JP2001299349A

JP2001299349A - 新規組換え型抗体とそのｃｄｒのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子

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Publication number: JP2001299349A
Application number: JP2000117394A
Authority: JP
Inventors: Yoshiaki Fukuda; 好晃福田; Kazuhiro Nagahira; 和広永平; Toshihiro Nakanishi; 俊博中西
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 2000-04-19
Filing date: 2000-04-19
Publication date: 2001-10-30
Also published as: CN1380884A; AU782680B2; EP1186617A4; WO2001079298A1; CA2376882A1; KR20020034093A; AU4877601A; EP1186617A1

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒト型化抗ＴＮＦα抗体およびその製造方法
を提供する。【解決手段】a) CDR-H1として、 Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asn-Tyr-Gly-Met-Asn b) CDR-H2として、 Trp-Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro-Thr-Tyr-Ala-As
p-Asp-Phe-Lys-Gly c) CDR-H3として、 Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Phe-Asp-Tyr のアミノ酸配列を少なくとも一つ有するヒトＴＮＦαに
対する組換え型抗体のＨ鎖ポリペプチドまたはその断
片、 a') CDR-L1として、 Thr-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Ser-Phe-Ser-Tyr-Leu-His b') CDR-L2として、 Tyr-Ser-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-Ser c') CDR-L3として、 His-Gln-Tyr-Leu-Arg-Ser-Pro-Tyr-Thr のアミノ酸配列を少なくとも一つ有するヒトＴＮＦαに
対する組換え型抗体のＬ鎖ポリペプチド、並びに上記Ｈ
鎖ポリペプチドまたはその断片およびＬ鎖ポリペプチド
からなるヒトＴＮＦαに対するヒト型化抗体またはその
断片を提供する。該抗体等をコードする遺伝子を有する
発現ベクターで宿主細胞を形質転換して培養し、ヒト型
化抗ＴＮＦα抗体を製造する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトＴＮＦαの活
性を阻害する抗体の抗原結合に関与する新規なアミノ酸
配列とそれをコードする遺伝子、およびこれらの配列を
含む遺伝子組み換え型抗体、特にヒト型化抗体、該抗体
の生産方法及び該抗体を含有する医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は細胞に対
して多岐に渡る生物活性を有する炎症性サイトカインで
ある（Proc Natl Acad Sci USA 72, 3666, 1975）。Ｔ
ＮＦαはマクロファージやマスト細胞およびリンパ系細
胞など多くの種類の細胞から産生され、細胞表層に存在
する特異的なレセプターに結合することによってその効
果を発揮する（Annu Rev Biochem 57, 505, 1988）。Ｔ
ＮＦαの作用には、例えば腫瘍細胞やウイルス感染細胞
を破壊するといった有益なものも含まれるが、生体にと
って明らかに有害な作用も存在する。例えば、ＴＮＦα
は敗血性ショック症状の主たる原因物質であることが知
られており（Science 234, 470, 1986）、また、慢性関
節リウマチや多発性硬化症、マラリア等の疾患において
は全身的もしくは局所的なＴＮＦαの過剰産生が原因と
なっていると考えられている（ProcNatl Acad Sci USA
89, 9784, 1992, J Infect Dis 161, 1148, 1990, J Ex
p Med 170, 607, 1989）。このような疾患においてはＴ
ＮＦαの過剰産生を抑制したり、ＴＮＦαの生物学的活
性を阻害することがその病態改善に有用であると考えら
れる。

【０００３】抗体は一般に、抗原との親和性が強く、且
つ特異性が高いことが知られ、特に抗原の生物学的活性
を阻害する中和抗体は医薬としての利用が期待されてい
る。従来、抗体としてはウサギ抗血清由来のポリクロー
ナル抗体や、マウスやラットなどのモノクローナル抗体
が作製され、種々の用途に提供されてきた。しかしなが
ら、これら非ヒト由来の抗体はヒトにおいて高い免疫原
性を有し、これらの抗体のヒトへの投与の結果として産
生されるこれら非ヒト由来の抗体に対するヒト抗体が、
期待した効果の妨げとなるのみならず、患者における免
疫反応に基づく重篤な副作用を誘起するという問題点が
ある。従って、このような抗体を医薬として患者に投与
することには大きな制約があった。

【０００４】抗体分子は２種類のポリペプチドから構成
され、分子量の大きい方のポリペプチドはＨ鎖と呼ば
れ、小さい方のポリペプチドはＬ鎖と呼ばれる。また、
各々のポリペプチドは、抗原結合部位を形成する可変領
域と、抗体のクラス毎にほぼ一定の構造を持つ定常領域
とから成る。可変領域は、抗原結合部位の形成にさらに
密接に関与する相補性決定領域（CDR）と、その間に介
在するフレームワークと呼ばれる領域から成る。CDR
は、Ｈ鎖とＬ鎖の各々に対して３箇所ずつ（合計６箇
所）存在し、それぞれＮ末端側からCDR-1、CDR-2、CDR-
3と命名されている。抗体の抗原に対する親和性や特異
性は、主としてこれらのCDRのアミノ酸配列によって決
定されていることが知られている。

