JP2001292778A

JP2001292778A - トランケート型リーリンタンパク質およびそれをコードするｄｎａ

Info

Publication number: JP2001292778A
Application number: JP2000109954A
Authority: JP
Inventors: Katsuhiko Mikoshiba; 克彦御子柴; Shusuke Tabata; 秀典田畑; Kazunori Nakajima; 一範仲嶋
Original assignee: RIKEN
Current assignee: RIKEN
Priority date: 2000-04-11
Filing date: 2000-04-11
Publication date: 2001-10-23
Also published as: EP1149844A3; EP1149844A2; US20030114657A1; CA2341786A1

Abstract

(57)【要約】【解決手段】リーリンタンパク質のF-spondinドメイ
ンおよびCR-50認識部位を含むが、リピート部位を含ま
ないトランケート型リーリンタンパク質およびそれをコ
ードするＤＮＡ。【効果】本発明のトランケート型リーリンタンパク質
およびそれをコードするＤＮＡは、神経細胞の配置異常
による滑脳症などの疾患の治療に利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リーリンタンパク
質のトランケート型アイソフォームおよびそれをコード
するＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】中枢神経系の発生過程においては、脳室
側で誕生した神経芽細胞はその発生運命に従って定めら
れた場所へ移動し、最終分化を果たす。このとき、どの
ような仕組みで神経芽細胞が自分の移動すべき場所を認
識しているのかが問題となる。この仕組みを研究する上
で非常に有用な突然変異マウスとしてリーラーが古くか
ら知られている。リーラーでは神経芽細胞が正しい場所
に移動できず、大脳、小脳、海馬等、中枢神経系のあら
ゆる場所において神経細胞の位置異常が認められる。リ
ーラーで欠損している分子を同定するため、我々はリー
ラーに対して正常マウスの胎児脳を免疫し、モノクロー
ナル抗体、CR-50を得た（Neuron 14,899-912(1995)）。
CR-50抗原は大脳ではCajal Retzius細胞に限局して発現
していた。その後、リーラーの原因遺伝子としてreelin
がクローニングされた（Nature 374,719-723(1995), Ge
nomics 26,543-549(1995), Nature Genetics 10,77-82
(1995)）。ReelinはN末端側にF-spondinとある程度の相
同性を示すF-spondinドメインをもち、ヒンジ領域を挟
んでC末端側にはReelinタンパク質の大部分を占める8個
のReelin repeatをもつ巨大な細胞外タンパク質であっ
た（Nature 374,719-723(1995)）。Reelin repeatの各
リピート内にはEGF様モチーフがあり、このことからRee
linタンパク質は細胞外基質(ECM)としての性質を持つこ
とが予想されている。CR-50抗原はReelinそのものであ
り、さらにCR-50はin vitro、in vivoの両方でReelinの
機能を阻害できることが明らかとなった（J. Neurosc
i.,17,23-31(1997), Nature 385,70-74(1997), J. Neur
osci.,17,3599-3609(1997), Proc. Natul. Acad. Sci.
USA, 94,8196-8201(1997)）。CR-50の認識部位はF-spon
dinドメインとReelin repeat Iの間にあることが確定し
ている（J. Neurosci.,17,23-31(1997)）。

【０００３】以上のような背景から、ReelinのＮ末端部
は、Reelinの機能と直結する部位であり、一方Reelin r
epeatはReelinタンパク質をECM様分子としてCajal-Retz
ius細胞などのReelin産生細胞の近傍に留め、より限局
したシグナルを付与するものと考えられた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、大脳では層
構造が観察されない両生類におけるReelin（以下、「リ
ーリン」と記す。）タンパク質の存在を確認することを
目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アフリカ
ツメガエル(Xenopus)のリーリン相同分子のクローニン
グを行い、その過程で選択的スプライシングによって産
生されるトランケート型アイソフォームの存在を明らか
にした。このアイソフォームはF-spondinドメインとCR-
50 認識部位を持つが、Reelin repeat（以下、「リピー
ト部位」と記す。）は一つも持たない分子であった。さ
らに、本発明者らは、このタイプのアイソフォームがマ
ウスにも存在することを明らかにした。これらのアイソ
フォームはリピート部位を含まないことから、ECM様分
子という性質は持たず、むしろより遠くに拡散する液性
因子としての役割を持つことが考えられる。本発明は、
上記の知見に基づいて完成された。

【０００６】本発明の要旨は以下の通りである。（１）リーリンタンパク質のF-spondinドメインおよ
びCR-50認識部位を含むが、リピート部位を含まないト
ランケート型リーリンタンパク質。（２）アフリカツメガエルまたはマウスに由来する
（１）記載のトランケート型リーリンタンパク質。（３）以下の(a)または(b)のいずれかである（２）記
載のトランケート型リーリンタンパク質。 (a)配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b)配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
列からなり、かつリーリンタンパク質の活性を有するタ
ンパク質

【０００７】（４）以下の(a)または(b)のいずれかで
ある（２）記載のトランケート型リーリンタンパク質。 (a)配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b)配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
列からなり、かつリーリンタンパク質の活性を有するタ
ンパク質

【０００８】（５）リーリンタンパク質のF-spondin
ドメインおよびCR-50認識部位を含むが、リピート部位
を含まないトランケート型リーリンタンパク質をコード
するＤＮＡ。（６）アフリカツメガエルまたはマウスに由来する
（５）記載のＤＮＡ。（７）以下の(a)または(b)のいずれかであるトランケ
ート型リーリンタンパク質をコードする（６）記載のＤ
ＮＡ。 (a)配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b)配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
列からなり、かつリーリンタンパク質の活性を有するタ
ンパク質

【０００９】（８）以下の(a)〜(c)のいずれかである
（７）記載のＤＮＡ。 (a)配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ (b)配列番号1の塩基配列の1456番〜2273番の塩基の配列
を有する核酸プローブとストリンジェントな条件下で
（例えば、5xSSPE、50%ホルムアミド存在下で42℃（但
し、20xSSPE=3 M NaCl、173 mM NaH₂PO₄、25 mM EDT
A））ハイブリダイズし、かつリーリンタンパク質の活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ (c)(a)または(b)のＤＮＡの塩基配列と縮重関係にある
塩基配列を有するＤＮＡ

【００１０】（９）以下の(a)または(b)のいずれかで
あるトランケート型リーリンタンパク質をコードする
（６）記載のＤＮＡ。 (a)配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b)配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
列からなり、かつリーリンタンパク質の活性を有するタ
ンパク質

【００１１】（１０）以下の(a)〜(c)のいずれかであ
る（９）記載のＤＮＡ。 (a)配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡ (b)配列番号３の塩基配列の2053番〜2758番の塩基の配
列を有する核酸プローブとストリンジェントな条件下で
（例えば、5xSSPE、50%ホルムアミド存在下で42℃（但
し、20xSSPE=3 M NaCl、173 mM NaH₂PO₄、25 mM EDT
A））ハイブリダイズし、かつリーリンタンパク質の活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ (c)(a)または(b)のＤＮＡの塩基配列と縮重関係にある
塩基配列を有するＤＮＡ

【００１２】本明細書において、「リーリンタンパク
質」とは、リーラー突然変異マウスの原因遺伝子で、シ
グナルペプチド、F-spondinドメイン、CR-50認識部位、
リーリンリピートを含む細胞外基質タンパク質をいう。
「F-spondinドメイン」とは、リーリンタンパク質のN末
端側において、F-spondinとの間に相同性が認められる
領域をいう。

【００１３】「CR-50認識部位」とは、マウスのリーリ
ンタンパク質において、CR-50抗体の認識する部位、ま
たは他の生物のもつリーリンタンパク質においては、マ
ウスリーリンのCR-50認識部位と相同な領域をいう。な
お、CR-50抗体は、Neuron 14,899-912(1995)に記載の方
法により作製することができる。「リピート部位」と
は、リーリンタンパク質のＣ末端側において、中心にEG
F様モチーフをもつ互いに相同性のあるアミノ酸配列の
単位が連続して繰り返される領域をいう。

【００１４】「リーリンタンパク質の活性」には、リー
リンタンパク質が有するいかなる生物学的および免疫学
的作用も含まれるが、その一例として、神経細胞を正し
い位置に配置させる機能を挙げることができる。この機
能は、Nature 385,70-74(1997), J. Neurosci.,17,3599
-3609(1997), Proc. Natul. Acad. Sci. USA, 94,8196-
8201(1997)に記載の方法により確認することができる。

【００１５】

【発明の実施の形態】リーリンは大脳においては正常な
層構造を形成する上で不可欠な分子である。両生類の大
脳では層構造は観察されないが、このような動物にもリ
ーリン分子が存在するのかどうかを明らかにするため、
アフリカツメガエルリーリンの探索を行った。

