JP2001112478A - ドライ形態において単離されたｒｎａの逆転写方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 核酸を転写し、そして増幅するための改良法
の提供。 【解決手段】 ＲＮＡを含んでなるドライ組成物に、Ｒ
ＮＡ転写混合液を直接添加することによるＲＮＡの逆転
写方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸を転写し、そ
して増幅するための改良法に関する。特に、本発明は、
ＲＮＡを含んでなるドライ（ｄｒｙ）組成物に、ＲＮＡ
転写混合液を直接添加することによってＲＮＡを逆転写
する方法を提供する。

【０００２】

【従来の技術】逆転写および増幅のためのＲＮＡを含む
サンプルを調製する場合、ＲＮＡの保全性がもっとも高
い関心事である。逆転写反応を行ってＲＮＡからｃＤＮ
Ａを合成する前の、ＲＮアーゼによるＲＮＡの分解は破
局ともなりうる。何らかのＲＮＡの分解が起きる場合
は、増幅技術を用いるアッセイにとって、システム全体
の感度が失われる。ＲＮＡ分解により、間違ってネガテ
ィブと出れば、結果は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）もしくは肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）のような感染性
疾患を試験する場合には患者にとって悲惨なことになる
であろう。

【０００３】多種多様な操作が、ＲＮＡサンプルの調製
のために使用されている：すなわち、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，
ａｎｄ Ｍａｔｉａｎｉｓ（（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒ
ｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔ
ｅｍ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）のＰＵＲＥＳＣ
ＲＩＰＴ ＲＮＡ単離キット，およびＦ．Ｈｏｆｆｍａ
ｎ Ｌａ ＲｏｃｈｅのＭＯＮＩＴＯＲ ＨＩＶ−ＲＮ
Ａ定量試験キットにおいて記述されているようなグアニ
ジウムに基づくサンプル調製を含む。

【０００４】これらの方法または関連する方法を用い
て、通常は、遠心されたペレットとしてＲＮＡを単離し
た後、すべての従来の操作法は、ＲＮアーゼ不含の水
（ピロ炭酸ジエチル処理された水）少なくとも２０μｌ
容量中にＲＮＡを含むペレットを、ＲＮアーゼ不含の水
４００μｌまでの再水和を要する若干の操作を用いて再
水和することを必要とする。ＲＮＡを再水和した後、再
水和されたＲＮＡを含有する溶液の一定分量が採取さ
れ、そして別のＲＮアーゼ不含のチューブに添加され、
ここで逆転写およびＰＣＲが実施される。かくして、単
離された核酸の一部のみが、続く逆転写およびポリメラ
ーゼ連鎖反応増幅において使用される。

【０００５】

【発明の構成】本発明は、別々の再水和と移行段階の必
要性を排除し、そして単離されたＲＮＡの全量を、逆転
写とポリメラーゼ連鎖反応のような続く操作において使
用されるようにする。本発明は、ＲＮアーゼによるＲＮ
Ａ分解のリスクを劇的に低下させ、そして続く逆転写ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）段階の全体の感度
を増強する。サンプルからドライ形態におけるＲＮＡの
単離は、例えば、グアニジウムに基づく方法、ＰＵＲＥ
ＳＣＲＩＰＴ ＲＮＡ単離法、または当該技術分野にお
いて既知の類似の方法を用いて実施することができる。
本発明の方法は、低いコピー数の標的ＲＮＡをもつサン
プルに関して使用される場合に特に得策である。本発明
の目的のためには、低コピー数は、サンプル１ミリリッ
トル当たり標的ＲＮＡ約２５０コピー未満もしくは同等
数として定義される。例えば、セロコンバージョン（ｓ
ｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）前の感染初期段階にある
ＨＩＶもしくはＨＣＶ罹患個体から得られるサンプル
は、一般に、低いウイルスタイターもしくはウイルス核
酸タイターを含有するであろう。

【０００６】本発明の目的は、ＲＮＡ標的を逆転写する
方法を提供することである。本方法は、（ｉ）サンプル
から核酸を単離して、ＲＮＡ標的を含んでなるドライ組
成物を形成すること；および（ｉｉ）ドライ組成物を、
該ＲＮＡ標的が逆転写されてＲＮＡ標的に相補的なｃＤ
ＮＡを形成するような条件下で、ＲＮＡ標的にアニール
するプライマー、４種の異なるヌクレオシド三リン酸お
よび逆転写酵素活性をもつ酵素と接触させること：の段
階を含んでなる。