【０００５】近年、抗体を医薬として利用するための新
たな方法として、ヒト・マウスキメラ抗体あるいはヒト
型化抗体の作製方法が報告されている（Nature 328, 32
3, 1988）。ヒト・マウスキメラ抗体では、抗原結合部
位を含む可変領域がマウスのモノクローナル抗体に由来
し、定常領域が適当なヒト抗体に由来するキメラ型の抗
体である。キメラ抗体は元のマウス抗体の完全な可変領
域を含有することから、元のマウス抗体と同一の親和性
および特異性をもって抗原に結合することが期待でき
る。またこのキメラ抗体は、マウス由来のアミノ酸配列
が可変領域に限られていることから、元のマウス抗体に
比べ免疫原性が低下していると期待される。一方、ヒト
型化抗体はマウス抗体のCDRをヒト抗体可変領域に移植
して作製する（Immunol. Today, 14, 243, 1993, Int R
ev Immunol 10, 241, 1993)。ヒト型化抗体は、ヒト以
外に由来するアミノ酸配列はCDRのみであり、マウスCDR
を移植したヒト型化抗体は、キメラ抗体よりもさらにヒ
トに対する免疫原性が低いと考えられる。

【０００６】ＴＮＦαに対する中和抗体はこれまでに数
多く報告されている。例えば、マウスの慢性関節リウマ
チの疾患モデルで有効性を示すＴＮＦα抗体（Proc Nat
l Acad Sci USA 89, 9784, 1992）、マウス敗血症モデ
ルで病態を改善するＴＮＦα抗体（Nature 330, 662, 1
987）、さらに実際にヒトの慢性関節リウマチ患者で有
効性が示されたＴＮＦα抗体（Lancet 344, 1105, 199
4）などがある。しかしながら、これらの抗体はマウス
由来のモノクローナル抗体であるか、もしくはヒト・マ
ウスキメラ抗体であり、これらの抗体のアミノ酸配列や
それをコードする遺伝子、特に抗原であるＴＮＦαの認
識に関与するCDRのアミノ酸配列やそれをコードする遺
伝子は知られていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ヒト
ＴＮＦαに対するヒト型化抗体およびその生産方法を提
供することにある。さらに本発明の課題は、これらの抗
体と医薬的に許容し得る担体とからなる医薬組成物を提
供することにある。

【０００８】本発明者らは、活性なヒトＴＮＦαを特異
的に認識するマウスモノクローナル抗体、ＭＡＢ−３Ｂ
１０を開発し、特開昭６３−２５３０９９号に開示し
た。本発明者らは、さらに研究を押し進め、ＭＡＢ−３
Ｂ１０のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域のアミノ酸配
列を解明し、解明されたアミノ酸配列に基づいて、ヒト
ＴＮＦαに対する組換え型抗体およびその生産方法を提
供する。本発明の組換え型抗体は、好ましくはヒト型化
抗体である。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明のヒトＴＮＦαに
対する組換え型抗体は、以下のアミノ酸配列からなるＨ
鎖可変領域及びＬ鎖可変領域のCDR-1, CDR-2及びCDR-3
の少なくとも一つ、好ましくは全部を有する。Ｈ鎖のCDR-H1: Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asn-Tyr-Gly-Met-
Asn（配列番号：１）Ｈ鎖のCDR-H2: Trp-Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro-
Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp-Phe-Lys-Gly（配列番号：２）Ｈ鎖のCDR-H3: Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Phe-Asp-Tyr（配
列番号：３）Ｌ鎖のCDR-L1: Thr-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Ser-Phe-Ser-
Tyr-Leu-His（配列番号：４）Ｌ鎖のCDR-L2: Tyr-Ser-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-Ser（配
列番号：５）Ｌ鎖のCDR-L3: His-Gln-Tyr-Leu-Arg-Ser-Pro-Tyr-Thr
（配列番号：６）。

【００１０】一つの態様において、本発明の抗体は、抗
体のＨ鎖可変領域が図１（Ａ）の３Ｂ１０の行に示すア
ミノ酸配列のアミノ酸1〜113 位に記載された配列（配
列番号：７）あるいはそれと実質的に同じ機能のアミノ
酸配列を含み、かつＬ鎖可変領域が図１（Ｂ）の３Ｂ１
０の行に示すアミノ酸配列のアミノ酸1〜107 位に記載
された配列（配列番号：８）あるいはそれと実質的に同
じ機能のアミノ酸配列を含み、またヒトTNFαを認識す
る。（これらの配列は、ＭＡＢ−３Ｂ１０のＨ鎖および
Ｌ鎖の可変領域の配列として本発明において同定された
ものである。）

【００１１】本明細書において、「抗体」とは、通常生
体内に存在する形の抗体以外に、抗体のＨ鎖もしくはＬ
鎖の可変領域もしくはその組み合わせで形成される抗原
結合部位を少なくとも１つ含む分子も含む。例えば、通
常生体内に存在する形の抗体をパパインで切断した結果
得られるFabのような１組のＨ鎖断片とＬ鎖から成る蛋
白質や、同様にペプシンで切断することによって作製さ
れるF(ab')₂のような２組のＨ鎖断片とＬ鎖から成る蛋
白質、あるいはＨ鎖断片とＬ鎖が同一ペプチド上に直列
に結合した１本鎖抗体ScFvなども含まれる。これら通常
生体内に存在する形以外の「抗体」は、生体内に存在する
形の抗体を蛋白分解酵素で切断することによって得られ
る場合もあるが、遺伝子組み換え手法によって作製され
る場合もある。

【００１２】本発明には、上記本発明の抗体分子の断片
であって、上記CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-
L2、CDR-L3の少なくとも一つを含む断片も含まれる。例
えば、図１（Ａ）の３Ｂ１０の行のアミノ酸１〜113位
に記載されたアミノ酸配列のＨ鎖可変領域あるいはそれ
と実質的に同じ機能のアミノ酸配列を含むペプチドも含
まれ、さらに、図１（Ｂ）の３Ｂ１０の行のアミノ酸1
〜107 位に記載されたアミノ酸配列のＬ鎖可変領域ある
いはそれと実質的に同じ機能のアミノ酸配列を含むペプ
チドも含まれる。そのようなペプチドを単独または種々
組み合わせて、抗体を模倣した種々の人工構築物を製造
することが可能である。

