JP2001275684A - 組換え体イヌジステンパーウイルスおよびその作製方法 - Google Patents
組換え体イヌジステンパーウイルスおよびその作製方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 イヌジステンパーウイルスの遺伝子操作を可
能にする。 【解決手段】 イヌジステンパーウイルスのＮ蛋白質、
Ｐ蛋白質およびＬ蛋白質を発現する宿主にイヌジステン
パーウイルスゲノムを導入し、イヌジステンパーウイル
ス粒子を再構成する方法を確立したことにより、このウ
イルスの遺伝子操作を可能とした。
能にする。 【解決手段】 イヌジステンパーウイルスのＮ蛋白質、
Ｐ蛋白質およびＬ蛋白質を発現する宿主にイヌジステン
パーウイルスゲノムを導入し、イヌジステンパーウイル
ス粒子を再構成する方法を確立したことにより、このウ
イルスの遺伝子操作を可能とした。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、組換え体イヌジス
テンパーウイルスとその製造方法に関する。
テンパーウイルスとその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】イヌジステンパーウイルスはイヌ科やイ
タチ科などの動物種に感染し、主に発熱、肺炎や気管支
炎などの呼吸器疾患、下痢、神経症状などの病態を示
し、古くからイヌの代表的な感染病の一つに挙げられて
いる。1960年代以来生ワクチンの接種によりジステンパ
ーの発症が制御されてきたが、近年わが国も含めた世界
的な発症率の上昇が報告されている。また、本来の宿主
とは異なるライオンなどのネコ科の動物やアザラシでの
自然発症や、近縁のウイルス種によるアザラシやイルカ
などの水棲哺乳類の大量死が話題になった。わが国にお
いても、近年の疫学調査によって野生の陸棲哺乳類や日
本近海の海棲哺乳類でイヌジステンパーウイルスおよび
その近縁種の感染が証明されている。イヌは家畜や愛玩
動物・伴侶動物として古来から社会生活上重要な働きを
果たしてきた。また、実験動物として生理学的・薬理学
的な研究、ヒトの疾患モデル、感染症の研究などに利用
され産業上の有効性は広く認知されている。従って、イ
ヌジステンパーウイルスの遺伝子操作系を確立すること
は、ワクチンの作製、ウイルス病原性の解明、遺伝子治
療等への応用の面で重要である。
タチ科などの動物種に感染し、主に発熱、肺炎や気管支
炎などの呼吸器疾患、下痢、神経症状などの病態を示
し、古くからイヌの代表的な感染病の一つに挙げられて
いる。1960年代以来生ワクチンの接種によりジステンパ
ーの発症が制御されてきたが、近年わが国も含めた世界
的な発症率の上昇が報告されている。また、本来の宿主
とは異なるライオンなどのネコ科の動物やアザラシでの
自然発症や、近縁のウイルス種によるアザラシやイルカ
などの水棲哺乳類の大量死が話題になった。わが国にお
いても、近年の疫学調査によって野生の陸棲哺乳類や日
本近海の海棲哺乳類でイヌジステンパーウイルスおよび
その近縁種の感染が証明されている。イヌは家畜や愛玩
動物・伴侶動物として古来から社会生活上重要な働きを
果たしてきた。また、実験動物として生理学的・薬理学
的な研究、ヒトの疾患モデル、感染症の研究などに利用
され産業上の有効性は広く認知されている。従って、イ
ヌジステンパーウイルスの遺伝子操作系を確立すること
は、ワクチンの作製、ウイルス病原性の解明、遺伝子治
療等への応用の面で重要である。
【０００３】イヌジステンパーウイルス（Canine Diste
mper Viru; CDV) はパラミクソウイルス科（Paramyxovi
ridae)、モービリウイルス属 (Morbillivirus)に分類さ
れる。イヌジステンパーウイルス粒子は多形性であり、
直径150 〜200nm のエンベロープを有し、中に翻訳の鋳
型とはならないゲノムRNA(以下、(-) 鎖RNA と称する)
を有している。ゲノム核酸の形態による分類では、イヌ
ジステンパーウイルスはRNA ウイルスの、一本鎖(-) 鎖
RNA ウイルスに属する。
mper Viru; CDV) はパラミクソウイルス科（Paramyxovi
ridae)、モービリウイルス属 (Morbillivirus)に分類さ
れる。イヌジステンパーウイルス粒子は多形性であり、
直径150 〜200nm のエンベロープを有し、中に翻訳の鋳
型とはならないゲノムRNA(以下、(-) 鎖RNA と称する)
を有している。ゲノム核酸の形態による分類では、イヌ
ジステンパーウイルスはRNA ウイルスの、一本鎖(-) 鎖
RNA ウイルスに属する。
【０００４】RNA ウイルスのうち、一本鎖RNA をゲノム
としてもつウイルスは、そのゲノムがプラス鎖である
(+) 鎖RNA ウイルスおよびマイナス鎖である(-) 鎖RNA
ウイルスに分類される。一般的に、(+) 鎖RNA ウイルス
のゲノムRNA は細胞に導入した場合mRNAとしても機能
し、複製や粒子形成に必要な蛋白質を宿主細胞の翻訳機
能により生産することができる。すなわち、(+) 鎖RNA
ウイルスのゲノムRNA はそれ自体が伝播力を有する。こ
の明細書において「伝播力」とは、「感染や人工的な手
法で核酸が細胞内に導入されると、この核酸が複製後、
感染性粒子またはそれに準ずる複合体を形成し、別の細
胞に次々と伝播することのできる能力」をいう。一方、
(-) 鎖RNA ウイルスは、粒子内にRNA 依存性RNA ポリメ
ラーゼを保有し、これにより細胞内でゲノムRNA からア
ンチゲノムRNA と蛋白質翻訳に必要なmRNAが転写され
る。このように、(-) 鎖RNA ウイルスのゲノムはmRNAと
しては機能しないため、細胞に(-) 鎖RNA ゲノムのみを
導入しても遺伝情報の発現が起こらない。さらに、イヌ
ジステンパーウイルスなどの(-) 鎖RNA ウイルスでは、
裸のRNA はゲノムでもアンチゲノムでもRNA ポリメラー
ゼの鋳型とならず、転写や複製の鋳型になるには、Ｎ蛋
白質、Ｐ蛋白質およびＬ蛋白質が必要であり、このこと
が(-) 鎖RNA ウイルスのcDNAからウイルスを生成させる
際の障害となっていた。
としてもつウイルスは、そのゲノムがプラス鎖である
(+) 鎖RNA ウイルスおよびマイナス鎖である(-) 鎖RNA
ウイルスに分類される。一般的に、(+) 鎖RNA ウイルス
のゲノムRNA は細胞に導入した場合mRNAとしても機能
し、複製や粒子形成に必要な蛋白質を宿主細胞の翻訳機
能により生産することができる。すなわち、(+) 鎖RNA
ウイルスのゲノムRNA はそれ自体が伝播力を有する。こ
の明細書において「伝播力」とは、「感染や人工的な手
法で核酸が細胞内に導入されると、この核酸が複製後、
感染性粒子またはそれに準ずる複合体を形成し、別の細
胞に次々と伝播することのできる能力」をいう。一方、
(-) 鎖RNA ウイルスは、粒子内にRNA 依存性RNA ポリメ
ラーゼを保有し、これにより細胞内でゲノムRNA からア
ンチゲノムRNA と蛋白質翻訳に必要なmRNAが転写され
る。このように、(-) 鎖RNA ウイルスのゲノムはmRNAと
しては機能しないため、細胞に(-) 鎖RNA ゲノムのみを
導入しても遺伝情報の発現が起こらない。さらに、イヌ
ジステンパーウイルスなどの(-) 鎖RNA ウイルスでは、
裸のRNA はゲノムでもアンチゲノムでもRNA ポリメラー
ゼの鋳型とならず、転写や複製の鋳型になるには、Ｎ蛋
白質、Ｐ蛋白質およびＬ蛋白質が必要であり、このこと
が(-) 鎖RNA ウイルスのcDNAからウイルスを生成させる
際の障害となっていた。
【０００５】RNA ウイルスの遺伝子操作系の確立は、ウ
イルス機能の遺伝的解析によるウイルス病原性の解明、
抗ウイルス剤の開発やワクチンの作製、あるいは遺伝子
治療用ベクターの開発等に重要である。そのためには、
ウイルス粒子の再構成のための手法が確立している必要
がある。すなわち、ウイルスゲノムの改変や外来性遺伝
子の導入などを行うには、DNA レベルでの遺伝子操作が
必要なので、遺伝子を改変した、あるいは外来遺伝子を
組み込んだウイルスcDNAからウイルス粒子が再構成され
なければならない。ここで、「ウイルス粒子の再構成」
とは、ウイルスゲノムの核酸を人工的に作製し、試験管
内または細胞内において、もとのウイルスまたは組換え
体ウイルスを作製することを意味する。
イルス機能の遺伝的解析によるウイルス病原性の解明、
抗ウイルス剤の開発やワクチンの作製、あるいは遺伝子
治療用ベクターの開発等に重要である。そのためには、
ウイルス粒子の再構成のための手法が確立している必要
がある。すなわち、ウイルスゲノムの改変や外来性遺伝
子の導入などを行うには、DNA レベルでの遺伝子操作が
必要なので、遺伝子を改変した、あるいは外来遺伝子を
組み込んだウイルスcDNAからウイルス粒子が再構成され
なければならない。ここで、「ウイルス粒子の再構成」
とは、ウイルスゲノムの核酸を人工的に作製し、試験管
内または細胞内において、もとのウイルスまたは組換え
体ウイルスを作製することを意味する。
【０００６】ウイルスの再構成技術が確立されれば、ウ
イルスに所望の外来性遺伝子を導入したり、ウイルスの
特定の遺伝子を欠失させたり改変させたりしたウイルス
を作製することが可能となる。
イルスに所望の外来性遺伝子を導入したり、ウイルスの
特定の遺伝子を欠失させたり改変させたりしたウイルス
を作製することが可能となる。
【０００７】また、ウイルスの再構成系が構築され、ウ
イルスの遺伝子操作が可能になれば、ウイルスの機能を
遺伝学的に解析するための重要な技術となり、疾病の予
防、治療等にきわめて有用である。例えば、イヌジステ
ンパーウイルス野外流行株の抗原性に関与する遺伝子ま
たはその一部が決定されれば、その部分を組換えたウイ
ルスの作製が可能となる。また、他種ウイルス、細菌や
寄生虫などの病原性に関与する遺伝子であれば、組換え
イヌジステンパーウイルスとの多価ワクチンの製造が可
能である。あるいは、ウイルス核酸の複製メカニズムが
解明されれば、その宿主細胞内の核酸複製機構との差を
利用して、宿主細胞へのダメージの少ない、核酸の複製
を作用点とした抗ウイルス剤を開発することが可能であ
る。また、ウイルス遺伝子のコードする蛋白質がどのよ
うな機能を有するかを解明することにより、ウイルス粒
子感染能や、ウイルス粒子形成能に係わるウイルス由来
