JP2001158800A

JP2001158800A - アビジン粒子

Info

Publication number: JP2001158800A
Application number: JP34417699A
Authority: JP
Inventors: Kakun Han; 可君范; Ikuno Higa; 郁乃比嘉
Original assignee: JSR Corp
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 1999-12-03
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2001-06-12

Abstract

(57)【要約】【課題】アビジンまたはストレプトアビジンが固定化
されてなり、免疫検定、酵素検定、核酸検定などの検定
法に有用なアビジン粒子を提供すること。【解決手段】本発明のアビジン粒子は、有機高分子物
質３０重量％以上を含有してなり、表面にカルボキシル
基が露出した粒子本体と、この粒子本体の表面に固定化
された、アビジンおよびストレプトアビジンの少なくと
も一方とを有してなることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アビジン粒子に関
し、更に詳しくは、診断薬担体、細菌分離担体、細胞分
離担体、核酸分離精製担体、タンパク質分離精製担体、
固定化酵素担体、ドラッグデリバリーなどとして有用な
アビジン粒子に関する。

【０００２】

【従来の技術】アビジンおよびビオチンは、互いに特異
的に結合する性質を有することが知られており、従来、
このような性質を利用して、セルロースにビオチンを固
定化して固定相とするアフィニティークロマトグラフィ
ーや、免疫検定、酵素検定、核酸検定などの検定法（ア
ッセイ）が提案されている。而して、アビジンは、分子
量が約２６万のタンパク質であって人工的に合成するこ
とが困難であるのに対し、ビオチンは、分子量が３８０
と小さく、その誘導体を含めて容易に人工的に合成する
ことができるものであり、しかも、検体、酵素、核酸な
どの標的物質に容易に標識することができるものであ
る。従って、アビジンを捕捉剤として利用し、ビオチン
によって標識された標的物質を捕捉して分離・精製する
方法が確立されれば、生物学分野、生化学分野、医学分
野においては、極めて有用である。

【０００３】しかしながら、上記のような方法において
は、ビオチンを固定相として用いているため、アビジン
によって標識された標的物質を捕捉してその分離・精製
を行うことは可能であるが、ビオチンによって標識され
た標的物質の分離・精製を行うことはできない。また、
上記の方法は、クロマトグラフィーの手法を利用してい
るため、比較的多量の標的物質を用いることが必要とさ
れ、従って、微量の標的物質については適用することが
困難である。

【０００４】一方、アビジンを捕捉剤として利用する検
定法としては、内壁にアビジンまたはストレプトアビジ
ンが固定化された反応容器を用いる手段が提案されてい
る（特開平２−２４５５９号参照）。しかしながら、こ
のような手段では、標的物質を捕捉する領域が反応容器
の内壁に限定され、また、アビジンまたはストレプトア
ビジンが、物理的吸着手段によって反応容器の内壁に固
定化されているため、使用条件、例えば温度、標的物質
を含む溶液中の界面活性剤の種類、塩濃度などの条件が
制限される、という問題がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、以上のよう
な事情に基づいてなされたものであって、その目的は、
アビジンまたはストレプトアビジンが固定化されてな
り、免疫検定、酵素検定、核酸検定などの検定法に有用
なアビジン粒子を提供することにある。本発明の他の目
的は、磁気によって分離することができるアビジン粒子
を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明のアビジン粒子
は、有機高分子物質３０重量％以上を含有してなり、表
面にカルボキシル基が露出した粒子本体と、この粒子本
体の表面に固定化された、アビジンおよびストレプトア
ビジンの少なくとも一方とを有してなることを特徴とす
る。

【０００７】本発明のアビジン粒子においては、前記粒
子本体が非多孔質のものであることが好ましい。また、
前記有機高分子物質は、アクリル酸エステルおよびメタ
クリル酸エステルから選ばれた少なくとも１種の単量体
に由来する構造単位を５０重量％以上含有してなるもの
であることが好ましい。また、前記粒子本体は、常磁性
体および強常磁性体の少なくとも一方を含有してなるも
のであることが好ましい。また、本発明のアビジン粒子
においては、ビオチン若しくはビオチン誘導体で修飾さ
れたタンパク質またはオリゴヌクレオチドが、アビジン
またはストレプトアビジンを介して粒子本体の表面に固
定化されていてもよい。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明のアビジン粒子につ
いて詳細に説明する。本発明のアビジン粒子は、表面に
カルボキシル基が露出した粒子本体と、この粒子本体の
表面に固定化された、アビジンおよびストレプトアビジ
ンの少なくとも一方とを有してなるものである。

