JP2001288197A - 蛍光ヌクレオチド - Google Patents
蛍光ヌクレオチドInfo
- Publication number
- JP2001288197A JP2001288197A JP2000107675A JP2000107675A JP2001288197A JP 2001288197 A JP2001288197 A JP 2001288197A JP 2000107675 A JP2000107675 A JP 2000107675A JP 2000107675 A JP2000107675 A JP 2000107675A JP 2001288197 A JP2001288197 A JP 2001288197A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- fluorescent
- nucleic acid
- nucleotide
- fluorescent nucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 107
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 105
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 54
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 51
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 44
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 44
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 30
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 28
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 22
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 18
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 claims description 17
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 16
- DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M merocyanine Chemical compound [Na+].O=C1N(CCCC)C(=O)N(CCCC)C(=O)C1=C\C=C\C=C/1N(CCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=CC=C2O\1 DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M 0.000 claims description 15
- 125000005504 styryl group Chemical group 0.000 claims description 15
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 13
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 claims description 11
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 9
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 claims description 7
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 claims description 7
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 claims description 6
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 108091029845 Aminoallyl nucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 4
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 4
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 3
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 3
- 238000005820 transferase reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 abstract description 3
- -1 rhodamine isothiocyanate Chemical class 0.000 description 46
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 31
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine group Chemical group N1=CCC2=CC=CC=C12 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- RFFLAFLAYFXFSW-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichlorobenzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1Cl RFFLAFLAYFXFSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N pyridine Substances C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 5
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 5
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N isothiocyanate group Chemical group [N-]=C=S ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 4
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 4
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 4
- 125000005439 maleimidyl group Chemical class C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 4
- RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M sodium;1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].ON1C(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C1=O RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 125000002128 sulfonyl halide group Chemical class 0.000 description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 3
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 3
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N protoneodioscin Natural products O(C[C@@H](CC[C@]1(O)[C@H](C)[C@@H]2[C@]3(C)[C@H]([C@H]4[C@@H]([C@]5(C)C(=CC4)C[C@@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@H](CO)O4)CC5)CC3)C[C@@H]2O1)C)[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N 0.000 description 3
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- JGVSIZVWGGQMPY-SNAWJCMRSA-N (e)-1,3,3-trimethoxyprop-1-ene Chemical compound CO\C=C\C(OC)OC JGVSIZVWGGQMPY-SNAWJCMRSA-N 0.000 description 2
- NVRVNSHHLPQGCU-UHFFFAOYSA-N 6-bromohexanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCBr NVRVNSHHLPQGCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical group [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical group [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 125000004069 aziridinyl group Chemical class 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 125000001951 carbamoylamino group Chemical group C(N)(=O)N* 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 2
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 2
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- HVTICUPFWKNHNG-UHFFFAOYSA-N iodoethane Chemical compound CCI HVTICUPFWKNHNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQPQWNKOIGAROB-UHFFFAOYSA-N isocyanate group Chemical group [N-]=C=O IQPQWNKOIGAROB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical class 0.000 description 2
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical group O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001174 sulfone group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 125000004306 triazinyl group Chemical class 0.000 description 2
- GKASDNZWUGIAMG-UHFFFAOYSA-N triethyl orthoformate Chemical compound CCOC(OCC)OCC GKASDNZWUGIAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- HUTXVUPGARJNHM-UHFFFAOYSA-N 1-(2-chloroethoxy)ethanol Chemical compound CC(O)OCCCl HUTXVUPGARJNHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PQTQDFFZZKJJNK-UHFFFAOYSA-N 1-(2-iodoethoxy)ethanol Chemical compound CC(O)OCCI PQTQDFFZZKJJNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- YQTCQNIPQMJNTI-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylpropan-1-one Chemical group CC(C)(C)[C]=O YQTCQNIPQMJNTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FLHJIAFUWHPJRT-UHFFFAOYSA-N 2,3,3-trimethylindole Chemical class C1=CC=C2C(C)(C)C(C)=NC2=C1 FLHJIAFUWHPJRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WDBQJSCPCGTAFG-QHCPKHFHSA-N 4,4-difluoro-N-[(1S)-3-[4-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)piperidin-1-yl]-1-pyridin-3-ylpropyl]cyclohexane-1-carboxamide Chemical compound FC1(CCC(CC1)C(=O)N[C@@H](CCN1CCC(CC1)N1C(=NN=C1C)C(C)C)C=1C=NC=CC=1)F WDBQJSCPCGTAFG-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- BWGRDBSNKQABCB-UHFFFAOYSA-N 4,4-difluoro-N-[3-[3-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)-8-azabicyclo[3.2.1]octan-8-yl]-1-thiophen-2-ylpropyl]cyclohexane-1-carboxamide Chemical compound CC(C)C1=NN=C(C)N1C1CC2CCC(C1)N2CCC(NC(=O)C1CCC(F)(F)CC1)C1=CC=CS1 BWGRDBSNKQABCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHDBZCJYSHDCKF-UHFFFAOYSA-N 4,6-dichlorotriazine Chemical class ClC1=CC(Cl)=NN=N1 IHDBZCJYSHDCKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSNSCYSYFYORTR-UHFFFAOYSA-N 4-chloroaniline Chemical compound NC1=CC=C(Cl)C=C1 QSNSCYSYFYORTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ORLGPUVJERIKLW-UHFFFAOYSA-N 5-chlorotriazine Chemical class ClC1=CN=NN=C1 ORLGPUVJERIKLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PCDQPRRSZKQHHS-XVFCMESISA-N CTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 102100033029 Carbonic anhydrase-related protein 11 Human genes 0.000 description 1
- 241000237074 Centris Species 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101900234631 Escherichia coli DNA polymerase I Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000867841 Homo sapiens Carbonic anhydrase-related protein 11 Proteins 0.000 description 1
- 101001075218 Homo sapiens Gastrokine-1 Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical group NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFZAGIJXANFPFN-UHFFFAOYSA-N N-[3-[4-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)piperidin-1-yl]-1-thiophen-2-ylpropyl]acetamide Chemical compound C(C)(C)C1=NN=C(N1C1CCN(CC1)CCC(C=1SC=CC=1)NC(C)=O)C LFZAGIJXANFPFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical group CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N UTP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 235000006545 Ziziphus mauritiana Nutrition 0.000 description 1
- 240000000038 Ziziphus mauritiana Species 0.000 description 1
- JJEJDZONIFQNHG-UHFFFAOYSA-N [C+4].N Chemical group [C+4].N JJEJDZONIFQNHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTXOHOIOFJSIFX-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O)CC[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 OTXOHOIOFJSIFX-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N [[(2s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N 0.000 description 1
- ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- 125000000738 acetamido group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)N([H])[*] 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000003668 acetyloxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)O[*] 0.000 description 1
- 239000002253 acid Chemical class 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004442 acylamino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004423 acyloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004414 alkyl thio group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004397 aminosulfonyl group Chemical group NS(=O)(=O)* 0.000 description 1