【００１３】本明細書において、「実質的に同じ機能」
とは、抗体分子上の相補性決定領域のアミノ酸配列や抗
原との親和性が実質的に同じであること、および場合に
よっては親和性がより大きいことを意味する。即ち、可
変領域のフレームワークや定常領域のアミノ酸の１ない
し数個を他のアミノ酸による置換を行った場合にも、実
質的に同じ機能を持った抗体が作製できる場合があり、
あるいはヒト型化抗体においては抗原に対する親和性が
より大きくなる場合があることが知られている。従っ
て、例えば、CDRのアミノ酸配列を一定に保ち、可変領
域のフレームワークや定常領域のアミノ酸のいくつかを
別のアミノ酸に置換したような、「実質的に同じ機能」
を有したいくつかの抗体の「誘導体」を作製することが
出来る。そのようなアミノ酸の置換のために、性質の類
似したアミノ酸に置換することはよく知られており、例
えば塩基性アミノ酸の間の置換、酸性アミノ酸の間の置
換、あるいは芳香環をもつアミノ酸の間の置換などが挙
げられる。

【００１４】また、可変領域のフレームワークや定常領
域でアミノ酸の１ないし数個を欠失または付加しても、
「実質的に同じ機能」を有したいくつかの抗体の「誘導
体」を作製することが出来ると予想され、それら実質的
に同じ機能を有する誘導体も本発明の範囲に含まれる。

【００１５】本発明の抗体またはその断片は、遺伝子組
換え手法によって産生できる。本発明の抗体は、その相
補性決定領域以外の構造は、抗ヒトＴＮＦαモノクロー
ナル抗体ＭＡＢ−３Ｂ１０以外であればいかなる抗体を
基本としてもよいが、好ましくはヒト抗体を基本とす
る。ヒト抗体を基本として本発明抗体を製造する場合を
例にして説明すれば、先ず、適当なヒトモノクローナル
抗体を用意し、そのＨ鎖およびＬ鎖の可変領域を、前記
の抗ヒトＴＮＦαモノクローナル抗体（ＭＡＢ−３Ｂ１
０）のＨ鎖およびＬ鎖の可変領域にそれぞれ置換したキ
メラ抗体を製造する。使用できるヒトモノクローナル抗
体に特別の制限はなく、例えばＨＢＳ−１と呼ばれるヒ
ト抗ＨＢｓ抗体(Gastroenterol Jpn 19, 344, 1984; J
Immunol Methods 222, 83, 1999)が使用できる。キメラ
抗体の製造方法は、Proc Natl Acad Sci USA, 81, 695
1, 1984に詳しく記載されている。

【００１６】次に、キメラ抗体をヒト型化抗体に改変す
る。即ち、キメラ抗体のＨ鎖およびＬ鎖の各々につい
て、可変領域のうち相補性決定領域以外のフレームワー
ク部分をヒト抗体のフレームワーク部分に変更する。そ
のためには、実施例３に記載するように、Satoらの方法
(Cancer Res 53, 851, 1993)を利用して、ＨＢＳ−１の
Ｌ鎖およびＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡをそれぞれ
鋳型とし、ＭＡＢ−３Ｂ１０のCDR-L1〜CDR-L3およびCD
R-H1〜CDR-H3の配列に基づいて作製した適当なプライマ
ー（例えば配列番号：９〜１４のプライマーL1〜プライ
マーL6および配列番号：１５〜１９のプライマーH1〜プ
ライマーH5）を用いて、フレームワーク部分をヒト型化
したＭＡＢ−３Ｂ１０のＬ鎖およびＨ鎖可変領域をコー
ドするＤＮＡを増幅する。増幅により得られたＬ鎖およ
びＨ鎖の各々の可変領域をコードするＤＮＡを用い、上
記キメラ抗体のＬ鎖およびＨ鎖をそれぞれコードするＤ
ＮＡの可変領域を、再度キメラ抗体製造技法で置換す
る。

【００１７】得られたヒト型化抗体のＬ鎖およびＨ鎖を
それぞれコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込み、
両者を同一または別々の宿主細胞に形質転換し、Ｌ鎖お
よびＨ鎖を別個にまたは同時に発現させることにより、
ヒト型化抗体を分泌させることが可能である(Proc Natl
Acad Sci USA, 84, 241, 1987; Cancer Res, 47, 999,
1987)。

【００１８】組換え抗体の生産方法として、例えば、CO
S-1細胞（アフリカミドリザル腎臓由来SV40形質転換細
胞）やCHO細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来細
胞）に組換え抗体をコードする遺伝子を導入することに
より分泌発現することが出来る。遺伝子導入には、種々
のベクターが使用可能であり、例えば真核細胞用発現ベ
クターpdKCR-dhfr（Biochem Biophys Res Commun 164,
39, 1989）に実施例に記載するような改変を加えたもの
等が利用出来る。ベクターは、Ｌ鎖またはＨ鎖をコード
するＤＮＡを宿主細胞で発現させるために、プロモータ
ー、ターミネーター、その他の要素を有してよい。ま
た、Ｌ鎖および／またはＨ鎖を宿主から分泌させるため
に、Ｌ鎖および／またはＨ鎖をコードするＤＮＡは、宿
主細胞と適合するシグナルペプチドをコードする遺伝子
の下流に配置して用いてもよい。