【００１６】縮重プライマーによるＰＣＲの結果、アフ
リカツメガエルリーリン(Xreelin)のＰＣＲ断片を得る
ことができた。驚いたことに、3'-RACEによる解析か
ら、XreelinにはＮ末端側に位置するF-spondinドメイン
とヒンジ領域のほとんどの部分を含むが、リピート部位
を一つも持たないスプライシング変異体が存在すること
が明らかとなった。完全型のXreelinおよびトランケー
ト型のXreelinはともに尾芽胚期(st.28)に発現が開始さ
れ、その後成体になるまで継続して発現していた。ノー
ザンブロット解析を行った結果、完全型の転写産物はマ
ウスと同じように約１２ｋｂのものであった。トランケ
ート型は、３〜４ｋｂの位置にバンドが確認された。in
situ hybridization法により、完全型の転写産物は尾
芽胚期の嗅球と視蓋の原基に検出され、オタマジャクシ
の時期(st.47)になってからは小脳における発現も確認
された。これらの結果は概ねマウスと一致するものであ
った。しかし、大脳における発現は観察されず、このこ
とはXenopusの脳に層構造が無いことと対応していた。

【００１７】本発明のトランケート型リーリンタンパク
質には、リーリンタンパク質の約８５％を占めるReelin
repeatが無い。Reelin repeatはEGF様モチーフをもつ
配列が８回くり返して現われる領域であり、他のEGF様
モチーフをもつ細胞外基質分子との結合が示唆されてい
る。このことから、Reelin repeatはリーリンタンパク
質を細胞外基質に留めるために必要な領域であり、この
リピート部位の無いトランケート型アイソフォームは生
体内でより遠くまで拡散すると考えられる。

【００１８】例えば、本発明のトランケート型リーリン
タンパク質をコードするcDNAを発現ベクターに組み込
み、これを患者の組織に由来する神経芽細胞、神経幹細
胞等に導入し、この細胞を患者の脳に移植することによ
り、神経細胞の配置異常による滑脳症、多小脳回症、異
所性灰白質等の疾患の治療を行うことができる。

【００１９】

【実施例】本発明を以下の実施例により具体的に説明す
る。これらの実施例は説明のためのものであって、本発
明の範囲を限定するものではない。〔実施例１〕アフリカツメガエル・リーリン (Xreelin)
のクローニング方法 35期(Nieuwkoop, P.D. & Faber, J. (1967) in Normal
Table of Xenopus laevis (Daudin), (North-Holland P
ublishing Company, Amsterdam).)アフリカツメガエル
全胚から精製した全RNAより、Super Script II (Gibco
BRL) を用いてランダムにプライミングしたcDNAを合成
し、これを縮重プライマーを用いたPCRにかけた。一対
の縮重プライマー（5'-A(A/G)TT(T/C)GGIAA(T/C)CA(A/
G)TT(T/C)ATGTG-3'（配列番号５）および5'-TG(T/C)TCI
CCCAT(T/C)CA(A/G)TT-3'（配列番号６））を用いて、図
１に示す塩基配列の362〜696に対応するXreelinのPCR断
片を得た。このPCR産物のより上流に位置する配列を得
るため、5'RACE (5'-rapidamplification of cDNA end)
を実施した。35期アフリカツメガエル全胚から単離した
全RNAより、Fast Track 2.0キット(Invitrogen)を用い
てPoly(A)+RNA を精製した。後の手順は、Gibco 5'RACE
システムver.2 (GC rich protocol, Gibco BRL) を用い
て実施した。第１鎖の合成は、遺伝子特異的プライマー
（5'-ATGTCCTCACTGGAAAGATC-3'（配列番号７））を用い
てプライミングした。第２鎖合成反応の精製産物にＡテ
ールを付し、AUAPプライマー(Gibco BRL) および遺伝子
特異的プライマー（5'-CAGCAACACATAGGGGACAA-3'（配列
番号８）)を用いてPCRを実施した。また、3'RACEシステ
ム(Gibco BRL) を用いて3'-RACE (3'-rqpid amplificat
ion of cDNA end)を実施した。オリゴヌクレオチド（5'
-GGCCACGCGTCGACTAGTACGAATTCATCTATAGC(T)₁₇-3'（配列
番号９）)を用いて、Super Script II によって、35期
アフリカツメガエル全胚の全RNAより第１鎖cDNAを生成
した。その配列が(T)₁₇を除いた上記のオリゴヌクレオ
チドに相補的であるアダプタープライマー、および遺伝
子特異的プライマー（5'-CAGTGTCGTTGCTTCCCACGTGAGTCA
TCTTCCCA-3'（配列番号１０））を用いてPCRを実施し
た。このPCR産物を、上記アダプタープライマーおよび
ネステド（nested）遺伝子特異的プライマー（5'-CGACA
GGTACAGGATGTGTCAACTTCATGGCCACA-3'（配列番号１１）)
を用いてさらに増幅した。この工程から単一バンドが得
られ、これをpGEM-T Easy ベクター(Promega) にクロー
ン化した。このクローンの配列決定をすることによっ
て、選択的スプライシングによって生成されたトランケ
ート型アイソフォームを同定した。cDNAライブラリーの
スクリーニングによって、完全型に特異的な配列が解明
された。Fast Track 2.0キットを用いて56期アフリカツ
メガエル・オタマジャクシより調製したPoly(A)+RNA
を、オリゴ(dT)_12-18およびランダムヘキサマーと共に
第１鎖の合成に使用した。合成したcDNAをλ ZapIIファ
ージベクター(Stratagene)に連結した。図１に示す塩基
配列のヌクレオチド414 〜1253に対応する³²P標識化プ
ローブを用いて、1x10⁶個の独立したクローンをスクリ
ーニングした。その結果２個のクローンを単離し、配列
を決定した。これらのクローンの配列決定によって、完
全型のヌクレオチド配列（1294〜1869）が明らかになっ
た。図１に示すヌクレトチド配列は少なくとも３回の独
立したPCR反応によって確認された。

【００２０】結果リーリンのアフリカツメガエルにおける対応物を得るた
め、マウスreelinの種々の領域に対する数対の縮重PCR
プライマーを設計した。これらのプライマーのうち、F-
spondinドメインとCR-50 エピトープ領域の間の境界を
囲むプライマー対は、マウス／ヒトreelinに高度に相同
な配列を有する断片を増幅した。次に、156塩基対(bp)
の5'末端非コード領域および1873 bpのコード領域が単
離されるように、5'RACEを行い、cDNAライブラリーをス
クリーニングした（図1A）。これらの配列は、３つの独
立したPCR産物を配列決定することによって確認され
た。下等脊椎動物とマウス／ヒトのReelinのアミノ酸配
列の比較（D'Arcangelo, G., Miao, G.G., Shu-Cheng,
C., Soares, H.D., Morgan, J.I. & Curran, T. (1995)
Nature 374, 719-723.; DeSilva, U., D'Arcangelo,
G., Braden, V., Chen, J., Miao, G., Curran, T. & G
reen, E.D. (1997) Genome Res. 7, 157-164.）は、進
化において保存された領域を明らかにした。Xreelin の
推定されるアミノ酸配列は、配列決定した領域の全般に
わたってマウス／ヒトreelinとの間で保存されている
が、特にF-spondinドメインにおいて保存されている。F
-spondinドメイン内の同一性および類似性は、それぞれ
93.2% および95.1% と推定される。他方、CR-50 エピト
ープ領域を含み、F-spondinドメインとReelin repeats
の間に位置するヒンジ領域においては、同一性および類
似性はそれぞれ77.2% および84.6% である（図2A、2
B）。これらの結果は、F-spondinドメインが機能的に重
要であることを強く示唆している。我々はF-spondinド
メインのすぐ下流を認識するCR-50 がin vitroおよびin
vivoの両方においてReelin機能をブロックすることを
以前に報告しているので(Ogawa, M., Miyata, T., Naka
jima, K., Yagyu, K., Seike, M., Ikenaka, K., Yamam
oto, H. & Mikoshiba, K. (1995) Neuron 14, 899-91
2.; Del Rio, J.A., Heimrich, B., Borrell, V., Fors
ter, E., Drakew, A., Alcantara, S., Nakajima, K.,
Miyata, T., Ogawa, M., Mikoshiba, K., Derer, P., F
rotscher, M. & Soriano, E. (1997) Nature 385, 70-7
4.; Miyata,T., Nakajima, K., Mikoshiba, K. & Ogaw
a, M. (1997) J. Neurosci. 17, 3599-3609.; Nakajim
a, K., Mikoshiba, K., Miyata, T., Kudo, C. & Ogaw
a, M. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8196-8
201.)、この知見は特に興味深い。

