JP2001238681A - 共培養による血液脳関門再構築モデル - Google Patents
共培養による血液脳関門再構築モデルInfo
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 血液脳関門透過機構に関する基礎的研究や、
血液脳関門透過機構に基づいた中枢作用型薬物、中枢で
の副作用が問題となる薬物、脳毛細血管内皮細胞に発現
する種々の受容体を標的とした薬物、又は脳毛細血管内
皮細胞の障害を標的とした薬物をスクリーニングする上
で極めて有用な血液脳関門再構築モデルを提供するこ
と。 【解決手段】 温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８の
ラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラッ
ト由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株と、同ラット由来
の不死化アストロサイト細胞株とを非接触状態で共培養
することにより、又は、前記不死化脳毛細血管内皮細胞
株と不死化アストロサイト細胞株と同ラット由来の不死
化脳毛細血管周皮細胞株とを非接触状態で共培養するこ
とにより、血液脳関門再構築モデルを作製する。
血液脳関門透過機構に基づいた中枢作用型薬物、中枢で
の副作用が問題となる薬物、脳毛細血管内皮細胞に発現
する種々の受容体を標的とした薬物、又は脳毛細血管内
皮細胞の障害を標的とした薬物をスクリーニングする上
で極めて有用な血液脳関門再構築モデルを提供するこ
と。 【解決手段】 温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８の
ラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラッ
ト由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株と、同ラット由来
の不死化アストロサイト細胞株とを非接触状態で共培養
することにより、又は、前記不死化脳毛細血管内皮細胞
株と不死化アストロサイト細胞株と同ラット由来の不死
化脳毛細血管周皮細胞株とを非接触状態で共培養するこ
とにより、血液脳関門再構築モデルを作製する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血液脳関門再構築
モデル、より詳しくは、ラット由来の不死化脳毛細血管
内皮細胞株、不死化アストロサイト細胞株、不死化脳毛
細血管周皮細胞株を共培養することによる血液脳関門再
構築モデルの作製方法や、共培養することにより得られ
る血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化
脳毛細血管内皮細胞株や、かかる血液脳関門モデルや血
液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛
細血管内皮細胞株を用いた血液脳関門形成促進物質等の
スクリーニング方法等に関する。
モデル、より詳しくは、ラット由来の不死化脳毛細血管
内皮細胞株、不死化アストロサイト細胞株、不死化脳毛
細血管周皮細胞株を共培養することによる血液脳関門再
構築モデルの作製方法や、共培養することにより得られ
る血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化
脳毛細血管内皮細胞株や、かかる血液脳関門モデルや血
液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛
細血管内皮細胞株を用いた血液脳関門形成促進物質等の
スクリーニング方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】血液脳関門（blood-brain barrier）と
は、血液から脳組織内への物質の移行を制限する関門で
あり、これによって、脳は有害物質などから守られてい
る。ニコチン、カフェイン、ヘロイン等の脂溶性物質は
この血液脳関門を容易に通過できるが、一般に極性物
質、強電解質など非脂溶性物質は通過しにくいものの、
脳の代謝に必要なＤ−グルコース等の水溶性物質はキャ
リヤーによって血液脳関門を透過して脳組織へ運ばれる
ことが知られている。脳毛細血管においては、隣接する
内皮細胞同士がタイト・ジャンクションと呼ばれる緊密
な結合を形成し、細胞間の隙間から漏出しないようにな
っており、そのため、脳内に出入りする物質は原則とし
て脳毛細血管内皮細胞を通過しなくてはならないとされ
ている。
は、血液から脳組織内への物質の移行を制限する関門で
あり、これによって、脳は有害物質などから守られてい
る。ニコチン、カフェイン、ヘロイン等の脂溶性物質は
この血液脳関門を容易に通過できるが、一般に極性物
質、強電解質など非脂溶性物質は通過しにくいものの、
脳の代謝に必要なＤ−グルコース等の水溶性物質はキャ
リヤーによって血液脳関門を透過して脳組織へ運ばれる
ことが知られている。脳毛細血管においては、隣接する
内皮細胞同士がタイト・ジャンクションと呼ばれる緊密
な結合を形成し、細胞間の隙間から漏出しないようにな
っており、そのため、脳内に出入りする物質は原則とし
て脳毛細血管内皮細胞を通過しなくてはならないとされ
ている。
【０００３】上記のように、脳毛細血管内皮細胞は、脳
への栄養物質だけでなく細胞膜に発現している種々の輸
送系によって薬物を脳内へ輸送する。あるいは、その実
体はほとんど解明されていないが、血液脳関門には脳か
ら循環血液方向へ神経伝達物質の代謝物および異物を排
出する輸送系が働く特殊な生理機能が存在する。異物で
ある薬物の中には脂溶性が高いにも係わらず脳への移行
性が悪いものも多いことが知られており、その原因とし
て血液脳関門に存在する排出輸送系によって一旦脳内へ
移行した薬物がその移行速度の数十倍から数百倍も高い
速度で脳から排出されることが考えられている。例えば
エイズウイルス治療薬であるアジドチミジンは血液脳関
門排出輸送系の働きによって脳への移行性が著しく制限
されている（J. Pharmacol. Exp. Ther., 281, 369-37
5, 1997、ibid 282, 1509-1517, 1997）。このように中
枢作用型薬物の脳への移行において血液脳関門は極めて
重要な役割を果たしている。
への栄養物質だけでなく細胞膜に発現している種々の輸
送系によって薬物を脳内へ輸送する。あるいは、その実
体はほとんど解明されていないが、血液脳関門には脳か
ら循環血液方向へ神経伝達物質の代謝物および異物を排
出する輸送系が働く特殊な生理機能が存在する。異物で
ある薬物の中には脂溶性が高いにも係わらず脳への移行
性が悪いものも多いことが知られており、その原因とし
て血液脳関門に存在する排出輸送系によって一旦脳内へ
移行した薬物がその移行速度の数十倍から数百倍も高い
速度で脳から排出されることが考えられている。例えば
エイズウイルス治療薬であるアジドチミジンは血液脳関
門排出輸送系の働きによって脳への移行性が著しく制限
されている（J. Pharmacol. Exp. Ther., 281, 369-37
5, 1997、ibid 282, 1509-1517, 1997）。このように中
枢作用型薬物の脳への移行において血液脳関門は極めて
重要な役割を果たしている。
【０００４】従来、血液脳関門のインビトロ実験系とし
ては、初代培養脳毛細血管内皮細胞単離方法（Audus＆B
orchardtら、Pharm. Res., 3, 81-87, 1986）に基づい
て、ウシから調製して実験が行われてきた。しかし、初
代培養細胞では、例えば中性アミノ酸輸送系で運ばれる
Ｌ−ドーパやヘキソース輸送系で運ばれるグルコースの
輸送速度がインビボ系に比べて数十倍以下と低いことが
報告され（Pardridgeら、J. Pharmacol. Exp. Ther., 2
53, 884-891, 1990）、逆に単純拡散による物質透過が
インビボ系よりも１５０倍以上高く、血液脳関門のモデ
ルとしては不十分であった。また、株化脳毛細血管内皮
細胞であるＭＢＥＣ−４（Tatsuta Tら、J. Biol. Che
m., 267, 20383-20391, 1992）では、インビボで発現し
ているｍｄｒ（multi drug resistance）１ａ遺伝子産
物が発現しておらず、またインビボで発現していないｍ
ｄｒ１ｂ遺伝子産物が発現している点で正常な脳毛細血
管内皮細胞ではないと考えられている。
ては、初代培養脳毛細血管内皮細胞単離方法（Audus＆B
orchardtら、Pharm. Res., 3, 81-87, 1986）に基づい
て、ウシから調製して実験が行われてきた。しかし、初
代培養細胞では、例えば中性アミノ酸輸送系で運ばれる
Ｌ−ドーパやヘキソース輸送系で運ばれるグルコースの
輸送速度がインビボ系に比べて数十倍以下と低いことが
報告され（Pardridgeら、J. Pharmacol. Exp. Ther., 2
53, 884-891, 1990）、逆に単純拡散による物質透過が
インビボ系よりも１５０倍以上高く、血液脳関門のモデ
ルとしては不十分であった。また、株化脳毛細血管内皮
細胞であるＭＢＥＣ−４（Tatsuta Tら、J. Biol. Che
m., 267, 20383-20391, 1992）では、インビボで発現し
ているｍｄｒ（multi drug resistance）１ａ遺伝子産
物が発現しておらず、またインビボで発現していないｍ
ｄｒ１ｂ遺伝子産物が発現している点で正常な脳毛細血
管内皮細胞ではないと考えられている。
【０００５】一方、脳毛細血管内皮細胞はアストロサイ
ト細胞との共培養により、脳毛細血管内皮細胞のＧＬＵ
Ｔ−１発現能力を高めることが知られている（Hayashi
Y.ら, GLIA, 19, 13-26, 1997）。しかし、共培養に使
用されるアストロサイト細胞は初代培養アストロサイト
細胞であるために、毎回調製する必要があるうえ、通常
生後1日ラットから分離培養しているために成熟ラット
のアストロサイト細胞とは異なる（Swanson R. A.ら, J
Neurosci., 17, 932-940, 1997）という問題がある。
これまで、アストロサイト細胞株として、ＫＧ−１−
Ｃ、Ｕ２５１、ＧＩ−１等のヒト由来の神経膠腫瘍細胞
（グリア細胞）やＲＣＲ−１、Ｃ６等のラット由来腫瘍
化グリア細胞が使用されてきたが、これらグリア細胞は
ＧＦＡＰ（glial fibrillary acidic protein）を発現
し、アストロサイトの性質を有しているものの、ミエリ
ン鞘を形成するオリゴデンドロサイトの性質も共に有し
ているため、本来のアストロサイトだけの機能を反映し
ていない。例えば、Ｃ６細胞ではアストロサイトが本来
有しているＮａ+依存性Ｌ−グルタミン酸トランスポー
ターであるＧＬＵＴ−１及びＧＬＡＳＴが発現しておら
ず、神経細胞に発現する蛋白質であるＥＡＡＣ１が発現
している（PalosT. P.ら, Mol. Brain Res., 37, 297-3
03, 1996）。
ト細胞との共培養により、脳毛細血管内皮細胞のＧＬＵ
Ｔ−１発現能力を高めることが知られている（Hayashi
Y.ら, GLIA, 19, 13-26, 1997）。しかし、共培養に使
用されるアストロサイト細胞は初代培養アストロサイト
細胞であるために、毎回調製する必要があるうえ、通常
生後1日ラットから分離培養しているために成熟ラット
のアストロサイト細胞とは異なる（Swanson R. A.ら, J
Neurosci., 17, 932-940, 1997）という問題がある。
これまで、アストロサイト細胞株として、ＫＧ−１−
Ｃ、Ｕ２５１、ＧＩ−１等のヒト由来の神経膠腫瘍細胞
（グリア細胞）やＲＣＲ−１、Ｃ６等のラット由来腫瘍
化グリア細胞が使用されてきたが、これらグリア細胞は
ＧＦＡＰ（glial fibrillary acidic protein）を発現
し、アストロサイトの性質を有しているものの、ミエリ
ン鞘を形成するオリゴデンドロサイトの性質も共に有し
ているため、本来のアストロサイトだけの機能を反映し
ていない。例えば、Ｃ６細胞ではアストロサイトが本来
有しているＮａ+依存性Ｌ−グルタミン酸トランスポー
ターであるＧＬＵＴ−１及びＧＬＡＳＴが発現しておら
ず、神経細胞に発現する蛋白質であるＥＡＡＣ１が発現
している（PalosT. P.ら, Mol. Brain Res., 37, 297-3
03, 1996）。
【０００６】脳毛細血管内皮細胞は、その周りが周皮細
胞及びアストロサイト細胞で覆われていることが報告さ
れている（Sci. Am. 255, 74-83, 1886）。また、林ら
の報告（Hayashi, Y.ら, GLIA 19, 13-26, 1997）によ
ると、ラット胎児のアストロサイト細胞とヒト臍帯静脈
内皮細胞（human umbilical cord vein）の共培養によ
り、ヒト臍帯静脈内皮細胞単培養と比較して、γ−ＧＴ
Ｐ活性が５倍高くなり、ＧＬＵＴ−１のｍＲＮＡが９〜
１１．６倍上昇したことから、アストロサイト細胞が脳
毛細血管内皮細胞とクロストークして血液脳関門を形成
していると考えられている。しかし、この報告による
と、ラット胎児由来のアストロサイト細胞と、ヒト臍帯
静脈由来の内皮細胞とを用いており、血液脳関門再構築
モデルとは言い難く、かつ調製が困難である。
胞及びアストロサイト細胞で覆われていることが報告さ
れている（Sci. Am. 255, 74-83, 1886）。また、林ら
の報告（Hayashi, Y.ら, GLIA 19, 13-26, 1997）によ
ると、ラット胎児のアストロサイト細胞とヒト臍帯静脈
内皮細胞（human umbilical cord vein）の共培養によ
り、ヒト臍帯静脈内皮細胞単培養と比較して、γ−ＧＴ
Ｐ活性が５倍高くなり、ＧＬＵＴ−１のｍＲＮＡが９〜
１１．６倍上昇したことから、アストロサイト細胞が脳
毛細血管内皮細胞とクロストークして血液脳関門を形成
していると考えられている。しかし、この報告による
と、ラット胎児由来のアストロサイト細胞と、ヒト臍帯
静脈由来の内皮細胞とを用いており、血液脳関門再構築
モデルとは言い難く、かつ調製が困難である。
【０００７】また、本発明者らによる特開平１１−３４
１９８２号公報には、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ
５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニッ
クマウスより樹立した脳毛細血管内皮細胞株と、温度感
受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を
導入したトランスジェニックラットより樹立したアスト
ロサイト細胞株とを共培養することにより、脳毛細血管
内皮細胞のＧＬＵＴ−１発現能力を高まることが開示さ
れている。しかし、共培養に用いた脳毛細血管内皮細胞
株とアストロサイト細胞株とは、由来する動物種を異に
することから、厳密な意味での最適血液脳関門再構築モ
デルとするにはなお改良の余地があった。
１９８２号公報には、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ
５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニッ
クマウスより樹立した脳毛細血管内皮細胞株と、温度感
受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を
導入したトランスジェニックラットより樹立したアスト
ロサイト細胞株とを共培養することにより、脳毛細血管
内皮細胞のＧＬＵＴ−１発現能力を高まることが開示さ
れている。しかし、共培養に用いた脳毛細血管内皮細胞
株とアストロサイト細胞株とは、由来する動物種を異に
することから、厳密な意味での最適血液脳関門再構築モ
デルとするにはなお改良の余地があった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】血液脳関門は薬物輸送
や脳代謝機能などにおいて重要な役割を果たしており、
現在までにインビトロでの再構築モデルが種々提案され
ているが、厳密な意味での最適血液脳関門再構築モデル
を作製することは困難とされてきた。本発明の課題は、
血液脳関門透過機構に基づいた中枢作用型薬物（抗痴呆
薬、脳腫瘍治療薬、ウイルス治療薬、精神神経作用
薬）、中枢での副作用が問題となる薬物、脳毛細血管内
皮細胞に発現する種々の受容体を標的とした薬物（脳微
小循環改善薬、脳浮腫治療薬）、または脳毛細血管内皮
細胞の障害（脳血管障害性痴呆症やアルツハイマー型痴
呆症）を標的とした薬物をスクリーニングする上で極め
て有用な血液脳関門再構築モデルを提供することにあ
る。
や脳代謝機能などにおいて重要な役割を果たしており、
現在までにインビトロでの再構築モデルが種々提案され
ているが、厳密な意味での最適血液脳関門再構築モデル
を作製することは困難とされてきた。本発明の課題は、
血液脳関門透過機構に基づいた中枢作用型薬物（抗痴呆
薬、脳腫瘍治療薬、ウイルス治療薬、精神神経作用
薬）、中枢での副作用が問題となる薬物、脳毛細血管内
皮細胞に発現する種々の受容体を標的とした薬物（脳微
小循環改善薬、脳浮腫治療薬）、または脳毛細血管内皮
細胞の障害（脳血管障害性痴呆症やアルツハイマー型痴
呆症）を標的とした薬物をスクリーニングする上で極め
て有用な血液脳関門再構築モデルを提供することにあ
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究し、同種の動物より樹立した
不死化細胞株であるラット脳毛細血管内皮細胞株ＴＲ−
ＢＢＢ１３（ＦＥＰＭＢＰ−６８７３）、ラットアスト
ロサイト細胞株ＴＲ−ＡＳＴ９３２（ＦＥＰＭ ＢＰ−
６２８３）、ラット脳毛細血管周皮細胞株ＴＲ−ＰＣＴ
１（ＦＥＲＭＢＰ−７０２４）を用いて共培養すること
により、最適血液脳関門再構築モデルを作製することが
できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
を解決するために鋭意研究し、同種の動物より樹立した
不死化細胞株であるラット脳毛細血管内皮細胞株ＴＲ−
ＢＢＢ１３（ＦＥＰＭＢＰ−６８７３）、ラットアスト
ロサイト細胞株ＴＲ−ＡＳＴ９３２（ＦＥＰＭ ＢＰ−
６２８３）、ラット脳毛細血管周皮細胞株ＴＲ−ＰＣＴ
１（ＦＥＲＭＢＰ−７０２４）を用いて共培養すること
により、最適血液脳関門再構築モデルを作製することが
できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】すなわち本発明は、ラット由来の不死化脳
毛細血管内皮細胞株と、ラット由来の不死化アストロサ
イト細胞株とを共培養することを特徴とする血液脳関門
再構築モデルの作製方法（請求項１）や、ラット由来の
不死化脳毛細血管内皮細胞株と、ラット由来の不死化ア
ストロサイト細胞株と、ラット由来の不死化脳毛細血管
周皮細胞株とを共培養することを特徴とする血液脳関門
再構築モデルの作製方法（請求項２）や、ラット由来の
不死化脳毛細血管内皮細胞株が、温度感受性変異株ＳＶ
４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトラン
スジェニックラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株
であることを特徴とする請求項１又は２記載の血液脳関
門再構築モデルの作製方法（請求項３）や、温度感受性
変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入
したトランスジェニックラット由来の不死化脳毛細血管
内皮細胞株が、ＴＲ−ＢＢＢ１３（ＦＥＰＭ ＢＰ−６
８７３）であることを特徴とする請求項３記載の血液脳
関門再構築モデルの作製方法（請求項４）や、ラット由
来の不死化アストロサイト細胞株が、温度感受性変異株
ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したト
ランスジェニックラット由来の不死化アストロサイト細
胞株であることを特徴とする請求項１又は２記載の血液
脳関門再構築モデルの作製方法（請求項５）や、温度感
受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を
導入したトランスジェニックラット由来の不死化アスト
ロサイト細胞株が、ＴＲ−ＡＳＴ９３２（ＦＥＰＭ Ｂ
Ｐ−６２８３）であることを特徴とする請求項５記載の
血液脳関門再構築モデルの作製方法（請求項６）や、ラ
ット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株が、温度感受性
変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入
したトランスジェニックラット由来の不死化脳毛細血管
周皮細胞株であることを特徴とする請求項２記載の血液
脳関門再構築モデルの作製方法（請求項７）や、温度感
受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を
導入したトランスジェニックラット由来の不死化脳毛細
血管周皮細胞株が、ＴＲ−ＰＣＴ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−
７０２４）であることを特徴とする請求項７記載の血液
脳関門再構築モデルの作製方法（請求項８）や、共培養
が、不死化脳毛細血管内皮細胞株と不死化アストロサイ
ト細胞株とを非接触状態で、又は不死化脳毛細血管内皮
細胞株と不死化アストロサイト細胞株及び不死化脳毛細
血管周皮細胞株とを非接触状態で培養する、非接触系共
培養であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記
載の血液脳関門再構築モデルの作製方法（請求項９）に
関する。
毛細血管内皮細胞株と、ラット由来の不死化アストロサ
イト細胞株とを共培養することを特徴とする血液脳関門
再構築モデルの作製方法（請求項１）や、ラット由来の
不死化脳毛細血管内皮細胞株と、ラット由来の不死化ア
ストロサイト細胞株と、ラット由来の不死化脳毛細血管
