JP2001275666A - ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡをクローニングする方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、cDNAライブラリーから簡便にcDNAク
ローンをクローニングする方法を提供することを課題と
する。 【解決手段】該課題を解決するために、本発明は、cDNA
ライブラリーからcDNAをクローニングする方法であっ
て、 （ａ）cDNAクローンを含有する微生物を結合し得る担体
を、前記微生物を含む集団と接触せしめて、前記微生物
を前記担体に結合せしめる工程と； （ｂ）微生物を結合せしめた担体から微生物を一個ずつ
解離させることにより、クローンを単離する工程と； （ｃ）前記クローンからcDNAクローンを採取する工程
と；を備えた方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、cDNAライブラリー
からcDNAをクローニングする方法に関する。

【０００２】より具体的には、担体を用いてcDNAライブ
ラリーからcDNAをクローニングする方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】各生物が保持する全遺伝子の構造が、ゲ
ノムシーケンスプロジェクトの進展により次々と明らか
にされつつある。この成果をどのように生かして生命現
象のなぞ解きを行うかは、大きな課題といえ、その一つ
として、細胞内における全ての遺伝子の発現を一度にモ
ニターするシステムの構築が考えられる。微生物で3000
個、ヒトで約10万個存在すると推定されている遺伝子全
てをモニターする簡便な方法としてDNAマイクロアレイ
を用いた解析法が開発されている(1,2)（以下、括弧内
の数字は末尾に列記されている参照文献を示す）。

【０００４】DNAマイクロアレイでは、大量解析、検出
感度の向上、マイクロ化によるサンプルの節約、データ
取得の自動化、及びデータ処理による簡便化等が期待さ
れている。このDNAマイクロアレイは大きく分けてDNAを
ガラス表面上で合成していくタイプ（DNAチップ）と、
予め調製したDNAを機械的に並べていくタイプ（DNAマイ
クロアレイ）がある。合成型のDNAチップは、Fodorら
が、1991年にコンビナトリアルケミストリーと半導体製
造用光リソグラフの技術を合体させることにより、基盤
上にポリマーを合成する技術を開発した(3)。

【０００５】光リソグラフ法はきわめて微細な表面加工
が可能なので、現在の技術の中では、最も集積度の高い
DNAマイクロアレイを作ることができる。この方法でガ
ラス基盤上に合成できるDNAの長さは20塩基対程度と言
われている。しかし、そのままオリゴマーをデザインし
ているので実際、発現パターンから面白そうな遺伝子が
見つかったとしても、その遺伝子が物理的にクローンと
して存在しているか、入手可能かどうかが疑問である。

【０００６】一方、張り付け型のDNAマイクロアレイ
は、スタンフォード大学のBrownやDavisのグループが、
スライドガラスにDNAを貼り付けていくタイプのDNAマイ
クロアレイを作製し、蛍光検出する方法を考案した
(4)。この方法は大掛りな半導体製造機を必要とせず、D
NAアレイ機及び検出機があれば、do it yourselfで始め
ることができる。貼り付けるDNAを任意に選べるのが利
点であるが、その一方で、DNAのコレクションを調製し
なければならない煩雑さがある。ピン先で物理的にスポ
ットしていくので、DNAの高密度化は光リソグラフ方式
よりは劣るが、約1万のDNAを乗せることができる。その
際、個々のcDNAクローンを必要とするが、大量のcDNAク
ローンの取り扱いはなかなか大変で、市販のものを購入
するか、手持ちのcDNAを大腸菌体等にin vitroパッケー
ジングしたものを寒天培地上に塗り広げ、培養し、コロ
ニーとなるまで増やし、それを一つずつ竹串等でつつい
てクローンを揃えなければならない。これを自動化した
装置が最近市販されたが、寒天培地上にコロニーを分散
させて培養するのは慣用手法と同じであり、技術を要す
るし煩雑である。一方、細胞を一つずつ分離する方法と
してセルソーターがあるが、細胞より小さな菌体を分離
するのは困難である。