【０００７】逆転写に続いて、かくして形成されたｃＤ
ＮＡは、核酸増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リガーゼ連鎖反応（Ｌ
ＣＲ）および当該技術において既知の他の反応において
使用することができる。

【０００８】ＰＣＲの詳細は周知である。要約すれば、
２種以上のオリゴヌクレオチドプライマーが、標的核酸
の変性された鎖にアニールされ、そしてプライマー伸長
生成物が、重合作用物質によるデオキシヌクレオシド三
リン酸の重合によって形成されて相補的な鎖が作成され
る。重合作用物質は、しばしば、熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼである。典型的なＰＣＲ操作法は、鋳型核酸の変
性、プライマーのアニーリングおよび重合作用物質によ
るアニールされたプライマーの伸長という反復サイクル
を伴い、標的核酸の対数的増幅をもたらす。したがっ
て、サンプル中に非常に低濃度で存在している標的の検
出が可能になる。

【０００９】種々の他の目的および利点が、発明の詳細
な記述から明らかになるであろう。

【００１０】

【発明を実施するための好適な態様】本発明は、ＤＮＡ
およびＲＮＡを含む核酸を逆転写および増幅するための
改良法を提供する。それは、ドライ形態におけるサンプ
ルから単離されたＲＮＡを逆転写するための平易な、効
率的な方法を提供する。この方法は、感度の増大、ＲＮ
アーゼによるＲＮＡ分解のリスクの減少、別々の再水和
および移行段階の除去という、先に述べたように、従来
既知の操作を越えた利点を提供し、そしてそれは、単離
された核酸の全量を利用できるようにさせる。

【００１１】本発明の方法では、ＲＮＡがサンプルから
単離され、そして逆転写されてｃＤＮＡが形成される。
サンプル中に存在するＲＮＡは、核酸を含んでなるドラ
イ組成物を作成することができる方法を用いて単離され
る。そのような方法は、限定されるものではないが、酸
−フェノール処理（Ｐｅｒｒｙ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ ａｌ
（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ Ｖｏｌ ２６２，ｐｇ．２２０、およびＲＮＡｇｅ
ｎｔｓ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓ
ｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、細胞用Ｑｉａｇｅｎ Ｒ
Ｎｅａｓｙ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）、血漿用Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（Ｑ
ｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、細胞用Ｂｉｏ １０１
ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１，Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ，ＣＡ）、グアニジン−ＨＣｌ処理（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｍａｎｉａｔｉｓ）１９８９
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ＰＵＲＥ
ＳＣＲＩＰＴ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ
（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ｍｉｎｎ
ｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ），および示差沈殿法（Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｃ
ｈ，Ｖｏｌ １６：４，Ｐａｇｅｓ１４８７−１４９
７、２−２５−１９８８）を含む。

【００１２】ドライ核酸組成物が、本発明にしたがって
得られた場合、それが、逆転写酵素活性を有する酵素を
含む溶液と直接組み合わされ、それによって従来の方法
では必要とされた別々の再水和および移行段階を削除
し、それによって得られたＲＮＡの全量を利用する。

【００１３】本発明における使用に適当な酵素は、限定
されるものではないが、逆転写酵素および逆転写酵素活
性をもつＤＮＡポリメラーゼを含む。好ましくは、ＤＮ
Ａポリメラーゼは熱安定性である。適当な逆転写酵素の
例は、限定されるものではないが、Ｇｉｂｃｏ（Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇｈ，ＭＤ）製の両Ｓｕｐｅｒｓｃｒ
ｉｐｔ ＲＮａｓｅＨ−ＲＴおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉ
ｐｔＩＩ ＲＮａｓｅＨ−ＲＴ、ならびにＡＭＶ（トリ
骨髄芽球症ウイルス）およびＭ−ＭＬＶ（モロニー・マ
ウス白血病ウイルス）を含む。同様に、適当な熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼの例は、限定されるものではない
が、Ｔｆｌ（サーマス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆ
ｌａｖｕｓ））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ（サーマス
・リトルリス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌｉｔｏｒｌｉｓ））
ＤＮＡポリメラーゼおよびＴａｑ（サーマス・アクアチ
クス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ））ポリメ
ラーゼを含む。逆転写酵素活性をもつＤＮＡポリメラー
ゼの例は、限定されるものではないがＴｔｈ（サーマス
・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ））ＤＮＡポリメラーゼを含む。すべての上に
引用された酵素は種々の市販先から入手することができ
る。

