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JP2001151691A - アンジオスタチンフラグメント、アンジオスタチン凝集体および使用方法 - Google Patents

アンジオスタチンフラグメント、アンジオスタチン凝集体および使用方法

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JP2001151691A
JP2001151691A JP2000308481A JP2000308481A JP2001151691A JP 2001151691 A JP2001151691 A JP 2001151691A JP 2000308481 A JP2000308481 A JP 2000308481A JP 2000308481 A JP2000308481 A JP 2000308481A JP 2001151691 A JP2001151691 A JP 2001151691A
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JP
Japan
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angiostatin
kringle
cells
tumor
fragment
Prior art date
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Pending
Application number
JP2000308481A
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English (en)
Inventor
Judah M Folkman
フォークマン，エム．，ジューダ
Michael S Oreilly
オーレイリー，マイケル，エス．
Yihai Cao
カオ，イーハイ
Jie Lin
リン，ジー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boston Childrens Hospital
Original Assignee
Boston Childrens Hospital
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Publication date
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Priority claimed from US08/605,598 external-priority patent/US5861372A/en
Priority claimed from US08/612,788 external-priority patent/US5837682A/en
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Abstract

(57)【要約】 内皮細胞増殖阻害物質のフラグメントおよび凝集型、お
よびその使用法が提供される。内皮細胞増殖阻害物質
は、プラスミノーゲン由来のタンパク質であり、あるい
はさらに特定すればアンジオスタチンである。一般的
に、アンジオスタチンは内皮増殖阻害物質内に存在する
クリングル構造に相当する。また、アンジオスタチンは
凝集型としても調整される。アンジオスタチンおよび凝
集型の内皮細胞増殖阻害活性は、腫瘍における血管新生
の阻害および血管新生が介在する疾患の治療に新たな手
段を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アンジオスタチン
(angiostatin)と称され、可逆的に内皮細胞の増殖を阻
害する内皮形成阻害物質に関する。さらに詳細には、本
発明は、血液や尿などの体液から単離される、または組
み換えを使用する方法、酵素を使用する方法または化学
的方法により合成できるアンジオスタチンタンパク質に
関する。アンジオスタチンは、血管新生関連性疾患を阻
害および血管新生プロセスを調節できる。さらに本発明
は、アンジオスタチン測定のための診断アッセイおよび
キット、アンジオスタチンの位置特定のための組織化学
検査キット、アンジオスタチンおよびアンジオスタチン
の生合成をモニターする分子プローブをコードするＤＮ
Ａ配列、アンジオスタチンに特異的な抗体、アンジオス
タチンレセプターに対するタンパク質性作動物質および
拮抗物質の開発、刺激性および遮断性の抗アンジオスタ
チンレセプター特異的抗体、およびアンジオスタチンタ
ンパク質に結合する細胞毒性物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】本明細書で使用する通り、「血管新生」
という言葉は、組織や器官内で新しい血管が発生するこ
とを意味する。通常の生理学的条件下では、ヒトおよび
動物は、非常に限定された状況においてのみ血管新生を
行う。たとえば、通常、傷の治癒、胎児または胚の発
達、および黄体、子宮内膜、胎盤の形成時において観察
される。内皮(endothelium)とは、漿液腔(serous cavit
y)、リンパ管および血管の内側にある扁平な上皮細胞の
薄い層のことである。コントロール下、および非コント
ロール下における血管新生は、どちらも同じように進行
すると考えられる。内皮細胞と基底膜(basement membra
ne)に囲まれた血管周辺細胞が毛細血管を形成する。血
管新生は先ず、内皮細胞および白血球の放出する酵素に
よって基底膜が浸食される。次いで、血管の内膜を覆う
内皮細胞が基底膜を貫いて突き出る。血管新生刺激因子
の誘導により、浸食された基底膜を通って内皮細胞が移
動する。移動した細胞が、親血管から肉芽(sprout)を形
成し、ここで内皮細胞が細胞分裂と増殖を行う。内皮肉
芽が互いに融合して毛細血管蹄(capillary loop)を形成
し、新しい血管をつくる。さまざまな疾病、腫瘍の転移
や内皮細胞の異常な増殖内では、持続的でコントロール
されない血管新生が起きており、これらの状態において
見られる病理学的損傷を裏付けている。コントロールさ
れない血管新生を起こすさまざまな疾病の病理学的状態
は、血管新生依存型か血管新生関連型の疾病の別に分類
されている。癌の成長は血管新生依存性であるという仮
説が始めて提唱されたのは、１９７１年である(Folkman
J.，Tumor angiogenesis: Therapeutic implication
s.，N．Engl．Jour．Med．285:1182-1186，1971)。この
論文は、非常にシンプルな表現で次のように述べている
「いったん腫瘍が出現すると、腫瘍細胞集団が増殖する
に先立ち、必ず腫瘍上に収束する新しい毛細血管が増大
する」。腫瘍の出現は、現時点では腫瘍の成長における
前血管形成段階、すなわち細胞集団の大きさが数マイク
ロリットル、数百万個までで、既存の宿主の微小血管上
で生存できる段階にあたると理解されている。この段階
を越えて腫瘍が大きくなるには、新たな毛細血管の誘導
が必要である。たとえば、マウスの早期前血管形成段階
の肺微小転移は、組織切片を高性能の顕微鏡で観察しな
ければ検出できない。この考え方を裏付ける間接的な例
には、以下のものがある。 （１）マウスの皮下の透明の間腔(transparent chambe
r)に移植された腫瘍の成長速度は、血管形成前は緩慢で
直線増加を示し、血管形成後は急速で指数増加を示す。
(Algire GH，et al．Vascular reactions of normal an
d malignant tumors in vivo I．Vascular reactions o
f mice to wounds and to normal and neoplastic tran
splants．J．Natl．Cancer Inst．6:73-85，1945) （２）単離された潅流臓器中の血管の増殖されない腫瘍
は、１から２ｍｍ3までにしか成長できないが、これが
マウスに移植されて血管形成すると、この大きさの１，
０００倍超にまで急速に大きくなる。(Folkman J，et a
l.，Tumor behavior in isoloated perfused organs: I
n vitro growth and metastasis of biopsy material i
n rabbit thyroid and canine intestinal segment．An
nals of Surgery 164:491-502，1966)。 （３）血管のない角膜における腫瘍の進行は、緩慢で直
線的成長を示すが、血管形成後は指数的成長に転じる。
(Gimbrone，M.A.，Jr．et al.，Tumor growth and neov
ascularization: An experimental model using the ra
bbit cornea．J．Natl．Cancer Institute 52:41 427，
1974) （４）ウサギの前眼房の水溶液中に懸濁された腫瘍は生
存しており、１ｍｍ3未満の大きさの無血管性腫瘍のま
まである。これはいったん虹彩血管床に移植されると、
血管を新生して急速に成長し、２週間以内に元の大きさ
の１６，０００倍にまで達する。(Gimbrone MA Jr.，et
al.，Tumor dormancy in vivo by prevention of neov
ascularizaion．J．Exp．Med．136:261-276) （５）腫瘍はニワトリの胚の漿尿膜上に移植されると、
７２時間までの無血管性段階の間は緩慢に成長し、平均
直径は０．９３＋０．２９ｍｍを越えない。血管形成開
始後は、２４時間以内に急速な腫瘍の増大が起こり、７
日目までにこれらの血管形成した腫瘍の平均直径は８．
０＋２．５ｍｍに達する。(Kninghton D.，Avascular a
nd vascular phases of tumor growth in the chick em
bryo．British J．Cancer，35:347-356，1977) （６）ウサギの肝臓における転移巣の血管柱(vascular
cast of metastases)は、転移の大きさは不均一である
が、血管形成が起こる大きさの限界点は比較的均一であ
ることを示した。腫瘍は一般に直径１ｍｍまでは無血管
性で、これを越えると血管が形成される。(Lien W.，et
al.，The blood supply of experimentalliver metast
ases．II．A microcirculatory study of normal and t
umor vessels of the liver with the use of perfused
silicone rubber．Surgery 68:334-340，1970) （７）膵島のベータ細胞に癌を発生する形質転換マウス
において、前血管形成の肥大した島は、大きさが１ｍｍ
までである。６〜７週の週齢で、４から１０パーセント
の島で血管形成が起こり、これらの島は前血管形成段階
の島の大きさの１０００倍以上の大きな血管形成腫瘍と
なる。(Folkman J．et al.，Induction ofangiogenesis
during the transition from hyperplasia to neoplas
ia．Nature339:58-61，1989) （８）ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子：vascular endothe
lial growth factor）に対して特異的な抗体は、微小血
管密度を低下させ、ＶＥＧＦを血管新生の唯一のメディ
エーターとしている３種類のヒトの腫瘍の成長を「有意
にあるいは非常に強く」阻害する（ヌードマウスにおい
て）。この抗体はインビトロにおける腫瘍細胞の成長は
阻害しない。(Kim K J，et al.，Inhibition of vascul
ar endothelial growth factor-induced angiogenesis
suppresses tumor growth in vivo．Nature 362:841-84
4，1993) （９）抗ｂＦＧＦモノクローナル抗体は、血管新生の唯
一のメディエーターとするｂＦＧＦの分泌に依存するマ
ウスの腫瘍の成長を７０％阻害する。この抗体は、イン
ビトロにおける腫瘍細胞の成長は阻害しない。(Hori A
et al.，Suppressi on of solid tumor growth by immu
noneutralizing monoclonal antibody against human b
asic fibroblast growth factor．Cancer Research，5
1:6180-6184，1991) （１０）ｂＦＧＦの腹腔内注入は、腫瘍内の毛細管内皮
細胞の成長を刺激することにより、一次腫瘍の成長と転
移を促進する。腫瘍細胞それ自身はｂＦＧＦのレセプタ
ーを有さず、ｂＦＧＦはインビトロにおいて腫瘍細胞の
分裂促進因子ではない。(Gross JL，et al．Modulation
of solid tumor growth by bFGF．Proc．Amer．Asso
c．Canc．Res．31:79，1990) （１１）ある特異的な血管新生阻害剤（ＡＧＭ−１４７
０）は、インビボにおいて腫瘍の成長と転移を阻害する
が、インビトロでは腫瘍細胞の増殖を阻害する活性がず
っと低い。この阻害物質は腫瘍細胞の増殖を阻害する場
合より４けた低い濃度で、血管内皮細胞増殖を最大反応
の半分に阻害する。(Ingber D，et al.，Angioinhibin
s: Synthetic analogues of fumagillin which inhibit
angiogenesis and suppress tumor growth．Nature，4
8:555-557，1990)。さらに、腫瘍の成長が血管新生依存
性であるという間接的な臨床所見が報告されている。 （１２）ガラス体に転移するヒトの網膜芽細胞腫瘍は、
（摘出した目から取り出してインビトロで分析する場合
は）生存しており、3Ｈ−チミジンを取り込むにもかか
わらず、１ｍｍ3未満の大きさに限定された無血管性の
球体に進行する。 （１３）子宮癌は小さな無血管性の白いシードとして腹
膜に転移する（１から３ｍｍ3）。これらの移植癌はそ
れらのひとつ、または複数が血管形成を受けるまでほと
んど大きくならない。 （１４）乳癌(Weidner N，et al.，Tumor angiogenesis
correlates with metastasis in invasive breast car
cinoma．N．Engl．J．Med．324:1 8，1991，andWeidner
N，et al.，Tumor angiogenesis: A new significant
and independentprognostic indicator in early stage
breast carcinoma，J Natl．Cancer Inst．84:1875-18
87，1992)および前立腺癌(Weidner N，Carroll PR，Fla
x J，Blu menfeld W，Folkman J．Tumor angiogenesis
correlates with metastasis ininvasive prostate car
cinoma．American Journal of Pathology，143(2):401-
409，1993)における血管新生の強度は、将来に転移する
リスクの大きさと強く相関する。 （１５）ヒト皮膚メラノーマからの転移は、血管新生以
前に起こることはまれである。血管新生が開始すると、
病巣の厚みの増大および転移リスクが増大する。(Sriva
stava A，et al.，The prognostic significance of tu
mor vascularityin intermediate thickness(0.76-4.0
mm thick skin melanoma．Amer．J．Pathol．133:419 4
23，1988) （１６）膀胱癌においては、疾患の状態および程度を表
す指標としては、細胞学的指標よりも血管形成タンパク
質であるｂＦＧＦの尿中濃度のほうが感度が高い。(Ngu
yen M，et al.，Elevated Ievels of an angiogenic pr
otein，basic fibroblast growth factor，in urine of
bladder cancer patients．J．Natl．cancer Inst．8
5:241-242，1993) このように、癌の転移において血管新生が主要な役割を
果たしていることは明らかである。この血管新生活性を
抑制または消失させることができれば、腫瘍は存在した
としても大きくはならないことになる。疾患において、
血管新生を防止することで、新しい微小管系の侵入によ
る損傷を防止できる可能性がある。血管新生プロセスの
コントロールを目的とする療法は、これらの疾患を治癒
または緩和できる可能性がある。このように、好ましく
ない血管の増殖、特に腫瘍内への増殖を阻害できる組成
物および方法が必要とされる。また、前記組成物を検
出、測定、位置特定する方法も必要とされる。前記組成
物は、転移前の腫瘍中における内因性の成長因子の活性
に打ち勝ち、腫瘍内における毛細血管の形成を防止し、
これによって腫瘍の成長を阻害できるものでなければな
らない。前記組成物、組成物のフラグメント 、および
組成物に特異的な抗体は、また、傷の治癒や生殖などの
他の血管新生プロセスにおきる毛細血管の形成も調節で
きなければならない。前記組成物および血管新生を阻害
する方法は、好ましくは毒性がなく副作用が少ないもの
であるべきである。また前記組成物の生合成される部位
および前記組成物の結合部位を検出、測定、位置特定す
る方法も必要とされる。前記組成物および前記組成物の
フラグメントは、放射活性および放射活性以外のいずれ
もの標識のための他の分子と抱合できるものである必要
がある。
【０００３】＜発明の要約＞本発明は、血管新生を調
節、および望まれない血管新生、特に腫瘍の成長に関連
する血管新生を阻害するに有効な組成物および方法を提
供するものである。本発明は、アンジオスタチンと称さ
れ、インビトロにおいてｂＦＧＦなどの内因性の成長因
子の血管新生活性を克服する能力と、プラスミノーゲン
のおよそ９８番目のアミノ酸から始まるプラスミノーゲ
ン内の一部分とのアミノ酸配列相同性および構造的類似
性を特徴とするタンパク質を含む。アンジオスタチン
は、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用した測
定でおよそ３８キロダルトンから４５キロダルトンの間
の分子量を有し、マウスの完全なプラスミーゲン分子の
９８番目のアミノ酸から始まるマウスのプラスミノーゲ
ンフラグメントと非常に似たアミノ酸配列を有するタン
パク質からなる（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
【０００４】アンジオスタチンのアミノ酸配列は、種間
でわずかに異なる。たとえば、ヒトのアンジオスタチン
において、アミノ酸配列は、上記のマウスのプラスミノ
ーゲンフラグメントの配列とほとんど同一であるが、活
性なヒトのアンジオスタチン配列は、完全なヒトプラス
ミノーゲンのアミノ酸配列の９７または９９番目のいず
れかのアミノ酸から始まっている。さらに、ヒトのプラ
スミノーゲンのフラグメントは、マウスの腫瘍モデルに
おいて示されるものと類似の抗血管新生活性を有する。
なお、活性なアンジオスタチン分子中のアミノ酸の数は
変化する場合があり、内皮阻害活性を有する全てのアミ
ノ酸配列が本発明に含まれる。
【０００５】本発明は、血管新生を阻害するに十分な容
量の、高度に生成されたアンジオスタチン、アンジオス
タチン誘導体、アンジオスタチンフラグメントあるいは
アンジオスタチン凝集体を含む組成物をヒトまたは動物
に投与することにより、望まれない、およびコントロー
ルされない血管新生が介在する疾患およびプロセスを治
療する方法、および組成物を提供するものである。本発
明は、特に、腫瘍の治療、または腫瘍の成長の抑制に有
用である。前血管新生転移性腫瘍を有するヒトまたは動
物にアンジオスタチンを投与することにより、これらの
腫瘍の成長、または増大が防止される。
【０００６】また、本発明は、アンジオスタチンをコー
ドするＤＮＡ配列、アンジオスタチンをコードするＤＮ
Ａ配列を含有する発現ベクター、およびアンジオスタチ
ンをコードするＤＮＡ配列を含有するひとつ、または複
数の発現ベクターを含有する細胞をも包含する。さら
に、本発明は、インビボでのアンジオスタチン濃度を改
善する目的でアンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列
を患者に導入する遺伝子治療法も包含する。
【０００７】また、本発明は、生物学的液体および組織
中におけるアンジオスタチン検出、および測定、組織お
よび細胞内におけるアンジオスタチンの位置特定のため
の診断方法、およびキットも含む。前記診断方法および
キットは、当業者に広く知られているいかなる構成のも
のでもよい。また、本発明は、アンジオスタチン分子お
よびその分子の部分に特異的な抗体、およびアンジオス
タチンに特異的な抗体の結合を阻害する抗体をも含む。
これらの抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナ
ル抗体でもよい。癌や他の血管新生が介在する疾患の発
病、または再発の診断あるいは予知を目的とする、アン
ジオスタチンの有無や量を検出する診断キットにおい
て、アンジオスタチンに特異的な抗体を使用することが
できる。アンジオスタチンに特異的な抗体はまた、ヒト
または動物に投与して、ヒトまたは動物にアンジオスタ
チンに対する受動免疫を与え、これにより血管新生の阻
害を小さくすることもできる。
【０００８】また、本発明は体液中のアンジオスタチン
と結合する抗体の有無およびその量を検出するための診
断方法およびキットをも含む。この診断方法およびキッ
トは、当業者に広く知られているいかなる構成のもので
もよい。また、本発明は、アンジオスタチンレセプター
に結合して、細胞に適切な信号を伝達し、作動物質また
は拮抗物質として作用するところの抗アンジオスタチン
レセプター特異的抗体をも含む。また、本発明はアイソ
トープ標識、または陽電子射出断層撮影、オートラジオ
グラフィー、フローサイトメトリー、ラジオレセプター
結合アッセイ、および免疫組織化学検査を含むが、これ
に限定されない手法を使用したアンジオスタチン結合部
位の検出および可視化に使用する他の分子、またはタン
パク質で標識できるアンジオスタチンタンパク質フラグ
メントおよびアナログを含む。また、これらのアンジオ
スタチンタンパク質およびアナログは、アンジオスタチ
ンレセプターにおいて、作動物質および拮抗物質として
作用し、アンジオスタチンの生物学的活性を増強または
妨害する。このようなタンパク質は、アンジオスタチン
レセプターの単離に使用する。また、本発明は、治療お
よび研究目的での細胞毒性薬剤と結合させた、アンジオ
スタチン、アンジオスタチンフラグメント、アンジオス
タチン抗血清、またはアンジオスタチンレセプター作動
物質およびアンジオスタチンレセプター拮抗物質を含
む。さらにまた、アンジオスタチン、アンジオスタチン
フラグメント、アンジオスタチン抗血清、またはアンジ
オスタチンレセプター作動物質、およびアンジオスタチ
ンレセプター拮抗物質は、薬学的に許容される賦形剤、
および任意で生分解性ポリマーなどの徐放性物質または
化合物と合わされて治療用組成物を形成する。本発明
は、アンジオスタチンの転写および翻訳に関与するリボ
核酸、およびデ オキシリボ核酸を検出する分子プロー
ブを含む。これらの分子プローブは、組織 および細胞
内でのアンジオスタチン生合成の検出および測定の手段
を提供する。このように、本発明の目的のひとつはアン
ジオスタチンを含む組成物を提供することにある。
【０００９】本発明の他の目的は、血管新生の介在する
疾患およびプロセスを治療する方法を提供することであ
る。本発明のさらに別の目的は、体液または組織中にお
けるアンジオスタチンの有無および量を検出する診断、
または予知方法およびキットを提供することである。
【００１０】本発明のさらに別の目的は、これに限定さ
れないが、血管腫、固形腫瘍、血液由来の腫瘍、白血
病、転移、毛細血管拡張症、乾癬、強皮症、化膿性肉芽
腫、心筋血管新生、クローン病、プラーク血管新生、冠
動脈側副枝、大脳側副枝、動静脈異常形成、虚血性四肢
血管新生、角膜疾患、皮膚潮紅、血管新生緑内障、糖尿
病性網膜症、水晶体後線維増殖、関節炎、糖尿病性血管
新生、黄斑変性、創傷の治癒、消化性潰瘍、ヘリコバク
ター関連性疾患、骨折、ケロイド、脈管形成、造血、排
卵、月経、胎盤形成、およびネコ引っ掻き熱などを含む
血管新生が介在する疾患およびプロセスの治療のための
方法と化合物を提供することである。本発明の別の目的
は、癌の治療またはその成長を抑制する組成物を提供す
ることである。
【００１１】本発明の別の目的は、インビボまたはイン
ビトロにおいてアンジオスタチンを産生する酵素の産生
または活性を調節または似せる組成物を提供することで
ある。本発明のさらに別の目的は、このようなアンジオ
スタチン、または抗アンジオスタチン抗体を必要として
いるヒトまたは動物に、アンジオスタチンＤＮＡを直接
注入することにより、アンジオスタチン、または抗アン
ジオスタチン抗体を提供することである。本発明のひと
つの目的は、体液中のアンジオスタチンに対して特異的
な抗体の有無および量を検出する方法を提供することで
ある。
【００１２】本発明のさらに別の目的は、プラスミノー
ゲンは認識せず、アンジオスタチン分子内の特定の部位
に選択的なアンジオスタチンに対する抗体を含む組成物
を提供することである。本発明の別の目的は、癌の検出
または予後診断の方法を提供することである。本発明の
別の目的は、インビボおよびインビトロにおいてアンジ
オスタチン結合部位の可視化および定量に使用する組成
物を提供することである。
【００１３】本発明のさらに別の目的は、アンジオスタ
チン生合成の検出および定量に使用する組成物を提供す
ることである。本発明のさらに別の目的は、これに伴う
副作用が最小限である癌の治療法を提供することであ
る。本発明のさらに別の目的は、癌の治療または癌の成
長を抑制する細胞毒性物質を結合したアンジオスタチン
またはアンジオスタチンタンパク質を含む組成物を提供
することである。本発明の別の目的は、アンジオスタチ
ン関連組成物を特定の部位に標的送達するための方法を
提供することである。本発明のさらに別の目的は、血管
新生プロセスの調節のための遺伝子治療に有用な組成物
および方法を提供することである。
【００１４】また、本願発明は以下のものである。 （１）プラスミノーゲン分子のクリングル領域断片を含
む、薬学的組成物であって、クリングル領域断片は抗血
管新生活性を有することを特徴とする薬学的組成物。
（２）クリングル領域断片は、ほぼ１個のクリングル領
域である（１）の薬学的組成物。（３）クリングル領域
断片は、ほぼ２個のクリングル領域である（１）の薬学
的組成物。（４）クリングル領域断片は、ほぼ３個のク
リングル領域である（１）の薬学的組成物。（５）クリ
