JP2001299392A

JP2001299392A - Ｃａｔｃｈ２２症候群検出方法

Info

Publication number: JP2001299392A
Application number: JP2000123976A
Authority: JP
Inventors: Kenji Ihara; 健二井原; Toshiro Hara; 寿郎原
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-04-25
Filing date: 2000-04-25
Publication date: 2001-10-30

Abstract

(57)【要約】【課題】従来のＦＩＳＨ法やＣＧＨ法に比較して、簡
便、迅速、安価に遺伝子発現量を測定し、ＣＡＴＣＨ２
２症候群を検出できる、該症候群の診断技術を提供す
る。【解決手段】染色体２２ｑ１１．２上にある配列番号：
１で示されるＵＦＤ１Ｌ遺伝子配列のエクソン１２領域
の塩基配列を含むポリヌクレオチド検体を、定量的リア
ルタイムＰＣＲ検出法によって測定して、該塩基配列の
欠損を検出することを特徴とするＣＡＴＣＨ２２症候群
検出方法および該検出のためのプローブまたはプライマ
ーとして用いられるオリゴヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特定染色体上の遺
伝子の欠失または過剰を定量的リアルタイムＰＣＲ検出
法によって検出する、ＣＡＴＣＨ２２症候群の検出方
法、および該検出に利用するオリゴヌクレオチド関す
る。

【０００２】

【従来の技術】癌を始めとする様々な疾患に癌抑制遺伝
子の欠失や、癌関連遺伝子の過剰発現などの変化が見ら
れることが近年わかってきた。これら遺伝子欠失などの
検出は、従来、染色体分染法により主として行われてき
たがこの方法では光学顕微鏡で検出不可能な遺伝子の微
小欠失は検出できない。かかる遺伝子の微小欠失の検出
方法としては、フルオレッセンス・インスィテュー・ハ
イブリダイゼーション(fluorescence in situ hybridiz
ation: FISH)法が知られており、例えばこれを利用し
て、ディジョージ症候群（DiGeorge syndromeまたはＣ
ＡＴＣＨ２２症候群(CATCH-22 syndrome)）を含む遺伝
子の欠失及び変異を検出する方法が提案されている(特
表平7-501691号)。

【０００３】即ち、ＣＡＴＣＨ２２症候群患者は、染色
体２２ｑ１１．２上に約３Ｍｂの欠失があることが知ら
れており、提案された方法は、該染色体２２ｑ１１．２
上に存在する部分塩基配列を有するＮ２５ＤＧＣＲプロ
ーブを用いてＦＩＳＨ法を実施することによって、上記
ＣＡＴＣＨ症候群を診断するものである。

【０００４】しかしながら、この方法（ＦＩＳＨ法）
は、検出に時間がかかることや、必要検体量の多さ、検
体の取扱いや手技の難しさという問題点があり、これに
代わる改良技術の開発が斯界で要望されている。

【０００５】一方、上記とは別個に、病歴を有する家系
内における遺伝子欠損の保因者診断は、遺伝子の多型マ
ーカーを用いた異型接合性の喪失分析(loss of heteroz
ygosity analysis: LOH)にて行われている。しかるに、
このＬＯＨ法は、病歴のある家系内での遺伝子の保因者
診断には便利であるが、標的遺伝子の近傍に情報量の多
いマーカーが必要であることと、家系と無関係の個人の
判定は困難である欠点がある。

【０００６】また、遺伝子過剰の他の判定方法として
は、競合的遺伝子的ハイブリダゼーション(Comparative
Genomic Hybridization: CGH; Kallioniemi, O.P., et
al.,Science, 258, 818-821 (1992))法が知られてお
り、これによれば、遺伝子の欠失や過剰発現も判定可能
である。しかるに、この方法は１コピー分の増減を判定
するのに１０Ｍｂｐ程度の遺伝子の大きさが必要であ
り、２１トリソミー(３染色体性)は判定することができ
ず、しかも、前記ＦＩＳＨ法と同様に、時間がかかった
り、測定手技に手間がかかるという不利がある。

【０００７】近年、遺伝子断片を大量に取得するために
開発されたＰＣＲ法が、組織中ＲＮＡの発現量やウイル
スＤＮＡ量などの定量にも応用されてきており、例え
ば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼ(タックマン：TaqMan)
プローブを用いて、ＰＣＲ反応をリアルタイムでモニタ
ーするカイネティックス分析によって、２倍の遺伝子量
の差を検出できる高精度の定量ＰＣＲ法が開発された
(均質検定システム：特許登録番号第2825976号、ABI PR
ISM 7700 Sequence Detection System User's Manual:
5.10.5.13(1996))。