あるいは細胞由来の蛋白質をターゲットとした抗ウイル
ス剤を開発することもできよう。
イルスの遺伝子操作が可能になれば、ウイルスの機能を
遺伝学的に解析するための重要な技術となり、疾病の予
防、治療等にきわめて有用である。例えば、イヌジステ
ンパーウイルス野外流行株の抗原性に関与する遺伝子ま
たはその一部が決定されれば、その部分を組換えたウイ
ルスの作製が可能となる。また、他種ウイルス、細菌や
寄生虫などの病原性に関与する遺伝子であれば、組換え
イヌジステンパーウイルスとの多価ワクチンの製造が可
能である。あるいは、ウイルス核酸の複製メカニズムが
解明されれば、その宿主細胞内の核酸複製機構との差を
利用して、宿主細胞へのダメージの少ない、核酸の複製
を作用点とした抗ウイルス剤を開発することが可能であ
る。また、ウイルス遺伝子のコードする蛋白質がどのよ
うな機能を有するかを解明することにより、ウイルス粒
子感染能や、ウイルス粒子形成能に係わるウイルス由来
あるいは細胞由来の蛋白質をターゲットとした抗ウイル
ス剤を開発することもできよう。
【０００８】DNA ウイルスの再構成は比較的早くから行
われており、続いてRNA ウイルスのうち(+) 鎖RNA ウイ
ルスにおいてcDNAからのウイルス生成が行われた。(-)
鎖RNA ウイルスの再構成については、cDNAを経由したウ
イルス粒子再構成は困難であった。前述したように、
(-) 鎖RNA ウイルスのRNA (vRNA; viral RNA) またはそ
の相補鎖 (cRNA; complementary RNA)を単独で細胞内に
導入しても(-) 鎖RNA ウイルスが生成されないことが明
らかにされている。(-) 鎖RNA ウイルスの再構成に関し
ては、８分節ゲノムを有するインフルエンザウイルスお
よびラブドウイルス科に属する狂犬病ウイルスにおいて
cDNAからのウイルス生成の報告があるが、製造効率の面
で十分ではなく、また天然型ウイルスや組換え型ワクシ
ニアウイルスを同時に感染させておりそれらのウイルス
の分離が容易でないという問題があった。さらに、セン
ダイウイルスにおいてcDNAからウイルスを再構成したこ
とが開示されている（国際出願公開WO97/16539およびWO
96/03068) が、イヌジステンパーウイルスの再構成系は
確立していなかった。
われており、続いてRNA ウイルスのうち(+) 鎖RNA ウイ
ルスにおいてcDNAからのウイルス生成が行われた。(-)
鎖RNA ウイルスの再構成については、cDNAを経由したウ
イルス粒子再構成は困難であった。前述したように、
(-) 鎖RNA ウイルスのRNA (vRNA; viral RNA) またはそ
の相補鎖 (cRNA; complementary RNA)を単独で細胞内に
導入しても(-) 鎖RNA ウイルスが生成されないことが明
らかにされている。(-) 鎖RNA ウイルスの再構成に関し
ては、８分節ゲノムを有するインフルエンザウイルスお
よびラブドウイルス科に属する狂犬病ウイルスにおいて
cDNAからのウイルス生成の報告があるが、製造効率の面
で十分ではなく、また天然型ウイルスや組換え型ワクシ
ニアウイルスを同時に感染させておりそれらのウイルス
の分離が容易でないという問題があった。さらに、セン
ダイウイルスにおいてcDNAからウイルスを再構成したこ
とが開示されている（国際出願公開WO97/16539およびWO
96/03068) が、イヌジステンパーウイルスの再構成系は
確立していなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、製造効率の
よいイヌジステンパーウイルス再構成系を確立し、イヌ
ジステンパーウイルスの遺伝子操作を可能にすることで
ある。
よいイヌジステンパーウイルス再構成系を確立し、イヌ
ジステンパーウイルスの遺伝子操作を可能にすることで
ある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、イヌジス
テンパーウイルス全長のcDNAを得て、細胞内で（+)鎖イ
ヌジステンパーウイルスRNA が生合成されるようなプラ
スミドを構築し、これを転写複製に関するcDNA群を発現
している細胞内に導入することにより、イヌジステンパ
ーウイルスcDNAよりイヌジステンパーウイルス粒子を再
構成することに初めて成功し、本発明を完成した。核酸
からウイルス粒子の再構成が効率よくできれば、外来遺
伝子の導入、特定のウイルス遺伝子の欠失や改変などを
容易に行うことができる。すなわち、イヌジステンパー
ウイルスの遺伝子操作が可能となる。
テンパーウイルス全長のcDNAを得て、細胞内で（+)鎖イ
ヌジステンパーウイルスRNA が生合成されるようなプラ
スミドを構築し、これを転写複製に関するcDNA群を発現
している細胞内に導入することにより、イヌジステンパ
ーウイルスcDNAよりイヌジステンパーウイルス粒子を再
構成することに初めて成功し、本発明を完成した。核酸
からウイルス粒子の再構成が効率よくできれば、外来遺
伝子の導入、特定のウイルス遺伝子の欠失や改変などを
容易に行うことができる。すなわち、イヌジステンパー
ウイルスの遺伝子操作が可能となる。
【００１１】本発明は以下のものを含む。 (1) 所望の外来遺伝子を含むかまたは所望の遺伝子が欠
失もしくは改変されたゲノムを保持し、伝播力を有する
組換え体イヌジステンパーウイルス。 (2) １以上のイヌジステンパーウイルスゲノムの遺伝子
が改変されている、(1)に記載の組換え体イヌジステン
パーウイルス。 (3) 宿主内で発現可能な外来遺伝子を有する、(1) また
は(2) に記載の組換え体イヌジステンパーウイルス。 (4) イヌジステンパーウイルスを構成する機能蛋白質遺
伝子間に人為的に制限酵素認識配列を配置している(1)
に記載の組換え体イヌジステンパーウイルス。 (5) 各制限酵素認識配列中に外来遺伝子が挿入されてい
るか、または各制限酵素認識配列間の遺伝子が交換、欠
失もしくは改変されている、(4) 記載の組換え体イヌジ
ステンパーウイルス。 (6) (1) ないし(5) のいずれかに記載の組換え体イヌジ
ステンパーウイルスに含まれるRNA またはcRNA。 (7) (6) 記載の組換え体イヌジステンパーウイルスゲノ
ムRNA またはcRNAを転写しうる鋳型cDNAを含むDNA 。 (8) イヌジステンパーウイルスのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質お
よびＬ蛋白質 (各蛋白質は同等の活性を有する蛋白質で
もよい) を発現する宿主に、所望の外来遺伝子を含むか
または所望の遺伝子が欠失もしくは改変されたイヌジス
テンパーウイルスゲノムRNA またはcRNAを導入すること
を含む、伝播力を有する組換え体イヌジステンパーウイ
ルスの製造方法。 (9) イヌジステンパーウイルスのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質お
よびＬ蛋白質 (各蛋白質は同等の活性を有する蛋白質で
もよい) を発現する宿主に、所望の外来遺伝子を含むか
または所望の遺伝子が欠失もしくは改変されたイヌジス
テンパーウイルスゲノムRNA またはcRNAを転写しうる鋳
型cDNAを含むDNA と、該DNA を鋳型として細胞内で前記
RNA を転写しうるユニットとを導入することを含む、伝
播力を有する組換え体イヌジステンパーウイルスの製造
方法。 (10)(a) イヌジステンパーウイルスのゲノムRNA または
cRNAを転写しうる鋳型cDNAを含むDNA と、(b) 該DNA を
鋳型として試験管内または細胞内でRNA を転写しうるユ
ニットとを含むキット。 (11)(a) イヌジステンパーウイルスのＮ蛋白質、Ｐ蛋白
質およびＬ蛋白質 (各蛋白質は同等の活性を有する蛋白
質でもよい) を発現する宿主、(b) イヌジステンパーウ
イルスのゲノムRNA またはcRNAを転写しうる鋳型cDNAを
含むDNA 、および(c) 該DNA を鋳型として試験管内また
は細胞内でRNA を転写しうるユニットを含むキット。 (12)宿主に(3) に記載の組換え体イヌジステンパーウイ
ルスを感染させ、発現した外来性蛋白質を回収する工程
を含む、外来性蛋白質の製造方法。 (13) (3)に記載の組換え体イヌジステンパーウイルスを
感染させた動物から体液を回収することによって得られ
る、発現した外来性蛋白質を含む体液。 (14)(1) ないし(3) のいずれかに記載の組換え体イヌジ
ステンパーウイルスを感染させた動物から採取される組
織、細胞および体液。 (15)(1) ないし(3) のいずれかに記載の組換え体イヌジ
ステンパーウイルスを感染させた動物から採取される、
外来遺伝子がコードする蛋白質または改変されたウイル
ス遺伝子がコードする蛋白質に対する抗血清。
失もしくは改変されたゲノムを保持し、伝播力を有する
組換え体イヌジステンパーウイルス。 (2) １以上のイヌジステンパーウイルスゲノムの遺伝子
が改変されている、(1)に記載の組換え体イヌジステン
パーウイルス。 (3) 宿主内で発現可能な外来遺伝子を有する、(1) また
は(2) に記載の組換え体イヌジステンパーウイルス。 (4) イヌジステンパーウイルスを構成する機能蛋白質遺
伝子間に人為的に制限酵素認識配列を配置している(1)
に記載の組換え体イヌジステンパーウイルス。 (5) 各制限酵素認識配列中に外来遺伝子が挿入されてい
るか、または各制限酵素認識配列間の遺伝子が交換、欠
失もしくは改変されている、(4) 記載の組換え体イヌジ
ステンパーウイルス。 (6) (1) ないし(5) のいずれかに記載の組換え体イヌジ
ステンパーウイルスに含まれるRNA またはcRNA。 (7) (6) 記載の組換え体イヌジステンパーウイルスゲノ
ムRNA またはcRNAを転写しうる鋳型cDNAを含むDNA 。 (8) イヌジステンパーウイルスのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質お
よびＬ蛋白質 (各蛋白質は同等の活性を有する蛋白質で
もよい) を発現する宿主に、所望の外来遺伝子を含むか
または所望の遺伝子が欠失もしくは改変されたイヌジス
テンパーウイルスゲノムRNA またはcRNAを導入すること
を含む、伝播力を有する組換え体イヌジステンパーウイ