【０００７】また、DNAを不溶性担体に固相化する方法
（特開平5-283518）や、塩基配列決定法のために不溶性
担体に一分子の核酸を固相化する方法は、報告されてる
が（特開平6-148076）ライブラリーのクローニングに応
用した例はまだない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、核酸に
関連した従来の方法は、約１万のDNAを乗せるために
は、大量のcDNAクローンを取り扱わなければならず、な
かなか大変で、市販のものを購入するか、手持ちのcDNA
を大腸菌体等にin vitroパッケージングしたものを寒天
培地上に塗り広げ、培養し、コロニーを一つ一つ竹串等
でつついてクローンを揃えなければならない。

【０００９】市販のcDNAクローンは高価であり、クロー
ン間でコンタミしたり、ファージに感染していたりする
問題が発生している。また、実験の目的に応じてライブ
ラリーを選択することができない。さらに、セルソータ
ーでは、細胞より小さな菌体などを分離するのは困難で
あるという問題がある。

【００１０】この点、不溶性担体一つに菌体を一つ吸着
させれば菌体よりもサイズが大きくなるので、cDNAクロ
ーンを一つ一つ分離することが可能となり、その後、分
離した菌体を一個体から増やすことでクローン化するこ
とができる。また、96穴、384穴等のマイクロプレート
で培養することで大量のcDNAクローンを提供することが
できる。

【００１１】本発明は、上記事情に鑑みてなされたもの
であり、cDNAクローンを含有する微生物を担体に結合せ
しめた後、微生物が吸着した担体を一個ずつ採取するこ
とにより、cDNAクローンを含む微生物を単離する方法を
提供し、従来技術の問題を一挙に解決することを目的と
する。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記課題を達成するため
に、本発明は、複数種の細胞を含む細胞集団からクロー
ンを単離する方法であって、 （ａ）前記細胞を結合し得る担体を前記細胞集団に添加
して、前記細胞を前記担体に略一対一の割合で結合せし
める工程と； （ｂ）細胞を結合せしめた担体から担体一個毎に細胞を
解離させることにより、クローンを単離する工程と；を
備えた方法を提供する。

【００１３】本発明は、さらに、上記方法を用いてcDNA
クローンを含む微生物を単離する方法、及び該方法を用
いてcDNAライブラリーからcDNAをクローニングする方法
も提供する。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明は、複数種の細胞を含む細
胞集団からクローンを単離する方法を提供する。

【００１５】本方法では、複数種の細胞を含む細胞集団
に、細胞を結合し得る担体を接触させた後、担体から細
胞を一個ずつ解離させることにより、クローンを単離す
る。

【００１６】本方法を適用すべき好ましい細胞は、微生
物、とりわけ大腸菌であるが、これに限定されない。

【００１７】本明細書において、「クローン」とは、均
一の細胞又は均一のDNA配列の集団をいう。従って、「c
DNAクローン」とは、単一種のcDNAに相当するDNA配列を
含んでなる集団を意味する。

【００１８】本発明の方法では、細胞を結合し得る担体
を細胞集団に接触させることにより、細胞を担体に結合
させる。「接触」とは、担体が細胞を結合し得る状態に
することをいう。典型的には、細胞集団に担体を添加す
るか、又は担体に細胞集団を添加する。あるいは、担体
存在下で細胞を培養してもよい。

【００１９】本発明の方法に使用し得る「担体」は、セ
ルロース、コラーゲン、プラスチック、ガラス等の不溶
性担体である。担体の形状は、球状、板状、紐状等任意
の形状であり得、サイズも任意の大きさであり得るが、
後述されているように、セルソーター等で細胞が結合し
た担体を選別する場合には、使用する細胞の数倍の大き
さであることが好ましい。「担体」は、試料中に浮遊し
た粒子であり得る。あるいは、マイクロプレート等の支
持体であってもよい。

【００２０】「担体」は、細胞、例えば大腸菌を結合し
得るものでなければならない。細胞を結合し得る担体
は、細胞を結合し得る物質（以下細胞結合物質と称す
る）を担体上に固相することによって調製し得る。細胞
が、大腸菌等のグラム陰性菌の場合には、細胞を結合し
得る前記物質は、例えば、抗リポ多糖（以下、LPS(lipo
polysaccharide)と略記する）抗体であり得るが、これ
に限定されない。

【００２１】細胞を一個体ずつ採集できるように、細胞
結合物質は、ほぼ担体一分子当り一分子の割合になるよ
うに、すなわち「略一対一の割合で」担体に固相するこ
とが望ましい。ここで、「略一対一の割合で」とは、少
なくとも25%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは
75%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95
%以上の担体が、一対一の割合で細胞結合物質が固相さ
れていることを意味する。

