JP2001278894A

JP2001278894A - 血液循環障害予防および／または治療用医薬用組成物並びにその有効成分であるペプチド

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Publication number: JP2001278894A
Application number: JP2000091867A
Authority: JP
Inventors: Osamu Ozawa; 修小澤; Hiroyuki Matsuno; 浩之松野; Masayuki Niwa; 雅之丹羽; Kanefusa Kato; 兼房加藤; Toshihiko Uematsu; 俊彦植松
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-03-29
Filing date: 2000-03-29
Publication date: 2001-10-10

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒトのストレス蛋白質の１種として知られて
いるＨＳＰ２０ペプチドと共通の構造を有するペプチド
を有効成分とする循環器障害、脳血管障害、末梢血管障
害等に有効な医薬用組成物の提供。【解決手段】ヒトＨＳＰ２０のＮＨ₂−末端から１６
番目に位置するセリンを中心として同セリンから−５な
いし＋６に位置するアミノ酸配列、あるいはＨＳＰ２０
と高い相同性を示すαＢクリスタリンのアミノ酸配列の
ＮＨ₂−末端から９番目に位置するトリプトファンから
始まるアミノ酸配列の内、ある種のアミノ酸配列が高い
血小板凝集抑制作用、および／またはプロトロンビン刺
激による血液凝固時間を延長する作用を有することを見
出して、上記課題を達成。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、循環器障害、脳
血管障害、末梢血管障害等に有効な医薬用組成物、特
に、ヒトのストレス蛋白質の１種として知られているヒ
トＨＳＰ２０の一部のペプチドと共通の構造を有するペ
プチドを有効成分とする医薬用組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、ストレス蛋白質（ヒートショッ
クプロテイン）は、細胞内で分子シャペロンとして作用
すると考えられていた。一方、ヒト由来の分子量２０キ
ロダルトンの蛋白質であるＨＳＰ２０を新たな低分子量
ＨＳＰとして精製し、その特質を同定し、そのアミノ酸
配列を報告している（Kato, K., et al.,J. Biol. Che
m. 269 : 15302-15309, 1994:文献１）。さらに、血管
平滑筋細胞における環状ヌクレオチド依存性の弛緩作用
に、ある種の分子量２０キロダルトンからなる蛋白質の
リン酸化が関与していること知られていたが、その正体
はＨＳＰ２０であることがA. C. Beall等により明らか
とされた（Beall, A. C., etal., J. Biol. Chem. 272
: 11283-11287, 1997:文献２）。本発明者等は、ヒト
ＨＳＰ２０が、細胞外において、ボトロセチン(Botroce
tin)やトロンビン(thrombin)に誘導された血小板凝集作
用を阻害する作用を有することを既に報告している（Ma
tsuno, H. et al., FEBS Letters,429:327-329,1998：
文献３）。しかし、同時に使用した低分子量ＨＳＰの１
種であるＨＳＰ２７は、活性を示さなかった。

【０００３】その後の研究によれば、ＨＳＰ２０を構
成するペプチドの内、ＮＨ₂−末端のメチオニンから１
６番目に位置するセリンがリン酸化されることが明らか
にされ、さらに、同プペプチドのアミノ酸配列の内、同
セリンを含むアミノ酸配列Trp Leu Arg Arg Ala Ser Al
a Pro Leu Pro Gly Leu Lys（ＮＨ₂−末端のメチオニン
から１１番目〜２２番目までのアミノ酸配列に、さらに
２２番目のロイシンのＣＯＯＨ−末端にリジンを結合さ
せたもの）からなるペプチドのセリン残基がリン酸化さ
れると血管平滑筋細胞を弛緩させることが報告されてい
る（Beall, A., et al., J. Biol. Chem. 274 : 11344-
11351, 1999:文献４）。しかしながら、上記の何れの報
告にも、ヒトＨＳＰ２０を構成するペプチドのアミノ酸
配列の内、特定のアミノ酸配列が血小板凝集作用を阻害
する活性を示すことは、開示されていない。勿論、特定
のアミノ酸配列がこの様な作用を有することを示唆する
記載もない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】循環器障害、脳血管
障害、末梢血管障害等に有効な医薬用組成物、特に、ヒ
トのストレス蛋白質の１種として知られているヒトＨＳ
Ｐ２０のペプチドのアミノ酸配列と共通のアミノ酸配列
を有するペプチドを有効成分とする循環器障害、脳血管
障害、末梢血管障害等に有効な医薬用組成物を提供する
ことを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等
は、ヒトＨＳＰ２０の一部と共通の構造を有するペプチ
ドであって、循環器障害、脳血管障害、末梢血管障害等
に有効な医薬用組成物を見出すべく、種々検討の結果、
ヒトＨＳＰ２０のＮＨ₂−末端から１６番目に位置する
セリンを中心として同セリンから−５ないし＋６に位置
するアミノ酸配列、あるいはＨＳＰ２０ペプチドと高い
相同性を示すαＢクリスタリンのアミノ酸配列のＮＨ₂
−末端から９番目に位置するトリプトファンから始まる
アミノ酸配列の内、ある種のアミノ酸配列がトロンビン
刺激による血小板凝集に対する強力な抑制作用、および
／またはプロトロンビン刺激による血液凝固時間を延長
する作用を有することを見出して、本発明を完成させた
ものである。