ングル領域断片は、ほぼ４個のクリングル領域である
（１）の薬学的組成物。（６）クリングル領域断片は、
ほぼ５個のクリングル領域である（１）の薬学的組成
物。（７）クリングル領域断片は、約３８キロダルトン
から４５キロダルトンの分子量を有する（１）の薬学的
組成物。（８）クリングル領域断片は、ヒトプラスミノ
ーゲン由来である（１）の薬学的組成物。（９）クリン
グル領域断片は、インビボで抗血管新生活性を有する
（１）の薬学的組成物。（１０）クリングル領域断片
は、インビトロで抗血管新生活性を有する（１）の薬学
的組成物。（１１）クリングル領域断片は、血管新生依
存性の疾患を阻害することができる（１）の薬学的組成
物。（１２）クリングル領域断片は、腫瘍の成長を阻害
することができる（１）の薬学的組成物。
【００１５】（１３）（１）のクリングル領域断片をコ
ードする核酸を含む薬学的組成物。 （１４）クリングル領域断片は、ほぼ１個のクリングル
領域である（１３）の薬学的組成物。（１５）クリング
ル領域断片は、ほぼ２個のクリングル領域である（１
３）の薬学的組成物。（１６）クリングル領域断片は、
ほぼ３個のクリングル領域である（１３）の薬学的組成
物。（１７）クリングル領域断片は、ほぼ４個のクリン
グル領域である（１３）の薬学的組成物。（１８）クリ
ングル領域断片は、ほぼ５個のクリングル領域である
（１３）の薬学的組成物。（１９）クリングル領域断片
は、約３８キロダルトンから４５キロダルトンの分子量
を有する（１３）の薬学的組成物。（２０）クリングル
領域断片は、ヒトプラスミノーゲン由来である（１３）
の薬学的組成物。（２１）クリングル領域断片は、イン
ビボで抗血管新生活性を有する（１３）の薬学的組成
物。（２２）クリングル領域断片は、インビトロで抗血
管新生活性を有する（１３）の薬学的組成物。（２３）
クリングル領域断片は、血管新生依存性の疾患を阻害す
ることができる（１３）の薬学的組成物。（２４）クリ
ングル領域断片は、腫瘍の成長を阻害することができる
（１３）の薬学的組成物。（２５）宿主細胞中に存在す
るときにクリングル領域断片を発現することができるベ
クターを更に含むことを特徴とする（１３）の薬学的組
成物。
【００１６】（２６）ヒトの血管新生を阻害する方法で
あって、プラスミノーゲン分子のクリングル領域断片の
インビボにおける濃度を、血管新生を阻害する量までヒ
トにおいて増加させる工程を含み、前記クリングル領域
断片は抗血管新生活性を有することを特徴とする方法。
（２７）クリングル領域断片は、ほぼ１個のクリングル
領域である（２６）の方法。（２８）クリングル領域断
片は、ほぼ２個のクリングル領域である（２６）の方
法。（２９）クリングル領域断片は、ほぼ３個のクリン
グル領域である（２６）の方法。（３０）クリングル領
域断片は、ほぼ４個のクリングル領域である（２６）の
方法。（３１）クリングル領域断片は、ほぼ５個のクリ
ングル領域である（２６）の方法。（３２）クリングル
領域断片は、約３８キロダルトンから４５キロダルトン
の分子量を有する請求項（２６）に記載の方法。（３
３）クリングル領域断片は、ヒトプラスミノーゲン由来
である（２６）の方法。（３４）クリングル領域断片
は、血管新生依存性の疾患を阻害することができる（２
６）の方法。（３５）クリングル領域断片は、腫瘍の成
長を阻害することができる（２６）の方法。
【００１７】（３６）ヒトの血管新生を阻害する方法で
あって、プラスミノーゲン分子のクリングル領域を、血
管新生を阻害する量でヒトに投与する工程を含み、前記
クリングル領域断片は抗血管新生活性を有することを特
徴とする方法。（３７）クリングル領域断片は、ほぼ１
個のクリングル領域である（３６）の方法。（３８）ク
リングル領域断片は、ほぼ２個のクリングル領域である
（３６）の方法。（３９）クリングル領域断片は、ほぼ
３個のクリングル領域である（３６）の方法。（４０）
クリングル領域断片は、ほぼ４個のクリングル領域であ
る（３６）の方法。（４１）クリングル領域断片は、ほ
ぼ５個のクリングル領域である（３６）の方法。（４
２）クリングル領域断片は、約３８キロダルトンから４
５キロダルトンの分子量を有する（３６）の方法。（４
３）クリングル領域断片は、ヒトプラスミノーゲン由来
である（３６）の方法。（４４）クリングル領域断片
は、血管新生依存性の疾患を阻害することができる（３
６）の方法。（４５）クリングル領域断片は、腫瘍の成
長を阻害することができる（３６）の方法。
【００１８】（４６）抗血管新生活性を有する、３次元
クリングル様配座またはシステインモティーフを有す
る、単離された蛋白質またはペプチド。（４７）前記蛋
白質またはペプチドはプラスミノーゲン由来であること
を特徴とする、（４６）の単離された蛋白質またはペプ
チド。本発明のこれらの目的、特徴および効果は、発明
の詳細な説明および特許請求の範囲を検討することによ
り明らかになるものである。
【００１９】
【発明の実施の態様】本発明は、血管新生に媒介される
または血管新生を伴う疾患およびプロセスの検出および
治療をする組成物および方法を含む。前記組成物は、ア
ンジオスタチンで、これらに限定されないが血清、尿お
よび腹水を含む体液から単離することができ、または化
学的または生物学的方法（たとえば、細胞培養、組み換
え遺伝子発現、タンパク質合成、および活性なアンジオ
スタチンを得るためのプラスミノーゲン、またはプラス
ミンのインビドロ酵素分解）によって合成される。組み
換え手法には、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）を
使用するＤＮＡ源からの遺伝子増幅、および逆転写酵素
／ＰＣＲを使用するＲＮＡ源からの遺伝子増幅が含まれ
る。アンジオスタチンは、未血管新生または血管新生腫
瘍などの組織内への血管の増殖を阻害する。
【００２０】また、本発明は、アンジオスタチンをコー
ドするＤＮＡ配列を保有するベクターからなる組成物
で、前記ベクターは細胞内に存在する時にアンジオスタ
チンを発現できるものである組成物、ベクターを有する
細胞からなる組成物であって、前記ベクターはアンジオ
スタチンまたはアンジオスタチンのフラグメントまたは
アナログをコードするＤＮＡ配列を有するものであり、
前記ベクターは細胞内に存在する時にアンジオスタチン
を発現できるものであり、およびベクターを有する細胞
をヒトまたはヒト以外の動物に移植することからなる方
法であって、前記ベクターはアンジオスタチンをコード
するＤＮＡ配列を有するものであり、前記ベクターは細
胞内に存在する時にアンジオスタチンを発現できるもの
である方法を包含する。
【００２１】さらにまた、本発明は、治療用の組成物を
作成するために薬学的に許容される賦形剤、および必要
に応じ生分解性ポリマーなどの徐放性化合物または組成
物と合わされたアンジオスタチン、アンジオスタチンフ
ラグメント、アンジオスタチン抗血清、アンジオスタチ
ンレセプター作動物質またはアンジオスタチンレセプタ
ー拮抗物質を包含する。特に本発明は、アンジオスタチ
ンと特異的に結合する抗体からなる組成物を含み、前記
抗体はプラスミノーゲンと結合しない。
【００２２】さらに詳細には、本発明は、アンジオスタ
チンと称される、およそ３８から４５キロダルトン（ｋ
Ｄ）の分子量を有し、インビトロにおいてｂＦＧＦなど
の内因性成長因子の血管新生活性に打ち勝つことのでき
るタンパク質を含む。アンジオスタチンは、還元ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を使用した測定でおよそ３８
キロダルトンから４５キロダルトンの間の分子量を有
し、マウスの完全なプラスミノーゲン分子の９８番目の
アミノ酸から始まるマウスのプラスミノーゲンフラグメ
ントと非常に類似したアミノ酸配列を有するタンパク質
である。「非常に類似した」という表現は、アンジオス
タチンアミノ酸配列に関して使用される場合、抗血管新
生活性を有し、およそ３８キロダルトンから４５キロダ
ルトンの間の分子量を有するアミノ酸配列で、またマウ
スのプラスミノーゲンのおよそ９８番目のアミノ酸から
始まる、３８キロダルトンから４５キロダルトンの間の
分子量のマウスのプラスミノーゲンのタンパク質フラグ
メントとの高い配列相同性を有するアミノ酸配列である
ということである。高い相同性とは、少なくともおよそ
６０％のアミノ酸相同性、好ましくは少なくともおよそ
７０％のアミノ酸相同性、さらに好ましくは少なくとも
およそ８０％のアミノ酸相同性を指す。ここで使用され
る「内皮阻害活性」とは、たとえば線維芽細胞成長因子
存在下における細胞培養中のウシの毛細血管内皮細胞の
成長を阻害するなどの一般的な血管新生を阻害する分子
の能力を指す。
【００２３】完全なマウスのプラスミノーゲン分子のア
ミノ酸配列を図１およびＳＥＱ ＩＤＮＯ：１に示す、
アンジオスタチンの配列は、およそ９８番目のアミノ酸
から始まる。活性なヒトのプラスミノーゲン分子も、完
全なヒトプラスミノーゲン分子の９７または９９番目の
いずれかのアミノ酸から始まっている。マウスから得た
アンジオスタチンの始めの３３９個のアミノ酸のアミノ
酸配列は図２〜４（ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：２）に示さ
れ、ヒト（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、アカゲザル（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：４）、ブタ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、
ウシ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）プラスミノーゲン由来の
プラスミノーゲンタンパク質フラグメントに相当する配
列と比較されている。これらの配列が、それらのアミノ
酸の５０％よりずっと多くが同一であることを考える
と、アンジオスタチンのアミノ酸配列は種間で実質的に
は類似していると理解される。アンジオスタチンのアミ
ノ酸の総数は、正確には分かっていないが、活性分子の
分子量によって決められる。本発明のアンジオスタチン
のアミノ酸配列は、プラスミノーゲン分子が由来する種
により異なるかもしれない。このように、ヒトプラスミ
ノーゲン由来の本発明のアンジオスタチンは、マウス由
来のアンジオスタチンと配列が少し異なるが、マウスの
腫瘍モデルにおいて示されるように抗血管新生活性を有
する。
【００２４】アンジオスタチンは、インビトロにおいて
内皮細胞の成長を阻害する能力があることが判明してい
る。アンジオスタチンは、他の細胞タイプに由来する細
胞株の成長は阻害しない。特に、アンジオスタチンはル
イスラット肺癌細胞株、ミンク肺上皮細胞、３Ｔ３線維
芽細胞、ウシ大動脈平滑筋細胞、ウシ網膜色素上皮、Ｍ
ＤＣｋ細胞（イヌ腎臓上皮）、ＷＩ３８細胞（ヒト胎児
肺線維芽細胞）ＦＥＮ細胞（マウス胎児線維芽細胞）お
よびＬＭ細胞（マウス結合組織）に対しては作用しな
い。腫瘍を宿すマウス内の内因性アンジオスタチンは、
およそ１０ｍｇアンジオスタチン／ｋｇ体重の全身濃度
において、転移を阻害する作用がある。アンジオスタチ
ンは、プラスミノーゲン分子のクリングル領域により決
定される特異的な三次元構造を有する。(Robbins，K.
C.，"The plasminogen-plasmin enzyme system" Hemost
asis and Thrombosis，Basic Principles and Practic
e，2ndEdition，ed．by Colman，R.W．et al．J.B．Lip
pincott Company，pp．340 -357，1987）こういったク
リングル領域は５つあり、これらは構造的に関係したモ
チーフで、プラスミノーゲン分子のＮＨ2末端部分に、
実質的な配列相同性がある。アンジオスタチンの三次元
構造は、プラスミノーゲンクリングル領域１から３およ
び４の一部を取り囲むと考えられている。プラスミノー
ゲン分子の各クリングル領域は、約８０アミノ酸からな
り、３つのジスルフィド結合が含まれる。このシステイ
ンモチーフは、他の生物学的活性を有するタンパク質に
も存在することが知られている。これらのタンパク質に
は、これに限定されないが、プロトロンビン、肝細胞成
長因子、拡散因子(scatter factor)、およびマクロファ
ージ刺激タンパク質が含まれる。（Yoshimura，T，et a
l.，"Cloning，Sequencing，andexpression of human m
acrophage Stimulating protein（MSP，MST1）confirms
MSP as a member of the family of kringle Proteins
and locates the MSP gene on Chromosome 3" J．Bio
l．Chem.，Vol.268，No.21，pp.15461-15468，1933）。
三次元クリングル様構造またはシステインモチーフを有
する、インビボにおいて抗血管新生活性を有する単離タ
ンパク質またはタンパク質はすべて、本発明に属すると
考えられる。
【００２５】また本発明は、癌などの疾患の診断または
予後観察の目的での体液および組織中のアンジオスタチ
ンの検出も含む。また本発明は、細胞および組織中のア
ンジオスタチン結合部位およびレセプターの検出を含
む。また本発明は、これに限定されるものではないが関
節炎や腫瘍などを含む血管新生性疾患およびプロセス
を、アンジオスタチンの産生を刺激すること、および／
または高度に精製されたアンジオスタチン、またはアン
ジオスタチン作動物質または拮抗物質、および／または
アンジオスタチン抗血清またはアンジオスタチン抗血清
に対する抗血清を患者に投与することによって、治療ま
たは予防する方法を含む。さらなる治療方法には、アン
ジオスタチン、アンジオスタチンフラグメント、アンジ
オスタチンアナログ、アンジオスタチン抗血清または細
胞毒性剤を結合させたアンジオスタチンレセプター作動
物質および拮抗物質の投与を含む。なお、アンジオスタ
チンは動物由来でもヒト由来のものでもよいと理解され
るものである。アンジオスタチンは、化学反応または発
現システムと連帯する組み換え手法により合成されても
よい。アンジオスタチンは、単離されたプラスミノーゲ
ンまたはプラスミンを酵素で切断させて血管新生活性を
有するタンパク質を形成することにより作成することも
できる。アンジオスタチンは、また、プラスミノーゲン
を切断してアンジオスタチンにする内因性酵素の作用を
模倣する化合物によって作成することもできる。アンジ
オスタチン産生は、また、プラスミノーゲン切断酵素の
活性に作用する化合物により調節できる。
【００２６】アンジオスタチンと特異的に結合する抗体
を使用した受動的抗体療法は、生殖、発達、および傷の
治癒と組織の修復などの血管新生依存性プロセスの調節
に使用することができる。さらに、アンジオスタチン抗
体のＦａｂ領域に対する抗血清を投与して、アンジオス
タチンと結合する内因性のアンジオスタチン抗血清の作
用をブロックすることができる。
【００２７】また本発明は、患者の内でアンジオスタチ
ンをコードする遺伝子をコントロールするという遺伝子
療法も包含する。遺伝子産生タンパク質の発現のために
細胞にＤＮＡを移す、または送達する様々な方法、また
は遺伝子治療と呼ばれる方法が、先行技術としてここに
含むGene Transfer into Mammalian Somatic Cells in
vivo，N．Yang，Crit．Rev．Biotechn．12(4):335-356
（1992）に開示されている。遺伝子治療には、エクスビ
ボまたはインビボ治療のいずれかで使用するための、体
細胞または生殖系細胞内にＤＮＡ配列を組み込むことが
含まれる。遺伝子治療は、遺伝子を交換、正常または異
常な遺伝子機能を増幅、および感染症や他の病気と戦う
作用をする。これらの医学的問題を遺伝子治療で治療す
るという手法には、欠陥のある遺伝子を識別した後に機
能を有する遺伝子を付与して欠陥遺伝子の機能を代替す
るか、機能が少しある遺伝子を増幅するといった治療戦
略；症状を治療するまたは組織や器官の治療に対する感
受性をより高めるような産生タンパク質をコードする遺
伝子を付与するといった予防的戦略が含まれる。予防的
戦略の一例には、アンジオスタチンなどの遺伝子を患者
の体内に導入し血管新生の発生を予防する、または腫瘍
細胞の放射線に対する感受性を高める遺伝子を導入して
から腫瘍に放射線照射をすれば殺せる腫瘍細胞数が増加
するなどがある。本発明において、アンジオスタチンＤ
ＮＡまたはアンジオスタチン調節配列を導入する多くの
プロトコールが想定されている。特にアンジオスタチン
に関連して通常見られるものとは異なるプロモーター配
列、またはアンジオスタチンタンパク質の産生を増幅さ
せる他の配列の移入も、遺伝子治療の方法として想定さ
れている。この技術の例は、Transkaryotic Therapie
s，Inc.，of Cambridge，Massachusettsにみられるが、
これは相同組み換えを使用して細胞内のエリスロポエチ
ン遺伝子を活性化する「遺伝子スイッチ」を挿入するも
のである。GeneticEngineering News，April 15，1994
を参照のこと。通常の状態でアンジオスタチン（または
アンジオスタチンレセプター）を発現しない細胞内にお
いてアンジオスタチン（またはアンジオスタチンレセプ
ター）を活性化するのに、このような「遺伝子スイッ
チ」を使用できる可能性がある。
【００２８】遺伝子治療における遺伝子導入方法は、広
く三つのカテゴリーに分類される−物理的方法（エレク
トロポーレーション、直接的遺伝子導入および粒子砲撃
等）、化学的方法（脂質を基にするキャリア、または他
の非ウイルス性ベクター）、および生物学的方法（ウイ
ルス由来ベクターおよびレセプター取り込み）。たとえ
ば、ＤＮＡで被覆したリポソームを含む非ウイルス性ベ
クターを使用することもできる。このようなリポソーム
／ＤＮＡ複合体は、患者に直接に経静脈注入することが
できる。このリポソーム／ＤＮＡ複合体は肝臓で濃縮さ
れ、肝臓でＤＮＡはマクロファージやクッパー細胞に供
給されると考えられている。これらの細胞は寿命が長
く、従って長期間にわたって供給されたＤＮＡの発現が
得られる。さらに、治療用ＤＮＡの標的送達として、ベ
クターや遺伝子の「むき出し」状態のＤＮＡを、所望の
器官、組織または腫瘍に直接注入することもできる。
【００２９】遺伝子治療の方法論は、供給先によって処
方することもできる。基本的な遺伝子の供給方法には、
エクスビボ遺伝子導入、インビボ遺伝子導入、およびイ
ンビトロ遺伝子導入が含まれる。エクスビボ遺伝子導入
においては、細胞が患者から採取され細胞培養で増殖さ
せる。この細胞にＤＮＡを移入し、ＤＮＡを移入された
細胞の数を増殖させ、患者に再度移植する。インビトロ
遺伝子導入においては、形質転換細胞は、組織培養細胞
等の細胞培養で成長させた細胞で、特定の患者から採取
された特定の細胞ではない。これらの「実験室細胞」は
ＤＮＡを導入され、それぞれ患者への移植や他の用途に
おいて、導入された細胞が選択、増加される。 インヒ
ボ遺伝子導入では、細胞が患者の体内にある状態で患者
の細胞内にＤＮＡが導入される。方法には、患者への遺
伝子送達に非感染性ウィルスを使用したウィルス媒介遺
伝子導入を使用すること、または患者内の治療部位にむ
き出しのままのＤＮＡを注入し、遺伝子産生タンパク質
が発現される細胞の一部にＤＮＡを取り込ませることを
含む。さらに、たとえば「遺伝子ガン（gene gun）」の
使用などの、ここに記載する他の方法も、アンジオスタ
チンＤＮＡまたはアンジオスタチン調節配列のインビド
ロ挿入に使用することができる。
【００３０】遺伝子治療の化学的方法には、ＤＮＡに細
胞膜を通過させて運ぶ脂質を基にする化合物（必ずしも
リポソームでなくてもよい）を含んでもよい。負に帯電
するＤＮＡに結合する正に帯電する脂肪を基にするイオ
ンであるリポフェクチンまたはチトフェクチンは、細胞
膜を通過して細胞内部にＤＮＡを供給できる複合体を形
成する。他の化学的方法では、レセプターを基にするエ
ンドサイトシスを使用するが、これには、特定のリガン
ドと細胞表面のレセプターの結合およびこれを包み込ん
で細胞膜を通って移動させることが含まれる。リガンド
がＤＮＡと結合し、複合体全体が細胞内に移送される。
リガンド遺伝子複合体は血中に注入され、レセプターを
有する標的細胞が特異的にリガンドと結合してリガンド
−ＤＮＡ複合体が細胞内に移送される。
【００３１】多くの遺伝子治療方法では、細胞内に遺伝
子を挿入するのにウィルスベクターを使用している。た
とえは、加工されたレトロウィルスベクターは、エクス
ビボ法において、遺伝子を抹消および腫瘍浸潤リンパ
球、肝臓細胞、表皮細胞、筋細胞、または他の体細胞中
に遺伝子を導入するために使用されている。これらの加
工細胞は、次いで患者に導入され、挿入ＤＮＡによる遺
伝子産物を供給する。
【００３２】ウィルスベクターは、また、インビボプロ
トコールにおいて細胞に遺伝子を挿入するために使用さ
れている。外部遺伝子の組織特異的な発現を得るため
に、シス作用性調節要素、または組織特異的であること
が判明しているプロモータを使用することができる。ま
たは、これは、インビボで、特異的な解剖組織学的部位
へのＤＮＡまたはウィルスベクターのｉｎ ｓｉｔｕ送
達により達成できる。たとえば、インビボにおける血管
への遺伝子導入は、インビトロで移転された内皮細胞を
動脈壁の選択された部位に移植することで得られた。周
囲の細胞もウィルスに感染し、遺伝子産物を発現した。
たとえばカテーテルなどでウィルスベクターをインビボ
部位に直接送達し、一定の部分のみウィルスに感染させ
て長期的で部位特異的な遺伝子発現を得ることができ
る。レトロウィルスベクターを使用したインビボ遺伝子
もまた、その器官に通じる血管中に加工したウィルスを
注入することで、乳房組織および肝臓組織のおいて実証
されている。
【００３３】遺伝子治療プロトコールに使用されている
ウィルスベクターには、レトロウィルス、ポリオウィル
スやＳｉｎｄｂｉｓウィルスなどの他のＲＮＡウィル
ス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウ
ィルス、ＳＶ４０、牛痘および他のＤＮＡウィルスなど
が含まれるがこれに限定されるものではない。複製欠損
マウスレトロウィルスベクターが、もっとも広範に使用
される遺伝子導入ベクターである。マウス白血病レトロ
ウィルスは、タンパク質コア（ｇａｇ）の中に納まり、
宿主範囲を決定する糖タンパク質エンベロープ（ｅｎ
ｖ）で周囲を被覆された、一本鎖ＲＮＡと核コアタンパ
ク質とポリメラーゼ（ｐｏｌ）酵素の複合体である。レ
トロウィルスの遺伝子構造は、５’および３’のロング
ターミナルリピート（ＬＴＲ）の間に位置するｇａｇ、
ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む。ウィルスの構造タン
パク質がイントランスにパッケージング細胞株に供給さ
れれば、５’および３’ＬＴＲおよびパッケージングシ
グナルを保有する最低限のベクターで、ベクターパッケ
ージング、感染、標的細胞への取り込みを十分に行える
ということをレトロウィルスのベクターシステムでは利
用している。遺伝子導入におけるレトロウィルスの基本
的な利点は、大半のタイプの細胞が有効に感染して遺伝
子を発現すること、標的細胞の染色体ＤＮＡ中に正確な
単一コピーベクターを挿入できること、およびレトロウ
ィルスゲノムの取扱いが簡単である事が含まれる。
【００３４】アデノウィルスは、キャプシドタンパク質
で周囲を取り囲まれた、コアタンパク質と複合体を形成
する直線の二本鎖ＤＮＡからなる。分子ウィルス学にお
ける進展により、これらの生物の生理を利用してインビ
ボにおいて標的細胞内に新しい遺伝子配列を導入できる
ベクターが作成できるようになった。アデノウィルスを
基にするベクターは、遺伝子産物ペプチドを高濃度に発
現する。アデノウィルスベクターはウィルスの力価が低
くても感染効率が高い。さらに、ウィルスは、細胞と離
れた状態のビリオンとしても完全な感染力を有するの
で、産生細胞株への注入が不要である。その他のアデノ
ウィルスベクターに考えられる利点は、インビボにおい
て長期間にわたり異種遺伝子の発現が得られることであ
る。
【００３５】ＤＮＡ送達の機械的方法には、リポソーム
や他の膜融合のための小胞体などの融合に適した脂質小
胞体、リポフェクチンのようなＤＮＡを取り込むカチオ
ン脂質の脂質粒、ＤＮＡのポリリジン−媒介移送、胚や
体細胞内へのＤＮＡのマイクロインジェクションなどの
ＤＮＡの直接注入、「遺伝子ガン」で使用される金粒子
などのような空気圧により送達されるＤＮＡ被覆粒子、
およびリン酸カルシウムＤＮＡ導入などのような無機化
学的方法も含まれる。別の方法であるリガンド媒介遺伝
子治療では、特定の細胞や組織にＤＮＡを向かわせるた
めに、ＤＮＡを特定のリガンドと複合させてリガンド−
ＤＮＡ抱合体を形成する。
【００３６】プラスミドＤＮＡを筋肉細胞に注射する
と、ＤＮＡ感染し、マーカー遺伝子の持続的に発現する
細胞を高い割合で得られることが判明している。プラス
ミドのＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれる場合も組
み込まれない場合もある。感染ＤＮＡが取り込まれない
場合は、最終的に分化した非増殖性の組織において、長
期間、細胞またはミトコンドリアゲノム中における突然
変異による挿入、欠失、変更の恐れもなく、ＤＮＡ感染
および遺伝子産物タンパク質を発現させることができ
る。永久である必要はないが、長期間にわたる特定の細
胞への治療遺伝子の導入は、遺伝子性疾患または予防的
使用における治療を可能とする。レシピエント細胞のゲ
ノムに突然変異が起こることなく、遺伝子産物レベルを
一定に維持するためにＤＮＡを定期的に再度注射するこ
とができる。外因性ＤＮＡが取り込まれないことは、全
てのＤＮＡ構築物が様々な遺伝子産物の発現を行う状態
で、ひとつの細胞内に数種類の異なる外因性ＤＮＡ構築
物の存在を可能とするかもしれない。
【００３７】粒子媒介による遺伝子導入方法は、始め形
質転換植物組織において使用されていた。ＤＮＡで被覆
した高密度粒子（金またはタングステンなど）を、標的
器官、組織または細胞を貫通できるだけの高速に加速さ
せるための原動力を得るのに、粒子砲撃装置、または
「遺伝子ガン」を使用する。粒子砲撃は、インビドロシ
ステムで、またはエクスビボまたはインビボ手法と組み
合わせて、細胞、組織または器官にＤＮＡを導入するた
めに使用できる。
【００３８】遺伝子導入のためのエレクトロポーレーシ
ョンでは、細胞または組織がエレクトロポーレーション
媒介性の遺伝子導入を受けやすくするために、電流を使
用する。ＤＮＡ分子が細胞内へと通過できるように膜の
透過性を高くするために、所定の電界強度を伴う短い電
気インパルスを使用する。この技術は、隠微吐露システ
ムでまたはエクスビボまたはインビボ手法と組み合わせ
て、細胞、組織または器官にＤＮＡを導入するために使
用できる。
【００３９】外来ＤＮＡを細胞に移入するのに、インビ
ボにおけるキャリア媒介による遺伝子導入を使用でき
る。キャリアーＤＮＡ複合体は簡単に体液または血流中
に導入され、次いで部位特異的に体内の標的器官または
組織に向かう。リポソームや、ポリリジン、リポフェク
チンまたはチトフェクチンなどのポリカチオンの双方と