【０００９】粒子本体は、有機高分子物質を含有してな
るものである。粒子本体に含有される有機高分子物質と
しては、水不溶性のものが用いられ、このような有機高
分子物質を得るための単量体としては、芳香族ビニル化
合物、α，β−不飽和カルボン酸エステル類、α，β−
不飽和カルボン酸アミド類、α，β−不飽和ニトリル化
合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役ジエン化合物、低
級脂肪酸ビニルエステルなどを用いることができる。

【００１０】このような単量体の具体例としては、アク
リル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸−ｎ−ブ
チル、アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、アクリル酸
ポリオキシエチレン、アクリル酸グリシジル、エチレン
グリコールジアクリル酸エステル、アクリル酸トリブロ
モフェニル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸トリデシ
ル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸−２−エチルヘ
キシル、アクリル酸シクロヘキシル、アクリル酸ベンジ
ル等のアクリル酸エステル、メタクリル酸メチル、メタ
クリル酸エチル、メタクリル酸−ｎ−ブチル、メタクリ
ル酸−２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸ポリオキシ
エチレン、メタクリル酸グリシジル、エチレングリコー
ルジメタクリル酸エステル、メタクリル酸トリブロモフ
ェニル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸トリデシ
ル、メタクリル酸ステアリル、メタクリル酸−２−エチ
ルヘキシル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル
酸ベンジル等のメタクリル酸エステル、スチレン、クロ
ルスチレン、クロロメチルスチレン、α−メチルスチレ
ン、ジビニルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウ
ム、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、アクロレ
イン、メタクロレイン、アクリルアミド、メタクリルア
ミド、メチレンビスアクリルアミド、メチレンビスメタ
クリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、
ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、
臭化ビニルなどを挙げることができる。これらは、単独
でまたは２種以上を組み合わせて用いることができる。

【００１１】これらの中では、アクリル酸エステルおよ
びメタクリル酸エステルが、タンパク質の非特異的吸着
が少ないので好ましく、より好ましくは炭素数が４以
上、さらに好ましくは４〜１８、特に好ましくは６〜１
２の炭化水素基を有するアクリル酸エステルおよびメタ
クリル酸エステルである。具体的には、アクリル酸−ｎ
−ブチル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸トリデシ
ル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸−２−エチルヘ
キシル、アクリル酸シクロヘキシル、アクリル酸ベンジ
ル、メタクリル酸−ｎ−ブチル、メタクリル酸ラウリ
ル、メタクリル酸トリデシル、メタクリル酸ステアリ
ル、メタクリル酸−２−エチルヘキシル、メタクリル酸
シクロヘキシル、メタクリル酸ベンジルなどが挙げら
れ、これらのうち、アクリル酸−２−エチルヘキシル、
アクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸−２−エチル
ヘキシル、メタクリル酸シクロヘキシルなどが特に好ま
しい。

【００１２】粒子本体の表面にカルボキシル基を露出さ
せるためには、有機高分子物質にカルボキシル基を導入
すればよい。このカルボキシル基は、粒子の分散安定性
に寄与すると共に、アビジンまたはストレプトアビジン
のアミノ基と反応にしてこれらを固定化する機能を有す
る。有機高分子物質にカルボキシル基を導入するための
手段としては、（イ）カルボキシル基含有不飽和単量体
を上記の単量体と共重合する手段、（ロ）上記の単量体
を重合した後、得られる重合体をカルボン酸変性させる
手段を利用することができる。上記（イ）の手段によっ
て有機高分子物質にカルボキシル基を導入する場合にお
いて、用いられるカルボキシル基含有不飽和単量体の具
体例としては、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸
などのモノカルボン酸、イタコン酸、マレイン酸、無水
マレイン酸などのジカルボン酸およびその無水物を例示
することができ、これらは、単独でまたは２種以上を組
み合わせて使用することができる。