【０００８】該定量ＰＣＲ法は、「定量的リアルタイム
ＰＣＲ検出法」と呼ばれ、各種ウイルス遺伝子の測定に
応用されている(ＥＢウイルス遺伝子の測定：特開平11-
137300号、ＨＣＶウイルス遺伝子の測定：特開平11-103
899号、ＨＢＶウイルス遺伝子の測定：特開平11-103897
号)。さらに該方法は、男女のＸ染色体の差や癌抑制遺
伝子の欠失の判定にも応用され得ることが報告されてお
り(Boulay, J.L., etal., Biotechniques, 27, 228-230
(1999))、末梢血から抽出したＤＮＡを検体として癌家
系内の保因者同定を行なった結果によれば、前記ＬＯＨ
法やＦＩＳＨ法よりも簡便であることも報告されている
(Laurendaeau, I., et al., Clin. Chem., 45 (7) 982-
986 (1999))。

【０００９】以上のよう、従来、ＣＡＴＣＨ２２症候群
患者は、染色体２２ｑ１１．２上に約３Ｍｂの欠失があ
ることを利用して、該染色体２２ｑ１１．２上に存在す
る部分塩基配列を有するＮ２５ＤＧＣＲプローブを用い
たＦＩＳＨ法により、診断されてきた(特表平7-501691
号)が、この方法は、検出に時間がかかり、多量の検体
量を要し、検体の取扱いや手技も難しい欠点があり、こ
れに代わって、より容易、簡便且つ短時間で、ＣＡＴＣ
Ｈ２２症候群の検出、診断などを行い得る技術の開発が
当業界で望まれていた。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、上記当業界で要望されている、より簡便且つ時間の
かからない改良された遺伝子疾患の定量、検出技術を提
供することにある。

【００１１】殊に本発明は、ＣＡＴＣＨ２２症候群、２
１トリソミー(ダウン症候群)などの遺伝子疾患の定量、
検出、診断をより高感度に行うことができる、上記改良
された技術を提供することをその課題とする。

【００１２】本発明者は、上記課題より、ＦＩＳＨ法に
代わるより簡便なＣＡＴＣＨ２２症候群の臨床診断法の
確立を企図し、先ず、該ＣＡＴＣＨ２２症候群患者にお
いて欠失の認められる染色体２２ｑ１１．２上の遺伝子
について、その部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを作成し、これらをプローブまたはプライマーとして
定量的リアルタイムＰＣＲ検出法の実施を着想したが、
ＣＡＴＣＨ２２症候群や２１トリソミー以外の疾患にお
いても、同じ遺伝子の微小欠失があることがあり、用い
るプライマー及びプローブの設定いかんによっては、臨
床診断について必ずしも満足する結果を得ることがきな
いことを確認した。

【００１３】しかるに引き続き鋭意研究を重ねた結果、
下記特定の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプ
ライマーおよびプローブを利用した定量的リアルタイム
ＰＣＲ法によれば、目的とするＣＡＴＣＨ症候群が他の
疾患とは明確に区別して、検出されるという事実を見出
した。即ち、臨床症状からＣＡＴＣＨ２２症候群と疑わ
れたが、従来のＦＩＳＨ法の実施によれば遺伝子の欠失
が認められず、正常と判断された症例について、上記特
定プライマーおよびプローブを用いた定量的リアルタイ
ムＰＣＲ法を実施したところ、ＦＩＳＨ法と一致する結
果が得られ、かくして、該方法によって、ＣＡＴＣＨ２
２症候群を正確に診断できることを見出した。本発明は
かかる知見を基礎として完成されたものである。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、染色体
２２ｑ１１．２上にある配列番号：１で示されるＵＦＤ
１Ｌ遺伝子配列のエクソン１２領域の塩基配列を含むポ
リヌクレオチド検体を、定量的リアルタイムＰＣＲ検出
法によって測定して、該塩基配列の欠損を検出すること
を特徴とするＣＡＴＣＨ２２症候群検出方法が提供され
る。

【００１５】殊に、本発明によれば、配列番号：１で示
される塩基配列のうちの連続する少なくとも１５塩基の
長さの塩基配列をプローブまたはプライマーとして用い
る上記ＣＡＴＣＨ２２症候群検出方法；プローブまたは
プライマーが、配列番号：１で示される塩基配列のうち
の連続する１５塩基から３０塩基の長さの塩基配列を有
するものである上記ＣＡＴＣＨ２２症候群検出方法；お
よびプローブまたはプライマーが、配列番号：２、配列
番号：３および配列番号：４に示される塩基配列を有す
るものから選ばれる上記ＣＡＴＣＨ２２症候群検出方法
が提供される。