ルスの製造方法。 (9) イヌジステンパーウイルスのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質お
よびＬ蛋白質 (各蛋白質は同等の活性を有する蛋白質で
もよい) を発現する宿主に、所望の外来遺伝子を含むか
または所望の遺伝子が欠失もしくは改変されたイヌジス
テンパーウイルスゲノムRNA またはcRNAを転写しうる鋳
型cDNAを含むDNA と、該DNA を鋳型として細胞内で前記
RNA を転写しうるユニットとを導入することを含む、伝
播力を有する組換え体イヌジステンパーウイルスの製造
方法。 (10)(a) イヌジステンパーウイルスのゲノムRNA または
cRNAを転写しうる鋳型cDNAを含むDNA と、(b) 該DNA を
鋳型として試験管内または細胞内でRNA を転写しうるユ
ニットとを含むキット。 (11)(a) イヌジステンパーウイルスのＮ蛋白質、Ｐ蛋白
質およびＬ蛋白質 (各蛋白質は同等の活性を有する蛋白
質でもよい) を発現する宿主、(b) イヌジステンパーウ
イルスのゲノムRNA またはcRNAを転写しうる鋳型cDNAを
含むDNA 、および(c) 該DNA を鋳型として試験管内また
は細胞内でRNA を転写しうるユニットを含むキット。 (12)宿主に(3) に記載の組換え体イヌジステンパーウイ
ルスを感染させ、発現した外来性蛋白質を回収する工程
を含む、外来性蛋白質の製造方法。 (13) (3)に記載の組換え体イヌジステンパーウイルスを
感染させた動物から体液を回収することによって得られ
る、発現した外来性蛋白質を含む体液。 (14)(1) ないし(3) のいずれかに記載の組換え体イヌジ
ステンパーウイルスを感染させた動物から採取される組
織、細胞および体液。 (15)(1) ないし(3) のいずれかに記載の組換え体イヌジ
ステンパーウイルスを感染させた動物から採取される、
外来遺伝子がコードする蛋白質または改変されたウイル
ス遺伝子がコードする蛋白質に対する抗血清。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明によれば、cDNAを経由した
組換え体イヌジステンパーウイルス粒子の再構成を行
い、伝播力を有する組換え体イヌジステンパーウイルス
を得ることができる。すなわち、本発明の組換え体イヌ
ジステンパーウイルスは、(1) 遺伝子工学的操作によ
り、外来遺伝子を含むか、ある遺伝子が欠失もしくは改
変されるように製造した組換え体イヌジステンパーウイ
ルスゲノムRNA もしくはcRNAのcDNA、および(2) このDN
A を鋳型として細胞内でRNA を転写しうるユニットを、
イヌジステンパーウイルスまたは近縁種ウイルスのＮ蛋
白質、Ｐ蛋白質およびＬ蛋白質（各蛋白質は同等の活性
を有する蛋白質でもよい）を同時に発現する宿主に導入
することによって得ることができる。この場合、例え
ば、(1) は特定のプロモーター下流に接続されており、
(2) はこの特定のプロモーターに作用するDNA 依存性RN
A ポリメラーゼを発現するDNA である。
組換え体イヌジステンパーウイルス粒子の再構成を行
い、伝播力を有する組換え体イヌジステンパーウイルス
を得ることができる。すなわち、本発明の組換え体イヌ
ジステンパーウイルスは、(1) 遺伝子工学的操作によ
り、外来遺伝子を含むか、ある遺伝子が欠失もしくは改
変されるように製造した組換え体イヌジステンパーウイ
ルスゲノムRNA もしくはcRNAのcDNA、および(2) このDN
A を鋳型として細胞内でRNA を転写しうるユニットを、
イヌジステンパーウイルスまたは近縁種ウイルスのＮ蛋
白質、Ｐ蛋白質およびＬ蛋白質（各蛋白質は同等の活性
を有する蛋白質でもよい）を同時に発現する宿主に導入
することによって得ることができる。この場合、例え
ば、(1) は特定のプロモーター下流に接続されており、
(2) はこの特定のプロモーターに作用するDNA 依存性RN
A ポリメラーゼを発現するDNA である。
【００１３】あるいは、遺伝子工学的操作により、外来
遺伝子を含むか、ある遺伝子が欠失もしくは改変される
ように製造した組換え体イヌジステンパーウイルスゲノ
ムRNA もしくはcRNAのcDNAを試験管内であらかじめ転写
して組換え体イヌジステンパーウイルスゲノムRNA を製
造しておき、これをイヌジステンパーウイルスまたは近
縁種ウイルスのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質およびＬ蛋白質（各
蛋白質は同等の活性を有する蛋白質でもよい）を同時に
発現する宿主に導入することによって得てもよい。
遺伝子を含むか、ある遺伝子が欠失もしくは改変される
ように製造した組換え体イヌジステンパーウイルスゲノ
ムRNA もしくはcRNAのcDNAを試験管内であらかじめ転写
して組換え体イヌジステンパーウイルスゲノムRNA を製
造しておき、これをイヌジステンパーウイルスまたは近
縁種ウイルスのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質およびＬ蛋白質（各
蛋白質は同等の活性を有する蛋白質でもよい）を同時に
発現する宿主に導入することによって得てもよい。
【００１４】本発明の組換え体イヌジステンパーウイル
スの製造において、外来性遺伝子を導入するか、また所
望の遺伝子を欠失もしくは改変するための材料として使
用できるイヌジステンパーウイルスとしては、例えばOn
dersteproot 株、Yanaka株等のイヌジステンパーウイル
スに分類される株であればよい。また、合成したオリゴ
ヌクレオチド等も材料の一部として利用することができ
る。
スの製造において、外来性遺伝子を導入するか、また所
望の遺伝子を欠失もしくは改変するための材料として使
用できるイヌジステンパーウイルスとしては、例えばOn
dersteproot 株、Yanaka株等のイヌジステンパーウイル
スに分類される株であればよい。また、合成したオリゴ
ヌクレオチド等も材料の一部として利用することができ
る。
【００１５】イヌジステンパーウイルスのゲノムは、ウ
イルスの複製に関与するリーダー配列とトレーラー配列
を両端にもち、その間にウイルスの構成蛋白質をコード
するＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨおよびＬ遺伝子を有する。Ｎ蛋
白質は3'端から順にウイルスRNA に結合し包装する。Ｐ
遺伝子からはＰ蛋白質、Ｖ蛋白質、Ｃ蛋白質の３種類の
蛋白質が生成され、Ｐ蛋白質はRNA ポリメラーゼの小サ
ブユニットとしてウイルスの転写複製に関与しているこ
とが明らかになっているが、他の蛋白質についてはよく
分かっていない。Ｌ蛋白質はRNA ポリメラーゼの大サブ
ユニットとして機能している。他にウイルス粒子構造を
内側から支えるＭ蛋白質、宿主細胞への侵入に関わるＦ
蛋白質とＨ蛋白質がある。
イルスの複製に関与するリーダー配列とトレーラー配列
を両端にもち、その間にウイルスの構成蛋白質をコード
するＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨおよびＬ遺伝子を有する。Ｎ蛋
白質は3'端から順にウイルスRNA に結合し包装する。Ｐ
遺伝子からはＰ蛋白質、Ｖ蛋白質、Ｃ蛋白質の３種類の
蛋白質が生成され、Ｐ蛋白質はRNA ポリメラーゼの小サ
ブユニットとしてウイルスの転写複製に関与しているこ
とが明らかになっているが、他の蛋白質についてはよく
分かっていない。Ｌ蛋白質はRNA ポリメラーゼの大サブ
ユニットとして機能している。他にウイルス粒子構造を
内側から支えるＭ蛋白質、宿主細胞への侵入に関わるＦ
蛋白質とＨ蛋白質がある。
【００１６】組換え体ウイルスの製造には、まず、イヌ
ジステンパーウイルスからゲノムRNA を調製し、そのcD
NAを作製する。cDNAは特定のプロモーター下流に接続さ
れ、cDNAの接続する向きによってゲノムRNA またはcRNA
が転写される。このcDNAに遺伝子工学的操作により、所
望の外来性遺伝子を挿入したり、所望のゲノム遺伝子が
欠失したり改変されるような操作を施す。得られる組換
え体イヌジステンパーウイルスが伝播力を保持する限
り、任意の部位に任意の外来性遺伝子が挿入されていて
も、またいかなるゲノム遺伝子が欠失もしくは改変され
ていてもよい。挿入される外来性遺伝子としては、宿主
内で発現可能な、ウイルス、細菌および寄生虫の病原性
を惹起する各種蛋白質をコードする遺伝子や、各種サイ
トカインをコードする遺伝子、各種ペプチドホルモンを
コードする遺伝子等が挙げられる。挿入した外来性遺伝
子の発現量は、遺伝子挿入の位置や遺伝子前後のRNA 塩
基配列により調節しうる。また、ウイルスの免疫原性に
関する遺伝子を不活化したり、RNA の転写効率や複製効
率を高めるために、イヌジステンパーウイルスのRNA複
製に関与する一部の遺伝子を改変してもよい。さらに、
イヌジステンパーウイルス野外流行株の遺伝子と部分的
に交換することで、病原性に関与する領域を探索するこ
とも可能である。
ジステンパーウイルスからゲノムRNA を調製し、そのcD
NAを作製する。cDNAは特定のプロモーター下流に接続さ
れ、cDNAの接続する向きによってゲノムRNA またはcRNA
が転写される。このcDNAに遺伝子工学的操作により、所
望の外来性遺伝子を挿入したり、所望のゲノム遺伝子が
欠失したり改変されるような操作を施す。得られる組換
え体イヌジステンパーウイルスが伝播力を保持する限
り、任意の部位に任意の外来性遺伝子が挿入されていて
も、またいかなるゲノム遺伝子が欠失もしくは改変され
ていてもよい。挿入される外来性遺伝子としては、宿主
内で発現可能な、ウイルス、細菌および寄生虫の病原性
を惹起する各種蛋白質をコードする遺伝子や、各種サイ
トカインをコードする遺伝子、各種ペプチドホルモンを
コードする遺伝子等が挙げられる。挿入した外来性遺伝
子の発現量は、遺伝子挿入の位置や遺伝子前後のRNA 塩
基配列により調節しうる。また、ウイルスの免疫原性に
関する遺伝子を不活化したり、RNA の転写効率や複製効
率を高めるために、イヌジステンパーウイルスのRNA複
製に関与する一部の遺伝子を改変してもよい。さらに、
イヌジステンパーウイルス野外流行株の遺伝子と部分的
に交換することで、病原性に関与する領域を探索するこ
とも可能である。
【００１７】本発明において好ましくは、イヌジステン
