JP2001348340A

JP2001348340A - ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤

Info

Publication number: JP2001348340A
Application number: JP2000171181A
Authority: JP
Inventors: Nobuaki Shinto; 信昭新堂; Hiroshi Terada; 央寺田; Masamichi Mori; 政道森; Nobuaki Amino; 伸明網野; Kinya Hayata; 錦矢早田; Koji Nagai; 浩二永井; Yoichi Hayakawa; 洋一早川; Kazuo Araya; 一男新家; Yuutai Masuoka; 優太升岡
Original assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-06-07
Filing date: 2000-06-07
Publication date: 2001-12-18

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】医薬、殊にヒストン脱アセチル化酵素(HDA
C)阻害剤の提供。【解決手段】一般式（１）で示されるデプシペプチ
ド化合物またはその製薬学的に許容される塩を有効成分
として含有する本発明のヒストン脱アセチル化酵素（HD
AC）阻害剤は、ヒストンのアセチル化の関与する疾患や
病態、殊に腫瘍や感染症、自己免疫疾患、皮膚病等の細
胞増殖性疾患の治療及び改善に有用である。（式中Ｒは、イソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基または
イソブチル基を意味する。）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する分野】本発明は医薬、殊に腫瘍や細胞増
殖性疾患の治療剤として有用なヒストン脱アセチル化酵
素(HDAC)阻害剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞の核内のDNAはヌクレオソームを基
本としたクロマチン構造を形成している。ヌクレオソー
ムはコアヒストン（ヒストンH2A, H2B, H3, H4それぞれ
2分子ずつから成る8量体）とDNAとが巻き付いた構造体
で、ヒストンN末端に存在する正電荷を帯びたリジン残
基は負電荷を帯びたDNAと電荷的に安定な状態を形成す
ることでヌクレオソームは高次に折り畳まれた状態で存
在している（Wolffe,A.P. et al Cell 84, 817-819, 19
96）。核内で遺伝子の転写反応が起こるためにはその構
造を解けた状態にして、様々な転写因子がDNAに接触で
きるようにすることが必要である。転写が抑制されてい
る遺伝子領域のヒストンはアセチル化の程度は少なく、
活発に転写が起こっている遺伝子領域のヒストンは強く
アセチル化されているといったように、ヒストンのアセ
チル化と転写活性化の関連性が以前より知られていた
（Hebbes,T.R. et al EMBO J. 7, 1395-1402, 1988、Gr
unstein,M. et al Nature 389, 349-352, 1997）。ヌク
レオソーム中のヒストンのリジン残基がアセチル化され
るとその正電荷は中和され、ヌクレオソーム構造が弛緩
することで様々な転写因子がDNAに接触できるようにな
り、転写が起こりやすくなると考えられている（Hong,
L.et al J.Biol.Chem. 268, 305-314, 1993）。

【０００３】ヒストンのアセチル化はヒストンアセチル
化酵素（ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(Histone
Acetyltransferase); HAT）とヒストン脱アセチル化酵
素（ヒストンデアセチラーゼ(Histone Deacetylase); H
DAC）とのバランスによって制御されていることが知ら
れており、近年、いくつかのHAT並びに HDACが同定され
その転写調節における重要性が報告されている（Ogryzk
o,V.V. et al Cell 87, 953-959, 1996、Brown,C.E. et
al Trends Biochem.Sci. 25(1), 15-19, 2000、Grozin
ger,C.M. et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96, 4868-487
3, 1999）。

【０００４】一方で、細胞周期停止、形質転換細胞の形
態正常化、分化誘導など多彩な作用を有する酪酸は、細
胞内に高アセチル化ヒストンを蓄積させ、HDAC阻害作用
を有することが以前より知られていた（Counsens,L.S.e
t al J.Biol.Chem. 254, 1716-1723, 1979）。また、微
生物代謝産物のトリコスタチンＡ（TSA）は細胞周期の
停止、分化誘導を示し（Yoshida,M. et al Cancer Res
47, 3688-3691, 1987、Yoshida,M. et al Exp.Cell Re
s 177, 122-131, 1988）、またアポトーシスを誘導する
ことが見出された。TSAは細胞内に高アセチル化ヒスト
ンを蓄積させ、部分精製したHDACを用いた検討からTSA
が強力なHDAC阻害剤であることが明らかとなった（Yosh
ida,M. et al J.Biol.Chem. 265, 17174-17179, 199
0）。