も使用できる。細胞特異的または器官特異的なリポソー
ムを作成でき、このようにリポソームによって運ばれる
外来ＤＮＡは、標的細胞中に取り込まれる。特定の細胞
上の特異的なレセプターを標的とする免疫リポソームの
注入は、レセプターを保有する細胞へのＤＮＡを導入す
る簡単な方法として使用できる。これまで使用されてき
た別のキャリアシステムは、インビボ遺伝子導入とし
て、ＤＮＡを肝臓細胞に運ぶためのアシアロ糖タンパク
質／ポリリジン抱合体システムを使用するものである。
【００４０】また、ＤＮＡがレシピエント細胞に運ばれ
た後に細胞質内または核質内に留まるように、導入ＤＮ
Ａを他の種類のキャリアと複合することもできる。特別
に作成した小胞複合体中の核タンパク質キャリアとＤＮ
Ａを結合させ、直接核に運搬されるようにすることもで
きる。
【００４１】アンジオスタチンの遺伝子調節は、アンジ
オスタチン遺伝子、またはアンジオスタチン遺伝子に関
連したコントロール領域、またはこれに相当するＲＮＡ
転写物と結合する化合物を投与して、転写または翻訳の
速度を調節することで行える。さらに、インビボでアン
ジオスタチンを供給する源を提供するために、アンジオ
スタチンをコードするＤＮＡ配列を導入した細胞を患者
に投与すこともできる。たとえば、アンジオスタチンを
コードする核酸配列を含むベクターで細胞を感染させる
こともできる。ここにおいて使用される「ベクター」と
いう言葉は、特定の核酸配列を含有またはこれに関連
し、その特定の核酸配列を細胞内に移送する機能を果た
すキャリアのことである。ベクターの例には、プラスミ
ド、およびウィルスなどの感染性微生物、またはリガン
ド−ＤＮＡ抱合体、リポソーム、脂質−ＤＮＡ複合体な
どの非ウィルス性ベクターがある。アンジオスタチンＤ
ＮＡ配列からなる組換ＤＮＡ分子は、アンジオスタチン
が発現できる発現ベクターを形成するための発現コント
ロール配列と協働的に結合されていることが望ましい。
感染細胞は患者の正常組織由来の細胞でも、患者の疾患
組織の細胞でもよく、または患者の細胞でなくともよ
い。
【００４２】たとえば、患者から採取した腫瘍細胞を、
本発明のアンジオスタチンタンパク質を発現するベクタ
ーに感染させ、患者に再度導入することもできる。感染
した腫瘍細胞は、患者の体内において腫瘍の生育を抑制
できる濃度のアンジオスタチンを産生する。患者はヒト
でもヒト以外の動物でもよい。細胞はベクター以外のも
の、またはエレクトロポーレーション、イオンポーレー
ション、または「遺伝子ガン」の使用など、当業で既知
の物理的または化学的方法で感染させてもよい。さら
に、アンジオスタチンＤＮＡをキャリアの助けなしに、
直接患者に注入してもよい。特に、アンジオスタチンＤ
ＮＡは皮膚、筋肉、または血液に注入することができ
る。
【００４３】患者にアンジオスタチンを導入するための
遺伝子治療プロトコールは、細胞の、またはミニクロゾ
ームのゲノムにアンジオスタチンＤＮＡを組み込むこと
によるものでも、細胞の細胞質または核質内で別個に複
製する、または複製しないＤＮＡ構築物の組み込みによ
って行うものでもよい。アンジオスタチンの発現は、長
期間継続するものでも、細胞、組織または器官内のアン
ジオスタチンタンパク質濃度、または血中濃度を所望の
値に維持するために定期的に注入を繰り返してもよい。
【００４４】アンジオスタチンは、ＨＰＬＣ Ｃ４カラ
ム（表３を参照）で単離することができる。アンジオス
タチンタンパク質は、アセトニトリル勾配の３０％から
３５％において溶出される。ドデシル硫酸ナトリウムポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）における、
還元条件下、活性を有するタンパク質バンドは、約３８
キロダルトンの位置に単一のピークとして溶出される。
【００４５】発明者らは、転移巣内の血管新生を抑制
し、これにより転移巣そのものの成長を阻害するアンジ
オスタチンを含む内皮細胞増殖に対して特異的な阻害物
質が、一次腫瘍の成長中には血流へ放出されていること
をすでに証明している。一次腫瘍に伴って放出されるア
ンジオスタチンの発生源は、知られていない。この化合
物は、特異的なプロテアーゼによるプラスミノーゲンの
分解により産生されるか、またはアンジオスタチンをコ
ードする特定の遺伝子の発現によってアンジオスタチン
が産生される可能性がある。
【００４６】一次腫瘍が血管を形成する表現型となるの
は、血管新生タンパク質の産生が正常細胞の産生する内
皮細胞阻害物質に優る場合であるが、この内皮細胞阻害
物質は悪性転換中は産生低下調節(down-regulated)を受
けると考えられている。個々の腫瘍細胞におけるアンジ
オスタチンの産生が、親細胞での産生に比較して減少す
る調節を受けていても、腫瘍全体が産生する阻害物質の
総量は、循環系に流入して離れた部位の微小転移巣の内
皮成長を抑制するのに十分である可能性がある。アンジ
オスタチンは、一次腫瘍の放出する血管新生タンパク質
よりもずっと長期間にわたり循環系に残存する。このよ
うに血管新生タンパク質は局所的に作用するが、アンジ
オスタチンは全身的に作用し、比較的に長い半減期で血
中を循環する。アンジオスタチン半減期はおよそ１２時
間から５日である。
【００４７】以下の仮説に拘束されることを望むもので
はないが、ある腫瘍が血管新生状態になると、１種類ま
たは複数の血管新生タンパク質を放出するが（例、ａＦ
ＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦな
ど）、これは局所的に作用し、近隣の一次腫瘍内の内皮
を血管外の方向から攻撃するが、循環しない（または短
い半減期で循環する）と考えられる。一次腫瘍がその集
団を拡大し続けるためには、これらの血管新生タンパク
質は、内皮細胞阻害物質（血管新生の阻害物質）の作用
に打ち勝つに十分な量を産生される必要がある。いった
ん、こういった一次腫瘍が順調に成長を始めると、腫瘍
は内皮細胞阻害物質を血管中に放出し続 ける。この仮
説によれば、これらの阻害物質は一次腫瘍から離れた場
所で作用し 、血管内から転移巣の毛細血管内皮に作用
し、循環を続ける。このように、離れた場所にある転移
巣がちょうど血管新生を開始しようという時、その近隣
の毛細血管内皮は流入するアンジオスタチンにより阻害
を受けていることとなる。
【００４８】一次腫瘍が、循環系に継続的にアンジオス
タチンを放出するような大きさにいったん到達すると、
二つ目の腫瘍移植片（または微小転移巣）がその血管新
生を開始または増大させることは難しい。一つ目の腫瘍
の移植の直後に二つ目の腫瘍移植片（たとえば、皮下ス
ペース内、または角膜内、または経静脈的に肺内への移
植）を移植した場合は、一つ目の腫瘍は二番目の腫瘍を
十分に抑制できない（二番目の腫瘍の血管新生が、十分
に開始してしまうため）。二つの腫瘍を同時に移植した
場合は（例、両わきなど）阻害物質は互いに同等の阻害
効果を有する。
【００４９】本発明のアンジオスタチンは、 （ｉ）腫瘍を宿すヒトおよび動物に抗血管新生療法とし
て投与される； （ｉｉ）予後観察のマーカーとして、ヒトおよび動物の
血清、尿、または組織中アンジオスタチンをモニターす
る； （ｉｉｉ）同じような血管新生分子について、癌患者の
血清および尿を分析する基準として使用される。
【００５０】本発明の一部として、アンジオスタチンは
血液または尿などの患者の体液から単離することがで
き、またはアンジオスタチンは、当業者がよく知る組換
えＤＮＡ法または合成タンパク質化学法により作成する
ことができると考えられる。タンパク質精製法は、当業
界で広く知られており、アンジオスタチンを精製および
阻害物質活性を検定する方法の特別な例は、下記の実施
例に記載される。ヒト内因性アンジオスタチンの単離
は、同様の手法を使用して行われる。
【００５１】組換えＤＮＡ手法を使用してアンジオスタ
チンを生産する方法の一例は、次のステップを伴う、
（１）上記の通りおよびさらに詳細には下記の通り、ア
ンジオスタチンを同定および精製、（２）精製した阻害
物質のＮ末端アミノ酸配列を決定、（３）前記アンジオ
スタチン配列の５’および３’ＤＮＡオリゴヌクレオチ
ドプライマーを合成、（４）ポリメラーゼを使用してア
ンジオスタチン遺伝子配列を増幅、（５）表現ベクター
のような、適切なベクターへ増幅配列を挿入、（６）微
生物や阻害物質遺伝子を発現できる他の表現系へ遺伝子
を有するベクターを導入、および（７）組み換え技術で
産生した阻害物質を単離するステップ。適切なベクター
にはウイルス、バクテリアおよび真核細胞の（酵母な
ど）表現ベクターが含まれる。上記の手法は、"Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual" Second Edition by
Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Press，1989な
どの実験マニュアルに、詳細にわたり記載されている。
ヒトのプラスミノーゲンのＤＮＡ配列は既に公表されて
おり(Browne，M.J.，et al.，"Expression of recombin
ant human plasminogen and aglycoplasminogen in Hel
a cells" Fibrinolysis Vol.5(4)．257-260，1991)、こ
れを本明細書に先行技術として含めた。そのような組換
え発現系の一つの例としては、アメリカンカルチャータ
イプコレクション（12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland 20852）から許可を得て入手することができ
るＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ．９８２３１で１９９６年１０
月２３日に寄託された大腸菌株XL-1B pTcrHisA/HasH4が
挙げられる。
【００５２】アンジオスタチンの遺伝子は、高濃度でア
ンジオスタチンを発現する細胞または組織（腫瘍細胞な
ど）から、次のように単離することもできる、すなわ
ち、（１）組織からメッセンジャーＲＮＡを単離し、
（２）逆転写酵素を使用して、これに相当するＤＮＡ配
列を作成し、（３）適当なプライマーとポリメラーゼチ
ェイン反応（ＰＣＲ）を使用して、活性なアンジオスタ
チンアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を増幅する方
法で単離する。アンジオスタチン、または生物学的に活
性なアンジオスタチンフラグメントを生産するさらに別
の方法は、タンパク質合成による方法である。下記にさ
らに詳細に説明されるアッセイシステムを使用して、生
物学的に活性なアンジオスタチンフラグメントをいった
ん見つけられれば、これを、たとえば、自動タンパク質
配列決定法などにより配列決定することができる。また
は、たとえば、上記の方法などによって、アンジオスタ
チンをコードする遺伝子またはＤＮＡ配列がいったん分
離されれば、当業で広く知られた手動式、または自動式
配列決定方法により、ＤＮＡ配列を決定することができ
る。この場合は、核酸配列からアミノ酸配列に関する情
報が得られる。このように、トリプシン消化などの特別
な方法で生物学的に活性なフラグメントが作成できれ
ば、またはそのフラグメントのＮ末端の配列が決まれ
ば、残るアミノ酸配列は、これに相当するＤＮＡ配列か
ら決定することができる。
【００５３】タンパク質のアミノ酸配列が判明すれ
ば、"Solid Phase Peptide Synthesis:APractical Appr
oach" E．Atherton and R.C．Sheppard，IRL Press，Ox
ford，England に例示されているなどの当業において広
く知られた技術により、フラグメントを合成することが
できる。同様に、後にそれぞれが結合して、より大きな
フラグメントを形成する複数のフラグメントを合成する
こともできる。これらの合成タンパク質フラグメント
は、インビトロおよびインビボでの作動性および拮抗性
を試すために、特定の位置にアミノ酸置換を行って作成
することもできる。組織に対する親和力が強いタンパク
質フラグメントは、アフィニティーカラムにおいて、ア
ンジオスタチンレセプターを分離するのに使用すること
ができる。アンジオスタチンレセプターの分離および精
製は、アンジオスタチンの作用機構の解明に向けて基本
的なステップである。アンジオスタチンレセプターの単
離およびアンジオスタチン作動物質および拮抗物質の同
定は、生物学的活性の最終経路である、アンジオスタチ
ンレセプターの活性を調節する薬剤の開発を容易にす
る。レセプターが単離できれば、ｉｎ ｓｉｔｕおよび
溶液ハイブリダイゼーション技術を使用して、レセプタ
ーの位置と合成をモニターする核酸プローブを作成する
ことができる。さらに、アンジオスタチンレセプターの
遺伝子を単離し、発現ベクター中に組み込んで親の腫瘍
細胞などの細胞に導入し、その細胞タイプ、すなわち組
織または腫瘍細胞のアンジオスタチンと結合する能力を
増大し局所における血管新生を阻害することができる。
【００５４】アンジオスタチンは、血管新生の介在す
る、または血管新生を含む疾患またはプロセスの治療に
有効である。本発明は、有効量のアンジオスタチン、ま
たは生物学的に活性なアンジオスタチンのフラグメン
ト、または集合して抗血管新生活性を有するアンジオス
タチンフラグメント混合物、またはアンジオスタチン作
動物質または拮抗物質により血管新生介在性疾患を治療
する方法を含む。血管新生介在性疾患には、固形腫瘍；
白血病のような血液由来の腫瘍；腫瘍転移巣；たとえば
血管腫、聴神経腫、神経繊維芽腫、トラコーマおよび化
膿性肉芽腫などの良性腫瘍；リューマチ様関節炎；乾
癬；糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移
植片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後繊維増殖、皮膚紅
潮などの眼球血管新生疾患；オースラー−ウエ−バ−症
候群；心筋血管新生；プラーク血管新生；末梢血管拡
張；血友病関節；血管繊維細胞腫；および創傷肉芽など
が含まれるが、これに限定されるものではない。アンジ
オスタチンは、内皮細胞の過剰または異常な刺激による
疾患の治療に有効である。これらの疾患には、腸癒着、
クローン病、アテローム硬化、強皮症、たとえばケロイ
ドのような過形成瘢痕などがあるが、これに限定される
ものではない。アンジオスタチンは、胚の着床に必要な
血管新生を防止することにより、バースコントロール薬
として使用できる。アンジオスタチンは、ネコ引っ掻き
病(Rochele minalia quintosa)および潰瘍(Helicobacte
r pylori)などのような病理学的帰結として血管新生を
起こす疾患の治療に有用である。
【００５５】アンジオスタチンの合成タンパク質フラグ
メントには、さまざまな用途がある。高い特異性および
結合活性でアンジオスタチンレセプターに結合するタン
パク質を放射活性標識して、オートラジオグラフィーま
たは膜結合技術を用いて、結合部位の可視化または定量
に使用することができる。この応用は、重要な診断およ
び研究手段を与えるものである。アンジオスタチンレセ
プターの結合特性についての知見は、レセプターに関連
する形質導入メカニズムの調査を容易にする。
【００５６】さらに、アンジオスタチンタンパク質を半
減期の短い放射性同位元素で標識することにより、ポジ
トロンエミッショントモグラフィーや他の最新のラジオ
グラフィー技術を利用してインビボにおいてレセプター
結合部位の可視化が可能となり、アンジオスタチン結合
部位を有する腫瘍の位置特定ができる。
【００５７】これらの合成タンパク質中にシステマティ
ックにアミノ酸置換を行うことで、レセプターに対する
アンジオスタチンの結合を促進または減少させる親和性
の高いアンジオスタチンレセプターに対する作動物質ま
たは拮抗物質を得ることができる。このような作動物質
は、微小転移の成長を抑制し、これにより腫瘍の拡散を
制限するのに使用される。アンジオスタチンの拮抗物質
は、血管新生が不十分でない場合においてアンジオスタ
チンの阻害作用を遮断し、血管新生を促進する。たとえ
ば、この治療は、糖尿病における損傷修復を促進する治
療効果がある。
【００５８】アンジオスタチンタンパク質は、腫瘍細胞
の培養細胞からアンジオスタチンレセプターを単離する
アフィニティーカラムの作成に使用される。アンジオス
タチンレセプターの単離、精製に次いで、アミノ酸配列
をおこなう。この情報をもとに、アンジオスタチンレセ
プターの遺伝子または遺伝子配列を同定、単離すること
ができる。次に、クローン化した核酸配列を、レセプタ
ーを発現する能力のあるベクターに挿入するために作成
する。これらの技術は、当業者には広く知られている。
アンジオスタチンレセプターをコードする核酸配列の腫
瘍細胞への導入、およびＤＮＡ導入された腫瘍細胞によ
るレセプターの発現は、これらの細胞の内因性または外
因性アンジオスタチンに対する反応性を増大し、これに
より転移巣の成長速度を低下させる。
【００５９】リシンなどの細胞毒性物質はアンジオスタ
チンおよび高い親和性を持つアンジオスタチンタンパク
質フラグメントに結合し、アンジオスタチンと結合する
細胞を破壊する手段を得ることができる。これらの細胞
は、微小転移および一次腫瘍などを含むがこれらに限定
されない、多くの部位において見いだされる。細胞毒性
物質を結合させたタンパク質は、所望の部位への送達を
最大限に行えるような方法で注入される。たとえば、リ
シンの結合した高親和性アンジオスタチンフラグメント
を、標的部位に血液を供給している血管中または標的に
直接カニューレで送達する。このような薬剤はまた、イ
ンフュージョンカニュレにつなげた浸透圧ポンプを使用
してコントロールしながら送達される。いくつかのアン
ジオスタチン拮抗物質を血管新生刺激物質と同時に投与
して、組織の血管形成を増大させることもできる。この
治療方法は、転移癌を破壊するのに有効な手法である。
【００６０】アンジオスタチンは、病気の治療を目的と
する他の成分や手法と組み合わせて使用されることもあ
る。たとえば、腫瘍を手術、放射線照射または化学療法
といった従来の治療法とアンジオスタチンで治療し、そ
の後、微小転移腫瘍の休止状態を継続させ、残存するす
べての一次腫瘍の成長を安定および阻害するために、患
者に引き続きアンジオスタチンを投与することもでき
る。更に、アンジオスタチン、アンジオスタチンフラグ
メント、アンジオスタチン抗血清、アンジオスタチンレ
セプター作動物質、アンジオスタチンレセプター拮抗物
質またはこれらの組み合わせは、薬学的に許容される賦
形剤および任意で生分解性ポリマーなどの徐放性基質と
組み合わされて治療用組成物が形成される。
【００６１】本明細書において、徐放性基質とは、酵
素、または酸／塩基加水分解反応、または溶解により分
解する材料で、通常はポリマーでできている。いったん
体内に挿入されると、この基質は酵素または体液により
作用を受ける。徐放性基質は、好ましくは、リポソー
ム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリ
コール酸のポリマー）、ポリラクチド コーグリコリド
（乳酸とグリコール酸のコポリマー）ポリアンヒドライ
ド、ポリ（オルソ）エステル、ポリタンパク質、ヒアル
ロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン
酸、脂肪酸、リン脂質、ポリサッカライド、核酸、ポリ
アミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン
などのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピ
レン、ポリビニルピロリドン、およびシリコンなどの生
体適合材料から選択される。好ましい生分解性基質は、
ポリラクチド、ポリグリコリド、またはポリラクチド
コ−グリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）の
いずれかの基質である。
【００６２】本発明の血管新生を調節する治療用組成物
は、固体、液体またはエアロゾルでもよく、および既知
のいずれかの投与経路で投与される。固体の治療成分の
例には、錠剤、クリーム、植え込み型剤形がある。錠剤
は経口投与、治療用クリームは局所投与される。植え込
み型投与ユニットは、たとえば腫瘍の部位などに局所的
に投与してもよく、または治療用血管新生調節成分を全
身に放出するために、たとえば皮下に植え込んでもよ
い。液体成分の例には、皮下、静脈、動脈注射用の剤形
および、局所および眼内投与用剤形を含む。エアロゾル
剤形の例には、肺への投与のための吸入用剤形が含まれ
る。
【００６３】また、本発明アンジオスタチンは、阻害物
質およびそのレセプターに特異的な抗体を作成するのに
使用できる。前記抗体は、ポリクローナルでもモノクロ
ーナル抗体のいすれでもよい。アンジオスタチンまたは
アンジオスタチンレセプターに特異的に結合するこれら
の抗体は、体液または組織のアンジオスタチン、または
アンジオスタチンレセプターの検出または定量を目的と
する、当業者に広く知られている診断方法およびキット
において使用することができる。これらの検査の結果
は、癌および他の血管新生介在性疾患の発生または再発
を、診断または予想するのに使用できる。
【００６４】アンジオスタチンはまた、アンジオスタチ
ンに結合する能力を有する抗体を、検出および定量する
診断方法、およびキットに使用することができる。これ
らのキットは、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて一次腫瘍が分泌
するアンジオスタチンの存在下における微小転移腫瘍の
拡散を示す、血中のアンジオスタチン抗体の検出を可能
とするであろう。こういった抗アンジオスタチン抗体が
血中にある患者では、多発性腫瘍および癌を発症する可
能性が高く、治療後または寛解期間の後に癌が再発する
可能性が高い。これらの抗アンジオスタチン抗体のＦａ
ｂフラグメントは、抗アンジオスタチン抗体を中和する
のに使用することができる抗アンジオスタチン Fabフラ
グメント抗血清を作成するにあたり、抗原として使用す
ることができる。このような方法は、抗アンジオスタチ
ン抗体による血中アンジオスタチンの排除を低下させ、
血中アンジオスタチン濃度を有効に上昇させる。
【００６５】本発明の他の構成は、過剰の内因性アンジ
オスタチンの作用を遮断する方法である。これは、シス
テム中の好ましくないアンジオスタチンに対して特異的
な抗体でヒトまたは動物に受動的に免疫を与えることで
行える。この治療は、異常な排卵、月経、胎盤形成、お
よび血管形成の治療において重要である。これは、転移
プロセスにおけるアンジオスタチン排除の効果を調べる
にあたり、有用な手段を提供するものである。アンジオ
スタチン抗体のＦａｂフラグメントには、アンジオスタ
チンとの結合部位が含まれる。このフラグメントは、当
業者において既知の技術を使用してアンジオスタチン抗
体から単離される。アンジオスタチン抗血清のＦａｂフ
ラグメントは、抗Ｆａｂフラグメント血清の産生を開始
させるための抗原として使用される。アンジオスタチン
のＦａｂフラグメントの抗血清を点滴すれば、アンジオ
スタチンのアンジオスタチン抗体との結合を防止でで
る。治療効果は、アンジオスタチンと抗アンジオスタチ
ンのＦａｂフラグメントの結合を遮断することで内因性
抗アンジオスタチン抗体を中和することにより得られ
る。この治療の純効果は、内因性血中アンジオスタチン
が標的細胞に到達することを容易にし、これにより転移
の拡散を減少させるものである。
【００６６】なお、本発明は、内皮形成阻害活性を有す
るアンジオスタチンのすべての誘導体を含有すると考え
られる。本発明は、完全なアンジオスタチンタンパク
質、アンジオスタチンタンパク質の誘導体、および生物
学的活性なアンジオスタチンタンパク質のフラグメント
全体を含む。これらには、アミノ酸置換、またはアミノ
酸基に糖または他の分子が結合するアンジオスタチン活
性を有するタンパク質が含まれる。また、本発明は、ア
ンジオスタチンおよびアンジオスタチンレセプターをコ
ードする遺伝子、およびこれらの遺伝子により発現され
るタンパク質を含む。
【００６７】上記のアンジオスタチン活性を有するタン
パク質およびタンパク質フラグメントは、当業者に既知
の製剤方法を使用した薬学的に許容される剤形で、単離
および高度に精製されたタンパク質、およびタンパク質
フラグメントとして提供することができる。これらの剤
形は、標準的な経路で投与することができる。一般に、
この組み合わせ物は、局所、経皮、腹腔内、頭蓋内、脳
室内、膣内、子宮内、経口、直腸、または非経口（たと
えば、静脈内、髄腔内、皮下、または筋肉内）経路で投
与することができる。さらに、アンジオスタチンは、こ
れを徐放させるような生分解性ポリマー中に含有させる
こともでき、前記ポリマーを、薬剤送達が必要とされる
場所、たとえば腫瘍の部位の周辺に、またはアンジオス
タチンが全身的に徐々に放出されるように植え込むこと
もできる。直接に転移癌成長部位中にまたはその腫瘍へ
の供給血管中への送達など、目的の部位にカニューレを
使用して、高濃度のアンジオスタチンをコントール下で
送達するために浸透圧ミニポンプもまた使用される。生
分解性ポリマーおよびその使用途は、たとえば、本明細
書中に先行技術として全体を含めている、Brem et a
l.，J．Neurosurg．74:44 1-446（1991）に詳細に記載
される。
【００６８】本発明のアンジオスタチンの用量は、疾患
の状態、または治療する症状、および体重およびヒトま
たは動物の状態、および薬剤の投与経路などの他の臨床
的要因によって決められる。ヒトおよび動物の治療にお
いては、およそ０．５ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇ
の間のアンジオスタチンが投与できる。その特定の動物
またはヒト内におけるアンジオスタチンの半減期によ
り、アンジオスタチンは１日数回から１週間に１回まで
の割合で投与される。なお、本発明は、ヒトおよび動物
における使用の双方への適用があることが理解される。
本発明の方法は、単独および複数投与、同時または長時
間にわたるものを想定している。
【００６９】アンジオスタチン剤形には、口、直腸、眼
（ガラス体内または眼房内を含む）、鼻、局所（頬およ
び舌下を含む）、子宮内、膣、非経口（皮下、腹腔内、
筋肉内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内および硬膜外を
含む）投与に適切なものを含む。アンジオスタチン剤形
は、便利なように、用量単位の剤形にしたり、従来の
薬学上技術を使用して調製できる。このような技術に
は、活性成分および薬学的 キャリアまたは賦形剤を混
合する段階を含む。一般に、製剤は、均一かつ丁寧に
、活性成分と液体キャリア、または細かくした固体キ
ャリアまたはその双方とを 混合し、それから、必要が
あれば製剤を成形して調製される。
【００７０】非経口投与に適当な剤形には、水溶性また
は非水溶性滅菌注射液で、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、
および製剤を投与対象者の血液と等張とするための溶質
を含んでもよい注射液；および水溶性または非水溶性滅
菌懸濁液で、懸濁剤と粘ちょう化剤を含んでもよい。製