【００１９】例えばCOS-1細胞は、10％ウシ胎児血清（F
CS）添加 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM
培地）のような培地を用い、５％CO₂存在下37℃で培養
する。COS-1細胞への遺伝子導入法や遺伝子導入後の細
胞の培養法は、Molecular Cloning, A Laboratory Manu
al (Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryP
ress, 1989)などの実験書に記載されている。

【００２０】医薬に用いる抗体を生産する際には、血清
由来のウシ抗体等の混入を避けるために、無血清の培地
によって培養することが望ましい。こうして培養上清中
に分泌された抗TNFα抗体は、例えばプロテインＡを結
合させた樹脂などを用いる一般的な抗体精製法（Antibo
dies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, 1988）によって容易に精製することがで
きる。工業生産の場合の宿主細胞としては CHO細胞やマ
ウス骨髄腫細胞Sp2/0などが使用できる。例えば CHO細
胞では、MTX などの薬剤により生産性の高いクローンを
選択することも可能であり (Immunol Lett 64, 139, 19
98)、安定な高生産株が取得できれば、その株は組み換
え型抗ヒトTNFα抗体の工業的な生産に有用である。

【００２１】本発明の抗体は、可変領域のフレームワー
ク部分のアミノ酸の一部を別のアミノ酸に置換すること
により、ヒトＴＮＦαに対する親和性が向上する場合が
ありうる。そのような置換は、例えば、実施例４に示す
ように、適当な変異を導入したプライマーを用いるＰＣ
Ｒを利用して行うことが可能である。

【００２２】医薬に用いる抗体の形は、生産された抗体
分子をそのまま利用することも可能であるが、各種プロ
テアーゼ処理により得られる抗原結合部位を含む断片を
用いてもよい。抗体の形は上述のように、通常生体内に
存在する形の抗体以外に、抗体のＨ鎖もしくはＬ鎖の可
変領域もしくはその組み合わせで形成される抗原結合部
位を少なくとも１つ含む断片であればよい。これらの抗
体は、遺伝子組み換え手法によって作製してもよいが、
遺伝子組み換え手法によって作製された後に蛋白分解酵
素を用いて限定分解することによって作製してもよく、
その方法は特に限定されるものではない。

【００２３】また、本発明は、上記本発明の組換え抗体
と医薬的に許容し得る担体とからなる医薬組成物を提供
する。本発明の医薬組成物中において、本発明の抗体
は、例えば医薬的に許容しうる成分組成の担体や安定化
剤など、人体への投与に際し、該抗体の活性を保持させ
るために使用される物質とともに含まれていてもよい。
このような担体や安定剤としては、ヒト血清アルブミ
ン、ゼラチン等を例示することができる。医薬的に許容
しうるとは、悪心、目眩、吐き気等投与に伴う望ましく
ない副作用、頻回投与時の製剤に対する免疫応答などが
起きないことを意味する。また、医薬的に許容しうる適
当な溶剤や希釈剤、安定化剤とともに溶解された液状の
医薬用組成物でもよい。さらに上記の医薬組成物に加え
て生体内における濃度調節を目的とするミクロスフィア
ー、リポゾーム等の徐放移植体を含む医薬用組成物であ
ってもよい。

【００２４】本発明の医薬組成物は、ＴＮＦαまたはそ
の過剰生産が関与する病気や症状を予防または治療する
ために、例えば、敗血性ショック症状、慢性関節リウマ
チ、多発性硬化症、マラリア等の患者に投与することが
できる。投与経路は必要に応じて選択でき、全身的に
は、静脈投与、経口投与、腹腔内投与、皮下投与、鼻腔
内投与、経皮投与等により、または局所的には軟膏、ロ
ーション等により投与することができる。投与量は、医
師が症状、患者の年齢、その他に応じて適宜決定してよ
い。

【００２５】

【実施例】以下、本発明の実施例を説明するが、これら
は本発明を具体例に基づいて説明するものであって、本
発明を限定するものではない。

【００２６】実施例１．抗ヒトTNFαマウス中和抗体3B1
0のH鎖及びL鎖可変領域ｃDNAクローニングヒトTNFαに対するマウス単クローン抗体を分泌する3B1
0細胞（J Immunol Methods 96, 57, 1987）の総RNAをRN
Azol B試薬（BIOTEX Laboratories社）を用いて分離
し、この総RNAを用いランダムヘキサマーおよび逆転写
酵素（SuperScriptPreamplification System、GIBCO BR
L社製）を使ってcDNAを合成した。得られたcDNAよりpol
ymerase chain reaction（PCR）法によりH鎖およびL鎖
可変領域をコードするcDNAを増幅した。尚、L鎖可変領
域のcDNAは、Huseらによって報告された配列（Science
246, 1275, 1989）にしたがって合成した増幅用プライ
マーにより増幅し、またH鎖可変領域はKabatらにより報
告されたH鎖アミノ酸配列（US Dept. Health and Human
Services, US Government Printing Offices, 1991）
に基づいて設計した5'プライマー（5'-AGGTGAAGCTNGTGG
AG/ATCTGG -3'）とHuseらの3'プライマーを組み合わせ
てPCRを行うことにより増幅した。 PCRには耐熱性DNAポ
リメラーゼ（AmpliTaq DNA polymerase、Perkin-Elmer
社製）およびサーマルサイクラー（TRIO-Thermo-bloc
k、 Biometra社製）を使用した。得られたcDNAの塩基配
列はSangerらの方法に従い解析した（Proc Natl Acad S
ci USA 74, 5463, 1977）。得られた3B10抗体のH鎖及び
L鎖の可変領域の塩基配列を図１に示す。Kabatらの方法
（US Dept. Health and Human Services, US Governmen
t Printing Offices, 1991）またはChothiaらの方法（J
Mol Biol 196, 901, 1987）に従い、CDR領域を同定
し、本発明においては、いずれかのCDR領域に含まれる
アミノ酸配列を「CDR領域」とみなした。