【００１６】また、本発明によれば、配列番号：１で示
される塩基配列のうちの連続する１５塩基から３０塩基
の長さの塩基配列からなり、ＣＡＴＣＨ２２症候群を定
量的リアルタイムＰＣＲ検出法によって検出するための
プローブまたはプライマーとして用いられるオリゴヌク
レオチドが提供される。

【００１７】殊に、本発明によれば、配列番号：２、配
列番号：３および配列番号：４に示される塩基配列を有
するものである上記オリゴヌクレオチドが提供される。

【００１８】本発明方法は、ＣＡＴＣＨ２２症候群や２
１トリソミーの臨床診断を高感度で正確且つ簡便に検出
できるものであり、斯界の要望に合致する改良された検
出方法である。

【００１９】また本発明方法は、従来法に比べて、一定
の時間内に多数の検体を処理することが可能であり、検
査を効率化して検査時間を短縮することができ、臨床検
査センターなどでの受注検査を行うことができる点で
も、非常に有用である。

【００２０】さらに、本発明によれば、同様にして、２
１トリソミーを検出する方法が提供される。

【００２１】該方法は、２１番染色体上にある配列番
号：５で示されるＳ１００β遺伝子を含むポリヌクレオ
チド検体を、定量的リアルタイムＰＣＲ検出法によって
測定して、上記検体中の遺伝子過剰を検出することを特
徴とする。

【００２２】上記２１トリソミーの検出には、配列番
号：５で示される塩基配列のうちの連続する少なくとも
１５塩基の長さの塩基配列がプローブまたはプライマー
として用いられる。該プローブまたはプライマーの塩基
配列は、より好ましくは、配列番号：５で示される塩基
配列のうちの連続する１５塩基から３０塩基の長さであ
り、その具体例としては配列番号：６、配列番号：７お
よび配列番号：８で示される塩基配列を挙げることがで
きる。

【００２３】さらにまた、本発明によれば、配列番号：
５で示される塩基配列のうちの連続する１５塩基から３
０塩基の長さの塩基配列からなり、２１トリソミーを定
量的リアルタイムＰＣＲ検出法によって検出するための
プローブまたはプライマーとして用いられるオリゴヌク
レオチド、特に、配列番号：６、配列番号：７および配
列番号：８で示される塩基配列を有する上記プローブま
たはプライマーが提供される。

【００２４】

【発明の実施の態様】本発明検出方法に採用される定量
的リアルタイムＰＣＲ検出法は、基本的には、公知の方
法に従うことができる。その操作などは、具体的には、
例えば特許第2825976号に記載されている。また、ＰＥ
バイオシステムズ社製のABI PRISM 7700配列決定システ
ム・ユーザーマニュアルの記載に従うこともできる。

【００２５】本発明方法は、該定量的リアルタイムＰＣ
Ｒ検出法において、プローブおよびプライマーとして、
特定の塩基配列を有するものを利用することが重要であ
る。該塩基配列の具体例としては、次のものを例示する
ことができる。 (1) 配列番号：１で示される塩基配列（ＵＦＤ１Ｌ遺伝
子のエクソン１２領域の塩基配列）のうちの連続する１
５塩基から３０塩基の長さの塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチド（フォワード側プライマー）、 (2) 配列番号：１で示される塩基配列のうちの連続する
１５塩基から３０塩基の長さの塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチド（リバース側プライマー）、 (3) 配列番号：１で示される塩基配列のうちの連続する
１５塩基から４７塩基の長さの塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドプローブ、および (4) 上記(3)のオリゴヌクレオチドプローブに、レポー
ター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素とが結合されたも
のであって、該レポーター蛍光色素は、これが上記クエ
ンチャー蛍光色素が結合されたプローブに結合されたと
きは、蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑
制され、上記クエンチャー蛍光色素が結合されたプロー
ブに結合されていない状態では、蛍光強度が抑制されな
いものである、プローブ。

【００２６】本発明はまた、前記(1)のフォワード側プ
ライマー、前記(2)のリバース側プライマーおよび前記
(4)のプローブを用いて、被検試料中の測定すべきＵＦ
Ｄ１Ｌ遺伝子配列のエクソン１２領域の遺伝子を鋳型と
して、ＰＣＲ反応を行い、反応液からの蛍光をリアルタ
イムに測定することからなる、被検試料中のＵＦＤ１Ｌ
遺伝子配列のエクソン１２領域遺伝子を測定する方法を
も提供する。また、本発明は該測定方法によって得られ
る測定値を利用してＣＡＴＣＨ２２症候群を診断する方
法をも提供する。