【０００６】すなわち、循環器障害、脳血管障害、末
梢血管障害等に有効な医薬用組成物用の有効成分として
有用なペプチド類を見出し、これらのペプチドを含む医
薬用組成物が、循環器障害、脳血管障害、末梢血管障害
等の予防や治療、特に、循環器障害の分野においては、
不安定狭心症、心筋梗塞の予防、ＰＴＣＡ（経皮冠動脈
形成術）後の冠状動脈閉塞の予防、冠状動脈バイパス手
術後のグラフト閉塞予防、心房細動による脳塞栓予防、
および人工弁置換術後の血栓形成予防などに、また、脳
血管障害の分野においては、一過性脳虚血発作（ＴＩ
Ａ）の再発防止、さらに、末梢血管障害の分野において
は、下部深部静脈血栓症、肺閉塞症の治療および予防、
血行再建術後の閉塞予防、閉塞性血栓血管炎、閉塞性動
脈硬化症等の予防や治療用に有望なことを見出し、本発
明を完成させたものである。

【０００７】かくして、本発明によれば、ヒトＨＳＰ
２０のＮＨ₂−末端のメチオニンから１６番目に位置す
るセリンを基準として数えて−５から＋６までのアミノ
酸配列（配列番号１）で示されるアミノ酸の内、そのＮ
Ｈ₂−末端側に、少なくとも−５〜−３に位置する３連
続アミノ酸配列Trp Leu Arg（配列番号１０）、もしく
は、−４から＋２に位置する７連続アミノ酸配列Leu Ar
g Arg AlaSer Ala Pro（配列番号１３）で示されるアミ
ノ酸を含むペプチド、または、ＨＳＰ２０ペプチドと高
い相同性を示すαＢクリスタリンのアミノ酸配列の内、
ＮＨ₂−末端のメチオニンから数えて９番目に位置する
トリプトファンから始まり、１７番目に位置するフェニ
ルアラニンまでのアミノ酸配列で示されるアミノ酸を少
なくとも６連続して含み、かつ、そのＮＨ₂−末端側
に、少なくとも９番目に位置するトリプトファンから１
４番目に位置するフェニルアラニンまでの６連続アミノ
酸配列Trp Ile Arg Arg Pro Phe（配列番号２６）で示
されるアミノ酸を含むペプチドを有効成分として含むこ
とを特徴とする血液循環障害予防および／または治療用
医薬用組成物が提供されることとなる。