- 125000002490 anilino group Chemical group [H]N(*)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005161 aryl oxy carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005110 aryl thio group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229940125717 barbiturate Drugs 0.000 description 1
- 125000001231 benzoyloxy group Chemical group C(C1=CC=CC=C1)(=O)O* 0.000 description 1
- 125000000440 benzylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000000649 benzylidene group Chemical group [H]C(=[*])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 1
- 125000004186 cyclopropylmethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C1([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N ddTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000004891 diazines Chemical class 0.000 description 1
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000003754 ethoxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC)* 0.000 description 1
- 125000004705 ethylthio group Chemical group C(C)S* 0.000 description 1
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000717 hydrazino group Chemical group [H]N([*])N([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000005462 imide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000001160 methoxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC(*)=O 0.000 description 1
- 125000000250 methylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002816 methylsulfanyl group Chemical group [H]C([H])([H])S[*] 0.000 description 1
- 125000004170 methylsulfonyl group Chemical group [H]C([H])([H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001280 n-hexyl group Chemical group C(CCCCC)* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005029 naphthylthio group Chemical group C1(=CC=CC2=CC=CC=C12)S* 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- AICOOMRHRUFYCM-ZRRPKQBOSA-N oxazine, 1 Chemical compound C([C@@H]1[C@H](C(C[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)N(C)C)[C@H](O)C[C@]21C)=O)CC1=CC2)C[C@H]1[C@@]1(C)[C@H]2N=C(C(C)C)OC1 AICOOMRHRUFYCM-ZRRPKQBOSA-N 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000006678 phenoxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000003356 phenylsulfanyl group Chemical group [*]SC1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000003170 phenylsulfonyl group Chemical group C1(=CC=CC=C1)S(=O)(=O)* 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 125000005412 pyrazyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003222 pyridines Chemical class 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N sulfanilamide Chemical compound NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000475 sulfinyl group Chemical group [*:2]S([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 125000006296 sulfonyl amino group Chemical group [H]N(*)S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004001 thioalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229930195735 unsaturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Indole Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 核酸の効率的な標識のために有用な蛍光ヌク
レオチドを提供すること。 【解決手段】 式：Ａ−Ｂ−Ｃ で表される蛍光ヌクレオチド。［式中、Ａは天然又は合
成のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレ
オチドあるいはそれらの誘導体の残基を示し、上記残基
中の塩基部分でＢと結合し、Ｂは２価の連結基または単
結合を示し、Ｃは、分子内に０ないし１個のスルホン酸
基またはリン酸基を有する蛍光色素から誘導される１価
の基を示す。］
レオチドを提供すること。 【解決手段】 式：Ａ−Ｂ−Ｃ で表される蛍光ヌクレオチド。［式中、Ａは天然又は合
成のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレ
オチドあるいはそれらの誘導体の残基を示し、上記残基
中の塩基部分でＢと結合し、Ｂは２価の連結基または単
結合を示し、Ｃは、分子内に０ないし１個のスルホン酸
基またはリン酸基を有する蛍光色素から誘導される１価
の基を示す。］
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光ヌクレオチド
並びにその利用に関するものである。
並びにその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】相同核酸配列の検出のために最も多く用
いられる分子生物学的方法の１つはＤＮＡ／ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成であ
る。この方法ではプローブとして用いる核酸（ＤＮＡ又
はＲＮＡ）を標識し、この標識された核酸を検出すべき
核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）とハイブリダイゼーションさ
せる。プローブとして用いた核酸と検出すべき核酸の間
に相同性が存在する場合、それぞれの相補的な１本鎖の
核酸がハイブリダイゼーションし、２本鎖が形成され、
その２本鎖をプローブの標識により検出する。
いられる分子生物学的方法の１つはＤＮＡ／ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成であ
る。この方法ではプローブとして用いる核酸（ＤＮＡ又
はＲＮＡ）を標識し、この標識された核酸を検出すべき
核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）とハイブリダイゼーションさ
せる。プローブとして用いた核酸と検出すべき核酸の間
に相同性が存在する場合、それぞれの相補的な１本鎖の
核酸がハイブリダイゼーションし、２本鎖が形成され、
その２本鎖をプローブの標識により検出する。
【０００３】従来より核酸をプローブとして用いる場
合、ラジオアイソトープでプローブを標識する方法が用
いられ、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーショ
ンの有無はオートラジオグラフィーにより検出されてい
た。遺伝子プローブを標識する際にラジオアイソトープ
を利用する方法は特に感度が高い点で優れているが、ラ
ジオアイソトープの取り扱いに付随して実験室の安全性
の確保及び放射性化合物の廃棄の問題という繁雑さが存
在していた。また、ラジオアイソトープは半減期を有す
るため、一定期間しか用いることができないという問題
点もあった。
合、ラジオアイソトープでプローブを標識する方法が用
いられ、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーショ
ンの有無はオートラジオグラフィーにより検出されてい
た。遺伝子プローブを標識する際にラジオアイソトープ
を利用する方法は特に感度が高い点で優れているが、ラ
ジオアイソトープの取り扱いに付随して実験室の安全性
の確保及び放射性化合物の廃棄の問題という繁雑さが存
在していた。また、ラジオアイソトープは半減期を有す
るため、一定期間しか用いることができないという問題
点もあった。
【０００４】上記理由から、より簡便な方法として非放
射性標識法が開発されてきており、例えば、遺伝子プロ
ーブをビオチン分子（欧州特許第０ ０６３ ８７９号明
細書）又はジゴキシゲニン分子（欧州特許第０ ３２４
４７４ Ａ１号明細書）を用いて標識する方法が知られ
ている。標識核酸プローブと検出すべき核酸配列とのハ
イブリダイゼーションを行った後、形成された２本鎖核
酸の中にはビオチン分子またはジゴキシゲニン分子が存
在する。ハイブリダイゼーション後、これらに対して
（ストレプト）アビジン−マーカー酵素複合体又はジゴ
キシゲニンへの抗−ジゴキシゲニン抗体−マーカー酵素
複合体を結合することによって、プローブがハイブリダ
イゼーションした核酸を検出することができる。しかし
ながら、このような酵素を用いた検出法は、感度や特異
性の面で十分なものではなかった。
射性標識法が開発されてきており、例えば、遺伝子プロ
ーブをビオチン分子（欧州特許第０ ０６３ ８７９号明
細書）又はジゴキシゲニン分子（欧州特許第０ ３２４
４７４ Ａ１号明細書）を用いて標識する方法が知られ
ている。標識核酸プローブと検出すべき核酸配列とのハ
イブリダイゼーションを行った後、形成された２本鎖核
酸の中にはビオチン分子またはジゴキシゲニン分子が存
在する。ハイブリダイゼーション後、これらに対して
（ストレプト）アビジン−マーカー酵素複合体又はジゴ
キシゲニンへの抗−ジゴキシゲニン抗体−マーカー酵素
複合体を結合することによって、プローブがハイブリダ
イゼーションした核酸を検出することができる。しかし
ながら、このような酵素を用いた検出法は、感度や特異
性の面で十分なものではなかった。
【０００５】また上記方法以外にも、蛍光色素で標的物
質を標識する方法が種々研究されている。蛍光標識試薬
に求められる性能としては、（１）高い蛍光量子収率を
有すること、（２）高い分子吸光係数を有すること、
（３）水溶性で、かつ水性溶媒中で凝集して自己消光を
起こさないこと、（４）加水分解を受けにくいこと、
（５）光分解が起こりにくいこと、（６）バックグラウ
ンド蛍光の影響を受けにくいこと、（７）標的物質と共
有結合を生じさせる反応性置換基が導入されていること
などが挙げられる。蛍光標識試薬として古くから知られ
ているフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）、ローダミンイソチオシアネートは高い蛍光量子収
率を有するものの、分子吸光係数が低く、また励起及び
発光波長が５００ｎｍ−６００ｎｍであるため、例えば
ブロッティングに用いるメンブレンのバックグラウンド
蛍光の影響を受けやすいという欠点がある。
質を標識する方法が種々研究されている。蛍光標識試薬
に求められる性能としては、（１）高い蛍光量子収率を
有すること、（２）高い分子吸光係数を有すること、
（３）水溶性で、かつ水性溶媒中で凝集して自己消光を
起こさないこと、（４）加水分解を受けにくいこと、
（５）光分解が起こりにくいこと、（６）バックグラウ
ンド蛍光の影響を受けにくいこと、（７）標的物質と共
有結合を生じさせる反応性置換基が導入されていること
などが挙げられる。蛍光標識試薬として古くから知られ
ているフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）、ローダミンイソチオシアネートは高い蛍光量子収
率を有するものの、分子吸光係数が低く、また励起及び
発光波長が５００ｎｍ−６００ｎｍであるため、例えば
ブロッティングに用いるメンブレンのバックグラウンド
蛍光の影響を受けやすいという欠点がある。
【０００６】分子吸光係数の高い色素としては、例えば
米国特許第５４８６６１６号明細書、特開平２−１９１
６７４号公報、同５−２８７２０９号公報、同５−２８
７２６６号公報、同８−４７４００号公報、同９−１２
７１１５号公報、同７−１４５１４８号公報、同６−２
２２０５９号公報に記載されたシアニン色素、Journal
of Fluorescence, 5, 231ページ（1995年）に記載され
たバルビツール酸オキソノール等のポリメチン色素が知
られているが、これらは水に溶けにくく、また溶解して
も加水分解が生じる等の問題がある。また、色素同士の
分子間相互作用が強いために水性媒体中で凝集体を生
じ、そのため蛍光の自己消光が観測される場合が多い。
また、特開平２−１９１６７４号公報等に記載されてい
るシアニン色素は比較的安定な発色団にスルホン酸基を
導入することで水溶性を付与し、かつ凝集体の形成を抑
制した優れた色素であるが、核酸合成反応、例えば、逆
転写反応による蛍光ヌクレオチドの取り込み効率が悪い
等の問題点があった。
米国特許第５４８６６１６号明細書、特開平２−１９１
６７４号公報、同５−２８７２０９号公報、同５−２８
７２６６号公報、同８−４７４００号公報、同９−１２
７１１５号公報、同７−１４５１４８号公報、同６−２
２２０５９号公報に記載されたシアニン色素、Journal
of Fluorescence, 5, 231ページ（1995年）に記載され
たバルビツール酸オキソノール等のポリメチン色素が知
られているが、これらは水に溶けにくく、また溶解して
も加水分解が生じる等の問題がある。また、色素同士の
分子間相互作用が強いために水性媒体中で凝集体を生
じ、そのため蛍光の自己消光が観測される場合が多い。
また、特開平２−１９１６７４号公報等に記載されてい
るシアニン色素は比較的安定な発色団にスルホン酸基を
導入することで水溶性を付与し、かつ凝集体の形成を抑
制した優れた色素であるが、核酸合成反応、例えば、逆
転写反応による蛍光ヌクレオチドの取り込み効率が悪い
等の問題点があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とし
た。即ち、本発明は、核酸の効率的な標識のために有用
な蛍光ヌクレオチドを提供することを解決すべき課題と
した。
来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とし
た。即ち、本発明は、核酸の効率的な標識のために有用
な蛍光ヌクレオチドを提供することを解決すべき課題と
した。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討を重ねた結果、マイナスチャー
ジの低い蛍光標識試薬を用いたヌクレオチドとの複合体
を形成し、その複合体を用いて核酸を標識および検出し
た結果、核酸への取り込み率が大幅に向上したことを見
出し、本発明を完成するに至った。
解決するために鋭意検討を重ねた結果、マイナスチャー
ジの低い蛍光標識試薬を用いたヌクレオチドとの複合体
を形成し、その複合体を用いて核酸を標識および検出し
た結果、核酸への取り込み率が大幅に向上したことを見
出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】即ち、本発明によれば、式：Ａ−Ｂ−Ｃで
表される蛍光ヌクレオチドが提供される。［式中、Ａは
天然又は合成のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は
ポリヌクレオチドあるいはそれらの誘導体の残基を示
し、上記残基中の塩基部分でＢと結合し、Ｂは２価の連
結基または単結合を示し、Ｃは、分子内に０ないし１個
のスルホン酸基またはリン酸基を有する蛍光色素から誘
導される１価の基を示す。］
表される蛍光ヌクレオチドが提供される。［式中、Ａは
天然又は合成のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は
ポリヌクレオチドあるいはそれらの誘導体の残基を示
し、上記残基中の塩基部分でＢと結合し、Ｂは２価の連
結基または単結合を示し、Ｃは、分子内に０ないし１個
のスルホン酸基またはリン酸基を有する蛍光色素から誘
導される１価の基を示す。］
【００１０】本発明によればさらに、式：Ａ−Ｂ−Ｃで
表される蛍光ヌクレオチドが提供される。［式中、Ａは
天然又は合成のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は
ポリヌクレオチドあるいはそれらの誘導体の残基を示
し、上記残基中の塩基部分でＢと結合し、Ｂは２価の連
結基または単結合を示し、Ｃは分子内にスルホン酸基、
リン酸基、カルボン酸基以外の水溶性基を有する蛍光色
素から誘導される１価の基を示す。］ 好ましくは、蛍光色素はシアニン、メロシアニン又はス
チリル蛍光色素である。
表される蛍光ヌクレオチドが提供される。［式中、Ａは
天然又は合成のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は
ポリヌクレオチドあるいはそれらの誘導体の残基を示
し、上記残基中の塩基部分でＢと結合し、Ｂは２価の連
結基または単結合を示し、Ｃは分子内にスルホン酸基、
リン酸基、カルボン酸基以外の水溶性基を有する蛍光色
素から誘導される１価の基を示す。］ 好ましくは、蛍光色素はシアニン、メロシアニン又はス
チリル蛍光色素である。
【００１１】好ましくは、シアニン、メロシアニン又は
スチリル蛍光色素は以下の一般式で表される構造を有す
る蛍光色素である。
スチリル蛍光色素は以下の一般式で表される構造を有す
る蛍光色素である。
【化３】 ［式中、ＸおよびＹはそれぞれ独立にＯ、ＳおよびＣ
（ＣＨ3）2よりなる群から選ばれ、ｍは１、２、３およ
び４よりなる群から選ばれる整数であり、Ｒ1及びＲ2は
それぞれ独立に水素原子、又はＢと共有結合し得る反応
性基で置換されていてもよいアルキル基を示し、該アル
キル基のアルキル鎖中には酸素原子又は硫黄原子が介在
していてもよく、Ｒ1及びＲ2の少なくとも片方はＢと共
有結合し得る反応性基で置換されていてもよいアルキル
基を示す。Ｒ3からＲ9はそれぞれ独立して水素原子又は
一価の置換基を示し、これらのうち隣接する２つの基は
互いに結合して環を形成してもよい。点線はそれぞれ前
記シアニン、メロシアニンおよびスチリル蛍光色素を形
成するのに必要な炭素原子を表す。］
（ＣＨ3）2よりなる群から選ばれ、ｍは１、２、３およ
び４よりなる群から選ばれる整数であり、Ｒ1及びＲ2は
それぞれ独立に水素原子、又はＢと共有結合し得る反応
性基で置換されていてもよいアルキル基を示し、該アル
キル基のアルキル鎖中には酸素原子又は硫黄原子が介在