【００２７】より詳しくは、本発明方法に用いられる
５’側プライマー（フォワード側プライマー）は、上述
したとおり、配列番号：１で示される塩基配列のうちの
連続する少なくとも１５塩基長さの、好ましくは１５塩
基から３０塩基長さの、塩基配列を有している。これら
のうちで、特に好ましいものとしては、配列番号：２で
示される１８塩基からなる塩基配列を有するものを挙げ
ることができる。

【００２８】なお、配列番号：１で示される塩基配列
は、ＣＡＴＣＨ２２症候群で全例欠失していたと報告さ
れている(Pizzuti, A., et al., Hum. Mol. Genet., 6
(2), 259-265(1997): Yamagishi, H., et al., Scienc
e, 283(5405), 1158-1161(1999))、１１５６塩基長から
なるＵＦＤ１Ｌ遺伝子(ヒトユビキチン融合−減成１様
蛋白(Homo sapiens ubiquitin fusion-degradation 1 l
ike protein):アクセッション番号：U64444)のエクソン
１２（その塩基配列は、配列番号：１に示される）内に
存在する塩基配列である。

【００２９】また、ＵＦＤ１Ｌ遺伝子の全塩基配列は公
知である（例えばNovelli, G., etal., Biochem. Bioph
ys Acta, 1396(2) 158-162(1998)参照、ジーンーバンク
(GenBank)アクセッション番号：U64444）。

【００３０】本発明方法に用いられる３’側プライマー
（リバース側プライマー）は、配列番号：１で示される
塩基配列のうちの連続する少なくとも１５塩基、好まし
くは連続する１５塩基から３０塩基の長さの塩基配列を
有するものから選ばれる。これらのうちで、特に好まし
いものとしては、配列番号：３で示される、１９塩基か
らなる塩基配列を有するものを挙げることができる。こ
れはＵＦＤ１Ｌ遺伝子のエクソン１２の１１０９−１１
２７番目の配列に相当する。

【００３１】本発明方法に用いられるプローブは、オリ
ゴヌクレオチドにレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍
光色素とが結合したものである。該プローブのオリゴヌ
クレオチド部分は、配列番号：１で示される塩基配列の
うちの連続する少なくとも１５塩基、好ましくは１５塩
基から３０塩基の長さの塩基配列を有するものから選ば
れる。これらのうちで、特に好ましいものとしては、配
列番号：４に示される、２８塩基からなる塩基配列を有
するものを挙げることができる。なお、配列番号：４で
示される塩基配列は、ＵＦＤ１Ｌ遺伝子のエクソン１２
（配列番号：１で示される塩基配列）内の第１０６６番
目〜第１０９３番目のヌクレオチド配列に相当する。

【００３２】上記プローブのオリゴヌクレオチド部分が
ハイブリダイズするＵＦＤ１Ｌ遺伝子のエクソン１２内
の領域は、前記５’側プライマーがハイブリダイズする
領域と一部重複していないが、実際のＰＣＲ反応の実施
に際しては、用いる５’側プライマーとプローブのそれ
ぞれがハイブリダイズする領域は互いに重複しないよう
に、これらプライマーおよびプローブの組み合わせを選
択する必要がある。

【００３３】上記レポーター蛍光色素は、該レポーター
蛍光色素がクエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結
合されている場合には、蛍光共鳴エネルギー転移により
その蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と
同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が
抑制されないものである。かかるレポーター蛍光色素と
しては、公知の各種のものをいずれも用いることがで
き、例えばＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイ
ン）のようなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましい。
クエンチャー蛍光色素としても、公知の各種のものを利
用でき、例えばＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメ
チル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光色素が好
ましい。これらの蛍光色素はまた、市販のリアルタイム
検出ＰＣＲ用キットに含まれているそれらをそのまま用
いることもできる。

【００３４】レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光
色素の結合位置は、特に限定されないが、通常、プロー
ブのオリゴヌクレオチド部の一端（好ましくは５’末
端）にレポーター蛍光色素が、他端にクエンチャー蛍光
色素が結合されるものとするのがよい。上記オリゴヌク
レオチドと蛍光色素との結合は公知の方法に従い実施す
ることができる（例えばNoble et al., (1984), Nuc. A
cids Res. 12: 3387-3403; Iyer et al., (1990), J. A
m. Chem. Soc. 112: 1253-1254に記載されている方法参
照）。

【００３５】本発明方法では、上記５’側プライマー
と、上記３’側プライマーと、上記プローブとを用い、
被検試料中の測定すべきＵＦＤ１Ｌ遺伝子のエクソン１
２内を鋳型として、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行
ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定する。こ
のリアルタイム検出ＰＣＲ法自体は公知であり、そのた
めの装置及びキットも市販されている。本発明はこのよ
うな市販の装置及びキットを用いて実施することができ
る。