剤は、１回用量または複数用量が入る容器、たとえば、
密封アンプルおよびバイアルなどに入って提供されても
よく、および使用の直前に滅菌液体キャリア、たとえば
注射用水などを加えるだけでよい、凍結乾燥状態で保存
することもできる。即席の注射溶液および懸濁液は、先
に記載したようなものの滅菌粉末、顆粒および錠剤から
調製できる。
【００７１】好ましい１回用量剤形は、投与成分の１日
分の用量または単位、１日分のサブドース、またはこれ
の適当な画分を含むものである。なお、投与成分に加え
て、特に上記のように、本発明の剤形には、該当する剤
形の種類によって当業で従来より使用される他の薬剤を
含むものである。患者に二元的な治療を提供するため
に、必要に応じて、細胞毒性物質を、アンジオスタチン
タンパク質または生物学的に機能を有するこれのタンパ
ク質フラグメントに混合または結合することもできる。
【００７２】本発明の血管新生阻害タンパク質は、標準
的なマイクロケミカル設備で合成することができ、純度
はＨＰＬＣおよびマススペクトロフォトメトリーで確認
できる。タンパク質合成、ＨＰＬＣ精製およびマススペ
クトロフォトメトリーの方法は、一般に当業で知られて
いるものである。また、アンジオスタチンタンパク質お
よびアンジオスタチンレセプタータンパク質は、組み換
え大腸菌または酵母菌表現系において産生され、カラム
クロマトグラフィーで精製される。
【００７３】これに限定されないが、以下を含むいくつ
かの応用用途のために、完全なアンジオスタチン分子か
ら各種のタンパク質フラグメントを合成することができ
る；特異的抗血清の作成のための抗原として、アンジオ
スタチン結合部位において活性な作動物質および拮抗物
質として、アンジオスタチンと結合する細胞を狙って殺
すための細胞毒性物質と結合、またはこれと組み合わせ
て使用するタンパク質としての用途。これらのタンパク
質を含むアミノ酸配列は、アンジオスタチン分子の外側
領域のその位置を基に選択され、抗血清との結合を利用
できる。アンジオスタチンのアミノおよびカルボキシ末
端、および分子の中央部分は、合成されるフラグメント
のなかにそれぞれ別に表現される。
【００７４】これらのタンパク質配列はゲンバンクブル
ックヘブンプロテイン(GenBank Brookhaven protein，S
WISS-PROT)およびＰＩＲなどのタンパク質配列データベ
ースを使用して、配列相同性の可能性を検討するため
に、既知の配列と比較される。この情報により、他の分
子との配列相同性が高い配列を排除することができ、特
異性の高いアンジオスタチンの抗血清、作動物質、拮抗
物質を開発できる可能性を高めている。
【００７５】アンジオスタチンおよびアンジオスタチン
由来タンパク質は、標準的な方法を使用して他の分子と
結合することができる。アンジオスタチンのアミノおよ
びカルボキシ末端の双方ともに、チロシンとリジン残基
を有し、たとえば、従来技術を使用した放射活性標識な
どの多くの技術でアイソトープまたはアイソトープ以外
の標識が付与される（チロシン残基−クロラミンＴ、ヨ
ードゲン、ラクトペルオキシダーゼ；リジン残基−ボル
トン−ハンター試薬）。これらのカップリング技術は、
当業者には広く知られているものである。また、これら
の残基を持たないフラグメントにチロシンまたはリジン
を付与して、タンパク質上の反応性のアミノおよびヒド
ロキシル基の標識付与を行いやすくできる。カップリン
グ手法は、スルフヒドラル、カルボキシル、アミド、フ
ェノール、およびイミダゾールを含むがこれに限定され
ないアミノ酸上で利用できる機能基によって選択され
る。これらのカップリングを行うには、様々な試薬が使
用されるが、その中には、グルタルアルデヒド、ジアゾ
化ベンジジン、カルボジイミドおよびｐ−ベンゾキノン
が含まれる。
【００７６】アンジオスタチンタンパク質は、アイソト
ープ、酵素、キャリアタンパク質、細胞毒性物質、蛍光
分子、ケミルミネセンス、バイオルミネセンスおよびそ
の他の様々な用途のための化合物と化学的にカップリン
グされる。カップリング反応の効率は、その特定の反応
に適切なそれぞれの手法によって測定される。たとえ
ば、アンジオスタチンタンパク質を125Iで放射標識する
には、クロラミンＴと比活性の高いＮａ125Ｉを使用し
て行う。反応はメタ重亜硫酸ナトリウムで停止させ、反
応混合物は使い捨てカラムで脱塩する。標識されたタン
パク質をカラムから溶出し画分を回収する。各画分から
一部を採取し、ガンマカウンターで放射活性を測定す
る。このようにして、未反応のＮａ125Ｉを、標識済ア
ンジオスタチンタンパク質から分離する。最も高い比放
射活性を示したタンパク質画分を、アンジオスタチン抗
血清に対する結合能力の分析などの後の使用のために保
管する。
【００７７】タンパク質抱合体の他の応用は、ポリクロ
ーナル抗血清の製造である。たとえば、リジン残基を有
するアンジオスタチンタンパク質を、グルタルアルデヒ
ドを使用して精製ウシ血清アルブミンに結合する。反応
の効率は、放射標識タンパク質の取り込みを測定して判
断する。未反応のグルタルアルデヒドおよびタンパク質
は、透析で分離する。抱合体は後の使用のために保管す
る。
【００７８】アンジオスタチンに対する抗血清、アンジ
オスタチンアナログ、アンジオスタチンのタンパク質フ
ラグメントおよびアンジオスタチンレセプターを作成す
ることができる。タンパク質の合成および精製後、当業
者に既知の確立された手法で、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗血清を作成する。たとえば、ポリクロー
ナル抗血清は、ウサギ、ヒツジ、ヤギまたは他の動物に
おいて作成される。ウシ血清アルブミンなどのキャリア
分子と抱合されたアンジオスタチンタンパク質、または
アンジオスタチン自身を、アジュバンド混合液と混合し
てエマルジョンを作成し、背中、首、わき腹、および場
合によっては足の裏の複数の部位に皮下注射する。ブー
スター注射は、２から４週間毎など、一定の期間毎にお
こなう。採血は、たとえば、拡張後の耳末梢静脈を使用
した静脈穿刺により、各回の注射から約７から１０日後
におこなう。血液サンプルは、摂氏４度で一晩凝固させ
た後、摂氏４度、３０分間、約２，４００Ｘｇで遠心分
離する。血清を回収し、小分けにし、直ちに使用する場
合は摂氏４度で、後の分析用には摂氏マイナス２０から
マイナス９０度にて保存する。
【００７９】ポリクローナル抗血清の形成の全ての血清
サンプルおよびモノクローナル抗血清の産生培地サンプ
ルは、抗体価を測定する。抗体価は、いくつかの方法、
たとえばドットブロットおよび密度分析を使用したも
の、およびプロテインＡ，二次抗血清、冷エタノールま
たは木炭−デキストランを使用した放射活性タンパク質
−抗体複合体の沈降と引き続くガンマカウンタ−による
活性測定など、によって測定される。また、最も抗体価
の高い抗血清は、市販のアフィニティーカラムで精製す
る。アンジオスタチンタンパク質は、アフィニティーカ
ラム内のゲルにカップリングされる。抗血清サンプルを
カラムに通すと、抗アンジオスタチン抗体はカラムに結
合して残る。これらの抗体を次いで溶出して回収し、力
価測定と特異性について評価する。
【００８０】最も抗体価の高い抗血清は、以下について
評価する；ａ）抗原の特異的結合が最大で非特異的結合
が最小となる最適な抗血清希釈倍率、ｂ）標準置換曲線
における斬増するアンジオスタチンタンパク質との結合
能力、ｃ）プラスミノーゲンおよび関連する種のアンジ
オスタチンを含む関連タンパク質およびタンパク質との
交差反応の可能性、ｄ）血漿、尿、組織および培養細胞
培地の抽出物中のアンジオスタチンタンパク質に対する
検出能力。
【００８１】アンジオスタチンおよびアンジオスタチン
レセプターの測定用キットもまた、本発明の一部である
と考えられる。最大の抗体価および特異性を有し、血
漿、尿、組織および培養細胞培地の抽出物中のアンジオ
スタチンタンパク質を検出できる抗血清は、アンジオス
タチンの迅速、高信頼性、高感度、および特異的な測定
および位置特定をおこなう使用が簡便なキットを作成す
るためにさらに検討される。これらのアッセイキット
は、以下の技術を含むがこれに限定されるものではな
い；競合および非競合的アッセイ、ラジオイムノアッセ
イ、バイオルミネセンスおよびケミルミネセンスアッセ
イ、フルオロメトリックアッセイ、サンドイッチアッセ
イ、イムノラジオメトリックアッセイ、ドットブロッ
ト、ＥＬＩＳＡなどの酵素結合アッセイ、マイクロタイ
タープレート、尿または血液の迅速なモニタリング用の
抗体でコーティングしたストリップまたはディップステ
ィック、およびイムノチトケミストリー。各キットの範
囲について、アッセイの感度、精度、信頼性、特異性、
および再現性を確立する。標準置換曲線の２０％、５０
％および８０％地点において、アッセイ内およびアッセ
イ間の変動を確立する。
【００８２】研究および臨床で一般に使用されるアッセ
イキットの一例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）キ
ットである。アンジオスタチンＲＩＡを、以下に説明す
る。アンジオスタチンまたはアンジオスタチンタンパク
質への放射性ヨウ素付与および精製をきちんと行った
後、最大の抗体価を有する抗血清を数種類の希釈倍率に
して、適当な緩衡液システム中に比較的一定量の放射活
性、１０，０００ｃｐｍなどを添加した試験管中に添加
する。他の試験管に緩衡液または免疫前の血清を入れ
て、非特異的な結合を測定する。摂氏４度で２４時間イ
ンキュベーションした後、プロテインＡを添加し、試験
管を浸透し、室温で９０分間インキュベートし、摂氏４
度、約２，０００〜２，５００Ｘｇで遠心分離し、標識
抗原に結合した抗体の複合体を沈殿させる。上清を吸引
して除去し、沈殿物中の放射活性をガンマカウンターで
測定する。非特異的結合を差し引いた後、標識タンパク
質の約１０から４０％と結合した希釈倍率の抗血清につ
いてさらに検討を行う。
【００８３】次に、抗血清の作成に使用したある希釈範
囲（約０．１ｐｇから１０ｎｇ）のアンジオスタチンタ
ンパク質を、既知の量のこのタンパク質を、放射活性タ
ンパク質および抗血清を入れた試験管に添加して評価す
る。さらにたとえば、２４から４８時間インキュベート
した後、プロテインＡを添加し、試験管を遠心分離にか
け、上清を除去し、沈殿物の放射活性を測定する。放射
標識をしないアンジオスタチンタンパク質（標準品）に
よる放射標識アンジオスタチンタンパク質結合の置換か
ら、標準曲線が得られる。数種類の濃度の他のアンジオ
スタチンタンパク質フラグメント、プラスミノーゲン、
異なる種のアンジオスタチン、および相同なタンパク質
をアッセイ試験管に添加して、アンジオスタチン抗血清
の特異性を確認する。
【００８４】一次および二次腫瘍、ルイスラット肺癌、
アンジオスタチン産生細胞培養物、胎盤、子宮および、
脳、肝臓、および小腸などの他の組織を含むがこれに限
定されない、様々な組織の抽出物を、アンジオスタチン
を抽出する為に継続的に用いられている抽出手法を使用
して調製する。組織抽出物を凍結乾燥またはスピードバ
ックした後、アッセイ緩衡液を添加して各量をＲＩＡ試
験管に入れる。既知のアンジオスタチン産生細胞の抽出
物は、標準曲線と並行する置換曲線を描いたが、一方、
アンジオスタチンを産生しない組織の抽出物は、アンジ
オスタチン抗血清において放射標識されたアンジオスタ
チンと置換しなかった。さらに、ルイスラット肺癌を有
する動物から得た尿、血漿、および脳脊髄液を、斬増量
でアッセイ試験管に添加した。並行の置換曲線は、組織
および体液中のアンジオスタチンを測定するアンジオス
タチンアッセイの有用性を示す。
【００８５】アンジオスタチンを含有する組織抽出物
は、さらに、その一部を逆相ＨＰＬＣにかけて確認をし
た。溶出画分を回収し、スピードバックで乾燥させ、Ｒ
ＩＡ緩衡液で再構成しアンジオスタチンＲＩＡで分析し
た。最大のアンジオスタチン免疫活性は、アンジオスタ
チンの溶出ポジションに相当する画分中に存在した。ア
ッセイキットは、手引き書、抗血清、アンジオスタチン
またはアンジオスタチンタンパク質および場合によって
は、放射標識アンジオスタチンおよび／または結合アン
ジオスタチンアンジオスタチン抗体複合体の沈殿用の試
薬を提供するものである。キットは腫瘍を持つ、または
持たない動物およびヒトの生物学的液体および組織抽出
物中のアンジオスタチンの測定に有用である。
【００８６】他のキットは、組織および細胞中のアンジ
オスタチンの位置特定に使用される。このアンジオスタ
チン免疫組織化学キットでは、手引き書、アンジオスタ
チン抗血清、および場合によっては、遮断血清（ブロッ
キング血清）およびフルオレセインイソチオシアネート
などの蛍光分子または一次抗血清を可視化するのに使用
される他の試薬を結合された二次抗血清を提供する。免
疫組織化学技術は、当業者においては広く知られてい
る。このアンジオスタチン免疫組織化学キットでは、光
学および電子顕微鏡の双方を使用して、組織切片および
培養細胞中のアンジオスタチンの位置を特定できる。こ
れは研究および臨床用のどちらにも使用できる。例え
ば、腫瘍を生検または採取し、アンジオスタチン産生部
位を検査するために組織切片をミクロトームで切除す
る。このような情報は、腫瘍の発見と治療において、診
断および場合によっては治療において有用である。アン
ジオスタチンの生合成部位を可視化する他の方法には、
アンジオスタチンメッセンジャーＲＮＡをプローブとす
るｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、核
酸を 放射標識する方法がある。同様に、免疫組織化学
技術を使用して、アンジオスタ チンレセプターの位置
を特定し、可視化、定量することができる。
【００８７】本発明は、以下の実施例によりさらに詳細
に説明されるが、これらの実施例はどのような場合でも
本発明の特許請求の範囲を限定すると解釈されるもので
はない。なお、反対に他の実施例、変更およびこれの均
等物によることもでき、それは、この説明を読めば、本
発明の精神および／または添付の請求の範囲を外れる事
なく、当業者に連想されるものであることが明らかであ
る。
【００８８】
【実施例】
【００８９】
【実施例１】転移巣の成長が一次腫瘍によって阻害さ
れ、一次腫瘍の切除で促進される動物−腫瘍システムの
選択 自身の転移を阻害する能力のある様々なマウスの腫瘍を
スクリーニングして、ルイスラット肺癌を選択した。こ
の癌において最も有効に肺転移を阻害するのは一次腫瘍
である。同系Ｃ５７ＢＩ６／Ｊ６週齢オスのマウスに１
ｘ１０6の腫瘍細胞を注射（背部皮下）した。肉眼で確
認できる腫瘍が始めて出現したのは、３〜４日後であっ
た。腫瘍の大きさが約１，５００ｍｍ3 に達した時、マ
ウスを２つのグループに無作為に分けた。１つのグルー
プでは腫瘍を完全に切除し、２つ目のグループでは疑手
術をおこなって腫瘍はそのまま残した。転移巣の成長を
阻害するのは、大きさ５００から３，０００ｍｍ3の腫
瘍であるが、高い生存率で局所再発を起こさずに安全に
切除できる一次腫瘍の大きさは、最大で１，５００ｍｍ
3である。
【００９０】２１日後、全てのマウスを屠殺し、剖検を
おこなった。一次腫瘍をそのまま残したマウスでは、４
＋２の肉眼で確認できる転移巣があったのに対して、腫
瘍を切除したマウスでは５０＋５の転移巣があった（ｐ
＜０．０００１）。これらのデータは、以前に証明され
ているように、腫瘍の大きさと密接に相関する肺重量に
よっても確認された。腫瘍をそのまま残したマウスに比
較して、腫瘍を切除したマウスの肺の湿重量は、４００
％大きかった。（ｐ＜０．０００１） この実験モデルは、再現性のあるデータを与え、記載の
実験は再現性があった。この腫瘍は、「ルイスラット肺
癌−低転移性」（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）と名付けられた。こ
の腫瘍はまた、ＢおよびＴリンパ球を欠損するＳＣＩＤ
マウスにおけるのとほとんど同一のパターンで転移を抑
制した。
【００９１】
【実施例２】一次腫瘍除去の有無に関係なく、高い転移
性を有するルイスラット肺癌腫瘍の変異種の単離 実施例１のひとつのグループのマウスのＬＬＣ−Ｌｏｗ
細胞株から、ルイスラット肺癌の転移性の高い変異種が
自然発生的に生じた。これを実施例１に記載の方法にし
たがって単離し、再度移植した。この腫瘍（ＬＬＣ−Ｈ
ｉｇｈ）は、一次腫瘍の有無に関係なく３０箇所以上の
肉眼で確認できる肺転移巣を形成した。
【００９２】
【実施例３】転移巣の大きさおよびその中の腫瘍細胞の
増殖速度。転移を阻害する一次腫瘍の 作用（ＬＬＣ−
Ｌｏｗ） 全ての実験において、Ｃ５７ＢＩ６／Ｊ６マウスを使用
した。マウスの皮下に、ＬＬＣ−Ｌｏｗ細胞を接種し、
１４日後に半数のマウスの一次腫瘍を切除した。腫瘍切
除から５、１０、１５日後にマウスを屠殺した。肺転移
巣の組織学的切片を採取した。一次腫瘍をそのまま残し
たマウスには、肺に血管新生のない微小転移巣があっ
た。これらの転移巣は、直径が１２〜１５細胞層以内
で、腫瘍切除から１５日後でさえも有意に増大しなかっ
た。これに対して、一次腫瘍を切除した。 マウスで
は、手術後５日ですでに血管新生した大きな転移巣が出
現していた。これらの転移巣は、腫瘍除去後１５日目に
は、（肺重量および組織学的検査に反映されるように）
さらに４倍に大きくなった。一次腫瘍を切除したマウス
のうちおよそ５０％が、実験が終了する前に肺転移で死
亡した。一次腫瘍をそのままにしたマウスはすべて、実
験の終了まで生存していた。
【００９３】転移巣内の腫瘍細胞の複製速度は、事前に
マウスに注射したＢｒｄＵに染色された核を数えること
て測定した。一次腫瘍を切除しないマウスにおいて、Ｂ
ｒｄＵを取り込んだ腫瘍細胞の割合が高かったのは小型
の無血管性転移巣であったが、一次腫瘍を切除したマウ
スでは、血管新生中の大きな転移巣で同程度のＢｒｄＵ
の取り込みが観察された（図５）。この所見は、一次腫
瘍の存在は、転移内の腫瘍細胞の複製速度に直接の影響
を与えないことを示唆する。
【００９４】図５において、左のパネルは、一次腫瘍の
有無における肺の腫瘍細胞のＢｒｄＵラベリングインデ
ックスを示す。免疫組織化学的染色に先立ち、切片は
０．２Ｍ ＨＣｌで１０分間、透過化し、０．２Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2中、１μｇ／ｍｌのプ
ロテナーゼＫ（ベーリンガーマンハイムＧｍｂＨ、マン
ハイム、ドイツ）で摂氏３７度で１５分間消化した。ラ
ベリングインデックスは、２５０倍、陽性核の割合をカ
ウントして判断する。図５の右のパネルは、一次腫瘍を
切除しない、または手術後５、１０、１５日に一次腫瘍
を切除した場合の腫瘍の肺総重量の分析を示す。マウス
は、ＢｒｄＵ（０．７５ｍｇ／マウス）の腹腔内注入か
ら６時間後に屠殺された。
【００９５】
【実施例４】無傷の一次腫瘍の存在下における肺転移巣
中の血管新生の阻害 肺転移巣における血管新生の程度を測定するために、フ
ォン・ヴィレブランド (ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ)
因子（内皮に特異的なマーカー、ダコ社カーペンテリ
ア、カリフォルニアにて入手可能）に対する抗体で組織
を染色した。無傷の一次腫瘍を有する動物の転移巣で
は、既存の肺血管の周囲に薄いカフ（８〜１２個の腫瘍
細胞の層）が形成されていた。血管の内側を覆う内皮細
胞を除いて、フォン・ヴィレブランド因子に対して陽性
な細胞はほんのわずか、または存在しなかった。これと
反対に、一次腫瘍切除後５日目の動物における肺転移巣
は、大きいばかりでなく、フォン・ヴィレブランド因子
で強く染色された内皮細胞を含む毛管肉芽で浸潤されて
いた。
【００９６】肺転移巣中の内皮細胞の存在に関する免疫
組織化学的分析においては、接種後１９日の無傷の一次
腫瘍を伴う肺転移巣には、既存の微小血管の周囲を腫瘍
細胞がカフに取り囲んでいた。転移巣は、最大で８から
１２個の細胞層までであった。微小血管の周囲に血管新
生の証拠はなく、新しい微小血管は観察されなかった。
これは、血管新生前の段階の最大の大きさの無血管性の
転移巣の典型であった。 一次腫瘍を切除してから５日
後（一次腫瘍の接種後１９日）に採取された組織の免疫
組織化学的分析では、肺において既存の血管の周囲を転
移巣が取り囲んでいた。一方、一次腫瘍を切除しなかっ
たサンプルでは、腫瘍は血管新生していた。このように
無傷の一次腫瘍は、転移巣における新たな毛細血管の形
成を阻害するが、転移巣内の腫瘍細胞の増殖は一次腫瘍
による影響を受けない。
【００９７】
【実施例５】マウス角膜において、一次腫瘍は移植され
た二次腫瘍の血管新生を抑制する。この二つ目の腫瘍の
成長は阻害される。０．２５から０．５ｍｍ2のルイス
ラット肺癌（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）を、第０日にマウスの角
膜に移植した。(Muthukkaruppan Vr.，et al.，Angioge
nesis in themouse cornea．Science 205:1416-1418，1
979)一次腫瘍は、角膜への移植の４または７日前；角膜
への移植の日；角膜への移植の４または７日後のいずれ
かに、１ｘ１０6個のＬＬＣ−Ｌｏｗ細胞を背部の皮下
に接種して形成させた。対照マウスは角膜移植は受けた
が皮下腫瘍の接種は受けなかった。他の対照マウスは、
角膜移植と角膜移植の４日まえに背部にＬＬＣ−Ｈｉｇ
ｈ腫瘍細胞の接種をおこなった。角膜は、角膜腫瘍の成
長（接眼マイクロメーターで測定した）および角膜縁の
端からの新しい毛細血管の成長について、スリットラン
プ立体顕微鏡で毎日検査した。一次皮下腫瘍を宿さない
対照マウスでは、大半の角膜（６／８）で角膜移植後６
から７日目から血管新生がはじまっており、１０日目ま
で続いた。１０日目までに、血管新生した角膜腫瘍は、
全眼の容積の約四分の一にまで到達していた。一次皮下
ＬＬＣ−Ｌｏｗ腫瘍がある場合は、角膜移植の最低４日
前までに一次腫瘍を形成させていた場合は、角膜移植片
は血管新生していなかった（表１）。血管新生がない場
合は、角膜腫瘍は、角膜内で薄い白色の無血管性円板と
して緩慢に成長した。
【００９８】しかし、角膜の移植から４日経過する前に
一次腫瘍を移植しなかったた場合は、角膜は血管新生
し、３／３の角膜腫瘍は、腫瘍を宿さない対照と同じ速
度で成長した。ＬＬＣ−Ｈｉｇｈの皮下一次腫瘍がある
場合は、大半の角膜（２／３）が、角膜移植後７日目に
血管新生を開始し１０日目まで続いた。ここでもまた、
１０日目までに、血管新生した角膜腫瘍は、全眼の容積
の約四分の一にまで到達していた。
【００９９】
【表１】 眼腫瘍移植の７日前に一次ＬＬＣ−Ｌｏｗ皮下腫瘍が移
植された場合（すなわち−７）は、０／１０の角膜にお
いて血管新生があると予想される。しかし、腫瘍のうち
２つは（２／１０）は、大きすぎたために（３ｃｍ
3超）壊死性となった。
【０１００】
【実施例６】無傷の一次腫瘍は、塩基性線維芽細胞成長
因子（ｂＦＧＦ）の二次皮下移植片に誘導される血管新
生を阻害する。実施例４および５は、一次腫瘍が、二次
転移巣中における血管新生を阻害することを記載してい
るが、これらの研究は、一次腫瘍が：（ｉ）直接、ある
いは（ｉｉ）転移腫瘍細胞の血管新生活性を低下調節す
ることにより間接的に、内皮増殖（または血管新生）を
阻害しているのかを明らかにしていない。これらの二つ
の可能性の違いを明確にするために、塩基性線維芽細胞
成長因子（ｂＦＧＦ）を含有するマトリゲルの移植によ
り、皮下血管新生の病巣を誘導した。(PassanitiA，et
al.，A simple，quantitative method for assessing a
ngiogenesis andanti-angiogenic agent using reconst
ituted basement membrane，heparin and fibroblast g
rwoth factor．Lab.Invest．67:519,1992) ヘパリン存在下、２５または５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ
を含有するマトリゲル（基底膜タンパク質の抽出物）
を、正常なマウスおよび腫瘍を宿すマウス（ＬＬＣ−Ｌ
ｏｗ）の腹面に皮下注射した。４日後にマウスを屠殺
し、ゲル中のヘモグロビン濃度を測定して血管新生を定
量した。マトリゲルに入った新しい血管数がヘモグロビ
ン濃度に相関することは、以前に証明されている。(Fol
kman J.，Angiogenesis and its inhibitiors in "Imor
tant Advances in Oncology 1985" ，VT DeVita，S．He
llman and S．Rosenberg，editors，J.B．Lippincott，
Philadelphia 1985)組織学的調査のために、他にいくつ
かのゲルを用意した。正常マウスでは、５０ｎｇ／ｍｌ
のｂＦＧＦを含有するマトリゲル沈殿物は、完全な赤色
である。これは、新たな毛細血管が濃密に広がり、２．
４ｇ／ｄｌのヘモグロビンを含んだ。ｂＦＧＦを含まな
いマトリゲルは、透明の灰色で、ヘモグロビン含有量は
わずか０．４ｇ／ｄｌである（６倍の差）。これに対し
て、一次腫瘍を有するマウスから得たマトリゲルには、
０．５ｇ／ｄｌのヘモグロビンしか含まれなかった（図
６）。 この実験におけるほぼ完全な血管新生の阻害
は、ルイスラット肺の一次腫瘍の存在は、ｂＦＧＦの誘
導する血管新生を直接阻害することを示唆する。
【０１０１】
【実施例７】一次腫瘍を除去した動物への、腫瘍を宿す
動物から得た血清の導入は、転移を抑制する。マウスに
ルイスラット肺癌を上記のように移植した。１５日後、
腫瘍の大きさが約１，５００ｍｍ3の時、マウスを無作
為に４つのグループに分けた。３つのグループでは、一
次腫瘍を外科的に完全に切除した；一つのグループでは
（偽手術手順を行った後）腫瘍をそのまま残した。３つ
の切除グループのマウスは、その後、毎日、生理食塩
水、正常で腫瘍を宿さないマウスから得た血清、または
１，５００ｍｍ3 のルイスラット肺癌を宿すマウスから
得た血清の腹腔内注射を受けた。腫瘍をそのまま残した
マウスのグループは、生理食塩水の腹腔内注射を受け
た。全てのマウスは、２１日間処置後、安楽死させ、肺
転移巣を計数した（表２）。
【表２】 結果は、肺重量で確認された。ふたつのグループ間の差
はｐ＝＜０．０００１「（５５と５０）対（７と
３）」。同様の結果は、腫瘍を宿す動物の尿中のアンジ
オスタチンを使用して得られている。
【０１０２】
【実施例８】ウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞アッセイ ＢＣＥ細胞は、９継代から14継代の間のもののみ使用さ
れる。０日目に、ＢＣＥ細胞をゼラチンを入れた（ＰＢ
Ｓ中１．５％ゼラチン、摂氏３７度、１０％ＣＯ 2で２
４時間後、０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄）２４ウエルプレ
ートに、１２，５００細胞／ウエルの濃度で撒く。細胞
数の計数には、ヘモサイトメーターを使用する。１０％
の加熱不活性化（摂氏５６度、２０分間）子ウシ血清と
１％グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇ
ＰＳ）を含有する５００μｌのＤＭＥＭ中に懸濁した細
胞をプレートに撒く。
【０１０３】ＢＣＥ細胞に、以下のチャレンジを行う：
培養液を除去し、２５０μｌのＤＭＥＭ／５％ＢＣＳ／