【００１４】逆転写酵素活性をもつ酵素に加えて、他の
試薬、例えば標的ＲＮＡにアニールするヌクレオチドプ
ライマーおよび４種の異なるヌクレオシド三リン酸（ｄ
ＮＴＰ）が、ドライ核酸組成物と直接組み合わすことが
できる。これらの試薬は、標的ＲＮＡが逆転写されて標
的に相補的なｃＤＮＡを形成するような条件下で、ドラ
イ核酸組成物と組み合わされる。ＲＮＡを逆転写するそ
のような条件および詳細は周知であり、そして多数の出
版物、例えば米国特許第５，３２２，７７０号、Ｐｒｏ
ｍｅｇａ ＰＣＲ Ｇｕｉｄｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ４−６
（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびＧｅ
ｎｅＡｍｐ ＥｚｒＴｔｈ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒＣａｔ．Ｎｏ．ＢＩＯ−７１）において提供さ
れる。

【００１５】用語「プライマー」は、核酸鋳型に相補的
なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下に置
かれた場合、合成の開始点として作用することができ
る、天然に存在するものでも、または合成的に製造され
てもよい、オリゴヌクレオチドを指す。

【００１６】本発明は、多くの起源由来のＲＮＡを逆転
写および増幅するために適当である。そのような起源
は、限定されるものではないが、生物サンプル、例えば
生物体（ウイルスおよび細菌）由来の核酸調製物、細胞
破片、精製された全ＲＮＡおよび精製されたｍＲＮＡを
含む。用語「生物サンプル」は、限定されるものではな
いが、細胞もしくはウイルス材料、毛髪、体液もしくは
検出できる核酸を含有している細胞材料を含む。

【００１７】形成されたｃＤＮＡは、先に述べたように
既知の技術を用いて増幅することができる。ｃＤＮＡを
含み、ＰＣＲを使用する、核酸の増幅および検出のため
の一般原理および条件は全く周知である。ＰＣＲを実行
するための詳細は、米国特許第４，６８３，１９５号、
同第４，６８３，２０２号および同第４，９６５，１８
８号を含む多数の出版物において提供されている。かく
して、当該技術における教示および本明細書に提供され
る特定の教示にかんがみて、当該技術において熟達した
技術者は、本発明にしたがって、ドライ形態において単
離されたＲＮＡから生成され、そして逆転写されたｃＤ
ＮＡを増幅することによって本発明を実施することは容
易であろう。

【００１８】

【実施例】次に示される実施例は、本発明のある実施態
様を具体的に説明するために提供され、そして本発明を
限定するものと考えられるべきではない。ＰＵＲＥＳＣ
ＲＩＰＴ ＲＮＡ単離操作が、ＲＮＡを含んでなるドラ
イ組成物を得る手段として選択されたが、それは、具体
的に説明する目的のためにのみ、ここに使用される。Ｐ
ＵＲＥＳＣＲＩＰＴ法を用いて得られた標的ＲＮＡを含
んでなるドライペレットは、次いで、従来のＲＮＡ転写
および増幅法におけるように再水和されるか、または以
下に記述されるように本発明にしたがって直接使用され
た。

【００１９】材料および方法 起源が特別に指示されていない材料は、すべて周知の市
販先から得られた。すべての水溶液は、ＲＮアーゼ不含
の水（Ａｍｂｉｏｎ，Ｔｅｘａｓ）を用いて調製され
た。

【００２０】ＨＩＶ−ＲＮＡ血漿 単位容量当たり特定コピー数のＨＩＶ−ＲＮＡを含有す
るヒト血漿保存液は、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃ
ａ，Ｉｎｃ．から得られた。保存血漿の一定分量が、Ｈ
ＩＶ−ＲＮＡに関してネガティブであることが知られて
いるヒト血漿により希釈されて、ＨＩＶ−ＲＮＡの１ｍ
ｌ当たり１００，５００および１０００コピーをもつ血
漿サンプルが得られ、これが、以下に述べるＲＮＡ単離
操作において使用された。