【００３６】ＰＣＲ反応は、例えば被検者から抽出して
調製したＤＮＡまたはＲＮＡを検体として、上記５’側
プライマー、３’側プライマー及びプローブ並びに耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素活性をも有するも
の）、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを
含む溶液を利用して常法に従い実施することができる。
検体がＲＮＡの場合は、上記ｄＴＴＰに代えてｄＵＴＰ
を用い、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を加
えることにより、ＰＣＲ産物からの混入ＤＮＡを分解す
ることができる。

【００３７】ＰＣＲ反応の条件は、この種リアルタイム
ＰＣＲ検出法に採用されることの知られているそれと同
様のものとすることができる。その具体的条件は、後記
実施例に詳述されている。

【００３８】なお、検体としては、検出したいＣＡＴＣ
Ｈ症候群の疑いのあるもの、即ち所望の遺伝子の欠損な
どを有する疑いのある患者由来のものであればよく、例
えば該患者の血液等の体液であればよい。

【００３９】上記ＰＣＲ反応では、例えば、末梢血検体
から市販のＤＮＡ抽出用キットなどを用いてゲノムＤＮ
Ａを調製し、これをそのまま増幅用ＤＮＡとして利用す
ることができる。

【００４０】増幅ＤＮＡは、本発明に利用するプローブ
と相補的な領域を含んでいるので、該プローブは一本鎖
状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズする。プローブが完
全にハイブリダイズした状態で、プローブがハイブリダ
イズしている一本鎖ＤＮＡを鋳型とする伸長が起きる
と、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によ
り、プローブが５’末端側から加水分解される。この分
解の結果、プローブのオリゴヌクレオチド部分に結合さ
れているレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素と
がバラバラになり、クエンチャー蛍光色素に起因する蛍
光共鳴エネルギー転移により抑制されていたレポーター
蛍光色素からの蛍光強度が増加する。一方、検体試料中
にＵＦＤ１Ｌ遺伝子のエクソン１２領域のＤＮＡが存在
しない場合には、ＤＮＡの増幅は起きないので、プロー
ブはＤＮＡにハイブリダイズせず、従ってＤＮＡポリメ
ラーゼによって加水分解されることもない。このため、
レポーター蛍光色素からの蛍光は、クエンチャー蛍光色
素により抑制されたままであり、蛍光強度は増加しな
い。かかる原理を利用して、蛍光強度の測定によって、
検体試料中のＵＦＤ１Ｌ遺伝子のエクソン１２内にある
所定の遺伝子を検出することが可能である。

【００４１】本発明の方法では、上記蛍光強度をリアル
タイムに測定する。即ち、蛍光強度を測定しながらＰＣ
Ｒ反応を行う。測定される蛍光強度は、あるサイクル数
を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そして、
検体試料中のＵＦＤ１Ｌ遺伝子のエクソン１２領域のＤ
ＮＡ量が多いほど、少ないサイクル数で蛍光強度が急に
増加する。従って、何サイクルを過ぎた時に蛍光強度の
急激な増加が始まるかを調べることにより、検体試料中
の所定遺伝子のＤＮＡの定量測定を行うことができる。

【００４２】より具体的には、例えば、ＵＦＤ１Ｌ遺伝
子のエクソン１２領域のＤＮＡを含まないネガティブコ
ントロールにおける各サイクル（例えば３〜１５サイク
ル）の蛍光強度の標準偏差の１０倍を閾値として設定
し、蛍光強度がこの閾値を超えるサイクル数を調べるこ
とにより、検体試料中のＵＦＤ１Ｌ遺伝子のエクソン１
２領域のＤＮＡを正確に定量測定することができる。検
体試料中のＵＦＤ１Ｌ遺伝子のエクソン１２領域のＤＮ
Ａ数の常用対数を横軸に、上記閾値を超えた時のサイク
ル数を縦軸にとると、測定結果はほぼ完全に直線上にの
る。従って、かかる検量線を作成しておけば、何サイク
ルで閾値を超えるかを調べることにより検体試料中のＵ
ＦＤ１Ｌ遺伝子のエクソン１２領域のＤＮＡ量を定量測
定することができる。このように、本発明方法によれ
ば、従来の半定量ＰＣＲ法のように、ＰＣＲ後に電気泳
動を行って増幅を調べる操作は不要であり、この点で本
発明方法は非常に簡便である。