１％ＧＰＳに置き換える。次にテストするサンプルをウ
エルに入れる。（量は、テストするサンプルによって異
なる）プレートを摂氏３７度／１０％ＣＯ2に約１０分
置く。２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む２５０μｌのＤＭ
ＥＭ／５％ＢＣＳ／１％ＧＰＳを各ウエルに添加する。
最終的な培養液は、１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む５０
０μｌのＤＭＥＭ／５％ＢＣＳ／１％ＧＰＳとなる。プ
レートを摂氏３７度／１０％ＣＯ2インキュベータに戻
し、７２時間置く。４日目に、培養液を除去して、その
後すべてのウエルを２から３分間トリプシン消化して
（０．５ｍｌ、トリプシン／ＥＤＴＡ）細胞を計数す
る。懸濁した細胞を９．５ｍｌのヘミトールを入れたシ
ンチレーションバイアルに移し、コールターカウンター
を使用して計数する。１活性単位とは、内皮細胞をｂＦ
ＧＦ１ｎｇ／ｍｌ中で７２時間インキュベートした場合
に、毛細血管内皮増殖の最大限の半分の阻害の効果を与
えるアンジオスタチンを含有する血清量である。
【０１０４】
【実施例９】低転移性のルイスラット肺腫瘍（ＬＬＣ−
Ｌｏｗ）を宿すマウスから得た血清は、インビトロにお
ける毛細血管内皮細胞増殖を阻害する。７２時間増殖ア
ッセイにおいて、ウシ毛細血管内皮細胞は、塩基性線維
芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ１ｎｇ／ｍｌ）により刺激を
受けた。腫瘍を宿すマウスから得た血清をこれらの培養
物に添加すると、用量依存および可逆的に内皮細胞の成
長を阻害した。正常血清は阻害性がなかった（図７）。
内皮細胞の増殖は、腫瘍を宿すｎｕ／ｎｕマウスおよび
ＳＣＩＤマウスから得られた血清によっても同様に（対
照と比較して）阻害された。一次腫瘍を除去すると、３
〜５日目までにアンジオスタチン活性は血清から消失し
た。
【０１０５】腫瘍を宿す動物の血清はまた、ウシ動脈内
皮細胞および自然発生性マウスの血管内皮腫由来の内皮
細胞を阻害した(Obeso，et al.，”Methods in Laborat
oryInvestigation，A Hemangioendothelioma-derived c
ell line; Its use as a Mod el for the Study of End
othelial Cell Biology,”Lab．Invest.，63(2)，pgs 2
59-269，1990)が、ルイスラット肺腫瘍細胞、３Ｔ３線
維芽細胞、動脈平滑筋細胞、ミンク肺上皮、またはＷ１
３８ヒト胎児肺線維芽細胞は阻害しなかった。
【０１０６】
【実施例１０】転移を阻害しないルイスラット肺腫瘍
（ＬＬＣ−Ｈｉｇｈ）を宿すマウスの血清は、インビト
ロにおける毛細血管内皮細胞の増殖を阻害しない。ＬＬ
Ｃ−Ｈｉｇｈの一次腫瘍を宿すマウスの血清は、対照に
比較して、ｂＦＧＦの刺激するウシ毛細血管内皮細胞の
増殖を有意に阻害しなかった。また、この血清は、精製
の始めの二段階（ヘパリン−セファロースクロマトグラ
フィーおよびゲル濾過）終了後には、どの画分にもアン
ジオスタチン活性が見られなくなる。
【０１０７】
【実施例１１】ルイスラット肺癌（低転移性）から得た
腹水もアンジオスタチン血清を産生する。ＬＬＣ−Ｌｏ
ｗまたはＬＬＣ−Ｈｉｇｈ腫瘍細胞（１０6）のいすれ
かをマウスの腹腔内に注入すると、１週間後、１０〜２
０匹のマウスのそれぞれより、１〜２ｍｌの血液の混じ
った腹水が得られた。腸間腫瘍の幡種が見られた。次い
でマウスを安楽死させた。心臓穿刺により血清を得た。
対照として、正常の、腫瘍を宿さないマウスから血清を
得た。血清と腹水は遠心分離により、細胞を除去し、上
清をｂＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）で刺激されたウシ毛細血
管内皮細胞刺激においてアッセイした（実施例８を参
照）。双方のタイプの腫瘍から得た腹水は、７２時間後
において対照に比較して、毛細血管内皮細胞の増殖を有
意に刺激した（たとえば、１００％増殖）（図８）。反
対に、低転移性マウスから得た血清は、内皮細胞増殖を
阻害した（対照の７９％に抑制）。高転移の細胞系から
得た血清は、２００％の刺激をした。
【０１０８】これらのデータは、低転移の細胞系の腹水
には、アンジオスタチンを凌駕する優勢な内皮成長刺激
因子が含まれること示す。この条件は、固形一次腫瘍に
類似している。さらに、刺激活性に打ち消されている
が、血清中にアンジオスタチン活性が現れている。この
パターンは、固形一次腫瘍（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）と同様で
ある。高転移性の腫瘍（ＬＬＣ−Ｈｉｇｈ）から得た腹
水は、また、優勢な内皮細胞刺激因子を含むが、血清中
にアンジオスタチンは確認されない。
【０１０９】
【実施例１２】カラムクロマトグラフィーによる血清か
らのアンジオスタチンの分画と成長阻害画分のＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる分析 アンジオスタチンを精製するために、腫瘍を宿すマウス
の血清をプールした。上記のインビトロ阻害因子活性ア
ッセイにより検定された阻害活性を、ヘパリン−セファ
ロース、バイオゲルＡ０．５ｍｍアガロースゲル、およ
び数サイクルのＣ４逆相高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）を使用して、連続的にクロマトグラフ化し
た。内皮阻害活性を有するＨＰＬＣ画分のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥは、見かけ上還元された３８，０００ダルトンの分
子量の明確なバンドを示し、これは約２Ｘ１０7の比活
性にまで、およそ１００万倍（表３参照）精製された。
精製の各段階で、プールされた画分を、既知の内皮阻害
物質存在について特異的な抗体を使用して検査した。粗
製または精製画分中に、血小板因子第４因子、トロンボ
スポジンまたは腫瘍増殖因子β（ＴＧＦβ）は検出され
なかった。
【０１１０】
【表３】 *１活性単位とは、内皮細胞をｂＦＧＦ１ｎｇ／ｍｌ中
で７２時間インキュベ ートした場合に、毛細血管内皮
増殖の最大限の半分の阻害効果を与えるアンジオスタチ
ンを含有する血清量である。
【０１１１】
【実施例１３】カラムクロマトグラフィーによる尿から
のアンジオスタチンの分画と成長阻害画分のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによる分析 血清からの内皮細胞阻害物質の精製は、各マウス得られ
る少量の血清または、血清中の大量のタンパク質によ
り、妨害される。腫瘍を宿すマウスから得た尿が分析さ
れ、これに、腫瘍を持たないマウスおよびＬＬＣ−Ｈｉ
ｇｈ腫瘍を宿すマウスの尿中には存在しない内皮細胞増
殖の阻害物質が含有されることが判明した。この内皮細
胞阻害活性の精製は、血清の精製に使用されたと同じ方
法で行われた（上記参照）（図９）。図９は、腫瘍を宿
す動物の粗製血清または尿のＣ４逆相クロマトグラフィ
ーを示す。全ての画分は、実施例８に記載される通り、
ｂＦＧＦを添加したウシ毛細 血管内皮細胞において７
２時間増殖アッセイで検定された。いすれの場合も、明
確な阻害ピークが、３０から３５％アセトニトリルで画
分２３に溶出するのが観察された。腫瘍を宿す動物の血
清の、３サイクル目のＣ４逆相クロマトグラフィーから
得た阻害活性を有する画分のＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動は、およそ３８，０００ダルトンの位置に
一本のバンドを示した。
【０１１２】
【実施例１４】血中のアンジオスタチンの分析 実施例９に記載の方法に従って内皮阻害作用がアッセイ
された。アンジオスタチンは、シンクロパック(Synchro
pak)ＨＰＬＣ Ｃ４カラムで単離された。（シンクロム
社、ラファィエット、インディアナ州）阻害物質は、３
０から３５％のアセトニトリル勾配において溶出され
た。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＰＡＧＥ）の還元条件のゲル（ｂ−メルカプト
エタノール（５％ｖ／ｖ）において、活性を有するタン
パク質バンドは３８キロダルトンの位置に溶出された。
非還元条件においては、活性を有するタンパク質バンド
は２８キロダルトンの位置に溶出された。最初のサンプ
ルが尿または血清から単離されたもののどちらであって
も、活性は同じポイントに検出された。他のバンドには
活性は検出されなかった。
【０１１３】このバンドに含まれる活性は、加熱（摂氏
１００度、１０分間）または、トリプシン処理で消失し
た。活性を有するバンドを、水／クロロホルム混合液
（１：１）で抽出した場合、水相のみに活性が検出され
た。
【０１１４】
【実施例１５】ヒトプラスミノーゲン由来の阻害作用の
あるフラグメントの精製 プラスミノーゲンリジン結合サイトＩは、シグマ化学株
式会社より入手した。この調製物は、エラスターゼで消
化したヒトプラスミノーゲンの精製物である。この方法
で得たリジン結合サイトＩは、プラスミンＡ鎖（クリン
グル１＋２＋３）中の少なくとも始めの３つのトリプル
ループ構造（番号１から３）を凝集体の状態で含有する
タンパク質の集まりである。(Sotrrup Jensen,L.，et a
l.，in Progress in Chemical Fibrinolysis and Throm
bolysis，Vol.3，191，Davidson,J.F.，et al.，eds．R
aven Press，New York 1978およびWiman，B.，et al.，
Biochemica et Biophysica Acta，579，142(1979))。プ
ラスミノーゲンリジン結合サイトＩ（シグマ化学株式会
社、セントルイス、ミズリー州）は、水中に再懸濁し、
ＨＰＬＣグレードの水／０．１％ＴＦＡで事前に平衡化
したＣ４逆相カラムに添加された。カラムを水／０．１
％ＴＦＡからアセトニトリル／０．１％ＴＦＡまでの勾
配で溶出し、画分をポリプロピレン製試験管で回収し
た。各画分の一部をスピードパックで蒸発させ、水中に
再懸濁し、増殖アッセイにおいてＢＣＥｓに添加した。
阻害活性のある画分について、溶出用の同様の勾配を用
いて、この手順を２回繰り返した。阻害活性は、最終の
Ｃ４カラム精製においおて３０〜３５％アセトニトリル
において溶出された。阻害活性のある画分のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥでは、見かけの還元分子量が４０、４２．５、４
５キロダルトンの３つの明瞭なバンドが示された。非還
元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、３０、３２．５、３５
キロダルトンの分子量の３本のバンドが出現した。
【０１１５】
【実施例１６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥからの阻害活性の抽出 ヒトプラスミノーゲン由来の精製物から得た阻害活性を
有する精製画分を、非変性条件下においてＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分析した。隣のレーンでは同じサンプルを泳動さ
せて銀染色を施しておき、そのバンドに相当する部分の
ゲルを切り出し、ポリプロピレン製試験管に入れて、１
ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中、摂氏４度、１２時間イ
ンキュベートした。上清を除去し、生理食塩水中で６時
間の透析を２回（ＭＷＣＯ＝６−８０００）、蒸留水中
で６時間の透析を２回行った。透析物は、真空遠心分離
にて乾燥させた。生成物は生理食塩水中に再懸濁し、１
ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽成長因子の刺激を与えたウシ
毛細血管内皮細胞に添加して７２時間アッセイをおこな
った。３つのバンドのそれぞれから抽出されたタンパク
質は、毛細血管内皮細胞を阻害した。
【０１１６】
【実施例１７】プラスミノーゲンフラグメント治療の研
究 マウスにルイスラット肺癌を移植し、腫瘍が１，５００
〜２，０００ｍｍ3になった時に切除する。手術の日
に、マウスを６匹づつ、６つのグループに無作為に割り
振った。マウスには、ヒトプラスミノーゲンの３種類の
精製された阻害活性のあるフラグメント、完全なヒトプ
ラスミノーゲン、腫瘍を宿す動物の尿、正常マウスの
尿、または生理食塩水のいずれかを毎日腹腔内注入し
た。偽手術のみを行った腫瘍を宿すマウスの１グループ
には、生理食塩水の注射をおこなった。一次腫瘍の切除
直後、ローディング投与として、２４μｇ（１．２ｍｇ
／ｋｇ／日／マウス）の阻害活性を有するプラスミノー
ゲンフラグメントをマウスに腹腔内注入した。その後、
実験期間を通して、毎日１２μｇ（０．６ｍｇ／ｋｇ／
日／マウス）の阻害活性を有するフラグメントをマウス
に腹腔内注入した。対照マウスには、腫瘍の切除後、同
じ用量の完全なプラスミノーゲン分子を投与した。尿投
与用には、正常または腫瘍を宿すマウスの尿を濾過、十
分に透析、凍結乾燥、そして滅菌水に再懸濁して２５０
倍の濃縮液を作成した。一次腫瘍の切除の日にローディ
ング投与として、腫瘍を宿すマウスまたは正常マウスか
ら得た透析尿濃縮液、０．８ｍｌを２回の腹腔内注射と
してマウスに投与した。その後実験の期間中、透析濃縮
尿０．４ｍｌを毎日マウスに腹腔内注入した。処置は１
３日間おこない、１３日目に全てのマウスを屠殺して剖
検した。
【０１１７】実験の結果は、図１０と１１に示す。図１
０は、１３日間の処置後の表面肺転移巣を示す。表面肺
転移巣とは、剖検時においてマウスの肺に観察された転
移巣の数を指す。立体顕微鏡を使用して転移巣を計数し
た。図１０は、実際に計数された表面肺転移巣の平均値
と標準誤差を示す。図示されるように、一次腫瘍を有す
るマウスのグループでは転移は見られなかった。一次腫
瘍を切除し、生理食塩水による処置を受けたマウスでは
広範な転移が見られた。ヒト由来のプラスミノーゲンフ
ラグメントによる処置を行ったマウスでは転移は見られ
なかった。完全なプラスミノーゲン分子による処置を行
ったマウスでは、広範な転移が見られ、完全なプラスミ
ノーゲン分子には内皮阻害活性がないことを示した。腫
瘍を宿すマウスから得た透析および濃縮した尿による処
置をおこなったマウスでは、転移はなかった。正常マウ
スの尿の濃縮液で処置したマウスでは広範な転移が見ら
れた。肺重量の測定でも同様の結果が得られた（図１
１）。
【０１１８】
【実施例１８】マウスおよびヒトアンジオスタチンのア
ミノ酸配列 マウス尿から単離されたアンジオスタチンおよびヒトの
リジン結合サイトＩフラグメント調製物から単離された
アンジオスタチンのアミノ酸配列を、アプライドバイオ
システムモデル４７７Ａタンパク質シークエンサーを使
用して決定した。フェニルチオヒダントインアミノ酸画
分を、ラインに接続したＡＢＩモデル１２０Ａ ＨＰＬ
Ｃによって同定した。Ｎ末端配列から決定したアミノ酸
配列、およびマウスおよびヒトのアンジオスタチンのト
リプシン消化の結果から、アンジオスタチンのアミノ酸
配列は、マウスのプラスミノーゲンの９８番目のアミノ
酸から始まる配列に類似していることが示唆される。こ
のように、アンジオスタチンのアミノ酸配列は、還元ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で決定されるように約３
８キロダルトンから４５キロダルトンの分子量を有する
タンパク質から成り、マウスの完全なプラスミノーゲン
分子の９８番目のアミノ酸から始まるマウスのプラスミ
ノーゲンフラグメントと実質的に同様のアミノ酸配列を
有する分子である。マウスアンジオスタチンの始めのア
ミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を、図１に示す。
アミノ酸配列の長さは、図１に示されるものよりも少し
長いまたは短い可能性もある。
【０１１９】ヒトのリジン結合サイトＩの活性画分のＮ
末端アミノ酸分析およびトリプシン消化（実施例１５参
照）の結果は、この画分の配列が、ヒトのプラスミノー
ゲンのおよそ９７または９９番目のアミノ酸から開始し
ていること、およびヒトのアンジオスタチンとマウスの
アンジオスタチンに相同性があることを示している。ヒ
トのアンジオスタチンの始めのアミノ酸配列（アミノ酸
９８から開始）を図２〜４に示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
３）。図２〜４において、マウスとヒトのアンジオスタ
チンのアミノ酸配列を、ブタ、ウシ、アカゲザルといっ
た他の種のプラスミノーゲン内のアミノ酸配列の相当す
る部分と比較しているが、これはこれらの種においてア
ンジオスタチンが存在することを示すものである。
【０１２０】
【実施例１９】大腸菌内におけるヒトのアンジオスタチ
ンの発現 大腸菌内における真核生物の遺伝子の翻訳の有効性を高
めるために、ｐＴｒｃＨｉｓＡベクター（インビトロゲ
ン社製）（図１２）を使用して、ｔｒｃプロモーターか
らの転写を高いレベルに調節した。金属との親和性を有
する樹脂を使用した一段階のみで精製するためにＮ末端
にニッケルを結合したポリヒスチジンテイルを融合した
状態で、アンジオスタチンを発現させた。発現後、融合
タンパク質中のエンテロキナーゼ分解認識サイトを利用
して、精製した組み換えタンパク質からＮ末端ヒスチジ
ン融合タンパク質を除去できる。組み換えヒトアンジオ
スタチンタンパク質は、リジンと結合することが判明し
ており；クリングル領域１、２、および３に対して特異
的なモノクローナル抗体と交差反応性があり、インビト
ロにおいて、ｂＦＧＦの誘導する内皮細胞増殖を阻害す
る。
【０１２１】挿入片を作成するために、ヒトの肝臓ｍＲ
ＮＡから、ヒトのアンジオスタチンをコードする遺伝子
フラグメントを得、これを逆転写し、ポリメラーゼチェ
イン反応（ＰＣＲ）および特異的なプライマーを使用し
て増幅した。１１３１の塩基対からなる生成物は、ヒト
のプラスミノーゲンの９３番目から４７０番目のアミノ
酸をコードするものである。増幅したフラグメントは、
ｐＴｒｃＨｉｓＡのＸｈｏＩ／ＫｐｎＩサイト中にクロ
ーニングし、この構築物をＸＬ−１Ｂ（ストラタジーン
社にて入手可能）大腸菌宿主細胞中に導入した。プラス
ミドベクターｐＴｒｃＨｉｓＡのみを保有する対照クロ
ーンも同様にＸＬ−１Ｂ大腸菌宿主細胞に転換した。こ
のクローンを、ベクター対照クローンと呼ぶ。どちらの
クローンも、以下の記載の通り、同様に精製した。
【０１２２】発現コロニーは、以下のように選択した。
アンジオスタチンをコードする遺伝子で形質転換した大
腸菌のコロニーリフトをＩＰＴＧをしみ込ませたニトロ
セルロースフィルター上で生育させ、ＬＢ寒天培地に塗
布する。ＩＰＴＧで発現を誘導した後、コロニーをニト
ロセルロースフィルター上で溶解する。ニトロセルロー
スリフトをブロックし、濯いだ後、アンジオスタチンの
特異的なコンフォメーションを認識する２種類のモノク
ローナル抗体（ｍＡｂｓ ＤｃｄおよびＶａｐ；ノート
ルダム大学の S.G．McCance および F.J．Castellinoよ
り贈与）をプローブとして検索した。ｍＡｂｓが認識す
る発現の強いコロニーを選択した。最大の発現を得られ
る最適時間を確認するために、ＩＰＴＧ誘導の前後の様
々な時間に細胞を集め、繰り返し凍結−融解サイクルを
行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティング、ｍＡ
ｂｓ ＤｃｄおよびＶａｐプローブ検索により分析し
た。
【０１２３】これらの結果、ｐＴｒｃＨｉｓＡ／ＨＡｓ
Ｈ４クローンが選択された。ＩＰＴＧ誘導を４時間行っ
た後、沈殿させた細胞を回収し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐ
Ｈ 8.0、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール、２００
ｍｇ／ｍｌリゾチーム中に懸濁して３０分間、摂氏４度
において撹拌した。この泥状液体を１４，０００ｒｐ
ｍ、２５分間遠心分離し、沈殿物を５０ｍＭＴｒｉｓ
ｐＨ８．０、２ｍＭＥ ＤＴＡ、５％グリセロールおよ
び０．１％ＤＯＣ中に再懸濁した。この懸濁液を１時
間、摂氏４度で撹拌し、１４，０００ｒｐｍで２５分間
遠心分離した。この段階での上清画分には、発現された
アンジオスタチンが含まれる。大腸菌の発現するヒトア
ンジオスタチンは、元のアンジオスタチンの物理特性、
すなわちリジンに結合するという特性を有することが判
明した。したがって、一段階で、リジン−セファロース
カラム（ファルマシア社またはシグマ社製）を使用し
て、大腸菌の発現したアンジオスタチンを精製した。ア
ンジオスタチンのカラムからの溶出には、０．２Ｍイプ
シロン−アミノ-n-カプロン酸、ｐＨ７．５を用いた。
【０１２４】これらの実験に続いて、規模を拡大して１
０リットルのｐＴｒｃＨｉｓＡ／ＨＡｓＨ４クローンを
バッチ発酵した。この拡大規模の誘導で得られた細胞を
沈殿させ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５中に懸濁さ
せ、中間段階は摂氏１０度に冷却しながら１０，０００
ｐｓｉで３回破砕した。得られたライゼートを、１０，
０００ｒｐｍ、３０分間、摂氏４度において遠心分離し
て浄化し、リジン−セファロースカラムで発現されたア
ンジオスタチンを単離した（図１３）。
【０１２５】大腸菌が発現したヒトアンジオスタチン精
製物を、水中でよく透析し、凍結乾燥した。発現された
ヒトアンジオスタチンは、培養液中（ＤＭＥＭ、５％Ｂ
ＣＳ、１％ゲンタマイシン／ペニシリン／ストレプトマ
イシン）に３μｇ／ｍｌの濃度で再懸濁し、実施例８、
３９ページに記載されるように、インビトロにおけるウ
シ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞アッセイに使用した。同
様に、ベクターのみを含有する対照クローンも、ｐＴｒ
ｃＨｉｓＡ／ＨＡｓＨ４クローンと同じ方法で処理し
た。これは、全く同様にＩＰＴＧで誘導し、細菌ライゼ
ートを使用してリジンを結合し、０．２Ｍアミノカプロ
ン酸で溶出し、十分に透析して凍結させた。この対照の
調製物も、３μｇ／ｍｌの同じ濃度で培地中に再懸濁し
た。組み換えアンジオスタチンサンプルと対照は、それ
ぞれ異なる誘導および発酵バッチ、別個の精製過程で得
たもので、双方ともメリーランドのエンターメド社(Ent
reMed)において作成された。ＢＣＥアッセイは、これら
のコードされたサンプルを使用して、盲検方法でボスト
ンの子供病院(Childre's Hospital)で実施された。組み
換えヒトアンジオスタチンのＢＣＥアッセイの結果によ
り、大腸菌で発現したヒトアンジオスタチンが、ｂＦＧ
Ｆ（１ｎｇ／ｍｌの濃度で使用）によるＢＣＥ細胞の増
殖を阻害することが示された（図１４）。培養液中に懸
濁した（約３μｇ／ｍｌの濃度）組み換えアミノ酸保存
液は、１：５、１：１０、１：２０に希釈して使用し
た。パーセント阻害は、以下にしたがって計算した。
【０１２６】
【数１】 ＢＣＥ細胞増殖のパーセント阻害は、同じ濃度のプラス
ミノーゲン由来のアンジオスタチンによる値と同等かそ
れ以上であった。再度実施したＢＣＥアッセイの結果を
図１５に示したが、ここでは１：５に希釈した保存液を
使用し、組み換えアンジオスタチンは、プラスミノーゲ
ン由来のアンジオスタチンと同程度のパーセント阻害を
示した。図１５は、ヒト組み換えアンジオスタチンタン
パク質は、細胞培養において、ＢＣＥの増殖を６０％以
上、さらに７５％以上も阻害するという驚嘆すべき結果
を示す。
【０１２７】
【実施例２０】アンジオスタチンは、アポトーシス（細
胞自滅）速度を増大させることにより、微小転移を休止
状態に維持する。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスにルイスラッ
ト肺癌細胞（１ｘ１０6）を皮下接種後、大きさ約１．
５ｃｍ3の一次腫瘍が出現した。一次腫瘍の外科的切除
または、偽手術をマウスに施した。手術後５、１０、お
よび１５日目にマウスを屠殺し、肺の組織学的検査を行
った。一次腫瘍を切除したマウスでは、偽手術をおこな
った対照と比較して、かなり増大した転移巣が見られた
（図１６）。転移巣の増大とともに肺重量が有意に増大
していた。
【０１２８】臭化デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り
込みにより測定される、腫瘍細胞増殖の分析では、５、
９、および１３日目において、一次腫瘍をそのままにし
たマウスと切除したマウス間に差はなく、腫瘍塊の増大
は増殖の促進により説明できないことを示した（図１
６）。したがって、これらのマウスにおいて細胞の死滅
について検討した。遺伝子発現における変化に依存する
細胞の死滅の過程で、発生および小腸などの組織におけ
る迅速な増殖組織における細胞の消滅を説明する、アポ
トーシスを、ターミナルデオキヌクレオチジルトランス
フェラーゼ（ＴｄＴ）技術を使用した免疫組織科学的に
標識したＤＮＡフラグメントを使用して調査した。アポ
トーシス指標は、各屠殺時に測定した。一次腫瘍の切除
は、調査した全ての時点において、統計的に有意にアポ
トーシス指標を増大（約３から４倍）させる原因となっ
た（図１７）。
【０１２９】一次腫瘍を切除したマウスに外因性の血管
新生抑制物質を投与することで、これを裏付ける証拠が
得られた。この物質ＴＮＰ−１４７０（以前にＡＧＭ−
１４７０と命名されたＯ−クロロアセチルカルバモイル
フマギロール）は、抗血管新生活性が報告されているフ
マギリンのアナログである。ＴＮＰ−１４７０の皮下投
与（３０ｍｇ／ｋｇ、二日毎）により、上記の一次腫瘍
をそのまま残したラットで得たのと非常に類似した結果
を得た。これらの動物では、生理食塩水を注射した対照
ラットと比較して、肺重量が小さく、増殖指標は同等、
アポトーシス指標は増大していた（図１８）。
【０１３０】これらのデータは、腫瘍細胞の増殖と細胞
の死滅の速度が均衡状態にある間は、転移は休止状態に
あることを示している。おそらく、腫瘍細胞中のアポト
ーシスを増加させることにより転移巣の成長をコントロ
ールしている血管新生阻害物質が排除されることが原因
で、一次腫瘍を切除すると転移巣の成長が急速に増大す
る。これらの作用は、一次腫瘍の切除と外因性の血管新
生阻害剤の投与に引き続いて観察されるものと類似して
いる。総合して考えると、これらのデータは、一次腫瘍
が微小転移巣を休止させるアンジオスタチンを放出して
いることを示唆するものである。
【０１３１】
【実施例２１】インビボにおけるアンジオスタチンによ
る一次腫瘍の治療 アンジオスタチンは、上記の実施例１５に記載されるよ
うに、ヒトのプラスミノーゲンを制限的にエラスターゼ
消化して精製した。アンジオスタチンをリン酸緩衝生理
食塩水中に再懸濁して、６週齢オスＣ５７ＢＩ６／Ｊマ
ウスに投与した。ルイスラット肺癌もしくはＴ２４１線
維芽肉腫細胞のいずれか１ｘ１０6個をマウスの皮下に
移植した。４日後、腫瘍の大きさは８０〜１６０ｍｍ3
の時にアンジオスタチンによる治療を開始した。アンジ
オスタチンの４０ｍｇ／ｋｇの単回投与、または８０ｍ