パーウイルスゲノムのcDNAを作成する際に、ウイルスを
構成する蛋白質をコードするＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｈおよび
Ｌ遺伝子の各遺伝子間に制限酵素認識配列を配置してお
く。そうすることにより、外来遺伝子の挿入が容易に行
われ、最適な外来蛋白質の発現を示す部位を選ぶことが
可能である。また、イヌジステンパーウイルスの他株や
他種ウイルスの遺伝子との交換を容易に行うことができ
る。
パーウイルスゲノムのcDNAを作成する際に、ウイルスを
構成する蛋白質をコードするＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｈおよび
Ｌ遺伝子の各遺伝子間に制限酵素認識配列を配置してお
く。そうすることにより、外来遺伝子の挿入が容易に行
われ、最適な外来蛋白質の発現を示す部位を選ぶことが
可能である。また、イヌジステンパーウイルスの他株や
他種ウイルスの遺伝子との交換を容易に行うことができ
る。
【００１８】上記のようにして遺伝子操作を施したイヌ
ジステンパーウイルスゲノムのcDNAを、このDNA を鋳型
として細胞内でRNA を転写しうるユニットと共に、イヌ
ジステンパーウイルスのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質およびＬ蛋
白質を同時に発現する宿主に導入することにより、組換
え体ウイルスを生成させる、すなわち組換え体ウイルス
を再構成させる。
ジステンパーウイルスゲノムのcDNAを、このDNA を鋳型
として細胞内でRNA を転写しうるユニットと共に、イヌ
ジステンパーウイルスのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質およびＬ蛋
白質を同時に発現する宿主に導入することにより、組換
え体ウイルスを生成させる、すなわち組換え体ウイルス
を再構成させる。
【００１９】DNA を鋳型としてRNA を転写しうるユニッ
トとしては、特定のプロモーターに作用するDNA 依存性
RNA ポリメラーゼを発現するDNA であればよく、遺伝子
操作を施したイヌジステンパーウイルスゲノムのcDNAは
この特定のプロモーター下流に接続されている。このユ
ニットの具体例としては、例えばT7RNA ポリメラーゼを
発現する組換えワクシニアウイルス、または培養細胞が
ある。
トとしては、特定のプロモーターに作用するDNA 依存性
RNA ポリメラーゼを発現するDNA であればよく、遺伝子
操作を施したイヌジステンパーウイルスゲノムのcDNAは
この特定のプロモーター下流に接続されている。このユ
ニットの具体例としては、例えばT7RNA ポリメラーゼを
発現する組換えワクシニアウイルス、または培養細胞が
ある。
【００２０】上記ユニットと共にcDNAを導入する宿主
は、イヌジステンパーウイルスまたはその近縁種ウイル
スの転写複製酵素群をすべて発現する宿主、すなわちＮ
蛋白質、Ｐ蛋白質およびＬ蛋白質を同時に発現する宿主
であればよい。例えば、これらの蛋白質をコードする遺
伝子を染色体上に有する細胞を用いるか、あるいは適宜
細胞にＮ蛋白質、Ｐ蛋白質およびＬ蛋白質の各蛋白質を
コードする遺伝子を有するプラスミドを導入したもので
もよい。好適には、適宜Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子
を有するプラスミドを導入した293 細胞またはB95a細胞
が使用できる。
は、イヌジステンパーウイルスまたはその近縁種ウイル
スの転写複製酵素群をすべて発現する宿主、すなわちＮ
蛋白質、Ｐ蛋白質およびＬ蛋白質を同時に発現する宿主
であればよい。例えば、これらの蛋白質をコードする遺
伝子を染色体上に有する細胞を用いるか、あるいは適宜
細胞にＮ蛋白質、Ｐ蛋白質およびＬ蛋白質の各蛋白質を
コードする遺伝子を有するプラスミドを導入したもので
もよい。好適には、適宜Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子
を有するプラスミドを導入した293 細胞またはB95a細胞
が使用できる。
【００２１】上記のように、cDNAを、このDNA を鋳型と
してRNA を転写しうるユニットと共に宿主に導入する方
法以外に、cDNAを予め試験管内でRNA に転写しておき、
これを宿主に導入して組換え体ウイルスを再構成させて
もよい。例えば、バクテリオファージ由来のT7やT3プロ
モーターの下流に遺伝子があれば、それぞれT7RNA ポリ
メラーゼやT3RNA ポリメラーゼで直接試験管内でRNA を
転写させることができる。
してRNA を転写しうるユニットと共に宿主に導入する方
法以外に、cDNAを予め試験管内でRNA に転写しておき、
これを宿主に導入して組換え体ウイルスを再構成させて
もよい。例えば、バクテリオファージ由来のT7やT3プロ
モーターの下流に遺伝子があれば、それぞれT7RNA ポリ
メラーゼやT3RNA ポリメラーゼで直接試験管内でRNA を
転写させることができる。
【００２２】このように、本発明によればゲノムを任意
に改変した組換え体イヌジステンパーウイルスを作製す
ることができる。従って、例えば、イヌジステンパーウ
イルスの野外流行株の抗原性に関与する遺伝子またはそ
の一部を決定して、その部分を組換えたウイルスを作製
したり、また、病原性に関与する部分を欠失、改変する
などにより人為的弱毒化ワクチンを製造したり、他種ウ
イルスや細菌、寄生虫などの病原性に関与する遺伝子を
挿入して組換えイヌジステンパーウイルスの多価ワクチ
ンを製造したりできる。あるいは、ウイルス核酸の複製
メカニズムの解明により、その宿主細胞内の核酸複製機
構との差を利用した抗ウイルス剤を開発できる。また、
ウイルス蛋白質の機能を解明することにより、ウイルス
粒子感染能や、ウイルス粒子形成性に係わるウイルス由
来あるいは細胞由来の蛋白質をターゲットとした抗ウイ
ルス剤の開発を行うことができる。さらに、RNA の複製
に関与する遺伝子を改変して遺伝子治療用ウイルスベク
ターを作製することができる。
に改変した組換え体イヌジステンパーウイルスを作製す
ることができる。従って、例えば、イヌジステンパーウ
イルスの野外流行株の抗原性に関与する遺伝子またはそ
の一部を決定して、その部分を組換えたウイルスを作製
したり、また、病原性に関与する部分を欠失、改変する
などにより人為的弱毒化ワクチンを製造したり、他種ウ
イルスや細菌、寄生虫などの病原性に関与する遺伝子を
挿入して組換えイヌジステンパーウイルスの多価ワクチ
ンを製造したりできる。あるいは、ウイルス核酸の複製
メカニズムの解明により、その宿主細胞内の核酸複製機
構との差を利用した抗ウイルス剤を開発できる。また、
ウイルス蛋白質の機能を解明することにより、ウイルス
粒子感染能や、ウイルス粒子形成性に係わるウイルス由
来あるいは細胞由来の蛋白質をターゲットとした抗ウイ
ルス剤の開発を行うことができる。さらに、RNA の複製
に関与する遺伝子を改変して遺伝子治療用ウイルスベク
ターを作製することができる。
【００２３】所望の蛋白質を発現させるためには、この
蛋白質をコードする外来性遺伝子を挿入した組換え体イ
ヌジステンパーウイルスを作製し、これを適宜細胞に感
染させ、発現した外来性遺伝子産物を回収する。使用で
きる細胞は、イヌジステンパーウイルスが感染する細胞
であれば任意のものでよいが、例えば、培養された哺乳
動物細胞などが好ましい。培養細胞を用いた場合、発現
した蛋白質は培養液から常法により回収すればよい。
蛋白質をコードする外来性遺伝子を挿入した組換え体イ
ヌジステンパーウイルスを作製し、これを適宜細胞に感
染させ、発現した外来性遺伝子産物を回収する。使用で
きる細胞は、イヌジステンパーウイルスが感染する細胞
であれば任意のものでよいが、例えば、培養された哺乳
動物細胞などが好ましい。培養細胞を用いた場合、発現
した蛋白質は培養液から常法により回収すればよい。
【００２４】また、外来性遺伝子が挿入されたり、特定
の遺伝子が欠失もしくは改変された組換え体イヌジステ
ンパーウイルスを、動物に感染させ、この動物から組
織、細胞または体液を採取することにより、例えば、抗
血清を作製し、治療や診断に応用することができる。組
換え体ウイルスを感染させる動物としては、イヌやフェ
レット等が例示され、採取する組織、細胞としては脾臓
やリンパ節など、採取する体液としては血液やリンパ
液、髄液等が挙げられる。具体例としては、ウイルスや
細菌の病原性に関与する遺伝子を挿入した組換え体ウイ
ルスをイヌに感染させ、血清を得て、この遺伝子がコー
ドする蛋白質に対する抗体を含有する抗血清を製造し
て、ELISA や中和試験に使用することができる。
の遺伝子が欠失もしくは改変された組換え体イヌジステ
ンパーウイルスを、動物に感染させ、この動物から組
織、細胞または体液を採取することにより、例えば、抗
血清を作製し、治療や診断に応用することができる。組
換え体ウイルスを感染させる動物としては、イヌやフェ
レット等が例示され、採取する組織、細胞としては脾臓
やリンパ節など、採取する体液としては血液やリンパ
液、髄液等が挙げられる。具体例としては、ウイルスや
細菌の病原性に関与する遺伝子を挿入した組換え体ウイ
ルスをイヌに感染させ、血清を得て、この遺伝子がコー
ドする蛋白質に対する抗体を含有する抗血清を製造し
て、ELISA や中和試験に使用することができる。
【００２５】
【００２６】
【実施例１】 イヌジステンパーウイルスプラスミドpC
DV（５＋）の作製イヌジステンパーウイルスの野外株Ya
naka株 (本発明者により発症犬より分離) のゲノム遺伝
子配列を配したイヌジステンパーウイルスcDNAを作製し
た。
DV（５＋）の作製イヌジステンパーウイルスの野外株Ya
naka株 (本発明者により発症犬より分離) のゲノム遺伝
子配列を配したイヌジステンパーウイルスcDNAを作製し
た。
【００２７】ウイルスの複製に関与するリーダー配列、
トレーラー配列、およびウイルスを構成する蛋白質をコ
ードするN,P,M,F,H,L の各遺伝子をそれぞれ PCR法を行
って増幅した。PCR 法で用いたプライマーは、ウイルス
を構成する蛋白質をコードする６種類の遺伝子の両端
に、人工的に制限酵素認識配列を配置した増幅DNA 断片
が得られるように設計した。PCR 法で用いたプライマー