していてもよく、Ｒ1及びＲ2の少なくとも片方はＢと共
有結合し得る反応性基で置換されていてもよいアルキル
基を示す。Ｒ3からＲ9はそれぞれ独立して水素原子又は
一価の置換基を示し、これらのうち隣接する２つの基は
互いに結合して環を形成してもよい。点線はそれぞれ前
記シアニン、メロシアニンおよびスチリル蛍光色素を形
成するのに必要な炭素原子を表す。］
【００１２】より好ましくは、シアニン、メロシアニン
又はスチリル蛍光色素は以下の一般式で表される構造を
有する蛍光色素である。
又はスチリル蛍光色素は以下の一般式で表される構造を
有する蛍光色素である。
【化４】 ［式中、ＸおよびＹはそれぞれ独立にＯ、ＳおよびＣ
（ＣＨ3）2よりなる群から選ばれ、ＺはＯおよびＳより
なる群から選ばれ、ｍは１、２、３および４よりなる群
から選ばれる整数であり、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に
水素原子、又はＢと共有結合し得る反応性基で置換され
ていてもよいアルキル基を示し、該アルキル基のアルキ
ル鎖中には酸素原子又は硫黄原子が介在していてもよ
く、Ｒ1及びＲ2の少なくとも片方はＢと共有結合し得る
反応性基で置換されていてもよいアルキル基を示す。Ｒ
3からＲ11はそれぞれ独立して、水素原子又は一価の置
換基を示し、これらのうち隣接する２つの基は互いに結
合して環を形成してもよい。］
（ＣＨ3）2よりなる群から選ばれ、ＺはＯおよびＳより
なる群から選ばれ、ｍは１、２、３および４よりなる群
から選ばれる整数であり、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に
水素原子、又はＢと共有結合し得る反応性基で置換され
ていてもよいアルキル基を示し、該アルキル基のアルキ
ル鎖中には酸素原子又は硫黄原子が介在していてもよ
く、Ｒ1及びＲ2の少なくとも片方はＢと共有結合し得る
反応性基で置換されていてもよいアルキル基を示す。Ｒ
3からＲ11はそれぞれ独立して、水素原子又は一価の置
換基を示し、これらのうち隣接する２つの基は互いに結
合して環を形成してもよい。］
【００１３】好ましくは、Ｒ1及びＲ2の少なくとも１つ
は、基Ｂ中のアミノ基、ヒドロキシル基、又はチオール
基と共有結合し得る活性エステル基で置換されたアルキ
ル基である。好ましくは、Ｒ1及びＲ2の少なくとも１つ
は、カルボキシル基で置換されたアルキル基である。
は、基Ｂ中のアミノ基、ヒドロキシル基、又はチオール
基と共有結合し得る活性エステル基で置換されたアルキ
ル基である。好ましくは、Ｒ1及びＲ2の少なくとも１つ
は、カルボキシル基で置換されたアルキル基である。
【００１４】好ましくは、Ａはヌクレオチドあるいはそ
れらの誘導体の残基である。より好ましくは、Ａは
（１）ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴ
Ｐ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ ＵＴ
Ｐ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−
Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、
１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭ
Ｐ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ
−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰか
ら成るヌクレオチドから成る群、（２）前記ヌクレオチ
ドに対応するデオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌ
クレオチドから成る群、並びに（３）前記（１）および
（２）に記載のヌクレオチドからさらに誘導される誘導
体、から成る群から選ばれる天然又は合成のヌクレオチ
ド又はその誘導体の残基を示す。
れらの誘導体の残基である。より好ましくは、Ａは
（１）ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴ
Ｐ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ ＵＴ
Ｐ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−
Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、
１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭ
Ｐ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ
−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰか
ら成るヌクレオチドから成る群、（２）前記ヌクレオチ
ドに対応するデオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌ
クレオチドから成る群、並びに（３）前記（１）および
（２）に記載のヌクレオチドからさらに誘導される誘導
体、から成る群から選ばれる天然又は合成のヌクレオチ
ド又はその誘導体の残基を示す。
【００１５】好ましくは、Ｂは−ＣＨ2−、−ＣＨ＝Ｃ
Ｈ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ
−またはこれらの組み合わせから成る連結基であって、
連結基上の水素原子は置換基でさらに置換されていても
よい連結基である。より好ましくは、Ｂはアミノアリル
基である。
Ｈ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ
−またはこれらの組み合わせから成る連結基であって、
連結基上の水素原子は置換基でさらに置換されていても
よい連結基である。より好ましくは、Ｂはアミノアリル
基である。
【００１６】本発明の別の側面によれば、核酸合成酵素
と鋳型核酸と本発明の蛍光ヌクレオチドとを用いて核酸
合成反応を行うことを含む、蛍光標識された核酸の調製
方法が提供される。好ましくは、核酸合成反応は、逆転
写反応、ターミナルトランスフェラーゼ反応、ランダム
プライム法、ＰＣＲ法またはニックトランスレーション
法から成る群から選ばれる反応である。
と鋳型核酸と本発明の蛍光ヌクレオチドとを用いて核酸
合成反応を行うことを含む、蛍光標識された核酸の調製
方法が提供される。好ましくは、核酸合成反応は、逆転
写反応、ターミナルトランスフェラーゼ反応、ランダム
プライム法、ＰＣＲ法またはニックトランスレーション
法から成る群から選ばれる反応である。
【００１７】本発明のさらに別の側面によれば、本発明
の蛍光ヌクレオチドで標識された核酸プローブまたはプ
ライマーが提供される。本発明のさらに別の側面によれ
ば、本発明の蛍光ヌクレオチドから成る核酸検出用試薬
または診断薬が提供される。本発明のさらに別の側面に
よれば、（１）本発明の蛍光ヌクレオチド、（２）核酸
合成酵素および（３）緩衝液を含む、核酸検出用キット
が提供される。
の蛍光ヌクレオチドで標識された核酸プローブまたはプ
ライマーが提供される。本発明のさらに別の側面によれ
ば、本発明の蛍光ヌクレオチドから成る核酸検出用試薬
または診断薬が提供される。本発明のさらに別の側面に
よれば、（１）本発明の蛍光ヌクレオチド、（２）核酸
合成酵素および（３）緩衝液を含む、核酸検出用キット
が提供される。
【００１８】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施態様および実
施方法について詳細に説明する。本発明は式：Ａ−Ｂ−
Ｃで表される蛍光ヌクレオチドに関する。上記式中、Ａ
は天然又は合成のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又
はポリヌクレオチドあるいはそれらの誘導体の残基を示
す。天然又は合成のヌクレオチドとしては、（１）ＡＭ
Ｐ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭ
Ｐ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ ＵＴＰ、ＴＭ
Ｐ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−Ｍｅ−Ａ
ＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、１−Ｍｅ
−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭＰ、５−
Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ−ＣＭ
Ｐ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰから成る
ヌクレオチドから成る群、（２）前記ヌクレオチドに対
応するデオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオ
チドから成る群、並びに（３）前記（１）および（２）
に記載のヌクレオチドからさらに誘導される誘導体、か
ら成る群から選ばれる天然又は合成のヌクレオチド又は
その誘導体が挙げられるが、これらに限定されるわけで
はない。天然又は合成のヌクレオチドのより具体的な例
としては、ATP、CTP、GTP、TTP、UTP、dATP、dCTP、dGT
P、dTTP、dUTP、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP、ddUTP、
又はこれらの誘導体などを挙げることができるが、これ
らに限定されるわけではない。
施方法について詳細に説明する。本発明は式：Ａ−Ｂ−
Ｃで表される蛍光ヌクレオチドに関する。上記式中、Ａ
は天然又は合成のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又
はポリヌクレオチドあるいはそれらの誘導体の残基を示
す。天然又は合成のヌクレオチドとしては、（１）ＡＭ
Ｐ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭ
Ｐ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ ＵＴＰ、ＴＭ
Ｐ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−Ｍｅ−Ａ
ＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、１−Ｍｅ
−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭＰ、５−
Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ−ＣＭ
Ｐ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰから成る
ヌクレオチドから成る群、（２）前記ヌクレオチドに対
応するデオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオ
チドから成る群、並びに（３）前記（１）および（２）
に記載のヌクレオチドからさらに誘導される誘導体、か
ら成る群から選ばれる天然又は合成のヌクレオチド又は
その誘導体が挙げられるが、これらに限定されるわけで
はない。天然又は合成のヌクレオチドのより具体的な例
としては、ATP、CTP、GTP、TTP、UTP、dATP、dCTP、dGT
P、dTTP、dUTP、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP、ddUTP、
又はこれらの誘導体などを挙げることができるが、これ
らに限定されるわけではない。
【００１９】オリゴヌクレオチドとは、上記ヌクレオチ
ドまたはその誘導体が１〜５０個程度、好ましくは１〜
３０個程度、さらに好ましくは１〜２０個程度重合して
成るものであり、構成単位の各ヌクレオチドは同一でも
相違していてもよい。ポリヌクレオチドとは、上記ヌク
レオチドまたはその誘導体が多数重合して重合体であ
り、その大きさ（長さ）は特に限定されず、例えば塩基
数として数ｂｐから数ｋｂに至るものでもよい。本明細
書で用いる蛍光ヌクレオチドと言う用語は、核酸成分が
上記したようなヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよ
びポリヌクレオチドである場合の全てを含む意味で用い
られる。
ドまたはその誘導体が１〜５０個程度、好ましくは１〜
３０個程度、さらに好ましくは１〜２０個程度重合して
成るものであり、構成単位の各ヌクレオチドは同一でも
相違していてもよい。ポリヌクレオチドとは、上記ヌク
レオチドまたはその誘導体が多数重合して重合体であ
り、その大きさ（長さ）は特に限定されず、例えば塩基
数として数ｂｐから数ｋｂに至るものでもよい。本明細
書で用いる蛍光ヌクレオチドと言う用語は、核酸成分が
上記したようなヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよ
びポリヌクレオチドである場合の全てを含む意味で用い
られる。
【００２０】Ａはヌクレオチド残基中の塩基部分でＢと
結合する。ヌクレオチド残基の塩基部分としては、プリ
ン誘導体とピリミジン誘導体が挙げられる。プリン塩基
中における連結基Ｂとの結合部位は、糖成分と結合する
９位以外であれば特に制限されず、例えばプリン塩基が
アデニンの場合には２位または８位で、あるいは６位に
存在するアミノ基で連結基Ｂと結合することができ、プ
リン塩基がグアニンの場合には１位または８位で、ある
いは２位に存在するアミノ基で連結基Ｂと結合すること
ができる。ピリミジン塩基中における連結基Ｂとの結合
部位は、糖成分と結合する１位以外であれば特に限定さ
れず、例えばピリミジン塩基がシトシンの場合には５位
または６位、あるいは４位に存在するアミノ基で連結基
Ｂと結合することができ、ピリミジン塩基がチミンの場
合には３位または６位、あるいは５位に存在するメチル
基で連結基Ｂと結合することができ、またピリミジン塩
基がウラシルの場合には３位、５位または６位で連結基
Ｂと結合することができる。
結合する。ヌクレオチド残基の塩基部分としては、プリ
ン誘導体とピリミジン誘導体が挙げられる。プリン塩基
中における連結基Ｂとの結合部位は、糖成分と結合する
９位以外であれば特に制限されず、例えばプリン塩基が
アデニンの場合には２位または８位で、あるいは６位に
存在するアミノ基で連結基Ｂと結合することができ、プ
リン塩基がグアニンの場合には１位または８位で、ある
いは２位に存在するアミノ基で連結基Ｂと結合すること
ができる。ピリミジン塩基中における連結基Ｂとの結合
部位は、糖成分と結合する１位以外であれば特に限定さ
れず、例えばピリミジン塩基がシトシンの場合には５位
または６位、あるいは４位に存在するアミノ基で連結基
Ｂと結合することができ、ピリミジン塩基がチミンの場
合には３位または６位、あるいは５位に存在するメチル
基で連結基Ｂと結合することができ、またピリミジン塩
基がウラシルの場合には３位、５位または６位で連結基
Ｂと結合することができる。
【００２１】上記式中、Ｂは２価の連結基または単結合
を示す。連結基の種類は、本発明の蛍光ヌクレオチドの
性質（即ち、蛍光ヌクレオチドの化合物としての安定
性、水溶性、核酸への取込み率、または蛍光強度など）
に大きな影響をもたらさない限り、特に限定されない。
当業者ならば、Ａで表されるヌクレオチド部分とＣで表
される蛍光化合物成分とを連結するのに適した２価の連
結基を適宜選択することができる。連結基Ｂは、一般的
には−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ
−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−またはこれらの組み合わ
せから成る連結基であって、連結基上の水素原子は置換
基でさらに置換されていてもよい。連結基の主鎖の炭素
数は特に限定されないが、一般的には１〜５０、好まし
くは１〜２０、より好ましくは１〜１０、特に好ましく
は１〜５である。
を示す。連結基の種類は、本発明の蛍光ヌクレオチドの
性質（即ち、蛍光ヌクレオチドの化合物としての安定
性、水溶性、核酸への取込み率、または蛍光強度など）
に大きな影響をもたらさない限り、特に限定されない。
当業者ならば、Ａで表されるヌクレオチド部分とＣで表
される蛍光化合物成分とを連結するのに適した２価の連
結基を適宜選択することができる。連結基Ｂは、一般的
には−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ
−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−またはこれらの組み合わ
せから成る連結基であって、連結基上の水素原子は置換
基でさらに置換されていてもよい。連結基の主鎖の炭素
数は特に限定されないが、一般的には１〜５０、好まし
くは１〜２０、より好ましくは１〜１０、特に好ましく
は１〜５である。
【００２２】上記式中、Ｃは、（１）分子内に０ないし
１個のスルホン酸基またはリン酸基を有する蛍光色素
（特に好ましくは、シアニン、メロシアニン又はスチリ
ル蛍光色素）から誘導される１価の基、あるいは（２）
分子内にスルホン酸基、リン酸基、カルボン酸基以外の
水溶性基を有する蛍光色素（特に好ましくは、シアニ
ン、メロシアニン又はスチリル蛍光色素）から誘導され
る１価の基を示す。
１個のスルホン酸基またはリン酸基を有する蛍光色素
（特に好ましくは、シアニン、メロシアニン又はスチリ
ル蛍光色素）から誘導される１価の基、あるいは（２）
分子内にスルホン酸基、リン酸基、カルボン酸基以外の
水溶性基を有する蛍光色素（特に好ましくは、シアニ
ン、メロシアニン又はスチリル蛍光色素）から誘導され
る１価の基を示す。
【００２３】Ｃで表される１価の基が誘導される蛍光色
素としては、例えば、シアニン、メロシアニン又はスチ
リル蛍光色素が好ましく、例えば、特開平９−１２４５
９９号公報等に記載されている公知の色素を用いること
ができる。特開平９−１２４５９９号公報には、スルホ
ン酸基を有さないインドシアニン化合物が記載されてい
るが、スルホン基が逆転写反応等の核酸合成反応におけ
る核酸への取り込み効率の低下に寄因していることは論
じられていない。本発明では、蛍光ヌクレオチドとして
の最適な分子構造を設計するにあたり、核酸分子がマイ
ナスチャ−ジである点に着目して、マイナスチャージを
有する分子同士の反発を低減することを目的として、蛍
光色素にスルホン酸基、リン酸基等のマイナスチャージ
を有する官能基をできるだけ少なくしたことに特徴があ
る。即ち、本発明の一態様では、蛍光ヌクレオチドは、
蛍光色素成分中に存在するスルホン酸基またはリン酸基
の数が０ないし１個であることを特徴とする。
素としては、例えば、シアニン、メロシアニン又はスチ
リル蛍光色素が好ましく、例えば、特開平９−１２４５
９９号公報等に記載されている公知の色素を用いること
ができる。特開平９−１２４５９９号公報には、スルホ
ン酸基を有さないインドシアニン化合物が記載されてい
るが、スルホン基が逆転写反応等の核酸合成反応におけ
る核酸への取り込み効率の低下に寄因していることは論
じられていない。本発明では、蛍光ヌクレオチドとして
の最適な分子構造を設計するにあたり、核酸分子がマイ
ナスチャ−ジである点に着目して、マイナスチャージを
有する分子同士の反発を低減することを目的として、蛍
光色素にスルホン酸基、リン酸基等のマイナスチャージ
を有する官能基をできるだけ少なくしたことに特徴があ
る。即ち、本発明の一態様では、蛍光ヌクレオチドは、
蛍光色素成分中に存在するスルホン酸基またはリン酸基
の数が０ないし１個であることを特徴とする。
【００２４】しかし、これらのマイナスチャージを有す
る官能基を少なくすることで、特に分子量の大きな蛍光
色素の場合には不溶性になる場合がある。本発明の一側
面においては、このような不溶性に関する問題点を、色
素の発色団に水溶性の官能基を導入することで解決して
いる。即ち、本発明の一態様では、蛍光ヌクレオチド
は、蛍光色素成分中にスルホン酸基以外の水溶性基を有
することを特徴とする。蛍光色素に導入することができ
る水溶性の官能基としては、スルホンアミド、ポリエー
テル、低級アルコ−ル、糖鎖、３級アミン、４級アンモ
ニウム塩等が挙げられる。
る官能基を少なくすることで、特に分子量の大きな蛍光
色素の場合には不溶性になる場合がある。本発明の一側
面においては、このような不溶性に関する問題点を、色
素の発色団に水溶性の官能基を導入することで解決して
いる。即ち、本発明の一態様では、蛍光ヌクレオチド
は、蛍光色素成分中にスルホン酸基以外の水溶性基を有
することを特徴とする。蛍光色素に導入することができ
る水溶性の官能基としては、スルホンアミド、ポリエー
テル、低級アルコ−ル、糖鎖、３級アミン、４級アンモ
ニウム塩等が挙げられる。
【００２５】本発明で使用する蛍光色素は、好ましくは