【０００５】他のHDAC阻害剤についても研究が進んでい
る。微生物代謝産物であるトラポキシン(TPX)は細胞増
殖を抑制し、v-sis形質転換細胞の形態を正常化する作
用が知られていたが（Itazaki,H. et al J.antibiotics
43(12), 1524-1534,1990）、後にHDAC阻害剤であるこ
とが明らかとなった（Kijima,M. et al J.Biol.Chem. 2
68, 22429-22435, 1993）。その阻害形式は不可逆的で
あることからこのトラポキシンを分子プローブとしてこ
れに結合するヒトHDACのクローニングも報告されている
（Taunton,J. et al Science 272 408-411, 1996）。そ
の他、Depudecin（Kwon,H.J. et al Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 95, 3356-3361, 1998）、フェニル酪酸（Warrel
l,R.P.Jr. et al J.Natl.Cancer Inst. 90(21), 1621-1
625, 1998）、FR-901228（Nakajima,H.et al Exp.Cell
Res. 241, 126-133,1998）、MS-27-275（Saito,A. et a
l Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4592-4597, 1999）
などの化合物がHDAC阻害作用を有することが報告されて
いる。

【０００６】HDAC阻害剤は、細胞周期停止、形質転換細
胞の形態正常化、分化誘導、アポトーシス誘導作用など
を有することから、抗腫瘍剤としての効果が期待されて
いる。また、細胞増殖性疾患の治療・改善薬として、例
えば感染症、自己免疫疾患、皮膚病（Darkin-Rattray,
S.J. et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93, 13143-13147,
1996）などの治療・改善薬、さらに遺伝子治療におけ
るベクター導入の効率化（Dion, L.D. et al Virology
231, 201-209, 1997）、導入遺伝子の発現亢進（Chen,
W.Y. et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94, 5798-5803, 1
997）など様々な応用も試みられており、有用な医薬と
なることが期待されている。既知のHDAC阻害剤のいくつ
かは医薬として開発が進められているが、今なお、活性
強度、安定性、体内動態や毒性などの更に改善された薬
剤の創製が切望されている。

【０００７】

【発明を解決しようとする課題】本発明は、HDACの関与
する疾患、殊に腫瘍や細胞増殖性疾患の予防若しくは治
療剤として有用なHDAC阻害剤の提供を目的とするもので
ある。

【０００８】

【課題を解決する方法】本発明者等は、天然に存在する
多くの微生物が産生する化合物につき、鋭意検討した結
果、シュードモナス属に属する新種の微生物を見いだ
し、該培養物から優れたヒト癌細胞に対する細胞傷害活
性及びＴＧＦ−β様作用を有する新規なデプシペプチド
化合物を単離し、先に特許出願を行った（PCT/JP00/001
10）。更にこれらの化合物の薬理作用を検討した結果、
これらの化合物が優れたHDAC阻害作用を有していること
を知見し、本発明を完成した。

【０００９】即ち、本発明は、下記一般式（Ｉ）で示さ
れるデプシペプチド化合物またはその製薬学的に許容さ
れる塩を有効成分として含有するHDAC阻害剤に関する。

【化２】（式中Ｒは、イソプロピル基、sec-ブチル基またはイソ
ブチル基を意味する。）

【００１０】以下、本発明につき詳述する。本発明デ
プシペプチド化合物またはその製薬学的に許容される塩
はシュードモナス属（Pseudomonas）に属する当該化合
物生産菌を栄養培地にて培養し、当該化合物を蓄積させ
た培養物から常法によって得られる。当該化合物の製造
方法において使用する微生物は、シュードモナス属に属
し当該化合物の生産能を有する微生物であればいずれも
用いることができる。このような微生物としては、例え
ば、長野県北佐久郡望月町で採集された土壌より分離さ
れたシュードモナス属に属する細菌シュードモナスエ
スピー (Pseudomonas sp.) Ｑ７１５７６株（工業技術
院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ
−６９４４号として寄託）を挙げることができる。本菌
株の菌学的性状は次の通りである。

【００１１】１）形態的性質本菌株は、グラム陰性の桿菌であり、極鞭毛により運動
性を有する。細胞の大きさは０．７〜０．９μｍ×１．
０〜１．４μｍである。胞子の形成は認められない。２）培養的性質肉汁寒天培地上で、薄茶色のコロニーを形成する。コロ
ニーは円形で表面はスムースである。肉汁液体培養で
は、培地表面に皮膜を形成し、培地全体が混濁した。肉
汁ゼラチン穿刺培養では、ゼラチンを液化した。リトマ
スミルクでの培養では，１週間培養後、凝固およびペプ
トン化は認められなかった。