【０００８】さらに、上記アミノ酸配列Trp Leu Arg
を含むペプチドが配列番号１〜１０に示すアミノ酸配列
で示されるアミノ酸からなるペプチドおよび同ペプチド
を有効成分として含むことを特徴とする血液循環障害予
防および／または治療用医薬用組成物、上記アミノ酸配
列Leu Arg Arg Ala Ser Ala Proを含むペプチドが配列
番号１１〜１３に示すアミノ酸配列で示されるアミノ酸
からなるペプチド、および同ペプチドを有効成分として
含有することを特徴とする血液循環障害予防および／ま
たは治療用医薬用組成物、上記アミノ酸配列Trp Ile Ar
g Arg Pro Pheを含むペプチドが配列番号２３〜２６に
示すアミノ酸配列で示されるアミノ酸からなるペプチ
ド、および同ペプチドを有効成分として含有することを
特徴とする血液循環障害予防および／または治療用医薬
用組成物が提供されることとなる。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明につき詳述する。
なお、本明細書において、ヒトＨＳＰ２０とは、低分子
量ストレス蛋白質ファミリーの一員であるヒト由来の分
子量２０キロダルトンの蛋白質をいう。また、記号−ま
たは＋は、文献４で報告されているヒトＨＳＰ２０のア
ミノ酸配列の内、環状ヌクレオチド依存性血管弛緩作用
に関与するリン酸化部位として知られているヒトＨＳＰ
２０のＮＨ₂−末端のメチオニンから数えて１６番目に
位置するセリンを基準（０）として、ＮＨ₂−末端側に
数えたときの位置には、−を、ＣＯＯＨ−末端側に数え
たときの位置には、＋を付けて表示するものとする。

【００１０】従って、ヒトＨＳＰ２０において、例え
ば、−５のアミノ酸とは、１６番目に位置するセリンか
らＮＨ₂−末端側に数えたとき、５番目に位置するアミ
ノ酸、即ち、ＮＨ₂−末端のメチオニンから数えて１１
番目に位置するトリプトファンを意味するものである。
また、−５から＋６までのアミノ酸配列とは、ＮＨ₂−
末端のメチオニンから数えて１１番目に位置するトリプ
トファンから、１６番目のセリンを含み、２２番目のロ
イシンまでのアミノ酸配列をいい、特に記載がない場合
には、これらの配列の内、いずれかを所定以上連続して
含むアミノ酸配列を意味するものと理解されたい。

【００１１】ところで、本発明者らは、文献４で報告
されているヒトＨＳＰ２０の環状ヌクレオチド依存性血
管弛緩作用に関与するリン酸化部位として知られている
ヒトＨＳＰ２０のＮＨ₂−末端のメチオニンから数えて
１６番目に位置するセリンに注目し、そのセリンから数
えて−５個から＋６個までのアミノ酸配列に含まれる一
連のアミノ酸配列からなるペプチドを主体に、その生理
活性を検定した。さらに、ヒトＨＳＰ２０のアミノ酸配
列と相同性の高いαＢクリスタリンのアミノ酸配列のう
ち、ＮＨ₂−末端のメチオニンから数えて９番目に位置
するトリプトファンから始まるアミノ酸配列を有するペ
プチドも検定に使用した。これらのペプチドおよびアミ
ノ酸は、表１および表２に示す。

【００１２】即ち、これらのペプチドおよびアミノ酸
を化学合成し、下記した試験条件で、各被検物質の血小
板凝集阻害作用を検定した。なお、表１および表２に示
したペプチドの内、アミノ酸が４個以上結合したペプチ
ドは、その効果の如何に拘わらずすべてを、また、３個
のアミノ酸からなるペプチドでも有効な作用を示したも
のについては、配列表にそのアミノ酸配列を、配列番号
１〜２７として示した。また、ペプチドは、Atherton、
E.等によるSolid phase peptide synthesis : a pract
ical approach. IRS PRESS (1989) PP. 25 - 161に記載
の固相合成法（F-moc solid phase method）に従い合成
した。精製は、Rainin Instrument Co.、Inc.製のカラ
ムを使用した逆相HPLCにより行った。なお、確認は島津
製作所製のKraros Kompact MALDI 2を使用して、行っ
た。

【００１３】

【表１】

【００１４】

【表２】

【００１５】これらのペプチドの血小板凝集試験、血
液凝固反応に対する阻害作用（血液凝固試験）につい
て、以下の方法により評価した。１．使用血液健常人（１８名、年齢２１〜３４)より採血し（採血管
内クエン酸濃度：３．１５％、体積比１／１０）、トロ
ンビン刺激による血小板凝集試験およびプロトロンビン
刺激による血液凝固試験に使用した。