【００１３】粒子本体の表面におけるカルボキシル基の
露出量は、その表面荷電が２５〜３５０Ｍ当量／ｇ、特
に５０〜１５０Ｍ当量／ｇとなる範囲であることが好ま
しい。カルボキシル基による表面荷電が２５Ｍ当量／ｇ
未満である場合には、当該粒子本体の表面に十分な量の
アビジンまたはストレプトアビジンを固定化することが
困難となると共に、得られるアビジン粒子は分散安定性
の低いものとなることがある。一方、カルボキシル基に
よる表面荷電が３５０Ｍ当量／ｇを超える場合には、粒
子を得るための重合方法が複雑となり、重合の再現性が
低下することがある。

【００１４】粒子本体における有機高分子物質の含有割
合は、３０重量％以上とされ、好ましくは４０重量％以
上とされる。この含有割合が３０重量％未満である場合
には、粒子本体表面に露出する有機高分子物質以外の成
分例えば無機成分の量が多くなるため、この粒子を使用
する際に、無機成分が溶出したり、当該粒子と共に使用
される他の物質と反応したりするおそれがあり、また、
アッセイに使用する場合には、高い精度で分析を行うこ
とが困難となることがある。

【００１５】また、粒子本体の全表面の面積に対する有
機高分子物質により形成された表面の面積の割合は、９
０％以上であることが好ましく、より好ましくは９５％
以上、特に好ましくは１００％である。

【００１６】粒子本体は、有機高分子物質のみにより構
成することができるが、磁力によって容易に分離・回収
することができる点で、常磁性体、強常磁性体および強
磁性体などの磁性体（以下、これらを総称して単に「磁
性体」ともいう。）が含有されてなるものであることが
好ましく、より好ましくは、常磁性体および強常磁性体
の両方またはいずれか一方が含有されてなるものであ
る。特に残留磁化がないまたは少ない点で、強常磁性体
を用いることが好ましい。かかる磁性体の具体例として
は、四三酸化鉄（Ｆｅ₃Ｏ₄）、γ−重三二酸化鉄（γ
−Ｆｅ₂Ｏ₃）、各種フェライト、鉄、マンガン、コバ
ルト、クロムなどの金属、コバルト、ニッケル、マンガ
ンなどの合金を挙げることができ、これらのうち、四三
酸化鉄が特に好ましい。このような磁性体は、親油化処
理されたものであることが好ましい。

【００１７】本発明において用いられる磁性体は、小粒
径の粒子よりなるものであって、優れた磁気分離性（磁
気によって短時間で分離する性能）を有し、かつ、ゆる
い上下震とう操作によって再分散し得るものであること
が好ましい。また、磁性体の粒子径は、４０〜３００Å
であることが好ましく、更に好ましくは５０〜２００
Å、特に好ましくは６０〜１５０Åとされる。この粒子
径が４０Å未満である場合には、当該磁性体を親油化処
理するための処理剤（脂肪酸、シランカップリング剤、
チタンカップリング剤）が多量に必要となり、当該磁性
体の割合が低下して、磁気応答性が不良となることがあ
る。一方、この粒子径が３００Åを超える場合には、得
られる粒子本体が磁化されたものとなり、当該粒子本体
が相互に凝集して水性媒体中で沈降しやすくなる。な
お、球状でない磁性体の粒子径としては、それぞれの磁
性体の最長径と最短径との平均値をとるものとする。ま
た、強磁性体を用いる場合には、その磁区が単磁区サイ
ズの２〜３倍であることが特に好ましい。

【００１８】粒子本体における磁性体の含有割合は、有
機高分子物質の含有割合が３０重量％以上であることか
ら、７０重量％以下とされるが、好ましくは２０〜７０
重量％、より好ましくは３０〜７０重量％である。この
割合が２０重量％未満である場合には、十分な磁気応答
性が発現されず、所要の磁力によって短時間で粒子を分
離することが困難となることがある。一方、この割合が
７０重量％を超える場合には、粒子本体表面に露出する
磁性体の量が多くなるため、当該磁性体の構成成分例え
ば鉄イオンの溶出などが生じ、使用時に他の材料に悪影
響を及ぼすことがあり、また、粒子本体が脆くなって実
用的な強度が得られないことがある。