シアニン、メロシアニン又はスチリル蛍光色素である。
シアニン、メロシアニン又はスチリル蛍光色素の好まし
い具体的構造としては、例えば以下の一般式で表される
構造が挙げられる。
シアニン、メロシアニン又はスチリル蛍光色素である。
シアニン、メロシアニン又はスチリル蛍光色素の好まし
い具体的構造としては、例えば以下の一般式で表される
構造が挙げられる。
【００２６】
【化５】
【００２７】［式中、ＸおよびＹはそれぞれ独立にＯ、
ＳおよびＣ（ＣＨ3）2よりなる群から選ばれ、ｍは１、
２、３および４よりなる群から選ばれる整数であり、Ｒ
1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子、又はＢと共有結合
し得る反応性基で置換されていてもよいアルキル基を示
し、該アルキル基のアルキル鎖中には酸素原子又は硫黄
原子が介在していてもよく、Ｒ1及びＲ2の少なくとも片
方はＢと共有結合し得る反応性基で置換されていてもよ
いアルキル基を示す。Ｒ3からＲ9はそれぞれ独立して水
素原子又は一価の置換基を示し、これらのうち隣接する
２つの基は互いに結合して環を形成してもよい。点線は
それぞれ前記シアニン、メロシアニンおよびスチリル蛍
光色素を形成するのに必要な炭素原子を表す。］
ＳおよびＣ（ＣＨ3）2よりなる群から選ばれ、ｍは１、
２、３および４よりなる群から選ばれる整数であり、Ｒ
1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子、又はＢと共有結合
し得る反応性基で置換されていてもよいアルキル基を示
し、該アルキル基のアルキル鎖中には酸素原子又は硫黄
原子が介在していてもよく、Ｒ1及びＲ2の少なくとも片
方はＢと共有結合し得る反応性基で置換されていてもよ
いアルキル基を示す。Ｒ3からＲ9はそれぞれ独立して水
素原子又は一価の置換基を示し、これらのうち隣接する
２つの基は互いに結合して環を形成してもよい。点線は
それぞれ前記シアニン、メロシアニンおよびスチリル蛍
光色素を形成するのに必要な炭素原子を表す。］
【００２８】シアニン、メロシアニン又はスチリル蛍光
色素のさらに好ましいが具体的構造としては、例えば、
以下の一般式で表される構造が挙げられる。
色素のさらに好ましいが具体的構造としては、例えば、
以下の一般式で表される構造が挙げられる。
【００２９】
【化６】
【００３０】［式中、ＸおよびＹはそれぞれ独立にＯ、
ＳおよびＣ（ＣＨ3）2よりなる群から選ばれ、ＺはＯお
よびＳよりなる群から選ばれ、ｍは１、２、３および４
よりなる群から選ばれる整数であり、Ｒ1及びＲ2はそれ
ぞれ独立に水素原子、又はＢと共有結合し得る反応性基
で置換されていてもよいアルキル基を示し、該アルキル
基のアルキル鎖中には酸素原子又は硫黄原子が介在して
いてもよく、Ｒ1及びＲ2の少なくとも片方はＢと共有結
合し得る反応性基で置換されていてもよいアルキル基を
示す。Ｒ3からＲ11はそれぞれ独立して、水素原子又は
一価の置換基を示し、これらのうち隣接する２つの基は
互いに結合して環を形成してもよい。］
ＳおよびＣ（ＣＨ3）2よりなる群から選ばれ、ＺはＯお
よびＳよりなる群から選ばれ、ｍは１、２、３および４
よりなる群から選ばれる整数であり、Ｒ1及びＲ2はそれ
ぞれ独立に水素原子、又はＢと共有結合し得る反応性基
で置換されていてもよいアルキル基を示し、該アルキル
基のアルキル鎖中には酸素原子又は硫黄原子が介在して
いてもよく、Ｒ1及びＲ2の少なくとも片方はＢと共有結
合し得る反応性基で置換されていてもよいアルキル基を
示す。Ｒ3からＲ11はそれぞれ独立して、水素原子又は
一価の置換基を示し、これらのうち隣接する２つの基は
互いに結合して環を形成してもよい。］
【００３１】本明細書において、アルキル基とは、直鎖
状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれ
でもよく、特に言及しない場合を除き、炭素原子数が１
〜２０程度である。Ｒ1及びＲ2が示すアルキル基は同一
でも異なっていてもよく、例えば、メチル基、エチル
基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル
基、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル
基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘ
キシル基、シクロヘキシル基などを挙げることができ
る。Ｒ1及びＲ2が示すアルキル基は、アルキル鎖上の任
意の位置に１又は２個以上の置換基を有していてもよ
い。２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一
でも異なっていてもよい。
状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれ
でもよく、特に言及しない場合を除き、炭素原子数が１
〜２０程度である。Ｒ1及びＲ2が示すアルキル基は同一
でも異なっていてもよく、例えば、メチル基、エチル
基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル
基、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル
基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘ
キシル基、シクロヘキシル基などを挙げることができ
る。Ｒ1及びＲ2が示すアルキル基は、アルキル鎖上の任
意の位置に１又は２個以上の置換基を有していてもよ
い。２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一
でも異なっていてもよい。
【００３２】Ｒ1及びＲ2が示すアルキル基上の置換基の
種類は特に制限されないが、上記一般式の蛍光色素を蛍
光標識としてヌクレオチドに導入するために、ヌクレオ
チド（またはヌクレオチドに結合した連結基）との間で
共有結合、イオン結合、水素結合などの結合を形成でき
る反応性基が導入されていることが好ましい（本明細書
において「反応性基」とは、上記の特徴を有する置換基
を意味する）。
種類は特に制限されないが、上記一般式の蛍光色素を蛍
光標識としてヌクレオチドに導入するために、ヌクレオ
チド（またはヌクレオチドに結合した連結基）との間で
共有結合、イオン結合、水素結合などの結合を形成でき
る反応性基が導入されていることが好ましい（本明細書
において「反応性基」とは、上記の特徴を有する置換基
を意味する）。
【００３３】Ｒ1及びＲ2が示すアルキル基上に導入可能
な反応性基としては、例えば、サクシンイミジルエステ
ル基、ハロゲン置換トリアジニル基、ハロゲン置換ピリ
ミジニル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル
基、マレイミジル基、アジリジニル基などを挙げること
ができる。これらの反応性基のほか、例えば、ハロゲン
原子（本明細書において「ハロゲン原子」という場合に
は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子
のいずれでもよい）、メルカプト基、シアノ基、ニトロ
基、カルボキシル基、リン酸基、スルホ基、ヒドロキシ
基、アミノ基、イソチオシアナート基、イソシアナート
基、炭素原子数が１〜８のアルコキシ基（例えば、メト
キシ基、エトキシ基など）、炭素原子数が６〜２０のア
リールオキシ基（例えば、フェノキシ基、ナフトキシ基
など）、炭素原子数が２〜１０のアルコキシカルボニル
基（例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニ
ル基）、炭素原子数が６〜２０のアリールオキシカルボ
ニル基（例えば、フェノキシカルボニル基など）、炭素
原子数が２〜１０のアシル基（例えば、アセチル基、ピ
バロイル基など）、炭素原子数が２〜８のアシルオキシ
基（例えば、アセチルオキシ基、ベンゾイルオキシ基な
ど）、炭素原子数が２〜８のアシルアミノ基（例えば、
アセチルアミノ基など）、炭素原子数が１〜８のスルホ
ニル基（例えば、メタンスルホニル基、エタンスルホニ
ル基、ベンゼンスルホニル基など）、炭素原子数が１〜
２０のスルフィニル基（例えば、メタンスルフィニル
基、エタンスルフィニル基、ベンゼンスルフィニル基な
ど）、炭素原子数が１〜８のスルホニルアミノ基（例え
ば、メタンスルホニルアミノ基、エタンスルホニルアミ
ノ基、ベンゼンスルホニルアミノ基など）、炭素原子数
が１〜１０のカルバモイル基（例えば、カルバモイル
基、メチルカルバモイル基、モリホリノカルバモイル基
など）、炭素原子数が１〜２０の置換アミノ基（例え
ば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ベンジルアミ
ノ基、アニリノ基、ジフェニルアミノ基など）、炭素原
子数が２〜１０のスルファモイル基（例えば、メチルス
ルファモイル基、エチルスルファモイル基、ピペリジノ
スルファモイル基など）、炭素原子数が０〜１５のアン
モニウム基（例えば、トリメチルアンモニウム基、トリ
エチルアンモニウム基など）、炭素原子数が０〜１５の
ヒドラジノ基（例えば、トリメチルヒドラジノ基な
ど）、炭素原子数が１〜１５のウレイド基（例えば、ウ
レイド基、N,N-ジメチルウレイド基など）、炭素原子数
が１〜１５のイミド基（例えば、スクシンイミド基な
ど）、炭素原子数が１〜２０のアルキルチオ基（例え
ば、メチルチオ基、エチルチオ基など）、炭素原子数が
６〜２０のアリールチオ基（例えば、フェニルチオ基、
ｐ−メチルフェニルチオ基、ｐ−クロロフェニルチオ
基、２−ピリジルチオ基、ナフチルチオ基など）、炭素
原子数１〜２０の置換又は無置換のヘテロ環基（例え
ば、ピリジル基、５−メチルピリジル基、チエニル基、
フリル基、モルホリノ基、テトラヒドロフリル基、２−
ピラジル基など）、炭素原子数２〜１８の不飽和炭化水
素基（例えば、ビニル基、エチニル基、１−シクロヘキ
セニル基、ベンジリジン基、ベンジリデン基など）、炭
素原子数が６〜２０の置換若しくは無置換のアリール基
（例えば、フェニル基、４−スルホフェニル基、２，５
−ジスルホフェニル基、４−カルボキシフェニル基、ナ
フチル基など）、炭素原子数が１〜２０のアルキル基
（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基など）が挙
げられる。
な反応性基としては、例えば、サクシンイミジルエステ
ル基、ハロゲン置換トリアジニル基、ハロゲン置換ピリ
ミジニル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル
基、マレイミジル基、アジリジニル基などを挙げること
ができる。これらの反応性基のほか、例えば、ハロゲン
原子（本明細書において「ハロゲン原子」という場合に
は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子
のいずれでもよい）、メルカプト基、シアノ基、ニトロ
基、カルボキシル基、リン酸基、スルホ基、ヒドロキシ
基、アミノ基、イソチオシアナート基、イソシアナート
基、炭素原子数が１〜８のアルコキシ基（例えば、メト
キシ基、エトキシ基など）、炭素原子数が６〜２０のア
リールオキシ基（例えば、フェノキシ基、ナフトキシ基
など）、炭素原子数が２〜１０のアルコキシカルボニル
基（例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニ
ル基）、炭素原子数が６〜２０のアリールオキシカルボ
ニル基（例えば、フェノキシカルボニル基など）、炭素
原子数が２〜１０のアシル基（例えば、アセチル基、ピ
バロイル基など）、炭素原子数が２〜８のアシルオキシ
基（例えば、アセチルオキシ基、ベンゾイルオキシ基な
ど）、炭素原子数が２〜８のアシルアミノ基（例えば、
アセチルアミノ基など）、炭素原子数が１〜８のスルホ
ニル基（例えば、メタンスルホニル基、エタンスルホニ
ル基、ベンゼンスルホニル基など）、炭素原子数が１〜
２０のスルフィニル基（例えば、メタンスルフィニル
基、エタンスルフィニル基、ベンゼンスルフィニル基な
ど）、炭素原子数が１〜８のスルホニルアミノ基（例え
ば、メタンスルホニルアミノ基、エタンスルホニルアミ
ノ基、ベンゼンスルホニルアミノ基など）、炭素原子数
が１〜１０のカルバモイル基（例えば、カルバモイル
基、メチルカルバモイル基、モリホリノカルバモイル基
など）、炭素原子数が１〜２０の置換アミノ基（例え
ば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ベンジルアミ
ノ基、アニリノ基、ジフェニルアミノ基など）、炭素原
子数が２〜１０のスルファモイル基（例えば、メチルス
ルファモイル基、エチルスルファモイル基、ピペリジノ
スルファモイル基など）、炭素原子数が０〜１５のアン
モニウム基（例えば、トリメチルアンモニウム基、トリ
エチルアンモニウム基など）、炭素原子数が０〜１５の
ヒドラジノ基（例えば、トリメチルヒドラジノ基な
ど）、炭素原子数が１〜１５のウレイド基（例えば、ウ
レイド基、N,N-ジメチルウレイド基など）、炭素原子数
が１〜１５のイミド基（例えば、スクシンイミド基な
ど）、炭素原子数が１〜２０のアルキルチオ基（例え
ば、メチルチオ基、エチルチオ基など）、炭素原子数が
６〜２０のアリールチオ基（例えば、フェニルチオ基、
ｐ−メチルフェニルチオ基、ｐ−クロロフェニルチオ
基、２−ピリジルチオ基、ナフチルチオ基など）、炭素
原子数１〜２０の置換又は無置換のヘテロ環基（例え
ば、ピリジル基、５−メチルピリジル基、チエニル基、
フリル基、モルホリノ基、テトラヒドロフリル基、２−
ピラジル基など）、炭素原子数２〜１８の不飽和炭化水
素基（例えば、ビニル基、エチニル基、１−シクロヘキ
セニル基、ベンジリジン基、ベンジリデン基など）、炭
素原子数が６〜２０の置換若しくは無置換のアリール基
（例えば、フェニル基、４−スルホフェニル基、２，５
−ジスルホフェニル基、４−カルボキシフェニル基、ナ
フチル基など）、炭素原子数が１〜２０のアルキル基
（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基など）が挙
げられる。
【００３４】Ｒ1及びＲ2の好ましい例として、カルボキ
シル基、イソチオシアナート基、サクシンイミジルエス
テル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル基、
又はマレイミジル基が置換した炭素原子数１〜１５のア
ルキル基、及びカルボキシル基、イソチオシアナート
基、サクシンイミジルエステル基、スルホニルハライド
基、α−ハロアセチル基、又はマレイミジル基が置換し
た炭素原子数７〜２０のアリールアルキル基を挙げるこ
とができる。さらに好ましい例として、カルボキシル
基、イソチオシアナート基、又はサクシンイミジルエス
テル基が置換した炭素原子数１〜１０のアルキル基を挙
げることができる。
シル基、イソチオシアナート基、サクシンイミジルエス
テル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル基、
又はマレイミジル基が置換した炭素原子数１〜１５のア
ルキル基、及びカルボキシル基、イソチオシアナート
基、サクシンイミジルエステル基、スルホニルハライド
基、α−ハロアセチル基、又はマレイミジル基が置換し
た炭素原子数７〜２０のアリールアルキル基を挙げるこ
とができる。さらに好ましい例として、カルボキシル
基、イソチオシアナート基、又はサクシンイミジルエス
テル基が置換した炭素原子数１〜１０のアルキル基を挙
げることができる。
【００３５】Ｒ3からＲ11はそれぞれ独立して、水素原
子又は一価の置換基を示し、これらのうち隣接する２つ
の基は互いに結合して環を形成してもよい。Ｒ3からＲ
11が示す置換基の種類は特に限定されず、それらは同一
でも異なっていてもよい。これらの基が示す置換基とし
ては、例えば、Ｒ1及びＲ2が示すアルキル基上の置換基
として例示したもの（反応性置換基を含む）を用いるこ
とができる。
子又は一価の置換基を示し、これらのうち隣接する２つ
の基は互いに結合して環を形成してもよい。Ｒ3からＲ
11が示す置換基の種類は特に限定されず、それらは同一
でも異なっていてもよい。これらの基が示す置換基とし
ては、例えば、Ｒ1及びＲ2が示すアルキル基上の置換基
として例示したもの（反応性置換基を含む）を用いるこ
とができる。
【００３６】Ｒ3からＲ11のうち隣接する２つの基は互
いに連結して飽和又は不飽和の環を形成してもよい。形
成される環としては、５〜７員環を挙げることができ
る。不飽和環は縮合芳香族環を形成していてもよい。不
飽和環は酸素原子、窒素原子、硫黄原子等のヘテロ原子
を含んでいてもよい。形成される環の環上の任意の位置
にはＲ1及びＲ2でアルキル基上の置換基として例示した
置換基、又はアルキル基が１又は２個以上置換していて
もよい。
いに連結して飽和又は不飽和の環を形成してもよい。形
成される環としては、５〜７員環を挙げることができ
る。不飽和環は縮合芳香族環を形成していてもよい。不
飽和環は酸素原子、窒素原子、硫黄原子等のヘテロ原子
を含んでいてもよい。形成される環の環上の任意の位置
にはＲ1及びＲ2でアルキル基上の置換基として例示した
置換基、又はアルキル基が１又は２個以上置換していて
もよい。
【００３７】Ｒ3からＲ11の好ましい例としては、例え
ば、水素原子、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、
臭素原子又はヨウ素原子）、−ＳＯ2ＮＨ2、炭素原子数
が１〜６のアルキル基（Ｒ1及びＲ2が示すアルキル基上
の置換基として例示した置換基（反応性置換基を含む）
が任意の位置に置換していてもよい）、炭素原子数が６
〜２０のアリール基（Ｒ1及びＲ2が示すアルキル基上の
置換基（反応性置換基を含む）として例示した置換基が
任意の位置に置換していてもよい）、炭素原子数が１〜
１０のチオアルキル基、炭素原子数が１〜１０のアルキ
ルスルホン基、炭素原子数が１〜１０のアルコキシ基、
置換アミノ基、イソチオシアナート基、イソシアナート
基、サクシンイミジルエステル基、ハロゲン置換トリア
ジニル基、ハロゲン置換ピリミジニル基、スルホニルハ
ライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル基、アジ
リジニル基、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジ
ン、モノ−ないしジハロゲン置換ピリジン、モノ−ない
し−ハロゲン置換ジアジン、酸ハライド、ヒドロキシス
クシンイミドエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミ
ドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、アジドニト
ロフェニル、アジド、３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオンアミド、グリオキサルおよびアルデヒドなどが挙
げられる。本発明では、Ｒ3からＲ9の少なくとも一つ、
又はＲ3からＲ11の少なくとも１つは、水素原子以外で
あることが好ましい。
ば、水素原子、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、
臭素原子又はヨウ素原子）、−ＳＯ2ＮＨ2、炭素原子数
が１〜６のアルキル基（Ｒ1及びＲ2が示すアルキル基上
の置換基として例示した置換基（反応性置換基を含む）
が任意の位置に置換していてもよい）、炭素原子数が６
〜２０のアリール基（Ｒ1及びＲ2が示すアルキル基上の
置換基（反応性置換基を含む）として例示した置換基が
任意の位置に置換していてもよい）、炭素原子数が１〜
１０のチオアルキル基、炭素原子数が１〜１０のアルキ
ルスルホン基、炭素原子数が１〜１０のアルコキシ基、
置換アミノ基、イソチオシアナート基、イソシアナート
基、サクシンイミジルエステル基、ハロゲン置換トリア
ジニル基、ハロゲン置換ピリミジニル基、スルホニルハ
ライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル基、アジ
リジニル基、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジ
ン、モノ−ないしジハロゲン置換ピリジン、モノ−ない
し−ハロゲン置換ジアジン、酸ハライド、ヒドロキシス
クシンイミドエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミ
ドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、アジドニト
ロフェニル、アジド、３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオンアミド、グリオキサルおよびアルデヒドなどが挙
げられる。本発明では、Ｒ3からＲ9の少なくとも一つ、
又はＲ3からＲ11の少なくとも１つは、水素原子以外で
あることが好ましい。
【００３８】上述したような蛍光色素は、本発明の蛍光
ヌクレオチドにおいて蛍光標識成分として使用される。