【００２７】実施例２．抗ヒトTNFαに対するヒト・マ
ウスキメラ抗体の発現ベクター作製真核細胞用発現ベクターpdKCR-dhfr（Biochem Biophys
Res Commun 164, 39,1989）にマルチクローニングサイ
ト（Eco RI, Mlu I, Spe I, Sal I）を導入した（以降p
KDEMSSベクターと呼ぶ）。次に、pKDEMSSのジヒドロ葉
酸還元酵素（DHFR）領域をpMAMneoCAT（CLONTECH社製）
のネオマイシン耐性（neor）領域に置換した（以降pKNE
MSSベクターと呼ぶ）。キメラH鎖発現ベクターは、HBS-
1と呼ばれるヒト抗HBs抗体（Gastroenterol Jpn 19, 34
4, 1984, J Immunol Methods 222, 83, 1999）のγ1鎖
のシグナル配列と、実施例１で得られた3B10のH鎖可変
領域、およびHBS-1のγ1鎖の定常領域を、Ｎ末側からこ
の順序でpKNEMSSベクターに組み込むことにより作製し
た（以降pKNH-c3B10と呼ぶ）。同様に、HBS-1のκ鎖の
シグナル配列と実施例１で得られた3B10のL鎖可変領
域、およびHBS-1のκ鎖の定常領域を、Ｎ末側からこの
順序でpKDEMSSベクターに組み込むことによりキメラL鎖
発現ベクターを作製した（以降pKDL-c3B10と呼ぶ）。図
２にpKNH-c3B10及びpKNL-c3B10の構造を示す。

【００２８】実施例３．ヒト型化抗ヒトTNFα抗体の構
築 Satoらの方法（Cancer Res 53, 851, 1993）に従い、マ
ウス抗体3B10の６つのCDRをヒトIgGの対応する位置に置
換した抗体遺伝子を構築した。図３に示されるように、
まず、HBS-1抗体のL鎖のcDNAを鋳型として５回のPCRを
実施することによりL鎖可変領域のcDNAフラグメントを
作製した。初回のPCRではプライマーL1およびL2を用い
て増幅を行った。増幅したフラグメントを5'プライマー
として用い、L3プライマーとの組み合わせで２回目のPC
Rを行った。同様にさらにL6プライマーまで使用した３
回のPCRを実施し、最終的に目的とするL鎖可変領域cDNA
フラグメントを作製した。H鎖可変領域のcDNAフラグメ
ントについてもHBS-1のH鎖のcDNAを鋳型にPCRを繰り返
すことにより作製した。ただし、２回目のPCRに用いた
3'プライマーは重なりを持つ２種類のプライマーでPCR
を行うことにより作製した。最終的に増幅されたこれら
のL鎖およびH鎖可変領域cDNAフラグメントを実施例２で
作製した抗ヒトTNFαに対するヒト・マウスキメラ抗体
の発現ベクターpKDL-c3B10およびpKNH-c3B10の可変領域
と置換することによりヒト型化抗体発現ベクターを構築
した。各々のベクターで同時に形質転換した適当な宿主
細胞を発現条件下で培養することにより、抗ヒトTNFα
ヒト型化抗体を分泌させることができる（実施例４参
照）。以上の操作で得られたヒト型化抗体をh3B10-1と
命名した。

【００２９】本実施例で使用したプライマーを表１に示
す。なお、これらのプライマーでは、L鎖のフレームワ
ーク部分の４番目、36番目、48番目、71番目のアミノ
酸、およびH鎖の71番目、93番目のアミノ酸が、各々マ
ウス3B10の対応するアミノ酸残基に置換されている。

【００３０】

【表１】軽鎖 L1 5'-AGG TGT GAC GTC CAG TTG ACC CAG TCT CCA （配列番号：９） L2 5'-CTG ATA CCA GTG TAA ATA ACT GAA GCT AAC GCT CGA ACT CGC CGT ACA AGT GAT （配列番号：１０） L3 5'-GAC CCC ACT TGC CAA ATT GGA TGT AGA ATA GAT CAG GAG CTT （配列番号：１１） L4 5'-TGT GAG AGT GTA TTC TGT CCC AGA TCC ACT （配列番号：１２） L5 5'-GCC GAA AGT GTA CGG GGA ACG AAG ATA CTG GTG ACA GTA （配列番号：１３）L6 5'-CTC ATC AGA TGG CGG GAA GA （配列番号：１４）重鎖 H1 5'-CAG AAT TCA CCA TGG AGT TTG GGC TGA GCT （配列番号：１５） H2 5'-GAC CCA GTT CAT ACC ATA GTT AGT GAA GGT GTA TCC AGA （配列番号：１６） H3 5'-GAG TGG GTG GCA TGG ATA AAC ACT TAT ACA GGT GAG CCA ACC TAC GCA （配列番号：１７） H4 5'-GTC TAA GGA AAT GGT GAA TCG GCC CTT GAA GTC GTC TGC GTA GGT TGG （配列番号：１８） H5 5'-TCC CTG GCC CCA GTA GTC AAA TCC GTC ATA ATC ATA TCT TGC ACA GTA （配列番号：１９）