【００１９】本発明のアビジン粒子において磁性体を含
有させる場合には、その磁気特性としては、１５０００
オステッド（Ｏｅ）の磁場において感磁させたときに、
保磁力が５０〜２０００Ｏｅ、特に１００〜１０００Ｏ
ｅであることが好ましく、残留磁束密度が１．０〜７０
ｅｍｕ／ｇ、特に２〜２０ｅｍｕ／ｇであることが好ま
しい。保磁力が５０Ｏｅ未満である場合または残留磁束
密度が１ｅｍｕ／ｇ未満である場合には、天然磁石（磁
束密度が例えば１０００〜４０００Ｇａｕｓｓ）によっ
て感磁させても、粒子間に十分に大きい磁力が作用しな
いため、当該天然磁石によって粒子を高い効率で分離・
回収することが困難となり、実用上好ましくない。一
方、保磁力が２０００Ｏｅを超える場合または残留磁束
密度が７０ｅｍｕ／ｇを超える場合には、粒子間に作用
する磁力が過大となるため、粒子を分離・回収した後、
再分散することが困難となる。

【００２０】また、粒子本体は、非多孔質のものである
ことが好ましく、これにより、核酸やタンパク質などの
標的物質を捕捉することが可能な領域が表面に限定され
る結果、短い時間で標的物質を捕捉することができる。
粒子本体が多孔質のものである場合には、標的物質が粒
子の細孔内に進入する過程が拡散支配であるため、標的
物質を捕捉するために相当に長い時間を要する。

【００２１】また、粒子本体の数平均粒子径は、０．１
〜１５μｍ、特に０．５〜１０μｍであることが好まし
い。この数平均粒子径が０．１μｍ未満である場合に
は、当該粒子本体が磁性体を含有してなるものであると
きには、十分な磁気応答性が発現されず、当該粒子を分
離するために相当に長い時間を要し、また、分離するた
めに相当に大きい磁力が必要となるため、好ましくな
い。一方、数平均粒子径が１５μｍを超える場合には、
当該粒子が水性媒体中で沈降しやすいものとなるため、
標的物質を捕捉する際に媒体を攪拌する操作が必要とな
り、また、粒子本体の表面積が小さくなるため、十分な
量の標的物質を捕捉することが困難となることがある。

【００２２】以上のような粒子本体は、種々の方法によ
って製造することができるが、磁性体を含有してなる粒
子本体を製造する場合には、有機高分子物質を形成する
ための全単量体のうちの疎水性単量体中に、親油化処理
が施された磁性体を分散することにより、単量体組成物
を調製し、この単量体組成物を有機相として水相中に乳
化分散させることにより、懸濁液を調製し、この懸濁液
中において、前記疎水性単量体を含む単量体を重合させ
る方法を採用することが好ましい。ここで、「疎水性単
量体」とは、２０℃における水への溶解度が０．１重量
％未満である単量体をいうものとする。

【００２３】単量体組成物の調製において、親油化処理
が施されていない磁性体を用いる場合には、当該磁性体
が得られる粒子本体の表面近傍に偏在し、更には粒子表
面に磁性体が露出するため、鉄イオンなどが水性媒体に
溶出するおそれがある。磁性体を親油化処理する方法と
しては、シランカップリング剤、チタンカップリング剤
などの表面処理剤により処理する方法、磁性体に脂肪酸
塩などを吸着させる方法など特に限定されるものではな
い。また、市販の磁性流体から分散媒を除去して得られ
る磁性体を使用することもできる。また、疎水性単量体
中に分散させる磁性体の量は、当該疎水性単量体１００
重量部に対して通常２〜３００重量部とされる。

【００２４】懸濁液の調製において、磁性体の分散媒と
して疎水性単量体以外の単量体を使用する場合には、当
該親単量体中に、親油化処理が施された磁性体を均一に
分散させることができず、得られる単量体組成物におい
て磁性体の凝集による粗大粒子が析出するため、当該単
量体組成物を水相に乳化分散させることが困難となる。