【００４３】

【実施例】以下、参考例および実施例を挙げて本発明を
更に具体的に説明するが、本発明はこれらの各例に限定
されるものではない。

【００４４】

【参考例１】ＦＩＳＨ法を用いたＣＡＴＣＨ２２症候群
の検出顔貌異常、低Ｃａ血症、ファロー四徴症（Tetralogy of
Fallot, TOF）、肺動脈閉鎖症（Pulmonary Atresin, P
A）、先天性心疾患(TOF+PA)などの臨床症状からＣＡＴ
ＣＨ２２症候群を疑われた患者２４名について、Ｎ２５
（Ｄ２２Ｓ７５）プローブ（Oncor社製）を用いて、Ｆ
ＩＳＨ法により、２２ｑ１１．２の領域に欠失があるか
どうかを試験した。尚、ＦＩＳＨ法は特表平７−５０１
６９１号公報に記載の方法に従って実施した。

【００４５】その結果、２４例全例において、２２ｑ１
１．２の領域に欠失があることが確認された。即ち、正
常では２本の染色体ｑ１１．２に蛍光プローブが結合し
て２つのシグナルが検出されるが、ＣＡＴＣＨ２２患者
では１つのシグナルしか検出されなかった。

【００４６】

【実施例１】本発明ＣＡＴＣＨ２２症候群の検出法測定用検体試料としては、上記参考例１で診断されたＣ
ＡＴＣＨ２２症候群患者２４例、Ｇ−バンディング染色
で診断された同ＣＡＴＣＨ症候群患者２２例および正常
例４０例の各患者より得られた末梢血検体を用いた。

【００４７】これら検体に対して、特定配列をプライマ
ーおよびプローブとする定量的リアルタイムＰＣＲ検出
法を以下の通り実施した。

【００４８】尚、上記ＣＡＴＣＨ２２症候群と診断され
た全例は、円錐動脈幹異常顔貌（ＣＴＡface）を認め、
他に先天性心臓病(CHD)、低Ｃａ血症、口蓋裂なとが認
められた。また、この症候群中には１例の親子が含まれ
ていた。

【００４９】ダウン症候群患者（２２名）は、全例ダウ
ン様顔貌、発達遅滞などの典型的症状が認められた。

【００５０】正常例は、全例顔貌異常や他の奇型はな
く、発達正常であり、また心エコーでＣＨＤも認められ
なかった。これら正常例には染色体検査は実施しなかっ
た。ａ）ゲノムＤＮＡの調製上記各患者の末梢血より、ＱＩＡａｍｐＤＮＡＭｉｎｉ
Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いて、ゲノムＤＮＡを抽
出し、ＵＶ分光器(島津社製)にて抽出ＤＮＡの濃度を測
定した。本発明検出法に供する測定用サンプルは、上記
ＤＮＡ濃度を１５〜２５ｎｇ／μｌに調製した。また、
検量線作成用の正常成人（別個に正常成人末梢血を用意
した）ＤＮＡ濃度は、同様にして３５ｎｇ／μｌに調製
した。ｂ）プローブおよびプライマーの調製ＣＡＴＣＨ２２症候群では、ＦＩＳＨ測定によって、２
２ｑ１１．２上の遺伝子においてＵＦＤ１Ｌ遺伝子が全
例欠失していたと報告されている(Pizzuti, A., et a
l., Hum. Mol. Genet., 6(2), 259-265(1997): Yamagis
hi, H., et al.,Science, 283(5405), 1158-1161(199
9))。

【００５１】本発明者らは、２２ｑ１１．２上の遺伝子
として、ＵＦＤ１Ｌ遺伝子のエクソン１２領域の塩基配
列に着目し、該領域内に存在する特定部分塩基配列を有
する以下のプライマーおよびプローブを設定した。

【００５２】即ち、配列番号：２に示される１８ｍｅｒ
のオリゴＤＮＡをＵＦＤ１Ｌのフォワード・プライマ
ー、配列番号３に示される１９ｍｅｒのオリゴＤＮＡを
ＵＦＤ１Ｌのリバース・プライマー、及び配列番号４に
示される２８ｍｅｒのオリゴＤＮＡをＵＦＤ１Ｌプロー
ブとしてをそれぞれ化学合成した。

【００５３】ある染色体の欠失を検出するためには、他
の染色体も調べてその比をとらなければならない。他の
染色体としては、２２番以外の常染色体ならいずれでも
よいが、ヒトの染色体異常症で最も高頻度である２１ト
リソミー（ダウン症候群）の診断法も兼ねることを想定
して、２１番染色体のダウン症候群の責任領域に含まれ
るＳ１００β遺伝子を定量することにした。

【００５４】上記２１番染色体上の遺伝子としては、定
量ＰＣＲにおいて、過剰が判定できた長腕上にあるＳ１
００βのエクソン２内に存在する、下記特定ＤＮＡ配列
を有するプローブおよびプライマーを用いた（Chiang,
P.W., et al., Genome Res.,6, 1013-1026 (1996))。