周皮細胞株とを共培養することを特徴とする血液脳関門
再構築モデルの作製方法（請求項２）や、ラット由来の
不死化脳毛細血管内皮細胞株が、温度感受性変異株ＳＶ
４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトラン
スジェニックラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株
であることを特徴とする請求項１又は２記載の血液脳関
門再構築モデルの作製方法（請求項３）や、温度感受性
変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入
したトランスジェニックラット由来の不死化脳毛細血管
内皮細胞株が、ＴＲ−ＢＢＢ１３（ＦＥＰＭ ＢＰ−６
８７３）であることを特徴とする請求項３記載の血液脳
関門再構築モデルの作製方法（請求項４）や、ラット由
来の不死化アストロサイト細胞株が、温度感受性変異株
ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したト
ランスジェニックラット由来の不死化アストロサイト細
胞株であることを特徴とする請求項１又は２記載の血液
脳関門再構築モデルの作製方法（請求項５）や、温度感
受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を
導入したトランスジェニックラット由来の不死化アスト
ロサイト細胞株が、ＴＲ−ＡＳＴ９３２（ＦＥＰＭ Ｂ
Ｐ−６２８３）であることを特徴とする請求項５記載の
血液脳関門再構築モデルの作製方法（請求項６）や、ラ
ット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株が、温度感受性
変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入
したトランスジェニックラット由来の不死化脳毛細血管
周皮細胞株であることを特徴とする請求項２記載の血液
脳関門再構築モデルの作製方法（請求項７）や、温度感
受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を
導入したトランスジェニックラット由来の不死化脳毛細
血管周皮細胞株が、ＴＲ−ＰＣＴ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−
７０２４）であることを特徴とする請求項７記載の血液
脳関門再構築モデルの作製方法（請求項８）や、共培養
が、不死化脳毛細血管内皮細胞株と不死化アストロサイ
ト細胞株とを非接触状態で、又は不死化脳毛細血管内皮
細胞株と不死化アストロサイト細胞株及び不死化脳毛細
血管周皮細胞株とを非接触状態で培養する、非接触系共
培養であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記
載の血液脳関門再構築モデルの作製方法（請求項９）に
関する。
【００１１】また本発明は、請求項１〜９のいずれか記
載の血液脳関門再構築モデルを用いるスクリーニング方
法であって、共培養中又は共培養の前後に、被検物質を
不死化脳毛細血管内皮細胞株と接触させ、血液脳関門の
マーカー遺伝子の発現の程度を測定・評価することを特
徴とする血液脳関門形成促進又は抑制物質のスクリーニ
ング方法（請求項１０）や、請求項１〜９のいずれか記
載の血液脳関門再構築モデルを用いるスクリーニング方
法であって、共培養中又は共培養の前後に、被検物質と
血液脳関門透過物質又は血液脳関門非透過物質とを不死
化脳毛細血管内皮細胞株と接触させ、これら血液脳関門
透過物質又は血液脳関門非透過物質の不死化脳毛細血管
内皮細胞内への透過の程度を測定・評価することを特徴
とする血液脳関門透過促進又は抑制物質のスクリーニン
グ方法（請求項１１）や、請求項１〜９のいずれか記載
の血液脳関門再構築モデルを用いるスクリーニング方法
であって、共培養中又は共培養の前後に、被検物質を不
死化脳毛細血管内皮細胞株と接触させ、不死化脳毛細血
管内皮細胞内への被検物質の透過の程度を測定・評価す
ることを特徴とする血液脳関門透過又は非透過物質のス
クリーニング方法（請求項１２）や、請求項１０記載の
血液脳関門形成促進又は抑制物質のスクリーニング方法
により得られる血液脳関門形成促進物質（請求項１３）
や、請求項１０記載の血液脳関門形成促進又は抑制物質
のスクリーニング方法により得られる血液脳関門形成抑
制物質（請求項１４）や、請求項１１記載の血液脳関門
透過促進又は抑制物質のスクリーニング方法により得ら
れる血液脳関門透過促進物質（請求項１５）や、請求項
１１記載の血液脳関門透過促進又は抑制物質のスクリー
ニング方法により得られる血液脳関門透過抑制物質（請
求項１６）や、請求項１２記載の血液脳関門透過又は非
透過物質のスクリーニング方法により得られる血液脳関
門透過物質（請求項１７）や、請求項１２記載の血液脳
関門透過又は非透過物質のスクリーニング方法により得
られる血液脳関門非透過物質（請求項１８）に関する。
載の血液脳関門再構築モデルを用いるスクリーニング方
法であって、共培養中又は共培養の前後に、被検物質を
不死化脳毛細血管内皮細胞株と接触させ、血液脳関門の
マーカー遺伝子の発現の程度を測定・評価することを特
徴とする血液脳関門形成促進又は抑制物質のスクリーニ
ング方法（請求項１０）や、請求項１〜９のいずれか記
載の血液脳関門再構築モデルを用いるスクリーニング方
法であって、共培養中又は共培養の前後に、被検物質と
血液脳関門透過物質又は血液脳関門非透過物質とを不死
化脳毛細血管内皮細胞株と接触させ、これら血液脳関門
透過物質又は血液脳関門非透過物質の不死化脳毛細血管
内皮細胞内への透過の程度を測定・評価することを特徴
とする血液脳関門透過促進又は抑制物質のスクリーニン
グ方法（請求項１１）や、請求項１〜９のいずれか記載
の血液脳関門再構築モデルを用いるスクリーニング方法
であって、共培養中又は共培養の前後に、被検物質を不
死化脳毛細血管内皮細胞株と接触させ、不死化脳毛細血
管内皮細胞内への被検物質の透過の程度を測定・評価す
ることを特徴とする血液脳関門透過又は非透過物質のス
クリーニング方法（請求項１２）や、請求項１０記載の
血液脳関門形成促進又は抑制物質のスクリーニング方法
により得られる血液脳関門形成促進物質（請求項１３）
や、請求項１０記載の血液脳関門形成促進又は抑制物質
のスクリーニング方法により得られる血液脳関門形成抑
制物質（請求項１４）や、請求項１１記載の血液脳関門
透過促進又は抑制物質のスクリーニング方法により得ら
れる血液脳関門透過促進物質（請求項１５）や、請求項
１１記載の血液脳関門透過促進又は抑制物質のスクリー
ニング方法により得られる血液脳関門透過抑制物質（請
求項１６）や、請求項１２記載の血液脳関門透過又は非
透過物質のスクリーニング方法により得られる血液脳関
門透過物質（請求項１７）や、請求項１２記載の血液脳
関門透過又は非透過物質のスクリーニング方法により得
られる血液脳関門非透過物質（請求項１８）に関する。
【００１２】また本発明は、ラット由来の不死化脳毛細
血管内皮細胞株と、ラット由来の不死化アストロサイト
細胞株とを共培養することにより得られることを特徴と
する血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死
化脳毛細血管内皮細胞株（請求項１９）や、ラット由来
の不死化脳毛細血管内皮細胞株と、ラット由来の不死化
アストロサイト細胞株と、ラット由来の不死化脳毛細血
管周皮細胞株とを共培養することにより得られることを
特徴とする血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強し
た不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２０）や、ラッ
ト由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株が、温度感受性変
異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入し
たトランスジェニックラット由来の不死化脳毛細血管内
皮細胞株であることを特徴とする請求項１９又は２０記
載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死
化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２１）や、温度感受性
変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入
したトランスジェニックラット由来の不死化脳毛細血管
内皮細胞株が、ＴＲ−ＢＢＢ１３（ＦＥＰＭ ＢＰ−６
８７３）であることを特徴とする請求項２１記載の血液
脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細
血管内皮細胞株（請求項２２）や、ラット由来の不死化
アストロサイト細胞株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔ
ｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェ
ニックラット由来の不死化アストロサイト細胞株である
ことを特徴とする請求項１９又は２０記載の血液脳関門
のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内
皮細胞株（請求項２３）や、温度感受性変異株ＳＶ４０
ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジ
ェニックラット由来の不死化アストロサイト細胞株が、
ＴＲ−ＡＳＴ９３２（ＦＥＰＭ ＢＰ−６２８３）であ
ることを特徴とする請求項２３記載の血液脳関門のマー
カー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞
株（請求項２４）や、ラット由来の不死化脳毛細血管周
皮細胞株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラ
ージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット
由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株であることを特徴と
する請求項２０記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発
現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２
５）や、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージ
Ｔ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来
の不死化脳毛細血管周皮細胞株が、ＴＲ−ＰＣＴ１（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−７０２４）であることを特徴とする請求
項２５記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強
した不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２６）や、共
培養が、不死化脳毛細血管内皮細胞株と不死化アストロ
サイト細胞株とを非接触状態で、又は不死化脳毛細血管
内皮細胞株と不死化アストロサイト細胞株及び不死化脳
毛細血管周皮細胞株とを非接触状態で培養する、非接触
系共培養であることを特徴とする請求項１９〜２６のい
ずれか記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強
した不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２７）や、血
液脳関門のマーカー遺伝子が、アルカリフォスファター
ゼ遺伝子、γ−グルタミールトランスペプチダーゼ遺伝
子、Ｇｌｕｔ１遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の
遺伝子であることを特徴とする請求項１９〜２７のいず
れか記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強し
た不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２８）や、アル
カリフォスファターゼ遺伝子の発現が、共培養すること
なく単独培養したときと比べて６倍以上増強したことを
特徴とする請求項２８記載の血液脳関門のマーカー遺伝
子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求
項２９）や、γ−グルタミールトランスペプチダーゼ遺
伝子の発現が、共培養することなく単独培養したときと
比べて２倍以上増強したことを特徴とする請求項２８又
は２９記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強
した不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項３０）や、Ｇ
ｌｕｔ１遺伝子の発現が、共培養することなく単独培養
したときと比べて１００倍以上増強したことを特徴とす
る請求項２８〜３０のいずれか記載の血液脳関門のマー
カー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞
株（請求項３１）に関する。
血管内皮細胞株と、ラット由来の不死化アストロサイト
細胞株とを共培養することにより得られることを特徴と
する血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死
化脳毛細血管内皮細胞株（請求項１９）や、ラット由来
の不死化脳毛細血管内皮細胞株と、ラット由来の不死化
アストロサイト細胞株と、ラット由来の不死化脳毛細血
管周皮細胞株とを共培養することにより得られることを
特徴とする血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強し
た不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２０）や、ラッ
ト由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株が、温度感受性変
異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入し
たトランスジェニックラット由来の不死化脳毛細血管内
皮細胞株であることを特徴とする請求項１９又は２０記
載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死
化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２１）や、温度感受性
変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入
したトランスジェニックラット由来の不死化脳毛細血管
内皮細胞株が、ＴＲ−ＢＢＢ１３（ＦＥＰＭ ＢＰ−６
８７３）であることを特徴とする請求項２１記載の血液
脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細
血管内皮細胞株（請求項２２）や、ラット由来の不死化
アストロサイト細胞株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔ
ｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェ
ニックラット由来の不死化アストロサイト細胞株である
ことを特徴とする請求項１９又は２０記載の血液脳関門
のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内
皮細胞株（請求項２３）や、温度感受性変異株ＳＶ４０
ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジ
ェニックラット由来の不死化アストロサイト細胞株が、
ＴＲ−ＡＳＴ９３２（ＦＥＰＭ ＢＰ−６２８３）であ
ることを特徴とする請求項２３記載の血液脳関門のマー
カー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞
株（請求項２４）や、ラット由来の不死化脳毛細血管周
皮細胞株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラ
ージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット
由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株であることを特徴と
する請求項２０記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発
現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２
５）や、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージ
Ｔ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来
の不死化脳毛細血管周皮細胞株が、ＴＲ−ＰＣＴ１（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−７０２４）であることを特徴とする請求
項２５記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強
した不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２６）や、共
培養が、不死化脳毛細血管内皮細胞株と不死化アストロ
サイト細胞株とを非接触状態で、又は不死化脳毛細血管
内皮細胞株と不死化アストロサイト細胞株及び不死化脳
毛細血管周皮細胞株とを非接触状態で培養する、非接触
系共培養であることを特徴とする請求項１９〜２６のい
ずれか記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強
した不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２７）や、血
液脳関門のマーカー遺伝子が、アルカリフォスファター
ゼ遺伝子、γ−グルタミールトランスペプチダーゼ遺伝
子、Ｇｌｕｔ１遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の
遺伝子であることを特徴とする請求項１９〜２７のいず
れか記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強し
た不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２８）や、アル
カリフォスファターゼ遺伝子の発現が、共培養すること
なく単独培養したときと比べて６倍以上増強したことを
特徴とする請求項２８記載の血液脳関門のマーカー遺伝
子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求
項２９）や、γ−グルタミールトランスペプチダーゼ遺
伝子の発現が、共培養することなく単独培養したときと
比べて２倍以上増強したことを特徴とする請求項２８又
は２９記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強
した不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項３０）や、Ｇ
ｌｕｔ１遺伝子の発現が、共培養することなく単独培養
したときと比べて１００倍以上増強したことを特徴とす
る請求項２８〜３０のいずれか記載の血液脳関門のマー
カー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞
株（請求項３１）に関する。
【００１３】また本発明は、被検物質と、請求項１９〜
３１のいずれか記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発
現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株とを接触さ
せ、血液脳関門のマーカー遺伝子の発現増強の程度を測
定・評価することを特徴とする血液脳関門形成促進又は
抑制物質のスクリーニング方法（請求項３２）や、被検
物質と血液脳関門透過物質又は血液脳関門非透過物質
と、請求項１９〜３１のいずれか記載の血液脳関門のマ
ーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細
胞株とを接触させ、これら血液脳関門透過物質又は血液
脳関門非透過物質の該不死化脳毛細血管内皮細胞内への
透過の程度を測定・評価することを特徴とする血液脳関
門透過促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項
３３）や、被検物質と、請求項１９〜３１のいずれか記
載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死
化脳毛細血管内皮細胞株とを接触させ、該不死化脳毛細
血管内皮細胞内への被検物質の透過の程度を測定・評価
することを特徴とする血液脳関門透過又は非透過物質の
スクリーニング方法（請求項３４）や、請求項３２記載
の血液脳関門形成促進又は抑制物質のスクリーニング方
法により得られる血液脳関門形成促進物質（請求項３
５）や、請求項３２記載の血液脳関門形成促進又は抑制
物質のスクリーニング方法により得られる血液脳関門形
成抑制物質（請求項３６）や、請求項３３記載の血液脳
関門透過促進又は抑制物質のスクリーニング方法により
得られる血液脳関門透過促進物質（請求項３７）や、請