【００２５】単量体組成物（有機相）を水相中に乳化分
散させるために使用する分散機としては、従来公知の超
音波分散機および高剪断速度の分散機などを使用するこ
とができる。超音波分散機の形式は特に制限されるもの
ではなく、例えば、ホーン型発振子を備えてなる分散
機、プレート型発振子を備えてなる分散機、発振部に液
を流通させる連続式の分散機などを例示することができ
る。また、高剪断速度の分散機としては、例えばホモミ
キサー、コロイドミル、ジェットホモジナイザー、高圧
ホモジナイザーなどを例示することができ、これらの分
散機は、目的とする分散粒子径に応じて適宜選択するこ
とができる。さらに、多孔膜または多孔フィルターを介
して単量体組成物（有機相）を水相中に押し出すことに
よって有機相を水相中に乳化分散させる膜乳化法を採用
することもできる。

【００２６】また、単量体組成物の分散媒となる水相中
には、アニオン系界面活性剤、ノニオン系界面活性剤、
水溶性高分子、無機系懸濁保護剤などの界面活性剤また
は乳化剤が添加されていてもよい。これらのうち、幅広
い粒子径の粒子を得る場合に適用することができ、正負
いずれの表面荷電の粒子も合成できるという点から部分
ケン化ポリビニルアルコールが好ましい。

【００２７】そして、このようにして調製された懸濁液
中に、疎水性単量体以外の単量体を添加した後、当該懸
濁液中において、疎水性単量体およびそれ以外の単量体
を重合する。単量体を重合するための重合開始剤として
は、特に制限されるものではなく、従来公知のラジカル
重合開始剤、例えば有機過酸化物、アゾ系開始剤、過硫
酸塩系開始剤などを使用することができる。これらのう
ち、油溶性重合開始剤を使用することが好ましい。特
に、疎水性単量体中に磁性体を分散して単量体組成物を
調製する際に、油溶性重合開始剤を添加することが好ま
しく、これにより、磁性体を含有しない粒子本体の生成
を防止することができる。

【００２８】単量体の重合反応は無酸素雰囲気下におい
て行うことが好ましい。反応温度は、使用する重合開始
剤の分解温度によっても異なるが、例えばベンゾイルペ
ルオキシドを用いる場合には７５〜８５℃で好適に重合
反応を進行させることができる。

【００２９】また、表面に磁性体が露出していない粒子
本体を製造するとしては、（１）懸濁液に添加される疎
水性単量体以外の単量体を２つに分割し、その一方を懸
濁液に添加して重合させた後、他方を添加して更に重合
を行う方法、（２）重合反応終了後、得られる粒子本体
に強酸を接触させ、粒子本体の表面近傍に存在する磁性
体を溶出除去する方法、などを利用することができる。

【００３０】本発明のアビジン粒子は、上記のような粒
子本体の表面に、アビジンおよびストレプトアビジンの
両方またはいずれか一方が固定化されてなるものであ
る。アビジンおよびストレプトアビジンとしては、一般
に市販されているものを用いることができ、これらは、
自然体に存在するものを分離・精製したものであったも
よく、遺伝子工学的技術によって人工的に生産されたも
のであってもよい。アビジンまたはストレプトアビジン
を粒子本体の表面に固定化する方法としては、例えば水
溶性カルボジイミドなどの脱水縮合剤の存在下に、アビ
ジンまたはストレプトアビジンの分子中のアミノ基を、
粒子本体の表面に露出するカルボキシル基に反応させて
アミド結合を形成することにより、アビジンまたはスト
レプトアビジンを粒子本体の表面に固定化する方法が挙
げられる。このような方法においては、予め、粒子本体
の表面に露出するカルボキシル基に脱水縮合剤を反応さ
せ、その後、アビジンまたはストレプトアビジンを加え
て反応させることもできる。

【００３１】上記のようなアビジン粒子によれば、粒子
本体の表面にアビジンまたはストレプトアビジンが固定
化されているため、ビオチンによって標識された標的物
質、例えば核酸やタンパク質などをを確実に捕捉するこ
とができる。また、アビジンまたはストレプトアビジン
が、粒子本体の表面に露出したカルボキシル基との化学
的結合により固定化されているため、使用条件が制限さ
れることが少ない。従って、このようなアビジン粒子
は、診断薬担体、細菌分離担体、細胞分離担体、核酸分
離精製担体、タンパク質分離精製担体、固定化酵素担
体、ドラッグデリバリーなどとして有用である。