【００２１】ＲＮＡ単離 ＰＵＲＥＳＣＲＩＰＴ操作は、次のように製造者の操作
を改変した：２０μｇよりもむしろ、グリコーゲン４０
μｇが、ウイルスＲＮＡの沈殿を助けるために血漿サン
プルに添加された。ＲＮＡのイソプロピルアルコール沈
殿後、１もしくは２回のエタノール洗浄がＲＮＡペレッ
トに対して行われ、そして製造者によって提供される再
水和溶液の代わりにＲＮＡペレットを再水和するため
に、ＲＮアーゼ不含水が使用された。

【００２２】ＰＵＲＥＳＣＲＩＰＴ溶解バッファー（５
００μｌ）を、上記血漿サンプル１００μｌを含有する
１．５ｍｌミクロ遠心チューブに添加した。内容物をＶ
ＯＲＴＥＸミキサーを用いて５〜１０秒間混合した。混
合液を７０℃で５分間加熱し、２分間室温において冷却
した。その混合液に、ＰＵＲＥＳＣＲＩＰＴタンパク質
−ＤＮＡ沈殿液２００μｌを添加した。内容物を、数回
チューブを転倒することにより静かに混合した。次い
で、チューブを５分間氷上に置き、続いて１４，０００
ｒｐｍ（１３，０００〜１６，０００ｘｇ）において５
分間遠心して堅いペレットを作成した。上澄液（約７５
０μｌ）を、１００％イソプロパノール６００μｌおよ
びグリコーゲン２０μｇ／ｍｌ水溶液２μｌを含有する
清潔な１．５ｍｌチューブ中にピペットにより注入し、
混合するために２分間ロッカー上に置いた。それを、１
４，０００ｒｐｍ（１３，０００〜１６，０００ｘｇ）
で５分間再遠心した。ペレットを乱さないようにして上
澄液を除去した。エタノール洗浄を、ペレットに７０％
エタノール１ｍｌを添加して実施した。内容物を転倒す
ることで混合し、１４，０００ｒｐｍ（１３，０００〜
１６，０００ｘｇ）で２分間再遠心し、上澄液を除去
し、そして短く（３〜５秒）再遠心して残渣を落下さ
せ、次いで、液を除去した。ペレットを室温で乾燥し
た。

【００２３】逆転写（ＲＴ）混合液 逆転写（ＲＴ）混合液は、使用直前に調製し、そして氷
上に保存した。次の試薬を１反応当たり指定容量におい
て使用した：５０μＭプライマー（Ｒａｎｄｏｍ Ｈｅ
ｘａｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（ｐｄ（Ｎ）６，Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ，Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））３．０μ
ｌ、１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ５ｘＢｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃ
ｏ，ＢＲＬ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇｈ，Ｍａｒｙｌ
ａｎｄ）５．０μｌ、０．１Ｍジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ）２．５μｌ、最終総ｄＮＴＰ濃度０．４ｍＭ、す
なわちチアミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン
（Ｇ）およびアデニン（Ａ）ヌクレオシド三リン酸（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｐｒｏｄｕｃｔ ＃２７−２０３５
−０２）各０．１ｍＭのｄＮＴＰ１．０μｌ、ＲＮａｓ
ｉｎ（４０Ｕ／μｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５μｌおよ
びＭ−ＭＬＶ（２００ユニット／μｌ、Ｇｉｂｃｏ，Ｂ
ＲＬ）１．０μｌ。

【００２４】ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅 下記実施例１および２において得られたｃＤＮＡ混合液
（２５μｌ）を、ＩＰＣ（下記）、ＨＩＶ−１ＬＴＲ領
域、ＨＩＶ−１Ｐｏｌ領域、ＨＩＶ−２エンベロープ領
域およびＨＩＶ−２ＬＴＲ領域に特異的な各０．４μＭ
プライマー、２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタンバッファー，ｐＨ８．５、３ｍＭＭｇＣｌ₂、
０．７２５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、
５４ｍＭＫＣｌ、３．７２ｍＭＮａＣｌ、４０μＭＤＴ
Ｔ、１０８μｇ／ｍｌゼラチン、９．５％グリセロー
ル、０．０２％ＮＰ４０界面活性剤（ノニルフェノキシ
ポリエトキシエタナノール）、２μｇ子ウシ胸腺ＤＮ
Ａ、全１．２ｍＭｄＮＴＰ（０．３ｍＭ各Ｔ，Ａ，Ｇ，
Ｃ）、線状化されたＩＰＣプラスミドＤＮＡ １０コピ
ー、Ｔａｑポリメラーゼ１６ユニット、および米国特許
第５，３３８，６７１号および同第５．５８７，２８７
号に記載の抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体５５：１モル比、
を含有するＰＣＲ増幅混合液７５μｌと合わせた。