【００１６】２．血小板の分離採血した全血を５〜６ｍｌずつ遠心管に分注し、１７０
×ｇで１２分間遠心分離を行う。遠心分離後、上清を分
取しこれを多血小板血漿（ＰＲＰ）とする。沈殿を再び
１５００×ｇで１０分間遠心分離して上清を集める。こ
れを貧血小板血漿(ＰＲＰ)とする。

【００１７】３．洗浄血小板の調製ＰＲＰにＰＧＩ₂のアナログ（最終濃度１０μＭ）を含
んだリン酸緩衝液（洗浄液）を等量加え、十分に混和す
る。次いで、５００×ｇで７分間遠心分離して上清を捨
てる。沈殿となった血小板に５ｍｌの上記洗浄液を加え
十分に混和、撹件する。この操作を２回繰り返す。３回
目の遠心後、上清を捨て、２ｍｌのリン酸緩衝液を加
え、血小板数をカウントする。ついで、血小板の数を一
定（４．０×１０⁸個／ｍｌ）になるようにリン酸緩衝
液を加えて調製する。

【００１８】４．血小板凝集試験血小板凝集測定器械(Hema Tracer 801、 NBS)を使用
し、トロンビン刺激による血小板凝集能を光透過度を指
標として検定する。上記３で調製したＰＲＰをマイクロ
キュベットに２００μｌ量りとり、このキュベットを測
定器の測定部位に入れ透過度を計る。この際の光透過率
を１００％に設定する。ついで、ＰＲＰ（ＰＲＰ１６０
μｌ＋リン酸緩衝液４０μｌ）を別のキュベットに入
れ、これを測定すると溶液中に浮遊する血小板のために
光透過度が減少する。この時の透過率を０％に設定す
る。この間、ＰＲＰは撹拌棒によってキュベット内で８
００ｒｐｍで撹拌されている。血小板を刺激する物質と
してトロンビンを加えると刺激を受けた血小板は凝集塊
を作り、下に沈殿する。この結果浮遊している血小板が
減少して光の透過率が上昇する。

【００１９】この変化によって血小板凝集能を算出す
る。トロンビンの加える量は体積比で１０％（２０μ
ｌ）、濃度は溶液中最終濃度で０．０６単位／ｍｌ〜
０．２単位／ｍｌである。この濃度は８０〜９０％の透
過率の上昇をもたらすトロンビンの濃度を各血液サンプ
ル毎にそれぞれに設定する。各被検材料としての合成ペ
プチドの濃度は、１０〜３００μＭ（最終キュベット内
濃度）とし、加える体積比は１０％（２０μｌ）であ
る。キュベット内に各濃度の合成ペプチド溶液を加えた
ＰＲＰ（ＰＲＰ１６０μｌ＋ペプチド２０μｌ）を入れ
て３〜４分３７℃でインキュベーションする。ついで、
トロンビンを加え光透過率の変化で血小板凝集の抑制作
用を検討する。

【００２０】５．血液凝固試験上記３で調製したＰＲＰをサンプルとして使用し試験す
る。血液の凝固時間の測定は、Blood Coagulation Anal
yzer CA-100 (Sysmex)を使用して測定する。試薬として
ヒトプロトロンビン（トロンボプラスチン・Ｃプラス、
Sysmex）を用いる。上記３で調製したＰＲＰ１００μｌ
を専用キュベットに量りとり、３分間３７℃でインキュ
ベートする。ついで、試薬２００μｌを加え、素速く専
用ボルテックスで軽く撹拌したのち、測定部へキュベッ
トをセットする。測定は、光透過度の変化で血液凝固時
間を測定する。健常人の平均測定時間が、１１秒〜１２
秒の範囲内となるように、この測定器は予め調整されて
いる。

【００２１】６．結果表１および表２に示したペプチドを使用して、トロンビ
ン刺激による血小板凝集抑制作用、およびプロトロンビ
ン刺激による凝固時間延長作用を検討した。各被検物質
番号１〜２７のペプチドのサンプルを３００μＭ使用し
た時の結果を図１のグラフに示した。ただし、結果は、
被検物質番号１〜２７について、各血液サンプルの測定
値の平均値を用いて示してある。なお、対照には、緩衝
液を用いた。血小板凝集率が対照に比べて低いほど、そ
のペプチドの血小板凝集抑制作用が強いことが示唆され
る。