【００２２】担体一分子に対して、細胞結合物質を一分
子固相するためには、適切な比率で該物質を担体に加え
ればよい。例えば、該物質が抗体の場合には、担体１00
に対して、1未満の抗体を加えれば、細胞結合物質一分
子が固相された担体を調製することができる。適切な割
合で、担体と細胞結合物質とを混合した後には、該物質
が一分子固相された担体のみを選別又は確認する操作を
行うことが好ましい。このような担体を検出するには、
細胞結合物質を検出可能な標識、例えば、蛍光物質（フ
ルオレセインイソチオシアネート等）、発光物質、放射
性物質でラベルし、前記標識を定量すればよい。

【００２３】担体がマイクロプレート等の支持体の場合
には、一つの担体に一個以上の細胞を固相してもよい
が、一つのコンパートメント（ウェル等）には一分子の
細胞結合物質を固相することが望ましい。

【００２４】このように、一つの担体又はコンパートメ
ントに、細胞結合物質を一分子固相すれば、一つの担体
又はコンパートメントに略一対一の割合で細胞を固相で
き、従って、一つの担体又はコンパートメントから一個
の細胞を採集できる。なお、細胞結合物質が抗体の場合
には、一つの担体に二以上の細胞が結合しないように、
一価になるように部分消化したF(ab)を使用することが
好ましい。

【００２５】細胞結合物質を担体に固相するためには、
アビジンとビオチン、ヒスチジンタグ、グルタチオン-S
-トランスフェラーゼタグ(GSTタグ)等の慣用手法の他、
サブユニットの相互作用を利用することもできる。

【００２６】このようにして担体を調製した後、細胞集
団と担体を接触させる。前述のように、担体には、細胞
結合物質、好ましくは抗体が固相されているので、細胞
と担体を混合すると、細胞は担体に結合する。

【００２７】細胞を担体に結合させた後には、担体から
細胞を一個ずつ解離させる。

【００２８】担体一個につき一個の細胞が結合している
場合、担体から細胞を一個ずつ解離させるには、細胞が
結合した担体を検出した後、担体を一個ずつ回収する操
作が必要となる。

【００２９】細胞が結合した担体を検出するには、例え
ば、前記細胞結合物質に検出可能な標識をラベルし、細
胞が結合したときに該標識が脱離するようにすればよ
い。前記細胞結合物質が抗体の場合、例えば、検出可能
な標識でラベルされた該抗体の抗原を結合させておく。
細胞が、前記抗原と拮抗的に前記抗体に結合すると、検
出可能な標識でラベルされた抗原が抗体から脱離する。
従って、標識されていない担体を検出することにより、
細胞が結合した担体を検出することが可能となる。細胞
を結合した担体は、サイズが大きいので、セルソーター
を用いて細胞が結合した担体を検出し得る。

【００３０】細胞が結合した担体を一個ずつ回収するた
めには、蛍光活性化セルソーター(以下、FACSと略記す
る)等のセルソーターを用いるのが簡便である。従っ
て、細胞結合物質をラベルすべき前記検出可能な標識
は、蛍光物質であることが好ましい。FACSは、蛍光で標
識された担体を一個ずつ検出して、蛍光が脱離した担体
と選別することができる。それ故、細胞が結合した担体
をFACSにかければ、蛍光物質の有無を指標とすることに
より、細胞が結合した担体と細胞が結合していない担体
を選別する操作と、細胞を一個ずつ採集する操作を同時
に行える。

【００３１】担体が透明な粒子である場合には光トラッ
プによる回収を行ってもよく、また、担体が磁性粒子で
ある場合には磁力によって回収を行ってもよい。

【００３２】担体が、マイクロプレート等の支持体であ
る場合には、担体を一個ずつ分離し、回収する操作は不
要である。

【００３３】このように、必要に応じて担体を一個ずつ
回収する操作を行った後、担体から細胞を解離させる操
作を行う。担体から細胞を解離させるには、例えば、細
胞を含む試料の中に、担体から細胞を解離させ得る物質
を添加すればよい。例えば、担体に抗体を固相した場合
には、担体に固相された抗体に対する抗原を過剰量添加
すればよい。