求項３３記載の血液脳関門透過促進又は抑制物質のスク
リーニング方法により得られる血液脳関門透過抑制物質
（請求項３８）や、請求項３４記載の血液脳関門透過又
は非透過物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門透過物質（請求項３９）や、請求項３４記載の血
液脳関門透過又は非透過物質のスクリーニング方法によ
り得られる血液脳関門非透過物質（請求項４０）に関す
る。
３１のいずれか記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発
現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株とを接触さ
せ、血液脳関門のマーカー遺伝子の発現増強の程度を測
定・評価することを特徴とする血液脳関門形成促進又は
抑制物質のスクリーニング方法（請求項３２）や、被検
物質と血液脳関門透過物質又は血液脳関門非透過物質
と、請求項１９〜３１のいずれか記載の血液脳関門のマ
ーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細
胞株とを接触させ、これら血液脳関門透過物質又は血液
脳関門非透過物質の該不死化脳毛細血管内皮細胞内への
透過の程度を測定・評価することを特徴とする血液脳関
門透過促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項
３３）や、被検物質と、請求項１９〜３１のいずれか記
載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死
化脳毛細血管内皮細胞株とを接触させ、該不死化脳毛細
血管内皮細胞内への被検物質の透過の程度を測定・評価
することを特徴とする血液脳関門透過又は非透過物質の
スクリーニング方法（請求項３４）や、請求項３２記載
の血液脳関門形成促進又は抑制物質のスクリーニング方
法により得られる血液脳関門形成促進物質（請求項３
５）や、請求項３２記載の血液脳関門形成促進又は抑制
物質のスクリーニング方法により得られる血液脳関門形
成抑制物質（請求項３６）や、請求項３３記載の血液脳
関門透過促進又は抑制物質のスクリーニング方法により
得られる血液脳関門透過促進物質（請求項３７）や、請
求項３３記載の血液脳関門透過促進又は抑制物質のスク
リーニング方法により得られる血液脳関門透過抑制物質
（請求項３８）や、請求項３４記載の血液脳関門透過又
は非透過物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門透過物質（請求項３９）や、請求項３４記載の血
液脳関門透過又は非透過物質のスクリーニング方法によ
り得られる血液脳関門非透過物質（請求項４０）に関す
る。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明の血液脳関門再構築モデル
の作製方法は、ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞
株と、ラット由来の不死化アストロサイト細胞株とを共
培養することや、ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細
胞株と、ラット由来の不死化アストロサイト細胞株と、
ラット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株とを共培養す
ることを特徴とする。また、本発明の血液脳関門のマー
カー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞
株は、ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株と、ラ
ット由来の不死化アストロサイト細胞株とを共培養する
ことにより得られることや、ラット由来の不死化脳毛細
血管内皮細胞株と、ラット由来の不死化アストロサイト
細胞株と、ラット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株と
を共培養することにより得られることを特徴とする。
の作製方法は、ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞
株と、ラット由来の不死化アストロサイト細胞株とを共
培養することや、ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細
胞株と、ラット由来の不死化アストロサイト細胞株と、
ラット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株とを共培養す
ることを特徴とする。また、本発明の血液脳関門のマー
カー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞
株は、ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株と、ラ
ット由来の不死化アストロサイト細胞株とを共培養する
ことにより得られることや、ラット由来の不死化脳毛細
血管内皮細胞株と、ラット由来の不死化アストロサイト
細胞株と、ラット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株と
を共培養することにより得られることを特徴とする。
【００１５】上記ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細
胞株、不死化アストロサイト細胞株、及び不死化脳毛細
血管周皮細胞株としては、特に制限されるものではない
が、それぞれ正常な脳毛細血管内皮細胞、アストロサイ
ト細胞及び脳毛細血管周皮細胞が本来有する機能や性状
を保持したまま不死化細胞として樹立された細胞株が好
ましい。これら不死化細胞株の樹立方法としては特に制
限されないが、例えば、ＳＶ４０の温度感受性突然変異
株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランス
ジェニックラットから得られる不死化脳毛細血管内皮細
胞株、不死化アストロサイト細胞株及び不死化脳毛細血
管周皮細胞株が、温度条件によりその増殖を制御しう
る、すなわち３３〜３７℃において永久的増殖能を保持
し、３９℃においては増殖を停止するため、細胞固有の
分化形質の発現を制御することができることから好まし
い。
胞株、不死化アストロサイト細胞株、及び不死化脳毛細
血管周皮細胞株としては、特に制限されるものではない
が、それぞれ正常な脳毛細血管内皮細胞、アストロサイ
ト細胞及び脳毛細血管周皮細胞が本来有する機能や性状
を保持したまま不死化細胞として樹立された細胞株が好
ましい。これら不死化細胞株の樹立方法としては特に制
限されないが、例えば、ＳＶ４０の温度感受性突然変異
株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランス
ジェニックラットから得られる不死化脳毛細血管内皮細
胞株、不死化アストロサイト細胞株及び不死化脳毛細血
管周皮細胞株が、温度条件によりその増殖を制御しう
る、すなわち３３〜３７℃において永久的増殖能を保持
し、３９℃においては増殖を停止するため、細胞固有の
分化形質の発現を制御することができることから好まし
い。
【００１６】かかるＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔ
ｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェ
ニックラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株として
は、血液脳関門の酵素マーカーであるアルカリフォスフ
ァターゼ（ＡＬＰ）やγ−グルタミールトランスペプチ
ダーゼ（γ−ＧＴＰ）、ヘキソース輸送担体であるＧＬ
ＵＴ−１等を発現する細胞株ＴＲ−ＢＢＢ１、ＴＲ−Ｂ
ＢＢ５、ＴＲ−ＢＢＢ６、ＴＲ−ＢＢＢ１１、ＴＲ−Ｂ
ＢＢ１３等を具体的に例示することができる。上記細胞
株ＴＲ−ＢＢＢ１３は、ブタペスト条約に基づいて日本
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番
号ＦＥＰＭ ＢＰ−６８７３として寄託されている。
ｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェ
ニックラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株として
は、血液脳関門の酵素マーカーであるアルカリフォスフ
ァターゼ（ＡＬＰ）やγ−グルタミールトランスペプチ
ダーゼ（γ−ＧＴＰ）、ヘキソース輸送担体であるＧＬ
ＵＴ−１等を発現する細胞株ＴＲ−ＢＢＢ１、ＴＲ−Ｂ
ＢＢ５、ＴＲ−ＢＢＢ６、ＴＲ−ＢＢＢ１１、ＴＲ−Ｂ
ＢＢ１３等を具体的に例示することができる。上記細胞
株ＴＲ−ＢＢＢ１３は、ブタペスト条約に基づいて日本
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番
号ＦＥＰＭ ＢＰ−６８７３として寄託されている。
【００１７】また、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔ
ｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェ
ニックラット由来の不死化アストロサイト細胞株として
は、Ｎａ+依存性Ｌ−グルタミン酸トランスポーター等
の発現能を有する細胞株ＴＲ−ＡＳＴ３２、ＴＲ−ＡＳ
Ｔ８１１、ＴＲ−ＡＳＴ９１２、ＴＲ−ＡＳＴ９３２、
ＴＲ−ＡＳＴ９４３等を具体的に例示することができ
る。上記細胞株ＴＲ−ＡＳＴ９３２は、ブタペスト条約
に基づいて日本通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に受託番号ＦＥＰＭ ＢＰ−６２８３として寄託
されている。同様に、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株
ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジ
ェニックラット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株とし
ては、ＰＤＧＦ受容体β及びアンギオポエチン−１等の
発現能を有する細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１、ＴＲ−ＰＣＴ２
等を具体的に例示することができる。上記細胞株ＴＲ−
ＰＣＴ１は、ブタペスト条約に基づいて日本通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＰＭ
ＢＰ−７０２４として寄託されている。
ｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェ
ニックラット由来の不死化アストロサイト細胞株として
は、Ｎａ+依存性Ｌ−グルタミン酸トランスポーター等
の発現能を有する細胞株ＴＲ−ＡＳＴ３２、ＴＲ−ＡＳ
Ｔ８１１、ＴＲ−ＡＳＴ９１２、ＴＲ−ＡＳＴ９３２、
ＴＲ−ＡＳＴ９４３等を具体的に例示することができ
る。上記細胞株ＴＲ−ＡＳＴ９３２は、ブタペスト条約
に基づいて日本通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に受託番号ＦＥＰＭ ＢＰ−６２８３として寄託
されている。同様に、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株
ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジ
ェニックラット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株とし
ては、ＰＤＧＦ受容体β及びアンギオポエチン−１等の
発現能を有する細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１、ＴＲ−ＰＣＴ２
等を具体的に例示することができる。上記細胞株ＴＲ−
ＰＣＴ１は、ブタペスト条約に基づいて日本通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＰＭ
ＢＰ−７０２４として寄託されている。
【００１８】本発明における血液脳関門再構築モデル
は、ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株と、ラッ
ト由来の不死化アストロサイト細胞株とを共培養するこ
とや、ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株と、ラ
ット由来の不死化アストロサイト細胞株と、ラット由来
の不死化脳毛細血管周皮細胞株とを共培養することによ
って作製することができる。共培養は、これら細胞株同
士を接触状態で培養することにより、又は、不死化脳毛
細血管内皮細胞株と不死化アストロサイト細胞株、若し
くは不死化脳毛細血管内皮細胞株と不死化アストロサイ
ト細胞株及び不死化脳毛細血管周皮細胞株とを、例えば
液性因子などは透過することができるが細胞は透過する
ことができない膜を介して、非接触状態で培養すること
により行うことができる。このような膜を介する非接触
状態での共培養により、不死化脳毛細血管内皮細胞株だ
けを他の細胞から簡単に分離することができるばかりで
なく、種々の孔サイズの膜を用いることにより、細胞相
互間の情報伝達を担う液性因子の分子量を推定すること
ができる。
は、ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株と、ラッ
ト由来の不死化アストロサイト細胞株とを共培養するこ
とや、ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株と、ラ
ット由来の不死化アストロサイト細胞株と、ラット由来
の不死化脳毛細血管周皮細胞株とを共培養することによ
って作製することができる。共培養は、これら細胞株同
士を接触状態で培養することにより、又は、不死化脳毛
細血管内皮細胞株と不死化アストロサイト細胞株、若し
くは不死化脳毛細血管内皮細胞株と不死化アストロサイ
ト細胞株及び不死化脳毛細血管周皮細胞株とを、例えば
液性因子などは透過することができるが細胞は透過する
ことができない膜を介して、非接触状態で培養すること
により行うことができる。このような膜を介する非接触
状態での共培養により、不死化脳毛細血管内皮細胞株だ
けを他の細胞から簡単に分離することができるばかりで
なく、種々の孔サイズの膜を用いることにより、細胞相
互間の情報伝達を担う液性因子の分子量を推定すること
ができる。
【００１９】また、本発明の血液脳関門のマーカー遺伝
子、例えばアルカリフォスファターゼ遺伝子、γ−グル
タミールトランスペプチダーゼ遺伝子、Ｇｌｕｔ１遺伝
子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株は、前
記ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージ
Ｔ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来
の不死化脳毛細血管内皮細胞株を、前記不死化アストロ
サイト細胞株、又は該不死化アストロサイト細胞株と前
記不死化脳毛細血管周皮細胞株と共培養することにより
得ることができる。かかる血液脳関門のマーカー遺伝子
の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株として
は、共培養後も、共培養することなく単独培養したとき
と比べて、アルカリフォスファターゼ遺伝子の発現が６
倍以上、γ−グルタミールトランスペプチダーゼ遺伝子
の発現が２倍以上、Ｇｌｕｔ１遺伝子の発現が１００倍
以上増強された性状を維持した不死化脳毛細血管内皮細
胞株が好ましい。さらに、多孔性平面膜上で単層培養す
ると細胞が相互に結合して、表裏極性をもつ血液脳関門
を試験内で再構築することができる不死化脳毛細血管内
皮細胞株が特に好ましい。
子、例えばアルカリフォスファターゼ遺伝子、γ−グル
タミールトランスペプチダーゼ遺伝子、Ｇｌｕｔ１遺伝
子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株は、前
記ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージ
Ｔ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来
の不死化脳毛細血管内皮細胞株を、前記不死化アストロ
サイト細胞株、又は該不死化アストロサイト細胞株と前
記不死化脳毛細血管周皮細胞株と共培養することにより
得ることができる。かかる血液脳関門のマーカー遺伝子
の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株として
は、共培養後も、共培養することなく単独培養したとき
と比べて、アルカリフォスファターゼ遺伝子の発現が６
倍以上、γ−グルタミールトランスペプチダーゼ遺伝子
の発現が２倍以上、Ｇｌｕｔ１遺伝子の発現が１００倍
以上増強された性状を維持した不死化脳毛細血管内皮細
胞株が好ましい。さらに、多孔性平面膜上で単層培養す
ると細胞が相互に結合して、表裏極性をもつ血液脳関門
を試験内で再構築することができる不死化脳毛細血管内
皮細胞株が特に好ましい。
【００２０】本発明における血液脳関門再構築モデルや
本発明の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した
不死化脳毛細血管内皮細胞は、血液から脳組織への物質
移行を制限している血液脳関門の研究、すなわち、脳の
栄養代謝研究や脳内への薬物透過研究及び血液脳関門に
おける防御機構の研究に活用することができる。従っ
て、医薬品の安全性や有効性に関するスクリーニング、
脳の栄養代謝及び恒常性機能障害に関連する疾患の診断
やその治療方法の開発の細胞レベルでの研究に有利であ
る。以下、本発明における血液脳関門再構築モデルや本
発明の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不
死化脳毛細血管内皮細胞を用いた、血液脳関門形成促進
又は抑制物質や、血液脳関門透過促進又は抑制物質や、
血液脳関門透過又は非透過物質のスクリーニング方法に
ついて説明する。
本発明の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した
不死化脳毛細血管内皮細胞は、血液から脳組織への物質
移行を制限している血液脳関門の研究、すなわち、脳の
栄養代謝研究や脳内への薬物透過研究及び血液脳関門に
おける防御機構の研究に活用することができる。従っ
て、医薬品の安全性や有効性に関するスクリーニング、
脳の栄養代謝及び恒常性機能障害に関連する疾患の診断
やその治療方法の開発の細胞レベルでの研究に有利であ
る。以下、本発明における血液脳関門再構築モデルや本
発明の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不
死化脳毛細血管内皮細胞を用いた、血液脳関門形成促進
又は抑制物質や、血液脳関門透過促進又は抑制物質や、
血液脳関門透過又は非透過物質のスクリーニング方法に
ついて説明する。
【００２１】血液脳関門再構築モデルを用いる血液脳関
門形成促進又は抑制物質のスクリーニングは、共培養中
又は共培養の前後に、被検物質を不死化脳毛細血管内皮
細胞株と接触させ、血液脳関門のマーカー遺伝子の発現
の程度を測定し、被検物質が非存在の対照の場合と比較
・評価することにより行うことができる。また、血液脳
関門形成促進又は抑制物質のスクリーニングは、被検物
質と血液脳関門マーカー遺伝子の発現が増強した不死化
脳毛細血管内皮細胞株とを接触させ、血液脳関門のマー
カー遺伝子の発現増強の程度を測定し、被検物質が非存
在の対照の場合と比較・評価することによっても行うこ
とができる。これらスクリーニングにより得られる血液
脳関門形成促進物質は、血液脳関門形成不全に起因する
治療剤として期待することができ、また、これら血液脳
関門形成促進又は抑制物質は、細胞レベルでの血液脳関
門形成の研究に有用である。
門形成促進又は抑制物質のスクリーニングは、共培養中
又は共培養の前後に、被検物質を不死化脳毛細血管内皮
細胞株と接触させ、血液脳関門のマーカー遺伝子の発現
の程度を測定し、被検物質が非存在の対照の場合と比較
・評価することにより行うことができる。また、血液脳
関門形成促進又は抑制物質のスクリーニングは、被検物
質と血液脳関門マーカー遺伝子の発現が増強した不死化
脳毛細血管内皮細胞株とを接触させ、血液脳関門のマー
カー遺伝子の発現増強の程度を測定し、被検物質が非存
在の対照の場合と比較・評価することによっても行うこ
とができる。これらスクリーニングにより得られる血液
脳関門形成促進物質は、血液脳関門形成不全に起因する
治療剤として期待することができ、また、これら血液脳
関門形成促進又は抑制物質は、細胞レベルでの血液脳関
門形成の研究に有用である。
【００２２】血液脳関門再構築モデルを用いる血液脳関
門透過促進又は抑制物質のスクリーニングは、共培養中
又は共培養の前後に、既知の血液脳関門透過物質又は血
液脳関門非透過物質と被検物質とを、不死化脳毛細血管
内皮細胞株と接触させ、これら血液脳関門透過物質又は
血液脳関門非透過物質の不死化脳毛細血管内皮細胞内へ
の透過の程度を測定し、被検物質が非存在の対照の場合
と比較・評価することによって行うことができる。ま
た、血液脳関門透過促進又は抑制物質のスクリーニング
は、既知の血液脳関門透過物質又は血液脳関門非透過物
質と被検物質とを、血液脳関門マーカー遺伝子の発現が
増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株と接触させ、これ
ら血液脳関門透過物質又は血液脳関門非透過物質の不死
化脳毛細血管内皮細胞内への透過量の程度を測定し、被
検物質が非存在の対照の場合と比較・評価することによ