【００２５】ＤＮＡは、次の操作法を用いるＰＥ−９６
００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃ
ｏｒｐ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を用いて増幅され
た：初発変性を９６℃で３分間、続いて９６℃で５秒間
の変性５サイクル、そして６２℃で４０秒間のアニーリ
ングおよび伸長、次いで９６℃で５秒間の変性３５サイ
クル、そして６２℃で４０秒間のアニーリングおよび伸
長。

【００２６】増幅生成物の検出 ＰＣＲ生成物は、非アイソトープ法を用いて検出され
た。ＰＣＲ生成物を、５’末端にビオチン標識されたプ
ライマー（センス鎖）の使用によって、増幅の間にビオ
チニル化した。生成物を、フロースルーメンブラン（Ｓ
ＵＲＥＣＥＬＬ，Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）の
表面に付着されたラテックス粒子に共有結合されたオリ
ゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションに
よって捕捉した。プローブ／生成物複合体を、染料前駆
物質の青色染料への酸化的転化を触媒するストレプトア
ビジン−セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼと反応させ
た。発色強度は、観察される強度を色彩標準と比較する
ことによって肉眼的にスコアされた（０＝発色なし、１
０＝強い青色）。３を越えるすべての肉眼的発色スコア
がポジティブと見なされた。

【００２７】ＤＮＡ増幅および検出操作において、内部
ポジティブ対照（ＩＰＣ）が、適当なＤＮＡ増幅が起き
ていることを確認するために使用された。ＩＰＣは、既
知の長さおよびコピー数をもつ合成ＤＮＡ鎖であり、増
幅前のＰＣＲ混合物に直接添加された。ＩＰＣに特異的
なプライマーはＰＣＲ混合液中に存在していた。ネガテ
ィブ対照は、各実験において生成物キャリーオーバーが
ないことを確認するために含まれた。ネガティブ対照
は、ＨＩＶ核酸を含有しないことが分かっている血漿か
らなった。それは、試験サンプルと同様のＲＮＡ単離操
作および増幅操作を通して置かれた。誤りのポジティブ
は、ネガティブ対照について観察されず、結果の確実性
が確認された。

【００２８】例１：ＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲの従来法 ＲＮアーゼ不含水（２４μｌ）を、先に述べたＰＵＲＥ
ＳＣＲＩＰＴサンプル調製から得られたドライペレット
に添加してＲＮＡを再水和した。それを、ＶＯＲＴＥＸ
ミキサーで５〜１０秒間混合し、１４，０００ｒｐｍに
おいて手短に遠心し、そしてＲＮＡペレットが完全に溶
解するまで５〜１０分間氷上に保った。

【００２９】ＲＮＡ転写混合液は、ＲＴ混合液１３μｌ
をＲＮアーゼ不含チューブ中の再水和ＲＮＡ１２μｌと
合わせることによって調製された。再水和されたＲＮＡ
の新しいＲＮアーゼ不含チューブへの移行は、ＲＮアー
ゼ不含の作業空間においてＲＮアーゼ不含ピペットチッ
プを用いて実施された。ＲＮＡ転写は、ＲＮＡ転写混合
液を４２℃で３０分間インキュベートすることによって
実施された。次いで、混合液を１００℃５分間加熱して
ＲＴ活性を破壊し、氷上で１分間冷却し、そして手短に
遠心してチューブ中で濃縮された液を落とした。ここで
ｃＤＮＡを含有する混合液を、直接先に述べたＰＣＲ増
幅にかけた。ｃＤＮＡ混合液は、所望であればＰＣＲ増
幅試薬とそれを合わせるまで−２０℃以下で保存されて
もよい。