【００２１】クローン化した領域の下流の配列情報を得
るため、3'RACE法を実施した。その結果、F-spondinド
メインおよびCR-50 エピトープ領域のみを含むXreelin
のトランケート型アイソフォームが同定された（図1B、
2B)。興味深く、かつ驚くべきことに、この新規なアイ
ソフォームはReelin repeatsを全くもたない。このトラ
ンケート型アイソフォームにおいては、TGGコドンの第
２のヌクレオチドからヌクレオチド配列が完全型のヌク
レオチド配列と異なっている。TGGコドンがTAAに変わっ
ているのである。この差異は、433位のアミノ酸（トリ
プトファン）を終止コドン(TAA)に変える。その後には6
98 bpの非コード領域が続き、そしてポリアデニル化シ
グナル(AATAAA)がポリアデニル化部位の15 bp上流に現
れる。完全型およびトランケート型の間で異なっている
ヌクレオチドは、マウスreelinのエキソン#11の末端に
対応している(Royaux, I., Lambert de Rouvroit, C.,
D'Arcangelo, G., Demirov, D. & Goffinet, A.M. (199
7) Genomics 46, 240-250.)。このアイソフォームがい
かにして生じるのかはまだ完全に分析されていないが、
最も考えられるのはスプライシングがスキッピングして
イントロン#11 中に読み込まれたという説明である。両
方のアイソフォームに対するフォワードプライマーおよ
びトランケート型アイソフォームのみに特異的なリバー
ズプライマーを用いたPCR増幅を、ゲノムDNAまたはラン
ダムにプライミングされたcDNAのいずれかを鋳型として
実施した。これらのPCRは両方とも同一サイズの増幅産
物をもたらした。これはスプライシング機構のスキッピ
ングと両立する。

【００２２】〔実施例２〕ノーザンブロット分析方法 50期、56期および60期のアフリカツメガエル・オタマジ
ャクシの頭から調製した5 g のpoly(A)+RNA を各レーン
にアプライし、電気泳動を行なった後、Zeta-Probe Blo
tting Membrane (Bio-Rad)に転写した。完全型およびト
ランケート型に共通の配列ならびにトランケート型の3'
末端非コード領域（それぞれヌクレオチド414〜1253お
よび1302〜2099に対応する）を用いて、〔α-³²P] UTP
および〔α-³²P] CTP を用いたin vitro転写によって³²
P標識化RNAプローブを合成した。5xSSPE/50%ホルムアミ
ド、5xデンハート溶液および0.5% SDSを含む緩衝液中
で、60℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した。2x
SSCおよび0.1% SDSを含む緩衝液を用いて60℃でフィル
ターを30分間洗浄し、次に0.1xSSC および0.1% SDSを含
む緩衝液を用いて60℃で30分間洗浄した。

【００２３】結果この新規なアイソフォームの存在を確認するため、ノー
ザンブロット分析を実施した（図３）。両方の形態に共
通する配列に対するRNAプローブを用いて、12〜13キロ
塩基(kb)の転写産物を検出した。この結果は、アフリカ
ツメガエルには実際、マウスにおけるreelinに類似した
巨大分子として完全型のreelinが存在することを示して
いる。この転写産物の他に、2.8 kbの別な転写産物もま
た見いだされた。さらに、3'末端非コード領域をプロー
ブとして用いると、2.8 kbの短い方の転写産物のみが検
出された。トランケート型は、1299塩基のコード領域お
よび698塩基の3'末端非翻訳領域を有し、またこれまで
に5'末端非翻訳領域の156塩基がクローン化され配列決
定されている。したがって、トランケート型のmRNAは少
なくとも2153塩基のヌクレオチドからなることが予想さ
れる。ノーザンブロット分析の結果検出されたバンドの
サイズはこれよりも大きいが、この不一致は5'末端非翻
訳領域のまだ同定されていない領域のためであると思わ
れる。したがって、我々はトランケート型のmRNAは確か
に存在すると結論する。

【００２４】〔実施例３〕RT-PCRによる、Xreelin mRNA
を発現する時期の決定方法２細胞期および７、８、10/11、12.5、13、15、19、2
2、28、35/36、42および50期の全胚、ならびに成体脳か
ら全RNAを調製した。1 gの全RNAを用いて逆転写を実施
し、逆転写産物の1/40を³²P-dCTPを用いたPCRにかけ
た。PCRプライマーは完全型Xreelinとトランケート型Xr
eelinとの共通領域内で設計した（5'-TCCCACAACAAACCTA
AGTT-3'（配列番号１２）および5'-ATGTCCTCACTGGAAAGA
TC-3'（配列番号１３））。対照として、同一の鋳型を
用いてヒストンH4のPCRも実施した（5'-CGGGATAACATTCA
GGGTATCACT-3'（配列番号１４）および5'-ATCCATGGCGGT
AACTGTCTTCCT-3'（配列番号１５））。PCRのサイクル数
はXreelinについては24、ヒストンH4については19であ
った。

【００２５】結果転写レベルにおけるXreelin発現の経時変化をRT-PCRに
よって測定した（図4A）。このアッセイに用いたプライ
マー対は、完全型とトランケート型の間の共通な配列を
増幅するように設計された。各サンプルを標準化するた
め、ヒストンH4用のプライマー対を用いたPCRを実施し
た。発生の初期においてはXreelin mRNAは検出されず、
このmRNAは後期神経胚 (28期）において初めて現われ
た。オタマジャクシの段階では、そのシグナルは神経胚
におけるシグナルよりもはるかに強くなった。Xreelin
転写産物は成体の脳にも検出された。マウスの発生にお
いては、reelin mRNAはE8後にin situ ハイブリダイゼ
ーションによってE8以降検出可能となり、成体脳におい
て発現され続ける(Ikeda, Y. & Terashima, T. (1997)
Dev. Dyn. 210, 157-172.; Schiffmann, S.N., Bernie
r, B. & Goffinet, A.M. (1997) European Journal of
Neuroscience 9, 1055-1071.; Alcantara, S.,Ruiz,
M., D'Arcangelo, G., Ezan, F., de Lecea, L. & Curr
an, T. (1998) J.Neurosci. 18, 7779-7799.) 。アフリ
カツメガエルの発生における後期神経胚は神経胚形成と
CNS の形態発生の間の変換点なので、この段階は神経発
生におけるマウス胚のE8に相当する。したがって、Xree
lin発現の経時変化はマウスreelinのそれに類似してい
る。

【００２６】〔実施例４〕完全型及びトランケート型の
mRNAの定量方法完全型及びトランケート型のXreelinの転写産物の量
を、遺伝子特異的プライマーおよび5'末端にFAM (5-car
boxyfluorescein)を、そして3'末端にTAMRA（N,N,N',N'
-tetramethyl-5-carboxyrhodamine）を結合させたオリ
ゴヌクレオチドプローブ(TaqManプローブ）を用いて、A
BI PRISM 7700 (Perkin Elmer) によって評価した。種
々の段階（２細胞期、22期、28期および43期の全胚）お
よび50〜54期脳の種々の部分から全RNAを調製した（図5
C）。Super Script II (Gibco BRL)およびランダムヘキ
サマーを用いて、これらのRNAサンプルの1 gから逆転写
(RT)を実施し、逆転写産物の1/40をTaqManプローブを用
いたPCRにかけた。このPCR分析の方法はTaqMan PCR Rea
gent Kit (Perkin Elmer) のプロトコールに従った。１
つの逆転写産物について３つの独立したPCR反応を実施
することによって、各点で平均および標準偏差を求め
た。完全型Xreelinを検出するため、１対のプライマー
（5'-GTCCTGATCTACAAACACCTGCTACT-3'（配列番号１６）
および5'-AGGTAGCACATGGACAAAATCC-3'（配列番号１
７））およびTaqManプローブ（5'-(FAM)CTGAAGCAAACCAG
TCACCGTGGTCA(TAMRA)-3'（配列番号１８））を用いた。
トランケート型Xreelinについては、１対のプライマー
（5'-TAGTGAGTGTGACAATCAGAAGTGA-3'（配列番号１９）
および5'-GGCCCTTTCTGGATAAGAATC-3'（配列番号２
０））およびTaqManプローブ（5'-(FAM)TCAACCATTTGCTC
ATACAGATGCACA(TAMRA)-3'（配列番号２１））を用い
た。完全型Xreelinまたはトランケート型Xreelinに特異
的な配列を含むプラスミドDNAの連続希釈物から作製し
た標準曲線によってコピー数を推定した。

【００２７】結果次に、我々は完全型Xreelinと比較したトランケート型X
reelinの発生プロフィールを検討した。この問題と取り
組むため、完全型およびトランケート型のmRNAの量をい
くつかの時点で測定した（図4B）。蛍光染料FAMおよびT
AMRAによって5'末端および3'末端を標識したプローブを
用いるTaqMan PCR技法によってRNAの量を定量し、PCRの
間におけるプローブの分解を観察した。トランケート型
Xreelinの発現は28期のあたりで初めて観察され、後の
段階ではこのシグナルははるかに強くなった。この発現
パターンは完全型Xreelinの発現パターンに類似してお
り、また完全型Xreelinに対するトランケート型Xreelin
の量の比率は発生の全期間を通して5 〜10%に一定して
いた。これらの結果は、両形態の絶対量は互いに異なる
が、発生における両形態の発現プロフィールは全く同じ
に調節されていることを示している。