ｇ／ｋｇの２回投与を、腹腔内（ｉｐ）または皮下（ｓ
ｃ）注射でおこなった。治療を１９日間継続した後、マ
ウスは各時点で屠殺された。
【０１３２】１日用量４０ｍｇ／ｋｇをｉｐ投与した場
合のアンジオスタチンは、Ｔ２４１一次腫瘍の成長を非
常に強く阻害した（図１９）。この成長阻害作用は、２
日以内に肉眼で確認できる程度になり、実験の期間中、
度合いが強くなっていった。１８日目には、アンジオス
タチン投与マウスの腫瘍の容量は、生理食塩水を注射し
た対照マウスの腫瘍のおよそ３８％となった。この差
は、統計的に有意である。（ｐ＜０．００１、スチュデ
ントのｔ検定）。
【０１３３】アンジオスタチン投与（１日用量８０ｍｇ
／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与または皮下投与で
１日２回投与）も、ＬＬＣ−ＬＭ一次腫瘍の成長速度を
有意に低下させた（図１９）。この阻害作用は、４日目
に確認され、以後、調査した時点全てにおいて程度が増
大していった。実験の最終日（１９日）には、アンジオ
スタチン投与マウスの平均腫瘍容積は、生理食塩水を投
与した対照のわずか２０％であり、有意な差があった
（ｐ＜０．００１、スチュデントのｔ検定）。別の実験
では、Ｔ２４１線維肉腫、ルイスラット肺癌（ＬＭ）、
または細網肉腫を移植したマウスにアンジオスタチン
（５０ｍｇ／ｋｇ ｑ１２ｈ）を投与した。各タイプの
腫瘍細胞において、アンジオスタチンを投与したマウス
では、腫瘍がかなり小さくなった。図２１は、Ｔ２４１
線維肉腫について、２４日目のアンジオスタチン投与マ
ウスの平均腫瘍容積は、非投与マウスのわずか１５％で
あったことを示す。図２２は、ルイスラット肺癌（Ｌ
Ｍ）について、２４日目のアンジオスタチン投与マウス
の平均腫瘍容積は、非投与マウスのわずか１３％であっ
たことを示す。図２３は、細網肉腫について、２４日目
のアンジオスタチン投与マウスの平均腫瘍容積は、非投
与マウスのわずか１９％であったことを示す。掲載のデ
ータは、各時点における４匹のマウスの平均値である。
これらの結果は、アンジオスタチンが、インビボにおい
て異なる３種類の一次腫瘍の非常に強力な阻害物質であ
ることを示す。
【０１３４】
【実施例２２】インビボにおけるマウス中のヒトの細胞
由来の一次腫瘍のアンジオスタチンによる治療 ２種類のヒトの腫瘍細胞系、ヒトの前立腺癌ＰＣ−３と
ヒトの乳癌ＭＤＡ−ＭＢ、に対するアンジオスタチンの
作用を調べた。免疫不全ＳＣＩＤマウスにヒトの腫瘍細
胞を移植し、実施例２１に記載のように、マウスに５０
ｍｇ／ｋｇのアンジオスタチンを基本的に１２時間毎に
投与した。その結果、本発明のアンジオスタチンタンパ
ク質が、ヒトの腫瘍細胞の成長を強力に阻害することが
示された。図２４は、ヒトの前立腺癌ＰＣ−３に関し、
２４日目において、アンジオスタチンを投与したマウス
の平均腫瘍容積は、投与をおこなわない対照マウスのわ
ずか２％であることを示している。図２５は、ヒトの乳
癌ＭＤＡ−ＭＢに関するもので、２４日目において、ア
ンジオスタチンを投与したマウスの平均腫瘍容積は、投
与をおこなわない対照マウスのわずか８％であることを
示している。
【０１３５】
【実施例２３】遺伝子治療−アンジオスタチン遺伝子導
入の腫瘍の容積に対する効果 マウスのプラスミノーゲンアミノ酸１から４６０をコー
ドする、マウスのプラスミノーゲンｃＤＮＡ（American
Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）より入手）に由
来する、アンジオスタチンをコードする１３８０塩基対
のＤＮＡ配列を、ＰＣＲを使用して作成し、発現ベクタ
ーに導入した。この発現ベクターをＴ２４１線維肉腫細
胞に導入し、ＤＮＡ導入細胞をマウスに移植した。対照
マウスには、非ＤＮＡ導入Ｔ２４１または、ベクターの
みを導入したＴ２４１（すなわち、アンジオスタチンを
発現しない感染細胞）を移植した。３種類のアンジオス
タチン発現ＤＮＡ導入細胞のクローンを、実験で使用し
た。平均腫瘍容積を、時間につれて測定した。その結
果、ＤＮＡを導入しない、および非発現対照細胞に比較
して、アンジオスタチン発現細胞クローンのマウスにお
いて平均腫瘍容積の驚異的かつ劇的な低下が示された。
【０１３６】マウスアンジオスタチンタンパク質をコー
ドするマウスＤＮＡ配列は、マウスのプラスミノーゲン
ｃＤＮＡに由来する。マウスのアンジオスタチンには、
マウスのプラスミノーゲンクリングル領域１〜４が含ま
れる。このクローンの構築の概略図を図２６に示す。
【０１３７】マウスのアンジオスタチンタンパク質クロ
ーンを、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTMトランスフェクション
システム（ライフテクノロジーズ社、ゲティスバーグ、
ＭＤにて入手可能）を使用して、Ｔ２４１線維肉腫細胞
に導入した。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTM試薬は、メンブラ
ン濾過した水中の、カチオン脂質N-[1-(2,3 ジオレイロ
キシ)プロピル]-n,n,n-トリメチルアンモニウムクロラ
イド(DOTMA)およびジオレコイルホスファチジルエタノ
ールアミン(DOPE)の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤で
ある。
【０１３８】細胞の一過性のトランスフェクションのた
めの手順は以下の通りである： １．Ｔ２４１細胞を６０ｃｍ2の組織培養皿で成長さ
せ、血清を添加した適当な成長培地２ｍｌ中にシード＝
約（１−２×１０5）細胞を接種する。 ２．摂氏３７度で、ＣＯ2インキュベーター中で、細胞
が４０〜７０％培養血を満たすまで細胞をインキュベー
トする。通常１８から２４時間かかるが、所要時間は細
胞のタイプによって違う。Ｔ２４１腫瘍細胞の程度は約
７０％である。 ３．以下の溶液を１２ｘ７５ｍｍの滅菌試験管に準備す
る： 溶液Ａ：各トランスフェクション処理用に、５μ
ｇのＤＮＡを１００μｌの血 清を含まないＯＰＴＩ−
ＭＥＭ Ｉリデュースド血清培地(Reduced Serum Mediu
m:ライフテクノロジーズ社より入手可能)中に希釈する
（組織培養等級の脱イオ ン水も使用できる）。溶液
Ｂ：各トランスフェクション処理用に、３０μｇのＬＩ
ＰＯＦＥＣＴＩＮを１００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地
で希釈する。 ４．２種類の溶液を混合し、穏やかに撹拌し、室温で１
０から１５分間インキュベートする。 ５．血清を含まない培地で２回細胞を洗浄する。 ６．各トランスフェクション処理用に、ＬＩＰＯＦＥＣ
ＴＩＮTM試薬−ＤＮＡ複合体を含有する各試験管に、
０．８ｍｌの血清を含まない培地を添加する。穏やかに
撹拌し、その複合体を細胞に載せる。 ７．ＣＯ2インキュベーター中、約１２時間、摂氏３７
度にて細胞をインキュベートする。 ８．ＤＮＡを含有する培地を、１ｍｇ／ｍｌ選択培地含
有血清で置き換え、細胞をＣＯ2インキュベーター中、
摂氏３７度にて、合計４８から７２時間インキュベート
する。 ９．トランスフェクションから４８から７２時間後、細
胞抽出物の遺伝子活性を検定する。
【０１３９】ＤＮＡ導入した細胞は、アンジオスタチン
特異的抗体を使用して、アンジオスタチンタンパク質の
発現について検定することができる。または、およそ１
０から１４日後、ＣＭＶ−アンジオスタチンを導入した
Ｔ２４１細胞中に、Ｇ４１８抵抗性コロニーが出現す
る。また、ベクターのみを導入したクローンの中にも、
多くのクローンが見られたが、導入をしなかったクロー
ンでは見られなかった。免疫蛍光法を使用して、Ｇ４１
８抵抗性クローンを、アンジオスタチン発現クローンと
して選択した。面白いことに、図２７および２８に示す
通りに、アンジオスタチンを導入したＴ２４１細胞とル
イスラット肺癌のインビトロにおける細胞増殖は阻害さ
れないか、または反対の作用を受ける。
【０１４０】図２９は、トランスフェクション実験の結
果を示す。アンジオスタチン発現Ｔ２４１導入クローン
は、３種類とも、平均腫瘍容積が対照マウスよりもずっ
と少なかった。クローン３７を移植したマウスの平均腫
瘍容積は、対照マウスのわずか１３％で、クローン３１
およびクローン２５では、それぞれ対照マウスの腫瘍容
積のわずか２１％と３４％であった。これらの結果は、
アンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列は、細胞中に
導入できること、導入されたＤＮＡ配列は、移植先の細
胞によってアンジオスタチンタンパク質を発現する能力
を有すること、発現されたアンジオスタチンはインビボ
で作用し、腫瘍の成長を低下させることを証明した。
【０１４１】
【実施例２４】インビボにおけるアンジオスタチン発現
部位の位置特定 インビボにおけるアンジオスタチンタンパク質の発現部
位を位置特定するために、ルイスラット肺癌細胞(マウ
ス)、Ｔ２４１線維芽肉腫（マウス）、およびバーキッ
トのリンパ腫細胞（ヒト）、腫瘍細胞から直接採取した
もの、または数継代後の細胞培養によるものなどの様々
な細胞タイプから得られた全ＲＮＡを分析してアンジオ
スタチン転写物の存在を確認した。サンプルをノーザン
分析した結果、マウスのプラスミノーゲンに相当する約
２．４ｋｂのシグナルがひとつ示された正常マウスの肝
臓ＲＮＡ以外のすべてのサンプルでは、ｔｈｎ配列との
シグナルハイブリダイゼーションがないことが判明し
た。ヒトのサンプルのノーザン分析の結果、ヒトのプラ
スミノーゲンに相当する約２．４ｋｂのシグナルがひと
つ示された正常ヒト肝臓ＲＮＡ以外では、ヒトのアンジ
オスタチン配列とのシグナルハイブリダイゼーションが
ないことが判明した。
【０１４２】逆転写ポリメラーゼチェイン反応（ＲＴ−
ＰＣＲ）分析の結果、正常マウス肝臓以外では、サンプ
ル中にマウスアンジオスタチン配列でプローブ検索され
る生成物がないことが判明した。逆転写ポリメラーゼチ
ェイン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析の結果、正常ヒト肝臓
サンプル以外では、全てのヒトから得たサンプル中に、
ヒトアンジオスタチン配列でプローブ検索される生成物
がないことが判明した（マウスでの予想サイズは１，０
５０ｂｐ、ヒトでは１，１３４ｂｐ）。このように、上
記の全てのマウスのサンプル中では、マウスアンジオス
タチン転写物（マウスのプラスミノーゲンのアミノ酸９
７から４５０と同一と考えられ る）が産生されず、上
記ヒトのサンプル中ではヒトアンジオスタチン転写物
（ヒトのプラスミノーゲンのアミノ酸９３から４７０と
同一と考えられる）を産生されないと考えられる。正常
なマウス／ヒトの肝臓で得られた陽性シグナルは、プラ
スミノーゲンとのハイブリダイゼーションのものであ
る。
【０１４３】
【実施例２５】酵母菌中におけるアンジオスタチンの発
現 ヒトのプラスミノーゲンのアミノ酸９３から４７０まで
をコードする遺伝子フラグメントを、酵母菌 Pichia pa
storis中のＰＨＯ１分泌シグナルを利用してタンパク質
の分泌発現を可能とする、ｐＨＩＬ−ＳＩ（インビトロ
ゲン社）のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩサイト中にクローニン
グした。同様に、ヒトのプラスミノーゲンのアミノ酸９
３から４７０までをコードする遺伝子フラグメントを、
酵母菌Pi chia pastoris 中のα因子分泌シグナルを利
用してタンパク質の分泌発現を可能とする、ｐＰＩＣ９
（インビトロｇｅｎ）中のＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩサイ
ト中にクローニングした。これらのシステムで発現され
たヒトアンジオスタチンタンパク質には、タンパク質プ
ロセッシング、タンパク質ホールディング（折りたた
み）、および糖化などの翻訳後の修飾など、大腸菌での
発現システムにはない多くの利点がある。
【０１４４】Pichia pastoris中での遺伝子の発現は以
下に記載される：Sreekrishna，K．et al.,(1988)High
level expression of heterologous proteins in methy
lotropic yeast Pichia pastoris．J．Basic Microbio
l．29(4): 265-278、およびClare，J.J．et at．(1991)
Production of epidermal growth factor in yeast：Hi
gh-level secretion using Pichia pastoris strains c
ontaining multiple gene copies，Gene 105:205-212、
どちらも本明細書に、先行技術として含めた。
【０１４５】
【実施例２６】遺伝子導入動物および植物におけるアン
ジオスタチンタンパク質の発現 アンジオスタチン遺伝子転写物を発現するウシまたはブ
タ科などの遺伝子導入動物を作成する。遺伝子導入動物
は、たとえば、これらの動物の乳中にアンジオスタチン
タンパク質を発現する。さらに、アンジオスタチン遺伝
子転写物を発現する食用の遺伝子導入植物を作成する。
外来ＤＮＡを発現する遺伝子導入動物の作成は、本明細
書に先行技術として含 めるSmith H．Phytochrome tran
sgenics: functional，ecological and biotech nical
applications，Semin．Cell．Biol．1994 5(5):315-32
5、に記載されている。
【０１４６】
【実施例２７】内皮細胞の増殖を阻害するアンジオスタ
チン断片の特徴 後述の実施例はアンジオスタチン断片の個々の、または
組合せの活性を特徴付けている。データは、個々のクリ
ングル構造間で機能的差異があることと、強力な抗内皮
細胞活性すなわち抗血管新生活性がこの様なアンジオス
タチンのタンパク質断片によって得られることを示唆し
ている。
【０１４７】ここで用いられている「アンジオスタチン
断片」という用語は、内皮細胞の増殖阻害活性を有する
アンジオスタチンあるいはプラスミノーゲンのタンパク
質誘導体を意味する。アンジオスタチン断片は、血管新
生が介在する疾患や状態の治療に有用である。たとえ
ば、アンジオスタチン断片は、腫瘍の成長の阻害あるい
は抑制のために用いることができる。このようなアンジ
オスタチン断片のアミノ酸配列は、実施例において特に
指示がないかぎり、マウスプラスミノーゲン（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ：１）、マウスアンジオスタチン（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ：２）、ヒトアンジオスタチン（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ：３）、アカゲザルアンジオスタ チン（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ：４）、ブタアンジオスタチン（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ ：５）およびウシアンジオスタチン（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ：６）の一部分から選択することができる。
【０１４８】ここで用いられているように”クリングル
１”は、内皮細胞阻害活性あるいは抗血管新生活性を有
し、以下のクリングル１に相同的なアミノ酸配列から成
り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘導体を意
味する。一例を挙げると、これらに限定されるものでは
ないが、実施例において特に指示がないかぎり、マウス
クリンゲル１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７）、ヒトクリング
ル１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８）、アカゲザルクリングル
１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９）、ブタクリングル１（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ：１０）、およびウシクリングル１（ＳＥ
Ｑ Ｉ Ｄ Ｎｏ：１１）がある。マウスクリングル１
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７）は、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１
のマウスプラスミノーゲンのアミノ酸配列１０３から１
８１番目（１０３と１８１番目を含めて）に相当し、Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２のマウスアンジオスタチンのアミノ
酸配列の６から８４番目（６と８４番目を含めて）に相
当する。ヒトクリングル１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８）、
アカゲザルクリングル１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９）、ブ
タクリングル１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０）、およびウ
シクリングル１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１）は、それぞ
れＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４、ＳＥ
Ｑ ＩＤＮｏ：５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６のアンジオス
タチンのアミノ酸配列の６から８４番目（６と８４番目
を含めて）に相当する。
【０１４９】ここで用いられているように”クリングル
２”は、内皮細胞阻害活性あるいは抗血管新生活性を有
し、以下のクリングル２に相同的なアミノ酸配列から成
り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘導体を意
味する。一例を挙げると、これらに限定されるものでは
ないが、実施例において特に指示がないかぎり、マウス
クリンゲル２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２）、ヒトクリン
グル２（ＳＥＱ Ｉ ＤＮｏ：１３）、アカゲザルクリン
グル２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１４）、ブタクリングル２
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１５）、およびウシクリングル２
（ＳＥＱ ＩＤＮｏ：１６）がある。マウスクリングル
２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：
１のマウスプラスミノーゲンのアミノ酸配列１８５から
２６２番目（１８５と２６２番目を含めて）に相当し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２のマウスアンジオスタチンのアミ
ノ酸配列の８８から１６５番目（８８と１６５番目を含
めて）に相当する。ヒトクリングル２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ：１３）、アカゲザルクリングル２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ：１４）、ブタクリングル２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１
５）、およびウシクリングル２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１
６）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３、ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ：４、ＳＥＱ ＩＤＮｏ：５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：
６のアンジオスタチンのアミノ酸配列の８８から１６５
番目（８８と１６５番目を含めて）に相当する。
【０１５０】ここで用いられているように”クリングル
３”は、内皮細胞阻害活性あるいは抗血管新生活性を有
し、以下のクリングル３に相同的なアミノ酸配列から成
り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘導体を意
味する。一例を挙げると、これらに限定されるものでは
ないが、実施例において特に指示がないかぎり、マウス
クリングル３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１７）、ヒトクリン
グル３（ＳＥＱ Ｉ ＤＮｏ：１８）、アカゲザルクリン
グル３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１９）、ブ タクリングル
３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２０）、およびウシクリングル
３（ＳＥ Ｑ ＩＤ Ｎｏ：２１）がある。マウスクリン
グル３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１ ７）は、ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ：１のマウスプラスミノーゲンのアミノ酸配列２７
５から３５２番目（２７５と３５２番目を含めて）に相
当し、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２のマウスアンジオスタチン
のアミノ酸配列の１７８から２５５番目（１７８と２５
５番目を含めて）に相当する。ヒトクリングル３（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ：１８）、アカゲザルクリングル３（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ：１９）、ブタクリン グル３（ＳＥＱＩ
Ｄ Ｎｏ：２０）、およびウシクリングル３（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ：２１）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４、ＳＥＱ ＩＤＮｏ：５、ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ：６のアンジオスタチンのアミノ酸配列の１
７８から２５５番目（１７８と２５５番目を含めて）に
相当する。
【０１５１】ここで用いられているように”クリングル
４”は、内皮細胞阻害活性あるいは抗血管新生活性を有
し、以下のクリングル４に相同的なアミノ酸配列から成
り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘導体を意
味する。一例を挙げると、これらに限定されるものでは
ないが、実施例において特に指示がないかぎり、マウス
クリングル４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２２）、ヒトクリン
グル４（ＳＥＱ ＩＤＮｏ：２３）がある。マウスクリ
ングル４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２２）は 、ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ：１のマウスプラスミノーゲンのアミノ酸配列３
７７から４５４番目（３７７と４５４番目を含めて）に
相当する。
【０１５２】ここで用いられているように”クリングル
２−３”は、内皮細胞阻害活性あるいは抗血管新生活性
を有し、以下のクリングル２−３に相同的なアミノ酸配
列から成り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘
導体を意味する。一例を挙げると、これらに限定される
ものではないが、実施例において特に指示がないかぎ
り、マウスクリングル２−３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２
４）、ヒトクリングル２−３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２
５）、アカゲザルクリングル２−３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ：２６）、ブタクリングル２−３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ：２７）、およびウシクリングル２−３（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ：２８）がある。マウスクリングル２−３（Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２４）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１のマ
ウスプラスミノーゲンのアミノ酸配列１８５から３５２
番目（１８５と３５２番目を含めて）に相当し、ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ：２のマウスアンジオスタチンのアミノ酸配
列の８８から２５５番目（８８と２５５番目を含めて）
に相当する。ヒトクリングル２−３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ：２５）、アカゲザルクリングル２−３（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ：２６）、ブタクリングル２−３（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ：２７ ）、およびウシクリングル２−３（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ：２８）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：
３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４、ＳＥＱ ＩＤＮｏ：５、Ｓ
ＥＱＩＤ Ｎｏ：６のアンジオスタチンのアミノ酸配列
の８８から２５５番目（８８と２５５番目を含めて）に
相当する。
【０１５３】ここで用いられているように”クリングル
１−３”は、内皮細胞阻害活性あるいは抗血管新生活性
を有し、以下のクリングル１−３に相同的なアミノ酸配
列から成り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘
導体を意味する。一例を挙げると、これらに限定される
ものではないが、実施例において特に指示がないかぎ
り、マウスクリングル１−３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２
９）、ヒトクリングル１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３０）、
アカゲザルクリングル１−３（ＳＥＱ ＩＤＮｏ：３
１）、ブタクリングル１−３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３
２）、およびウシクリングル１−３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ：３３）がある。マウスクリングル１−３（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ：２９）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１のマウス
プラスミノーゲンのアミノ酸配列１０３から３５２番目
（１０３と３５２番目を含めて）に相当し、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ：２のマウスアンジオスタチンのアミノ酸配列
の６から２５５番目（６と２５５番目を含めて）に相当
する。ヒトクリングル１−３（ＳＥＱＩＤ Ｎｏ：３
０）、アカゲザルクリングル１−３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ：３１）、ブタクリングル１−３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ：３２）、およびウシクリングル１−３（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ：３３）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３、
ＳＥＱＩＤ Ｎｏ：４、ＳＥＱ ＩＤＮｏ：５、ＳＥＱ
ＩＤＮ ｏ：６のアンジオスタチンのアミノ酸配列の６
から２５５番目（６と２５５番目を含めて）に相当す
る。
【０１５４】ここで用いられているように”クリングル
１−２”は、内皮細胞阻害活性あるいは抗血管新生活性
を有し、以下のクリングル１−２に相同的なアミノ酸配
列から成り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘
導体を意味する。一例を挙げると、これらに限定される
ものではないが、実施例において特に指示がないかぎ
り、マウスクリングル１−２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３
４）、ヒトクリングル１−２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３
５）、アカゲザルクリングル１−２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ：３６）、ブタクリングル１−２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ：３７）、およびウシクリングル１−２（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ：３８）がある。マウスクリングル１−２（Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３４）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１のマ
ウスプラスミノーゲンのアミノ酸配列１０３から２６２
番目（１０３と２６２番目を含めて）に相当し、ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ：２のマウスアンジオスタチンのアミノ酸配
列の６から１６５番目（６と１６５番目を含めて）に相
当する。ヒトクリングル１−２（ＳＥＱＩＤ Ｎｏ：３
５）、アカゲザルクリングル１−２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ：３６）、ブタクリングル１−２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ：３７）、およびウシクリングル１−２（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ：３８）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３、
ＳＥＱＩＤ Ｎｏ：４、ＳＥＱ ＩＤＮｏ：５、ＳＥＱＩ
Ｄ Ｎｏ：６のアンジオスタチンのアミノ酸配列の６か
ら１６５番目（６と１６ ５番目を含めて）に相当す
る。
【０１５５】ここで用いられているように”クリングル
１−４”は、内皮細胞阻害活性あるいは抗血管新生活性
を有し、以下のクリングル１−４に相同的なアミノ酸配
列から成り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘
導体を意味する。一例を挙げると、これらに限定される
ものではないが、実施例において特に指示がないかぎ
り、マウスクリングル１−４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３
９）、ヒトクリングル１−４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４
０）がある。マウスクリングル１−４（ＳＥＱＩ ＤＮ
ｏ：３９）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１のマウスプラスミ
ノーゲンのアミノ酸配列１０３から４５４番目（１０３
と４５４番目を含めて）に相当する。
【０１５６】クリングル１、クリングル２、クリングル
３、クリングル４、クリングル２−３、クリングル１−
３、クリングル１−２、クリングル１−４のアミノ酸配
列はそれぞれ上記で特定した特別のクリングル配列に相
同的なものである。好ましくは、アミノ酸配列は明らか
にされている配列との相同性において、少なくとも６０
％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましく
は少なくとも８０％を有する。既に列挙した断片に対す
る様々なアミノ酸の置換、付加、欠失あるいは他の修飾
はアンジオスタチン断片の内皮細胞増殖抑制活性あるい
は抗血管新生活性を増強あるいは修飾することがあ
る。”機能的な相同物”と言う用語は、結果として同じ
か機能的に同等な遺伝子産物をコードすることとなる異
なる配列の欠失、付加あるいは置換を含む発明に伴って
変更を加えた配列も使用することができることを意味し
ている。遺伝子産物それ自身がアミノ酸配列の欠失、付
加、置換をアンジオスタチン配列中に含むことができ
る。それによって、不顕性の変化がもたらされ、機能的
にアンジオスタチンタンパク質と同等のものが創出され
ることができる。このようなアミノ酸の置換は含まれる
アミノ酸の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、ある
いは両極性の性質に基づいて行うことができる。例え
ば、陰性に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸、グル
タミン酸があり、陽性に荷電したアミノ酸にはリジン、
ヒスチジン、アルギニンがあり、非荷電性の基を有する
アミノ酸は同等な親水性値を示し、グリシン、アスパラ
ギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンを含
む。また、非極性基を有するアミノ酸は同様の親水性値
を示し、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、
フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、トリプトフ
ァンを含む。このような修飾は、本請求の範囲と精神を
拡大することを目的とはしていない。例えば、クリング
ル間のＳ−Ｓ結合によるホモ二量体化を防ぐ目的でリコ
ンビナントヒトクリングル２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１
３）中のシステイン残基Ｃ４と、リコンビナントクリン
グル３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１８）中のＣ４２がセリン
に置換されている。さらに、それによって断片の内皮細
胞増殖抑制活性を失うことなしに、様々なアミノ酸の置
換、付加、欠失あるいは他の修飾を上記で特定されたア
ンジオスタチン断片において行うことが可能で、従って
これらは本請求の範囲を拡大することを目的とするもの
ではないことが理解さる。”有意には変化させない”と
いう用語によって、アンジオスタチン断片がここで明か
にしている最も相同的なアンジオスタチン断片の内皮細
胞増殖抑制活性に比べて少なくとも６０％、より好まし
くは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８
０％の活性を有することを意味している。
【０１５７】＜遺伝子の構築と発現＞ヒトプラスミノー
ゲン（ＨＰｇ）のクリングル１（Ｋ１）、クリングル２
（Ｋ２）、クリングル３（Ｋ３）、クリングル４（Ｋ
４）、クリングル２−３（Ｋ２−３）をコードするｃＤ
ＮＡ断片の作製に当たっては、ＰＣＲを基礎にした方法
が使用された。組換え体クリングル１（ｒＫ１）、クリ
ングル２（ｒＫ２）、クリングル３（ｒＫ３）、クリン
グル４（ｒＫ４）、およびクリングル２−３（ｒＫ２−
３）は、以前に記載されている（Menhart，N.，Shel，
L.C.，Kelly，R.F.，and Castellino，F.J．（1991）Bi
ochem．30，1948-1957; Marti，D.，Schall er，J.，Oc
hensberger，B.，and Rickli，E.E.(1994)Eur．J．Bioc
hem．219，45 5- 462; Sohdel，S.，Hu，C.-K.，Mard
i，D.，Affolter，M.，Schaller，J.，Llina s，M.，an
d Rickli，E.E．（1996）Biochem．in press; Rejant
e，M.R.，Byeon，I.-J.L.，and Llinas，M.，（1991）B
iochem．30，11081-11092）様に大腸菌に発現させた。
図３４Ｂに示したようなクリングル間のＳ−Ｓ結合によ
る架橋形成によるホモ二量体化を防止するためにｒＫ２
のＣ１６９およびｒＫ３のＣ２９７のシステイン残基
は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３と１８の４番目と
４２番目に認められる如くセリンに変異させた(Sonde
l，S.，Hu，C.-K.，Mardi，D .，Affolter，M.，Schall
er，J.，Llinas，M.，and Rickli，E.E．（1996）Bioc
hem．in press)。ｒＫ３とｒＫ２−３は、タンパク質の
精製に使用するアミノ末端の６個のヒスチジン標識を付
加している（図示せず）。
【０１５８】＜タンパク質の分解処理＞Ｋ１−３、Ｋ１
−４、Ｋ４の断片はすでに上記したごとく（Powell,J.
R.,andCastellino,F.J.(1983)Biochem 22,923-927）リ
ジン−ＨＰｇ（アボットラブス社）のブタエラスターゼ
（シグマ社）による分解によって作製された。略記する
と、１．５ｍｇのエラスターゼを２００ｍｇのヒトプラ
スミノーゲンと５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０中
において振盪しながら室温で一晩培養した。反応はジイ
ソプロピルフッ化リン酸（ＤＦＰ）（シグマ社）を最終
濃度１ｍＭで添加することによって停止させた。反応混
合液はさらに３０分間室温で振盪した後、５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液ｐＨ８．０で一晩透析した。
【０１５９】＜タンパク質の精製＞組み換えＫ１は、Ｄ
Ｈ５α大腸菌の菌体中でｐＳＴＩＩプラスミドベクター
を用いて発現させた。このタンパク質は、リジンセファ
ロース４Ｂ（ファルマシア）とモノＱ（バイオラド）カ
ラムを用いたクロマトグラフィーによって単一にまで精
製された。ｒＫ２およびｒＫ３を発現する大腸菌の菌体
（系統ＨＢ１０１）を１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン
および２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２ｘＹＴ培
地中に３℃でＯＤ600が約０．８になるまで増殖させ
た。組換え体タンパク質の産生を誘導するために、ＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）を最終濃度が１ｍＭになるように添加した後、さら
に３７℃で４．５時間培養した。菌体は、遠心によって
回収し、沈渣を−８０℃で保存した。融解した菌体溶解
物は、抽出液（６Ｍ塩酸グアニジン、０．１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ８．０溶液）に再懸濁した。懸濁液
を、１５,０００ｘｇで３０分間遠心した後、上清中に
ｂ−メルカプトエタノールを最終濃度が１０ｍｍになる
ように添加した。上清を次いで、抽出液で事前に平衡化
したニッケル（Ｎｉ 2）− ＮＴＡアガロースカラム
（１．５ｃｍｘ５ｃｍ）に充填した。カラムは、ｐＨ
８．０とｐＨ６．３の抽出液でそれぞれ連続的に洗浄し
た。組換え体Ｋ２とＫ３は、ｐＨ５０の抽出液によって
溶出された。
【０１６０】タンパク質の分解産物の断片であるＫ１−
３、Ｋ１−４およびＫ４は、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
ｐＨ８．０で平衡化したリジンセファロースカラム
（２．５ｃｍｘ１５ｃｍ）で、１８０ｎｍの吸光度が
０．００５になるまで精製した。吸着したクリングル断
片は２００ｍＭのε−アミノカプロイン酸を含むトリス
緩衝液ｐＨ８．０を用いて溶出した。溶出した試料は、
２０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ５．０に対して一晩透析
し、同じ緩衝液で平衡化したバイオラドモノ−Ｓカラム
に添加した。Ｋ４、Ｋ１−３、Ｋ１−４の断片は、２０
ｍＭリン酸／１ＭＫＣｌ溶液ｐＨ５の０〜２０％、２０
〜５０％、５０〜７０％の非連続勾配によって溶出し
た。ほとんどのＫ１−３、Ｋ１−４断片は、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで確認したところ、０．５ＭＫＣｌによってカラ
ムから溶出された。全ての断片を２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液で一晩透析した。透析後、Ｋ１−３、Ｋ１−４断片
は、さらに２０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０で平
衡化したヘパリンセファロースカラム（５ｃｍｘ１０ｃ
ｍ）（シグマ社）を用いて精製した。Ｋ１−３断片は３
５０ｍＭの塩化カリウムで溶出され、Ｋ１−４は、通り
抜ける画分から回収された。精製されたクリングル断片
はＳＤＳゲル上で銀染色、抗ヒトＫ４、Ｋ１−３ポリク
ローナル抗体を用いたウエスタン免疫染色解析、および
アミノ末端の配列決定によって解析した。
【０１６１】＜インビトロでの再折たたみ＞ｒＫ２、ｒ
Ｋ３、ｒＫ２−３の再折たたみは、標準的な手法（Clea
ry，S.，Mulkerrin，M．G.，and Kelly,R．R．（1989）
Biochem．28，1884−1891）に従って行った。精製した
タンパク質をｐＨ８．０に調製した後、ジチオスレイト
ルを最終濃度５ｍＭになるように添加した。一晩培養
後、溶液を、１．２５ｍＭの還元型グルタチオンを含む
４倍量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０で希釈し
た。１時間の培養後、酸化型グルタチオンを最終濃度
１．２５ｍＭ加え、４℃で６時間培養した。復元したタ
ンパク質は最初は水で２日間透析し、５０ｍＭリン酸緩
衝生理食塩液ｐＨ８．０にてさらに２日間透析した。溶
液は次いで、同じリン酸緩衝生理食塩水で平衡化したリ
ジン−Ｂｉｏ−ゲルカラム（２ｃｍｘ１３ｃｍ）に充填
した。カラムを、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、タン
パク質を５０ｍＭ ６−ＡＨＡ（６−アミノヘキサン
酸）を含むリン酸緩衝液にて溶出した。逆相ＨＰＬＣ
を、アクアポアブチルカラム（２．１ｘ１００ｍｍ、ワ
イドポア３０ｎｍ、７ｍｍ、アプライドバイオシステム
社）を用いて行い、ヒューレットパッカード社の液体ク
ロマトグラフィーをアセトニトリルの勾配で使用した。
【０１６２】＜還元とアルキル化＞クリングル断片の還
元とアルキル化は、標準的な方法（Cao，Y．，and Pett
ersson，R．F.，（1990）Growth Factor3，1013）に従
って行った。血清を含まない３００−５００ｍｌのＤＭ
Ｅ培地に入った約２０−８０ｍｇの精製タンパク質を
０．５Ｍ ＤＴＴ１５ｍｌと共に１５分間室温にて培養
した。培養後、０．５Ｍヨード酢酸アミド３０ｍｌを反
応液に添加した。タンパク質溶液は、最初に２０倍量の
ＤＭＥＭに対して４℃で一晩透析した。溶液はさらに２
０倍量の新鮮なＤＭＥＭに対して４℃で４時間透析し
た。透析後、試料はＳＤＳゲル上で分析し、その内皮細
胞増殖に対する阻害活性を測定した。
【０１６３】＜内皮細胞増殖試験＞ウシ微小血管内皮細
胞（ＢＣＥ）は、既報（Folkman，J.，Haudenschild，
C．C．and Zetter，B．R．（1979）Proc．Natl．Acad．
Sci USA． 76、5217− 5221）の如く単離し、１０％熱
非働化ウシ胎児血清（ＢＣＳ）、抗生物質、３ｎ ｇ／
ｍｌの組み換えヒトｂＦＧＦ（Ｓｃｉｏｓ Ｎｏｖａ、
Ｍｏｕｎｔａｉｎ ｖｉｅｗ、ＣＡ）を添加したＤＭＥ
Ｍ中で維持した。６穴プレート中で成長させ た単層Ｂ
ＣＥ細胞を０．０５％のトリプシン溶液中に分散させ
た。細胞は、１０％ＢＣＳを含むＤＭＥＭ中に再懸濁さ
せた。０．５ｍｌ中の約１２，５００個の細胞をゼラチ
ン処理した２４穴プレートのそれぞれのウェルに加え、
３７℃（１０％ＣＯ2下で）、２４時間培養した。培養
液を５％のＢＣＳを含む新鮮なＤＭＥＭ５００ｍｌで置
換し、クリングル断片のそれぞれ、あるいは組合せをｎ
＝３で各ウェルへ添加した。３０分間培養後、ｂＦＧＦ
を最終濃度１ｎｇ／ｍｌで添加した。７２時間の培養
後、細胞をトリプシン処理し、Ｈｅｍａｔａｌｌ（Fish
er Scientific，Pittsburg，PA）に再懸濁し、コルタ
ーカウンターで計数した。
【０１６４】＜ヒトプラスミノーゲンのクリングル断片
の精製と特徴の解析＞ヒトプラスミノーゲンの個々のク
リングル（Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４）およびクリングル
２−３（Ｋ２−３）をコードするｃＤＮＡ断片は、ＰＣ
Ｒを基礎とした方法で増幅させた。（図３０）ＰＣＲで
増幅したｃＤＮＡ断片は、細菌用発現ベクターにクロー
ニングした。大腸菌で発現させた組み換えタンパク質
は、インビトロで再折たたみさせたのち、ＨＰＬＣに組
み込んだクロマトグラフィーを用いて、９８％以上にま
で均質に精製した（図３１）。還元条件下において、組
み換えＫ２、Ｋ３、およびＫ４は１２−１３キロダルト
ンの分子量して泳動され、それぞれのクリングル断片の
予測される分子量に一致した（図３１Ａ、２−４レー
ン）。１７キロダルトンより高分子量側に泳動される組
み換えＫ１は、ＳＤＳゲル電気泳動によって同定した。
Ｋ１−４、Ｋ１−３の断片は、以前に記述したとおり
（Powell.,J.R.，and Castellino,F．J．（1983）Bioch
em．22，923−927；Brockway，W．J.，and Castellin
o，F．J．（1972）Arch．Biochem．Biophys）、ヒトリ
ジン−プラスミノーゲン（Ｌｙｓ−ＨＰｇ）をエラスタ
ーゼでタンパク分解することによって得られた。これら
の推定分子量がそれぞれ、４３キロダルトンと３５キロ
ダルトンである２つの断片（図３１Ｂ、レーン１、２）
も均質にまで精製した。精製断片のＮ端末アミノ酸配列
の分析結果は、同一の−ＹＬＳＥ−であり、それぞれＫ
１−３、Ｋ１−４ではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０およびＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０がそれに続いた。Ｋ４のＮ末端配
列は−ＶＶＱＤ−であったが、約２０％は−ＶＱＤ−で
あり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３がそれに続いた。どちら
もヒトアンジオスタチン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のバ
リン176とバリン1 77から始まる予想される配列から推定
された。
【０１６５】＜個々のクリングルの抗内皮細胞増殖活性
＞アンジオスタチンの個々の組み換えクリングル断片に
ついて、ｂＦＧＦによって刺激されたウシ微小血管内皮
（ＢＣＥ）細胞の増殖に対する阻害活性を評価した。図
３２Ａに図示したように、ｒＫ１はＢＣＥ細胞の増殖を
濃度依存的に阻害した。５０％阻害（ＥＤ50）をもたら
すのに必要なｒＫ１濃度は約３２０ｎｍであった（表
４）。それに比較して、ｒＫ４は、内皮細胞増殖に対し
てわずかしか、あるいは全く阻害効果を示さなかった。
組み換えＫ２、ｒＫ３、２種のリジン結合のないクリン
グルも内皮細胞増殖に対して濃度依存的な阻害をもたら
した（図３２Ｂ）。しかし、ｒＫ２阻害強度は、ｒＫ１
およびｒＫ３よりも本質的に弱かった（ＥＤ50＝４６
０）（図３２および表４）。これらのクリングルの高濃
度存在下においても、細胞毒性およびアポトーシスを起
こしている内皮細胞に特有な形態、たとえば、円形化、
剥がれ、および細胞の断片化などは認められなかった。
これらのデータは、アンジオスタチンの抗内皮細胞増殖
活性が、Ｋ１、Ｋ２ 、Ｋ３によってそれぞれ別々に認
められ、Ｋ４にはほとんど認められないことを示してい
る。
【０１６６】
【表４】
【０１６７】＜Ｋ１−３とＫ１−４断片の抗内皮細胞増
殖活性＞複合型のクリングル断片の抗内皮細胞増殖活性
を評価するために、精製したタンパク質分解断片である
ヒトＫ１−４、Ｋ１−３、ｒＫ２−３のＢＣＥ細胞に対
する効果を評価した。これまで認められているように
(O'Reilly，M.S.，Holmgren，L.，Shing，Y.，Chen，
C.，Rosenthal，R.A.，Moses，J.，Lane，W.S.，Cao，
Y.，Sage，E.H.，and Folkman，J．（1994）Cell 79，3
15-328)、図３２に図示したごとく、ＢＣＥ細胞増殖は
アンジオスタチン様断片Ｋ１−４によって有意に阻害さ
れた（ＥＤ50＝１３５ｎＭ）（表４）。Ｋ１−３断片に
おいては抗内皮細胞増殖活性の増強が認められた（ＥＤ
50＝７０ｎＭ）（表４）。内皮細胞増殖の阻害は濃度依
存的に起こった。これらの結果はアンジオスタチンから
Ｋ４を除去することによって抗内皮細胞増殖活性が増強
することを意味している。
【０１６８】＜ｒＫ２とｒＫ３による相加的な阻害＞ｒ
Ｋ２−３断片はｒＫ２単独の場合と同様な弱い阻害効果
しか示さなかった（図３３）。しかし、ｒＫ２とｒＫ３
は両者とも内皮細胞増殖を阻害した（図３２Ｂ）。この
ことは、Ｋ３の持つ阻害効果がＫ２−３構造中で隠され
てしまっていることを意味している。これまでの構造的
な検討から、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のシステイン91とシ
ステイン219に相当するヒトプラスミノーゲンのＫ２
（システイン169）とＫ３（システイン297）の間にクリ
ングル間のＳ−Ｓ結合が存在することが判っている（So
ndel，S.，Hu，C.-K.，Marti，D.，Affolter，M.，Scha
ller，J.，Llinas，M.，and Rickli，E.E．（1996）Bio
chem．印刷中）図３４Ｂ参照。ｒＫ２とｒＫ３の組合せ
の場合での阻害効果について検討した。興味あること
に、個々のｒＫ２とｒＫ３断片をＢＣＥ細胞に同時に添
加した場合、相加的な阻害効果が観察された。図３４Ａ
参照。これらの結果は、Ｋ２−３の最大阻害効果を得る
ためには、Ｋ２とＫ３間のＳ−Ｓ結合による架橋を開裂
させたほうがよいことを示している。
【０１６９】クリングル構造の適切な折たたみはアンジ
オスタチンの抗内皮細胞活性に必須である。クリングル
構造の折たたみが抗内皮細胞増殖活性に必要かどうか検
討するために、未変性のアンジオスタチンをＤＴＴで還
元した後にウシ微小血管内皮細胞に対する効果を評価し
た。還元した後に、アンジオスタチンをさらにヨード酢
酸アミドで処理しアルキル化し、ＳＤＳゲル電気泳動に
て分析した。図３６Ａに示すように、ＤＴＴ処理したタ
ンパク質は、未変性のアンジオスタチンが分子量約３３
キロダルトンの所に泳動されるのに比べ（レーン１）、
分子量約４２キロダルトンとより高分子量側に泳動され
（レーン２）、これはアンジオスタチンが完全に還元さ
れたことを示している。アンジオスタチンの抗増殖活性
は還元後に大部分が失われた（図３６Ｂ）。これらの結
果から我々は、内皮細胞増殖に対する強力な阻害活性を
維持するためには、クリングル内のＳ−Ｓ結合を介した
正確な折たたみが必要とされると結論付けた。
【０１７０】ヒトプラスミノーゲンのクリングル構造部
位のアミノ酸配列を並べて比較すると、図３７に示され
ているように、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３およびＫ４は同じ全体
構成とアミノ酸配列の相同性（５６−８２％判明）を示
すことが判った。これらの構造のうちで、高親和性リジ
ン結合クリングルであるＫ１は、最も強力に内皮細胞増
殖を阻害する部分である。興味あることに中等度のリジ
ン結合親和性を示す断片であるＫ４は阻害効果を欠いて
いる。これらの結果はクリングル構造のリジン結合部位
が阻害効果の発現に必ずしも直接関わっているわけでは
ないことを示している。これらのクリングル構造間での
アミノ酸配列の保存と機能的な多様性は、進化の過程に
おけるＤＮＡの複製に際して生じる変異の役割を検討す
るのに理想的な系である。構造的に関連したタンパク質
によって示される血管新生の調節に準じた同様な活性の
変動は、−Ｃ−Ｘ−Ｃ−ケモカインやプロラクチン−成
長ホルモン群においても観察される(Maione，T.E.，Gra
y，G.S.，Petro，A.J.，Hunt，A.L.，and Donner，S.