は以下の通りである (配列番号１〜12）。 Ｎ遺伝子： 配列番号１：5' GACGTCCGTCAGGGTTCAGACCTACCAGTATGGCT
AGCCTTCTTAAG 3' (BsiWI 部位を含む) 配列番号２：5' ACCTCGAGGCCGGCCTTAATTGAGTAGCTCTCT
3' (FseIとXhoI部位を含む) Ｐ遺伝子： 配列番号３：5' GCCTCGAGGTGTTACATCAGTCACCA 3' (Xho
I 部位を含む) 配列番号４：5' TATCTAGAGTTTAAACTTAAGCATGTGTGATACT
3' (PmeIとXbaI部位を含む) Ｍ遺伝子： 配列番号５：5' ACTCTAGATAATCTATTAACAGGTTCA 3' (Xba
I 部位を含む) 配列番号６：5' TAACGCGTTAGAGAATTTTGAAAAG 3' (MluI
部位を含む) Ｆ遺伝子： 配列番号７：5' TAACGCGTTAGTTCATGAACTAAAACTC 3' (Ml
uI部位を含む) 配列番号８：5' GTGGTACCGCGATCGCTCAGAGTGATCTTACATA
3' (SgfIとkpnI部位を含む) Ｈ遺伝子： 配列番号９：5' GCGGTACCACGTCTTACCTGATTGTTA 3' (kpn
I 部位を含む) 配列番号10：5' GAGTCGACTTAATTAACTATCAAGGTTTTGAACG
3' (PacIとSalI部位を含む) Ｌ遺伝子： 配列番号11：5' AAGTCGACTCTCAATTGAACTTAAGGA 3' (Sal
I 部位を含む) 配列番号12：5' TGGCGGCCGCAGGGTTAGGATCCAGACC 3' (No
tI部位を含む) ウイルスを構成する蛋白質をコードする６種類の遺伝子
は順次連結して、リーダー配列とトレーラー配列を除く
イヌジステンパーウイルスゲノムcDNAを構築した。リー
ダー配列とトレーラー配列はそれぞれオリゴヌクレオチ
ドを生合成し、pMDBl プラスミド(Baron MD and Barret
t T, J.Viorol. 1997, 71(2)1265-1271)のT7プロモータ
ーとリボザイム遺伝子間に挿入した。すなわち、T7プロ
モーター、リーダー配列、トレーラー配列、リボザイム
遺伝子、T7ターミネーターの順に保持するプラスミドを
作製した。このプラスミドのリーダー配列とトレーラー
配列間に、リーダー配列とトレーラー配列を除くイヌジ
ステンパーウイルスゲノムcDNAを挿入して、プラスミド
pCDV（７＋）を作製した。さらにリーダー配列内にある
制限酵素 BsiWI配列と、トレーラー配列内にある制限酵
素NotI配列をイヌジステンパーウイルス遺伝子本来の配
列に再置換を行って、最終的にプラスミドpCDV（５＋）
を作製した。図１および図２にプラスミドpCDV（５＋）
の作製の概略と構成を示す。
トレーラー配列、およびウイルスを構成する蛋白質をコ
ードするN,P,M,F,H,L の各遺伝子をそれぞれ PCR法を行
って増幅した。PCR 法で用いたプライマーは、ウイルス
を構成する蛋白質をコードする６種類の遺伝子の両端
に、人工的に制限酵素認識配列を配置した増幅DNA 断片
が得られるように設計した。PCR 法で用いたプライマー
は以下の通りである (配列番号１〜12）。 Ｎ遺伝子： 配列番号１：5' GACGTCCGTCAGGGTTCAGACCTACCAGTATGGCT
AGCCTTCTTAAG 3' (BsiWI 部位を含む) 配列番号２：5' ACCTCGAGGCCGGCCTTAATTGAGTAGCTCTCT
3' (FseIとXhoI部位を含む) Ｐ遺伝子： 配列番号３：5' GCCTCGAGGTGTTACATCAGTCACCA 3' (Xho
I 部位を含む) 配列番号４：5' TATCTAGAGTTTAAACTTAAGCATGTGTGATACT
3' (PmeIとXbaI部位を含む) Ｍ遺伝子： 配列番号５：5' ACTCTAGATAATCTATTAACAGGTTCA 3' (Xba
I 部位を含む) 配列番号６：5' TAACGCGTTAGAGAATTTTGAAAAG 3' (MluI
部位を含む) Ｆ遺伝子： 配列番号７：5' TAACGCGTTAGTTCATGAACTAAAACTC 3' (Ml
uI部位を含む) 配列番号８：5' GTGGTACCGCGATCGCTCAGAGTGATCTTACATA
3' (SgfIとkpnI部位を含む) Ｈ遺伝子： 配列番号９：5' GCGGTACCACGTCTTACCTGATTGTTA 3' (kpn
I 部位を含む) 配列番号10：5' GAGTCGACTTAATTAACTATCAAGGTTTTGAACG
3' (PacIとSalI部位を含む) Ｌ遺伝子： 配列番号11：5' AAGTCGACTCTCAATTGAACTTAAGGA 3' (Sal
I 部位を含む) 配列番号12：5' TGGCGGCCGCAGGGTTAGGATCCAGACC 3' (No
tI部位を含む) ウイルスを構成する蛋白質をコードする６種類の遺伝子
は順次連結して、リーダー配列とトレーラー配列を除く
イヌジステンパーウイルスゲノムcDNAを構築した。リー
ダー配列とトレーラー配列はそれぞれオリゴヌクレオチ
ドを生合成し、pMDBl プラスミド(Baron MD and Barret
t T, J.Viorol. 1997, 71(2)1265-1271)のT7プロモータ
ーとリボザイム遺伝子間に挿入した。すなわち、T7プロ
モーター、リーダー配列、トレーラー配列、リボザイム
遺伝子、T7ターミネーターの順に保持するプラスミドを
作製した。このプラスミドのリーダー配列とトレーラー
配列間に、リーダー配列とトレーラー配列を除くイヌジ
ステンパーウイルスゲノムcDNAを挿入して、プラスミド
pCDV（７＋）を作製した。さらにリーダー配列内にある
制限酵素 BsiWI配列と、トレーラー配列内にある制限酵
素NotI配列をイヌジステンパーウイルス遺伝子本来の配
列に再置換を行って、最終的にプラスミドpCDV（５＋）
を作製した。図１および図２にプラスミドpCDV（５＋）
の作製の概略と構成を示す。
【００２８】
【実施例２】 cDNAからのイヌジステンパーウイルス再
構成実験 組換えイヌジステンパーウイルスの再構成実験は以下の
通りに行った。６ウエルプレートに通常のトリプシン処
理を施した 293細胞を１ウエル当たり1,000,000 個と５
％ウシ胎児血清を含むDulbecco-MEM培地２mlを添加し、
５％CO 2 、37℃の条件下で24時間培養した。培養液を取
り除き、多重感染度(moi、multiplicity of infection)
が２になるように調整した、T7RNA ポリメラーゼを発現
する組換えワクシニアウイルスMVA-7 を0.2 mlのPBS に
懸濁したものをウエルに添加した。10分間毎にウイルス
液が全体に行き渡るようにプレートを揺らし、30分間感
染を行った。ウイルス液を除去し、このウエルに２mlの
培地を添加した後、0.2 mlのcDNA溶液を滴下した。cDNA
溶液の調製は以下のように行った。
構成実験 組換えイヌジステンパーウイルスの再構成実験は以下の
通りに行った。６ウエルプレートに通常のトリプシン処
理を施した 293細胞を１ウエル当たり1,000,000 個と５
％ウシ胎児血清を含むDulbecco-MEM培地２mlを添加し、
５％CO 2 、37℃の条件下で24時間培養した。培養液を取
り除き、多重感染度(moi、multiplicity of infection)
が２になるように調整した、T7RNA ポリメラーゼを発現
する組換えワクシニアウイルスMVA-7 を0.2 mlのPBS に
懸濁したものをウエルに添加した。10分間毎にウイルス
液が全体に行き渡るようにプレートを揺らし、30分間感
染を行った。ウイルス液を除去し、このウエルに２mlの
培地を添加した後、0.2 mlのcDNA溶液を滴下した。cDNA
溶液の調製は以下のように行った。
【００２９】イヌジステンパーウイルスの複製に必要と
なるプラスミドpGEM-NP 、pGEM-P、pGEM-Lをそれぞれ１
μｇ、１μｇ、0.1 μｇを1.5 mlのサンプリングチュー
ブにとり、さらにpCDV(5＋) を１μｇと滅菌蒸留水を加
えて核酸溶液10μｌを調製した。他方、別のサンプリン
グチューブの中にDulbecco-MEM培地0.17mlを準備して、
20μｌのFugene6(ベーリンガーマンハイム社製) を滴下
し混合後、この状態で室温で15分間静置した。調製した
溶液は上記核酸溶液と調合し、さらに室温で10分間静置
してcDNA溶液とした。cDNA溶液200 μｌをウエル内の培
地に滴下し、静かに攪拌した。
なるプラスミドpGEM-NP 、pGEM-P、pGEM-Lをそれぞれ１
μｇ、１μｇ、0.1 μｇを1.5 mlのサンプリングチュー
ブにとり、さらにpCDV(5＋) を１μｇと滅菌蒸留水を加
えて核酸溶液10μｌを調製した。他方、別のサンプリン
グチューブの中にDulbecco-MEM培地0.17mlを準備して、
20μｌのFugene6(ベーリンガーマンハイム社製) を滴下
し混合後、この状態で室温で15分間静置した。調製した
溶液は上記核酸溶液と調合し、さらに室温で10分間静置
してcDNA溶液とした。cDNA溶液200 μｌをウエル内の培
地に滴下し、静かに攪拌した。
【００３０】前記ウエルを含むプレートを72時間、５％
CO2 、37℃の条件下で培養した。その後、ウエルから１
mlの培地を取り除き、プレートを−80度で３時間凍結さ
せた。次に室温に戻し融解させ、細胞破砕成分を含む懸
濁液を得た。あらかじめ、６ウエルプレートにB95a細胞
を１ウエル当たり1,000,000 個と５％ウシ胎児血清を含
むRPMI1640培地を添加しておき、そのウエルに400 μｌ
の細胞破砕成分を含む懸濁液を滴下した。プレートを24
時間、５％CO2 、37℃の条件下で培養した後、培地を５
％ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地と交換してさらに72
時間同条件下で培養した。イヌジステンパーウイルスの
生成の判定は、イヌジステンパーウイルスの感染によっ
てB95a細胞に現れる細胞傷害性効果(CPE、cytopathogen
ic effect)を指標とした。