【００２８】〔実施例５〕in situハイブリダイゼーシ
ョン法によるXreelin mRNAの局在化の分析方法 SDSに基づくin situ ハイブリダイゼーションプロトコ
ール(Shain, D.H. & Zuber, M.X. (1996) J. Biochem.
Biophys. Methods 31, 185-188.)を用いた。35/36期の
全胚をMEMFA緩衝液(Harland, R.M. in Methods in Cell
Biology (1991)(Academic Press Inc., San Diego), p
p685-694.)中で90分間固定した。47期の脳をMEMFA中で
摘出し、新鮮なMEMFA中で90分間固定した。図1Aの414〜
1252に対応するヌクレオチド配列を含むプラスミドDNA
を鋳型として用いて、in vitro転写によってジゴキシゲ
ニン標識化RNAプローブを合成した。Purple AP（ベーリ
ンガー・マンハイム）を用いて、室温で数時間アルカリ
性ホスファターゼ発色反応を実施した。70% PBS に溶解
した4%パラホルムアルデヒド中で51期の脳を摘出し、新
鮮な同一固定液中で一晩固定した。OCT化合物(Tissue T
ech)に包埋した標本を厚さ20 μm の薄片とし、全胚に
ついても脳についても同じ方法でin situハイブリダイ
ゼーションに使用した。ただし、発色反応の工程では、
全胚についてはアルカリ性ホスファターゼ緩衝液に溶解
したNBT溶液を、脳については同一緩衝液に溶解したBCI
P溶液を使用した。完全型Xreelinおよびトランケート型
Xreelinに対するRNAプローブを、図1Aの1296〜1825およ
び図1Bの1302〜2099に対応する配列からそれぞれ合成し
た。XdIIおよびエオメソデルミン(eomesodermin)に対す
るRNAプローブは、51期のアフリカツメガエル・オタマ
ジャクシから調製したcDNAから各遺伝子特異的プライマ
ー（XdIIについては5'-CCTCCAAGTCTGCCTTTATG-3'（配列
番号２２）および5'-GCGGACAACAATATGCAAGG-3'（配列番
号２３）、エオメソデルミンについては5'-GCGGACAACAA
TATGCAAGG-3'（配列番号２４）および5'-GGTTGTTGACAAA
CTGGTCC-3'（配列番号２５））を用いて得たPCR断片を
含むプラスミドより調製した。

【００２９】結果 Reelin分子はマウス脳の発生におけるきちんと整列した
層構造の形成に必要とされる。アフリカツメガエルにも
リーリンの対応物が存在するが、アフリカツメガエルの
終脳は明白な層構造を全く示さない。したがって、Xree
linがマウス新皮質の相同物であるアフリカツメガエル
背側外套(dorsal pallium)で発現されるかどうかは重要
である（Northcutt, G.R. & Kaas, J.H. (1995) Trends
Neurosci 18, 373-379.; Fernandez, A.S., Pieau,
C., Reperant, J., Boncinelli, E.& Wassef, M. (199
8) Development 125, 2099-2111.）。この点を調べるた
め、終脳におけるXreelin mRNAの分布をより厳密に検討
した。XdIIはdistallessのアフリカツメガエル対応物で
あり(Asano, M., Emori, Y., Saigo, K. & Shiokawa,K.
(1992) J. Biol. Chem. 267, 5044-5047.)、線条にお
いて発現されることが知られている(Asano, M., Emori,
Y., Saigo, K. & Shiokawa, K. (1992) J. Biol. Che
m. 267, 5044-5047.)。XdII mRNAは終脳の腹側に局在し
ており（図5D）、そしてXreelin転写産物はXdII陽性領
域よりも背側（外側外套 lateral pallium）に見いださ
れる（図5C）。外側外套の背側に位置する背側外套にお
いては、終脳胞の表面に近い少数の分散した細胞でXree
linが弱く発現される。これらの細胞はマウス新皮質中
のカハル-レチウス(Cajal-Retzius)細胞に対応し、そし
て神経芽細胞の多層アライメント以外の形態形成現象に
おいて何らかの機能を有している可能性がある。

【００３０】発生中のマウス嗅球においては、reelin転
写産物は僧帽状細胞で発現される。我々はアフリカツメ
ガエル嗅球におけるXreelin発現細胞を同定した。エオ
メソデルミン(Eomd)は嗅球の僧帽状細胞で特異的に発現
されることが知られている(Ryan, K., Garrett, N., Mi
tchell, A. & Gurdon, J.B. (1996) Cell 87, 989-100
0.; Ryan, K., Butler, K., Bellefroid, E. & Gurdon,
J.B. (1998) Mech. Dev. 75, 167-170.）。Eomdに対す
るプローブを用いて、我々は僧帽状細胞が51期嗅球の水
平切断面上に"V"字型のパターンに配置されていること
（図5F）、およびXreelin転写産物が同じパターンで検
出されること（図5E）を明らかにした。その結果、我々
はXreelinは発生中の嗅球の僧帽状細胞で発現されると
結論した。

【００３１】脳のホールマウントin situハイブリダイ
ゼーションは、Xreelinが蓋で発現されることを明らか
にした（図5B）。Xreelin発現細胞の局在化を詳細に解
明するため、Xreelin特異的プローブを用いて54期の蓋
の横断面とハイブリダイズさせた。Xreelinは、蓋の最
も表層に位置する視神経線維層の下に見いだされた（図
5B）。視神経線維層を通ってきた網膜軸索は、その下に
位置する多細胞層中に入り、特定の板(lamina)サブセッ
トの所で終わる。マウスreelin mRNAの上丘における詳
細な分布はこれまで報告されていない。しかし、ホモ接
合型リーラーマウスは細胞構築それ自体は正常である
が、網膜蓋投射の異常を示す(Frost, D.O.,Edwards, M.
A., Sachs, G.M. & Caviness, V.J. (1986) Brain Res
393, 109-20.)。総合的に考えると、これらのデータ
は、Xreelinは発生中の網膜蓋投射において何らかの役
割を有することを示唆している。

【００３２】脊髄においては、Xreelinシグナルは最も
背側と最も腹側の間にある正中面に対してやや背側に位
置する、中間から中間外側部分に主として見いだされ
る。弱いシグナルは後角にも検出される（図5H）。これ
らの発現パターンはマウスの発現パターンに類似してい
る（Ikeda, Y. & Terashima, T. (1997) Dev. Dyn. 21
0, 157-172.; Schiffmann, S.N., Bernier, B. & Goffi
net, A.M. (1997) European Journal of Neuroscience
9, 1055-1071.; Alcantara, S., Ruiz, M., D'Arcangel
o, G., Ezan, F., de Lecea, L. & Curran, T. (1998)
J. Neurosci. 18,7779-7799.）。

【００３３】トランケート型Xreelinの局在化を調べる
ため、トランケート型特異的プローブを用いてin situ
ハイブリダイゼーションを実施した。我々は完全型Xree
lin（図6A）に類似したパターンの微かなシグナルを小
脳で検出することができた（図6B）。他の領域において
はin situシグナルを検出することはできなかった。そ
こで、我々はアフリカツメガエル脳の種々の領域由来の
RNAを用いて、TaqManPCR分析を実施した（図6C、6D）。
完全型のmRNAが嗅球、蓋および小脳に大量に見いださ
れ、これはin situ ハイブリダイゼーションによって明
らかとなった発現パターンに一致した。他方、トランケ
ート型Xreelinは完全型Xreelinに類似した分布を示し、
完全型Xreelinに対するトランケート型の比率はどの領
域においても約10%であった。種々の段階から得た結果
（図4B）を考慮すると、両方の形態の発現プロフィール
は何らかの共通した機構によって調節されているように
思われる。

【００３４】[実施例６] マウスにおけるトランケート
型リーリンタンパク質の存在操作手順マウスのトランケート型リーリンタンパク質は、3'-RAC
Eによって、その存在が確認された。胎生18日目のリー
ラー系統のヘテロ胎児（遺伝子型はPCRにより特定し
た）から脊髄を取り出し、ここからtotal RNAを抽出し
た。5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGAATTCATCTATAGC(T)₁₇-3'
（配列番号９）のプライマーを用いてFirststrand synt
hesisを行い、これをAdaptor primer AP2 （5'-CGCGTCG
ACTAGTACGAATT-3'（配列番号２６））とリーリン遺伝子
特異的プライマーRL-11（5'-CTGATTGGATTCAGCTGGAG-3'
（配列番号２７））でPCR、さらにこのPCR産物をAP2と
リーリン遺伝子特異的プライマーRL-12（5'-ATTCAGCCCA
CAGAGAAGTC-3'（配列番号２８））でnested PCRを行っ
た。

【００３５】結果このPCRで３本のバンドを確認し、それぞれpGEM-T Easy
ベクターに組み込み、Sequenceを行ったところ、その内
の一つが、マウスリーリンのexon14までを含むが、その
後、未知の配列が続く選択的スプライシング産物であっ
た。この選択的スプライシング産物と完全長リーリンタ
ンパク質の違いはexon14の最後のアミノ酸がセリンから
アルギニンに置換し、その次のコドンで終止コドンとな
ることで、そのため、この選択的スプライシング産物は
トランケート型であると特定された。このマウスのトラ
ンケート型リーリンの3'非翻訳領域の最後には複数のpo
ly-adenylation signal (AATAAA) が確認された。