っても行うことができる。これらスクリーニングにより
得られる血液脳関門透過促進又は抑制物質は、脳の栄養
代謝研究や脳内への薬物透過研究や血液脳関門における
防御機構の研究に活用することができ、特に血液脳関門
透過促進物質は、中枢作用型薬物（抗痴呆薬、脳腫瘍治
療薬、ウイルス治療薬、精神神経作用薬）との併用剤と
して有用である。
門透過促進又は抑制物質のスクリーニングは、共培養中
又は共培養の前後に、既知の血液脳関門透過物質又は血
液脳関門非透過物質と被検物質とを、不死化脳毛細血管
内皮細胞株と接触させ、これら血液脳関門透過物質又は
血液脳関門非透過物質の不死化脳毛細血管内皮細胞内へ
の透過の程度を測定し、被検物質が非存在の対照の場合
と比較・評価することによって行うことができる。ま
た、血液脳関門透過促進又は抑制物質のスクリーニング
は、既知の血液脳関門透過物質又は血液脳関門非透過物
質と被検物質とを、血液脳関門マーカー遺伝子の発現が
増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株と接触させ、これ
ら血液脳関門透過物質又は血液脳関門非透過物質の不死
化脳毛細血管内皮細胞内への透過量の程度を測定し、被
検物質が非存在の対照の場合と比較・評価することによ
っても行うことができる。これらスクリーニングにより
得られる血液脳関門透過促進又は抑制物質は、脳の栄養
代謝研究や脳内への薬物透過研究や血液脳関門における
防御機構の研究に活用することができ、特に血液脳関門
透過促進物質は、中枢作用型薬物（抗痴呆薬、脳腫瘍治
療薬、ウイルス治療薬、精神神経作用薬）との併用剤と
して有用である。
【００２３】血液脳関門再構築モデルを用いる血液脳関
門透過又は非透過物質のスクリーニングは、共培養中又
は共培養の前後に、被検物質を不死化脳毛細血管内皮細
胞株と接触させ、不死化脳毛細血管内皮細胞内への被検
物質の透過の程度を測定し、被検物質が非存在の対照の
場合と比較・評価することによって行うことができる。
また、血液脳関門透過又は非透過物質のスクリーニング
は、血液脳関門マーカー遺伝子の発現が増強した不死化
脳毛細血管内皮細胞株と被検物質とを接触させ、該不死
化脳毛細血管内皮細胞内への被検物質の透過量の程度を
測定し、被検物質が非存在の対照の場合と比較・評価す
ることによっても行うことができる。これらスクリーニ
ングにより得られる血液脳関門透過物質は、前記中枢作
用型薬物として期待することができ、血液脳関門非透過
物質は、中枢での副作用の問題がない薬物として期待す
ることができる。
門透過又は非透過物質のスクリーニングは、共培養中又
は共培養の前後に、被検物質を不死化脳毛細血管内皮細
胞株と接触させ、不死化脳毛細血管内皮細胞内への被検
物質の透過の程度を測定し、被検物質が非存在の対照の
場合と比較・評価することによって行うことができる。
また、血液脳関門透過又は非透過物質のスクリーニング
は、血液脳関門マーカー遺伝子の発現が増強した不死化
脳毛細血管内皮細胞株と被検物質とを接触させ、該不死
化脳毛細血管内皮細胞内への被検物質の透過量の程度を
測定し、被検物質が非存在の対照の場合と比較・評価す
ることによっても行うことができる。これらスクリーニ
ングにより得られる血液脳関門透過物質は、前記中枢作
用型薬物として期待することができ、血液脳関門非透過
物質は、中枢での副作用の問題がない薬物として期待す
ることができる。
【００２４】
【実施例】以下の実施例をもって本発明をより詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定される
ものではない。 実施例１（トランスジェニックラットの作出） ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のＤＮＡを
導入したトランスジェニックラットは、下記の手順で作
出した。
明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定される
ものではない。 実施例１（トランスジェニックラットの作出） ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のＤＮＡを
導入したトランスジェニックラットは、下記の手順で作
出した。
【００２５】１−１（導入遺伝子の調製） マイクロインジェクションにはＳＶ４０の温度感受性突
然変異株ｔｓＡ５８のゲノムＤＮＡを使用した。ｔｓＡ
５８のゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで開環し、ｐ
ＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に導入し、ＳｆｉＩ配列を
ＳａｃIIに変換してＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）を欠
失するｏｒｉ（−）としたＤＮＡクローンｐＳＶｔｓＡ
５８ｏｒｉ（−）−２（Ohno T. et al., Cytotechnolo
gy, 165-172, 1991；図１参照）から常法に従い導入用
ＤＮＡを調製した。すなわち、大腸菌内で大量に増幅さ
せることにより得られたプラスミドＤＮＡのｐＳＶｔｓ
Ａ５８ｏｒｉ（−）−２を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造
社製）で消化した後、アガロース電気泳動法（１％ゲ
ル；ベーリンガー社製）により分離し、ゲルを溶解した
後、フェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿
処理を行いＤＮＡを回収した。回収した精製ＤＮＡをＴ
Ｅバッファー（１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）に溶解して１７０μｇ／ｍ
ｌの精製ＤＮＡを含む溶液を得た。このＤＮＡ溶液を注
入用バッファー（０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）で５μｇ／ｍｌとな
るように希釈して注入用ＤＮＡ溶液を調製した。なお、
調製したＤＮＡ溶液は注入操作まで−２０℃で保存し
た。
然変異株ｔｓＡ５８のゲノムＤＮＡを使用した。ｔｓＡ
５８のゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで開環し、ｐ
ＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に導入し、ＳｆｉＩ配列を
ＳａｃIIに変換してＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）を欠
失するｏｒｉ（−）としたＤＮＡクローンｐＳＶｔｓＡ
５８ｏｒｉ（−）−２（Ohno T. et al., Cytotechnolo
gy, 165-172, 1991；図１参照）から常法に従い導入用
ＤＮＡを調製した。すなわち、大腸菌内で大量に増幅さ
せることにより得られたプラスミドＤＮＡのｐＳＶｔｓ
Ａ５８ｏｒｉ（−）−２を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造
社製）で消化した後、アガロース電気泳動法（１％ゲ
ル；ベーリンガー社製）により分離し、ゲルを溶解した
後、フェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿
処理を行いＤＮＡを回収した。回収した精製ＤＮＡをＴ
Ｅバッファー（１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）に溶解して１７０μｇ／ｍ
ｌの精製ＤＮＡを含む溶液を得た。このＤＮＡ溶液を注
入用バッファー（０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）で５μｇ／ｍｌとな
るように希釈して注入用ＤＮＡ溶液を調製した。なお、
調製したＤＮＡ溶液は注入操作まで−２０℃で保存し
た。
【００２６】１−２（トランスジェニックラットの作
出） ラット前核期受精卵への上記調製した注入用ＤＮＡ溶液
のマイクロインジェクションは下記の要領で行った。性
成熟した８週齢のウィスターラットを明暗サイクル１２
時間（４：００〜１６：００を明時間）、温度２３±２
℃、湿度５５±５％で飼育し、膣スメアにより雌の性周
期を観察して、ホルモン処理日を選択した。まず、雌ラ
ットにより１５０ＩＵ／ｋｇの妊馬血清性性腺刺激ホル
モン（日本ゼンヤク社製；ＰＭＳ全薬（pregnant mare
serum gonadotropin：ＰＭＳＧ））を腹腔内投与し、そ
の４８時間後に７５ＩＵ／ｋｇのヒト絨毛性性腺刺激ホ
ルモン（三共臓器社製；プベローゲン（human chorioni
c gonadotropin：ｈＣＧ））を投与して過剰排卵処理を
行った後、雄との同居により交配を行った．ｈＣＧ投与
３２時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。
卵管灌流及び卵の培養にはｍＫＲＢ液（Toyoda Y. and
Chang M.C., J. Reprod. Fertil., 36, 9-22, 1974）を
使用した。採取した受精卵を０．１％のヒアルロニダー
ゼ（シグマ社製；Hyaluronidase Typel-S）を含むｍＫ
ＲＢ液中で３７℃、５分間の酵素処理を行い卵丘細胞を
除去した後、ｍＫＲＢ液で３回洗浄して酵素を除去し、
ＤＮＡ注入操作までＣＯ2−インキュベーター内（５％
のＣＯ2−９５％のＡｉｒ，３７℃、飽和湿度）に保存
した。この様にして準備したラット受精卵の雄性前核に
前記ＤＮＡ溶液を注入した。注入した２２８個の卵を９
匹の仮親に移植して出産させ８０匹の産仔を得た。注入
ＤＮＡのラットへの導入は、離乳直後に断尾して得た尾
より調製したＤＮＡをＰＣＲ法により検定した［使用プ
ライマー；ｔｓＡ５８−１Ａ，５′−ＴＣＣＴＡＡＴＧ
ＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧ−３′（１３６５〜１３８４
部位に相当：配列番号１）、ｔｓＡ５８−１Ｂ，５′−
ＡＴＧＡＣＧＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧ−３′（１
５７１〜１５９０部位に相当：配列番号２）］。その結
果、遺伝子導入の認められた２０匹（雄６匹、雌８匹、
生別不明６匹）の産仔の中から性成熟期間を経過する１
２週齢まで生存した１１ラインのトランスジェニックラ
ット（雄ライン：＃０７−２，＃０７−５，＃０９−
６，＃１２−３，＃１９−５，雌ライン：＃０９−７，
＃１１−６，＃１２−５，＃１２−７，＃１８−５，＃
１９−８）を得た。これらのＧ0世代のトランスジェニ
ックラットとウィスターラットを交配し、雄ファウンダ
ーの２ライン（＃０７−２，＃０７−５）と雌ファウン
ダーの３ライン（＃０９−７，＃１１−６，＃１９−
８）において次世代以降への遺伝子の伝達を確認した。
出） ラット前核期受精卵への上記調製した注入用ＤＮＡ溶液
のマイクロインジェクションは下記の要領で行った。性
成熟した８週齢のウィスターラットを明暗サイクル１２
時間（４：００〜１６：００を明時間）、温度２３±２
℃、湿度５５±５％で飼育し、膣スメアにより雌の性周
期を観察して、ホルモン処理日を選択した。まず、雌ラ
ットにより１５０ＩＵ／ｋｇの妊馬血清性性腺刺激ホル
モン（日本ゼンヤク社製；ＰＭＳ全薬（pregnant mare
serum gonadotropin：ＰＭＳＧ））を腹腔内投与し、そ
の４８時間後に７５ＩＵ／ｋｇのヒト絨毛性性腺刺激ホ
ルモン（三共臓器社製；プベローゲン（human chorioni
c gonadotropin：ｈＣＧ））を投与して過剰排卵処理を
行った後、雄との同居により交配を行った．ｈＣＧ投与
３２時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。
卵管灌流及び卵の培養にはｍＫＲＢ液（Toyoda Y. and
Chang M.C., J. Reprod. Fertil., 36, 9-22, 1974）を
使用した。採取した受精卵を０．１％のヒアルロニダー
ゼ（シグマ社製；Hyaluronidase Typel-S）を含むｍＫ
ＲＢ液中で３７℃、５分間の酵素処理を行い卵丘細胞を
除去した後、ｍＫＲＢ液で３回洗浄して酵素を除去し、
ＤＮＡ注入操作までＣＯ2−インキュベーター内（５％
のＣＯ2−９５％のＡｉｒ，３７℃、飽和湿度）に保存
した。この様にして準備したラット受精卵の雄性前核に
前記ＤＮＡ溶液を注入した。注入した２２８個の卵を９
匹の仮親に移植して出産させ８０匹の産仔を得た。注入
ＤＮＡのラットへの導入は、離乳直後に断尾して得た尾
より調製したＤＮＡをＰＣＲ法により検定した［使用プ
ライマー；ｔｓＡ５８−１Ａ，５′−ＴＣＣＴＡＡＴＧ
ＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧ−３′（１３６５〜１３８４
部位に相当：配列番号１）、ｔｓＡ５８−１Ｂ，５′−
ＡＴＧＡＣＧＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧ−３′（１
５７１〜１５９０部位に相当：配列番号２）］。その結
果、遺伝子導入の認められた２０匹（雄６匹、雌８匹、
生別不明６匹）の産仔の中から性成熟期間を経過する１
２週齢まで生存した１１ラインのトランスジェニックラ
ット（雄ライン：＃０７−２，＃０７−５，＃０９−
６，＃１２−３，＃１９−５，雌ライン：＃０９−７，
＃１１−６，＃１２−５，＃１２−７，＃１８−５，＃
１９−８）を得た。これらのＧ0世代のトランスジェニ
ックラットとウィスターラットを交配し、雄ファウンダ
ーの２ライン（＃０７−２，＃０７−５）と雌ファウン
ダーの３ライン（＃０９−７，＃１１−６，＃１９−
８）において次世代以降への遺伝子の伝達を確認した。
【００２７】実施例２（脳毛細血管内皮細胞の調製） ２−１（脳毛細血管内皮細胞の分離） 実施例１で得られたＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔ
ｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェ
ニックラット（１匹）より大脳を摘出した。クリーンベ
ンチ内で摘出した大脳を氷冷した調整用緩衝液（１０ｍ
ＭのＨｅｐｅｓ、１００Ｕ／ｍｌのbenzylpenicillin p
otassium、１００μｇ／ｍｌのstreptomycin sulfate、
０．５％のウシ血清アルブミンを含むＨＢＳＳ）でよく
洗浄した後、大脳を１〜２ｍｍ3に細切し、１ｍｌ用テ
ーバー型テフロン（登録商標）製ホモゲナイザー（WHEA
TON社製）に移し、１ｍｌの氷冷した調整用緩衝液を加
え、４回のアップダウンのストロークを行い組織をホモ
ゲナイズしてスラリーを得た。得られたスラリーを遠心
（６００×ｇ、５分間、４℃）してペレットを得た。得
られたペレットを１ｍｌの酵素溶液（０．０１％のcoll
agenase/dispase（Boehringer Manheim社製）、１００
Ｕ／ｍｌのbenzylpenicillin potassium、１００μｇ／
ｍｌのstreptomycin sulfate、２０Ｕ／ｍｌのdeoxyrib
onuclease I、０．１４７μｇ／ｍｌのtosyl-lysine-ch
loromethylketoneを添加したＨＢＳＳ）に懸濁し、振盪
を加えた水浴中で酵素処理（３７℃、３０分間）を行
い、不要な組織から毛細血管を分離した。遠心（６００
×ｇ、５分間、４℃）してペレットを得た。得られたペ
レットから不要な組織を除去するため、１０ｍｌの１６
％のデキストランを含むＨＢＳＳにペレットを懸濁し、
遠心（１，０００×ｇ、１５分間、４℃）により毛細血
管画分のペレットを得た。得られたペレットを再び１ｍ
ｌの酵素溶液に懸濁して酵素処理（３７℃、３０分間）
を行うことで毛細血管を細切した。遠心（６００×ｇ、
５分間、４℃）してペレットを得た。次に、得られたペ
レットを２ｍｌの培養液（１５μｇ／ｍｌのendothelia
l cell growth factor、１００Ｕ／ｍｌのbenzylpenici
llin potassium、１００μｇ／ｍｌのstreptomycin sul
fate、２．５０μｇ／ｍｌのamphotericin Bを添加した
ＤＭＥＭ）に分散して１枚のコラーゲンタイプＩをコー
トした３５mmφ培養シャーレー（Becton Dickinson社
製）に播種した。３３℃の炭酸ガス培養器（５％ＣＯ2
−９５％Ａｉｒ、飽和湿度）内で培養（初代培養）し
た。培地を１週間に２回交換し、継代はトリプシン液
（０．０５％のTrypsin、０．５３ｍＭＥＤＴＡ；Gibco
BRL社製）を用いて細胞を剥離し、細胞を分散播種し
た。継代はおよそ１週間隔で行った。３回の継代の後、
１０2〜１０3個の細胞をコラーゲンタイプＩをコートし
た１００mmφ培養シャーレー（Becton Dickinson社製）
に播種した。３３℃の炭酸ガス培養器内で培養してコロ
ニー形成を行った。培地を１週間に２回交換し、７〜１
０日後にコロニーを形成した増殖速度の比較的速いコロ
ニーをペニシリンカップを用いて周囲の細胞から単離
し、得られた細胞を再び１００mmφ培養シャーレーに播
種して３３℃の炭酸ガス培養器内で培養してコロニー形
成を行った。ペニシリンカップを用いて増殖速度の比較
的速いコロニーを周囲の細胞から単離して５種の細胞株
（ＴＲ−ＢＢＢ１、ＴＲ−ＢＢＢ５、ＴＲ−ＢＢＢ６、
ＴＲ−ＢＢＢ１１、ＴＲ−ＢＢＢ１３）を得た。これら
の細胞株は内皮細胞特異的なスピンドルファイバー状の
継代を示した。なお、ＴＲ−ＢＢＢ１３株は、ブタペス
ト条約に基づいて日本通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に受託番号ＦＥＰＭ ＢＰ−６８７３とし
て寄託されている。
ｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェ
ニックラット（１匹）より大脳を摘出した。クリーンベ
ンチ内で摘出した大脳を氷冷した調整用緩衝液（１０ｍ
ＭのＨｅｐｅｓ、１００Ｕ／ｍｌのbenzylpenicillin p
otassium、１００μｇ／ｍｌのstreptomycin sulfate、
０．５％のウシ血清アルブミンを含むＨＢＳＳ）でよく
洗浄した後、大脳を１〜２ｍｍ3に細切し、１ｍｌ用テ
ーバー型テフロン（登録商標）製ホモゲナイザー（WHEA
TON社製）に移し、１ｍｌの氷冷した調整用緩衝液を加
え、４回のアップダウンのストロークを行い組織をホモ
ゲナイズしてスラリーを得た。得られたスラリーを遠心
（６００×ｇ、５分間、４℃）してペレットを得た。得
られたペレットを１ｍｌの酵素溶液（０．０１％のcoll
agenase/dispase（Boehringer Manheim社製）、１００
Ｕ／ｍｌのbenzylpenicillin potassium、１００μｇ／
ｍｌのstreptomycin sulfate、２０Ｕ／ｍｌのdeoxyrib
onuclease I、０．１４７μｇ／ｍｌのtosyl-lysine-ch
loromethylketoneを添加したＨＢＳＳ）に懸濁し、振盪
を加えた水浴中で酵素処理（３７℃、３０分間）を行
い、不要な組織から毛細血管を分離した。遠心（６００
×ｇ、５分間、４℃）してペレットを得た。得られたペ
レットから不要な組織を除去するため、１０ｍｌの１６
％のデキストランを含むＨＢＳＳにペレットを懸濁し、
遠心（１，０００×ｇ、１５分間、４℃）により毛細血
管画分のペレットを得た。得られたペレットを再び１ｍ
ｌの酵素溶液に懸濁して酵素処理（３７℃、３０分間）
を行うことで毛細血管を細切した。遠心（６００×ｇ、
５分間、４℃）してペレットを得た。次に、得られたペ
レットを２ｍｌの培養液（１５μｇ／ｍｌのendothelia
l cell growth factor、１００Ｕ／ｍｌのbenzylpenici
llin potassium、１００μｇ／ｍｌのstreptomycin sul
fate、２．５０μｇ／ｍｌのamphotericin Bを添加した
ＤＭＥＭ）に分散して１枚のコラーゲンタイプＩをコー
トした３５mmφ培養シャーレー（Becton Dickinson社
製）に播種した。３３℃の炭酸ガス培養器（５％ＣＯ2
−９５％Ａｉｒ、飽和湿度）内で培養（初代培養）し
た。培地を１週間に２回交換し、継代はトリプシン液
（０．０５％のTrypsin、０．５３ｍＭＥＤＴＡ；Gibco
BRL社製）を用いて細胞を剥離し、細胞を分散播種し
た。継代はおよそ１週間隔で行った。３回の継代の後、
１０2〜１０3個の細胞をコラーゲンタイプＩをコートし
た１００mmφ培養シャーレー（Becton Dickinson社製）
に播種した。３３℃の炭酸ガス培養器内で培養してコロ
ニー形成を行った。培地を１週間に２回交換し、７〜１
０日後にコロニーを形成した増殖速度の比較的速いコロ
ニーをペニシリンカップを用いて周囲の細胞から単離
し、得られた細胞を再び１００mmφ培養シャーレーに播
種して３３℃の炭酸ガス培養器内で培養してコロニー形
成を行った。ペニシリンカップを用いて増殖速度の比較
的速いコロニーを周囲の細胞から単離して５種の細胞株
（ＴＲ−ＢＢＢ１、ＴＲ−ＢＢＢ５、ＴＲ−ＢＢＢ６、
ＴＲ−ＢＢＢ１１、ＴＲ−ＢＢＢ１３）を得た。これら
の細胞株は内皮細胞特異的なスピンドルファイバー状の
継代を示した。なお、ＴＲ−ＢＢＢ１３株は、ブタペス
ト条約に基づいて日本通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に受託番号ＦＥＰＭ ＢＰ−６８７３とし
て寄託されている。
【００２８】２−２（ラージＴ抗原タンパク質の確認） 上記実施例２−１で得られた５種の細胞株におけるラー
ジＴ抗原蛋白質の発現をウエスタンブロット法（実験医
学別冊バイオマニュアルＵＰシリーズ「分子生物学的ア
プローチによる癌研究プロトコール」１０８〜１１５
頁、羊土社、１９９５年発行）により検討した。５種の
細胞株（継代数：２０）を９０mmφ培養シャーレーで飽
和まで培養した。回収した細胞を３％ＳＤＳ−ＰＢＳ
（ｐＨ７.４）で可溶化した後、遠心（１０，０００ｒ
