の医薬組成物。
5. 【請求項５】 医薬活性成分が、ＨＰ−２０ｃ又はその
   部分ペプチドとＨＰ−５５又はその部分ペプチドとのい
   ずれか一方又は両方に結合している請求項３又は４に記
   載の医薬組成物。
6. 【請求項６】 冬眠特異的タンパク質と標識化物質との
   結合体を含む試薬。
7. 【請求項７】 さらに甲状腺ホルモン類又はその分泌を
   促進する物質を含む請求項６に記載の試薬。
8. 【請求項８】 冬眠特異的タンパク質が、ＨＰ−２０ｃ
   とＨＰ−５５との複合体である請求項６又は７に記載の
   試薬。
9. 【請求項９】 冬眠特異的タンパク質が、ＨＰ−２０ｃ
   の部分ペプチドとＨＰ−５５との複合体、ＨＰ−２０ｃ
   とＨＰ−５５の部分ペプチドとの複合体、又は、ＨＰ−
   ２０ｃの部分ペプチドとＨＰ−５５の部分ペプチドとの
   複合体である請求項６又は７に記載の試薬。
10. 【請求項１０】 標識化物質が、ＨＰ−２０ｃ又はその
    部分ペプチドとＨＰ−５５又はその部分ペプチドとのい
    ずれか一方又は両方に結合している請求項８又は９に記
    載の試薬。
11. 【請求項１１】 甲状腺ホルモン類又はその分泌を促進
    する物質を有効成分とする、脳内移行性タンパク質又は
    脳内移行性タンパク質と医薬活性成分若しくは標識化物
    質との結合体の脳内への送達生起剤。
12. 【請求項１２】 医薬活性成分又は標識化物質を冬眠特
    異的タンパク質に結合させて結合体を得、結合体を甲状
    腺ホルモン類又はその分泌を促進する物質とともに投与
    することにより、医薬活性成分又は標識化物質を脳内に
    送達する方法。