【００３６】

【発明の効果】本発明のトランケート型リーリンタンパ
ク質およびそれをコードするＤＮＡは、神経細胞の配置
異常による滑脳症などの疾患の治療に利用できる。

【００３７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> Truncated form of Reelin protein and DNA encoding the same <130> RJH11-060N <140> <141> <160> 28 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2274 <212> DNA <213> Xenopus laevis <220> <221> CDS <222> (157)..(1455) <220> <221> sig-peptide <222> (157)..(234) <220> <221> misc-feature <222> (241)..(726) <223> F-spondin domain <220> <221> misc-feature <222> (847)..(1197) <223> CR-50 epitope region <400> 1 cattctactg tcacgttaac tttccatttt cttcacttta actttgaaga atttaaaaaa 60 aaccattaat tatatattta tataaatata tatatataan ctctgtatcc caggctgctt 120 atgaagaaag ctcattaaga acagtgggac ccagga atg gaa ctg ctc cac acc 174 Met Glu Leu Leu His Thr 1 5 ttc tgc ggt ggg cgc tgg act ttg ctg ctc ttc acg ggg atc ttg tgc 222 Phe Cys Gly Gly Arg Trp Thr Leu Leu Leu Phe Thr Gly Ile Leu Cys 10 15 20 ttt gtt gtt gcc cgc gga gtg ggg tat tat ccc agg ttc tct cca ttc 270 Phe Val Val Ala Arg Gly Val Gly Tyr Tyr Pro Arg Phe Ser Pro Phe 25 30 35 ttt ttc ctt tgc act cat cat gga gaa ctg gaa gga gat ggg gaa caa 318 Phe Phe Leu Cys Thr His His Gly Glu Leu Glu Gly Asp Gly Glu Gln 40 45 50 gga gaa gtg ctc atc tct ctg cac ctg gcg ggc aac ccc agc tac tac 366 Gly Glu Val Leu Ile Ser Leu His Leu Ala Gly Asn Pro Ser Tyr Tyr 55 60 65 70 ata cct ggg cag gag tac cat gtg acc ata tcc act agt acc ttc ttt 414 Ile Pro Gly Gln Glu Tyr His Val Thr Ile Ser Thr Ser Thr Phe Phe 75 80 85 gat ggt ctt ctg gtg act gga ctt tac act tct acc agt gtt caa gcg 462 Asp Gly Leu Leu Val Thr Gly Leu Tyr Thr Ser Thr Ser Val Gln Ala 90 95 100 tct cag agc att gga ggc tct aaa gca ttt gga ttt ggt att atg agc 510 Ser Gln Ser Ile Gly Gly Ser Lys Ala Phe Gly Phe Gly Ile Met Ser 105 110 115 gac cgt cag ttt ggt acc cag ttt atg tgc agt gtc gtt gct tcc cac 558 Asp Arg Gln Phe Gly Thr Gln Phe Met Cys Ser Val Val Ala Ser His 120 125 130 gtg agt cat ctt ccc aca aca aac cta agt ttt gta tgg att gca cca 606 Val Ser His Leu Pro Thr Thr Asn Leu Ser Phe Val Trp Ile Ala Pro 135 140 145 150 cca gca ggt aca gga tgt gtc aac ttc atg gcc aca gca aca cat agg 654 Pro Ala Gly Thr Gly Cys Val Asn Phe Met Ala Thr Ala Thr His Arg 155 160 165 gga caa gtt att ttc aag gat gcc ctg gca caa caa ctg tgc gaa caa 702 Gly Gln Val Ile Phe Lys Asp Ala Leu Ala Gln Gln Leu Cys Glu Gln 170 175 180 gga gct cct act gaa gct ccc ttg cgg cct aat tta gcc gaa att cac 750 Gly Ala Pro Thr Glu Ala Pro Leu Arg Pro Asn Leu Ala Glu Ile His 185 190 195 agt gaa agc atc ctt tta cga gat gat ttt gac tca tat aag ctt cag 798 Ser Glu Ser Ile Leu Leu Arg Asp Asp Phe Asp Ser Tyr Lys Leu Gln 200 205 210 gaa ttg aat cca aat att tgg ctc cag tgc aga aat tgc gaa gtt ggt 846 Glu Leu Asn Pro Asn Ile Trp Leu Gln Cys Arg Asn Cys Glu Val Gly 215 220 225 230 gag cag tgt ggt gca att atg cat ggt ggg gca gtc act ttt tgt gat 894 Glu Gln Cys Gly Ala Ile Met His Gly Gly Ala Val Thr Phe Cys Asp 235 240 245 ccg tat gga cca aga gaa ttg ata act gtt caa atg aac aca act acg 942 Pro Tyr Gly Pro Arg Glu Leu Ile Thr Val Gln Met Asn Thr Thr Thr 250 255 260 gca tct gtt ttg cag ttt tct att ggg tca gga tcg tgc agg ttc agc 990 Ala Ser Val Leu Gln Phe Ser Ile Gly Ser Gly Ser Cys Arg Phe Ser 265 270 275 tat tca gac cct gga att gtg gtg tca tac aca aag aat aat tca tct 1038 Tyr Ser Asp Pro Gly Ile Val Val Ser Tyr Thr Lys Asn Asn Ser Ser 280 285 290 agt tgg atg cca ttg gag aga att agt gct cct tcc aat gtt agc acc 1086 Ser Trp Met Pro Leu Glu Arg Ile Ser Ala Pro Ser Asn Val Ser Thr 295 300 305 310 atc att cac att att tac cta cct cct gaa gct aaa gga gaa aat gtg 1134 Ile Ile His Ile Ile Tyr Leu Pro Pro Glu Ala Lys Gly Glu Asn Val 315 320 325 aaa ttc cgt tgg agg cag gag aac atg cag gca ggt gat gtg tat gaa 1182 Lys Phe Arg Trp Arg Gln Glu Asn Met Gln Ala Gly Asp Val Tyr Glu 330 335 340 gcc tgc tgg gca ctg gat aac att ttg att atc aat gct gct cat aaa 1230 Ala Cys Trp Ala Leu Asp Asn Ile Leu Ile Ile Asn Ala Ala His Lys 345 350 355 gaa gtc gtg tta gaa gac aat cta gat cca atg gac aca gga aac tgg 1278 Glu Val Val Leu Glu Asp Asn Leu Asp Pro Met Asp Thr Gly Asn Trp 360 365 370 ctt ttt ttc cct ggg gct act gta aag cat acc tgt cag tcg gat gga 1326 Leu Phe Phe Pro Gly Ala Thr Val Lys His Thr Cys Gln Ser Asp Gly 375 380 385 390 aac tct ata tat ttt cat ggt aca gaa agc agt gaa tac aac ttt gct 1374 Asn Ser Ile Tyr Phe His Gly Thr Glu Ser Ser Glu Tyr Asn Phe Ala 395 400 405 act acc aga gat gtg gat ctt tcc agt gag gac atc cag gac cag tgg 1422 Thr Thr Arg Asp Val Asp Leu Ser Ser Glu Asp Ile Gln Asp Gln Trp 410 415 420 tct gaa gag ttt gag aat cta cca gct ggg taa attttagatg tagccatgag 1475 Ser Glu Glu Phe Glu Asn Leu Pro Ala Gly 425 430 cattacattt tatcacgtga aaatgcaaga aacagtattt atatacatat tttaaaggtc 1535 aatacagaac cctataaatg gcaggttagg gctaccatgt aaatattttt aatgttcata 1595 atgtcatagg tggtaagtat tttacatagc agttactgat tgattattat tgtttgtctt 1655 ttacccagtt acagctaaca cacagggcat ttttttccaa tggcaacatc cattttgccg 1715 ctctgagcag aacatttgtt tcatttatgg catttgaacc tgtgtctatg agagtgcagc 1775 taaaataaac ttcctggcta tgggtgttac catacaacac tggtacctca tgacatatga 1835 aaaatatgac tcacattaaa tcagtaagat cagttcaagt atagtacggt gcattaatct 1895 gccaataaac atttagaatt gtattttata ttttatattt aagattagaa ttgactccat 1955 tcttgtacct tgcatcacat ttgtggctag tttatgggtc aatagacagc catcatacat 2015 tagtcagagt aaatcgagca ttacaaaact caatgagcca tagtgagtgt gacaatcaga 2075 agtgactgtc aagtaaatca accatttgct catacagatg cacatttgaa cagtggattc 2135 ttatccagaa agggccattt tttactatca ctctgggatt taaatgccac ttctaattgg 2195 aacttccagg tcacaaaaat agaatggaca tttaaacatc atggttctca ttacccctaa 2255 taaaactccg gttttttta 2274 <210> 2 <211> 432 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 2 Met Glu Leu Leu His Thr Phe Cys Gly Gly Arg Trp Thr Leu Leu Leu 1 5 10 15 Phe Thr Gly Ile Leu Cys Phe Val Val Ala Arg Gly Val Gly Tyr Tyr 20 25 30 Pro Arg Phe Ser Pro Phe Phe Phe Leu Cys Thr His His Gly Glu Leu 35 40 45 Glu Gly Asp Gly Glu Gln Gly Glu Val Leu Ile Ser Leu His Leu Ala 50 55 60 Gly Asn Pro Ser Tyr Tyr Ile Pro Gly Gln Glu Tyr His Val Thr Ile 65 70 75 80 Ser Thr Ser Thr Phe Phe Asp Gly Leu Leu Val Thr Gly Leu Tyr Thr 85 90 95 Ser Thr Ser Val Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Gly Ser Lys Ala Phe 100 105 110 Gly Phe Gly Ile Met Ser Asp Arg Gln Phe Gly Thr Gln Phe Met Cys 115 120 125 Ser Val Val Ala Ser His Val Ser His Leu Pro Thr Thr Asn Leu Ser 130 135 140 Phe Val Trp Ile Ala Pro Pro Ala Gly Thr Gly Cys Val Asn Phe Met 145 150 155 160 Ala Thr Ala Thr His Arg Gly Gln Val Ile Phe Lys Asp Ala Leu Ala 