【００３２】本発明のアビジン粒子には、ビオチン若し
くはビオチン誘導体（以下、両者を総称して「ビオチン
類」ともいう。）によって修飾されたタンパク質または
オリゴヌクレオチドが、アビジンまたはストレプトアビ
ジンを介して粒子本体の表面に固定化されていてもよ
い。

【００３３】具体的に説明すると、アビジン粒子の表面
に、ビオチン類によって修飾されたオリゴヌクレオチド
を固定化させることにより、核酸固定化粒子を得ること
ができる。ここで、固定化されるオリゴヌクレオチドの
長さは１０から１００塩基、好ましくは１５から７０塩
基である。また、固定化されるオリゴヌクレオチドは１
本鎖ＤＮＡであってもよく、２本鎖ＤＮＡであってもよ
く、或いはＲＮＡであってもよい。このような核酸は、
通常市販されている核酸合成器を用いて調製することが
できる。このような核酸固定化粒子は、遺伝子診断をは
じめ、遺伝子工学全般に使用することができる。具体的
には、例えばオリゴｄＴを結合させた磁性ポリマー粒子
を用いて、細胞溶解液から、直接メッセンジャＲＮＡを
回収することができる。また、固定化される核酸とし
て、エイズウィルス核酸に相補性のある塩基配列を有す
るものを用いることにより、生物検体から、エイズウィ
ルスを回収し、ＤＮＡプローブ法、またはポリメラーゼ
チェーンリアクション法を用いて検出することができ
る。

【００３４】また、アビジン粒子の表面に、ビオチン類
によって修飾された生理活性タンパク質を固定化させる
ことにより、生理活性タンパク質を担持するタンパク質
固定化粒子を調製することができる。上記生理活性タン
パク質は一般的な生理活性を有するタンパク質、または
その複合体を含み、具体的には、例えば免疫グロブリ
ン、各種酵素等が挙げられる。このような抗体結合粒
子、酵素結合粒子は、診断分野、研究分野に利用するこ
とができる。

【００３５】以上において、ビオチン誘導体としては、
ビオチン−ε−Ｎ−リンジン、ビオシチンヒドラジド、
２−イミノビオチン、ビオチニル−ε−Ｎ−アミノカプ
ロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのアミ
ノ若しくはスルヒドリル誘導体、スルホスクシンイミド
イミノジオチン、ビオチンブロモアセチルヒドラジド、
ｐ−ジアゾベンゾイルビオチン、３−（Ｎ−マレインイ
ミドピロピオニル）ビオチンなどを用いることができ
る。

【００３６】ビオチン類によってタンパク質またはオリ
ゴヌクレオチドを修飾する方法としては、例えば、ビオ
チン類とＮ−ヒドロキシイミド類とのエステル、例えば
ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを、タンパク
質分子のアミノ基に反応させることにより、ビオチン類
によってタンパク質を修飾する方法、オリゴヌクレオチ
ドの５’末端に、フタルイミドトリエチレングリコール
を結合した後、これを水酸化アンモニウムによって加水
分解することにより、第一級アミノ基を形成し、このア
ミノ基に、例えばビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドを結合することにより、ビオチン類によってオリゴ
ヌクレオチドの５’末端を修飾する方法などを挙げるこ
とができるが、これらに限定されるものではなく、従来
公知の種々の方法を利用することができ、適宜の方法に
より、ビオチン類によってオリゴヌクレオチドの３’末
端を修飾することもできる。

【００３７】粒子の表面に固定化されたアビジン若しく
はストレプトアビジンに、タンパク質またはオリゴヌク
レオチドに修飾されたビオチン類を固定化する方法とし
ては、従来知られているアビジンにビオチン類を固定化
する方法を適用することができる。例えば、リン酸緩衝
液または１Ｍ塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液中におい
て、アビジン粒子とビオチン類によって修飾されたタン
パク質またはオリゴヌクレオチドとを室温で１０分間〜
１時間混合した後、固液分離操作によって、未反応のタ
ンパク質またはオリゴヌクレオチドを除去することによ
り、タンパク質またはオリゴヌクレオチドが固定化され
た粒子を調製することができる。