【００５５】即ち、配列番号：６に示される１９ｍｅｒ
のオリゴヌクレオチドをＳ１００βのフォワード・プラ
イマー（Ｓ１００βのエクソン２の４７−６５番目の配
列に相当する）、配列番号：７に示される２１ｍｅｒの
オリゴヌクレオチドをＳ１００βのリバース・プライマ
ー（Ｓ１００βのエクソン２の１１９−１３８番目の配
列に相当する）および配列番号：８に示される２８ｍｅ
ｒのオリゴヌクレオチドをＳ１００βプローブ（Ｓ１０
０βのエクソン２の８６−１１１番目の配列に相当す
る）として、それぞれ化学合成した。

【００５６】更に、上記２つの各プローブについては、
それらの各５’末端にＦＡＭを、また各３’末端にＴＡ
ＭＲＡを、それぞれ、上記文献記載の方法により結合
し、標識プローブを作成した。ｃ）定量的リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎＰＣＲ）上記ｂ）で調製した各プライマーおよびプローブを用い
た定量的リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７
７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔ
ｅｍ(ＰＥバイオシステムズ社製)を用いて、該装置の取
り扱いマニュアルに従い、以下の通り実施した。

【００５７】即ち、各フォワードおよびリバース・プラ
イマーを０．２ｐｍｏｌ／μｌずつおよびプローブを
０．１ｐｍｏｌ／μｌ用い、また２ｘTaqMan Universal
PCR Mastermix (PEバイオシステムズ社製)を用いて、
全反応容量を３５μｌに調製した。ついで、これを１６
μｌずつ２分し、ＵＦＤ１Ｌ遺伝子測定用およびＳ１０
０β遺伝子測定用とした。

【００５８】反応条件としては、５０℃で２分プレイン
キュベーション、９５℃で１０分の変性に続いて、９５
℃１５秒、６０℃１分の４０サイクルを採用した。検量
線用ＤＮＡ(３６ｎｇ／μｌ)は、２倍ずつ原液から１６
倍の５段階希釈した。

【００５９】ＰＣＲの各サイクル毎に蛍光強度を測定
し、蛍光強度の変化を縦軸に、サイクル数を横軸にとっ
てプロットした。検体試料中のＤＮＡのコピー数の常用
対数と蛍光強度の急激な増加が始まる閾値を越えたサイ
クル数との間には直線関係があり、このサイクル数を測
定することにより、検体中の所望のＤＮＡを定量測定で
きる。これらＰＣＲ反応により得られた結果の解析は、
上記装置に付属の解析用ソフトウェア(Sequence Detect
or)により行った。

【００６０】各々のサンプルにおける所望の遺伝子の初
期ＤＮＡ量を、検量線用ＤＮＡサンプルの原液の測定値
を１０００とした相対値で表示し、この値を用いて、Ｃ
ＡＴＣＨ２２症候群の場合は、Ｓ１００β遺伝子を標準
遺伝子として、ＵＦＤ１Ｌ遺伝子／Ｓ１００β遺伝子の
比を、またダウン症候群の場合は、ＵＦＤ１Ｌ遺伝子を
標準遺伝子として、Ｓ１００β遺伝子／ＵＦＤ１Ｌ遺伝
子の比をそれぞれ計算した。即ち、この測定方法におけ
る論理値は、遺伝子の欠失では０．５、正常では１．
０、そしてトリゾミーでは１．５となる。ｄ）解析結果上記ｃ）に従い求められた検体と各プローブおよびプラ
イマーとの反応の解析結果を、下記表１及び表２に示
す。

【００６１】

【表１】

【００６２】

【表２】

【００６３】表１よりＣＡＴＣＨ２２症候群と正常群で
は、平均±３ＳＤの範囲でも重複がなく、明確に区別さ
れた(99.7％信頼区間)。このことは、本発明のＣＡＴＣ
Ｈ２２症候群検出方法が、従来法に代わって使用し得る
ことを明らかしている。

【００６４】また、表２よりダウン症候群の場合も、平
均±３ＳＤでは正常群と重複がなく診断できることが証
明された。

【００６５】

【発明の効果】本発明により、ＣＡＴＣＨ２２症候群を
正確に診断するために少量のサンプルで高感度で正確
に、かつ、迅速、安価に目的遺伝子の存在を測定するこ
とが可能になった。