165 170 175 Gln Gln Leu Cys Glu Gln Gly Ala Pro Thr Glu Ala Pro Leu Arg Pro 180 185 190 Asn Leu Ala Glu Ile His Ser Glu Ser Ile Leu Leu Arg Asp Asp Phe 195 200 205 Asp Ser Tyr Lys Leu Gln Glu Leu Asn Pro Asn Ile Trp Leu Gln Cys 210 215 220 Arg Asn Cys Glu Val Gly Glu Gln Cys Gly Ala Ile Met His Gly Gly 225 230 235 240 Ala Val Thr Phe Cys Asp Pro Tyr Gly Pro Arg Glu Leu Ile Thr Val 245 250 255 Gln Met Asn Thr Thr Thr Ala Ser Val Leu Gln Phe Ser Ile Gly Ser 260 265 270 Gly Ser Cys Arg Phe Ser Tyr Ser Asp Pro Gly Ile Val Val Ser Tyr 275 280 285 Thr Lys Asn Asn Ser Ser Ser Trp Met Pro Leu Glu Arg Ile Ser Ala 290 295 300 Pro Ser Asn Val Ser Thr Ile Ile His Ile Ile Tyr Leu Pro Pro Glu 305 310 315 320 Ala Lys Gly Glu Asn Val Lys Phe Arg Trp Arg Gln Glu Asn Met Gln 325 330 335 Ala Gly Asp Val Tyr Glu Ala Cys Trp Ala Leu Asp Asn Ile Leu Ile 340 345 350 Ile Asn Ala Ala His Lys Glu Val Val Leu Glu Asp Asn Leu Asp Pro 355 360 365 Met Asp Thr Gly Asn Trp Leu Phe Phe Pro Gly Ala Thr Val Lys His 370 375 380 Thr Cys Gln Ser Asp Gly Asn Ser Ile Tyr Phe His Gly Thr Glu Ser 385 390 395 400 Ser Glu Tyr Asn Phe Ala Thr Thr Arg Asp Val Asp Leu Ser Ser Glu 405 410 415 Asp Ile Gln Asp Gln Trp Ser Glu Glu Phe Glu Asn Leu Pro Ala Gly 420 425 430 <210> 3 <211> 2745 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (283)..(2052) <220> <221> sig-peptide <222> (283)..(363) <220> <221> misc-feature <222> (284)..(849) <223> F-spondin domain <220> <221> misc-feature <222> (970)..(1320) <223> CR-50 epitope region <400> 3 ggggcgtcgc gtgcacaccg gcggcggcgg cgctcggagg cggacgacgc gctctcggcg 60 cccgcggccc cggttccccc cgcgctctcg ctccggcggc ccaaagtaac ttcgggagcc 120 tcggtctccc gctaacttcc ccccgcgggc tcggttgccc ggacccgctc ggctcgagcc 180 cgccgccggc tcgccttccc cgcacgcggc tcctccgtgc cggtgcctcc gaaagtggat 240 gagagagcgc gcggggcgcg cggcggcacg gagcgcggcg gc atg gag cgc ggc 294 Met Glu Arg Gly 1 tgc tgg gcg ccg cgg gct ctc gtc ctg gcc gtg ctg ctg ctg ctg gcg 342 Cys Trp Ala Pro Arg Ala Leu Val Leu Ala Val Leu Leu Leu Leu Ala 5 10 15 20 acg ctg agg gcg cgc gcg gcc acc ggc tac tac ccg cgc ttc tcg cct 390 Thr Leu Arg Ala Arg Ala Ala Thr Gly Tyr Tyr Pro Arg Phe Ser Pro 25 30 35 ttc ttt ttc ctg tgc acc cac cac ggg gag ctg gaa ggg gat ggg gag 438 Phe Phe Phe Leu Cys Thr His His Gly Glu Leu Glu Gly Asp Gly Glu 40 45 50 cag ggc gag gtg ctc att tcc ctg cac att gcg ggc aac ccc acc tac 486 Gln Gly Glu Val Leu Ile Ser Leu His Ile Ala Gly Asn Pro Thr Tyr 55 60 65 tac gta ccg gga cag gaa tac cat gtt aca att tca aca agc acc ttc 534 Tyr Val Pro Gly Gln Glu Tyr His Val Thr Ile Ser Thr Ser Thr Phe 70 75 80 ttt gat ggc ttg ctg gtg acg gga ctc tat acc tcg aca agc atc cag 582 Phe Asp Gly Leu Leu Val Thr Gly Leu Tyr Thr Ser Thr Ser Ile Gln 85 90 95 100 tct tct cag agc att gga ggc tcc agc gcc ttt gga ttc ggg atc atg 630 Ser Ser Gln Ser Ile Gly Gly Ser Ser Ala Phe Gly Phe Gly Ile Met 105 110 115 tcc gac cac cag ttt ggt aac cag ttt atg tgc agt gtg gtg gcc tct 678 Ser Asp His Gln Phe Gly Asn Gln Phe Met Cys Ser Val Val Ala Ser 120 125 130 cat gtg agt cac ctg cct aca acc aac ctc agc ttt gtc tgg att gcc 726 His Val Ser His Leu Pro Thr Thr Asn Leu Ser Phe Val Trp Ile Ala 135 140 145 cca cca gct ggc aca ggc tgt gtg aat ttc atg gct act gca aca cat 774 Pro Pro Ala Gly Thr Gly Cys Val Asn Phe Met Ala Thr Ala Thr His 150 155 160 agg ggc cag gtg att ttc aaa gac gca ctg gcc cag cag ctg tgt gaa 822 Arg Gly Gln Val Ile Phe Lys Asp Ala Leu Ala Gln Gln Leu Cys Glu 165 170 175 180 caa gga gct ccc aca gag gcc act gct tac tcg cac ctt gct gaa ata 870 Gln Gly Ala Pro Thr Glu Ala Thr Ala Tyr Ser His Leu Ala Glu Ile 185 190 195 cac agt gac agt gtg atc cta cga gat gac ttt gac tcc tac cag caa 918 His Ser Asp Ser Val Ile Leu Arg Asp Asp Phe Asp Ser Tyr Gln Gln 200 205 210 ctg gaa ttg aac ccc aac ata tgg gtt gaa tgc agc aac tgt gag atg 966 Leu Glu Leu Asn Pro Asn Ile Trp Val Glu Cys Ser Asn Cys Glu Met 215 220 225 gga gag cag tgt ggc acc atc atg cat ggc aat gct gtc acc ttc tgt 1014 Gly Glu Gln Cys Gly Thr Ile Met His Gly Asn Ala Val Thr Phe Cys 230 235 240 gag ccg tac ggc cct cga gag ctg acc acc aca tgc ctg aac aca aca 1062 Glu Pro Tyr Gly Pro Arg Glu Leu Thr Thr Thr Cys Leu Asn Thr Thr 245 250 255 260 aca gca tct gtc ctc cag ttt tcc att ggg tca gga tca tgt cga ttt 1110 Thr Ala Ser Val Leu Gln Phe Ser Ile Gly Ser Gly Ser Cys Arg Phe 265 270 275 agt tac tct gac ccc agc atc act gtg tca tac gcc aag aac aat acc 1158 Ser Tyr Ser Asp Pro Ser Ile Thr Val Ser Tyr Ala Lys Asn Asn Thr 280 285 290 gct gat tgg att cag ctg gag aaa att aga gcc cct tcc aat gtg agc 1206 Ala Asp Trp Ile Gln Leu Glu Lys Ile Arg Ala Pro Ser Asn Val Ser 295 300 305 aca gtc atc cac atc ctg tac ctc ccc gag gaa gcc aaa ggg gag agc 1254 Thr Val Ile His Ile Leu Tyr Leu Pro Glu Glu Ala Lys Gly Glu Ser 310 315 320 gtg cag ttc cag tgg aaa cag gac agc ctg cga gtg ggt gag gtg tat 1302 Val Gln Phe Gln Trp Lys Gln Asp Ser Leu Arg Val Gly Glu Val Tyr 325 330 335 340 gag gcc tgc tgg gcc ctg gat aac atc ctg gtc atc aat tca gcc cac 1350 Glu Ala Cys Trp Ala Leu Asp Asn Ile Leu Val Ile Asn Ser Ala His 345 350 355 aga gaa gtc gtt ctg gag gac aac ctc gac ccg gtc gac acg ggc aac 1398 Arg Glu Val Val Leu Glu Asp Asn Leu Asp Pro Val Asp Thr Gly Asn 360 365 370 tgg ctc ttc ttc cct gga gca acg gtc aag cat agc tgt cag tca gat 1446 Trp Leu Phe Phe Pro Gly Ala Thr Val Lys His Ser Cys Gln Ser Asp 375 380 385 ggg aac tcc att tat ttc cat gga aat gaa ggc agc gag ttc aat ttt 1494 Gly Asn Ser Ile Tyr Phe His Gly Asn Glu Gly Ser Glu Phe Asn Phe 390 395 400 gcc acc acc cgg gat gta gat ctt tct aca gag gat att caa gag cag 1542 Ala Thr Thr Arg Asp Val Asp Leu Ser Thr Glu Asp Ile Gln Glu Gln 405 410 415 420 tgg tca gaa gaa ttt gag agc cag ccc aca gga tgg gat atc ttg gga 1590 Trp Ser Glu Glu Phe Glu Ser Gln Pro Thr Gly Trp Asp Ile Leu Gly 425 430 435 gca gta gtt ggt gca gac tgt gga acc gta gaa tca gga cta tca ctg 1638 Ala Val Val Gly Ala Asp Cys Gly Thr Val Glu Ser Gly Leu Ser Leu 440 445 450 gtg ttc ctc aaa gat gga gag agg aag ctt tgc acc ccc tac atg gat 1686 Val Phe Leu Lys Asp Gly Glu Arg Lys Leu Cys Thr Pro Tyr Met Asp 455 460 465 aca act ggt tat ggc aac ctg agg ttc tac ttc gtt atg gga gga atc 1734 Thr Thr Gly Tyr Gly Asn Leu Arg Phe Tyr Phe Val Met Gly Gly Ile 470 475 480 tgt gac cct gga gtc tct cat gaa aac gat atc atc tta tat gca aag 1782 Cys Asp Pro Gly Val Ser His Glu Asn Asp Ile Ile Leu Tyr Ala Lys 485 490 495 500 att gaa gga aga aaa gaa cac att gca ctg gac act ctt acc tat tct 1830 Ile Glu Gly Arg Lys Glu His Ile Ala Leu Asp Thr Leu Thr Tyr Ser 505 510 515 tcc tat aag gtt