ｐｍ １０分間）して不溶画分を除去した後、ブラッド
フォード法（BIO-RAD社製プロテインアッセイキットII
を使用）で総蛋白質量を定量した。それぞれ２０μｇの
蛋白質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離
後、ニトロセルロース膜に転写した。３％スキムミルク
溶液でブロッキングしたニトロセルロース膜に１次抗体
として抗ＳＶ４０ラージＴ抗原抗体（CALBIOCHEM社製、
DPO2-C）を、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ
抗体（Amersham社製）を反応させ、ラージＴ抗原蛋白質
特異的な反応をアマシャム社製ECLウエスタンブロッテ
ィング検出システム（RPN2106M1）を用いて検出した。
５種の細胞株全てにおいてラージＴ抗原蛋白質の発現を
確認した。
ジＴ抗原蛋白質の発現をウエスタンブロット法（実験医
学別冊バイオマニュアルＵＰシリーズ「分子生物学的ア
プローチによる癌研究プロトコール」１０８〜１１５
頁、羊土社、１９９５年発行）により検討した。５種の
細胞株（継代数：２０）を９０mmφ培養シャーレーで飽
和まで培養した。回収した細胞を３％ＳＤＳ−ＰＢＳ
（ｐＨ７.４）で可溶化した後、遠心（１０，０００ｒ
ｐｍ １０分間）して不溶画分を除去した後、ブラッド
フォード法（BIO-RAD社製プロテインアッセイキットII
を使用）で総蛋白質量を定量した。それぞれ２０μｇの
蛋白質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離
後、ニトロセルロース膜に転写した。３％スキムミルク
溶液でブロッキングしたニトロセルロース膜に１次抗体
として抗ＳＶ４０ラージＴ抗原抗体（CALBIOCHEM社製、
DPO2-C）を、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ
抗体（Amersham社製）を反応させ、ラージＴ抗原蛋白質
特異的な反応をアマシャム社製ECLウエスタンブロッテ
ィング検出システム（RPN2106M1）を用いて検出した。
５種の細胞株全てにおいてラージＴ抗原蛋白質の発現を
確認した。
【００２９】２−３（細胞の同定） 上記実施例２−１で得られた細胞株が脳毛細血管内皮細
胞であることを、ＧＬＵＴ−１輸送担体およびｐ−糖蛋
白質の発現をウエスタンブロッティング法で検定した。
得られた各細胞株について、実施例２−２と同じ方法で
作製したニトロセルロース膜を用いて、１次抗体として
抗マウスＧＬＵＴ−１抗体（Chemicon社製、Temecular,
CA）又は抗ｐ−糖蛋白質ウサギ抗体（抗ｍｄｒ抗体、O
ncogeneResearch Products社製）を、２次抗体としてＨ
ＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Amersham社製）又はＨＲ
Ｐ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Cappel社製）を反応させ、
ＧＬＵＴ−１蛋白質あるいはｐ−糖蛋白質特異的な反応
をアマシャム社製ECLウエスタンブロッティング検出シ
ステム（RPN2106M1）を用いて検出した。５種の細胞株
全てにおいてＧＬＵＴ−１蛋白質及びｐ−糖蛋白質の発
現が確認された。従って、得られた５種の細胞が脳毛細
血管内皮細胞であることが同定された。
胞であることを、ＧＬＵＴ−１輸送担体およびｐ−糖蛋
白質の発現をウエスタンブロッティング法で検定した。
得られた各細胞株について、実施例２−２と同じ方法で
作製したニトロセルロース膜を用いて、１次抗体として
抗マウスＧＬＵＴ−１抗体（Chemicon社製、Temecular,
CA）又は抗ｐ−糖蛋白質ウサギ抗体（抗ｍｄｒ抗体、O
ncogeneResearch Products社製）を、２次抗体としてＨ
ＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Amersham社製）又はＨＲ
Ｐ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Cappel社製）を反応させ、
ＧＬＵＴ−１蛋白質あるいはｐ−糖蛋白質特異的な反応
をアマシャム社製ECLウエスタンブロッティング検出シ
ステム（RPN2106M1）を用いて検出した。５種の細胞株
全てにおいてＧＬＵＴ−１蛋白質及びｐ−糖蛋白質の発
現が確認された。従って、得られた５種の細胞が脳毛細
血管内皮細胞であることが同定された。
【００３０】２−４（グルコース輸送能の確認） 上記実施例２−１で得られた細胞株ＴＲ−ＢＢＢ１、Ｔ
Ｒ−ＢＢＢ５、ＴＲ−ＢＢＢ６、ＴＲ−ＢＢＢ１１、Ｔ
Ｒ−ＢＢＢ１３が機能的なＧＬＵＴ−１輸送担体を持つ
ことを、３−ＯＭＧ（3-o-methyl-D-glucose）取り込み
能を測定し、濃度依存的なグルコース輸送能を示すこと
で機能的なＧＬＵＴ−１輸送担体を有することを確認し
た。すなわち、２４穴細胞培養用プレートにＴＲ−ＢＢ
Ｂ株を３×１０5／ウェル／ｍｌとなるように播き、３
３℃の炭酸ガス培養基で２４時間培養して細胞をコンフ
ルエントにした。３−ＯＭＧの取り込みの測定は次の要
領で行った。まず、培地を吸引して除去した後、３７℃
に温めた２３２ｋＢｑ／ｍｌの［3Ｈ］３−ＯＭＧを含
むuptake bufferを０．２ｍｌ加えた。uptake buffer
（１２２ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭ
のＣａＣｌ2、１．４ｍＭのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．
４ｍＭのＫ2ＨＰＯ4、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２５ｍＭ
のＮａＨＣＯ3）は、５％ＣＯ2−９５％Ｏ2で２０分間
バブリングしてＮａＯＨでｐＨ７．４に調製したもので
ある。１０秒後にuptake bufferを取り除き、４℃のupt
ake bufferで洗浄した。以下、uptake bufferを取り除
くまでの時間を２０秒間、３０秒間、１分間として同様
の操作を行った。細胞を１％のトライトンＸ−１００を
含む１ｍｌのＰＢＳで一晩可溶化し、液体シンチレーシ
ョンカウンターを用いて放射活性を測定し、３−ＯＭＧ
の取り込み能の直線性を確認した。結果、２０秒間の取
り込み時間を設定した。
Ｒ−ＢＢＢ５、ＴＲ−ＢＢＢ６、ＴＲ−ＢＢＢ１１、Ｔ
Ｒ−ＢＢＢ１３が機能的なＧＬＵＴ−１輸送担体を持つ
ことを、３−ＯＭＧ（3-o-methyl-D-glucose）取り込み
能を測定し、濃度依存的なグルコース輸送能を示すこと
で機能的なＧＬＵＴ−１輸送担体を有することを確認し
た。すなわち、２４穴細胞培養用プレートにＴＲ−ＢＢ
Ｂ株を３×１０5／ウェル／ｍｌとなるように播き、３
３℃の炭酸ガス培養基で２４時間培養して細胞をコンフ
ルエントにした。３−ＯＭＧの取り込みの測定は次の要
領で行った。まず、培地を吸引して除去した後、３７℃
に温めた２３２ｋＢｑ／ｍｌの［3Ｈ］３−ＯＭＧを含
むuptake bufferを０．２ｍｌ加えた。uptake buffer
（１２２ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭ
のＣａＣｌ2、１．４ｍＭのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．
４ｍＭのＫ2ＨＰＯ4、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２５ｍＭ
のＮａＨＣＯ3）は、５％ＣＯ2−９５％Ｏ2で２０分間
バブリングしてＮａＯＨでｐＨ７．４に調製したもので
ある。１０秒後にuptake bufferを取り除き、４℃のupt
ake bufferで洗浄した。以下、uptake bufferを取り除
くまでの時間を２０秒間、３０秒間、１分間として同様
の操作を行った。細胞を１％のトライトンＸ−１００を
含む１ｍｌのＰＢＳで一晩可溶化し、液体シンチレーシ
ョンカウンターを用いて放射活性を測定し、３−ＯＭＧ
の取り込み能の直線性を確認した。結果、２０秒間の取
り込み時間を設定した。
【００３１】次に、３−ＯＭＧの取り込みの基質濃度依
存性を検討した。細胞を３７℃に温めたuptake buffer
で洗浄した後、３７℃に温めた４６２ｋＢｑ／ウェルの
［3Ｈ］３−ＯＭＧを含むuptake bufferを０．２ｍｌ加
えた。ただし、非標識体の３−ＯＭＧを０、０．５、
１．５、１０、２０、３０、５０ｍＭ含むuptake buffe
rを使用して３−ＯＭＧの各濃度液とした。２０秒後にu
ptake bufferを取り除き、４℃の１０ｍＭの非標識体３
−ＯＭＧを含むuptake bufferで洗浄した。次に、１％
のトライトンＸ−１００を含む１ｍｌのＰＢＳで一晩可
溶化し、液体シンチレーションカウンターを用いて放射
活性を測定した。なお、、３−ＯＭＧの濃度に対する取
り込み速度のプロット式（Ｖ＝ＶｍａｘＸ［Ｓ］／（Ｋ
ｍ＋［Ｓ］）；Ｖｍａｘは最大速度定数、Ｋｍはミカエ
リス定数、［Ｓ］は基質濃度）を用いて３−ＯＭＧの取
り込みのＫｍとＶｍａｘを非線形最小二乗法プログラム
（Yamaoka K. et al., J. Pharmacobio-Dyn., 4, 879-8
85, 1981）を用いて解析した。この結果、ＧＬＵＴ−１
の基質である［3Ｈ］３−ＯＭＧの取り込みは濃度依存
的であり、そのミカエリス定数（Ｋｍ）は５．６ｍＭ、
最大取り込み速度定数（Ｖｍａｘ）は４５ｎｍｏｌ／ｍ
ｉｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。その初期取り込
み速度を７．０７〜１０．２μｌ／ｍｉｎ／ｍｇ ｐｒ
ｏｔｅｉｎであった。結果を表１に示す。
存性を検討した。細胞を３７℃に温めたuptake buffer
で洗浄した後、３７℃に温めた４６２ｋＢｑ／ウェルの
［3Ｈ］３−ＯＭＧを含むuptake bufferを０．２ｍｌ加
えた。ただし、非標識体の３−ＯＭＧを０、０．５、
１．５、１０、２０、３０、５０ｍＭ含むuptake buffe
rを使用して３−ＯＭＧの各濃度液とした。２０秒後にu
ptake bufferを取り除き、４℃の１０ｍＭの非標識体３
−ＯＭＧを含むuptake bufferで洗浄した。次に、１％
のトライトンＸ−１００を含む１ｍｌのＰＢＳで一晩可
溶化し、液体シンチレーションカウンターを用いて放射
活性を測定した。なお、、３−ＯＭＧの濃度に対する取
り込み速度のプロット式（Ｖ＝ＶｍａｘＸ［Ｓ］／（Ｋ
ｍ＋［Ｓ］）；Ｖｍａｘは最大速度定数、Ｋｍはミカエ
リス定数、［Ｓ］は基質濃度）を用いて３−ＯＭＧの取
り込みのＫｍとＶｍａｘを非線形最小二乗法プログラム
（Yamaoka K. et al., J. Pharmacobio-Dyn., 4, 879-8
85, 1981）を用いて解析した。この結果、ＧＬＵＴ−１
の基質である［3Ｈ］３−ＯＭＧの取り込みは濃度依存
的であり、そのミカエリス定数（Ｋｍ）は５．６ｍＭ、
最大取り込み速度定数（Ｖｍａｘ）は４５ｎｍｏｌ／ｍ
ｉｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。その初期取り込
み速度を７．０７〜１０．２μｌ／ｍｉｎ／ｍｇ ｐｒ
ｏｔｅｉｎであった。結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】２−５（スカベンジャーレセプター機能の
確認） 上記実施例２−１で得られた細胞株ＴＲ−ＢＢＢ１３が
機能的なスカベンジャーレセプターを持つことを、蛍光
標識体である1,1' -dioctadecyl- 3,3,3',3'-tetrameth
yl-indocarbocyanine perchlorate標識アセチル化ＬＤ
Ｌ（Dil-Ac-LDL、Biomedical Technologies, Stoughto
n, MA）の取り込みを測定することで解析した。カバー
グラスに細胞株ＴＲ−ＢＢＢ１３を１×１０5／ウエル
／ｍｌ培地で播種し、３３℃の炭酸ガス培養器内で４８
時間培養して細胞をコンフルエントにした。Ｄｉｌ−Ａ
ｃ−ＬＤＬの取り込み測定は、まず、培地を吸引して除
去した後に予め３７℃に温めたuptake buffer II（１２
２ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭのＣａ
Ｃｌ2、１．４ｍＭのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．４ｍＭ
のＫ2ＨＰＯ4、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２５ｍＭのＮａ
ＨＣＯ3、１０ｍＭのＤ−ｇｌｕｃｏｓｅの溶液を５％
ＣＯ2−９５％Ｏ2で２０分間バブリングして、ＮａＯＨ
でｐＨ７．４に調整）で細胞を洗浄した。次に、３７℃
に温めた１０μｇ／２００μｌのＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ
を含むuptake buffer IIを０．２ｍｌ加え３０分間炭酸
ガス培養器でインキュベーションした。４時間後にupta
ke buffer IIを除去し、４℃のuptake buffer IIで３回
洗浄した。次に、３％ formaldehyde／ＰＢＳを加え２
０分間室温に保持して固定したものを共焦点レーザー顕
微鏡を用いて細胞内に取り込まれた蛍光を測定した。そ
の結果、スカベンジャーレセプターのリガンドである1,
1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl-indocarbocyan
ine perchlorateで標識されたアセチル化ＬＤＬ（Ｄｉ
ｌ−Ａｃ−ＬＤＬ）が細胞内に取り込まれていることを
確認した。また、他の細胞株でも同様の結果が得た。
確認） 上記実施例２−１で得られた細胞株ＴＲ−ＢＢＢ１３が
機能的なスカベンジャーレセプターを持つことを、蛍光
標識体である1,1' -dioctadecyl- 3,3,3',3'-tetrameth
yl-indocarbocyanine perchlorate標識アセチル化ＬＤ
Ｌ（Dil-Ac-LDL、Biomedical Technologies, Stoughto
n, MA）の取り込みを測定することで解析した。カバー
グラスに細胞株ＴＲ−ＢＢＢ１３を１×１０5／ウエル
／ｍｌ培地で播種し、３３℃の炭酸ガス培養器内で４８
時間培養して細胞をコンフルエントにした。Ｄｉｌ−Ａ
ｃ−ＬＤＬの取り込み測定は、まず、培地を吸引して除
去した後に予め３７℃に温めたuptake buffer II（１２
２ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭのＣａ
Ｃｌ2、１．４ｍＭのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．４ｍＭ
のＫ2ＨＰＯ4、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２５ｍＭのＮａ
ＨＣＯ3、１０ｍＭのＤ−ｇｌｕｃｏｓｅの溶液を５％
ＣＯ2−９５％Ｏ2で２０分間バブリングして、ＮａＯＨ
でｐＨ７．４に調整）で細胞を洗浄した。次に、３７℃
に温めた１０μｇ／２００μｌのＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ
を含むuptake buffer IIを０．２ｍｌ加え３０分間炭酸
ガス培養器でインキュベーションした。４時間後にupta
ke buffer IIを除去し、４℃のuptake buffer IIで３回
洗浄した。次に、３％ formaldehyde／ＰＢＳを加え２
０分間室温に保持して固定したものを共焦点レーザー顕
微鏡を用いて細胞内に取り込まれた蛍光を測定した。そ
の結果、スカベンジャーレセプターのリガンドである1,
1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl-indocarbocyan
ine perchlorateで標識されたアセチル化ＬＤＬ（Ｄｉ
ｌ−Ａｃ−ＬＤＬ）が細胞内に取り込まれていることを
確認した。また、他の細胞株でも同様の結果が得た。
【００３４】２−６（アルカリフォスファターゼ及びγ
−グルタミルランスペプチダーゼ活性の確認） 上記実施例２−１で得られた細胞株が脳毛細血管内皮細
胞に発現しているアルカリフォスファターゼ活性及びγ
グルタミルトランスペプチダーゼ活性を発現することを
常法に従い測定した。測定には、アルカリ性ホスファＢ
−テストワコー及びγ−ＧＴＰ−テストワコー（和光純
薬社製）を使用し、それぞれのキットに記載された標準
測定法に従って測定した。尚、タンパク質量は、ブラッ
ドフォード法（プロテインアッセイキットII；BIO-RAD
社製）により測定した。その結果、アルカリフォスファ
ターゼ活性及びγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活
性はラット脳毛細血管リッチ画分（Brain Capillarie
s）を対照に、それぞれ８．７〜２５．８％及び５．４
〜２２．６％を示し、脳毛細血管内皮細胞特異酵素の発
現を認めた。結果を表２に示す。
−グルタミルランスペプチダーゼ活性の確認） 上記実施例２−１で得られた細胞株が脳毛細血管内皮細
胞に発現しているアルカリフォスファターゼ活性及びγ
グルタミルトランスペプチダーゼ活性を発現することを
常法に従い測定した。測定には、アルカリ性ホスファＢ
−テストワコー及びγ−ＧＴＰ−テストワコー（和光純
薬社製）を使用し、それぞれのキットに記載された標準
測定法に従って測定した。尚、タンパク質量は、ブラッ
ドフォード法（プロテインアッセイキットII；BIO-RAD
社製）により測定した。その結果、アルカリフォスファ
ターゼ活性及びγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活
性はラット脳毛細血管リッチ画分（Brain Capillarie
s）を対照に、それぞれ８．７〜２５．８％及び５．４
〜２２．６％を示し、脳毛細血管内皮細胞特異酵素の発
現を認めた。結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】実施例３（アストロサイト細胞株の調製） ３−１（アストロサイト細胞株の分離） 上記の実施例１で得られたＳＶ４０の温度感受性突然変
異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトラン
スジェニックラット（５匹）から大脳を摘出した。脳ア
ストロサイト細胞の分離と回収は酵素法を用いて以下の
ように行った。大脳を１２１℃、１５分間で滅菌し、分
離バッファー（１２２ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣ
ｌ、１．４ｍＭのＣａＣｌ2、１．２ｍＭのＭｇＳＯ4、
０．４ｍＭのＫ2ＨＰＯ4、１０ｍＭのＧｌｕｃｏｓｅ、
１０ｍＭのＨｅｐｅｓ；ｐＨ７．４）の入ったシャーレ
に入れてクリーンベンチ内に移し、分離バッファーで洗
浄した。大脳をはさみで２ｍｍ角に細くし、あるいは小
さく刻み、１ｍｌの２．４Ｕ／ｍｌのディスパーゼ溶液
を加え、３７℃、１０分間で酵素処理した。未消化断片
を除去後、培地（１００Ｕ／ｍｌのPenicillin G、１０
０ｍｇ／ｍｌのstreptomycin sulfate、１０％のfetal
bovine serum、ＤＭＥＭ９．６ｇを２回蒸留水で１Ｌに
したもの）に懸濁した。
異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトラン
スジェニックラット（５匹）から大脳を摘出した。脳ア
ストロサイト細胞の分離と回収は酵素法を用いて以下の
ように行った。大脳を１２１℃、１５分間で滅菌し、分
離バッファー（１２２ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣ
ｌ、１．４ｍＭのＣａＣｌ2、１．２ｍＭのＭｇＳＯ4、
０．４ｍＭのＫ2ＨＰＯ4、１０ｍＭのＧｌｕｃｏｓｅ、
１０ｍＭのＨｅｐｅｓ；ｐＨ７．４）の入ったシャーレ
に入れてクリーンベンチ内に移し、分離バッファーで洗
浄した。大脳をはさみで２ｍｍ角に細くし、あるいは小
さく刻み、１ｍｌの２．４Ｕ／ｍｌのディスパーゼ溶液
を加え、３７℃、１０分間で酵素処理した。未消化断片
を除去後、培地（１００Ｕ／ｍｌのPenicillin G、１０
０ｍｇ／ｍｌのstreptomycin sulfate、１０％のfetal
bovine serum、ＤＭＥＭ９．６ｇを２回蒸留水で１Ｌに
したもの）に懸濁した。
【００３７】得られた細胞懸濁液を培養皿（Corning社
製；＃４３０１６７）にて３７℃の５％ＣＯ2インキュ
ベーターで２日間培養した。３日目に３３℃の５％ＣＯ
2インキュベーターに移して培養を継続した。細胞の継
代には０．１％のコラゲナーゼ／ディスパーゼ溶液で３
７℃、５分間処理した後、４℃で２時間放置して細胞を
培養皿から剥離した。この細胞のクローニングはコロニ
ー形成法で行った。１〜３回継代した細胞について、細
胞を剥離後、１０2〜１０3個の細胞を９０ｍｍ培養皿に
播き、コロニー形成を行った。培地を吸引除去後、片側
にグリースを塗ったクローニングカップをコロニーが中
央にくるように培養皿に立てた。カップ内にのみ０．２
５％のトリプシン−ＥＤＴＡ液を加え、３３℃で１分間
インキュベートした。培地をカップ内に加え、ピペッテ
ィングして細胞を剥し、ダブリングタイムが約２４時間
で増殖し、約３０代まで継代が進んでも増殖性に顕著な
変化は見られなく安定であった。これらをＴＲ−ＡＳＴ
３２、ＴＲ−ＡＳＴ８１１，ＴＲ−ＡＳＴ９１２、ＴＲ
−ＡＳＴ９３２、ＴＲ−ＡＳＴ９４３株とそれぞれ命名
した。なお、前記のように、ＴＲ−ＡＳＴ９３２株は、
ブタペスト条約に基づいて日本通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＰＭ ＢＰ−６２
８３として寄託されている。
製；＃４３０１６７）にて３７℃の５％ＣＯ2インキュ
ベーターで２日間培養した。３日目に３３℃の５％ＣＯ