【００３０】例２：本発明によるＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲ ＲＮＡ転写混合液は、先に述べたＰＵＲＥＳＣＲＩＰＴ
操作から得られたドライＲＮＡペレットに、直接ＲＴ混
合液２５μｌを添加することによって調製され、混合さ
れ、そして手短に遠心されて、チューブの側面および上
部に付着している少量の液滴を落とした。ＲＮＡ転写
は、ＲＮＡ転写混合液を４２℃で３０分間インキュベー
トすることによって前記のように実施された。次いで、
それを１００℃５分間加熱し、氷上で１分間冷却し、そ
して手短に遠心した。ここにｃＤＮＡを含有する混合液
を、直接ＰＣＲのために使用した。先に述べたように、
ｃＤＮＡ混合液は、必要になるまで、所望であればＰＣ
Ｒ増幅試薬と組み合わせるまで−２０℃以下で保存され
てもよい。ＤＮＡ増幅および生成物検出は、前記のよう
に実施した。

【００３１】結果 比較的高いコピー数のＲＮＡ標的を用いる、例１（従来
法）および例２（本発明の方法）における、ＲＮＡ単
離、転写およびｃＤＮＡ増幅、ならびに検出の比較 複製物１〜５ 元の血漿サンプルにおけるＨＩＶ−ＲＮＡのコピー数は
１ｍｌ当たり１０００コピーであった。ＲＮＡを前記方
法にしたがって単離し、そして転写およびｃＤＮＡ増幅
し、そして生成物を例１のように検出した。ＲＮＡ転写
までに至る全段階が、血漿サンプル中の標的ＲＮＡの回
収率１００％であれば、標的ＲＮＡは、最終ＲＴ混合液
２５μｌ当たり１２．５コピーにおいて存在するであろ
う。

【００３２】複製物６〜１０ 元の血漿サンプルにおけるＨＩＶ−ＲＮＡのコピー数は
１ｍｌ当たり５００コピーであった。ＲＮＡを前記方法
にしたがって単離し、そして転写およびｃＤＮＡ増幅
し、そして生成物を例２のように検出した。ＲＮＡ転写
までに至る全段階が、血漿サンプル中の標的ＲＮＡの回
収率１００％であれば、標的ＲＮＡは、最終ＲＴ混合液
２５μｌ当たり２５コピーにおいて存在するであろう。

【００３３】複製物１１〜１５ 元の血漿サンプルにおけるＨＩＶ−ＲＮＡのコピー数は
１ｍｌ当たり１０００コピーであった。ＲＮＡを前記方
法にしたがって単離し、そして転写およびｃＤＮＡ増幅
し、そして生成物を例２のように検出した。ＲＮＡ転写
までに至る全段階が、血漿サンプル中の標的ＲＮＡの回
収率１００％であれば、標的ＲＮＡは、最終ＲＴ混合液
１００μｌ当たり１００コピーにおいて存在するであろ
う。

【００３４】複製物１６〜２０ 複製物６〜１０のように行う；しかしながら、２回のエ
タノール洗浄段階をＰＵＲＥＳＣＲＩＰＴ単離操作にお
いて使用した。

【００３５】複製物２１〜２５ 複製物１１〜１５のように行う；しかしながら、２回の
エタノール洗浄段階をＰＵＲＥＳＣＲＩＰＴ単離操作に
おいて使用した。

【００３６】結果は、以下の図１および表１において示
される。ＨＩＶ−１ＬＴＲおよびＨＩＶ−１Ｐｏｌプロ
ーブのスコアは表１に含まれる。ＩＰＣスコアは、それ
らがすべてポジティブ（３を超える肉眼的スコア）であ
ったので含まれていない。ＨＩＶ−２プローブは、血漿
がＨＩＶ−２についてネガティブであることが分かって
いたので試験されなかった。

【００３７】

【表１】

【００３８】これらの実験は、比較的高いコピー数の標
的ＲＮＡの逆転写、続くｃＤＮＡ増幅および生成物検出
が、従来法および本発明の方法により類似の結果をもた
らすことを示している。