【００２２】表１および表２に示した被検物質番号１
〜５、１６、１７（配列番号１〜５、１１、１２）のペ
プチドでは、血小板凝集は９０〜９８％抑制された。つ
いで、被検物質番号６〜１０、１８（配列番号６〜１
０、１３）では、２０〜７０％が抑制された。他のペプ
チドでは抑制は観察されなかった。一方、凝固時間（プ
ロトロンビン時間）の延長は、対照に比較して１９〜２
４％の延長が被検物質番号１〜１０（配列番号１〜１
０）で見られ、それ以外は全く観察されなかった。な
お、セリンのリン酸化による影響について検討するため
に、これらのペプチド配列中のセリンをリン酸化したも
のも使用したが、リン酸化の有無は、血小板凝集抑制作
用、凝固時間延長作用に何ら影響しなかった。

【００２３】ヒトＨＳＰ２０のアミノ酸配列と相同性
の高いαＢクリスタリンのＮＨ₂−末端のメチオニンか
ら数えて９番目に位置するトリプトファンから始まり、
最長１７番目に位置するフェニルアラニンまでのアミノ
酸配列を有するペプチドである被検物質番号２８〜３２
（配列番号２３〜２７）も化学的に合成し、トロンビン
刺激による血小板凝集抑制作用、およびプロトロンビン
刺激による凝固時間延長作用を検討した。各ペプチド３
０μM使用時の結果をグラフに示した。対照には、緩衝
液を用いた。被検物質番号２８、２９、３０および３１
（配列番号２３〜２６）のペプチドについて血小板凝集
抑制作用が観察された。被検物質番号２８〜３２（配列
番号２３〜２７）のペプチドには、凝固時間の延長がみ
られた。被検物質番号２８、２９、３０および３１（配
列番号２３〜２６）の血小板凝集に対する抑制作用は、
ヒトＨＳＰ２０ペプチドの内の以下に詳述する特定アミ
ノ酸配列を有する上記被検物質番号１〜１０（配列番号
１〜１０）のペプチドに比較して、１０倍強力であっ
た。

【００２４】図１と図２に示す結果から、文献４で報
告されているヒトＨＳＰ２０の環状ヌクレオチド依存性
血管弛緩作用に関与するリン酸化部位として知られてい
るヒトＨＳＰ２０のＮＨ₂−末端のメチオニンから数え
て１６番目に位置するセリンから数えて−５個〜＋６個
までのアミノ酸配列（配列番号１）で示されるペプチド
の内、ヒトＨＳＰ２０のＮＨ₂−末端のメチオニンから
数えて１６番目に位置するセリンから数えて−５から−
３までの３連続のアミノ酸配列TrpLeu Arg（配列番号１
０）を少なくとも含み、場合によっては、さらに−２か
ら最長＋６までのアミノ酸配列を含んでもよいペプチ
ド、あるいは、−４から＋２までの７連続アミノ酸配列
Leu Arg Arg Ala Ser Ala Pro（配列番号１３）を少な
くとも含み、場合によっては、最長＋６番目に位置する
ロイシンまでの配列を含んでいてもよいペプチド、また
は、ＨＳＰ２０ペプチドと高い相同性を示すαＢクリス
タリンのアミノ酸配列の内、ＮＨ₂−末端のメチオニン
から数えて９番目に位置するトリプトファンから始ま
り、少なくとも１４番目に位置するフェニルアラニンま
での６連続アミノ酸配列Trp Ile Arg Arg Pro Phe（配
列番号２６）、場合によっては、さらに１５番目に位置
するフェニルアラニンから最長１７番目に位置するフェ
ニルアラニンまでのアミノ酸配列を有するペプチドが血
小板凝集抑制作用、および／またはプロトロンビン刺激
による血液凝固時間を対照に比較して延長する作用を有
することが明らかとなった。