【００３１】実施例４．ヒト型化抗ヒトTNFα抗体の誘
導体の構築 h3B10-1に更に変異を加えたヒト型化3B10抗体誘導体を8
種作製した。変異は、H鎖およびL鎖のフレームワーク部
分に導入した。すなわち、h3B10-1を鋳型として、変異
を導入したプライマーを用いてPCRを行うことにより行
った。PCRには耐熱性DNAポリメラーゼ（AmpliTaq DNA p
olymerase、Perkin-Elmer社製）およびサーマルサイク
ラー（TRIO-Thermo-block、Biometra社製）を使用し
た。作製した8種のヒト型化抗体（h3B10-2〜9と命
名）、h3B10-1H及びh3B10-1Lにおけるアミノ酸配列の異
なる部分を表２にまとめた。なお、L鎖がh3B10-1と同じ
でH鎖のフレームワーク領域がHBS-1そのものである抗体
をh3B10-1Hと命名し、H鎖がh3B10-1と同じでL鎖のフレ
ームワーク領域がHBS-1そのものである抗体をh3B10-1L
と命名した。

【００３２】

【表２】表２ヒト型化抗TNFα抗体のフレームワーク領域の構造Ｈ鎖のアミノ酸残基Ｌ鎖のアミノ酸残基抗体 3 46 71 78 93 3 4 36 46 47 71 m3B10 ＫＫＬＡＡＥＬＹＬＷＹ c3B10 ＫＫＬＡＡＥＬＹＬＷＹ HBS-1 ＱＥＲＬＩＱＭＦＲＬＦ h3B10-1 ＱＥＬＬＡＱＬＹＬＬＹ h3B10-1H ＱＥＲＬＩＱＬＹＬＬＹ h3B10-1L ＱＥＬＬＡＱＭＦＲＬＦ h3B10-2 ＫＥＬＬＡＱＬＹＬＬＹ h3B10-3 ＱＫＬＬＡＱＬＹＬＬＹ h3B10-4 ＱＥＬＡＡＱＬＹＬＬＹ h3B10-5 ＫＫＬＡＡＱＬＹＬＬＹ h3B10-6 ＱＥＬＬＡＥＬＹＬＬＹ h3B10-7 ＱＥＬＬＡＱＬＹＬＷＹ h3B10-8 ＱＥＬＬＡＥＬＹＬＷＹ h3B10-9 ＫＫＬＡＡＱＬＹＬＷＹ表２中、アミノ酸は1文字略字で示し、Kabatらの方法
（US Dept. Health andHuman Services, US Government
Printing Offices, 1991）に従い番号を付した。ま
た、マウス由来の配列を下線で示した。 m3B10: 元のマウス抗TNFα抗体; c3B10: ヒト・マウスキメラ抗TNFα抗体; HBS-1: HBｓに対するヒト抗体; h3B10-1H: L鎖がh3B10-1と同じでH鎖のフレームワーク
領域がHBS-1そのものである抗体; h3B10-1L: H鎖がh3B10-1と同じでL鎖のフレームワーク
領域がHBS-1そのものである抗体。

【００３３】実施例５．ヒト型化抗ヒトTNFα抗体及び
その誘導体の発現とその解析 COS-1細胞（ATCCより入手）を35mmシャーレに3.0 x 10⁵
個播種し18時間前培養した。実施例２〜４で構築した合
計９種類のヒト型化抗ヒトTNFα抗体およびヒト・マウ
スキメラ抗体に対応する各々のH鎖発現ベクターとL鎖発
現ベクターのペア各2μgずつを10μlのリポフェクトア
ミン試薬（GIBCO BRL社製）を用いて同時にCOS-1細胞に
導入した。遺伝子を導入した細胞から分泌される各組み
換え型抗体のヒトTNF-αに対する結合性をELISA法によ
り検討するとともに、FCA（Fluorescence Concentratio
n Analyzer）法と呼ばれる方法で培養上清中のヒトIgG
量を定量した。ELISAは次のような方法で実施した。ま
ず、96ウェルプレートの中央部60ウェルに10μg/mlのヒ
トTNF-αを満たし室温で18時間インキュベートすること
により固相化した。ウェルを洗浄バッファー(0.1% Twee
n 20を含むphosphate-buffered saline (PBS))で３回洗
浄した後、1% BSAを含むPBSで２時間ブロッキングし
た。PBS-Tで３回洗浄した後、各々のCOS-1細胞上清と２
時間反応させた。同様に洗浄を行った後、TNF-αに結合
した抗体をパーオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG Fc抗体
（Jackson ImmunoResearch Laboratories社製）または
パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス IgG Fc抗体（Calta
g Laboratories社製）を反応させ、文献（J Immunol Me
thods 143, 89, 1991）に記載の方法により検出を行っ
た。一方、FCA法は、既に報告されている方法に準じ（B
iochem Biophys Res Commun193, 886, 1993）、ヤギ抗
ヒトIgG Fc抗体をコートしたFCA用パーティクルとFITC
で標識したヤギ抗ヒトIgG Fc抗体を用い、既知濃度のヒ
トIgGを標準物質として定量した。各COS-1細胞で発現し
た各ヒト型化抗体のヒトTNFαとの結合性は種々の濃度
のIgGに対するELISA反応量で表示した。

【００３４】その結果、図４及び図５に示すように、い
ずれのヒト型化抗体においてもヒトTNFαに対する結合
活性が認められ、h3B10-9において最も強い活性が確認
され、その強さはヒト・マウスキメラ抗体と同程度であ
った。抗体h3B10-1においても、ヒト・マウスキメラ抗
体より弱い活性ながら、結合活性を有することが示され
た。対照として作製したh3B10-1Hやh3B10-1LにはヒトTN
Fαに対する結合性は認められなかった。