【００１２】３）生理学的性質

【表１】

【００１３】

【表２】

【００１４】

【表３】

【００１５】以上の微生物学的性質をまとめると，本菌
株はグラム陰性好気性の桿菌で運動性を有する。生育温
度範囲は３〜３２℃で，オキシダーゼ試験，カタラーゼ
試験，ゼラチンの液化反応，クエン酸の利用性、無機窒
素源の利用性、アルギニン分解反応が陽性であり、Ｌ−
アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ―グルコース、Ｄ―
マンノースより酸を産生し、ＯＦテストの結果は酸化型
である。一方，硫化水素の生成，インドールの生成，Ｖ
Ｐ試験、硝酸塩の還元、脱窒反応の結果は陰性である。
なお、微生物は人工的に又は自然に変異を起こしやすい
ので、本発明において用いられるシュードモナスエス
ピー (Pseudomonas sp.)Ｑ７１５７６株は、天然から分
離された微生物の他に、これに紫外線、Ｘ線、化学薬剤
などで人工的に変異させたもの及びそれらの天然変異株
についても包含する。

【００１６】（製造方法）本発明化合物はシュードモナ
ス属に属し、本発明化合物生産能を有する微生物を培
養することによって得られる。培養は一般微生物の培養
方法に準じて行われる。培養に用いられる培地として
は、シュードモナスエスピーＱ７１５７６株が利
用する栄養源を含有する培地であればよく、合成培地、
半合成培地または天然培地が用いられる。培地に添加す
る栄養物として公知のものを使用できる。培地の組成
は、例えば炭素源としてはＤ−グルコース、Ｄ−マンノ
ース、Ｄ−フルクトース、イノシトール、Ｄ−マンニト
ール、Ｄ−ガラクトース、トレハロース、キサンチン、
デンプン、ブドウ糖、デキストリン、グリセリン、植物
油等が挙げられる。窒素源としては肉エキス、ペプト
ン、グルテンミール、綿実粕、大豆粉、落花生粉、魚
粉、コーンスチーブリカー、乾燥酵母、酵母エキス、塩
化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、尿酸その他の有機、無機の窒素源が用いられる。ま
た、金属塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシ
ウム、カルシウム、亜鉛、鉄、コバルトなどの硫酸塩、
硝酸塩、炭酸塩、リン酸塩などが必要に応じて添加され
る。さらに、必要に応じてメチオニン、システイン、シ
スチン、チオ硫酸塩、オレイン酸メチル、ラード油、シ
リコン油、界面活性剤などの生成促進化合物または消泡
剤を添加することもできる。

【００１７】培養条件としては好気的条件下で培養する
のが一般的に有利で、培養温度は３〜３２℃（上記生理
学的性質の記載参照）の範囲、好ましくは２０〜２５℃
付近で行われる。培地のｐＨは約４．５〜９、好ましく
は約５〜７．５の範囲に調整すると好結果が得られる。
培養期間は培地の組成、温度条件に応じて適宜設定され
るが、通常１〜７日程度、好ましくは２〜４日程度であ
る。培養物より目的とする本発明化合物を単離するに
は、微生物が産生する代謝産物に用いる通常の抽出、精
製の手段が適宣利用できる。例えば培養化合物中の該化
合物は培養液をそのままか、又は遠心分離あるいは培養
物に濾過助剤を加えて濾過して得られた培養液に酢酸エ
チル等の水と混和しない有機溶剤を加えて抽出する。ま
た、培養液を適宜の担体に接触させ、濾液中の生産化合
物を吸着させ、次いで適当な溶媒で溶出することにより
該化合物を抽出することができる。例えば、アンバーラ
イトＸＡＤ−２、ダイヤイオンＨＰ−２０、ダイヤイオ
ンＣＨＰ−２０、又はダイヤイオンＳＰ−９００のよう
な多孔性吸着樹脂に接触させて該化合物を吸着させる。
次いでメタノール、エタノール、アセトン、ブタノー
ル、アセトニトリル又はクロロホルム等の有機溶媒を単
独若しくは混合した溶媒を、又は当該溶媒と水の混合液
を用いて該化合物を溶出させる。このときの有機溶媒の
混合比率を低濃度より段階的に又は連続的に高濃度まで
上げていくことにより、該化合物の含まれる比率のより
高い画分を得ることができる。酢酸エチル、クロロホル
ム等の有機溶媒で抽出する場合には、培養濾液にこれら
の溶媒を加え、良く振盪し、該化合物を抽出する。次
に、上記の各操作法を用いて得た該化合物含有画分は、
シリカゲル、ＯＤＳ等を用いたカラムクロマトグラフィ
ー、遠心液々分配クロマトグラフィー、ＯＤＳを用いた
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の定法によ
り、さらに純粋に分離精製することができる。一方、Ｔ
ＧＦ−β様作用等を指標として、適当な溶剤に対する溶
解性及び溶解度の差等を利用する一般の生理活性化合物
の製造に用いられる手段によって、分離、精製すること
もできる。これらの方法は必要に応じて単独に用いら
れ、又は任意の順序に組合せ、反復して適用できる。