【００３９】低いコピー数のＲＮＡ標的を用いる、例１
（従来法）および例２（本発明の方法）における、ＲＮ
Ａ単離、転写およびｃＤＮＡ増幅、ならびに検出の比較 従来の再水和法および本発明の方法を用いる、ｃＤＮＡ
増幅と組み合わされたＲＮＡ転写および生成物検出が、
低いコピー数のＲＮＡ標的による全体のアッセイ感度を
比較するために実験された。ＨＩＶ−１ＲＮＡは、血漿
１ｍｌ当たり１００コピーレベルをもつ血漿から単離さ
れた。

【００４０】そのような低コピー数をもつサンプルは、
ＨＩＶ感染および他の感染性疾患の伝播の低減を助ける
ために決定する必要がある。かくして、低コピー数の標
的ＲＮＡの検出を可能にするアッセイの感度におけるい
かなる増強も望ましいことである。

【００４１】複製物１〜９および２０〜２７ 元の血漿サンプルにおけるＨＩＶ−ＲＮＡのコピー数は
１ｍｌ当たり１００コピーであった。ＲＮＡを前記方法
にしたがって単離し、そして転写およびｃＤＮＡ増幅
し、そして生成物を例１のように検出した。ＲＮＡ転写
までに至る全段階が、血漿サンプル中の標的ＲＮＡの回
収率１００％であれば、標的ＲＮＡは、最終ＲＴ混合液
２５μｌ当たり１．２５コピーにおいて存在するであろ
う。

【００４２】複製物１０〜１８および２８〜３６ 元の血漿サンプルにおけるＨＩＶ−ＲＮＡのコピー数は
１ｍｌ当たり１００コピーであった。ＲＮＡを前記方法
にしたがって単離し、そして転写およびｃＤＮＡ増幅
し、そして生成物を例２のように検出した。ＲＮＡ転写
までに至る全段階が、血漿サンプル中の標的ＲＮＡの回
収率１００％であれば、標的ＲＮＡは、最終ＲＴ混合液
２５μｌ当たり２．５コピーにおいて存在するであろ
う。

【００４３】ＲＮＡ転写、ｃＤＮＡ増幅および生成物検
出が前記のとおり実施された。陰性対照が含まれた。結
果は、以下の表２において示される。ＩＰＣスコアは、
複製物２９の例を除いて、それらがすべて陽性（３．０
を超える肉眼的スコア）であったので示されていない。
複製物２９に関するＩＰＣの陽性シグナルの欠如は、Ｈ
ＩＶ−１ＬＴＲについての観察された低スコアは人為的
なものであったことを示唆している。

【００４４】

【表２】

【００４５】表２に与えられた感度の測定値は、各方法
に関してＨＩＶ−１の複製物陽性％を算出することによ
って決定された。

【００４６】感度における有意な増大は、本発明の方法
を用いて例証される：低コピー数ＲＮＡ標的による本発
明の方法を用いての全体の感度８３％に比較して、全体
の感度４４％が従来の再水和法により観察される。

【００４７】感度は、感染性疾患の診断試験のもっとも
重要な特性の１つであるので、このことは、本発明を用
いる場合の有意な利点を明白に例証している。本発明の
方法を用いて、サンプルから単離された全ＲＮＡが、続
く転写のために利用させられる。

【００４８】すべての引用された出版物は、引用によっ
て完全に本明細書に組み入れられている。前述の発明
が、明確化と理解のために若干詳細に記述されたけれど
も、種々の形態の変化および詳細が、本発明の真の範囲
から逸脱することなく実施できることは、当業者にとっ
て本開示の理解から明らかである。

【００４９】本発明の特徴および態様は以下のとおりで
ある。

【００５０】１． （ｉ）サンプルから核酸を単離し
て、ＲＮＡ標的を含んでなるドライ組成物を形成するこ
と；および（ｉｉ）ドライ組成物を、該ＲＮＡ標的が逆
転写されてＲＮＡ標的に相補的なｃＤＮＡを形成するよ
うな条件下で、該ＲＮＡ標的にアニールするプライマ
ー、４種の異なるヌクレオシド三リン酸、および逆転写
酵素活性をもつ酵素と接触させること：を含んでなる、
ＲＮＡ標的の逆転写方法。