【００３８】

【実施例】以下、本発明の具体的な実施例について説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００３９】〈実施例１〉カルボキシル基が導入された
ポリスチレン粒子（平均粒子径：１．０μｍ，カルボキ
シル基表面荷電：７０Ｍ当量／ｇ）の１％分散液（ジェ
イエスアール株式会社製）１ｍＬを、遠心分離処理し、
固形物（ポリスチレン粒子）に０．１ｍＭＨＣｌ溶液
（ｐＨ＝５．５）を添加して遠心分離処理する操作を３
回繰り返すことにより、ポリスチレン粒子の洗浄処理を
行った。その後、ポリスチレン粒子に１−エチル−３−
ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（同仁化
学社製）５ｍｇを溶解した０．１ｍＭＨＣｌ溶液０．１
ｍＬを添加し、室温で２時間回転攪拌し、更に、ストレ
プトアビジン（シグマ社製）１ｍｇを溶解した０．１ｍ
ＭＨＣｌ溶液０．１ｍＬを添加し、室温で８時間回転攪
拌することより、ポリスチレン粒子の表面にストレプト
アビジンを固定化させることにより、アビジン粒子を調
製した。

【００４０】次いで、このアビジン粒子を含む溶液を遠
心分離処理し、固形物（アビジン粒子）に、０．１％牛
血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ，０．１
％ＢＳＡ／ＰＢＳ，ｐＨ＝７．２）を添加して遠心分離
処理する操作を３回繰り返すことにより、未反応のスト
レプトアビジンを除去した。そして、アビジン粒子を、
その濃度が１％となるよう、０．１％牛血清アルブミン
を含むリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ，０．１％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓ，ｐＨ＝７．２）に分散させてアビジン粒子分散液を
調製した。

【００４１】〈実施例２〉ポリスチレン粒子の１％分散
液の代わりに、表面にカルボキシル基が露出した磁性ポ
リマー粒子〔磁性体：γ−Ｆｅ₂Ｏ₃，有機高分子物
質：ポリシクロヘキシルメタクリレート，磁性体：有機
高分子物質＝５０：５０（重量比），平均粒子径１．２
μｍ，粒子表面における有機高分子物質の占める割合：
９９％，カルボキシル基表面荷電：６０Ｍ当量／ｇ）の
１０％分散液を用いたこと以外は、実施例１と同様にし
てアビジン粒子分散液を調製した。

【００４２】〔実験例１〕実施例１および実施例２で調
製したアビジン粒子分散液１００μＬ（アビジン粒子１
０μｇ相当）を、それぞれ遠心チューブに入れ、これら
の遠心チューブの各々に、蛍光色素ＦＡＭによって５’
末端が標識され、ビオチンによって３’末端が標識され
た合成ＤＮＡオリゴマー（３０ｍｅｒ）２００ｐｍｏｌ
を溶解したリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．２）１ｍＬを入
れ、室温で１５分間回転攪拌した。その後、リン酸塩緩
衝液からアビジン粒子を分離した後、当該リン酸塩緩衝
液の蛍光強度を測定すると共に、合成ＤＮＡオリゴマー
を溶解したリン酸塩緩衝液の原液の蛍光強度を測定し、
これらの値から、アビジン粒子による合成ＤＮＡオリゴ
マーの捕捉量（粒子１ｍｇ当たりの捕捉量）を算出し
た。また、比較例として、実施例１で使用したポリスチ
レン粒子（比較例１）および磁性ポリマー粒子（比較例
２）について、同様にして合成ＤＮＡオリゴマーの捕捉
量を算出した。以上、結果を表１に示す。

【００４３】

【表１】

【００４４】〈実施例３〉実施例１で調製したアビジン
粒子分散液１００μＬ（アビジン粒子１ｍｇ相当）を遠
心チューブに入れ、この遠心チューブに、ビオチンによ
って３’末端が修飾された合成ＤＮＡオリゴマー（塩基
配列「５’ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’」，３０ｍｅｒ）２００
ｐｍｏｌを溶解したリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．２）１
ｍＬを入れ、室温で１５分間回転攪拌することにより、
合成ＤＮＡオリゴマーが固定化されたアビジン粒子を調
製した。次いで、このアビジン粒子を含む溶液を遠心分
離処理し、固形物（アビジン粒子）に、０．１％牛血清
アルブミンを含むリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ，０．１％Ｂ
ＳＡ／ＰＢＳ，ｐＨ＝７．２）を添加して遠心分離処理
する操作を３回繰り返すことにより、固定化されていな
い合成ＤＮＡオリゴマーを除去した。そして、アビジン
粒子を、その濃度が１％となるよう、０．１％牛血清ア
ルブミンを含むリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ，０．１％ＢＳ
Ａ／ＰＢＳ，ｐＨ＝７．２）に分散させてアビジン粒子
分散液を調製した。