【００１８】本発明デプシペプチド化合物の製薬学的に
許容される塩は、無機若しくは有機塩基との塩であり，
製薬学的に許容しうる塩が好ましい。これらの塩として
は，具体的にはナトリウム，カリウム，マグネシウム，
カルシウム，アルミニウムなど無機塩基，メチルアミ
ン，エチルアミン，エタノールアミンなどの有機塩基，
リジン，オルニチンなどの塩基性アミノ酸との塩等を挙
げることができる。また、本発明化合物は不斉炭素原子
及び二重結合を有するので、これに基づく立体異性体
（ラセミ体、光学異性体、ジアステレオマー等）及び幾
何異性体（シス体又はトランス体）が存在する。従って
本発明化合物は、これらの立体異性体又は幾何異性体の
混合物もしくは単離されたものを包含する。さらに、本
発明は、当該化合物の水和物または各種溶媒和物を、又
は当該化合物の結晶多型も包含する。

【００１９】以下に本発明のHDAC阻害剤の製剤化法及び
投与方法を詳述する。本発明デプシペプチド化合物やそ
の製薬学的に許容される塩の１種又は２種以上を有効成
分として含有するHDAC阻害剤の医薬組成物は，通常用い
られている製剤用の担体や賦形剤，その他の添加剤を用
いて，錠剤，散剤，細粒剤，顆粒剤，カプセル剤，丸
剤，液剤，注射剤，坐剤，軟膏，貼付剤等に調製され，
経口的又は非経口的に投与される。本発明デプシペプチ
ド化合物のヒトに対する臨床投与量は、通常経口投与の
場合、１日の投与量は，体表面積当たり約１から１００
００ｍｇ／ｍ²、好ましくは１０〜５０００ｍｇ／ｍ²が
適当であり，これを１回であるいは２乃至４回に分けて
投与する。静脈投与される場合は、１日の投与量は，体
表面積当たり約０．１から１０００ｍｇ／ｍ²が適当
で、１日１回乃至複数に分けて投与する。投与量は症
状，年令，性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決
定される。

【００２０】本発明による経口投与のための固体組成物
としては，錠剤，散剤，顆粒剤等が用いられる。このよ
うな固体組成物においては，一つ又はそれ以上の活性化
合物が，少なくとも一つの不活性な希釈剤，例えば乳
糖，マンニトール，ブドウ糖，ヒドロキシプロピルセル
ロース，微結晶セルロース，デンプン，ポリビニルピロ
リドン，メタケイ酸アルミン酸マグネシウムと混合され
る。組成物は，常法に従って，不活性な希釈剤以外の添
加剤，例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤
や繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤，ラク
トースのような安定化剤，溶解補助剤を含有していても
よい。錠剤又は丸剤は必要によりショ糖，ゼラチン，ヒ
ドロキシプロピルセルロース，ヒドロキシプロピルメチ
ルセルロースフタレートなどの糖衣または胃溶性あるい
は腸溶性化合物のフィルムで被膜してもよい。