【００３５】

【発明の効果】本発明で初めて提供された６つのCDRの
アミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子は、これら
をヒトのIgGの対応する位置に置換することにより、ヒ
トTNFαに対し結合活性を保持したヒト型化抗体が得ら
れることが示された。本発明で得られるヒト型化抗TNF
α抗体は、医薬品として利用した場合、ヒト体内での免
疫原性がマウスなどの動物に由来する抗体に比較し極度
に低下しており、より安全性が向上している。本発明に
よれば、TNFαが関与する種々の患者に対する投与に際
してヒトTNFαを認識するヒト型抗体を大量に調製する
ことが可能となる。

【００３６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Suntory Limited <120> Novel recominat antibody, amino acid sequences of its CDR regions and DNAs encoding said CDR regions <130> 000539 <160> 19 <210> SEQ ID NO:1 <211> 10 <212> PRT <213> mouse <220> <223> CDR-H1 of anti-human TNF-alpha antibody <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn 5 10 <210> SEQ ID NO:2 <211> 17 <212> PRT <213> mouse <220> <223> CDR-H2 of anti-human TNF-alpha antibody <400> 2 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 5 10 15 Lys Gly <210> SEQ ID NO:3 <211> 8 <212> PRT <213> mouse <220> <223> CDR-H3 of anti-human TNF-alpha antibody <400> 3 Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr 5 <210> SEQ ID NO:4 <211> 12 <212> PRT <213> mouse <220> <223> CDR-L1 of anti-human TNF-alpha antibody <400> 4 Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Ser Tyr Leu His 5 10 <210> SEQ ID NO:5 <211> 8 <212> PRT <213> mouse <220> <223> CDR-L2 of anti-human TNF-alpha antibody <400> 5 Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 5 <210> SEQ ID NO:6 <211> 9 <212> PRT <213> mouse <220> <223> CDR-L3 of anti-human TNF-alpha antibody <400> 6 His Gln Tyr Leu Arg Ser Pro Tyr Thr 5 <210> SEQ ID NO:7 <211> 351 <212> DNA <213> mouse <220> <223> H-chain CDR region of anti-human TNF-alpha antibody <400> 7 cag gtg aag ctg ctc gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48 Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga tac acc ttt act aac tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 ggt atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ttg aag tgg gtg 144 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Val 35 40 45 gca tgg ata aac act tat aca ggt gag cca acc tac gca gac gac ttc 192 Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 aag ggc cga ttc acc att tcc tta gac aat tcc aag aac aca gcg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg gaa gtg aag agc ctg caa act gag gac acg ggt gtc tat tac tgt 288 Leu Glu Val Lys Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga tat gat tat gac gga ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg 336 Ala Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 gtc acc gtc tcc tca 351 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> SEQ ID NO:8 <211> 324 <212> DNA <213> mouse <220> <223> L-chain CDR region of anti-human TNF-alpha antibody <400> 8 gac gtc cag ttg acc cag tct cca tct gcc atg gct gca tct gta gga 48 Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ala Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgt acg gcg agt tcg agc gtt agc ttc agt 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Ser 20 25 30 tat tta cac tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gtc cct aag ctc tgg 144 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Trp 35 40 45 atc tat tct aca tcc aat ttg gca agt ggg gtc cca tcg agg ttc agc 192 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt gga tct ggg aca gaa tac act ctc aca atc agc agc ctg cag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 cct gaa gat ttt gca act tat tac tgt cac cag tat ctt cgt tcc ccg 288 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu Arg Ser Pro 85 90 95 tac act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 324 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> SEQ ID NO:9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer L1 <400> 9 aggtgtgacg tccagttgac ccagtctcca 30 <210> SEQ ID NO:10 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer L2 <400> 10 ctgataccag tgtaaataac tgaagctaac gctcgaactc gccgtacaag tgat 54 <210> SEQ ID NO:11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer L3 <400> 11 gaccccactt gccaaattgg atgtagaata gatcaggagc tt 42 <210> SEQ ID NO:12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer L4 <400> 12 tgtgagagtg tattctgtcc cagatccact 30 <210> SEQ ID NO:13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer L5 <400> 13 gccgaaagtg tacggggaac gaagatactg gtgacagta 39 <210> SEQ ID NO:14 <211> <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 20 <223> Primer L6 <400> 14 ctcatcagat ggcgggaaga 20 <210> SEQ ID NO:15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H1 <400> 15 cagaattcac catggagttt gggctgagct 30 <210> SEQ ID NO:16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H2 <400> 16 gacccagttc ataccatagt tagtgaaggt gtatccaga 39 <210> SEQ ID NO:17 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H3 <400> 17 gagtgggtgg catggataaa cacttataca ggtgagccaa cctacgca 48 <210> SEQ ID NO:18 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H4 <400> 18 gtctaaggaa atggtgaatc ggcccttgaa gtcgtctgcg taggttgg 48 <210> SEQ ID NO:19 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H5 <400> 19 tccctggccc cagtagtcaa atccgtcata atcatatctt gcacagta 48

【図面の簡単な説明】

【図１】抗ヒトTNFαマウス中和抗体3B10のH鎖及びL
鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸は
1文字略字で示し、Kabatらの方法（US Dept.Health and
Human Services, US Government Printing Offices, 1
991）に従い番号を付した。下線はKabatらの方法（US D
ept. Health and Human Services, US Government Prin
ting Offices, 1991）によるCDR領域を示し、四角で囲
んだ部分はChothiaらの方法（J Mol Biol 196, 901, 19
87）によるCDR領域を示す。本発明では、いずれかのCDR
領域に含まれるアミノ酸を「CDR領域」とみなした。また
参考のために、HBS-1抗体のH鎖及びL鎖可変領域のアミ
ノ酸配列を3B10の配列に対応するように併記した。