【００４５】〔実験例２〕実施例３で調製したアビジン
粒子分散液１００μＬ（アビジン粒子１ｍｇ相当）を、
それぞれ遠心チューブに入れ、これらの遠心チューブの
各々に、蛍光色素ＦＡＭによって５’末端が標識された
合成ＤＮＡオリゴマー（塩基配列「５’ＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
３’」，３０ｍｅｒ）２００ｐｍｏｌを溶解した緩衝液
（１０ｍＭトリス塩酸，０．１Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ
＝７．６）１ｍＬを入れ、３７℃で３０分間回転攪拌し
た。その後、緩衝液からアビジン粒子を分離した後、当
該緩衝液の蛍光強度を測定すると共に、合成ＤＮＡオリ
ゴマーを溶解した緩衝液の原液の蛍光強度を測定し、こ
れらの値から、アビジン粒子による合成ＤＮＡオリゴマ
ーの捕捉量（粒子１ｍｇ当たりの捕捉量）を算出した。
その結果、合成ＤＮＡオリゴマーの捕捉量は１１５ｐｍ
ｏｌ／ｍｇであった。

【００４６】

【発明の効果】本発明のアビジン粒子によれば、粒子本
体の表面にアビジンまたはストレプトアビジンが固定化
されているため、ビオチンによって標識された標的物
質、例えば核酸やタンパク質などをを確実に捕捉するこ
とができる。また、アビジンまたはストレプトアビジン
が、粒子本体の表面に露出したカルボキシル基との化学
的結合により固定化されているため、使用条件が制限さ
れることが少ない。このようなアビジン粒子は、免疫検
定、酵素検定、核酸検定などの検定法に有用なものであ
る。

【００４７】また、粒子本体を非多孔質のものとするこ
とにより、標的物質を短い時間で確実に捕捉することが
できるアビジン粒子が得られる。また、粒子本体に常磁
性体または超常磁性体を含有させることにより、磁気に
よって容易に分離することができるアビジン粒子が得ら
れる。また、ビオチン若しくはビオチン誘導体によって
修飾されたタンパク質またはオリゴヌクレオチドが、ア
ビジンまたはストレプトアビジンを介して粒子本体の表
面に固定化されることにより、例えば診断薬として広い
範囲に適用することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/545 Ｇ０１Ｎ 33/545 ＺＦターム(参考） 4B063 QA01 QA12 QA18 QQ42 QR32 QR48 QR54 QR56 QR83 QS13 QS34 QS36 QX02 4H045 AA10 BA62 EA61 FA81

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】有機高分子物質３０重量％以上を含有し
てなり、表面にカルボキシル基が露出した粒子本体と、
この粒子本体の表面に固定化された、アビジンおよびス
トレプトアビジンの少なくとも一方とを有してなること
を特徴とするアビジン粒子。
【請求項２】粒子本体が非多孔質のものであることを
特徴とする請求項１に記載のアビジン粒子。
【請求項３】有機高分子物質は、アクリル酸エステル
およびメタクリル酸エステルから選ばれた少なくとも１
種の単量体に由来する構造単位を５０重量％以上含有し
てなるものであることを特徴とする請求項１または請求
項２に記載のアビジン粒子。
【請求項４】粒子本体は、常磁性体および強常磁性体
の少なくとも一方を含有してなるものであることを特徴
とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載のアビジ
ン粒子。
【請求項５】ビオチン若しくはビオチン誘導体によっ
て修飾されたタンパク質またはオリゴヌクレオチドが、
アビジンまたはストレプトアビジンを介して粒子本体の
表面に固定化されていることを特徴とする請求項１乃至
請求項４のいずれかに記載のアビジン粒子。