【００３４】担体から微生物を解離させる操作は、FACS
によって、蛍光標識された担体を検出する操作と平行し
て実施してもよい。

【００３５】上述のように、一個の担体又は担体中の一
個のコンパートメントには一個の微生物が結合されてい
るので、一個の担体から、又は担体中の一個のコンパー
トメントから細胞を解離し、該細胞を採集すればクロー
ンが得られる。

【００３６】本発明は、さらにcDNAライブラリーからcD
NAをクローニングする方法を提供する。

【００３７】本発明の方法では、cDNAを含有する微生物
を担体に結合せしめた後、担体一個毎に前記微生物を担
体から解離させ、解離した微生物を採集して、該微生物
からcDNAクローンを採取することにより、cDNAをクロー
ニングする。

【００３８】本発明の方法を実施するには、まず、cDNA
ライブラリー中のcDNAクローンを含有する微生物を準備
する。

【００３９】「cDNAクローンを含有する微生物」を準備
するためには、微生物、典型的には細菌、最も典型的に
は大腸菌に対して、例えば、インビトロ・パッケージン
グを行えばよい。このようにして調製された微生物は、
ある単一種のcDNAが導入されているので、かかる微生物
を精製し、増殖させれば、容易にcDNAクローンを採取す
ることができる。

【００４０】なお、本明細書において、「cDNAライブラ
リー」とは、特定の組織や細胞由来のmRNAから作成され
た相補的DNA（cDNA）を含んでなる多種類のcDNA分子種
の集合体をいう。

【００４１】続いて、cDNAクローンを含有する微生物を
該微生物を結合し得る担体と接触させて、該担体に結合
させる。

【００４２】微生物を担体に結合させた後には、上述し
た操作と同様の操作によって、微生物が結合した担体を
一個ずつ回収すれば、cDNAクローンを含有する微生物を
一個体ずつ採集することができる。

【００４３】その後、該微生物からcDNAクローンを採取
すれば、cDNAをクローニングすることができる。

【００４４】加えて、本発明は、細胞結合物質が固相さ
れ、検出可能な標識物質でラベルされた担体を備えた上
記方法に使用するためのキットも好ましい。上記のよう
に、好ましい細胞結合物質は抗体であり、好ましい標識
物質は蛍光物質である。

【００４５】以下、図面を参照しながら、実施例によっ
て、本発明をさらに詳細に説明する。

【００４６】［実施例１］本実施例では、cDNAクローン
を含有する大腸菌を結合して、該大腸菌を捕捉し得る担
体の調製法について、図１を参照しながら説明する。

【００４７】本実施例の調製法では、大腸菌を捕捉し得
る担体を調製するために、まず、ビオチン１が結合され
たF(ab)抗LPS抗体２と蛍光標識３でラベルされたLPS抗
原４とを含む溶液と、アビジン５を表面に付着せしめた
担体６を含む溶液とを混合する。

【００４８】LPS抗原4は、F(ab)抗LPS抗体２に対する抗
原なので、F(ab)抗LPS抗体２とLPS抗原４は、抗原抗体
反応により、抗原抗体複合体７を形成する。さらに、抗
原抗体複合体７は、抗体部分にビオチン１が結合されて
いるので、担体６上のアビジン５を介して担体６に強固
に結合し、担体−抗原抗体複合体８が生成する。

【００４９】担体−抗原抗体複合体８の抗原部分には蛍
光標識３がラベルされているので、蛍光を有する担体の
みを選別すれば、抗原抗体複合体７が結合した担体のみ
を取得できる。

【００５０】［実施例２］本実施例では、図２を参照し
ながら、実施例１で調製した担体を用いて、cDNAクロー
ンを含有する大腸菌を採取する方法について説明する。

【００５１】本方法では、実施例１で調製した担体−抗
原抗体複合体８に大腸菌９を添加し、大腸菌−担体−抗
原複合体１０を形成せしめる。

【００５２】担体−抗原抗体複合体８に大腸菌９が結合
すると、蛍光標識３が大腸菌９と交換されて脱離するの
で、大腸菌−担体−抗体複合体１０は、蛍光標識を有し
ていない。これに対して、大腸菌９が結合しなかった担
体−抗原抗体複合体８には、蛍光標識３が残存している
ので、蛍光標識の有無によって、担体−抗原抗体複合体
８と大腸菌−担体−抗体複合体１０を識別することがで
きる。