CO2 、37℃の条件下で培養した。その後、ウエルから１
mlの培地を取り除き、プレートを−80度で３時間凍結さ
せた。次に室温に戻し融解させ、細胞破砕成分を含む懸
濁液を得た。あらかじめ、６ウエルプレートにB95a細胞
を１ウエル当たり1,000,000 個と５％ウシ胎児血清を含
むRPMI1640培地を添加しておき、そのウエルに400 μｌ
の細胞破砕成分を含む懸濁液を滴下した。プレートを24
時間、５％CO2 、37℃の条件下で培養した後、培地を５
％ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地と交換してさらに72
時間同条件下で培養した。イヌジステンパーウイルスの
生成の判定は、イヌジステンパーウイルスの感染によっ
てB95a細胞に現れる細胞傷害性効果(CPE、cytopathogen
ic effect)を指標とした。
【００３１】
【実施例３】 再構成されたイヌジステンパーウイルス
の判定 イヌジステンパーウイルス全長をコードする遺伝子が挿
入されたpCDV(5＋) から再構成される組換えイヌジステ
ンパーウイルスは、人工的に配置した５種類の制限酵素
認識配列をそれぞれの遺伝子間に持つ。このことを利用
した簡便な組換えイヌジステンパーウイルスCDV (5＋)
の判定を標準的なRT-PCR法(reverse transcriptase-pol
ymerase chain reaction) を検討した。
の判定 イヌジステンパーウイルス全長をコードする遺伝子が挿
入されたpCDV(5＋) から再構成される組換えイヌジステ
ンパーウイルスは、人工的に配置した５種類の制限酵素
認識配列をそれぞれの遺伝子間に持つ。このことを利用
した簡便な組換えイヌジステンパーウイルスCDV (5＋)
の判定を標準的なRT-PCR法(reverse transcriptase-pol
ymerase chain reaction) を検討した。
【００３２】組換えイヌジステンパーウイルスをB95a細
胞に感染させ、CPE が観察された後に細胞を遠心管に移
し、2,000rpm、５分間、４℃で遠心を行い細胞を回収し
た。この細胞からIsogen (日本ジーン社製) でRNA を精
製し、試料とした。組換えイヌジステンパーウイルス感
染細胞から精製されたRNA の対照試料として、イヌジス
テンパーウイルス野外株Yanaka株感染細胞からRNA を得
て、DNase 処理を施した。これらのRNA 試料をPCR 反応
の鋳型として用いる場合、一部は逆転写酵素とランダム
プライマーによる逆転写反応によって合成させたcDNAを
用い、一部はRNA 試料のままPCR 反応に供した。PCR の
対照試料として、pCDV(5＋) 、牛疫ウイルスRBOK株全長
をコードする遺伝子を含むプラスミド、滅菌蒸留水を準
備した。反応に用いるプライマーとして、イヌジステン
パーウイルスのＮ遺伝子とＰ遺伝子間を増幅するプライ
マー (配列番号：13および14) と、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子
間を増幅するプライマー (配列番号：15および16) の２
対を準備した。PCR 反応は94℃・１分、55℃・１分、72
℃・１分を１サイクルとして33サイクル連続して行っ
た。PCR 反応後、１％アガロースゲルで増幅されたDNA
断片を視覚化した。 プライマー配列 配列番号13：5'GTGTCAGAAATAGCATCCAAG 3' 配列番号14：5'CAGTTGACTTGAGTGCAGAT 3' 配列番号15：5'ATTGACAAAGAGTCTAGCTC 3' 配列番号16：5'ATGCCCAAATTACCTCGGCT 3' 結果を図３の左側に示す。
胞に感染させ、CPE が観察された後に細胞を遠心管に移
し、2,000rpm、５分間、４℃で遠心を行い細胞を回収し
た。この細胞からIsogen (日本ジーン社製) でRNA を精
製し、試料とした。組換えイヌジステンパーウイルス感
染細胞から精製されたRNA の対照試料として、イヌジス
テンパーウイルス野外株Yanaka株感染細胞からRNA を得
て、DNase 処理を施した。これらのRNA 試料をPCR 反応
の鋳型として用いる場合、一部は逆転写酵素とランダム
プライマーによる逆転写反応によって合成させたcDNAを
用い、一部はRNA 試料のままPCR 反応に供した。PCR の
対照試料として、pCDV(5＋) 、牛疫ウイルスRBOK株全長
をコードする遺伝子を含むプラスミド、滅菌蒸留水を準
備した。反応に用いるプライマーとして、イヌジステン
パーウイルスのＮ遺伝子とＰ遺伝子間を増幅するプライ
マー (配列番号：13および14) と、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子
間を増幅するプライマー (配列番号：15および16) の２
対を準備した。PCR 反応は94℃・１分、55℃・１分、72
℃・１分を１サイクルとして33サイクル連続して行っ
た。PCR 反応後、１％アガロースゲルで増幅されたDNA
断片を視覚化した。 プライマー配列 配列番号13：5'GTGTCAGAAATAGCATCCAAG 3' 配列番号14：5'CAGTTGACTTGAGTGCAGAT 3' 配列番号15：5'ATTGACAAAGAGTCTAGCTC 3' 配列番号16：5'ATGCCCAAATTACCTCGGCT 3' 結果を図３の左側に示す。
【００３３】この結果、２対のプライマーを用いた場合
とも、pCDV(5＋) 、組換えイヌジステンパーウイルス感
染細胞RNA およびイヌジステンパーウイルス野外株Yana
ka株で目的とする大きさのDNA 断片が認められ、選択し
たプライマーはイヌジステンパーウイルスに対して特異
的に増幅すること、組換えイヌジステンパーウイルス感
染細胞RNA 試料において再構成に使用したpCDV(5＋) の
混在が認められなかったことが明らかになった。さら
に、pCDV(5＋) 、組換えイヌジステンパーウイルス感染
細胞RNA およびイヌジステンパーウイルス野外株Yanaka
株を試料として得られたDNA 断片を精製して、pCDV(5
＋) のＮ遺伝子とＰ遺伝子間に人工的に配置した制限酵
素認識配列を切断するXhoIと、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子間に
配置した制限酵素認識配列を切断するXbaIでそれぞれの
遺伝子断片を切断した。その結果を図３の右側に示す。
とも、pCDV(5＋) 、組換えイヌジステンパーウイルス感
染細胞RNA およびイヌジステンパーウイルス野外株Yana
ka株で目的とする大きさのDNA 断片が認められ、選択し
たプライマーはイヌジステンパーウイルスに対して特異
的に増幅すること、組換えイヌジステンパーウイルス感
染細胞RNA 試料において再構成に使用したpCDV(5＋) の
混在が認められなかったことが明らかになった。さら
に、pCDV(5＋) 、組換えイヌジステンパーウイルス感染
細胞RNA およびイヌジステンパーウイルス野外株Yanaka
株を試料として得られたDNA 断片を精製して、pCDV(5
＋) のＮ遺伝子とＰ遺伝子間に人工的に配置した制限酵
素認識配列を切断するXhoIと、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子間に
配置した制限酵素認識配列を切断するXbaIでそれぞれの
遺伝子断片を切断した。その結果を図３の右側に示す。
【００３４】pCDV(5＋) および組換えイヌジステンパー
ウイルス感染細胞RNA から増幅されたDNA 断片は、それ
ぞれの制限酵素によって切断されて一致したパターンを
示したが、イヌジステンパーウイルス野外株Yanaka株感
染細胞RNA から増幅されたDNA 断片では両者とも切断が
みられなかった。
ウイルス感染細胞RNA から増幅されたDNA 断片は、それ
ぞれの制限酵素によって切断されて一致したパターンを
示したが、イヌジステンパーウイルス野外株Yanaka株感
染細胞RNA から増幅されたDNA 断片では両者とも切断が
みられなかった。
【００３５】この結果から、pCDV(5＋) を用いたイヌジ
ステンパーウイルス再構成系で、ウイルスを再構成する
ことができたことが明らかである。さらに、上記の方法
は簡便な組換えイヌジステンパーウイルスCDV (5＋) の
判定に有効である。
ステンパーウイルス再構成系で、ウイルスを再構成する
ことができたことが明らかである。さらに、上記の方法
は簡便な組換えイヌジステンパーウイルスCDV (5＋) の
判定に有効である。
【００３６】
【実施例４】 再構成された組換えイヌジステンパーウ
イルスの複製能の検討 再構成させた組換えイヌジステンパーウイルスCDV (5
＋) と、もととなったイヌジステンパーウイルス野外株
Yanaka株との培養細胞での複製能を検討した。
イルスの複製能の検討 再構成させた組換えイヌジステンパーウイルスCDV (5
＋) と、もととなったイヌジステンパーウイルス野外株
Yanaka株との培養細胞での複製能を検討した。
【００３７】12ウエルプレートに通常のトリプシン処理
を施したB95a細胞を１ウエル当たり700,000 個と２％ウ
シ胎児血清を含むRPMI1640培地１mlを添加し、５％C
O2 、37℃の条件下で１時間培養して、細胞をプレート
に吸着させた。培養液を取り除き、moi が0.001 になる
ように調整した、組換えイヌジステンパーウイルスと野
外株Yanaka株をそれぞれを0.2 mlのPBS に懸濁したもの
をウエルに添加した。10分間毎にウイルス液が全体に行
き渡るようにプレートを揺らし、１時間感染を行った。
ウイルス液を除去し、このウエルに1.5 mlの培地を添加
した後、５％CO2 、37℃の条件下で培養を行った。感染
細胞を培地ともども、６、12時間、１日、２日、３日、
４日、５日、６日、７日後に回収した後、凍結融解を３
回繰り返し行った。さらに氷冷で超音波破砕後、3000rp
m 、10分間遠心してウイルス試料とした。あらかじめB9
5a細胞を96ウエルプレートに１ウエル当たり30,000個と
２％ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地0.11mlを添加し
た。ウイルス試料は10倍から1,000,000 倍に希釈して0.