【００２５】すなわち、ヒトＨＳＰ２０のＮＨ₂−末
端のメチオニンから１６番目に位置するセリンからＮＨ
₂−末端側に数えて−５〜−３に位置する３連続アミノ
酸配列Trp Leu Argを少なくとも含み、場合によって
は、さらに−２から最長＋６までのアミノ酸配列を含ん
でいてもよいペプチド、あるいは、−４から＋２までの
７連続アミノ酸配列Leu Arg Arg Ala Ser Ala Pro（配
列番号１３）を少なくとも含み、場合によっては、最長
＋６番目に位置するロイシンまでの配列を含んでいても
よいペプチド、または、ＨＳＰ２０ペプチドと高い相同
性を示すαＢクリスタリンのアミノ酸配列の内、ＮＨ₂
−末端のメチオニンから数えて９番目に位置するトリプ
トファンから始まり、少なくとも１４番目に位置するフ
ェニルアラニンまでの６連続アミノ酸配列Trp Ile Arg
Arg Pro Phe（配列番号２６）、場合によっては、さら
に１５番目に位置するフェニルアラニンから最長１７番
目に位置するフェニルアラニンまでのアミノ酸配列で示
されるアミノ酸を含んでいてもよいペプチドが血液循環
障害予防および／または治療用医薬品として有効なこと
が判明した。

【００２６】より具体的には、１６番目のセリンから
数えて−５から−３までのアミノ酸配列Trp Leu Argを
最小単位として含むアミノ酸配列からなるペプチドとし
ては、配列番号１のTrp Leu Arg Arg Ala Ser Ala Pro
Leu Pro Gly Leu、配列番号２のTrp Leu Arg Arg Ala S
er Ala Pro Leu Pro Gly、配列番号３のTrp Leu Arg Ar
g Ala Ser Ala Pro Leu Pro、配列番号４のTrp Leu Arg
Arg AlaSer Ala Pro Leu、配列番号５のTrp Leu Arg A
rg Ala Ser Ala Pro、配列番号６のTrp Leu Arg Arg Al
a Ser Ala、配列番号７のTrp Leu Arg Arg Ala Ser、配
列番号８のTrp Leu Arg Arg Ala、配列番号９のTrp Leu
Arg Arg、および配列番号１０のTrp Leu Argのアミノ
酸から構成されるペプチドが挙げられる。

【００２７】同ＮＨ₂−末端から１６番目のセリンか
ら数えて−４から＋２までの７連続アミノ酸配列Leu Ar
g Arg Ala Ser Ala Proを最小単位として含むペプチド
としては、配列番号１１のLeu Arg Arg Ala Ser Ala Pr
o Leu Pro Gly Leu、配列番号１２のLeu Arg Arg Ala S
er Ala Pro Leu Pro、配列番号１３のLeuArg Arg Ala S
er Ala Proのアミノ酸から構成されるペプチドが挙げら
れる。

【００２８】また、ＨＳＰ２０ペプチドと高い相同性
を示すαＢクリスタリンのアミノ酸配列の内、ＮＨ₂−
末端のメチオニンから数えて９番目に位置するトリプト
ファンから始まり、少なくとも１４番目に位置するフェ
ニルアラニンまでの６連続アミノ酸配列Trp Ile Arg Ar
g Pro Phe（配列番号２６）を最小単位として含むペプ
チドとしては、配列番号２３のTrp Ile Arg Arg Pro Ph
e Phe ProPhe、配列番号２４のTrp Ile Arg Arg Pro Ph
e Phe Pro、配列番号２５のTrp Ile Arg Arg Pro Phe P
he、および配列番号２６のTrp Ile Arg Arg Pro Pheか
らなるペプチドが挙げられる。

【００２９】本発明に係るペプチドを１種または２種
以上を有効成分として含有する医薬用組成物は、通常医
薬用の製剤化に用いられる担体や賦形剤、その他の添加
剤を用いて調製される。製剤用の担体や賦形剤として
は、固体または液体のいずれでもよく、例えば乳糖、ス
テアリン酸マグネシウム、スターチ、タルク、ゼラチ
ン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ
油、カカオバター、エチレングリコール等やその他常用
のものが挙げられる。

【００３０】投与は、通常、静注等の注射剤、坐剤、
経皮等による非経口投与のいずれかの形態が採用され
る。投与量は症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して
個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常成人１人当
たり、１日につき１〜１０００ｍｇの範囲で、１日１回
から数回に分け静脈内投与されるか、または、１日１時
間〜２４時間の範囲で静脈内持続投与される。もちろ
ん、前記したように、投与量は種々の条件で変動するの
で、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。