ヌクレオチドに蛍光色素を蛍光標識として導入するため
の手法は種々知られており、当業者に利用可能な手段を
適宜選択して利用することが可能である。例えば、ヌク
レオチド中のアミノ基、水酸基などの官能基と蛍光色素
中のカルボキシル基、活性エステル基等の反応性置換基
をイオン結合的又は共有結合的に直接結合させるか、あ
るいはヌクレオチドの一部に連結基を導入するなどの化
学修飾を行った後に蛍光色素を反応させればよい。反応
後に生成した蛍光ヌクレオチドは、クロマトグラフィ
ー、電気泳動、再結晶などの汎用の分離技術により精製
することができる。
ヌクレオチドにおいて蛍光標識成分として使用される。
ヌクレオチドに蛍光色素を蛍光標識として導入するため
の手法は種々知られており、当業者に利用可能な手段を
適宜選択して利用することが可能である。例えば、ヌク
レオチド中のアミノ基、水酸基などの官能基と蛍光色素
中のカルボキシル基、活性エステル基等の反応性置換基
をイオン結合的又は共有結合的に直接結合させるか、あ
るいはヌクレオチドの一部に連結基を導入するなどの化
学修飾を行った後に蛍光色素を反応させればよい。反応
後に生成した蛍光ヌクレオチドは、クロマトグラフィ
ー、電気泳動、再結晶などの汎用の分離技術により精製
することができる。
【００３９】本発明はさらに、本発明の蛍光ヌクレオチ
ドの利用にも関する。即ち、本発明の蛍光ヌクレオチド
は核酸の検出のために利用することができる。本発明の
蛍光ヌクレオチドを、核酸の検出などのＤＮＡ解析に用
いる場合には、例えば、ルース（Jerry L. Ｒuth, DNA,
3, 123 (1984)）に記載の方法でプローブ又はプライマ
ーに本発明の蛍光ヌクレオチドを取り込ませることがで
きる。即ち、本発明は、核酸合成酵素と鋳型核酸と本発
明の蛍光ヌクレオチドとを用いて核酸合成反応を行うこ
とを含む、蛍光標識された核酸の調製方法をも提供す
る。
ドの利用にも関する。即ち、本発明の蛍光ヌクレオチド
は核酸の検出のために利用することができる。本発明の
蛍光ヌクレオチドを、核酸の検出などのＤＮＡ解析に用
いる場合には、例えば、ルース（Jerry L. Ｒuth, DNA,
3, 123 (1984)）に記載の方法でプローブ又はプライマ
ーに本発明の蛍光ヌクレオチドを取り込ませることがで
きる。即ち、本発明は、核酸合成酵素と鋳型核酸と本発
明の蛍光ヌクレオチドとを用いて核酸合成反応を行うこ
とを含む、蛍光標識された核酸の調製方法をも提供す
る。
【００４０】本明細書で言う核酸合成酵素の具体例とし
ては、ＤＮＡポリメラーゼ（Klenow酵素、TaqＤＮＡポ
リメラーゼなど全てのＤＮＡポリメラーゼを含む）、Ｒ
ＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素またはターミナルトラン
スフェラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されな
い。鋳型核酸の種類はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、天然
由来のＤＮＡまたはＲＮＡ、組み換えＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、化学合成ＤＮＡまたはＲＮＡの何れでもよい。核酸
合成反応は、例えば、鋳型ＤＮＡ、非蛍光のヌクレオチ
ド混合物、本発明の蛍光ヌクレオチド、および核酸合成
酵素を用いて、酵素反応に適した条件（塩濃度、ｐＨ、
温度など）下において行うことができる。このような核
酸合成法は当業者に周知であり、標識の目的などに応じ
て、使用する材料や試薬などは当業者ならば適宜選択す
ることができる。
ては、ＤＮＡポリメラーゼ（Klenow酵素、TaqＤＮＡポ
リメラーゼなど全てのＤＮＡポリメラーゼを含む）、Ｒ
ＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素またはターミナルトラン
スフェラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されな
い。鋳型核酸の種類はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、天然
由来のＤＮＡまたはＲＮＡ、組み換えＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、化学合成ＤＮＡまたはＲＮＡの何れでもよい。核酸
合成反応は、例えば、鋳型ＤＮＡ、非蛍光のヌクレオチ
ド混合物、本発明の蛍光ヌクレオチド、および核酸合成
酵素を用いて、酵素反応に適した条件（塩濃度、ｐＨ、
温度など）下において行うことができる。このような核
酸合成法は当業者に周知であり、標識の目的などに応じ
て、使用する材料や試薬などは当業者ならば適宜選択す
ることができる。
【００４１】各種方法を用いて本発明の蛍光ヌクレオチ
ドで核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を標識することができ
る。ランダムプライム法はＤＮＡを標識するための一つ
方法であり、任意の組み合わせのヘキサヌクレオチド配
列の混合物をプライマー（ランダムプライマー）として
使用し、このランダムプライマーを標識すべき核酸にハ
イブリダイゼーションさせる。このランダムプライマー
の３’−ＯＨ末端から出発し、１本鎖に相補的な鎖をKl
enow酵素などのＤＮＡポリメラーゼ又は他のＤＮＡポリ
メラーゼを用いて合成するが、その際ＤＮＡポリメラー
ゼの基質である４種のデオキシリボヌクレオチドが相補
鎖中に挿入される。これらのデオキシリボヌクレオチド
の少なくとも１種として本発明の蛍光ヌクレオチドを用
いることにより、蛍光ヌクレオチドで標識された相補的
ＤＮＡが合成される。
ドで核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を標識することができ
る。ランダムプライム法はＤＮＡを標識するための一つ
方法であり、任意の組み合わせのヘキサヌクレオチド配
列の混合物をプライマー（ランダムプライマー）として
使用し、このランダムプライマーを標識すべき核酸にハ
イブリダイゼーションさせる。このランダムプライマー
の３’−ＯＨ末端から出発し、１本鎖に相補的な鎖をKl
enow酵素などのＤＮＡポリメラーゼ又は他のＤＮＡポリ
メラーゼを用いて合成するが、その際ＤＮＡポリメラー
ゼの基質である４種のデオキシリボヌクレオチドが相補
鎖中に挿入される。これらのデオキシリボヌクレオチド
の少なくとも１種として本発明の蛍光ヌクレオチドを用
いることにより、蛍光ヌクレオチドで標識された相補的
ＤＮＡが合成される。
【００４２】ランダムプライマーの代わりに、特異的配
列を有するオリゴＤＮＡ（特異的プライマー）を用いる
ことができる。特異的プライマーは鋳型ＤＮＡ中の相補
的領域に結合し、鋳型ＤＮＡに対する相補的ＤＮＡの合
成は特異的プライマーの３’−ＯＨ末端から開始され
る。ランダムプライム法の場合と同様に、相補的ＤＮＡ
が合成される際に本発明の蛍光ヌクレオチドが取込まれ
ることにより、蛍光標識された相補的ＤＮＡが合成され
る。
列を有するオリゴＤＮＡ（特異的プライマー）を用いる
ことができる。特異的プライマーは鋳型ＤＮＡ中の相補
的領域に結合し、鋳型ＤＮＡに対する相補的ＤＮＡの合
成は特異的プライマーの３’−ＯＨ末端から開始され
る。ランダムプライム法の場合と同様に、相補的ＤＮＡ
が合成される際に本発明の蛍光ヌクレオチドが取込まれ
ることにより、蛍光標識された相補的ＤＮＡが合成され
る。
【００４３】ニックトランスレーション法は、ＤＮアー
ゼＩの２本鎖ＤＮＡへの作用を利用した方法である。Ｄ
ＮアーゼＩの作用により鋳型２本鎖ＤＮＡの１本鎖に切
断される箇所が生じる。同時に大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼＩと、この酵素の基質である４種のデオキシリボヌク
レオチドと、本発明の蛍光ヌクレオチドとを反応混合物
中に添加しておく。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩは、切
断された１本鎖の５’−末端デオキシリボヌクレオシド
を切断し、同時に基質のデオキシリボヌクレオチド１個
を遊離している３’−ＯＨ末端の隣接に挿入する。この
過程を繰り返すことにより切断部位が３’末端に移動し
ていく。基質のヌクレオチド中に本発明の蛍光ヌクレオ
チドを含めることによって、ニックトランスレーション
法を用いて蛍光ＤＮＡが合成することができる。
ゼＩの２本鎖ＤＮＡへの作用を利用した方法である。Ｄ
ＮアーゼＩの作用により鋳型２本鎖ＤＮＡの１本鎖に切
断される箇所が生じる。同時に大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼＩと、この酵素の基質である４種のデオキシリボヌク
レオチドと、本発明の蛍光ヌクレオチドとを反応混合物
中に添加しておく。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩは、切
断された１本鎖の５’−末端デオキシリボヌクレオシド
を切断し、同時に基質のデオキシリボヌクレオチド１個
を遊離している３’−ＯＨ末端の隣接に挿入する。この
過程を繰り返すことにより切断部位が３’末端に移動し
ていく。基質のヌクレオチド中に本発明の蛍光ヌクレオ
チドを含めることによって、ニックトランスレーション
法を用いて蛍光ＤＮＡが合成することができる。
【００４４】２本鎖又は１本鎖ＤＮＡの３’末端を標識
する場合には、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌク
レオチドを３’−ＯＨ末端に結合する酵素であるターミ
ナルトランスフェラーゼを用いることができる。ターミ
ナルトランスフェラーゼは少なくとも１種のデオキシリ
ボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを基質として必要
とする。本発明の蛍光ヌクレオチドをターミナルトラン
スフェラーゼの基質として用いることによって、３’−
ＯＨ末端で伸長された蛍光標識核酸を合成することがで
きる。
する場合には、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌク
レオチドを３’−ＯＨ末端に結合する酵素であるターミ
ナルトランスフェラーゼを用いることができる。ターミ
ナルトランスフェラーゼは少なくとも１種のデオキシリ
ボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを基質として必要
とする。本発明の蛍光ヌクレオチドをターミナルトラン
スフェラーゼの基質として用いることによって、３’−
ＯＨ末端で伸長された蛍光標識核酸を合成することがで
きる。
【００４５】逆転写反応法は１本鎖ＲＮＡから相補的Ｄ
ＮＡを合成する反応である。先ず、プライマーとしてオ
リゴデオキシリボヌクレオチドをＲＮＡの相補的部分に
アニーリングさせた後に、逆転写酵素を用いて伸長反応
を行うことによって、ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖がプ
ライマーの３’−ＯＨ末端から出発して合成される。こ
のＤＮＡ合成においても４種のデオキシリボヌクレオチ
ドが酵素基質として使用され、本発明の蛍光ヌクレオチ
ドをその中に添加しておくことによって逆転写反応中に
蛍光ヌクレオチドが伸長していくＤＮＡ鎖に挿入され、
蛍光標識ＤＮＡが合成される。
ＮＡを合成する反応である。先ず、プライマーとしてオ
リゴデオキシリボヌクレオチドをＲＮＡの相補的部分に
アニーリングさせた後に、逆転写酵素を用いて伸長反応
を行うことによって、ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖がプ
ライマーの３’−ＯＨ末端から出発して合成される。こ
のＤＮＡ合成においても４種のデオキシリボヌクレオチ
ドが酵素基質として使用され、本発明の蛍光ヌクレオチ
ドをその中に添加しておくことによって逆転写反応中に
蛍光ヌクレオチドが伸長していくＤＮＡ鎖に挿入され、
蛍光標識ＤＮＡが合成される。
【００４６】ＤＮＡからＲＮＡを合成する酵素を用い
て、本発明の蛍光ヌクレオチドで標識されたＲＮＡを合
成することもできる。ＤＮＡからＲＮＡを合成する酵素
としては、ＳＰ６、Ｔ３又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼな
どのファージによりコードされるＲＮＡポリメラーゼで
ある。これらの酵素はＳＰ６、Ｔ３又はＴ７プロモータ
ーを含む２本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡ合成のための酵素
であり、基質としての４種類のリボヌクレオチドが使用
される。基質の一つとして本発明の蛍光ヌクレオチドを
使用することによって、蛍光標識されたＲＮＡを合成す
ることができる。
て、本発明の蛍光ヌクレオチドで標識されたＲＮＡを合
成することもできる。ＤＮＡからＲＮＡを合成する酵素
としては、ＳＰ６、Ｔ３又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼな
どのファージによりコードされるＲＮＡポリメラーゼで
ある。これらの酵素はＳＰ６、Ｔ３又はＴ７プロモータ
ーを含む２本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡ合成のための酵素
であり、基質としての４種類のリボヌクレオチドが使用
される。基質の一つとして本発明の蛍光ヌクレオチドを
使用することによって、蛍光標識されたＲＮＡを合成す
ることができる。
【００４７】あるいはまた、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）を用いて本発明の蛍光ヌクレオチドで標識された
核酸を合成することもできる。ＰＣＲでは、生物試料中
の検出すべき核酸は１本鎖に変性され、２種のプライマ
ーがこの一本鎖核酸にアニーリングする。アニーリング
後、ポリメラーゼ(好ましくはTaqＤＮＡポリメラーゼ)
及び酵素基質としてのデオキシリボヌクレオチドにより
伸長反応を行う。プライマーの３’−ＯＨ末端から出発
して相補的ＤＮＡが合成され、二本鎖ＤＮＡが形成され
る。この工程を繰り返すことにより、試料中に含まれる
検出すべきＤＮＡを増幅することができる。TaqＤＮＡ
ポリメラーゼによる伸長反応の際に、基質の一つとして
本発明の蛍光ヌクレオチドを用いることにより、蛍光標
識された増幅核酸が得られる。
ＣＲ）を用いて本発明の蛍光ヌクレオチドで標識された
核酸を合成することもできる。ＰＣＲでは、生物試料中
の検出すべき核酸は１本鎖に変性され、２種のプライマ
ーがこの一本鎖核酸にアニーリングする。アニーリング
後、ポリメラーゼ(好ましくはTaqＤＮＡポリメラーゼ)
及び酵素基質としてのデオキシリボヌクレオチドにより
伸長反応を行う。プライマーの３’−ＯＨ末端から出発
して相補的ＤＮＡが合成され、二本鎖ＤＮＡが形成され
る。この工程を繰り返すことにより、試料中に含まれる
検出すべきＤＮＡを増幅することができる。TaqＤＮＡ
ポリメラーゼによる伸長反応の際に、基質の一つとして
本発明の蛍光ヌクレオチドを用いることにより、蛍光標
識された増幅核酸が得られる。
【００４８】上記のようにして調製された、本発明の蛍
光ヌクレオチドで標識された蛍光核酸は、ハイブリダイ
ゼーションによる相同核酸配列の検出のための遺伝子プ
ローブとして用いることができる。標的核酸のハイブリ
ダイズした蛍光ヌクレオチドは、蛍光強度計で蛍光強度
を測定することにより容易に検出することができる。
光ヌクレオチドで標識された蛍光核酸は、ハイブリダイ
ゼーションによる相同核酸配列の検出のための遺伝子プ
ローブとして用いることができる。標的核酸のハイブリ
ダイズした蛍光ヌクレオチドは、蛍光強度計で蛍光強度
を測定することにより容易に検出することができる。
【００４９】上記で詳述した通り、本発明の蛍光ヌクレ
オチドは遺伝子プローブの標識のために用いることがで
きるので、核酸検出用の試薬または診断薬として有用で
ある。本発明の蛍光ヌクレオチドを核酸検出用の試薬ま
たは診断薬として用いる場合には、１種又は２種以上の
添加物を配合して試薬組成物の形態で供給することがで
きる。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、防腐
剤など適宜の添加物を用いて、溶液剤などの所望の形態
の試薬を調製することができる。試薬の形態およびその
製造方法は、当業者が適宜選択可能である。
オチドは遺伝子プローブの標識のために用いることがで
きるので、核酸検出用の試薬または診断薬として有用で
ある。本発明の蛍光ヌクレオチドを核酸検出用の試薬ま
たは診断薬として用いる場合には、１種又は２種以上の
添加物を配合して試薬組成物の形態で供給することがで
きる。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、防腐
剤など適宜の添加物を用いて、溶液剤などの所望の形態
の試薬を調製することができる。試薬の形態およびその
製造方法は、当業者が適宜選択可能である。
【００５０】本発明の蛍光ヌクレオチドはまた、上記し
た核酸合成反応に使用する酵素、並びに緩衝液などと一
緒に、核酸検出用キットの形態で供給することもでき
る。キットに含めるべき試薬の種類はキットの目的に応
じて適宜選択することができ、蛍光ヌクレオチド、核酸
合成酵素、緩衝液に加えて、１種類以上（好ましくは４
種類）の非蛍光のヌクレオチド混合物、精製水などを挙
げることもできる。また、ランダムプライマー、オリゴ
ｄＴプライマー、あるいは目的に応じた特異的プライマ
ーなどのプライマーをキットに含めることもできる。以
下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明
は実施例によって限定されることはない。本発明の精神
から離れることなく、実施例に記載の材料および方法を
変更、改良又は置換できることは当業者には自明であ
る。
た核酸合成反応に使用する酵素、並びに緩衝液などと一
緒に、核酸検出用キットの形態で供給することもでき
る。キットに含めるべき試薬の種類はキットの目的に応
じて適宜選択することができ、蛍光ヌクレオチド、核酸
合成酵素、緩衝液に加えて、１種類以上（好ましくは４
種類）の非蛍光のヌクレオチド混合物、精製水などを挙
げることもできる。また、ランダムプライマー、オリゴ
ｄＴプライマー、あるいは目的に応じた特異的プライマ
ーなどのプライマーをキットに含めることもできる。以
下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明
は実施例によって限定されることはない。本発明の精神
から離れることなく、実施例に記載の材料および方法を
変更、改良又は置換できることは当業者には自明であ
る。
【００５１】
【実施例】実施例で合成及び使用した化合物（化合物１
〜８）の構造を以下に示す。
〜８）の構造を以下に示す。
【００５２】
【化７】
【００５３】実施例Ａ：化合物１〜４の合成 本発明で使用する化合物は、市販の4置換アニリン誘導
体（４-chloroaniline,4-amino-benzenesulfonamide）
よりフィッシャーらの方法（E. Fisher, O. Hess, Beri
chte, 17, 559(1883)）に従って合成した2,3,3-トリメ
チルインドレニン誘導体を原料として合成した。
体（４-chloroaniline,4-amino-benzenesulfonamide）
よりフィッシャーらの方法（E. Fisher, O. Hess, Beri
chte, 17, 559(1883)）に従って合成した2,3,3-トリメ
チルインドレニン誘導体を原料として合成した。
【００５４】(化合物１の合成)2,3,3‐トリメチルイン
ドレニン‐5‐スルホンアミド9.5g(0.04 mol)に大過剰
のヨウ化エチルを加え24時間還流させた。過剰のヨウ化
エチルをデカンテーションで除いた後、アセトンで繰り
返し洗浄し、N-エチル2,3,3‐トリメチルインドレニウ
ム‐5‐スルホンアミドヨウ素塩(化合物A)を得た。収量
6.8g、収率42％であった。2,3,3‐トリメチルインドレ
ニン‐5‐スルホンアミド9.5g(0.04 mol)に6-ブロモヘ
キサン酸9.8g(0.05mol)及び1,2-ジクロロベンゼン(100m
l)を加え110℃で12時間加熱した。冷却後反応液を減圧
濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ（メタノ
ール/クロロホルム）で精製し、1-(5-カルボキシペンチ
ニル)‐2,3,3‐トリメチルインドレニウム‐5‐スルホ
ンアミド臭素塩(化合物B)を得た。収量9.0g、収率52％
であった。化合物A 2.0g(0.005mol)及び化合物B 2.2g
(0.005mol)をピリジン10mlに溶解し、110℃に加熱した
後、1,3,3-トリメトキシプロペン1.0g(0.0075mol)を加
え1時間加熱反応させた。反応液を減圧濃縮し、クロロ
ホルムに溶解後水洗し、溶液を乾燥、濃縮後シリカゲル
カラムクロマトグラフ（メタノール/クロロホルム）で
精製し、目的の化合物１を得た。黒緑色粉末で、収量66