【００６６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ostuka Pharmaceutical Co., ltd. <120> Detection method for CATCH22 syndrome <130> DB00JP <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1156 <212> DNA <213> Exone 12 of homo sapiens ubiquitin fusion-degradation 1 like protein (UFD1L) gene <400> 1 ggcacgagga agagcggtcg gcggggtttc ttcgttgcat tgcctgagag gagcggagtc 60 tgccaggtgg tgtccatcat gttctctttc aacatgttcg accaccctat tcccagggtc 120 ttccaaaacc gcttctccac acagtaccgc tgcttctctg tgtccatgct agcatggcct 180 aatgacaggt cagatgtgga gaaaggaggg aagataatta tgccaccctc ggccctggac 240 caactcagcc gacttaacat tacctatccc atgctgttca aactgaccaa taagaattcg 300 gaccgcatga cgcattgtgg cgtgctggaa tttgtggctg atgaaggcat ctgctacctc 360 ccacactgga tgatgcagaa cttactcttg gaagaagacg gcctggtcca gttggagacc 420 gtcaaccttc aagtggccac ctactccaag agtaagttct gctacctccc acactggatg 480 atgcagaact tactcttgga agaaggcggc ctggtccagg tggagagcgt caaccttcaa 540 gtggccacct actccaaatt ccaacctcag agcgctgact tcctggacat caccaacccc 600 aaagccgtat tagaaaacgc acttaggaac tttgcctgtc tgaccaccgg ggatgtgatt 660 gccattaact acaatgaaaa gatctacgaa ctgcgtgtga tggagaccaa acccgacaag 720 gcagtgtcca ttcatgagtg tgacatgaac gtggactttg atgctcccct gggctacaaa 780 gaacccgaaa gacaagtcca gcatgaggag tcgacagaag gtgaagccga ccacagtggc 840 tatgctggag agcttggctt ccgcgctttc tctggatctg gcaatagact ggatggaaag 900 aagaaagggg tagagcccag cccctcccca atcaagcctg gagatattaa aagaggaatt 960 cccaattatg aatttaaact tggtaagata actttcatca gaaattcacg tccccttgtc 1020 aaaaaggttg aagaggatga agctggaggc agattcgtcg ctttctctgg agaaggacag 1080 tcattgcgta aaaagggaag aaagccctaa gtgaggactg ttggctgatt ggaaaataat 1140 aaaagtttca tttgca 1156 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Foward primer sequence <400> 2 aggcagattc gtcgcttt 18 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Reverse primer sequence <400> 3 cagccaacag tcctcactt 19 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Prove sequence <400> 4 tctggagaag gacagtcatt gcgtaaaa 28 <210> 5 <211> 172 <212> DNA <213> Exone 2 of Human S100 protein beta-subunit gene <400> 5 ctttgcgagc ccctaggatg tctgagctgg agaaggccat ggtggccctc atcgacgttt 60 tccaccaata ttctggaagg gagggagaca agcacaagct gaagaaatcc gaactcaagg 120 agctcatcaa caatgagctt tcccatttct tagaggtgag tcttgctttt ta 172 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Foward primer sequence <400> 6 cctcatcgac gttttccac 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Reverse primer sequence <400> 7 gctcattgtt gatgagctcc 20 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Probe sequence <400> 8 agacaagcac aagctgaaga aatccg 26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】染色体２２ｑ１１．２上にある配列番
号：１で示されるＵＦＤ１Ｌ遺伝子配列のエクソン１２
領域の塩基配列を含むポリヌクレオチド検体を、定量的
リアルタイムＰＣＲ検出法によって測定して、該塩基配
列の欠損を検出することを特徴とするＣＡＴＣＨ２２症
候群検出方法。
【請求項２】配列番号：１で示される塩基配列のうちの
連続する少なくとも１５塩基の長さの塩基配列をプロー
ブまたはプライマーとして用いる請求項１に記載のＣＡ
ＴＣＨ２２症候群検出方法。
【請求項３】プローブまたはプライマーが、配列番号：
１で示される塩基配列のうちの連続する１５塩基から３
０塩基の長さの塩基配列を有するものである請求項２に
記載のＣＡＴＣＨ２２症候群検出方法。
【請求項４】プローブまたはプライマーが、配列番号：
２、配列番号：３および配列番号：４に示される塩基配
列を有するものから選ばれる請求項３に記載のＣＡＴＣ
Ｈ２２症候群検出方法。
【請求項５】配列番号：１で示される塩基配列のうち
の連続する１５塩基から３０塩基の長さの塩基配列から
なり、ＣＡＴＣＨ２２症候群を定量的リアルタイムＰＣ
Ｒ検出法によって検出するためのプローブまたはプライ
マーとして用いられるオリゴヌクレオチド。
【請求項６】配列番号：２、配列番号：３および配列
番号：４に示される塩基配列を有するものである請求項
５に記載のオリゴヌクレオチド。