【００３１】非経口投与のための注射剤としては、無
菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含
する。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば注射用蒸
留水および生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤、
懸濁剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエ
チレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノ
ールのようなアルコール類、ポリソルベート８０等があ
る。このような組成物はさらに防腐剤、湿潤剤、乳化
剤、分散剤、安定化剤（例えば、ラクトース）、溶解補
助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のよう
な補助剤を含んでいてもよい。これらは例えばバクテリ
ア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合または照射
によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成
物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に
溶解して使用することもできる。

【００３２】

【発明の効果】本発明によりヒトＨＳＰ２０またはそ
れと高い相同性を示すαＢクリスタリンの一部アミノ酸
配列を有するペプチドであって、上述したような特異的
アミノ酸配列を有する３ないし１２個のアミノ酸から構
成されるペプチドは、対照としてのＨＳＰ２７と比較し
ても、極めて高い血小板凝集抑制作用、および／または
プロトロンビン刺激による血液凝固時間を対照に比較し
て延長する作用を示すことが明らかにされた。かくし
て、これらのペプチドを有効成分として含有する医薬用
組成物が循環器障害、脳血管障害、末梢血管障害等の予
防や治療用として、有望であることが強く示唆された。

【００３３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kozawa, Osamu; Matsuno, Hiroyuki; Niwa, Masayuki; Kato, Kanefusa Uematsu, Toshihiko <120> A medical composition for therapeutical and/or preventive treatmen t of impairment in blood circluation and related organs and a pept ide usable as an active ingredient therefore <130> WP-3187 <140> <141> <160> 27 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Trp Leu Arg Arg Ala Ser Ala Pro Leu Pro Gly Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Trp Leu Arg Arg Ala Ser Ala Pro Leu Pro Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Trp Leu Arg Arg Ala Ser Ala Pro Leu Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Trp Leu Arg Arg Ala Ser Ala Pro Leu 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Trp Leu Arg Arg Ala Ser Ala Pro 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Trp Leu Arg Arg Ala Ser Ala 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Trp Leu Arg Arg Ala Ser 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Trp Leu Arg Arg Ala 1 5 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Trp Leu Arg Arg 1 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Trp Leu Arg 1 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Leu Arg Arg Ala Ser Ala Pro Leu Pro Gly Leu 1 5 10 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Leu Arg Arg Ala Ser Ala Pro Leu Pro 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Leu Arg Arg Ala Ser Ala Pro 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Leu Arg Arg Ala Ser Ala 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Leu Arg Arg Ala Ser 1 5 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Arg Arg Ala Ser Ala Pro Leu Pro Gly Leu 1 5 10 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Arg Ala Ser Ala Pro Leu Pro Gly Leu 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ala Ser Ala Pro Leu Pro Gly Leu 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ser Ala Pro Leu Pro Gly Leu 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ala Pro Leu Pro Gly Leu 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Pro Leu Pro Gly Leu 1 5 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Leu Pro Gly Leu 1 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Trp Ile Arg Arg Pro Phe Phe Pro Phe 1 5 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Trp Ile Arg Arg Pro Phe Phe Pro 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Trp Ile Arg Arg Pro Phe Phe 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Trp Ile Arg Arg Pro Phe 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Trp Ile Arg Arg Pro 1 5

【図面の簡単な説明】

【図１】被検物質番号１〜２７の血小板凝集率および
プロトロンビン時間延長率を対照との比較で示すグラフ
である。

【図２】被検物質番号２８〜３２の血小板凝集率およ
びプロトロンビン時間延長率を対照との比較で示すグラ
フである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 7/06 Ａ６１Ｋ 37/02 (71)出願人 593232446 加藤兼房愛知県名古屋市名東区富が丘20−１ (71)出願人 500140301 植松俊彦岐阜県岐阜市本荘3680−15 (72)発明者小澤修愛知県春日井市篠木町３丁目−47 (72)発明者松野浩之岐阜県本巣郡北方町高屋白木２丁目60 (72)発明者丹羽雅之岐阜県岐阜市岩田西１−628 (72)発明者加藤兼房愛知県名古屋市名東区富が丘20−１ (72)発明者植松俊彦岐阜県岐阜市本荘3680−15 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 AA07 BA01 BA02 BA10 BA15 BA16 BA17 BA23 NA14 ZA362 ZC022 4H045 AA10 AA30 BA12 BA13 BA14 BA15 BA16 CA40 EA23