0mg、収率20％であった。
ドレニン‐5‐スルホンアミド9.5g(0.04 mol)に大過剰
のヨウ化エチルを加え24時間還流させた。過剰のヨウ化
エチルをデカンテーションで除いた後、アセトンで繰り
返し洗浄し、N-エチル2,3,3‐トリメチルインドレニウ
ム‐5‐スルホンアミドヨウ素塩(化合物A)を得た。収量
6.8g、収率42％であった。2,3,3‐トリメチルインドレ
ニン‐5‐スルホンアミド9.5g(0.04 mol)に6-ブロモヘ
キサン酸9.8g(0.05mol)及び1,2-ジクロロベンゼン(100m
l)を加え110℃で12時間加熱した。冷却後反応液を減圧
濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ（メタノ
ール/クロロホルム）で精製し、1-(5-カルボキシペンチ
ニル)‐2,3,3‐トリメチルインドレニウム‐5‐スルホ
ンアミド臭素塩(化合物B)を得た。収量9.0g、収率52％
であった。化合物A 2.0g(0.005mol)及び化合物B 2.2g
(0.005mol)をピリジン10mlに溶解し、110℃に加熱した
後、1,3,3-トリメトキシプロペン1.0g(0.0075mol)を加
え1時間加熱反応させた。反応液を減圧濃縮し、クロロ
ホルムに溶解後水洗し、溶液を乾燥、濃縮後シリカゲル
カラムクロマトグラフ（メタノール/クロロホルム）で
精製し、目的の化合物１を得た。黒緑色粉末で、収量66
0mg、収率20％であった。
【００５５】(化合物２の合成)2,3,3‐トリメチルイン
ドレニン‐5‐クロリド7.7g(0.04 mol)に6-ブロモヘキ
サン酸9.8g(0.05mol)及び1,2-ジクロロベンゼン(100ml)
を加え110℃で12時間加熱した。冷却後反応液を減圧濃
縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ（メタノー
ル/クロロホルム）で精製し、1-(5-カルボキシペンチニ
ル)‐2,3,3‐トリメチルインドレニウム‐5‐クロリド
臭素塩(化合物C)を得た。収量9.3g、収率60％であっ
た。2,3,3‐トリメチルインドレニン‐5‐クロリド7.7g
(0.04 mol)にヨードエトキシエタノール(クロロエトキ
シエタノールをNAI存在下アセトン中で還流してハロゲ
ン交換より合成）10.8g(0.05mol)及び1,2-ジクロロベン
ゼン(100ml)を加え110℃で12時間加熱した。冷却後反応
液を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ
（メタノール/クロロホルム）で精製し、1-(2-ヒドロキ
シエトキシエチル)‐2,3,3‐トリメチルインドレニウム
‐5‐クロリドヨウ素塩(化合物D)を得た。収量7.7g、収
率47％であった。化合物C 1.6g(0.005mol)及び化合物D
1.4 g(0.005mol)をピリジン10mlに溶解し、110℃に加熱
した後、1,3,3-トリメトキシプロペン1.0g(0.0075mol)
を加え1時間加熱反応させた。反応液を減圧濃縮し、ク
ロロホルムに溶解後水洗し、溶液を乾燥、濃縮後シリカ
ゲルカラムクロマトグラフ（メタノール/クロロホル
ム）で精製し、目的の化合物２を得た。黒緑色粉末で、
収量490mg、収率16％であった。
ドレニン‐5‐クロリド7.7g(0.04 mol)に6-ブロモヘキ
サン酸9.8g(0.05mol)及び1,2-ジクロロベンゼン(100ml)
を加え110℃で12時間加熱した。冷却後反応液を減圧濃
縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ（メタノー
ル/クロロホルム）で精製し、1-(5-カルボキシペンチニ
ル)‐2,3,3‐トリメチルインドレニウム‐5‐クロリド
臭素塩(化合物C)を得た。収量9.3g、収率60％であっ
た。2,3,3‐トリメチルインドレニン‐5‐クロリド7.7g
(0.04 mol)にヨードエトキシエタノール(クロロエトキ
シエタノールをNAI存在下アセトン中で還流してハロゲ
ン交換より合成）10.8g(0.05mol)及び1,2-ジクロロベン
ゼン(100ml)を加え110℃で12時間加熱した。冷却後反応
液を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ
（メタノール/クロロホルム）で精製し、1-(2-ヒドロキ
シエトキシエチル)‐2,3,3‐トリメチルインドレニウム
‐5‐クロリドヨウ素塩(化合物D)を得た。収量7.7g、収
率47％であった。化合物C 1.6g(0.005mol)及び化合物D
1.4 g(0.005mol)をピリジン10mlに溶解し、110℃に加熱
した後、1,3,3-トリメトキシプロペン1.0g(0.0075mol)
を加え1時間加熱反応させた。反応液を減圧濃縮し、ク
ロロホルムに溶解後水洗し、溶液を乾燥、濃縮後シリカ
ゲルカラムクロマトグラフ（メタノール/クロロホル
ム）で精製し、目的の化合物２を得た。黒緑色粉末で、
収量490mg、収率16％であった。
【００５６】(化合物３の合成)化合物A 2.0g(0.005mol)
及び化合物B 2.2g(0.005mol)をピリジン10mlに溶解し、
110℃に加熱した後、オルトギ酸トリエチル1.1g(0.0075
mol)を加え1時間加熱反応させた。反応液を減圧濃縮
し、クロロホルムに溶解後水洗し、溶液を乾燥、濃縮後
シリカゲルカラムクロマトグラフ（メタノール/クロロ
ホルム）で精製し、目的の化合物３を得た。黒褐色粉末
で、収量710mg、収率23％であった。
及び化合物B 2.2g(0.005mol)をピリジン10mlに溶解し、
110℃に加熱した後、オルトギ酸トリエチル1.1g(0.0075
mol)を加え1時間加熱反応させた。反応液を減圧濃縮
し、クロロホルムに溶解後水洗し、溶液を乾燥、濃縮後
シリカゲルカラムクロマトグラフ（メタノール/クロロ
ホルム）で精製し、目的の化合物３を得た。黒褐色粉末
で、収量710mg、収率23％であった。
【００５７】(化合物４の合成)化合物C 1.6g(0.005mol)
及び化合物D 1.4 g(0.005mol)をピリジン10mlに溶解
し、110℃に加熱した後、オルトギ酸トリエチル1.1g(0.
0075mol) を加え1時間加熱反応させた。反応液を減圧濃
縮し、クロロホルムに溶解後水洗し、溶液を乾燥、濃縮
後シリカゲルカラムクロマトグラフ（メタノール/クロ
ロホルム）で精製し、目的の化合物４を得た。黒褐色粉
末で、収量540mg、収率18％であった。
及び化合物D 1.4 g(0.005mol)をピリジン10mlに溶解
し、110℃に加熱した後、オルトギ酸トリエチル1.1g(0.
0075mol) を加え1時間加熱反応させた。反応液を減圧濃
縮し、クロロホルムに溶解後水洗し、溶液を乾燥、濃縮
後シリカゲルカラムクロマトグラフ（メタノール/クロ
ロホルム）で精製し、目的の化合物４を得た。黒褐色粉
末で、収量540mg、収率18％であった。
【００５８】実施例Ｂ：化合物５〜８の合成 化合物１〜４のインドレニンシアニンを用い、各化合物
のｄUTP体（化合物５〜８）を合成した。 （化合物５の合成）5.75mg(1.0部)の化合物１に1mlアセ
トニトリル及び0.1MのMES緩衝液2mlを加え溶解し、WSC
塩酸塩2.20mg(1.2部)及びSulfo-NHS 2.52mg(1.2部)を加
え室温で30分間撹拌した。これに、アミノアリル-dUTP
(Sigma)2.2mgを200μlの0.1MのMESに溶解して添加し、
室温で１晩反応させた。1M のTris緩衝液(pH7.5)100μl
を加え反応を停止させた後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ
120A)を充填したカラムに吸着させ、30％メタノール水
溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取クロマ
トグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)により精
製し純度95％の目的物を得た(収率63％)。 MS分析値：M- 1211
のｄUTP体（化合物５〜８）を合成した。 （化合物５の合成）5.75mg(1.0部)の化合物１に1mlアセ
トニトリル及び0.1MのMES緩衝液2mlを加え溶解し、WSC
塩酸塩2.20mg(1.2部)及びSulfo-NHS 2.52mg(1.2部)を加
え室温で30分間撹拌した。これに、アミノアリル-dUTP
(Sigma)2.2mgを200μlの0.1MのMESに溶解して添加し、
室温で１晩反応させた。1M のTris緩衝液(pH7.5)100μl
を加え反応を停止させた後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ
120A)を充填したカラムに吸着させ、30％メタノール水
溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取クロマ
トグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)により精
製し純度95％の目的物を得た(収率63％)。 MS分析値：M- 1211
【００５９】（化合物６の合成）5.40mg(1.0部)の化合
物２を400μlのDMSOに溶解し、WSC塩酸塩1.86mg(1.2部)
及びSulfo-NHS 2.13mg(1.2部)を加え室温で30分間撹拌
した。これに、2mlの0.1MのMESに溶解したアミノアリル
-dUTP(Sigma)2.2mgを添加し、室温で1晩反応させた。1M
のTris緩衝液(pH7.5)100μlを加え反応を停止させた
後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ 120A)を充填したカラム
に吸着させ、40％メタノール水溶液で溶離した。溶離液
を濃縮後さらに中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN U
ltrapack ODS-S-40B)により精製し純度92％の目的物を
得た(収率56％) MS分析値：M- 1182
物２を400μlのDMSOに溶解し、WSC塩酸塩1.86mg(1.2部)
及びSulfo-NHS 2.13mg(1.2部)を加え室温で30分間撹拌
した。これに、2mlの0.1MのMESに溶解したアミノアリル
-dUTP(Sigma)2.2mgを添加し、室温で1晩反応させた。1M
のTris緩衝液(pH7.5)100μlを加え反応を停止させた
後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ 120A)を充填したカラム
に吸着させ、40％メタノール水溶液で溶離した。溶離液
を濃縮後さらに中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN U
ltrapack ODS-S-40B)により精製し純度92％の目的物を
得た(収率56％) MS分析値：M- 1182
【００６０】（化合物７の合成）5.40mg(1.0部)の化合
物３を400μlのDMSOに溶解し、WSC塩酸塩1.86mg(1.2部)
及びSulfo-NHS 2.13mg(1.2部)を加え室温で30分間撹拌
した。これに、2mlの0.1Mの MESに溶解したアミノアリ
ル-dUTP(Sigma)2.2mgを添加し、室温で1晩反応させた。
1MのTris緩衝液(pH7.5)100μlを加え反応を停止させた
後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ 120A)を充填したカラム
に吸着させ、40％メタノール水溶液で溶離した。溶離液
を濃縮後さらに中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN U
ltrapack ODS-S-40B)により精製し純度92％の目的物を
得た(収率49％) MS分析値：M- 1185
物３を400μlのDMSOに溶解し、WSC塩酸塩1.86mg(1.2部)
及びSulfo-NHS 2.13mg(1.2部)を加え室温で30分間撹拌
した。これに、2mlの0.1Mの MESに溶解したアミノアリ
ル-dUTP(Sigma)2.2mgを添加し、室温で1晩反応させた。
1MのTris緩衝液(pH7.5)100μlを加え反応を停止させた
後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ 120A)を充填したカラム
に吸着させ、40％メタノール水溶液で溶離した。溶離液
を濃縮後さらに中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN U
ltrapack ODS-S-40B)により精製し純度92％の目的物を
得た(収率49％) MS分析値：M- 1185
【００６１】（化合物８の合成）2.16mg(1.0部)の化合
物４を200μlのDMSOに溶解し、WSC塩酸塩0.76mg(1.1部)
及びSulfo-NHS 0.86mg(1.1部)を加え室温で30分間撹拌
した。これに、1mlの0.1MのMESに溶解したアミノアリル
-dUTP(Sigma）2.2mgを添加し、室温で1晩反応させた。1
M Tris緩衝液(pH7.5)100μlを加え反応を停止させた
後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ 120A)を充填したカラム
に吸着させ、40％メタノール水溶液で溶離した。溶離液
を濃縮後さらに中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN U
ltrapack ODS-S-40B)により精製し純度95％の目的物を
得た(収率67％) MS分析値：M- 1156
物４を200μlのDMSOに溶解し、WSC塩酸塩0.76mg(1.1部)
及びSulfo-NHS 0.86mg(1.1部)を加え室温で30分間撹拌
した。これに、1mlの0.1MのMESに溶解したアミノアリル
-dUTP(Sigma）2.2mgを添加し、室温で1晩反応させた。1
M Tris緩衝液(pH7.5)100μlを加え反応を停止させた
後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ 120A)を充填したカラム
に吸着させ、40％メタノール水溶液で溶離した。溶離液
を濃縮後さらに中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN U
ltrapack ODS-S-40B)により精製し純度95％の目的物を
得た(収率67％) MS分析値：M- 1156
【００６２】実施例Ｃ：蛍光色素標識ＤＮＡプローブの
作製 実施例Ｃ−１：インドレニンシアニン-dUTP結合体を用
いた蛍光色素ラベル化ＤＮＡプローブの作製 pBlueScriptIISK(+)-α-2-HS-glycoproteinを鋳型とし
てT7 RNA Polymeraseを反応させcRNAを調製した(MEGAsc
ript, Ambion)。cRNAとプライマ−１（配列番号１：TGG
CCGCCTTCAACGCTCAG）混合物に、ＲＮａｓｅＯＵＴ（Gib
co BRL）（４０Ｕ）、ｄＡＴＰ（５００μＭ）、ｄＧＴ
Ｐ（５００μＭ）、ｄＣＴＰ（５００μＭ）、ｄＴＴＰ
（２００μＭ）、実施例Ｂで得た化合物５もしくは化合
物６（１００μＭ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転
写酵素(Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ)（４００Ｕ）、ＤＥＰＣ処
理水（全量２０ｕｌになる量）を添加し、４２℃で２時
間反応させた。反応終了後、ＥＤＴＡ及びＮａＯＨを添
加し６５℃で１時間インキュベートすることで、反応の
停止とcＲＮＡの分解を行った。反応液をＣｅｎｔｒｉ
Ｓｅｐカラム(ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ ＳＥＰＡＲＡＴＩ
ＯＮ，ＩＮＣ)に通し、未反応の化合物５又は化合物６
などを除去して精製した。
作製 実施例Ｃ−１：インドレニンシアニン-dUTP結合体を用
いた蛍光色素ラベル化ＤＮＡプローブの作製 pBlueScriptIISK(+)-α-2-HS-glycoproteinを鋳型とし
てT7 RNA Polymeraseを反応させcRNAを調製した(MEGAsc
ript, Ambion)。cRNAとプライマ−１（配列番号１：TGG
CCGCCTTCAACGCTCAG）混合物に、ＲＮａｓｅＯＵＴ（Gib
co BRL）（４０Ｕ）、ｄＡＴＰ（５００μＭ）、ｄＧＴ
Ｐ（５００μＭ）、ｄＣＴＰ（５００μＭ）、ｄＴＴＰ
（２００μＭ）、実施例Ｂで得た化合物５もしくは化合
物６（１００μＭ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転
写酵素(Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ)（４００Ｕ）、ＤＥＰＣ処
理水（全量２０ｕｌになる量）を添加し、４２℃で２時
間反応させた。反応終了後、ＥＤＴＡ及びＮａＯＨを添
加し６５℃で１時間インキュベートすることで、反応の
停止とcＲＮＡの分解を行った。反応液をＣｅｎｔｒｉ
Ｓｅｐカラム(ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ ＳＥＰＡＲＡＴＩ
ＯＮ，ＩＮＣ)に通し、未反応の化合物５又は化合物６
などを除去して精製した。
【００６３】また、比較用として、化合物５又は化合物
６の代わりにＣｙ５で標識した蛍光ヌクレオチド（Cy5-
dUTP結合体；Amersham pharmacia biotech）を使用して
上記と同様に逆転写反応を行い、反応物を精製した。精
製後の反応液をそれぞれアガロースゲル電気泳動し、Ｓ
ＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏ
ｂｅｓ）で染色後ＦＬＡ２０００(富士写真フイルム)で
励起波長：633nm、検出波長：675nmにてスキャンした。
これらの結果を表１に示す。さらに、FLA2000での画像
を図1に示す。
６の代わりにＣｙ５で標識した蛍光ヌクレオチド（Cy5-
dUTP結合体；Amersham pharmacia biotech）を使用して
上記と同様に逆転写反応を行い、反応物を精製した。精
製後の反応液をそれぞれアガロースゲル電気泳動し、Ｓ
ＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏ
ｂｅｓ）で染色後ＦＬＡ２０００(富士写真フイルム)で
励起波長：633nm、検出波長：675nmにてスキャンした。
これらの結果を表１に示す。さらに、FLA2000での画像
を図1に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】表１及び図１の結果から分かるように、ス
ルホン酸基を有さない化合物５、化合物６の方が、スル
ホン酸基を２個持つCy5-dUTP結合体よりも優位に蛍光強
度が高いことが分かった。即ち、スルホン酸基の数が少
ない方が蛍光強度が高く、分子量や親水基の寄与よりも
電荷を減らす効果の方が大きいことがわかった。
ルホン酸基を有さない化合物５、化合物６の方が、スル
ホン酸基を２個持つCy5-dUTP結合体よりも優位に蛍光強
度が高いことが分かった。即ち、スルホン酸基の数が少
ない方が蛍光強度が高く、分子量や親水基の寄与よりも
電荷を減らす効果の方が大きいことがわかった。
【００６６】実施例Ｃ−２：インドレニンシアニン-dUT
P結合体を用いた蛍光色素ラベル化ＤＮＡプローブの作
製 pBlueScriptIISK(+)-α-2-HS-glycoproteinを鋳型とし
てT7 RNA Polymeraseを反応させcRNAを調製した(MEGAsc
ript, Ambion)。cRNAとプライマ−1（配列番号１：TGGC
CGCCTTCAACGCTCAG）混合物に、ＲＮａｓｅＯＵＴ（Gibc
o BRL）（４０Ｕ）、ｄＡＴＰ（５００μＭ）、ｄＧＴ
Ｐ（５００μＭ）、ｄＣＴＰ（５００μＭ）、ｄＴＴＰ
（２００μＭ）、化合物７もしくは化合物８（１００μ
Ｍ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素(Ｇｉｂ
ｃｏ ＢＲＬ)（４００Ｕ）、ＤＥＰＣ処理水（全量２
０ｕｌになる量）を添加し、４２℃で２時間反応させ
た。反応終了後、ＥＤＴＡ及びＮａＯＨを添加し６５℃
で１時間インキュベートすることで、反応の停止とcＲ
ＮＡの分解を行った。反応液をＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラ
ム(ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ，ＩＮ
Ｃ)に通し、未反応の化合物７又は化合物８などを除去
して精製した。
P結合体を用いた蛍光色素ラベル化ＤＮＡプローブの作
製 pBlueScriptIISK(+)-α-2-HS-glycoproteinを鋳型とし