1 mlを上記B95a細胞と混合した。培養細胞中に現れたCP
Eを指標としてウイルス濃度を決定し、ウイルスの複製
能を測定した。その結果を図４に示す。
を施したB95a細胞を１ウエル当たり700,000 個と２％ウ
シ胎児血清を含むRPMI1640培地１mlを添加し、５％C
O2 、37℃の条件下で１時間培養して、細胞をプレート
に吸着させた。培養液を取り除き、moi が0.001 になる
ように調整した、組換えイヌジステンパーウイルスと野
外株Yanaka株をそれぞれを0.2 mlのPBS に懸濁したもの
をウエルに添加した。10分間毎にウイルス液が全体に行
き渡るようにプレートを揺らし、１時間感染を行った。
ウイルス液を除去し、このウエルに1.5 mlの培地を添加
した後、５％CO2 、37℃の条件下で培養を行った。感染
細胞を培地ともども、６、12時間、１日、２日、３日、
４日、５日、６日、７日後に回収した後、凍結融解を３
回繰り返し行った。さらに氷冷で超音波破砕後、3000rp
m 、10分間遠心してウイルス試料とした。あらかじめB9
5a細胞を96ウエルプレートに１ウエル当たり30,000個と
２％ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地0.11mlを添加し
た。ウイルス試料は10倍から1,000,000 倍に希釈して0.
1 mlを上記B95a細胞と混合した。培養細胞中に現れたCP
Eを指標としてウイルス濃度を決定し、ウイルスの複製
能を測定した。その結果を図４に示す。
【００３８】組換えイヌジステンパーウイルスの複製能
CDV (5＋) は元株Yanaka株と同様の複製能を再現した。
CDV (5＋) は元株Yanaka株と同様の複製能を再現した。
【００３９】
【実施例５】 構成遺伝子の一部を変異させたイヌジス
テンパーウイルスの再構成と複製能の検討 イヌジステンパーウイルスの構成遺伝子の一つであるＰ
遺伝子からＰ蛋白質、Ｖ蛋白質、Ｃ蛋白質の３つの蛋白
質が翻訳されることが知られている。そのうちＶ蛋白質
は、Ｐ遺伝子(P mRNA)の中途に1G残基が挿入されたV mR
NAから翻訳され、前半部はＰ蛋白質と一致し、後半部は
別のアミノ酸配列を持つ。イヌジステンパーウイルスで
はP mRNAが７に対してV mRNAが３の割合で転写される。
Ｖ蛋白質は病原性に関与していることが報告されてい
て、例えばセンダイウイルスマウス感染実験においてＶ
蛋白質欠損ウイルスは弱毒化し、重篤な病原性を示さな
かった。そこで、Ｐ遺伝子を改変してV mRNAの発現を欠
損させた組換えイヌジステンパーウイルスの作出を以下
のようにして行った (図５参照) 。
テンパーウイルスの再構成と複製能の検討 イヌジステンパーウイルスの構成遺伝子の一つであるＰ
遺伝子からＰ蛋白質、Ｖ蛋白質、Ｃ蛋白質の３つの蛋白
質が翻訳されることが知られている。そのうちＶ蛋白質
は、Ｐ遺伝子(P mRNA)の中途に1G残基が挿入されたV mR
NAから翻訳され、前半部はＰ蛋白質と一致し、後半部は
別のアミノ酸配列を持つ。イヌジステンパーウイルスで
はP mRNAが７に対してV mRNAが３の割合で転写される。
Ｖ蛋白質は病原性に関与していることが報告されてい
て、例えばセンダイウイルスマウス感染実験においてＶ
蛋白質欠損ウイルスは弱毒化し、重篤な病原性を示さな
かった。そこで、Ｐ遺伝子を改変してV mRNAの発現を欠
損させた組換えイヌジステンパーウイルスの作出を以下
のようにして行った (図５参照) 。
【００４０】イヌジステンパーウイルスゲノムcDNAを含
むプラスミドpCDV(5＋) のＰ遺伝子のRNA 編集領域 AAA
AAGGG(2485〜2492) をAAGAAAGGにQuick Change site-di
rected mutagenesis kit (Stratagene社) を用いて変異
させ、プラスミドpCDV(5＋)dV を作製した。実施例２に
記載の方法に従って293 細胞に導入し、B95a細胞で組換
えイヌジステンパーウイルスCDV (5＋)dV を再構成させ
た。次いで、実施例３に記載の方法により、組換えイヌ
ジステンパーウイルスであることを確認した。さらに、
組換えイヌジステンパーウイルスのＰ遺伝子の変異部位
の確認は定法のRT-PCR法で以下のようにして行った。
むプラスミドpCDV(5＋) のＰ遺伝子のRNA 編集領域 AAA
AAGGG(2485〜2492) をAAGAAAGGにQuick Change site-di
rected mutagenesis kit (Stratagene社) を用いて変異
させ、プラスミドpCDV(5＋)dV を作製した。実施例２に
記載の方法に従って293 細胞に導入し、B95a細胞で組換
えイヌジステンパーウイルスCDV (5＋)dV を再構成させ
た。次いで、実施例３に記載の方法により、組換えイヌ
ジステンパーウイルスであることを確認した。さらに、
組換えイヌジステンパーウイルスのＰ遺伝子の変異部位
の確認は定法のRT-PCR法で以下のようにして行った。
【００４１】ウイルスRNA の精製は、B95a細胞にウイル
スを感染させ、CPE が観察された後に細胞を遠心管に移
し、2,000rpm、５分間、４℃で遠心を行い細胞を得、こ
の細胞からIsogen (日本ジーン社製) でRNA を精製する
ことより行う。試料としては、プラスミドpCDV(5＋) か
ら再構成させた組換えイヌジステンパーウイルスとプラ
スミドpCDV(5＋)dV から再構成させた組換えイヌジステ
ンパーウイルスを用意した。プライマーとしてはＰ遺伝
子のRNA 編集領域を含む領域を増幅するプライマー (配
列番号：17および14) を用いた。RNA 試料は、一部は
(1) 逆転写酵素とプライマー (配列番号：18) で、一部
は(2) 逆転写酵素とオリゴdTプライマーでcDNAを合成さ
せた。(1) のcDNAはウイルスゲノムの変異部位の確認、
(2) はゲノムから転写されるＰ遺伝子mRNAの変異部位の
確認のために用いた。PCR 反応は94℃・１分、55℃・１
分、72℃・１分を１サイクルとして30サイクル連続して
行った。PCR 反応後、増幅されたDNA 断片を１％アガロ
ースゲルにおいて視覚化し、切り出して精製を行った。
精製したDNA 断片はBig-dye-terminator sequence kit
(ABI社) によりプライマー (配列番号：17) を用いてdi
rect sequence 法を行って塩基配列を決定した。 プライマー配列 配列番号17：5'TGCTTCATCTAACTGGGGAT 3' 配列番号18：5'GATTCTGGCGAAGATTAGGC 3' その結果、(1) では、野外株Yanaka株と組換えイヌジス
テンパーウイルスCDV(5+) はＰ遺伝子内のRNA 編集領域
での変異はないが、組換えイヌジステンパーウイルスCD
V(5+)dV ではRNA 編集領域の変異が確認された。(2) に
おいて、野外株Yanaka株と組換えイヌジステンパーウイ
ルスCDV(5+) ではＰ遺伝子mRNAとＶ遺伝子mRNAの両方が
混在するので、塩基配列を表すシグナルがRNA 編集領域
以降混在していた。一方、組換えイヌジステンパーウイ
ルスCDV(5+)dV ではＰ遺伝子mRNAを示す単一のシグナル
が検出された。
スを感染させ、CPE が観察された後に細胞を遠心管に移
し、2,000rpm、５分間、４℃で遠心を行い細胞を得、こ
の細胞からIsogen (日本ジーン社製) でRNA を精製する
ことより行う。試料としては、プラスミドpCDV(5＋) か
ら再構成させた組換えイヌジステンパーウイルスとプラ
スミドpCDV(5＋)dV から再構成させた組換えイヌジステ
ンパーウイルスを用意した。プライマーとしてはＰ遺伝
子のRNA 編集領域を含む領域を増幅するプライマー (配
列番号：17および14) を用いた。RNA 試料は、一部は
(1) 逆転写酵素とプライマー (配列番号：18) で、一部
は(2) 逆転写酵素とオリゴdTプライマーでcDNAを合成さ
せた。(1) のcDNAはウイルスゲノムの変異部位の確認、
(2) はゲノムから転写されるＰ遺伝子mRNAの変異部位の
確認のために用いた。PCR 反応は94℃・１分、55℃・１
分、72℃・１分を１サイクルとして30サイクル連続して
行った。PCR 反応後、増幅されたDNA 断片を１％アガロ
ースゲルにおいて視覚化し、切り出して精製を行った。
精製したDNA 断片はBig-dye-terminator sequence kit
(ABI社) によりプライマー (配列番号：17) を用いてdi
rect sequence 法を行って塩基配列を決定した。 プライマー配列 配列番号17：5'TGCTTCATCTAACTGGGGAT 3' 配列番号18：5'GATTCTGGCGAAGATTAGGC 3' その結果、(1) では、野外株Yanaka株と組換えイヌジス
テンパーウイルスCDV(5+) はＰ遺伝子内のRNA 編集領域
での変異はないが、組換えイヌジステンパーウイルスCD
V(5+)dV ではRNA 編集領域の変異が確認された。(2) に
おいて、野外株Yanaka株と組換えイヌジステンパーウイ
ルスCDV(5+) ではＰ遺伝子mRNAとＶ遺伝子mRNAの両方が
混在するので、塩基配列を表すシグナルがRNA 編集領域
以降混在していた。一方、組換えイヌジステンパーウイ
ルスCDV(5+)dV ではＰ遺伝子mRNAを示す単一のシグナル
が検出された。
【００４２】よって、組換えイヌジステンパーウイルス
CDV(5+)dV ではＰ遺伝内のRNA 編集領域の変異によって
Ｖ遺伝子発現が欠損していることが明らかである。
CDV(5+)dV ではＰ遺伝内のRNA 編集領域の変異によって
Ｖ遺伝子発現が欠損していることが明らかである。
【００４３】
【発明の効果】本発明によって、イヌジステンパーウイ
ルスcDNAより効率よくウイルス粒子を再構成する系が確
立され、イヌジステンパーウイルスにおける遺伝子操作
が可能となった。所望の外来性遺伝子を含むか、または
所望の遺伝子が欠失もしくは改変されたゲノムを保持
し、伝播力を有する組換え体イヌジステンパーウイルス
を作製することができるため、弱毒ウイルスの作製や多
価ウイルスの作製が可能となった。
ルスcDNAより効率よくウイルス粒子を再構成する系が確
立され、イヌジステンパーウイルスにおける遺伝子操作
が可能となった。所望の外来性遺伝子を含むか、または
所望の遺伝子が欠失もしくは改変されたゲノムを保持
し、伝播力を有する組換え体イヌジステンパーウイルス
を作製することができるため、弱毒ウイルスの作製や多
価ウイルスの作製が可能となった。
【００４４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING ＜110 ＞NIPPON MEDICAL RESEARCH, INC. ＜120 ＞RECOMBINANT CANINE DISTEMPER VIRUS AND METHOD FOR PRODUCTION THE REOF ＜130 ＞N18X12P ＜160 ＞18 ＜210 ＞1 ＜211 ＞47 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying N gene of canine distemper virus ＜400 ＞1 gacgtccgtc agggttcaga cctaccagta tggctagcct tcttaag 47 ＜210 ＞2 ＜211 ＞33 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying N gene of canine distemper virus ＜400 ＞2 acctcgaggc cggccttaat tgagtagctc tct 33 ＜210 ＞3 ＜211 ＞26 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying P gene of canine distemper virus ＜400 ＞3 gcctcgaggt gttacatcag tcacca 26 ＜210 ＞4 ＜211 ＞34 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying P gene of canine distemper virus ＜400 ＞4 tatctagagt ttaaacttaa gcatgtgtga tact 34 ＜210 ＞5 ＜211 ＞27 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying M gene of canine distemper virus ＜400 ＞5 actctagata atctattaac aggttca 27 ＜210 ＞6 ＜211 ＞25 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying M gene of canine distemper virus ＜400 ＞6 taacgcgtta gagaattttg aaaag 25 ＜210 ＞7 ＜211 ＞28 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying F gene of canine distemper virus ＜400 ＞7 taacgcgtta gttcatgaac taaaactc 28 ＜210 ＞8 ＜211 ＞34 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying F gene of canine distemper virus ＜400 ＞8 gtggtaccgc gatcgctcag agtgatctta cata 34 ＜210 ＞9 ＜211 ＞27 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying H gene of canine distemper virus ＜400 ＞9 gcggtaccac gtcttacctg attgtta 27 ＜210 ＞10 ＜211 ＞34 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying H gene of canine distemper virus ＜400 ＞10 gagtcgactt aattaactat caaggttttg aacg 34 ＜210 ＞11 ＜211 ＞27 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying L gene of canine distemper virus ＜400 ＞11 aagtcgactc tcaattgaac ttaagga 27 ＜210 ＞12 ＜211 ＞28 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying L gene of canine distemper virus ＜400 ＞12 tggcggccgc agggttagga tccagacc 28 ＜210 ＞13 ＜211 ＞21 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying a region containing non-coding re gion between N gene and P gene of canine distemper virus ＜400 ＞13 gtgtcagaaa tagcatccaa g 21 ＜210 ＞14 ＜211 ＞20 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying a region containing non-coding re gion between N gene and P gene of canine distemper virus ＜400 ＞14 cagttgactt gagtgcagat 20 ＜210 ＞15 ＜211 ＞20 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying a region containing non-coding re gion between P gene and M gene of canine distemper virus ＜400 ＞15 attgacaaag agtctagctc 20 ＜210 ＞16 ＜211 ＞20 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying a region containing non-coding re gion between P gene and M gene of canine distemper virus ＜400 ＞16 atgcccaaat tacctcggct 20 ＜210 ＞17 ＜211 ＞20 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for amplifying a region containing editing site in P gene of canine distemper virus ＜400 ＞17 tgcttcatct aactggggat 20 ＜210 ＞18 ＜211 ＞20 ＜212 ＞DNA ＜213 ＞Artificial Sequence ＜220 ＞ ＜223 ＞Primer designed for producing cDNA of a region of canine distemp er virus ＜400 ＞18 gattctggcg aagattaggc 20
【図１】プラスミドpCDV(5+)の作製の概略を示す図であ
る。
る。
【図２】プラスミドpCDV(5+)の作製の概略を示す図であ
る。
る。
【図３】組換えウイルス判定のためのRT-PCR法の結果を
示す図である。
示す図である。
【図４】ウイルスの複製能を示す図である。
【図５】pCDV(5+)dVの作出法を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 14/13 Ｃ１２Ｒ 1:91） 16/10 (Ｃ１２Ｎ 7/00 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA32 CA04 CA06 CA11 DA02 EA04 FA02 FA07 GA11 GA18 HA08 4B063 QA01 QA13 QQ10 QQ42 QQ52 QR08 QR14 QR31 QR32 QR33 QR62 QR77 QR80 QS16 QS25 4B064 AG32 CA10 CA12 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA95Y AB01 AC20 BA02 BA14 CA24 CA45 4H045 AA11 AA20 CA01 DA75 DA86 FA72 FA74
Claims (15)
- 【請求項１】 所望の外来遺伝子を含むかまたは所望の
遺伝子が欠失もしくは改変されたゲノムを保持し、伝播
力を有する組換え体イヌジステンパーウイルス。 - 【請求項２】 １以上のイヌジステンパーウイルスゲノ
ムの遺伝子が改変されている、請求項１記載の組換え体
イヌジステンパーウイルス。 - 【請求項３】 宿主内で発現可能な外来遺伝子を有す
る、請求項１または２記載の組換え体イヌジステンパー
ウイルス。 - 【請求項４】 イヌジステンパーウイルスを構成する機
能蛋白質遺伝子間に人為的に制限酵素認識配列を配置し
ている、請求項１記載の組換え体イヌジステンパーウイ
ルス。 - 【請求項５】 各制限酵素認識配列中に外来遺伝子が挿
入されているか、または各制限酵素認識配列間の遺伝子
が交換、欠失もしくは改変されている、請求項４記載の
組換え体イヌジステンパーウイルス。 - 【請求項６】 請求項１ないし５のいずれかの項記載の
組換え体イヌジステンパーウイルスに含まれるRNA また
はcRNA。 - 【請求項７】 請求項６記載の組換え体イヌジステンパ
ーウイルスゲノムRNA またはcRNAを転写しうる鋳型cDNA
を含むDNA 。 - 【請求項８】 イヌジステンパーウイルスのＮ蛋白質、
Ｐ蛋白質およびＬ蛋白質 (各蛋白質は同等の活性を有す
る蛋白質でもよい) を発現する宿主に、所望の外来遺伝
子を含むかまたは所望の遺伝子が欠失もしくは改変され
たイヌジステンパーウイルスゲノムRNA またはcRNAを導
入することを含む、伝播力を有する組換え体イヌジステ
ンパーウイルスの製造方法。 - 【請求項９】 イヌジステンパーウイルスのＮ蛋白質、
Ｐ蛋白質およびＬ蛋白質 (各蛋白質は同等の活性を有す
る蛋白質でもよい) を発現する宿主に、所望の外来遺伝
子を含むかまたは所望の遺伝子が欠失もしくは改変され
たイヌジステンパーウイルスゲノムRNA またはcRNAを転
写しうる鋳型cDNAを含むDNA と、該DNA を鋳型として細
胞内で前記RNA を転写しうるユニットとを導入すること
を含む、伝播力を有する組換え体イヌジステンパーウイ
ルスの製造方法。 - 【請求項10】 (a) イヌジステンパーウイルスのゲノム
RNA またはcRNAを転写しうる鋳型cDNAを含むDNA と、
(b) 該DNA を鋳型として試験管内または細胞内でRNA を
転写しうるユニットとを含むキット。 - 【請求項11】 (a) イヌジステンパーウイルスのＮ蛋白
質、Ｐ蛋白質およびＬ蛋白質 (各蛋白質は同等の活性を
有する蛋白質でもよい) を発現する宿主、(b) イヌジス
テンパーウイルスのゲノムRNA またはcRNAを転写しうる
鋳型cDNAを含むDNA 、および(c) 該DNA を鋳型として試
験管内または細胞内でRNA を転写しうるユニットを含む
キット。 - 【請求項12】 宿主に請求項３記載の組換え体イヌジス
テンパーウイルスを感染させ、発現した外来性蛋白質を
回収する工程を含む、外来性蛋白質の製造方法。 - 【請求項13】 請求項３記載の組換え体イヌジステンパ
ーウイルスを感染させた動物から体液を回収することに
よって得られる、発現した外来性蛋白質を含む体液。 - 【請求項14】 請求項１ないし３のいずれかの項記載の
組換え体イヌジステンパーウイルスを感染させた動物か
ら採取される組織、細胞および体液。 - 【請求項15】 請求項１ないし３のいずれかの項記載の
組換え体イヌジステンパーウイルスを感染させた動物か
ら採取される、外来遺伝子がコードする蛋白質または改
変されたウイルス遺伝子がコードする蛋白質に対する抗
血清。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000098786A JP2001275684A (ja) | 2000-03-31 | 2000-03-31 | 組換え体イヌジステンパーウイルスおよびその作製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000098786A JP2001275684A (ja) | 2000-03-31 | 2000-03-31 | 組換え体イヌジステンパーウイルスおよびその作製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6773710B2 (en) | 2002-04-05 | 2004-08-10 | Nippon Biologicals, Inc. | Recombinant canine distemper virus vaccine against canine distemper and leishmaniasis |
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63502722A (ja) * | 1986-03-07 | 1988-10-13 | コ−ジェント リミティド | Ｈｃｍｖの糖タンパク質類、それらに対する抗体類及びｈｃｍｖワクチンの産生法、並びにそれらのための組換えベクタ− |
| WO1997016539A1 (en) * | 1995-11-01 | 1997-05-09 | Dnavec Research Inc. | Recombinant sendai virus |
-
2000
- 2000-03-31 JP JP2000098786A patent/JP2001275684A/ja active Pending
Patent Citations (2)
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| JPS63502722A (ja) * | 1986-03-07 | 1988-10-13 | コ−ジェント リミティド | Ｈｃｍｖの糖タンパク質類、それらに対する抗体類及びｈｃｍｖワクチンの産生法、並びにそれらのための組換えベクタ− |
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