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトＨＳＰ２０のＮＨ₂−末端のメチオ
ニンから１６番目に位置するセリンを基準として数えて
−５から＋６までのアミノ酸配列（配列番号１）で示さ
れるアミノ酸の内、そのＮＨ₂−末端側に、少なくとも
−５〜−３に位置する３連続アミノ酸配列Trp Leu Arg
（配列番号１０）、もしくは、−４から＋２に位置する
７連続アミノ酸配列Leu Arg Arg Ala Ser Ala Pro（配
列番号１３）で示されるアミノ酸を含むペプチド、また
は、ＨＳＰ２０ペプチドと高い相同性を示すαＢクリス
タリンのアミノ酸配列の内、ＮＨ₂−末端のメチオニン
から数えて９番目に位置するトリプトファンから始ま
り、１７番目に位置するフェニルアラニンまでのアミノ
酸配列で示されるアミノ酸を少なくとも６連続して含
み、かつ、そのＮＨ₂−末端側に、少なくとも９番目に
位置するトリプトファンから１４番目に位置するフェニ
ルアラニンまでの６連続アミノ酸配列Trp Ile ArgArg P
ro Phe（配列番号２６）で示されるアミノ酸を含むペプ
チドを有効成分として含むことを特徴とする血液循環障
害予防および／または治療用医薬用組成物。
【請求項２】上記アミノ酸配列Trp Leu Argを含むペ
プチドが配列番号１〜１０に示すアミノ酸配列で示され
るアミノ酸からなるものであることを特徴とする請求項
１に記載の血液循環障害予防および／または治療用医薬
用組成物。
【請求項３】上記アミノ酸配列アミノ酸配列Leu Arg
Arg Ala Ser Ala Proを含むペプチドが配列番号１１〜
１３に示すアミノ酸配列で示されるアミノ酸からなるも
のであることを特徴とする請求項１に記載の血液循環障
害予防および／または治療用医薬用組成物。
【請求項４】上記アミノ酸配列Trp Ile Arg Arg Pro
Pheを含むペプチドが配列番号２３〜２６に示すアミノ
酸配列で示されるアミノ酸からなるものであることを特
徴とする請求項１に記載の血液循環障害予防および／ま
たは治療用医薬用組成物。
【請求項５】ヒトＨＳＰ２０のＮＨ₂−末端のメチオ
ニンから数えて１６番目に位置するセリンを基準とし
て、−５から＋６までに位置するアミノ酸配列アミノ酸
配列（配列番号１）で示されるアミノ酸の内、そのＮＨ
₂−末端側に、少なくとも−５〜−３に位置する３連続
アミノ酸配列Trp Leu Arg（配列番号１０）、もしく
は、−４から＋２に位置する７連続アミノ酸配列Leu Ar
g Arg Ala SerAla Pro（配列番号１３）で示されるアミ
ノ酸を含むペプチド、または、ＨＳＰ２０ペプチドと高
い相同性を示すαＢクリスタリンのアミノ酸配列の内、
ＮＨ₂−末端のメチオニンから数えて９番目に位置する
トリプトファンから始まり、１７番目に位置するフェニ
ルアラニンまでのアミノ酸配列で示されるアミノ酸を少
なくとも６連続して含み、かつ、そのＮＨ₂−末端側
に、少なくとも９番目に位置するトリプトファンから１
４番目に位置するフェニルアラニンまでの６連続アミノ
酸配列Trp Ile Arg Arg Pro Phe（配列番号２６）で示
されるアミノ酸を含むペプチド。
【請求項６】配列番号１〜１０に示すアミノ酸配列で
示されるアミノ酸からなるペプチド。
【請求項７】配列番号１１〜１３に示すアミノ酸配列
で示されるアミノ酸からなるペプチド。
【請求項８】配列番号２３〜２６に示すアミノ酸配列
で示されるアミノ酸からなるペプチド。