ccg tct ttg gtt tct gtg gtc atc aac cct gaa ctt 1878 Ser Tyr Lys Val Pro Ser Leu Val Ser Val Val Ile Asn Pro Glu Leu 520 525 530 cag aca cct gcc acc aaa ttt tgt ctc agg caa aag agc cac caa ggg 1926 Gln Thr Pro Ala Thr Lys Phe Cys Leu Arg Gln Lys Ser His Gln Gly 535 540 545 tat aat cgg aat gtc tgg gct gtg gac ttc ttc cat gtg ctg ccc gtt 1974 Tyr Asn Arg Asn Val Trp Ala Val Asp Phe Phe His Val Leu Pro Val 550 555 560 ctc cct tca aca atg tct cac atg atc cag ttt tct att aat ttg gga 2022 Leu Pro Ser Thr Met Ser His Met Ile Gln Phe Ser Ile Asn Leu Gly 565 570 575 580 tgc ggc aca cac cag cct ggg aac agg tga gaagcatgcc gagtgtccta 2072 Cys Gly Thr His Gln Pro Gly Asn Arg 585 590 acatggtagg aaataaacac atgcactgga ccattgaagt aagtttgtca gtaggatttt 2132 tggatgggat tttaacaaaa tatccattaa gaaaatacag attcctactc cctccctaaa 2192 agagttcttt ggttaataaa tagaagggat gtgactgggt agatttttag gttagaatag 2252 tttcattcag ggagcttgat acaagttatc agaggtgttc accatgctgt gtggcagcat 2312 cccccgttct aacagattgc tgggtgaaga tgactgaaga caagattggc ttctgttggc 2372 tggtgacccc ttataatagg tatggaagtc aattagcact tcaagggcta tgacttctct 2432 gctcctcttg cataagtgtt gctcccatcc tctgtaaaga actttgctga cctcacattc 2492 acaggatgaa gtgacagtgt gagacatggt aattgcctag ctatctatca aattcaagag 2552 cacaaaccca gtttactgtg tattgtcctt cagacgtagc ttttatggca gtaatccaat 2612 ggcttgccct ctgaaggctg gtcaggcttc agtgagagat gacacattta gtaaaggtct 2672 tagagaaatc ccacattcat cgactcattc aaggtattta gctagaaata aaaagaatca 2732 aaaaaataaa tta 2745 <210> 4 <211> 589 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Glu Arg Gly Cys Trp Ala Pro Arg Ala Leu Val Leu Ala Val Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Thr Leu Arg Ala Arg Ala Ala Thr Gly Tyr Tyr Pro 20 25 30 Arg Phe Ser Pro Phe Phe Phe Leu Cys Thr His His Gly Glu Leu Glu 35 40 45 Gly Asp Gly Glu Gln Gly Glu Val Leu Ile Ser Leu His Ile Ala Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Tyr Tyr Val Pro Gly Gln Glu Tyr His Val Thr Ile Ser 65 70 75 80 Thr Ser Thr Phe Phe Asp Gly Leu Leu Val Thr Gly Leu Tyr Thr Ser 85 90 95 Thr Ser Ile Gln Ser Ser Gln Ser Ile Gly Gly Ser Ser Ala Phe Gly 100 105 110 Phe Gly Ile Met Ser Asp His Gln Phe Gly Asn Gln Phe Met Cys Ser 115 120 125 Val Val Ala Ser His Val Ser His Leu Pro Thr Thr Asn Leu Ser Phe 130 135 140 Val Trp Ile Ala Pro Pro Ala Gly Thr Gly Cys Val Asn Phe Met Ala 145 150 155 160 Thr Ala Thr His Arg Gly Gln Val Ile Phe Lys Asp Ala Leu Ala Gln 165 170 175 Gln Leu Cys Glu Gln Gly Ala Pro Thr Glu Ala Thr Ala Tyr Ser His 180 185 190 Leu Ala Glu Ile His Ser Asp Ser Val Ile Leu Arg Asp Asp Phe Asp 195 200 205 Ser Tyr Gln Gln Leu Glu Leu Asn Pro Asn Ile Trp Val Glu Cys Ser 210 215 220 Asn Cys Glu Met Gly Glu Gln Cys Gly Thr Ile Met His Gly Asn Ala 225 230 235 240 Val Thr Phe Cys Glu Pro Tyr Gly Pro Arg Glu Leu Thr Thr Thr Cys 245 250 255 Leu Asn Thr Thr Thr Ala Ser Val Leu Gln Phe Ser Ile Gly Ser Gly 260 265 270 Ser Cys Arg Phe Ser Tyr Ser Asp Pro Ser Ile Thr Val Ser Tyr Ala 275 280 285 Lys Asn Asn Thr Ala Asp Trp Ile Gln Leu Glu Lys Ile Arg Ala Pro 290 295 300 Ser Asn Val Ser Thr Val Ile His Ile Leu Tyr Leu Pro Glu Glu Ala 305 310 315 320 Lys Gly Glu Ser Val Gln Phe Gln Trp Lys Gln Asp Ser Leu Arg Val 325 330 335 Gly Glu Val Tyr Glu Ala Cys Trp Ala Leu Asp Asn Ile Leu Val Ile 340 345 350 Asn Ser Ala His Arg Glu Val Val Leu Glu Asp Asn Leu Asp Pro Val 355 360 365 Asp Thr Gly Asn Trp Leu Phe Phe Pro Gly Ala Thr Val Lys His Ser 370 375 380 Cys Gln Ser Asp Gly Asn Ser Ile Tyr Phe His Gly Asn Glu Gly Ser 385 390 395 400 Glu Phe Asn Phe Ala Thr Thr Arg Asp Val Asp Leu Ser Thr Glu Asp 405 410 415 Ile Gln Glu Gln Trp Ser Glu Glu Phe Glu Ser Gln Pro Thr Gly Trp 420 425 430 Asp Ile Leu Gly Ala Val Val Gly Ala Asp Cys Gly Thr Val Glu Ser 435 440 445 Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Lys Asp Gly Glu Arg Lys Leu Cys Thr 450 455 460 Pro Tyr Met Asp Thr Thr Gly Tyr Gly Asn Leu Arg Phe Tyr Phe Val 465 470 475 480 Met Gly Gly Ile Cys Asp Pro Gly Val Ser His Glu Asn Asp Ile Ile 485 490 495 Leu Tyr Ala Lys Ile Glu Gly Arg Lys Glu His Ile Ala Leu Asp Thr 500 505 510 Leu Thr Tyr Ser Ser Tyr Lys Val Pro Ser Leu Val Ser Val Val Ile 515 520 525 Asn Pro Glu Leu Gln Thr Pro Ala Thr Lys Phe Cys Leu Arg Gln Lys 530 535 540 Ser His Gln Gly Tyr Asn Arg Asn Val Trp Ala Val Asp Phe Phe His 545 550 555 560 Val Leu Pro Val Leu Pro Ser Thr Met Ser His Met Ile Gln Phe Ser 565 570 575 Ile Asn Leu Gly Cys Gly Thr His Gln Pro Gly Asn Arg 580 585 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <220> <221> modified-base <222> (8) <223> i <400> 5 arttyggnaa ycarttyatg tg 22 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 6 tgytccccat ycartt 16 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 7 atgtcctcac tggaaagatc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 8 cagcaacaca taggggacaa 20 <210> 9 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 9 ggccacgcgt cgactagtac gaattcatct atagcttttt tttttttttt t 51 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 10 cagtgtcgtt gcttcccacg tgagtcatct tccca 35 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 11 cgacaggtac aggatgtgtc aacttcatgg ccaca 35 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 12 tcccacaaca aacctaagtt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 13 atgtcctcac tggaaagatc 20 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 14 cgggataaca ttcagggtat cact 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 15 atccatggcg gtaactgtct tcct 24 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 16 gtcctgatct acaaacacct gctact 26 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 17 aggtagcaca tggacaaaat cc 22 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 18 ctgaagcaaa ccagtcaccg tggtca 26 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 19 tagtgagtgt gacaatcaga agtga 25 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 20 ggccctttct ggataagaat c 21 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 21 tcaaccattt gctcatacag atgcaca 27 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 22 cctccaagtc tgcctttatg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 23 gcggacaaca atatgcaagg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 24 gcggacaaca atatgcaagg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 25 ggttgttgac aaactggtcc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 26 cgcgtcgact agtacgaatt 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 27 ctgattggat tcagctggag 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 28 attcagccca cagagaagtc 20