【００５３】該選別は、FACSを含むセルソーターを用い
て、一分子の担体−抗原抗体複合体８又は大腸菌−担体
−抗体複合体１０ごとに行い得るので、該選別操作によ
って、大腸菌−担体−抗体複合体１０を一個ずつ採取で
きる。

【００５４】フローサイトメトリーのように、大腸菌−
担体−抗体複合体１０を含む溶液を液滴にして選別を行
えば、cDNAのクローニングを迅速に行い得る（図３参
照）。

【００５５】大腸菌−担体−抗体複合体１０を一個ずつ
採取した後、該複合体にLPS抗原４を過剰量添加すれ
ば、該複合体から大腸菌が解離する。図のように、一分
子の大腸菌−担体−抗体複合体１０には、一個体の大腸
菌が結合されているので、大腸菌−担体−抗体複合体１
０一分子から大腸菌９を解離させれば、大腸菌一個体を
採集できる。

【００５６】解離操作は、図４のように、大腸菌−担体
−抗体複合体１０が広い流路１１の中を移動している状
態で行ってもよい。図４の操作では、大腸菌−担体−抗
体複合体１０が通過し得ない狭い流路１２から蛍光標識
３でラベルされたLPS抗原４を供給することにより、前
記複合体から大腸菌９を解離させる。解離した大腸菌９
は、狭い流路１２の中に移動し得るが、担体−抗原抗体
複合体８はサイズが大きいので狭い流路１２には入れ
ず、そのまま広い流路１１を移動していく。該操作は、
大腸菌−担体−抗体複合体１０から大腸菌９を解離させ
る操作と大腸菌９を一個体ずつ採集する操作を同時に行
うことを特徴とする。

【００５７】一個体の大腸菌は、単一種のcDNAを含有し
ているので、各大腸菌からcDNAクローンを採取すれば、
cDNAがクローニングされる。

【００５８】

【発明の効果】本発明の方法によれば、cDNAライブラリ
ーから簡便にcDNAをクローニングすることが可能とな
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法に使用するための担体の調製法を
示す図。

【図２】本発明の方法によるクローンの単離法を示す
図。

【図３】本発明の方法の好ましい実施態様を示す図。

【図４】本発明の方法の好ましい実施態様を示す図。

【符号の説明】

１ ビオチン ２ 抗LPS抗体 ３ 蛍光標識 ４ LPS抗原 ５ アビジン ６ 担体 ７ 抗原抗体複合体 ８ 担体−抗原抗体複合体 ９ 大腸菌 １０ 大腸菌−担体−抗体複合体 １１ 広い流路 １２ 狭い流路

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 複数種の細胞を含む細胞集団からクロー
   ンを単離する方法であって、 （ａ）前記細胞を結合し得る担体を前記細胞集団と接触
   させて、前記細胞を前記担体に結合せしめる工程と； （ｂ）細胞を結合せしめた担体から細胞を一個ずつ解離
   させることにより、クローンを単離する工程と；を備え
   た方法。
2. 【請求項２】複数種の細胞を含む細胞集団からクローン
   を単離する方法であって、 （ａ）前記細胞を結合し得る担体を前記細胞集団と接触
   させて、前記細胞を前記担体に略一対一の割合で結合せ
   しめる工程と； （ｂ）細胞を結合せしめた担体を一個ずつ回収する工程
   と； （ｃ）回収した担体から細胞を解離させることにより、
   クローンを単離する工程と；を備えた方法。
3. 【請求項３】 前記細胞がcDNAクローンを含有する微生
   物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方
   法。
4. 【請求項４】 cDNAライブラリーからcDNAをクローニン
   グする方法であって、 請求項３に記載の方法の最後の工程の後に、単離したク
   ローンからcDNAクローンを採取することにより、cDNAを
   クローニングする工程をさらに備えた方法。
5. 【請求項５】 細胞を結合し得る物質が固相され、検出
   可能な標識でラベルされた担体を備えた請求項１〜４に
   記載の方法に使用するためのキット。
6. 【請求項６】 前記細胞を結合し得る物質が抗体であ
   り、前記検出可能な標識が蛍光物質であることを特徴と
   する請求項５に記載のキット。