2インキュベーターに移して培養を継続した。細胞の継
代には０．１％のコラゲナーゼ／ディスパーゼ溶液で３
７℃、５分間処理した後、４℃で２時間放置して細胞を
培養皿から剥離した。この細胞のクローニングはコロニ
ー形成法で行った。１〜３回継代した細胞について、細
胞を剥離後、１０2〜１０3個の細胞を９０ｍｍ培養皿に
播き、コロニー形成を行った。培地を吸引除去後、片側
にグリースを塗ったクローニングカップをコロニーが中
央にくるように培養皿に立てた。カップ内にのみ０．２
５％のトリプシン−ＥＤＴＡ液を加え、３３℃で１分間
インキュベートした。培地をカップ内に加え、ピペッテ
ィングして細胞を剥し、ダブリングタイムが約２４時間
で増殖し、約３０代まで継代が進んでも増殖性に顕著な
変化は見られなく安定であった。これらをＴＲ−ＡＳＴ
３２、ＴＲ−ＡＳＴ８１１，ＴＲ−ＡＳＴ９１２、ＴＲ
−ＡＳＴ９３２、ＴＲ−ＡＳＴ９４３株とそれぞれ命名
した。なお、前記のように、ＴＲ−ＡＳＴ９３２株は、
ブタペスト条約に基づいて日本通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＰＭ ＢＰ−６２
８３として寄託されている。
【００３８】３−２（樹立した株化アストロサイト細胞
のＧＦＡＰの発現とＬグルタミン酸輸送能） 実施例３−１で得られた細胞株ＴＲ−ＡＳＴ３２、ＴＲ
−ＡＳＴ８１１，ＴＲ−ＡＳＴ９１２、ＴＲ−ＡＳＴ９
３２、ＴＲ−ＡＳＴ９４３のアストロサイト特有の蛋白
質であるglial fibrillary acidic Protein（ＧＦＡ
Ｐ）の発現を免疫染色によって検討した。細胞をカバー
グラス上に培養しサンプルとした。ＰＬＰ溶液（過塩素
酸ナトリウム・Ｌリジン塩酸塩・パラホルムアルデヒド
混合液）で氷冷下で１５分間固定後、ブロッキング溶液
を用いてブロッキングを室温で６０分間行った。１００
倍希釈した抗ＧＦＡＰ抗体を室温で６０分作用させた
後、リンスバッファーで３回洗浄し、５００倍希釈した
ペルオキシターゼ標識抗ラビットＩｇＧを６０分間作用
させた。サンプルをリンスバッファーで十分に洗浄後、
発色反応を行った。氷冷した発色液を加え、顕微鏡で観
察し、サンプルが発色した時点で冷ＰＢＳを加え反応を
停止させ、この時点でネガティブコントロールと発色の
強さを比較した。発色試薬として３０％過酸化水素含有
３，３−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ−ＰＢＳ溶
液を用いた。その結果、ＴＲ−ＡＳＴ３２、ＴＲ−ＡＳ
Ｔ８１１，ＴＲ−ＡＳＴ９１２、ＴＲ−ＡＳＴ９３２、
ＴＲ−ＡＳＴ９４３株のいずれにおいても、ＧＦＡＰの
発現を示す要請の染色が確認された。よってＴＲ−ＡＳ
Ｔ３２、ＴＲ−ＡＳＴ８１１，ＴＲ−ＡＳＴ９１２、Ｔ
Ｒ−ＡＳＴ９３２、ＴＲ−ＡＳＴ９４３株はアストロサ
イト細胞株であることが確認された。
のＧＦＡＰの発現とＬグルタミン酸輸送能） 実施例３−１で得られた細胞株ＴＲ−ＡＳＴ３２、ＴＲ
−ＡＳＴ８１１，ＴＲ−ＡＳＴ９１２、ＴＲ−ＡＳＴ９
３２、ＴＲ−ＡＳＴ９４３のアストロサイト特有の蛋白
質であるglial fibrillary acidic Protein（ＧＦＡ
Ｐ）の発現を免疫染色によって検討した。細胞をカバー
グラス上に培養しサンプルとした。ＰＬＰ溶液（過塩素
酸ナトリウム・Ｌリジン塩酸塩・パラホルムアルデヒド
混合液）で氷冷下で１５分間固定後、ブロッキング溶液
を用いてブロッキングを室温で６０分間行った。１００
倍希釈した抗ＧＦＡＰ抗体を室温で６０分作用させた
後、リンスバッファーで３回洗浄し、５００倍希釈した
ペルオキシターゼ標識抗ラビットＩｇＧを６０分間作用
させた。サンプルをリンスバッファーで十分に洗浄後、
発色反応を行った。氷冷した発色液を加え、顕微鏡で観
察し、サンプルが発色した時点で冷ＰＢＳを加え反応を
停止させ、この時点でネガティブコントロールと発色の
強さを比較した。発色試薬として３０％過酸化水素含有
３，３−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ−ＰＢＳ溶
液を用いた。その結果、ＴＲ−ＡＳＴ３２、ＴＲ−ＡＳ
Ｔ８１１，ＴＲ−ＡＳＴ９１２、ＴＲ−ＡＳＴ９３２、
ＴＲ−ＡＳＴ９４３株のいずれにおいても、ＧＦＡＰの
発現を示す要請の染色が確認された。よってＴＲ−ＡＳ
Ｔ３２、ＴＲ−ＡＳＴ８１１，ＴＲ−ＡＳＴ９１２、Ｔ
Ｒ−ＡＳＴ９３２、ＴＲ−ＡＳＴ９４３株はアストロサ
イト細胞株であることが確認された。
【００３９】実施例３−１で得られた細胞株ＴＲ−ＡＳ
Ｔ３２、ＴＲ−ＡＳＴ８１１，ＴＲ−ＡＳＴ９１２、Ｔ
Ｒ−ＡＳＴ９３２、ＴＲ−ＡＳＴ９４３株のグルタミン
酸輸送能を、［3Ｈ］Ｌ−ｇｕｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉ
ｄ（［3Ｈ］Ｌ−Ｇｌｕ）の取り込みによって検討し
た。２４穴細胞培養用プレートにＴＲ−ＡＳＴ株を２×
１０5細胞／ウェル培地となるように播き、３３℃のＣ
Ｏ2インキュベーターで３０時間培養し、コンフルエン
トにした。［3Ｈ］Ｌ−Ｇｌｕの取り込みの測定は以下
のように行った。まず培地を吸引し、３７℃に温めた上
記uptake buffer IIで洗浄後、３７℃に温めた４６．３
ｋＢｑ／ウェルの［3Ｈ］Ｌ−Ｇｌｕと９．２５ｋＢｑ
／ｍｌの［14Ｃ］イヌリンを含む０．２ｍｌのuptake b
uffer IIを添加し、２、５、１０、３０分後にトレーサ
ー液を取り除いて４℃の１ｍｌのuptakebuffer IIで３
回洗浄した。これに０．７５ｍｌの１％トライトンＸ−
１００溶液を加え、一晩放置し、細胞を可溶化し、液体
シンチレーションカウンターを用いて放射活性を測定し
た。その結果、Ｌ−グルタミン酸トランスポーターの基
質である［3Ｈ］Ｌ−Ｇｌｕの取り込みは濃度依存的で
あり、そのミカエリス定数（Ｋｍ）は９６μＭ、最大取
り込み速度定数（Ｖｍａｘ）は１．８ｎｍｏｌ／ｍｉｎ
／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。この取り込みはＮａ
+−ｆｒｅｅ ｂｕｆｆｅｒで有意に阻害され、また他
の基質であるＬ−ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄやＤ−ａ
ｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄで、有意な阻害を示した。結
果を表３に示す。表３から、得られた細胞株がアストロ
サイト本来の機能を保持していることが確認された。
Ｔ３２、ＴＲ−ＡＳＴ８１１，ＴＲ−ＡＳＴ９１２、Ｔ
Ｒ−ＡＳＴ９３２、ＴＲ−ＡＳＴ９４３株のグルタミン
酸輸送能を、［3Ｈ］Ｌ−ｇｕｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉ
ｄ（［3Ｈ］Ｌ−Ｇｌｕ）の取り込みによって検討し
た。２４穴細胞培養用プレートにＴＲ−ＡＳＴ株を２×
１０5細胞／ウェル培地となるように播き、３３℃のＣ
Ｏ2インキュベーターで３０時間培養し、コンフルエン
トにした。［3Ｈ］Ｌ−Ｇｌｕの取り込みの測定は以下
のように行った。まず培地を吸引し、３７℃に温めた上
記uptake buffer IIで洗浄後、３７℃に温めた４６．３
ｋＢｑ／ウェルの［3Ｈ］Ｌ−Ｇｌｕと９．２５ｋＢｑ
／ｍｌの［14Ｃ］イヌリンを含む０．２ｍｌのuptake b
uffer IIを添加し、２、５、１０、３０分後にトレーサ
ー液を取り除いて４℃の１ｍｌのuptakebuffer IIで３
回洗浄した。これに０．７５ｍｌの１％トライトンＸ−
１００溶液を加え、一晩放置し、細胞を可溶化し、液体
シンチレーションカウンターを用いて放射活性を測定し
た。その結果、Ｌ−グルタミン酸トランスポーターの基
質である［3Ｈ］Ｌ−Ｇｌｕの取り込みは濃度依存的で
あり、そのミカエリス定数（Ｋｍ）は９６μＭ、最大取
り込み速度定数（Ｖｍａｘ）は１．８ｎｍｏｌ／ｍｉｎ
／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。この取り込みはＮａ
+−ｆｒｅｅ ｂｕｆｆｅｒで有意に阻害され、また他
の基質であるＬ−ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄやＤ−ａ
ｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄで、有意な阻害を示した。結
果を表３に示す。表３から、得られた細胞株がアストロ
サイト本来の機能を保持していることが確認された。
【００４０】
【表３】
【００４１】実施例４（脳毛細血管周皮細胞の調製） ４−１（脳毛細血管周皮細胞の分離） 大脳からの脳毛細血管周皮細胞の分離はＩｃｈｉｋａｗ
ａらの方法（IchikawaN et al., (1996) J. Pharmacol.
Toxicol. Method., 36, 45-52）、Ｃａｐｅｔａｎｄｅ
ｓらの方法（Capetandes A and Gerristen ME (1990) I
nvest. Ophthalmol. Vis. Sci., 31, 1738-1744）を改
良して行った。実施例１で得られたＳＶ４０の温度感受
性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入し
たトランスジェニックラット（１匹）から脳を摘出し
た。摘出した脳は、大脳以外の間脳、脳管などを取り除
いた後、クリーンベンチ内で氷冷した調製用緩衝液（１
２２ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭのＣ
ａＣｌ2、１．２ｍＭのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．４ｍ
ＭのＫ2ＨＰＯ4、１０ｍＭのＧｌｕｃｏｓｅ、１０ｍＭ
のＨｅｐｅｓ；ｐＨ７．４）でよく洗浄した。洗浄した
大脳は、組織を１〜２ｍｍ2に細切した。細切した組織
を１０ｍｌ用Potter-Elvehjemホモゲナイザー（東京理
化器械社製）に移し、大脳の４倍量の氷冷した調製用緩
衝液を加え、１０回のアップダウンのストロークを行い
組織をホモゲナイズし、３２％のデキストランを含むＰ
ＢＳを等量加え、３回のアップダウンのストロークを行
いスラリーを得た。
ａらの方法（IchikawaN et al., (1996) J. Pharmacol.
Toxicol. Method., 36, 45-52）、Ｃａｐｅｔａｎｄｅ
ｓらの方法（Capetandes A and Gerristen ME (1990) I
nvest. Ophthalmol. Vis. Sci., 31, 1738-1744）を改
良して行った。実施例１で得られたＳＶ４０の温度感受
性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入し
たトランスジェニックラット（１匹）から脳を摘出し
た。摘出した脳は、大脳以外の間脳、脳管などを取り除
いた後、クリーンベンチ内で氷冷した調製用緩衝液（１
２２ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭのＣ
ａＣｌ2、１．２ｍＭのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．４ｍ
ＭのＫ2ＨＰＯ4、１０ｍＭのＧｌｕｃｏｓｅ、１０ｍＭ
のＨｅｐｅｓ；ｐＨ７．４）でよく洗浄した。洗浄した
大脳は、組織を１〜２ｍｍ2に細切した。細切した組織
を１０ｍｌ用Potter-Elvehjemホモゲナイザー（東京理
化器械社製）に移し、大脳の４倍量の氷冷した調製用緩
衝液を加え、１０回のアップダウンのストロークを行い
組織をホモゲナイズし、３２％のデキストランを含むＰ
ＢＳを等量加え、３回のアップダウンのストロークを行
いスラリーを得た。
【００４２】このスリラーを遠心（４℃下、４５００×
ｇで１５分間）して得られるペレットを２．４ｍｌの酵
素溶液［０．０６６％のcollagenase/dispase（Boehrin
gerMannheim 社製)、０．０３３％のＢＳＡ（シグマ社
製）を含むＰＢＳ］に懸濁し、振盪を加えた水溶中で酵
素処理（３７℃、３時間）を行い、不要な細胞外マトリ
ックスを分離し、遠心（４℃下、６００×ｇで５分間）
してペレットを得た。得られたペレットを１０ｍｌの培
養液（１００Ｕ／ｍｌのbenzylpenicillin potassium、
１００μｇ／ｍｌのstreptomycin sulfate、２．５０μ
ｇ／ｍｌのamphotericin B、２０％のＦＣＳを添加した
ＤＭＥＭ）に分散して４枚の３５ｍｍφ培養シャーレ
（Falcon社製）に種播した。３３℃の炭酸ガス培養器
（５％のＣＯ 2−９５％のＡｉｒ、飽和湿度）内で培養
（初代培養）した。培地を１週間に２回交換し、継代は
トリプシン液（０．０５％のTrypsin、０．５３ｍＭの
ＥＤＴＡ；Gibco BRL社製）を用いておよそ１週間隔で
行った。２回の継代の後、１０4個の細胞を１００ｍｍ
φ培養シャーレ（Falcon社製）に種播した。培地を１週
間に２回交換し、７〜１０日後にコロニーを形成した増
殖速度の比較的速いコロニーをペニシリンカップを用い
て周囲の細胞から単離し、得られた１０3個の細胞を再
び１００ｍｍφ培養シャーレに種播して３３℃の炭酸ガ
ス培養器内で培養してコロニー形成を行った。ペニシリ
ンカップを用いて増殖速度の比較的速いコロニーを周囲
の細胞から単離して２種の細胞株（ＴＲ−ＰＣＴ１，Ｔ
Ｒ−ＰＣＴ２）を得た。なお、前記のように、ＴＲ−Ｐ
ＣＴ１株は、ブタペスト条約に基づいて日本通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＰＭ
ＢＰ−７０２４として寄託されている。
ｇで１５分間）して得られるペレットを２．４ｍｌの酵
素溶液［０．０６６％のcollagenase/dispase（Boehrin
gerMannheim 社製)、０．０３３％のＢＳＡ（シグマ社
製）を含むＰＢＳ］に懸濁し、振盪を加えた水溶中で酵
素処理（３７℃、３時間）を行い、不要な細胞外マトリ
ックスを分離し、遠心（４℃下、６００×ｇで５分間）
してペレットを得た。得られたペレットを１０ｍｌの培
養液（１００Ｕ／ｍｌのbenzylpenicillin potassium、
１００μｇ／ｍｌのstreptomycin sulfate、２．５０μ
ｇ／ｍｌのamphotericin B、２０％のＦＣＳを添加した
ＤＭＥＭ）に分散して４枚の３５ｍｍφ培養シャーレ
（Falcon社製）に種播した。３３℃の炭酸ガス培養器
（５％のＣＯ 2−９５％のＡｉｒ、飽和湿度）内で培養
（初代培養）した。培地を１週間に２回交換し、継代は
トリプシン液（０．０５％のTrypsin、０．５３ｍＭの
ＥＤＴＡ；Gibco BRL社製）を用いておよそ１週間隔で
行った。２回の継代の後、１０4個の細胞を１００ｍｍ
φ培養シャーレ（Falcon社製）に種播した。培地を１週
間に２回交換し、７〜１０日後にコロニーを形成した増
殖速度の比較的速いコロニーをペニシリンカップを用い
て周囲の細胞から単離し、得られた１０3個の細胞を再
び１００ｍｍφ培養シャーレに種播して３３℃の炭酸ガ
ス培養器内で培養してコロニー形成を行った。ペニシリ
ンカップを用いて増殖速度の比較的速いコロニーを周囲
の細胞から単離して２種の細胞株（ＴＲ−ＰＣＴ１，Ｔ
Ｒ−ＰＣＴ２）を得た。なお、前記のように、ＴＲ−Ｐ
ＣＴ１株は、ブタペスト条約に基づいて日本通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＰＭ
ＢＰ−７０２４として寄託されている。
【００４３】４−２（ラージＴ抗原タンパク質の確認） 実施例４−１で得られた２種の細胞株のラージＴ抗原蛋
白質を、実施例２−２に記載のウェスタンブロット法に
より検出した。すなわち、２種の細胞株をそれぞれＰＢ
Ｓで洗浄後、１ｍＬの可溶化溶液（１％のＳＤＳ、１０
ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のglyceri
n）で可溶化し、１００℃で１０分間加熱した後、遠心
（１００００ｒｐｍで１０分間）して不溶画分を除去し
た後、ブラッドフォード法（ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡプ
ロテインアッセイ試薬Ａを使用）で総蛋白質量を定量し
た。それぞれ１０μｇの蛋白質をＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分離後、ニトロセルロース膜に転写
した。３％のスキムミルク溶液でブロッキングしたニト
ロセルロース膜に１次抗体として抗ＳＶ４０ラージＴ抗
原マウス抗体（ＤＰ０２−Ｃ；CALBIOCHEM社製）を、２
次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Amersham
社製）を反応させ、ラージＴ抗原特異的な反応をアマシ
ャム社製ＥＣＬウエスタンブロティング検出システム
（ＲＰＮ２１０６Ｍ１）を用いて検出した。結果を表６
に示す。この結果、得られた２種の細胞株全てにおいて
ラージＴ抗原蛋白質を確認した。
白質を、実施例２−２に記載のウェスタンブロット法に
より検出した。すなわち、２種の細胞株をそれぞれＰＢ
Ｓで洗浄後、１ｍＬの可溶化溶液（１％のＳＤＳ、１０
ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のglyceri
n）で可溶化し、１００℃で１０分間加熱した後、遠心
（１００００ｒｐｍで１０分間）して不溶画分を除去し
た後、ブラッドフォード法（ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡプ
ロテインアッセイ試薬Ａを使用）で総蛋白質量を定量し
た。それぞれ１０μｇの蛋白質をＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分離後、ニトロセルロース膜に転写
した。３％のスキムミルク溶液でブロッキングしたニト
ロセルロース膜に１次抗体として抗ＳＶ４０ラージＴ抗
原マウス抗体（ＤＰ０２−Ｃ；CALBIOCHEM社製）を、２
次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Amersham
社製）を反応させ、ラージＴ抗原特異的な反応をアマシ
ャム社製ＥＣＬウエスタンブロティング検出システム
（ＲＰＮ２１０６Ｍ１）を用いて検出した。結果を表６
に示す。この結果、得られた２種の細胞株全てにおいて
ラージＴ抗原蛋白質を確認した。
【００４４】４−３（ＰＤＧＦ受容体βとＴｈｙ−１の
確認） 得られた細胞株を単層培養し、細胞膜に発現されたＰＤ
ＧＦ受容体βとＴｈｙ−１を免疫染色し、顕微鏡を用い
て確認した。実施例４−１で得られた細胞株ＴＲ−ＰＣ
Ｔ１を24 well dish（Falcon社製）のカバーグラス上で
培養した。培養液を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した
後、０．５ｍＬの固定液（３．６％のパラホルムアルデ
ヒド）を加え、４℃で２０分間放置後、ＰＢＳでよく洗
浄した。０．５ｍＬの３％ＢＳＡ−ＰＢＳを加え、室温
で２時間放置してブロッキングした後、１次抗体（抗Ｐ
ＤＧＦ受容体βヤギ抗体；Santacruze社製、ＦＩＴＣ標
識抗Ｔｈｙ−１マウス抗体；Pharmingen社製）を室温で
１時間反応させた。０．１％のＢＳＡ−ＰＢＳで５回洗
浄後、２次抗体（ＦＩＴＣ標識抗ヤギＩｇＧ；シグマ社
製（ＰＤＧＦ受容体β検出のみ使用））を室温で１時間
反応させ、０．１％のＢＳＡ−ＰＢＳで５回洗浄した。
最後に標識した細胞をグリセリン封入液（９０％のglyc
erol、１ｍｇ／ｍＬのp-phenylendiamine、０．０１Ｍ
のＮａ2ＨＰＯ4；ｐＨ８．５）で封入した。観察は顕微
鏡で行った。この結果、細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１では細胞
膜上にＰＤＧＦ受容体β、及びＴｈｙ−１の発現を認め
た。またＰＤＧＦ受容体βの発現は、ウェスタンブロッ
ト、ＲＴ−ＰＣＲにおいても確認した。なお、ＴＲ−Ｐ
ＣＴ２についても同様の結果が得られた。
確認） 得られた細胞株を単層培養し、細胞膜に発現されたＰＤ
ＧＦ受容体βとＴｈｙ−１を免疫染色し、顕微鏡を用い
て確認した。実施例４−１で得られた細胞株ＴＲ−ＰＣ
Ｔ１を24 well dish（Falcon社製）のカバーグラス上で
培養した。培養液を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した
後、０．５ｍＬの固定液（３．６％のパラホルムアルデ
ヒド）を加え、４℃で２０分間放置後、ＰＢＳでよく洗
浄した。０．５ｍＬの３％ＢＳＡ−ＰＢＳを加え、室温
で２時間放置してブロッキングした後、１次抗体（抗Ｐ
ＤＧＦ受容体βヤギ抗体；Santacruze社製、ＦＩＴＣ標
識抗Ｔｈｙ−１マウス抗体；Pharmingen社製）を室温で
１時間反応させた。０．１％のＢＳＡ−ＰＢＳで５回洗
浄後、２次抗体（ＦＩＴＣ標識抗ヤギＩｇＧ；シグマ社
製（ＰＤＧＦ受容体β検出のみ使用））を室温で１時間
反応させ、０．１％のＢＳＡ−ＰＢＳで５回洗浄した。
最後に標識した細胞をグリセリン封入液（９０％のglyc
erol、１ｍｇ／ｍＬのp-phenylendiamine、０．０１Ｍ
のＮａ2ＨＰＯ4；ｐＨ８．５）で封入した。観察は顕微
鏡で行った。この結果、細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１では細胞
膜上にＰＤＧＦ受容体β、及びＴｈｙ−１の発現を認め
た。またＰＤＧＦ受容体βの発現は、ウェスタンブロッ
ト、ＲＴ−ＰＣＲにおいても確認した。なお、ＴＲ−Ｐ
ＣＴ２についても同様の結果が得られた。
【００４５】４−４（アンギオポエチン−１とオステオ
ポエチン、ＩＣＡＭ−１の確認） 上記実施例４−１で得られた細胞株を単層培養し、細胞
に発現されたアンギオポエチン−１とオステオポエチン
（Osteopontin）、ＩＣＡＭ−１をＲＴ−ＰＣＲにて検
出した。すなわち、細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１を１００ｍｍ