てT7 RNA Polymeraseを反応させcRNAを調製した(MEGAsc
ript, Ambion)。cRNAとプライマ−1（配列番号１：TGGC
CGCCTTCAACGCTCAG）混合物に、ＲＮａｓｅＯＵＴ（Gibc
o BRL）（４０Ｕ）、ｄＡＴＰ（５００μＭ）、ｄＧＴ
Ｐ（５００μＭ）、ｄＣＴＰ（５００μＭ）、ｄＴＴＰ
（２００μＭ）、化合物７もしくは化合物８（１００μ
Ｍ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素(Ｇｉｂ
ｃｏ ＢＲＬ)（４００Ｕ）、ＤＥＰＣ処理水（全量２
０ｕｌになる量）を添加し、４２℃で２時間反応させ
た。反応終了後、ＥＤＴＡ及びＮａＯＨを添加し６５℃
で１時間インキュベートすることで、反応の停止とcＲ
ＮＡの分解を行った。反応液をＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラ
ム(ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ，ＩＮ
Ｃ)に通し、未反応の化合物７又は化合物８などを除去
して精製した。
【００６７】また、比較用として、化合物７又は化合物
８の代わりにＣｙ３で標識した蛍光ヌクレオチド（Cy3-
dUTP結合体；Amersham pharmacia biotech）を使用して
上記と同様に逆転写反応を行い、反応物を精製した。精
製後の反応液をそれぞれアガロースゲル電気泳動し、Ｓ
ＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏ
ｂｅｓ）で染色後ＦＬＡ２０００(富士写真フイルム)で
励起波長：532nm、検出波長：580nmにてスキャンした。
これらの結果を表２に示す。さらに、FLA2000での画像
を図２に示す。
８の代わりにＣｙ３で標識した蛍光ヌクレオチド（Cy3-
dUTP結合体；Amersham pharmacia biotech）を使用して
上記と同様に逆転写反応を行い、反応物を精製した。精
製後の反応液をそれぞれアガロースゲル電気泳動し、Ｓ
ＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏ
ｂｅｓ）で染色後ＦＬＡ２０００(富士写真フイルム)で
励起波長：532nm、検出波長：580nmにてスキャンした。
これらの結果を表２に示す。さらに、FLA2000での画像
を図２に示す。
【００６８】
【表２】
【００６９】表２及び図２の結果から分かるように、ス
ルホン酸基を有さない化合物７、化合物８の方が、スル
ホン酸基を２個持つCy3-dUTP結合体よりも優位に蛍光強
度が高いことが分かった。即ち、スルホン酸基の数が少
ない方が蛍光強度が高く、分子量や親水基の寄与よりも
電荷を減らす効果の方が大きいことがわかった。
ルホン酸基を有さない化合物７、化合物８の方が、スル
ホン酸基を２個持つCy3-dUTP結合体よりも優位に蛍光強
度が高いことが分かった。即ち、スルホン酸基の数が少
ない方が蛍光強度が高く、分子量や親水基の寄与よりも
電荷を減らす効果の方が大きいことがわかった。
【００７０】
【発明の効果】本発明により、核酸の標識のために有効
な蛍光ヌクレオチド、特には核酸合成反応の際における
取り込み効率の高い蛍光ヌクレオチドを提供することが
可能になった。
な蛍光ヌクレオチド、特には核酸合成反応の際における
取り込み効率の高い蛍光ヌクレオチドを提供することが
可能になった。
【００７１】
SEQUENCE LISTING <110> Fuji Photo Film Co.Ltd., <120> Fluorescent Nucleotide <130> A01180MA <160> 1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial DNA <400> 1 tggccgcctt caacgctcag 20
【図１】図１は、インドレニンシアニン-dUTP結合体
（化合物５及び化合物６）を用いた蛍光色素ラベル化Ｄ
ＮＡプローブをアガロースゲル電気泳動し、ＳＹＢＲ
ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）
で染色後ＦＬＡ２０００(富士写真フイルム)で励起波
長：532nm、検出波長：580nmにてスキャンした結果を示
す。
（化合物５及び化合物６）を用いた蛍光色素ラベル化Ｄ
ＮＡプローブをアガロースゲル電気泳動し、ＳＹＢＲ
ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）
で染色後ＦＬＡ２０００(富士写真フイルム)で励起波
長：532nm、検出波長：580nmにてスキャンした結果を示
す。
【図２】図２は、インドレニンシアニン-dUTP結合体
（化合物７及び化合物８）を用いた蛍光色素ラベル化Ｄ
ＮＡプローブをアガロースゲル電気泳動し、ＳＹＢＲ
ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）
で染色後ＦＬＡ２０００(富士写真フイルム)で励起波
長：532nm、検出波長：580nmにてスキャンした結果を示
す。
（化合物７及び化合物８）を用いた蛍光色素ラベル化Ｄ
ＮＡプローブをアガロースゲル電気泳動し、ＳＹＢＲ
ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）
で染色後ＦＬＡ２０００(富士写真フイルム)で励起波
長：532nm、検出波長：580nmにてスキャンした結果を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ ４Ｃ２０４ Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｃ０７Ｄ 209/08 // Ｃ０７Ｄ 209/08 209/30 209/30 403/06 403/06 403/14 403/14 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 小島 政芳 埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士写 真フイルム株式会社朝霞研究所内 (72)発明者 須藤 幸夫 埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士写 真フイルム株式会社朝霞研究所内 (72)発明者 瀬志本 修 埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士写 真フイルム株式会社朝霞研究所内 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA12 DA13 DA14 FB07 FB12 GC15 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 HA13 HA20 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR42 QR56 QR62 QS03 QS16 QS20 QS25 QS34 QX02 4C057 BB02 BB03 BB04 BB05 LL08 LL18 LL19 LL21 LL22 LL27 LL41 LL42 LL44 LL45 MM01 MM02 MM04 MM05 MM09 4C063 AA01 BB03 CC29 DD06 EE01 4C204 BB01 CB03 DB13 EB10 FB19 GB24 GB29
Claims (16)
- 【請求項１】 式：Ａ−Ｂ−Ｃ で表される蛍光ヌクレオチド。［式中、Ａは天然又は合
成のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレ
オチドあるいはそれらの誘導体の残基を示し、上記残基
中の塩基部分でＢと結合し、Ｂは２価の連結基または単
結合を示し、Ｃは、分子内に０ないし１個のスルホン酸
基またはリン酸基を有する蛍光色素から誘導される１価
の基を示す。］ - 【請求項２】式：Ａ−Ｂ−Ｃ で表される蛍光ヌクレオチド。［式中、Ａは天然又は合
成のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレ
オチドあるいはそれらの誘導体の残基を示し、上記残基
中の塩基部分でＢと結合し、Ｂは２価の連結基または単
結合を示し、Ｃは分子内にスルホン酸基、リン酸基、カ
ルボン酸基以外の水溶性基を有する蛍光色素から誘導さ
れる１価の基を示す。］ - 【請求項３】 蛍光色素がシアニン、メロシアニン又は
スチリル蛍光色素である、請求項１又は２に記載の蛍光
ヌクレオチド。 - 【請求項４】 シアニン、メロシアニン又はスチリル蛍
光色素が以下の一般式で表される構造を有する蛍光色素
である、請求項３に記載の蛍光ヌクレオチド。 【化１】 ［式中、ＸおよびＹはそれぞれ独立にＯ、ＳおよびＣ
（ＣＨ3）2よりなる群から選ばれ、ｍは１、２、３およ
び４よりなる群から選ばれる整数であり、Ｒ1及びＲ2は
それぞれ独立に水素原子、又はＢと共有結合し得る反応
性基で置換されていてもよいアルキル基を示し、該アル
キル基のアルキル鎖中には酸素原子又は硫黄原子が介在
していてもよく、Ｒ1及びＲ2の少なくとも片方はＢと共
有結合し得る反応性基で置換されていてもよいアルキル
基を示す。Ｒ3からＲ9はそれぞれ独立して水素原子又は
一価の置換基を示し、これらのうち隣接する２つの基は
互いに結合して環を形成してもよい。点線はそれぞれ前
記シアニン、メロシアニンおよびスチリル蛍光色素を形
成するのに必要な炭素原子を表す。］ - 【請求項５】 シアニン、メロシアニン又はスチリル蛍
光色素が以下の一般式で表される構造を有する蛍光色素
である、請求項３又は４に記載の蛍光ヌクレオチド。 【化２】 ［式中、ＸおよびＹはそれぞれ独立にＯ、ＳおよびＣ
（ＣＨ3）2よりなる群から選ばれ、ＺはＯおよびＳより
なる群から選ばれ、ｍは１、２、３および４よりなる群
から選ばれる整数であり、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に
水素原子、又はＢと共有結合し得る反応性基で置換され
ていてもよいアルキル基を示し、該アルキル基のアルキ
ル鎖中には酸素原子又は硫黄原子が介在していてもよ
く、Ｒ1及びＲ2の少なくとも片方はＢと共有結合し得る
反応性基で置換されていてもよいアルキル基を示す。Ｒ
3からＲ11はそれぞれ独立して、水素原子又は一価の置
換基を示し、これらのうち隣接する２つの基は互いに結
合して環を形成してもよい。］ - 【請求項６】 Ｒ1及びＲ2の少なくとも１つが、基Ｂ中
のアミノ基、ヒドロキシル基、又はチオール基と共有結
合し得る活性エステル基で置換されたアルキル基であ
る、請求項４又は５に記載の蛍光ヌクレオチド。 - 【請求項７】 Ｒ1及びＲ2の少なくとも１つが、カルボ
キシル基で置換されたアルキル基である請求項４または
５に記載の蛍光ヌクレオチド。 - 【請求項８】 Ａがヌクレオチドあるいはそれらの誘導
体の残基である、請求項１から７の何れか１項に記載の
蛍光ヌクレオチド。 - 【請求項９】 Ａが（１）ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、Ｇ
ＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭ
Ｐ、ＵＤＰ ＵＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍ
ｅ−ＡＭＰ、２−Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１
−Ｍｅ−ＧＭＰ、１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴ
Ｐ、５−Ｍｅ−ＣＭＰ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−
ＣＴＰ、５−ＭｅＯ−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５
−ＭｅＯ−ＣＴＰから成るヌクレオチドから成る群、
（２）前記ヌクレオチドに対応するデオキシヌクレオチ
ドおよびジデオキシヌクレオチドから成る群、並びに
（３）前記（１）および（２）に記載のヌクレオチドか
らさらに誘導される誘導体、から成る群から選ばれる天
然又は合成のヌクレオチド又はその誘導体の残基を示
す、請求項１から８の何れか１項に記載の蛍光ヌクレオ
チド。 - 【請求項１０】 Ｂが−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−
Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−または
これらの組み合わせから成る連結基であって、連結基上
の水素原子は置換基でさらに置換されていてもよい連結
基である、請求項１から９の何れか１項に記載の蛍光ヌ
クレオチド。 - 【請求項１１】 Ｂがアミノアリル基である、請求項１
から１０の何れか１項に記載の蛍光ヌクレオチド。 - 【請求項１２】 核酸合成酵素と鋳型核酸と請求項１か
ら１１の何れか１項に記載の蛍光ヌクレオチドとを用い
て核酸合成反応を行うことを含む、蛍光標識された核酸
の調製方法。 - 【請求項１３】 核酸合成反応が、逆転写反応、ターミ
ナルトランスフェラーゼ反応、ランダムプライム法、Ｐ
ＣＲ法またはニックトランスレーション法から成る群か
ら選ばれる反応である、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 請求項１から１１の何れか１項に記載
の蛍光ヌクレオチドで標識された核酸プローブまたはプ
ライマー。 - 【請求項１５】 請求項１から１１の何れか１項に記載
の蛍光ヌクレオチドから成る核酸検出用試薬または診断
薬。 - 【請求項１６】 （１）請求項１から１１の何れか１項
に記載の蛍光ヌクレオチド、（２）核酸合成酵素および
（３）緩衝液を含む、核酸検出用キット。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000107675A JP2001288197A (ja) | 2000-04-10 | 2000-04-10 | 蛍光ヌクレオチド |
| US09/829,467 US7109314B2 (en) | 2000-04-10 | 2001-04-09 | Fluorescent nucleotides |
| EP01107864A EP1152008B1 (en) | 2000-04-10 | 2001-04-10 | Fluorescent nucleotides containing a cyanine, merocyanine or styryl dye for the detection of nucleic acid |
| DE60108799T DE60108799T2 (de) | 2000-04-10 | 2001-04-10 | Fluoreszente Nucleotide, enthaltend einen Cyanin, Merocyanin- oder Styryl-Farbstoff, zur Erkennung von Nucleinsäuren |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000107675A JP2001288197A (ja) | 2000-04-10 | 2000-04-10 | 蛍光ヌクレオチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001288197A true JP2001288197A (ja) | 2001-10-16 |
Family
ID=18620635
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000107675A Pending JP2001288197A (ja) | 2000-04-10 | 2000-04-10 | 蛍光ヌクレオチド |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7109314B2 (ja) |
| EP (1) | EP1152008B1 (ja) |
| JP (1) | JP2001288197A (ja) |
| DE (1) | DE60108799T2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005062046A1 (ja) * | 2003-12-24 | 2005-07-07 | Shinichiro Isobe | 生体分子の検出方法及びそれに用いる標識色素並びに標識キット |
| US7015002B2 (en) | 2003-12-24 | 2006-03-21 | Shinichiro Isobe | Method of detecting biological molecules, and labeling dye and labeling kit used for the same |
| JP2008501679A (ja) * | 2004-06-02 | 2008-01-24 | エーエスエム サイエンティフィック， インコーポレイテッド | ２’−ニトロベンジル改変型リボヌクレオチド |
| JP2008538382A (ja) * | 2005-04-22 | 2008-10-23 | ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド | 反応性蛍光標識試薬としての水溶性フルオロ置換シアニン色素 |
| WO2010010966A1 (ja) * | 2008-07-24 | 2010-01-28 | 国立大学法人九州大学 | ヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブの製造方法および標的核酸の検出方法 |
| JP2011026324A (ja) * | 2008-07-24 | 2011-02-10 | Kyushu Univ | 酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸誘導体 |
| JP2011169878A (ja) * | 2010-01-22 | 2011-09-01 | Kyushu Univ | 核酸検出用キット |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003035865A1 (en) * | 2001-10-22 | 2003-05-01 | Takara Bio Inc. | Method of labeling nucleic acids |
| JP2003261464A (ja) * | 2002-03-07 | 2003-09-16 | Fuji Photo Film Co Ltd | 近赤外蛍光造影剤および蛍光造影法 |
| US20040175717A1 (en) * | 2002-06-20 | 2004-09-09 | North Carolina State University | Methods and kits for labeling and hybridizing cDNA for microarray analysis |
| US7939613B2 (en) * | 2005-04-22 | 2011-05-10 | The Hong Kong University Of Science And Technology | Fluorescent water-soluble conjugated polyene compounds that exhibit aggregation induced emission and methods of making and using same |
| JP5638734B2 (ja) * | 2005-07-28 | 2014-12-10 | 信一郎 礒部 | 生体分子用標識色素及び標識キット並びに生体分子の検出方法 |
| US8119816B2 (en) * | 2005-10-13 | 2012-02-21 | Taiwan Fluoro Technology Co., Ltd. | Merocyanine dye and use thereof |
| ITSV20060002A1 (it) | 2006-01-19 | 2007-07-20 | Ferrania Technologies Spa | Colorante fluorescente di tipo cianinico |
| EP2655327B1 (en) * | 2010-12-21 | 2016-02-24 | Pierce Biotechnology, Inc. | Fluorescent compounds |
| US8889884B1 (en) | 2011-07-14 | 2014-11-18 | Pierce Biotechnology, Inc. | Phosphine derivatives of fluorescent compounds |
| US9249307B2 (en) | 2011-08-16 | 2016-02-02 | Pierce Biotechnology, Inc. | Benzocyanine compounds |