【００２１】経口投与のための液体組成物は，薬剤的に
許容される乳濁剤，溶液剤，懸濁剤，シロップ剤，エリ
キシル剤等を含み，一般的に用いられる不活性な希釈
剤，例えば精製水，エチルアルコールを含む。この組成
物は不活性な希釈剤以外に溶解補助剤，湿潤剤，懸濁剤
のような補助剤，甘味剤，風味剤，芳香剤，防腐剤を含
有していてもよい。非経口投与のための注射剤として
は，無菌の水性又は非水性の溶液剤，懸濁剤，乳濁剤を
包含する。水性の溶液剤，懸濁剤の希釈剤としては，例
えば注射剤用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶
性の溶液剤，懸濁剤の希釈剤としては，例えばプロピレ
ングリコール，ポリエチレングリコール，オリーブ油の
ような植物油，エチルアルコールのようなアルコール
類，ポリソルベート８０（商品名）等がある。このよう
な組成物は，さらに等張化剤，防腐剤，湿潤剤，乳化
剤，分散剤，安定化剤（例えば，ラクトース），溶解補
助剤のような添加剤を含んでもよい。これらは例えばバ
クテリア保留フィルターを通す濾過，殺菌剤の配合又は
照射によって無菌化される。これらは又無菌の固体組成
物を製造し，使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶
解して使用することもできる。

【００２２】本発明化合物の溶解性が低い場合には，可
溶化処理を施してもよい。可溶化処理としては，医薬製
剤に適用できる公知の方法，例えば界面活性剤（ポリオ
キシエチレン硬化ヒマシ油類，ポリオキシエチレンソル
ビタン高級脂肪酸エステル類，ポリオキシエチレンポリ
オキシプロピレングリコール類，ショ糖脂肪酸エステル
類等）を添加する方法，薬物と可溶化剤例えば高分子
（ハイドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭ
Ｃ），ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）等の水溶性高分子，カルボキシメ
チルエチルセルロース（ＣＭＥＣ），ハイドロキシプロ
ピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ），メタ
アクリル酸メチル−メタアクリル酸共重合体（オイドラ
ギットＬ，Ｓ，商品名；ローム・アンド・ハース社製）
等の腸溶性高分子）との固体分散体を形成する方法が挙
げられる。更に必要により，可溶性の塩にする方法，サ
イクロデキストリン等を用いて包接化合物を形成させる
方法等も採用できる。可溶化の手段は，目的とする薬物
に応じて適宜変更できる［「最近の製剤技術とその応用
Ｉ」，内海勇ら，医薬ジャーナル１５７−１５９（１９
８３）及び「薬学モノグラフＮｏ．１，生物学的利用
能」，永井恒司ら，ソフトサイエンス社，７８−８２］
（１９８８）参照］。

【００２３】

【実施例】以下、製造例にて本発明化合物の具体的な製
造方法を、また、実施例にて本発明のHDAC阻害剤の作用
を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。

【００２４】製造例１グルコース１０ｇ、ポテトスターチ２０ｇ、ポリペプト
ン５ｇ、酵母エキス５ｇ、炭酸カルシウム４ｇ、蒸留水
１Lを含む培地（ｐＨ７．０）１００mLを、５００mL容
の三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間滅菌し
た。ベネット寒天培地に良く生育させたシュードモナス
エスピーＱ７１５７６株を掻き取って接種し、２８
℃、２００回転／分の条件で３日間振盪培養し、種培養
液とした。次にグリセロール３０ｇ、グルコース１ｇ、
ポリペプトン５ｇ、肉エキス５ｇ、NaCl ５ｇ、消泡剤
（ＮＫＬ５４３０）０．５ｇ、蒸留水１Ｌを含む培地
（ｐＨ７．０）を１００mLずつ５００mL容の三角フラス
コに分注し、１２０℃で２０分間滅菌した。この培地に
前記種培養液を２mLずつ接種し、２８℃、２００回転／
分の条件で３日間、振盪培養した。このようにして培養
した培養液２．５Ｌについて、６０００ｒｐｍで１０分
間遠心分離を行った。上清液を酢酸エチルにて抽出し、
硫酸ナトリウムを添加して脱水した後、減圧下で濃縮乾
固した。油状の粗抽出物をシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー (30 i.d.×200 mm) に供し、クロロホルム−
メタノール（２０：１）で洗浄後、クロロホルム−メタ
ノール（５：１）で溶出し、活性画分を濃縮した。次
に、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィー (2
0 i.d.×500 mm) に供し、クロロホルム−メタノール
（１：１）でゲル濾過を行った。活性画分を濃縮後、Ｃ
ＰＣ (centrifugal partition chromatography) に供
し、クロロホルム−メタノール−水（５：６：４）の溶
媒系にて上昇法を用いて不純物を除去した。最終的に活
性画分を濃縮乾固した後、メタノールに溶解し、センシ
ュー科学社製 PEGASIL ODSカラム (20 i.d.×250 mm)
を用い、３５％アセトニトリル水溶液にて逆相ＨＰＬＣ
（流速10mL/分）を行った。その結果、化合物Ａは１
０．８分に、化合物Ｂは１５．４分にピークが認めら
れ、それぞれのピークを分取することにより化合物Ａ及
びＢの白色粉末を各１０ｍｇ得た。