【００５１】２． 該逆転写酵素活性をもつ酵素が、逆
転写酵素または逆転写酵素活性をもつＤＮＡポリメラー
ゼである、第１項の方法。

【００５２】３． 該逆転写酵素活性をもつ酵素が、逆
転写酵素である、第２項の方法。

【００５３】４． 該逆転写酵素が、モロニー・マウス
白血病ウイルス・逆転写酵素、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ
ＲＮａｓｅＨ、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＲＮ
ａｓｅＨ、またはトリ骨髄芽球症ウイルスＲＴである、
第３項の方法。

【００５４】５． 該逆転写酵素活性をもつ酵素が、Ｄ
ＮＡポリメラーゼである、第２項の方法。

【００５５】６． 該ＤＮＡポリメラーゼが、サーマス
・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）もしくはサーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来である、第５項の方
法。

【００５６】７． （ｉ）サンプルから核酸を単離し
て、ＲＮＡ標的を含んでなるドライ組成物を形成するこ
と； （ｉｉ）ドライ組成物を、該ＲＮＡ標的が逆転写され、
それによってＲＮＡ標的に相補的なｃＤＮＡを形成する
ような条件下で、該ＲＮＡ標的にアニールするプライマ
ー、４種の異なるヌクレオシド三リン酸、および逆転写
酵素活性をもつ酵素と接触させること：および （ｉｉｉ）ｃＤＮＡを、（ａ）ｃＤＮＡにハイブリダイ
ズするのに十分その領域に相補的である少なくとも２種
のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｂ）少なくとも４
種の異なるヌクレオシド三リン酸、（ｃ）熱安定性ＤＮ
Ａ重合作用物質と接触させること：の段階を含んでな
る、ＤＮＡを増幅する方法。

【００５７】８． 該逆転写酵素活性をもつ酵素が、逆
転写酵素または逆転写酵素活性をもつＤＮＡポリメラー
ゼである、第７項の方法。

【００５８】９． 該逆転写酵素活性をもつ酵素が、逆
転写酵素である、第８項の方法。

【００５９】１０． 該逆転写酵素が、モロニー・マウ
ス白血病ウイルス・逆転写酵素、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰ
Ｔ ＲＮａｓｅＨ、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩ Ｒ
ＮａｓｅＨ、またはトリ骨髄芽球症ウイルスＲＴであ
る、第９項の方法。

【００６０】１１． 該逆転写酵素活性をもつ酵素が、
ＤＮＡポリメラーゼである、第９項の方法。

【００６１】１２． 該ＤＮＡポリメラーゼが、サーマ
ス・サーモフィルスもしくはサーマス・アクアチクス由
来である、第１１項の方法。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１に記載の実験の結果を示すゲル電気泳
動の結果を示す図に代わる写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヨン・エイ・プスカス アメリカ合衆国ニユーヨーク州14613ロチ エスター・ケイテラス19 (72)発明者 ケミング・ソング アメリカ合衆国ミズーリ州63021ボールウ イン・アーバーグレン379

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ｉ）サンプルから核酸を単離して、Ｒ
   ＮＡ標的を含んでなるドライ組成物を形成すること；お
   よび（ｉｉ）ドライ組成物を、ＲＮＡ標的が逆転写され
   てＲＮＡ標的に相補的なｃＤＮＡを形成するような条件
   下で、該ＲＮＡ標的にアニールするプライマー、４種の
   異なるヌクレオシド三リン酸、および逆転写酵素活性を
   もつ酵素と接触させること：を含んでなる、ＲＮＡ標的
   の逆転写方法。
2. 【請求項２】 （ｉ）サンプルから核酸を単離して、Ｒ
   ＮＡ標的を含んでなるドライ組成物を形成すること； （ｉｉ）ドライ組成物を、該ＲＮＡ標的が逆転写され、
   それによってＲＮＡ標的に相補的なｃＤＮＡを形成する
   ような条件下で、該ＲＮＡ標的にアニールするプライマ
   ー、４種の異なるヌクレオシド三リン酸、および逆転写
   酵素活性をもつ酵素と接触させること：および （ｉｉｉ）ｃＤＮＡを、（ａ）ｃＤＮＡにハイブリダイ
   ズするのに十分その領域に相補的である少なくとも２種
   のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｂ）少なくとも４
   種の異なるヌクレオシド三リン酸、（ｃ）熱安定性ＤＮ
   Ａ重合作用物質と接触させること：の段階を含んでな
   る、ＤＮＡを増幅する方法。