φ培養シャーレ（Falcon社製）に培養した。培養液を除
去し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、セルスクレーパー
（IWAKI社製）にて細胞をかき集め、ＲＮＡ抽出試薬
（Ｔｒｉｚｏｌ；Gibco社製）にて全ＲＮＡを抽出し
た。逆転写酵素（Rev Tra Ace：TOYOBO社製）を用い
て、抽出した全ＲＮＡ１μｇからｃＤＮＡを合成し、Ｐ
ＣＲ法（ｅｘＴａｑ；宝酒造社製）にて発現を確認し
た。ＰＣＲ増幅産物の確認は、５％アクリルアミドゲル
の電気泳動にて行った。この結果、細胞株ＴＲ−ＰＣＴ
１においてアンギオポエチン−１とオステオポエチン及
びＩＣＡＭ−１の発現を確認した。なお、ＴＲ−ＰＣＴ
２についても同様の結果が得られた。
ポエチン、ＩＣＡＭ−１の確認） 上記実施例４−１で得られた細胞株を単層培養し、細胞
に発現されたアンギオポエチン−１とオステオポエチン
（Osteopontin）、ＩＣＡＭ−１をＲＴ−ＰＣＲにて検
出した。すなわち、細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１を１００ｍｍ
φ培養シャーレ（Falcon社製）に培養した。培養液を除
去し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、セルスクレーパー
（IWAKI社製）にて細胞をかき集め、ＲＮＡ抽出試薬
（Ｔｒｉｚｏｌ；Gibco社製）にて全ＲＮＡを抽出し
た。逆転写酵素（Rev Tra Ace：TOYOBO社製）を用い
て、抽出した全ＲＮＡ１μｇからｃＤＮＡを合成し、Ｐ
ＣＲ法（ｅｘＴａｑ；宝酒造社製）にて発現を確認し
た。ＰＣＲ増幅産物の確認は、５％アクリルアミドゲル
の電気泳動にて行った。この結果、細胞株ＴＲ−ＰＣＴ
１においてアンギオポエチン−１とオステオポエチン及
びＩＣＡＭ−１の発現を確認した。なお、ＴＲ−ＰＣＴ
２についても同様の結果が得られた。
【００４６】４−５（高密度培養によるマトリックス塊
カルシウム沈着の確認） 上記実施例４−１で得られた細胞株を単層培養し、マト
リックス塊に沈着したカルシウムをｖｏｎｋｏｓｓａ染
色にて確認した。すなわち、１０6個の細胞株ＴＲ−Ｐ
ＣＴ１を、ＤＭＥＭにて１００ｍｍφ培養シャーレ（Fa
lcon社製）及び１００ｍｍφＩ型コラーゲンコート培養
シャーレ（IWAKI社製）に培養した。１００ｍｍφＩ型
コラーゲンコート培養シャーレの培養液には１０ｍＭの
β−グリセロリン酸を添加した。３日後培養液を除去
し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、８ｍＬの固定液（０．
１％のグルタールアルデヒドを含むＰＢＳ）を加え、室
温で１５分放置後、蒸留水で２回洗浄した。８ｍＬの５
％の硝酸銀水溶液（Wako社製）を加え遮光し、室温で３
０分放置した後、５％の硝酸銀水溶液を除去し、蒸留水
で２回洗浄した。シャーレは室温で３０分露光させ、観
察は顕微鏡で行った。この結果、細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１
ではマトリック塊にカルシウムの沈着を認め、コラーゲ
ンコート培養シャーレではカルシウム沈着の増加を確認
した。なお、ＴＲ−ＰＣＴ２についても同様の結果が得
られた。
カルシウム沈着の確認） 上記実施例４−１で得られた細胞株を単層培養し、マト
リックス塊に沈着したカルシウムをｖｏｎｋｏｓｓａ染
色にて確認した。すなわち、１０6個の細胞株ＴＲ−Ｐ
ＣＴ１を、ＤＭＥＭにて１００ｍｍφ培養シャーレ（Fa
lcon社製）及び１００ｍｍφＩ型コラーゲンコート培養
シャーレ（IWAKI社製）に培養した。１００ｍｍφＩ型
コラーゲンコート培養シャーレの培養液には１０ｍＭの
β−グリセロリン酸を添加した。３日後培養液を除去
し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、８ｍＬの固定液（０．
１％のグルタールアルデヒドを含むＰＢＳ）を加え、室
温で１５分放置後、蒸留水で２回洗浄した。８ｍＬの５
％の硝酸銀水溶液（Wako社製）を加え遮光し、室温で３
０分放置した後、５％の硝酸銀水溶液を除去し、蒸留水
で２回洗浄した。シャーレは室温で３０分露光させ、観
察は顕微鏡で行った。この結果、細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１
ではマトリック塊にカルシウムの沈着を認め、コラーゲ
ンコート培養シャーレではカルシウム沈着の増加を確認
した。なお、ＴＲ−ＰＣＴ２についても同様の結果が得
られた。
【００４７】実施例５（血液脳関門再構築モデルの作
製） ５−１（共培養） 上記実施例２〜４で調製した、脳毛細血管内皮細胞株
（ＴＲ−ＢＢＢ１３）とアストロサイト細胞株（ＴＲ−
ＡＳＴ９３２）との共培養（以下「Ａ＋内皮細胞」とい
う）、及び脳毛細血管内皮細胞株（ＴＲ−ＢＢＢ１３）
とアストロサイト細胞株（ＴＲ−ＡＳＴ９３２）と脳毛
細血管周皮細胞株（ＴＲ−ＰＣＴ１）との共培養（以下
「Ａ＋Ｐ＋内皮細胞」という）を行った。なお、脳毛細
血管内皮細胞株（ＴＲ−ＢＢＢ１３）の単独培養をコン
トロールとした。
製） ５−１（共培養） 上記実施例２〜４で調製した、脳毛細血管内皮細胞株
（ＴＲ−ＢＢＢ１３）とアストロサイト細胞株（ＴＲ−
ＡＳＴ９３２）との共培養（以下「Ａ＋内皮細胞」とい
う）、及び脳毛細血管内皮細胞株（ＴＲ−ＢＢＢ１３）
とアストロサイト細胞株（ＴＲ−ＡＳＴ９３２）と脳毛
細血管周皮細胞株（ＴＲ−ＰＣＴ１）との共培養（以下
「Ａ＋Ｐ＋内皮細胞」という）を行った。なお、脳毛細
血管内皮細胞株（ＴＲ−ＢＢＢ１３）の単独培養をコン
トロールとした。
【００４８】５−２（使用細胞株の調製） 上記実施例２により得られたＴＲ−ＢＢＢ１３は、ＤＭ
ＥＭ１［ＤＭＥＭ（ニッスイ社製；＃０５９１５）に最
終濃度で１０％のウシ胎児血清（ＪＲＨ社製；＃１２０
０３−７８Ｐ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００
μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン
（ＧＩＢＣＯ社製；＃１０３７８−０１６）、１５μｇ
／ｍｌのｂＥＣＧＦ（ベーリンガー社製；＃１０３３４
８４）］に分散して、コラーゲンタイプＩをコートした
培養皿（IWAKI社製；＃４０２０−１０）に播種し、５
％ＣＯ2／９５％ＡＩＲの条件下において３３℃で予め
培養しておいた。また、上記実施例３により得られたＴ
Ｒ−ＡＳＴ９３２及び上記実施例４により得られたＴＲ
−ＰＣＴ１は、ＤＭＥＭ２［ＤＭＥＭ（ニッスイ社製；
＃０５９１５）に最終濃度で１０％のウシ胎児血清（Ｊ
ＲＨ社製；＃１２００３−７８Ｐ）、１００Ｕ／ｍｌの
ペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、
２ｍＭのグルタミン（ＧＩＢＣＯ社製；＃１０３７８−
０１６）］が入った培養皿（Corning社製；＃４３０１
６７）で、５％ＣＯ2／９５％ＡＩＲの条件下において
３３℃で予め培養しておいた。
ＥＭ１［ＤＭＥＭ（ニッスイ社製；＃０５９１５）に最
終濃度で１０％のウシ胎児血清（ＪＲＨ社製；＃１２０
０３−７８Ｐ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００
μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン
（ＧＩＢＣＯ社製；＃１０３７８−０１６）、１５μｇ
／ｍｌのｂＥＣＧＦ（ベーリンガー社製；＃１０３３４
８４）］に分散して、コラーゲンタイプＩをコートした
培養皿（IWAKI社製；＃４０２０−１０）に播種し、５
％ＣＯ2／９５％ＡＩＲの条件下において３３℃で予め
培養しておいた。また、上記実施例３により得られたＴ
Ｒ−ＡＳＴ９３２及び上記実施例４により得られたＴＲ
−ＰＣＴ１は、ＤＭＥＭ２［ＤＭＥＭ（ニッスイ社製；
＃０５９１５）に最終濃度で１０％のウシ胎児血清（Ｊ
ＲＨ社製；＃１２００３−７８Ｐ）、１００Ｕ／ｍｌの
ペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、
２ｍＭのグルタミン（ＧＩＢＣＯ社製；＃１０３７８−
０１６）］が入った培養皿（Corning社製；＃４３０１
６７）で、５％ＣＯ2／９５％ＡＩＲの条件下において
３３℃で予め培養しておいた。
【００４９】５−３（非接触状態での培養） 上記予め培養した細胞株を用いて、図１に示すように、
非接触状態での培養を行った。ＤＭＥＭ１が入ったミリ
セル（ミリポア社製；Millicell：３．０μｍｃｕｌｔ
ｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ、３０ｍｍ ｄｉａｍｅｔｅｒ、
＃ＰＩＴＰ０３０５０）に上記ＴＲ−ＢＢＢ１３（１×
１０5細胞／ウェル）を入れ、上記ＤＭＥＭ２の入った
下側の６ウェルプレートに上記ＴＲ−ＡＳＴ９３２（３
×１０ 4細胞／ウェル）、又はＴＲ−ＡＳＴ９３２及び
上記ＴＲ−ＰＣＴ１（１×１０5細胞／ウェル）を入れ
て、５％ＣＯ2／９５％ＡＩＲの条件下において３３℃
で４日間非接触状態で共培養した。これらの非接触系培
養における内皮細胞の酵素活性の変化を、血液脳関門の
内皮細胞の酵素マーカーであるアルカリフォスファター
ゼ（ＡＬＰ）やγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
（γ−ＧＴＰ）の活性を測定することにより調べた。
非接触状態での培養を行った。ＤＭＥＭ１が入ったミリ
セル（ミリポア社製；Millicell：３．０μｍｃｕｌｔ
ｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ、３０ｍｍ ｄｉａｍｅｔｅｒ、
＃ＰＩＴＰ０３０５０）に上記ＴＲ−ＢＢＢ１３（１×
１０5細胞／ウェル）を入れ、上記ＤＭＥＭ２の入った
下側の６ウェルプレートに上記ＴＲ−ＡＳＴ９３２（３
×１０ 4細胞／ウェル）、又はＴＲ−ＡＳＴ９３２及び
上記ＴＲ−ＰＣＴ１（１×１０5細胞／ウェル）を入れ
て、５％ＣＯ2／９５％ＡＩＲの条件下において３３℃
で４日間非接触状態で共培養した。これらの非接触系培
養における内皮細胞の酵素活性の変化を、血液脳関門の
内皮細胞の酵素マーカーであるアルカリフォスファター
ゼ（ＡＬＰ）やγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
（γ−ＧＴＰ）の活性を測定することにより調べた。
【００５０】実施例６（酵素活性の測定） ６−１（タンパク質濃度） ＢＣＡ酵素アッセイ試薬（BCA Protein Assay Reagen
t；ＰＩＲＣＥ社製：＃５３１−２０７２１）の試薬Ａ
と試薬Ｂを５０：１の割合で混合して１日間放置し、ワ
ーキングソリューション（working solution）とした。
それぞれ０．１ｍｌの上記培養した３種類のサンプル
（コントロール、Ａ＋内皮細胞、Ａ＋Ｐ＋内皮細胞）及
びＢＳＡ標準液に、各２ｍｌのワーキングソリューショ
ンを加え、３７℃で３０分間インキュベートし、室温ま
で冷却した後、５６２ｎｍの波長における吸光度を測定
した。ＢＳＡ標準液により作成した検量線によりの３種
類のサンプルのタンパク質濃度をそれぞれ算出した。
t；ＰＩＲＣＥ社製：＃５３１−２０７２１）の試薬Ａ
と試薬Ｂを５０：１の割合で混合して１日間放置し、ワ
ーキングソリューション（working solution）とした。
それぞれ０．１ｍｌの上記培養した３種類のサンプル
（コントロール、Ａ＋内皮細胞、Ａ＋Ｐ＋内皮細胞）及
びＢＳＡ標準液に、各２ｍｌのワーキングソリューショ
ンを加え、３７℃で３０分間インキュベートし、室温ま
で冷却した後、５６２ｎｍの波長における吸光度を測定
した。ＢＳＡ標準液により作成した検量線によりの３種
類のサンプルのタンパク質濃度をそれぞれ算出した。
【００５１】６−２（ＡＬＰ活性の測定） 次に、ＡＬＰテストワコー（ＷＡＫＯ社製：＃２７４−
０４４０１）の基質緩衝液０．５ｍｌを３７℃で３分間
予めインキュベーションしておいたものに、５０μｌの
上記培養した３種類のサンプル（コントロール、Ａ＋内
皮細胞、Ａ＋Ｐ＋内皮細胞）を加えて３７℃で１５分間
インキュベーションし、０．０２ＮのＮａＯＨ溶液を５
ｍｌ加えた後よく振り混ぜた。これらの溶液を４０５ｎ
ｍの波長で吸光度を測定し、予め作成しておいた検量線
から吸光度に相当するＡＬＰ活性値（ｍＵ／ｍｌ）を算
出し、上記蛋白濃度より１ｍｇの蛋白質当たりのＡＬＰ
活性値を求めた。結果を図２に示す。
０４４０１）の基質緩衝液０．５ｍｌを３７℃で３分間
予めインキュベーションしておいたものに、５０μｌの
上記培養した３種類のサンプル（コントロール、Ａ＋内
皮細胞、Ａ＋Ｐ＋内皮細胞）を加えて３７℃で１５分間
インキュベーションし、０．０２ＮのＮａＯＨ溶液を５
ｍｌ加えた後よく振り混ぜた。これらの溶液を４０５ｎ
ｍの波長で吸光度を測定し、予め作成しておいた検量線
から吸光度に相当するＡＬＰ活性値（ｍＵ／ｍｌ）を算
出し、上記蛋白濃度より１ｍｇの蛋白質当たりのＡＬＰ
活性値を求めた。結果を図２に示す。
【００５２】６−３（γ−ＧＴＰ活性の測定） また、γ−ＧＴＰテストワコー（ＷＡＫＯ社製：＃２７
３−３２７０１）の基質緩衝液３ｍｌを３７℃で５分間
予めインキュベーションしておいたものに、１５μｌの
上記培養した３種類のサンプル（コントロール、Ａ＋内
皮細胞、Ａ＋Ｐ＋内皮細胞）を加えて３７℃で正確に３
０分間インキュベーションし、４〜５回振って混合さ
せ、発色液Ｂを１００μｌ加えた後よく振り混ぜ、室温
にて１０分間放置した。これらの溶液を５５０ｎｍの波
長で吸光度を測定し、予め作成しておいた検量線から吸
光度に相当するγ−ＧＴＰ活性値（ｍＵ／ｍｌ）を算出
し、上記蛋白濃度より１ｍｇの蛋白質当たりのγ−ＧＴ
Ｐ活性値を求めた。結果を図３に示す。
３−３２７０１）の基質緩衝液３ｍｌを３７℃で５分間
予めインキュベーションしておいたものに、１５μｌの
上記培養した３種類のサンプル（コントロール、Ａ＋内
皮細胞、Ａ＋Ｐ＋内皮細胞）を加えて３７℃で正確に３
０分間インキュベーションし、４〜５回振って混合さ
せ、発色液Ｂを１００μｌ加えた後よく振り混ぜ、室温
にて１０分間放置した。これらの溶液を５５０ｎｍの波
長で吸光度を測定し、予め作成しておいた検量線から吸
光度に相当するγ−ＧＴＰ活性値（ｍＵ／ｍｌ）を算出
し、上記蛋白濃度より１ｍｇの蛋白質当たりのγ−ＧＴ
Ｐ活性値を求めた。結果を図３に示す。
【００５３】６−４（測定結果の比較） 上記の結果から、ＡＬＰ活性値はそれぞれ、脳毛細血管
内皮細胞株（ＴＲ−ＢＢＢ１３）のみを培養したコント
ロールにおいては３．９３±０．３９ｍＵ／ｍｇ、アス
トロサイト細胞株（ＴＲ−ＡＳＴ９３２）と共培養した
脳毛細血管内皮細胞株（Ａ＋内皮細胞）においては２
３．５±４．６９ｍＵ／ｍｇ、脳毛細血管周皮細胞株
（ＴＲ−ＰＣＴ１）とアストロサイト細胞株と共培養し
た脳毛細血管内皮細胞株（Ａ＋Ｐ＋内皮細胞）において
は２５．０±１．６ｍＵ／ｍｇであった。また、γ−Ｇ
ＴＰ活性値はそれぞれ、コントロールにおいては４．１
３±０．６８ｍＵ／ｍｇ、Ａ＋内皮細胞においては１
８．５±１．６ｍＵ／ｍｇ、Ａ＋Ｐ＋内皮細胞において
は１０．３±０．５ｍＵ／ｍｇであった。これらのこと
から、ＴＲ−ＢＢＢ１３単独培養に比較して、ＴＲ−Ａ
ＳＴ９３２と共培養することでＡＬＰ活性が６倍に増加
し、γ−ＧＴＰ活性が４．５倍に増加することがわかっ
た。また、ＴＲ−ＰＣＴ１とＴＲ−ＡＳＴ９３２と共培
養した脳毛細血管内皮細胞株のＡＬＰ活性が６倍に増加
し、γ−ＧＴＰ活性が２．５倍に増加することがわかっ
た。
内皮細胞株（ＴＲ−ＢＢＢ１３）のみを培養したコント
ロールにおいては３．９３±０．３９ｍＵ／ｍｇ、アス
トロサイト細胞株（ＴＲ−ＡＳＴ９３２）と共培養した
脳毛細血管内皮細胞株（Ａ＋内皮細胞）においては２
３．５±４．６９ｍＵ／ｍｇ、脳毛細血管周皮細胞株
（ＴＲ−ＰＣＴ１）とアストロサイト細胞株と共培養し
た脳毛細血管内皮細胞株（Ａ＋Ｐ＋内皮細胞）において
は２５．０±１．６ｍＵ／ｍｇであった。また、γ−Ｇ
ＴＰ活性値はそれぞれ、コントロールにおいては４．１
３±０．６８ｍＵ／ｍｇ、Ａ＋内皮細胞においては１
８．５±１．６ｍＵ／ｍｇ、Ａ＋Ｐ＋内皮細胞において
は１０．３±０．５ｍＵ／ｍｇであった。これらのこと
から、ＴＲ−ＢＢＢ１３単独培養に比較して、ＴＲ−Ａ
ＳＴ９３２と共培養することでＡＬＰ活性が６倍に増加
し、γ−ＧＴＰ活性が４．５倍に増加することがわかっ
た。また、ＴＲ−ＰＣＴ１とＴＲ−ＡＳＴ９３２と共培
養した脳毛細血管内皮細胞株のＡＬＰ活性が６倍に増加
し、γ−ＧＴＰ活性が２．５倍に増加することがわかっ
た。
【００５４】実施例７（ＧＬＵＴ−１の検出） ７−１（ＲＴ−ＰＣＲ） 上記脳毛細血管内皮細胞株のみを培養したもの（コント
ロール）や、アストロサイト細胞株と共培養した脳毛細
血管内皮細胞株（Ａ＋内皮細胞）におけるＧ３ＰＤＨ
（ハウスキーピング遺伝子）やＧＬＵＴ−１（グルコー
ストランスポーター１）の発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
により検出した。上記脳毛細血管内皮細胞株をミリセル
（ミリポア社製；Millicell：３．０μｍ ｃｕｌｔｕ
ｒｅ ｉｎｓｅｒｔ、３０ｍｍ ｄｉａｍｅｔｅｒ、＃
ＰＩＴＰ０３０５０）で培養した。培養液を除去し、細
胞をＰＢＳで洗浄した後、セルスクレーパー（Iwaki社
製）にて細胞をかき集め、ＲＮＡ抽出試薬（Ｔｒｉｚｏ
ｌ；Gibco社製）にて全ＲＮＡを抽出した。逆転写酵素
（Rev Tra Ace：東洋紡社製）を用いて、抽出した全Ｒ
ＮＡ１μｇからｃＤＮＡを合成した。
ロール）や、アストロサイト細胞株と共培養した脳毛細
血管内皮細胞株（Ａ＋内皮細胞）におけるＧ３ＰＤＨ
（ハウスキーピング遺伝子）やＧＬＵＴ−１（グルコー
ストランスポーター１）の発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
により検出した。上記脳毛細血管内皮細胞株をミリセル
（ミリポア社製；Millicell：３．０μｍ ｃｕｌｔｕ
ｒｅ ｉｎｓｅｒｔ、３０ｍｍ ｄｉａｍｅｔｅｒ、＃
ＰＩＴＰ０３０５０）で培養した。培養液を除去し、細
胞をＰＢＳで洗浄した後、セルスクレーパー（Iwaki社
製）にて細胞をかき集め、ＲＮＡ抽出試薬（Ｔｒｉｚｏ
ｌ；Gibco社製）にて全ＲＮＡを抽出した。逆転写酵素
（Rev Tra Ace：東洋紡社製）を用いて、抽出した全Ｒ
ＮＡ１μｇからｃＤＮＡを合成した。
【００５５】７−２（プライマー） 得られたｃＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）２．０μｌに対し
て、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応における各遺伝子
のプライマーの組合せとしては、Ｇ３ＰＤＨ［Ｇ３ＰＤ
Ｈ−Ｆ：５′−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣ
ＡＣ−３′（配列番号３）、Ｇ３ＰＤＨ−Ｒ：５′−Ｔ
ＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３′（配列
番号４）］、ＧＬＵＴ−１［ＧＬＵＴ−１−Ｆ：５′−
ＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＣＴＧＴＴＧＧＣＣＴ−３′（配
列番号５）、ＧＬＵＴ−１−Ｒ：５′−ＡＧＣＧＧＡＡ
ＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＴＧ−３′（配列番号６）］を
それぞれ用いた。
て、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応における各遺伝子
のプライマーの組合せとしては、Ｇ３ＰＤＨ［Ｇ３ＰＤ
Ｈ−Ｆ：５′−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣ
ＡＣ−３′（配列番号３）、Ｇ３ＰＤＨ−Ｒ：５′−Ｔ
ＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３′（配列
番号４）］、ＧＬＵＴ−１［ＧＬＵＴ−１−Ｆ：５′−
ＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＣＴＧＴＴＧＧＣＣＴ−３′（配
列番号５）、ＧＬＵＴ−１−Ｒ：５′−ＡＧＣＧＧＡＡ
ＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＴＧ−３′（配列番号６）］を
それぞれ用いた。
【００５６】７−３（ＰＣＲ） 上記ｃＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）２μｌに、ＤＤＷを３
３．８μｌ、１０×Ｅｘ ｂｕｆｆｅｒを５．０μｌ、
２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ ｍｉｘを４．０μｌ、５Ｕ／
μｌのｒＥｘＴａｑを０．２μｌ、２０μＭの上記各プ
ライマーを２．５μｌ加え、全量５０μｌでＰＣＲ反応
を行った。サーマルサイクルのプログラムは、最初のみ
9４℃で３分間変性させ、その後９４℃で１分間熱変性
させ、５７℃で１分間伸張させ、７２℃で１分間アニー
リングするというサイクルを２５回繰り返し、最後に７
２℃で１０分間アニーリングを行った。その後、ＰＣＲ
増幅産物をアガロースゲル（２％）電気泳動法により分
離した後、エチジウムブロミド染色を行い、ＣＣＤイメ
ージアナライザーを用いて、それぞれのバンドの強度を
測定した。結果を図４に示す。
３．８μｌ、１０×Ｅｘ ｂｕｆｆｅｒを５．０μｌ、
２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ ｍｉｘを４．０μｌ、５Ｕ／
μｌのｒＥｘＴａｑを０．２μｌ、２０μＭの上記各プ
ライマーを２．５μｌ加え、全量５０μｌでＰＣＲ反応
を行った。サーマルサイクルのプログラムは、最初のみ
9４℃で３分間変性させ、その後９４℃で１分間熱変性
させ、５７℃で１分間伸張させ、７２℃で１分間アニー