| US9751868B2 (en) | 2012-02-28 | 2017-09-05 | Pierce Biotechnology, Inc. | Benzocyanine compounds |
| CN104395306B (zh) | 2012-03-02 | 2019-04-23 | 皮尔斯生物科技有限公司 | 作为生物分子的标记染料的吲哚衍生物 |
| US9676787B2 (en) | 2012-08-28 | 2017-06-13 | Pierce Biotechnology, Inc. | Benzopyrylium compounds |
| GB201408077D0 (en) | 2014-05-07 | 2014-06-18 | Illumina Cambridge Ltd | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels |
| KR101880502B1 (ko) * | 2016-04-20 | 2018-08-20 | 에스에프씨 주식회사 | 메로시아닌계 화합물, 이를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물 |
| RU2637310C1 (ru) * | 2016-06-08 | 2017-12-04 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Флуоресцентно-меченые дезоксиуридинтрифосфаты |
| WO2019078513A1 (ko) * | 2017-10-17 | 2019-04-25 | 에스에프씨 주식회사 | 메로시아닌계 화합물, 이를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물 |
| RU2725884C2 (ru) * | 2017-11-21 | 2020-07-07 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Дезоксиуридинтрифосфаты, маркированные цвитерионными индоцианиновыми красителями |
| WO2019164977A1 (en) | 2018-02-21 | 2019-08-29 | Singular Genomics Systems, Inc. | Fluorinated nucleotides and uses thereof |
| US12145960B2 (en) | 2018-10-25 | 2024-11-19 | Singular Genomics Systems, Inc. | Nucleotide analogues |
| EP4117682B1 (en) * | 2020-04-24 | 2025-06-04 | Singular Genomics Systems, Inc. | Modified nucleotides and uses thereof |
| WO2023107673A2 (en) | 2021-12-10 | 2023-06-15 | Singular Genomics Systems, Inc. | Cleavable disulfide linkers and uses thereof |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01280750A (ja) * | 1988-05-07 | 1989-11-10 | Konica Corp | ハロゲン化銀写真感光材料 |
| JPH02191674A (ja) * | 1988-09-02 | 1990-07-27 | Carnegie Mellon Univ | 発光アリールスルホネートシアニン染料を用いた物質の標識ないし検出方法 |
| JPH05286953A (ja) * | 1992-04-09 | 1993-11-02 | Fuji Photo Film Co Ltd | メチン化合物 |
| JPH06222059A (ja) * | 1993-01-28 | 1994-08-12 | Ibiden Co Ltd | 蛍光標識試薬および蛍光免疫測定法 |
| JPH0727768A (ja) * | 1993-07-08 | 1995-01-31 | Canon Inc | 色素標識化核酸プローブの製造方法及び該核酸プローブ形成用中間体 |
| JPH07103983A (ja) * | 1993-10-04 | 1995-04-21 | Canon Inc | 核酸検出法 |
| JPH07145148A (ja) * | 1992-06-02 | 1995-06-06 | Bio Sensor Kenkyusho:Kk | ポリメチン系化合物およびそれを用いる測定方法 |
| JPH09124599A (ja) * | 1995-01-30 | 1997-05-13 | Doujin Kagaku Kenkyusho:Kk | インドシアニン化合物 |
| JPH09127115A (ja) * | 1995-01-30 | 1997-05-16 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 診断用マーカー |
| JPH10504974A (ja) * | 1995-01-18 | 1998-05-19 | フアーマシア バイオテツク インコーポレーテツド | 標識ヌクレオシド三リン酸を安定化する方法及び組成物 |
| WO1998030992A2 (en) * | 1997-01-10 | 1998-07-16 | Li-Cor, Inc. | Fluorescent cyanine dyes |
| WO1998058942A1 (en) * | 1997-06-20 | 1998-12-30 | Amersham Pharmacia Biotech Inc. | Non-sulfonated cyanine dyes for labeling nucleosides and nucleotides |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1219824A (en) | 1981-04-17 | 1987-03-31 | David C. Ward | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| US5268486A (en) | 1986-04-18 | 1993-12-07 | Carnegie-Mellon Unversity | Method for labeling and detecting materials employing arylsulfonate cyanine dyes |
| US5569587A (en) | 1986-04-18 | 1996-10-29 | Carnegie Mellon University | Method for labeling and detecting materials employing luminescent arysulfonate cyanine dyes |
| DE3813278A1 (de) | 1988-01-12 | 1989-07-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis von nukleinsaeuren |
| US5808044A (en) | 1993-01-22 | 1998-09-15 | Pharmacia Biotech Inc. | Indocarbocyanine and benzindocarbocyanine phosphoramidites |
| JP3260884B2 (ja) | 1993-02-05 | 2002-02-25 | キヤノン株式会社 | 標識複合体、それを用いる分析法、生体関連物質の検出および定量の方法 |
| US5986093A (en) * | 1995-06-07 | 1999-11-16 | Carnegie Mellon University | Monomethine cyanines rigidized by a two-carbon chain |
| US5719031A (en) * | 1996-08-14 | 1998-02-17 | Molecular Probes, Inc. | Dye labeled polymers as reagents for measuring polymer degradation |
| US6130101A (en) * | 1997-09-23 | 2000-10-10 | Molecular Probes, Inc. | Sulfonated xanthene derivatives |
| ATE435262T1 (de) * | 1999-07-02 | 2009-07-15 | Visen Medical Inc | Fluoreszierende cyaninlabels mit einem sulphamidobrückenglied |
-
2000
- 2000-04-10 JP JP2000107675A patent/JP2001288197A/ja active Pending
-
2001
- 2001-04-09 US US09/829,467 patent/US7109314B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-04-10 EP EP01107864A patent/EP1152008B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-10 DE DE60108799T patent/DE60108799T2/de not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01280750A (ja) * | 1988-05-07 | 1989-11-10 | Konica Corp | ハロゲン化銀写真感光材料 |
| JPH02191674A (ja) * | 1988-09-02 | 1990-07-27 | Carnegie Mellon Univ | 発光アリールスルホネートシアニン染料を用いた物質の標識ないし検出方法 |
| JPH05286953A (ja) * | 1992-04-09 | 1993-11-02 | Fuji Photo Film Co Ltd | メチン化合物 |
| JPH07145148A (ja) * | 1992-06-02 | 1995-06-06 | Bio Sensor Kenkyusho:Kk | ポリメチン系化合物およびそれを用いる測定方法 |
| JPH06222059A (ja) * | 1993-01-28 | 1994-08-12 | Ibiden Co Ltd | 蛍光標識試薬および蛍光免疫測定法 |
| JPH0727768A (ja) * | 1993-07-08 | 1995-01-31 | Canon Inc | 色素標識化核酸プローブの製造方法及び該核酸プローブ形成用中間体 |
| JPH07103983A (ja) * | 1993-10-04 | 1995-04-21 | Canon Inc | 核酸検出法 |
| JPH10504974A (ja) * | 1995-01-18 | 1998-05-19 | フアーマシア バイオテツク インコーポレーテツド | 標識ヌクレオシド三リン酸を安定化する方法及び組成物 |
| JPH09124599A (ja) * | 1995-01-30 | 1997-05-13 | Doujin Kagaku Kenkyusho:Kk | インドシアニン化合物 |
| JPH09127115A (ja) * | 1995-01-30 | 1997-05-16 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 診断用マーカー |
| WO1998030992A2 (en) * | 1997-01-10 | 1998-07-16 | Li-Cor, Inc. | Fluorescent cyanine dyes |
| WO1998058942A1 (en) * | 1997-06-20 | 1998-12-30 | Amersham Pharmacia Biotech Inc. | Non-sulfonated cyanine dyes for labeling nucleosides and nucleotides |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7662555B2 (en) | 2003-12-24 | 2010-02-16 | Shinichiro Isobe | Method for detecting biomolecule, labeling dye used therefore, and labeling kit |
| US7015002B2 (en) | 2003-12-24 | 2006-03-21 | Shinichiro Isobe | Method of detecting biological molecules, and labeling dye and labeling kit used for the same |
| JPWO2005062046A1 (ja) * | 2003-12-24 | 2007-12-13 | 信一郎 礒部 | 生体分子の検出方法及びそれに用いる標識色素並びに標識キット |
| WO2005062046A1 (ja) * | 2003-12-24 | 2005-07-07 | Shinichiro Isobe | 生体分子の検出方法及びそれに用いる標識色素並びに標識キット |
| JP4801445B2 (ja) * | 2003-12-24 | 2011-10-26 | 信一郎 礒部 | 生体分子の検出方法及びそれに用いる標識色素並びに標識キット |
| JP2008501679A (ja) * | 2004-06-02 | 2008-01-24 | エーエスエム サイエンティフィック， インコーポレイテッド | ２’−ニトロベンジル改変型リボヌクレオチド |
| JP2012095665A (ja) * | 2004-06-02 | 2012-05-24 | Twistdx Inc | ２’−ニトロベンジル改変型リボヌクレオチド |
| JP2008538382A (ja) * | 2005-04-22 | 2008-10-23 | ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド | 反応性蛍光標識試薬としての水溶性フルオロ置換シアニン色素 |
| WO2010010966A1 (ja) * | 2008-07-24 | 2010-01-28 | 国立大学法人九州大学 | ヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブの製造方法および標的核酸の検出方法 |
| JP2010047559A (ja) * | 2008-07-24 | 2010-03-04 | Kyushu Univ | 酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸、核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブの製造方法および標的核酸の検出方法 |
| JP2011026324A (ja) * | 2008-07-24 | 2011-02-10 | Kyushu Univ | 酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸誘導体 |
| US8198418B2 (en) | 2008-07-24 | 2012-06-12 | Kyushu University, National University Corporation | Nucleoside triphosphate derivative, nucleic acid probe, multilabeled nucleic acid probe, method for production of multilabeled nucleic acid probe, and method for detection of target nucleic acid |
| JP2011169878A (ja) * | 2010-01-22 | 2011-09-01 | Kyushu Univ | 核酸検出用キット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60108799T2 (de) | 2006-04-27 |
| US20020064782A1 (en) | 2002-05-30 |
| EP1152008A3 (en) | 2002-03-20 |
| EP1152008B1 (en) | 2005-02-09 |
| US7109314B2 (en) | 2006-09-19 |
| DE60108799D1 (de) | 2005-03-17 |
| EP1152008A2 (en) | 2001-11-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2001288197A (ja) | 蛍光ヌクレオチド | |
| JP5518428B2 (ja) | リアルタイム核酸検出法と組成物 | |
| US6201112B1 (en) | Method for 3′ end-labeling ribonucleic acids | |
| JP4551063B2 (ja) | 標識試薬と標識された標的、標的標識法、および核酸の測定と分析におけるこれらの使用のための他の方法 | |
| AU2007315190B2 (en) | Click chemistry for the production of reporter molecules | |
| AU2013380645B2 (en) | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels | |
| CN119301275A (zh) | 用于核酸测序的组合物和方法 | |
| JP4676654B2 (ja) | 蛍光ヌクレオチド及びそれを用いた標識法 | |
| FR2824335A1 (fr) | Procede de marquage et de fragmentation d'adn | |
| US9156987B2 (en) | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels | |
| AU2015257477B2 (en) | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels | |
| EP1106621B1 (en) | Fluorescent substances | |
| FR2824323A1 (fr) | Reactif de marquage et procede de detection de molecules biologiques | |
| EP1025115B1 (fr) | Nouveaux conjugues fluorescents de nucleosides ou de nucleotides, leur procede de preparation et leurs utilisations | |
| EP2768306B1 (en) | Fluorescent dyes | |
| JP5975524B2 (ja) | 化合物、核酸、核酸の製造方法および核酸を製造するためのキット | |
| JP2003034697A (ja) | 蛍光ヌクレオチド及びそれを用いた標識法 | |
| JP2003034695A (ja) | 蛍光ヌクレオチド及びそれを用いた標識法 | |
| JP2001163895A (ja) | 蛍光ヌクレオチド | |
| US7741294B1 (en) | Non-standard nucleobases implementing the isocytidine and isoguanosine hydrogen bonding patterns |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050920 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20070116 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090623 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090819 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100420 |