【００２５】製造例２グルコース10g、ポテトスターチ20g、ポリペプトン5g、
酵母エキス5g、炭酸カルシウム4g、蒸留水1Lを含む培地
(pH7.0)を100mLずつ500mL容の付き三角フラスコに分注
し、120℃で20分間滅菌した。ベネット寒天培地に良く
生育させたシュードモナスエスピー Q71576株を掻き
取って接種し、28℃、200回転／分の条件で3日間振盪培
養した。同培地400mLを2L容の三角フラスコに分注し、1
20℃で20分間滅菌した後、前記培養液8mLを植菌し、28
℃、200回転／分の条件で3日間振盪培養し、種培養液と
した。次にマンニトール30g、ポリペプトン5g、肉エキ
ス5g、塩化ナトリウム5g、水道水1Lを含む培地(pH7.0)
を18Lずつ30L容ジャーファーメンター3基に分注し、120
℃で20分間滅菌した。この培地に前記種培養液を360mL
ずつ接種し、24℃、150回転／分、1vvmで64時間培養を
行った。シャープレスにて菌体と分離した培養液50 Lを
HP-20を充填したカラムに供し、水、20%アセトン水溶
液、40%メタノール水溶液で洗浄後、80%アセトン水溶液
で溶出した。溶出画分を濃縮して得られた水溶液につい
てクロロホルム、酢酸エチルで抽出を行い、各抽出物を
混合して濃縮後、シリカゲルを充填したカラムに供し
た。クロロホルム-メタノール(50：1)、(20：1)、(10：
1)で溶出し、クロロホルム-メタノール(20：1)および
（10：1）溶出画分の一部を混合して濃縮後、エタノー
ルに溶解して再結晶を行い、化合物Ａ，Ｂ及びＣを含む
混合物として、白色粉末776mgを得た。得られた粉末に
ついて、ODS-HPLCカラム(cosmosil AR-II20 i.d.×250
mm)による化合物Ｃ溶出画分の分取を行い、化合物Ｃの
白色粉末として20 mgを得た。上記の製造例で得られた
化合物Ａ、Ｂ及びＣの物理化学的性状を後記表４〜７に
示す。これらの物理化学的性状から決定された化合物
Ａ、Ｂ及びＣの化学構造式は以下の通りである。

【００２６】

【化３】

【００２７】

【表４】

【００２８】

【表５】

【００２９】

【表６】

【００３０】

【表７】

【００３１】実施例１：HDAC阻害試験（１）［³H］アセチルヒストンの調整ヒト白血病細胞K562細胞（1.3x10⁹個）を2時間10mM酢酸
ナトリウム存在下で［ ³H］−酢酸ナトリウム（第一化学
薬品株式会社; NET-003H）標識し、吉田らの方法（Yosh
ida,M. et al J.Biol.Chem 265, 17174-17179, 1990）
に従ってヒストン抽出を行った。抽出ヒストンは水で溶
解し、ブラッドフォード法で蛋白質定量を行った（7mg/
ml）。

【００３２】（２）HDACの部分精製 K562細胞より単離した核を吉田らの方法（Yoshida,M. e
t al J.Biol.Chem 265, 17174-17179, 1990）に従って
抽出し、その抽出液をQ Sepharose FFカラム（ファルマ
シア社; 17-0510-01）を用い、0-0.5MのNaClの濃度勾配
によりHDACの部分精製を行った。その後、HDA緩衝液［1
5mMリン酸カリウム（pH7.5）、5%グリセロール、0.2mM
EDTA］で透析を行った。（３）HDAC阻害活性の測定（１）で調整した［³H］アセチルヒストンをHDA緩衝液
で280μg/mlに希釈しこれを25μlと、（２）で精製・透
析したHDAC画分25μlとを混合し室温にて4時間反応させ
た後、1モル塩酸を50μl添加して反応を停止させ、さら
に酢酸エチル800μlを加え混合・遠心を行い、酢酸エチ
ル層400μlをシンチレーターバイアルに採取し、5mlの
シンチレーターを添加して遊離した［³H］酢酸の放射活
性を液体シンチレーションカウンターにて測定した。基
質と酵素とを混合する前に予めDMSOで溶解・希釈した薬
物を2μl添加し、上記のアッセイを行うことで薬物のHD
ACに対する阻害活性を検討した。その結果、化合物Ａは
0.3μMの濃度で50%以上のHDAC阻害活性を示した。また
化合物Ｂについても同様の阻害作用が見られた。