【００３８】

【配列表フリーテキスト】配列番号５〜１７、１９、２
０、および２２〜２８は、プライマーの塩基配列を示
す。配列番号１８および２１は、プローブの塩基配列を
示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】アフリカツメガエルリーリンタンパク質（Xree
lin）の完全型のタンパク質（Ａ）およびトランケート
型アイソフォーム（Ｂ）のヌクレオチド配列およびアフ
リカツメガエルリーリンタンパク質の推定アミノ酸配列
を示す。＊は停止コドンを表す。矢じり（▼）で示した
領域内のアミノ酸は、完全型のリーリンタンパク質には
含まれるが、トランケート型アイソフォームには含まれ
ない。ポリアデニル化部位から１５ヌクレオチド上流の
ポリアデニル化シグナルに下線を引いた。

【図２】Ａは、アフリカツメガエル(Xenopus)、マウス
(mouse)およびヒト(human)リーリンタンパク質の推定ア
ミノ酸のマルチプルアラインメントを示す。Signalase
ソフトで予想された推定シグナルペプチドに破線を引い
た。F-spondinドメインには太線を引いた。３種すべて
の間でアミノ酸残基が共通な領域は枠で囲った。挿入し
たギャップは−で示した。Xreelinと同一のアミノ酸残
基は・で示した。Ｂは、マウスリーリンタンパク質、Xr
eelinおよびトランケート型Xreelinの模式図を示す。定
義されていない領域は破線で示す。枠で囲った領域はコ
ード領域で、線は非コード領域である。

【図３】Ａは、Xreelinのノーザンブロット解析の結果
を示す。太い矢印（←）は完全型のリーリンタンパク質
を示し、矢じりはトランケート型のリーリンタンパク質を示す。Ｂは、
Xreelinのウェスタンブロット解析の結果を示す。太い
矢印（←）は、リーリンタンパク質抗体142で検出され
た、マウスリーリンタンパク質と同じサイズのXreelin
タンパク質を示す。細い矢印（←）は、メタロプロテイ
ナーゼでプロセシングされた、マウスリーリンタンパク
質フラグメントよりわずかに小さいサイズのXreelinタ
ンパク質フラグメントを示す。矢じりはトランケート型のリーリンタンパク質と予想されるサ
イズのタンパク質を示す。

【図４】種々の発生段階のRNAサンプルを用いて、RT-PC
Rを行った結果を示す。各レーンのサンプルの発生段階
の番号をパネルの一番上に示す。

【図５】完全型Xreelin mRNAの分布をin situ ハイブリ
ダイゼーションで調べた結果を示す（図５Ａ、Ｂ、Ｃ、
Ｄ、Ｅ、Ｆ）。終脳における線条の領域および嗅球にお
ける僧帽状細胞を明確にするため、XdII (D)およびエオ
メソデルミン(F)に対するアンチセンスプローブもまた
使用した。実験に用いたサンプルは、(A) 35/36期の全
胚；(B) 47期の全脳；(E、F) 51期の嗅球の水平切断切
片；ならびに (C、D)終脳、(G) 蓋および(H) 脊髄のレ
ベルで切断した54期の冠状切片であった。a:アンチセン
スプローブ、cp: 小脳原基、ob: 嗅球、s:センスプロー
ブ、tec:蓋。縮尺線: A, B 500μm; C, D, G, H 100μ
m; E, F 200μm。

【図６】完全型Xreelin mRNAとトランケート型Xreelin
mRNAの発現パターンをin istuハイブリダイゼーション
(A〜C)およびTaqMan PCR分析(D)によって比較した結果
を示す。51期小脳の水平切断切片中に、完全型Xreelin
mRNA (A)およびトランケート型Xreelin mRNA (B)が検出
された。近隣の切片を完全型Xreelinのセンスプローブ
とハイブリダイズさせた(C)。縮尺線: 100 μm。アフリ
カツメガエル脳(E)の７つの部分由来の全RNAをTaqMan P
CR分析にかけた。白抜きの棒および黒く塗った棒は、完
全型Xreelin mRNAおよびトランケート型Xreelin mRNAの
コピー数をそれぞれ示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者仲嶋一範東京都板橋区前野町６−24−２−205 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 EA03 HA14 HA17 4H045 AA10 CA40 CA53 EA21 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】リーリンタンパク質のF-spondinドメイ
ンおよびCR-50認識部位を含むが、リピート部位を含ま
ないトランケート型リーリンタンパク質。
【請求項２】アフリカツメガエルまたはマウスに由来
する請求項１記載のトランケート型リーリンタンパク
質。
【請求項３】以下の(a)または(b)のいずれかである請
求項２記載のトランケート型リーリンタンパク質。 (a)配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b)配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
列からなり、かつリーリンタンパク質の活性を有するタ
ンパク質
【請求項４】以下の(a)または(b)のいずれかである請
求項２記載のトランケート型リーリンタンパク質。 (a)配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b)配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
列からなり、かつリーリンタンパク質の活性を有するタ
ンパク質
【請求項５】リーリンタンパク質のF-spondinドメイ
ンおよびCR-50認識部位を含むが、リピート部位を含ま
ないトランケート型リーリンタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。
【請求項６】アフリカツメガエルまたはマウスに由来
する請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項７】以下の(a)または(b)のいずれかであるト
ランケート型リーリンタンパク質をコードする請求項６
記載のＤＮＡ。 (a)配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b)配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
列からなり、かつリーリンタンパク質の活性を有するタ
ンパク質
【請求項８】以下の(a)〜(c)のいずれかである請求項
７記載のＤＮＡ。 (a)配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ (b)配列番号１の塩基配列の1456番〜2273番の塩基の配
列を有する核酸プローブとストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズし、かつリーリンタンパク質の活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡ (c)(a)または(b)のＤＮＡの塩基配列と縮重関係にある
塩基配列を有するＤＮＡ
【請求項９】以下の(a)または(b)のいずれかであるト
ランケート型リーリンタンパク質をコードする請求項６
記載のＤＮＡ。 (a)配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b)配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
列からなり、かつリーリンタンパク質の活性を有するタ
ンパク質
【請求項１０】以下の(a)〜(c)のいずれかである請求
項９記載のＤＮＡ。 (a)配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡ (b)配列番号３の塩基配列の2053番〜2758番の塩基の配
列を有する核酸プローブとストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズし、かつリーリンタンパク質の活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡ (c)(a)または(b)のＤＮＡの塩基配列と縮重関係にある
塩基配列を有するＤＮＡ