【図２】抗ヒトTNFαに対するヒト・マウスキメラ抗
体の発現ベクターの模式図である。Aは抗ヒトTNFαに対
するヒト・マウスキメラ抗体のH鎖の発現ベクターを示
し、Bは抗ヒトTNFαに対するヒト・マウスキメラ抗体の
L鎖の発現ベクターを示す。VH, H鎖の可変領域; SH,H鎖
のシグナル領域; CH1, CH2, CH3, H鎖の３つの定常領
域; VL, L鎖の可変領域; SL, L鎖のシグナル領域;CL, L
鎖の定常領域。

【図３】ヒト型化抗ヒトTNFα抗体の構築手順を示す
図である。星印と番号で示した部位は、h3B10-1フレー
ムワークの中でマウス3B10のアミノ酸残基に変換されて
いる部位を示す。L1〜L6はh3B10-1のL鎖を作製するため
に用いたPCR用のプライマーを示し、H1〜H6はh3B10-1の
H鎖を作製するために用いたPCR用のプライマーを示す。
この方法は既に報告された方法（Cancer Res 53, 851,
1993）に準ずる。

【図４】ヒト型化抗ヒトTNFα抗体のヒトTNFαとの結
合性を示すグラフである。各ヒト型化抗ヒトTNFα抗体
をコードする遺伝子を導入したCOS-1細胞の、遺伝子導
入48時間後の培養上清のヒトTNFαとの結合性を示す。
まず、FCA法によりヒトIgG Fcを持つIgGの量を定量した
後、種々のIgG濃度における各ヒト型化抗ヒトTNFα抗体
のヒトTNFαとの結合性をELISA法で調べ、その強さを45
0 nmにおける吸光度で示した。

【図５】ヒト型化抗ヒトTNFα抗体のヒトTNFαとの結
合性を示すグラフである。各ヒト型化抗ヒトTNFα抗体
をコードする遺伝子を導入したCOS-1細胞の、遺伝子導
入48時間後の培養上清のヒトTNFαとの結合性を示す。
まず、FCA法によりヒトIgG Fcを持つIgGの量を定量した
後、種々のIgG濃度（A）あるいは1.0 ng/ml（B）におけ
る各ヒト型化抗ヒトTNFα抗体のヒトTNFαとの結合性を
ELISA法で調べ、その強さを450 nmにおける吸光度で示
した。（B）ではデータを平均±標準偏差で示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 33/06 33/06 Ｃ０７Ｋ 16/24 Ｃ０７Ｋ 16/24 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｐ 21/08 ） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 CA04 CA20 DA02 EA04 FA18 GA13 GA18 GA25 4B064 AG27 CA10 CA19 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA91Y AA93Y AB01 AC14 AC15 BA05 BA16 BC01 BD50 CA25 CA44 CA46 4C085 AA14 CC05 CC23 DD62 EE01 EE05 4H045 AA11 AA20 AA30 BA41 CA40 DA76 EA20 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下のアミノ酸配列を少なくとも１つ有
するヒトＴＮＦαに対する組換え型抗体のＨ鎖ポリペプ
チドまたはその断片：ａ）CDR-H1が、CDR-H1として配列番号：１に記載のアミ
ノ酸配列、ｂ）CDR-H2が、CDR-H2として配列番号：２に記載のアミ
ノ酸配列、ｃ）CDR-H3が、CDR-H3として配列番号：３に記載のアミ
ノ酸配列。
【請求項２】配列番号：７に記載されたアミノ酸配列
あるいは該アミノ酸配列において配列番号：１ないし３
に記載されたアミノ酸配列以外の部分において１ないし
数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されたアミノ酸
配列からなるヒトＴＮＦαに対する抗体のＨ鎖可変領域
を含む、ヒトＴＮＦαに対する組換え型抗体のＨ鎖ポリ
ペプチドまたはその断片。
【請求項３】以下のアミノ酸配列を少なくとも１つ有
するヒトＴＮＦαに対する組換え型抗体のＬ鎖ポリペプ
チド：ａ）CDR-L1が、CDR-L1として配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列、ｂ）CDR-L2が、CDR-L2として配列番号：５に記載のアミ
ノ酸配列、ｃ）CDR-L3が、CDR-L3として配列番号：６に記載のアミ
ノ酸配列。
【請求項４】配列番号：８に記載されたアミノ酸配列
あるいは該アミノ酸配列において配列番号：４ないし６
に記載されたアミノ酸配列以外の部分において１ないし
数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されたアミノ酸
配列からなるヒトＴＮＦαに対する抗体のＬ鎖可変領域
を含む、ヒトＴＮＦαに対する組換え型抗体のＬ鎖ポリ
ペプチド。
【請求項５】請求項１または２に記載のＨ鎖ポリペプ
チドまたはその断片をコードする遺伝子。
【請求項６】請求項３または４に記載のＬ鎖ポリペプ
チドをコードする遺伝子。
【請求項７】請求項５および／または６に記載の遺伝
子を組み込んだ発現ベクター。
【請求項８】請求項７に記載の発現ベクターにより宿
主細胞を形質転換し、該宿主細胞をヒトＴＮＦαに対す
る抗体を発現する条件下で培養し、宿主細胞により生産
された抗体を回収することからなる、ヒトＴＮＦαに対
する組換え型抗体の製造方法。
【請求項９】請求項５および／または６に記載の遺伝
子、あるいは請求項８に記載の方法を用い、遺伝子組換
え手法によって得ることのできるヒトＴＮＦαに対する
組換え型抗体またはその断片。
【請求項１０】請求項９に記載の抗体またはその断片
と医薬的に許容し得る担体とからなる医薬組成物。