リングするというサイクルを２５回繰り返し、最後に７
２℃で１０分間アニーリングを行った。その後、ＰＣＲ
増幅産物をアガロースゲル（２％）電気泳動法により分
離した後、エチジウムブロミド染色を行い、ＣＣＤイメ
ージアナライザーを用いて、それぞれのバンドの強度を
測定した。結果を図４に示す。
【００５７】７−４（測定結果の比較） 上記結果から、アストロサイト細胞株と共培養した脳毛
細血管内皮細胞株（Ａ＋内皮細胞）の血液脳関門に発現
するヘキソース輸送担体のｍＲＮＡであるＧｌｕｔ１の
発現量は、Ｇ３ＰＤＨとの比較からして、脳毛細血管内
皮細胞株を単独培養したもの（コントロール）に比べて
１００倍増加していることがわかった。
細血管内皮細胞株（Ａ＋内皮細胞）の血液脳関門に発現
するヘキソース輸送担体のｍＲＮＡであるＧｌｕｔ１の
発現量は、Ｇ３ＰＤＨとの比較からして、脳毛細血管内
皮細胞株を単独培養したもの（コントロール）に比べて
１００倍増加していることがわかった。
【００５８】
【発明の効果】本発明によると、よりインビボに近いイ
ンビトロの血液脳関門実験系の再構築が可能となり、従
来の共培養と比べて条件的不死化細胞株を使用した共培
養系は飛躍的に細胞−細胞間相互作用が促進され、血液
脳関門が本来の機能に近いところまで、再現できること
がわかった。したがって、本発明の血液脳関門再構築モ
デル等を用いることにより、血液脳関門に関する基礎的
研究成果が得られる上に、薬物の血液脳透過機構に基づ
いた中枢作用型薬物（抗痴呆薬、脳腫瘍治療薬、ウイル
ス治療薬、精神神経作用薬）や、中枢での副作用が問題
となる薬物のスクリーニングを効率的に行うことができ
るだけでなく、脳毛細血管内皮細胞に発現する種々の受
容体を標的とした薬物（脳微小循環改善薬、脳浮腫治療
薬）の効果や脳毛細血管内皮細胞の障害（脳血管障害性
痴呆症やアルツハイマー型痴呆症）の評価が可能とな
る。
ンビトロの血液脳関門実験系の再構築が可能となり、従
来の共培養と比べて条件的不死化細胞株を使用した共培
養系は飛躍的に細胞−細胞間相互作用が促進され、血液
脳関門が本来の機能に近いところまで、再現できること
がわかった。したがって、本発明の血液脳関門再構築モ
デル等を用いることにより、血液脳関門に関する基礎的
研究成果が得られる上に、薬物の血液脳透過機構に基づ
いた中枢作用型薬物（抗痴呆薬、脳腫瘍治療薬、ウイル
ス治療薬、精神神経作用薬）や、中枢での副作用が問題
となる薬物のスクリーニングを効率的に行うことができ
るだけでなく、脳毛細血管内皮細胞に発現する種々の受
容体を標的とした薬物（脳微小循環改善薬、脳浮腫治療
薬）の効果や脳毛細血管内皮細胞の障害（脳血管障害性
痴呆症やアルツハイマー型痴呆症）の評価が可能とな
る。
【００５９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> Reconstitution of the Blood-Brain Barrier in Vascular Endothelial Cells <130> A081P09 <140> <141> <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer(tsA58-1A) <400> 1 tcctaatgtg cagtcaggtg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer(tsA58-1B) <400> 2 atgacgagct ttggcacttg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer(G3PDH-F) <400> 3 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer(G3PDH-R) <400> 4 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer(GLUT-1-F) <400> 5 gatgatgaac ctgttggcct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer(GLUT-1-R) <400> 6 agcggaacag ctccaagatg 20
【図１】本発明における非接触系共培養法の概略を示す
図である。
図である。
【図２】本発明の共培養による血液脳関門再構築モデル
のＡＬＰ活性の結果を示す図である。
のＡＬＰ活性の結果を示す図である。
【図３】本発明の共培養による血液脳関門再構築モデル
のγ−ＧＴＰ活性の結果を示す図である。
のγ−ＧＴＰ活性の結果を示す図である。
【図４】本発明の共培養による血液脳関門再構築モデル
におけるＧＬＵＴ−１発現結果を示す図である。
におけるＧＬＵＴ−１発現結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/54 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/68 33/50 Ｃ１２Ｒ 1:91） 33/68 (Ｃ１２Ｑ 1/42 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/48 Ａ (Ｃ１２Ｑ 1/42 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/54 (Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｑ 1/54 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 細谷 健一 宮城県仙台市太白区三神峯１−３ ３− 501 (72)発明者 服部 研之 東京都文京区白山４−22−２前島方 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CB01 CB17 CB26 DA20 DA77 DA80 FB07 4B024 AA11 BA31 CA04 DA02 EA04 FA10 GA12 HA11 4B063 QQ02 QQ08 QQ26 QQ33 QQ68 QS33 4B065 AA91X AA91Y AA95Y AB01 AC02 BA04 BC11 CA46
Claims (40)
- 【請求項１】 ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞
株と、ラット由来の不死化アストロサイト細胞株とを共
培養することを特徴とする血液脳関門再構築モデルの作
製方法。 - 【請求項２】 ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞
株と、ラット由来の不死化アストロサイト細胞株と、ラ
ット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株とを共培養する
ことを特徴とする血液脳関門再構築モデルの作製方法。 - 【請求項３】 ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞
株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ
抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来の
不死化脳毛細血管内皮細胞株であることを特徴とする請
求項１又は２記載の血液脳関門再構築モデルの作製方
法。 - 【請求項４】 温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８の
ラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラッ
ト由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株が、ＴＲ−ＢＢＢ
１３（ＦＥＰＭ ＢＰ−６８７３）であることを特徴と
する請求項３記載の血液脳関門再構築モデルの作製方
法。 - 【請求項５】 ラット由来の不死化アストロサイト細胞
株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ
抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来の
不死化アストロサイト細胞株であることを特徴とする請
求項１又は２記載の血液脳関門再構築モデルの作製方
法。 - 【請求項６】 温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８の
ラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラッ
ト由来の不死化アストロサイト細胞株が、ＴＲ−ＡＳＴ
９３２（ＦＥＰＭ ＢＰ−６２８３）であることを特徴
とする請求項５記載の血液脳関門再構築モデルの作製方
法。 - 【請求項７】 ラット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞
株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ
抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来の
不死化脳毛細血管周皮細胞株であることを特徴とする請
求項２記載の血液脳関門再構築モデルの作製方法。 - 【請求項８】 温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８の
ラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラッ
ト由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株が、ＴＲ−ＰＣＴ
１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７０２４）であることを特徴とす
る請求項７記載の血液脳関門再構築モデルの作製方法。 - 【請求項９】 共培養が、不死化脳毛細血管内皮細胞株
と不死化アストロサイト細胞株とを非接触状態で、又は
不死化脳毛細血管内皮細胞株と不死化アストロサイト細
胞株及び不死化脳毛細血管周皮細胞株とを非接触状態で
培養する、非接触系共培養であることを特徴とする請求
項１〜８のいずれか記載の血液脳関門再構築モデルの作
製方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか記載の血液脳
関門再構築モデルを用いるスクリーニング方法であっ
て、共培養中又は共培養の前後に、被検物質を不死化脳
毛細血管内皮細胞株と接触させ、血液脳関門のマーカー
遺伝子の発現の程度を測定・評価することを特徴とする
血液脳関門形成促進又は抑制物質のスクリーニング方
法。 - 【請求項１１】 請求項１〜９のいずれか記載の血液脳
関門再構築モデルを用いるスクリーニング方法であっ
て、共培養中又は共培養の前後に、被検物質と血液脳関
門透過物質又は血液脳関門非透過物質とを不死化脳毛細
血管内皮細胞株と接触させ、これら血液脳関門透過物質
又は血液脳関門非透過物質の不死化脳毛細血管内皮細胞
内への透過の程度を測定・評価することを特徴とする血
液脳関門透過促進又は抑制物質のスクリーニング方法。 - 【請求項１２】 請求項１〜９のいずれか記載の血液脳
関門再構築モデルを用いるスクリーニング方法であっ
て、共培養中又は共培養の前後に、被検物質を不死化脳
毛細血管内皮細胞株と接触させ、不死化脳毛細血管内皮
細胞内への被検物質の透過の程度を測定・評価すること
を特徴とする血液脳関門透過又は非透過物質のスクリー
ニング方法。 - 【請求項１３】 請求項１０記載の血液脳関門形成促進
又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門形成促進物質。 - 【請求項１４】 請求項１０記載の血液脳関門形成促進
又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門形成抑制物質。 - 【請求項１５】 請求項１１記載の血液脳関門透過促進
又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門透過促進物質。 - 【請求項１６】 請求項１１記載の血液脳関門透過促進
又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門透過抑制物質。 - 【請求項１７】 請求項１２記載の血液脳関門透過又は
非透過物質のスクリーニング方法により得られる血液脳
関門透過物質。 - 【請求項１８】 請求項１２記載の血液脳関門透過又は
非透過物質のスクリーニング方法により得られる血液脳
関門非透過物質。 - 【請求項１９】 ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細
胞株と、ラット由来の不死化アストロサイト細胞株とを
共培養することにより得られることを特徴とする血液脳
関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血
管内皮細胞株。 - 【請求項２０】 ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細
胞株と、ラット由来の不死化アストロサイト細胞株と、
ラット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株とを共培養す
ることにより得られることを特徴とする血液脳関門のマ
ーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細
胞株。 - 【請求項２１】 ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細
胞株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージ
Ｔ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来
の不死化脳毛細血管内皮細胞株であることを特徴とする
請求項１９又は２０記載の血液脳関門のマーカー遺伝子
の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。 - 【請求項２２】 温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８
のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラ
ット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株が、ＴＲ−ＢＢ
Ｂ１３（ＦＥＰＭ ＢＰ−６８７３）であることを特徴
とする請求項２１記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の
発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。 - 【請求項２３】 ラット由来の不死化アストロサイト細
胞株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージ
Ｔ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来
の不死化アストロサイト細胞株であることを特徴とする
請求項１９又は２０記載の血液脳関門のマーカー遺伝子
の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。 - 【請求項２４】 温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８
のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラ
ット由来の不死化アストロサイト細胞株が、ＴＲ−ＡＳ
Ｔ９３２（ＦＥＰＭ ＢＰ−６２８３）であることを特
徴とする請求項２３記載の血液脳関門のマーカー遺伝子
の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。 - 【請求項２５】 ラット由来の不死化脳毛細血管周皮細
胞株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージ
Ｔ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来
の不死化脳毛細血管周皮細胞株であることを特徴とする
請求項２０記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が
増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。 - 【請求項２６】 温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８
のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラ
ット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株が、ＴＲ−ＰＣ
Ｔ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７０２４）であることを特徴と
する請求項２５記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発
現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。 - 【請求項２７】 共培養が、不死化脳毛細血管内皮細胞
株と不死化アストロサイト細胞株とを非接触状態で、又
は不死化脳毛細血管内皮細胞株と不死化アストロサイト
細胞株及び不死化脳毛細血管周皮細胞株とを非接触状態
で培養する、非接触系共培養であることを特徴とする請
求項１９〜２６のいずれか記載の血液脳関門のマーカー
遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。 - 【請求項２８】 血液脳関門のマーカー遺伝子が、アル
カリフォスファターゼ遺伝子、γ−グルタミールトラン
スペプチダーゼ遺伝子、Ｇｌｕｔ１遺伝子から選ばれる
１種又は２種以上の遺伝子であることを特徴とする請求
項１９〜２７のいずれか記載の血液脳関門のマーカー遺
伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。 - 【請求項２９】 アルカリフォスファターゼ遺伝子の発
現が、共培養することなく単独培養したときと比べて６
倍以上増強したことを特徴とする請求項２８記載の血液
脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細
血管内皮細胞株。 - 【請求項３０】 γ−グルタミールトランスペプチダー
ゼ遺伝子の発現が、共培養することなく単独培養したと
きと比べて２倍以上増強したことを特徴とする請求項２
８又は２９記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が
増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。 - 【請求項３１】 Ｇｌｕｔ１遺伝子の発現が、共培養す
ることなく単独培養したときと比べて１００倍以上増強
したことを特徴とする請求項２８〜３０のいずれか記載
の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化
脳毛細血管内皮細胞株。 - 【請求項３２】 被検物質と、請求項１９〜３１のいず
れか記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強し
た不死化脳毛細血管内皮細胞株とを接触させ、血液脳関
門のマーカー遺伝子の発現増強の程度を測定・評価する
ことを特徴とする血液脳関門形成促進又は抑制物質のス
クリーニング方法。 - 【請求項３３】 被検物質と血液脳関門透過物質又は血
液脳関門非透過物質と、請求項１９〜３１のいずれか記
載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死
化脳毛細血管内皮細胞株とを接触させ、これら血液脳関
門透過物質又は血液脳関門非透過物質の該不死化脳毛細
血管内皮細胞内への透過の程度を測定・評価することを
特徴とする血液脳関門透過促進又は抑制物質のスクリー
ニング方法。 - 【請求項３４】 被検物質と、請求項１９〜３１のいず
れか記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強し
た不死化脳毛細血管内皮細胞株とを接触させ、該不死化
脳毛細血管内皮細胞内への被検物質の透過の程度を測定
・評価することを特徴とする血液脳関門透過又は非透過
物質のスクリーニング方法。 - 【請求項３５】 請求項３２記載の血液脳関門形成促進
又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門形成促進物質。 - 【請求項３６】 請求項３２記載の血液脳関門形成促進
又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門形成抑制物質。 - 【請求項３７】 請求項３３記載の血液脳関門透過促進
又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門透過促進物質。 - 【請求項３８】 請求項３３記載の血液脳関門透過促進
又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門透過抑制物質。 - 【請求項３９】 請求項３４記載の血液脳関門透過又は
非透過物質のスクリーニング方法により得られる血液脳
関門透過物質。 - 【請求項４０】 請求項３４記載の血液脳関門透過又は
非透過物質のスクリーニング方法により得られる血液脳
関門非透過物質。
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