【００３３】実施例２：腫瘍組織内アセチル化ヒストン
の亢進試験（１）化合物Ａ投与後の腫瘍サンプルの取得 BALB/C-nu/nuマウスにヒト大腸癌WiDr細胞を2×10⁶ cel
ls/100μl PBS/mouseでうえつけ、約2週間後に腫瘍体積
が300 mm³程度になったマウスに尾静脈より化合物Ａ 3
mg/kgを投与し、さらに8時間後に腫瘍を摘出した．また
対照群として薬剤未処置のマウスからも腫瘍を摘出し
た。

【００３４】（２）腫瘍組織内アセチル化ヒストン亢進
作用の検討テーパー型ホモジナイザー（WHEATON社; 358103）に
（１）で取得した腫瘍組織とTNE溶解緩衝液（50mM Tris
HCl（pH8.0）, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1mM EDTA, comp
lete（ベーリンガーインゲルハイム社; No.1873580）,
10μg/ml aprotinin）を加えホモジナイズした後に、遠
心し上清部分を採取した。この上清をブラッドフォード
法にて蛋白質定量後、それぞれの検体を等蛋白質量に揃
えて定法に従いSDS-PAGE、ウェスタンブロットを行っ
た。その際に一次抗体には抗アセチル化ヒストンＨ３抗
体（UPSTATE biotechnology社; #06-599）を、二次抗体
にはHRP標識抗ウサギ抗体（アマシャム社; code NA 934
0）を使用し、ECL（アマシャム社; RPN2106）にて発光
を検出した。結果、化合物Ａ3mg/kg投与サンプルでは対
照サンプルに比較して顕著なアセチル化ヒストンＨ３の
バンドが検出されたことから、化合物Ａはマウスにうえ
つけた腫瘍組織内においてもヒストン脱アセチル化酵素
を阻害しヒストンのアセチル化を亢進させていることが
確認された。

【００３５】

【発明の効果】一般式（Ｉ）に示される本発明化合物
は、前記実施例に示したように、HDAC阻害作用を有し、
in vivoにおいてもHDAC阻害に基づくヒストンアセチル
化の亢進を示すことが確認された。従って、一般式
（Ｉ）で示されるデプシペプチド化合物またはその製薬
学的に許容される塩を有効成分として含有する本発明の
HDAC阻害剤は、ヒストンのアセチル化の関与する疾患や
病態、殊に腫瘍や細胞増殖性疾患の治療及び改善に有用
である。細胞増殖性疾患としては、例えば感染症、自己
免疫疾患、皮膚病が挙げられる。また、本発明のHDAC阻
害剤は遺伝子治療におけるベクター導入の効率化や導入
遺伝子の発現亢進にも有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １１１Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者森政道茨城県つくば市御幸が丘21 山之内製薬株式会社内 (72)発明者網野伸明茨城県つくば市御幸が丘21 山之内製薬株式会社内 (72)発明者早田錦矢茨城県つくば市御幸が丘21 山之内製薬株式会社内 (72)発明者永井浩二東京都板橋区小豆沢１−１−８山之内製薬株式会社内 (72)発明者早川洋一千葉県柏市新富町２−６−57 (72)発明者新家一男東京都文京区千駄木５−13−６ (72)発明者升岡優太東京都豊島区要町１−１−10−802 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA01 BA15 BA26 CA04 DC50 ZA891 ZA892 ZB071 ZB072 ZB211 ZB212 ZB261 ZB262

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（Ｉ）で示されるデプシペプチド
化合物またはその製薬学的に許容される塩を有効成分と
して含有するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤。【化１】（式中Ｒは、イソプロピル基、sec-ブチル基またはイソ
ブチル基を意味する。）