I．（1990）Science 247，77-79; Koch，A.E.，Polve r
ini，P.J.，Kunkel，S.L.，Harlow，L.A.，DiPietro，
L.A.，Elner，V.M.，Eln er, S.J.，and Strieter，R.
M．（1992）Science 258，1798-1801.；Cao，Y.，C he
n， C.，Weatherbee，J.A.，Tsang，M.，and Folkman，
J．（1995）J．Exp．Med．18 2，2069-2077.；Striete
r，R.M.，Polverini，P.J.，Arenberg，D.A.，and Kunk
el，S.L．（1995）Shock 4，155-160.；Jackson，D.，
Volpert，O.V.，Bouck，N .，and Linzer，D.I.H．（19
94）Science 266，1581-1584)。
【０１７１】さらに配列を検討したところ、Ｋ４はシス
テイン２２と７８に近接してそれぞれ２つの陽性に荷電
したリジン残基を有することが判明した（図３７）。1
Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析によって、これら４つのリ
ジンは、リジン５７と共にＫ４中に陽性に荷電した部位
の中心を形成することが明かとなった（Llinas M，未発
表データ）、一方他のクリングル構造はそのような陽性
荷電した部位を欠如している。このリジンに富む領域が
クリングル４の阻害活性の喪失に寄与しているのかどう
かはこれからの研究課題である。Ｋ４は他の細胞種の増
殖を亢進すること、および細胞内カルシウム放出を増加
させることが報告されている(Donate，L.E.，Gherard
i，E.，Srinivasan，N.，Sowdhamini，R.，Aporicio，
S.，and Blundell，T.L．（1994）Prot．Sci．3，2378-
2394)。アンギオスタシンからＫ４を除去すると内皮細
胞に対する抑制効果が増強するという事実は、この構造
がＫ１−３の抑制効果のうちのいくらかを妨げている事
を示唆している。
【０１７２】アンジオスタチンとその関連するクリング
ル断片が特異的に内皮細胞増殖を抑制する基礎となる作
用機序については、未検討である。阻害が増殖している
内皮細胞に特異的に発現している受容体を介しているも
のなのか、アンジオスタチンは内皮細胞内に取り込まれ
ることによって、その後細胞増殖を阻害するのかは、依
然明確ではない。あるいは、アンジオスタチンは内皮細
胞の接着受容体、例えばインテグリンavB3と相互作用す
ることによって、インテグリン介在性の血管新生(Brook
s，P.C.，Montgomery，A.M.，Rosenfeld，M.，Reisfel
d，R.A.，Hu，T.Klicr，G.，and Cheresh，D.A．（199
4）Cell 79，1157-1164)を阻害しているのかもしれな
い。興味あることにFriedlanderら(Friedlander，M.，B
rooks，P.C.，Shaffer，R.W.，Kincaid，C.M.，Varne
r，J.A.，and Cheresh，D.A．（1995）240，1502)は最
近、生体における（ｂＦＧＦあるいは腫瘍壊死因子によ
って誘導される）角膜あるいは漿尿膜モデルでの血管新
生は、avb3依存的であると報告した。しかし、ＶＥＧ
Ｆ、ＴＧＦａあるいはフォルボールエステルによって誘
導される血管新生はavb5依存的であった。それぞれのイ
ンテグリンに対する抗体はこれらの経路の内の一つを特
異的に阻害し、両インテグリンに対する環状タンパク質
性拮抗剤は、それぞれのサイトカインによって誘導され
る血管新生を阻害した(Friedlander，M.，Brooks，P.
C.，Shaffer，R.W.，Kincaid，C.M.，Varner，J.A.，an
d Cheresh，D.A．（1995）270,1502)。ｂＦＧＦとＶＥ
ＧＦによって誘導される血管新生はアンジオスタチンに
よって阻害されるので、これらインテグリン依存性の血
管新生に共通の経路を阻害しているのかも知れない。
【０１７３】最近数１０年間に数多くの内因性の血管新
生阻害因子が同定された(Folkman，J．（1995）N．Eng
l．J．Med．333，1757-1763)。９つの解析されている内
皮細胞抑制因子のうちで、いくつかがタンパク質分解物
である。たとえば、ヒトプロラクチンのＮ末端の１６キ
ロダルトン断片が内皮細胞の増殖を阻害し、生体で血管
新生を阻害する（Clapp，C.，Martial，J.A.，Guzman，
R.C.，Rentierdelrue，F.，and Weiner，R.I．（1993）
Endocrinology 133，1292-1299)。最近の論文におい
て、D'Angeloらは、抗血管新生性の１６キロダルトンの
Ｎ末端断片は、微小血管においてＶＥＧＦやｂＦＧＦに
よって活性化されたマイトジェン活性化タンパク質キナ
ーゼ（ＭＡＰＫ）を阻害したと報告した(D'Angelo，
G.，Struman，I.，Martial，J.，and Weiner，R．（199
5）Proc．Natl．Acad．Sci．92，6374-6378)。アンジオ
スタチンと同様に、元々の完全なプロラクチン分子は内
皮細胞の増殖を阻害しないし、血管新生阻害物質でもな
い。血小板因子４（ＰＦ−４）は高濃度で血管新生を阻
害する(Maione，T.E.，Gray，G.S.，Petro，A.J.，Hun
t，A.L.，and Donner，S.I．（1990）Science 247，77-
79; Cao，Y.，Chen，C.，Weatherbee，J.A.，Tsang，
M.，and Folkman，J．（1995）J．Exp．Med．182，2069
-2077)。しかし、Ｎ末端が切断された、タンパク質分解
的に切られたＰＦ−４断片は元々の完全なＰＦ−４に対
して、抗細胞増殖活性において３０−５０倍の増強を示
した(Gupta，S.K.，Hassel，T.，and Singh，J.P．（19
95）Proc．Na tl．Acad．Sci．92，7799-7803)。フィブ
ロネクチン、マウスの上皮成長因子（ ＥＧＦ）および
トロンボスポンジンのより短い断片もまた特異的に内皮
細胞増殖を阻害すると報告されている(Homandberg，G.
A.，Williams，J.E.，Grant，D.，Schumacher，B.，and
Eisenstein，R．（1985）Am．J．Pathol．120，327-33
2; Nelson，J.，Alle n，W.E.，Scott，W.N.，Bailie，
J.R.，Walker，B.，McFerran，N.V.，and Wilson，D.
J．（1995）Cancer Res．55，3772-3776; Tolsma，S.
S.，Volpert，O.V.，Good，D.J.，Frazer，W.A.，Polve
rini，P.J.，and Bouck，N．（1993）J．Ce llBiol．12
2，497-511)。大きいタンパク質をタンパク質分解する
ことによって元々の分子の立体構造が変わったり、抗血
管新生的な新たな活性部位が露出したりするのかも知れ
ない。従って、タンパク質分解酵素が血管新生において
重要な役割を演じている。これまでに生体におけるその
ようなタンパク質分解酵素の調節機構についてはほとん
ど知られていない。
【０１７４】結果はまた、アンジオスタチンのＳ−Ｓ結
合を介したクリングル構造への折たたみが内皮細胞増殖
に対する阻害的な効果の維持に必要であることも示し
た。プラスミノーゲンに見られるようなクリングル構造
は他の様々なタンパク質においても認められている。た
とえば、アポリポプロテイン（ａ）はプラスミノーゲン
のクリングル４の繰り返しを３７個も持っている(McLea
n，J.W.，Tomlinson，J.E.，Kuang，W.-J.，Eaton，D.
L.，Chen，E.Y.，Fless，G.M.，Scanu，A.M.，andLaw
n，R.M．（1987）Nature 330，132-137)。プロトロンビ
ンのアミノ末端部分もプラスミノーゲンのものと同様な
２つのクリングルを持つ(Walz，D.A.，Hewett Emmett，
D.，and Seegers，W.H．（1977）Proc．Natl．Acad．Sc
i．74，1969-1973)。ウロキナーゼもまたプラスミノー
ゲンと徹底的に相同性を示すクリングル構造を有してい
る(Gunzler，W.A.，J.，S.G.，Otting，F.，Kim，S.-M.
A.，Frankus，E.，and Flohe，L．（1982）Hoppe-Seyle
r's A．Physiol．Chem．363，1155-1165)。さらに、サ
ーファクタントタンパク質Ｂと肝成長因子もクリングル
構造を備えている(Johansson，J.，Curstedt，T.，and
Jonvall，H．（1991）Blochcm．30，6917-6921; Lukke
r，N.A.，Presta，L.G.，and Godowski，P.J．（1994）
Prot．Engin．7，895-903)。
【０１７５】
【実施例２８】アンジオスタチン断片による転移と内皮
細胞増殖の阻害下記の実施例において、追加のアンジオ
スタチン断片の活性の特徴を解析している。データは強
力な抗内皮細胞および腫瘍抑制活性が、アンジオスタチ
ンのこのような断片によって得られることを示唆してい
る。ここで用いられているように”クリングル１−４Ｂ
ＫＬＳ”は、内皮細胞阻害活性を有し、以下のクリング
ル１−４ＢＫＬＳに相同的なアミノ酸配列から成り立っ
ているプラスミノーゲンのタンパク質誘導体を意味す
る。一例を挙げると、これらに限定されるものではない
が、実施例において特に指示がないかぎり、マウスクリ
ングル１−４ＢＫＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４１）、ヒ
トクリングル１−４ＢＫＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４
２）がある。マウスクリングル１−４ＫＬＳ（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ：４１）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１のマウス
プラスミノーゲンのアミノ酸配列９３から４７０番目
（９３と４７０番目を含めて）に相当する。本実施例
は”アンジオスタチン断片”はプラスミノーゲン断片で
も構わないこと、およびたとえばＳＥＱＩＤ ＮＯ：３
で示されるようなアンジオスタチンよりも大きなアミノ
酸配列を包含すること、さらにまた治療的な内皮細胞増
殖阻害活性あるいは抗血管新生活性を有することを明ら
かにした。
【０１７６】クリングル１−４ＢＬＫＳのアミノ酸配列
は、上記で同定した特定のクリングル１−４ＢＬＫＳの
配列と相同的である。好ましくは、アミノ酸配列は明ら
かにされている配列との相同性において、少なくとも６
０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好まし
くは少なくとも８０％を有する。断片の内皮細胞阻害効
果を改善あるいは修正するために、様々なアミノ酸の置
換、欠失そして他の修飾をすることが可能である。この
ような修飾は本請求の範囲および精神を拡げる事を目的
とはしていない。さらに、断片の内皮細胞阻害活性を有
意に変化させないような、様々な不顕性のアミノ酸置
換、付加、あるいは欠失もなされることが可能であり、
従ってこれらが本請求の範囲および精神を拡げる事を目
的とはしていないことが理解される。
【０１７７】＜Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを用い
たアンジオスタチンのクローニング＞アンジオスタチン
をコードする配列をVentポリメラーゼ(New England Bio
labs)とそれぞれＸｈｏＩとＥＣｏＲＩのリンカーをも
つプライマー＃１５４（5’-A TCGCTCGAGCGTTATTTGAAAA
GAAAGTG-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）と＃１５１
（5’-ATCGGAATTCAAGCAGGACAACAGGCGG-3'）（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：４４）を用いたＰＣＲによってｐＴｒｃＨｉ
ｓ／ＨＡｓを鋳型として増幅した。このプラスミドは、
ヒトプラスミノーゲン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）のア
ミノ酸９３番目から４７０番目をコードし、Ｐ．ｐａｓ
ｔｏｒｉｓの本来の分泌信号であるＰＨＯ１を用いてｐ
ＨＩＬ−Ｓ１発現ベクターのＸｈｏＩ／EｃｏＲＩ制限
酵素部位部位にクローニングするための配列を含んでい
る。この同様な配列が同様の方法でそれぞれＳｎａ Ｂ
Ｉ制限酵素部位とＲｃｏＲh 制限酵素部位を持つプライ
マー＃１５６（5’-ATCGTACGTATTATTTGAAAAGAAAGTG-
3'）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：４５）と＃１５１を用い
て，α因子の分泌信号を用いているｐＰｌＣ９発現 ベ
クターのＳｎａ ＢＩ／ＥｃｏＲＩ制限酵素部位部位に
クローニングするためた増幅した増幅結果の産物はゲル
で精製し、リンカー部位を適当な酵素で精製し、さらに
再びジーン クリーン（Ｂｉｏ１０１）を用いて精製し
た。これらの遺伝子断片は適当なベクター中に組み込ま
れた。得られたクローンを選択し、クローンのプラスミ
ド調製品を得て、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主株ＧＳ１１
５に形質転換したときにＨｉｓ+ＭｕｔsおよびＨｉｓ+
Ｍｕｔ+組み換え体を得るために線状化した。挿入はＰ
ＣＲにて確認した。
【０１７８】Ｈｉｓ+およびＨｉｓ+Ｍｕｔ+組み換え体
は両者ともメタノールで誘導され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルのクマシー染色とクリングル１から３に対するマウス
モノクローナル抗体（Castellino，Enzyme Research La
beratories，InC.，South Bend，IN）を用いた免疫ブロ
ットによって、アンジオスタチンを高レベルに発現して
いるものを選抜した。
【０１７９】これらから、ＧＳ１１５形質転換Ｐ．ｐａ
ｓｔｏｒｉｓクローン、ｐＨＩＬ−Ｓ１／ＨＡｓ１８を
選択し、Ｈｉｓ+Ｍｕｔs表現系と特徴付けた。ｐＨＩＬ
−Ｓ１／ＨＡｓ１８の発現 ｐＨＩＬ−Ｓ１／ＨＡｓ１
８からのアンジオスタチンの発現は、Ｈｉｓ+Ｍｕｔsク
ローンに特有である。バッフル振盪フラスコ中での誘導
において、１リッ トルのＯＤ600細胞を１％酵母抽出
物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウ ムｐＨ
６．０、硫酸アンモニウムを用いた１．３４％イースト
・ナイトロジェン・ベース、０．００００４％ビオチン
および０．５％メタノールを含む１５０ｍｌの緩衝メタ
ノール複合培地中で１リットルのバッフルフラスコを用
いて培養した。細胞は、３０℃、２５０ｒｐｍで常に振
盪した。２４時間おきに、最終濃度０．５％になるよう
に無水メタノールをバッチに添加した。１２０時間後、
５０００ｒ ｐｍ、１０分間、遠心し、上清を使用する
ときまで−７０℃にて保存した。
【０１８０】＜リジン−セファロースクロマトグラフィ
ーによるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発酵培地 からのアンジ
オスタチンの精製＞全ての手順は４℃にて行った。アン
ジオスタチンを含む粗発酵培地、普通２００ｍｌを、１
４，０００ｘｇで遠心し、３０キロダルトンの分子量遮
断メンブレンＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３０（アミコン）を
用いて最初の量の４分の１にまで濃縮した。同量の５０
ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５を濃縮した試料に添加
し、再び最初の試料の量の４分の１にまで濃縮した。試
料を再び、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．
５を用いて容量比１：１に希釈した。６０ｇのリジン−
セファロース４Ｂ（ファルマシア）を５００ｍｌの氷冷
した５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５中に再懸濁し、
４８ｘ１００ｍｍカラム（充填容量〜１８０ｍｌ）に詰
めた。カラムを、１．５ｍｌ／分の流速で、カラム容量
（ＣＶ）の７．５倍の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
で一晩洗浄した。試料を１．５ｍｌ／分の流速でカラム
に載せ、その後、１．５ＣＶの５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７．５を用いて３ｍｌ／分の流速でカラムを洗
浄した。カラムをその後、１．５ＣＶのリン酸緩衝生理
食塩水、ｐＨ７．４を用いて３ｍｌ／分の流速で洗浄し
た：アンジオスタチンを、それから０．２Ｍ ε−アミ
ノ−ｎ−カプロン酸、ｐＨ７．４を用いて３ｍｌ／分の
流速で溶出した。有意な吸光度を示す画分を集め、脱イ
オン水に対して２４−４８時間透析し、凍結乾燥した。
１００ｍｇの全タンパク質からの収量は、アンジオスタ
チン１０ｍｇであった。カラムを、５倍のカラム容量の
５０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．
５を用いて再生した。
【０１８１】＜ウシ毛細血管内皮細胞増殖試験＞ウシ毛
細血管内皮細胞は、前記のように得た。細胞は、７５ｃ
ｍ2細胞培養用フラスコ中で、３ｍｇ／ｍｌの組み換え
ヒトｂＦＧＦ（Scios Nova，Mountainview，CA）、１０
％熱非働化仔牛血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０
０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５ｍｇ／ｍｌ
ファンギゾン（fungizone）（BioWhittaker）を含むＤ
ＭＥＭ培地で維持された。解析は以前に記したように行
った。
【０１８２】＜動物試験＞６週から８週齢のＣ５７ＢＬ
／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）の皮下に、マウスルイス肺癌−低転移性系統（Ｌ
ＬＣ−ＬＭ）を移植した（１ｘ１０6細胞．／注入）。
移植してからおよそ１４日後、一次腫瘍が１．５ｃｍ3
に達したときに動物をメトキシフルレンにて麻酔し、一
次腫瘍を外科的に切除した。切開部位は、簡単な断続縫
合を行って閉じた。この群の半数の動物に、外科手術直
後に組み換えあるいはプラスミノーゲン由来アンギオテ
ンシンを十分量（３ｍｇ／ｋｇ皮下）と、その後１４日
間毎日１．５ｍｇ／ｍｌを注入した。対照群のマウスに
は、外科手術後１４日間毎日、同量のＰＢＳを投与し
た。全てのマウスを、一次腫瘍を切除して１４日後（腫
瘍を移植して２８日後）に屠殺し、肺を切除して重量を
測定し、表面転移巣をステレオマイクロスコープにて計
数した。
【０１８３】＜組換えヒトアンジオスタチン断片の特徴
＞全部で２６個のシステイン残基を含むヒトプラスミノ
ーゲンのクリングル１から４を含有するヒトアンジオス
タチンをコードする遺伝子断片を、メチルトロピック酵
母であるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに発現させ
た。アンジオスタチンを発現したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ
はリジンセファロースに結合し、ε−アミノカプロン酸
で特異的に溶出することができる。プラスミノーゲンの
クリングル１および４の物理学的特性（Sottrup−Jense
n，Lら、Progress in Chemical Fibrinolysis and Thro
mbolysis，Vol．３（1978）Ravens Press，N．Y．p．19
1）を有する、完全に機能を有するεアミノカプロン酸
−結合性クリングルが、 Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓによっ
て発現され分泌されうる事、および再折たたみを必要と
しない技術によって精製されうることを示す（図３８Ａ
およびＢ）。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来の発現されたア
ンジオスタチンおよびプラスミノーゲンのエラスターゼ
切断によって精製されたアンジオスタチンは、クリング
ル１から３に対する立体配座依存性モノクローナル抗体
（Castellino，Enzyme Research Labora tories．In
c.，South Bend，IN）によって認識される（図３８
Ｂ）。この抗体は、プラスミノーゲンあるいはアンジオ
スタチンの還元型は認識することができない。Ｐ．ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ発現アンジオスタチンは、変性非還元ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲル上で、４９キロダルトン
および５１．５キロダルトンに泳動される二量体のよう
である。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現タンパク質は、主に
高マンノース型のＮ−結合性グリコシル化およびわずか
にＯ−結合性グリコシル化によって翻訳後に修飾され
る。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現アンジオスタチン中のグ
リコシル化の可能性を調べるために、我々は、高マンノ
ース構造に特異的なエンドグリコシダーゼＨによって組
み換えアンジオスタチンを切断したところ、５１．５キ
ロダルトンのバンドが４９キロダルトンのバンドと同位
置に移動した（図３９ＡおよびＢ）。最初にシアル酸残
基を除去するためにノイラミニダーゼ処理をした後にＯ
−グリカナーゼ消化を行うと、二量体の泳動パターンに
変化はなかった（データは示さない）。これらの結果
は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現アンジオスタチンには２
種類の型があることを示す：（１）以下の構造である可
能性のＮ−結合性複合体鎖を有する：
【０１８４】
【化１】（Ｍａｎ）2-150--Ｍａｎ Ｍａｎ--ＧｌｃＮＡｃ---ＧｌｃＮＡｃ-Ａｓｎ- （Ｍａｎ）1-2-Ｍａｎ および（２）いかなる糖鎖も持たない．
【０１８５】＜インビトロにおけるウシ毛細血管内皮細
胞の阻害＞組み換えによって発現されたアンジオスタチ
ンが抗血管新生活性を有するかどうかを調べるために、
ＢＣＥをｂＦＧＦの存在化で培養し、精製した組み換え
アンジオスタチンの添加がＢＣＥの増殖を阻害するかど
うかを検討した。精製したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ア
ンジオスタチンは、インビトロにおけるウシ内皮細胞の
ｂＦＧＦによって誘導される増殖を用量依存的に（図４
０Ｃ）阻害した（図４０Ｂ）。１μｇｍｌの組み換えア
ンジオスタチンでは、阻害は８０％であった。５０％阻
害は、ヒトプラスミノーゲンのエラスターゼ切断由来の
アンジオスタチンで得られる値と一致した。
【０１８６】＜インビボにおける転移の抑制＞アンジオ
スタチンが最初に同定され、移植可能なマウスＬＬＣ
（ＬＭ）株を使用した。同系のＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス
の皮下に移植すると、腫瘍は迅速に成長し、１４日以内
に１．５ｃｍ3以上の腫瘍塊を形成する。原発腫瘍を切
除した後、肺における微小転移が指数関数的に急成長
し、肺全体の表面を覆うまでになる。これらの転移巣
は、原発巣の切除後１４日後には高度に血管の分布を受
けている。もし、原発巣が依然として残っている場合
は、微小転移は潜在化しており巨視的に観察されること
はない。転移巣の成長に対する抑制効果を検討するため
に、原発腫瘍の切除後に組換えアンジオスタチンをマウ
スに全身的に投与した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが発現し
たアンジオスタチンを全身性に３０μｇ／マウス／日で
投与することによって、転移巣の成長を表面への転移の
スコア化（図４１Ａ）および肺の全重量（図４１Ｂ）と
して定量した場合、それを抑制していた。原発腫瘍を切
除し、組換えアンジオスタチンあるいはプラスミノーゲ
ンをエラスターゼで分解して得られたアンジオスタチン
を毎日投与したマウスの肺の重量は、正常マウスの肺重
量（１９０〜２００ｍｇ）と同程度であった。原発腫瘍
を切除し、引き続き組換えアンジオスタチンを毎日投与
されたマウスの肺はピンク色で、血管の供給を受けてい
ない微小転移が最小限認められた（図４２）。それに比
較して、原発腫瘍の切除後に生理食塩水を投与されてい
たマウスの肺は、血管の分布した転移巣で覆われていた
（図４３）。さらに注目すべき重要な点は、Ｐ．ｐａｓ
ｔｏｒｉｓが発現したアンジオスタチンが今回の検討で
用いた投与量、投与法によって全身性あるいは局所性の
毒性を全く示さなかったことである。炎症および出血の
事実は全ての処置マウスにおいて認められなかった。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが発現したアンジオスタチンタン
パク質は２つの重要な天然タンパク質の物理的特性を有
している。（１）ヒトプラスミノーゲンのクリングル１
〜３に対して作製された、立体構造依存的な抗体によっ
て認識される（図３８Ｂ）。（２）リジンを結合する
（図３８Ａ、Ｂ）。これらの特性は組換えアンジオスタ
チンタンパク質が、本来の分子を模倣する立体構造を保
つ形で発現されていることを示している。Ｐ．ｐａｓｔ
ｏｒｉｓが発現したアンジオスタチンタンパク質はｂＦ
ＧＦで刺激されたウシ微小血管内皮細胞の増殖をインビ
トロで阻害する（図４０）。全身性に投与した場合、放
置すれば致死的な転移性のＬｅｗｉｓ肺癌を抑制状態に
維持する（図４１ＡとＢ、図４２）。
【０１８７】初期のデータでは、マウスから切除した新
鮮なＬｅｗｉｓ肺癌あるいはインビトロの培養系で４回
継代したＬＬＣ細胞にはアンジオスタチンの転写物は認
められなかった。肝臓で産生されるプラスミノーゲン
は、循環血流中で濃度が１．６±０．２μＭに維持され
ている。ＬＬＣ−ＬＭ腫瘍の場合、結合型あるいは循環
血流中のプラスミノーゲンを切断しアンジオスタチンを
産みだす酵素を発現していると言う可能性がある。別の
可能性としては、腫瘍部位に集積する炎症系の細胞がそ
のような酵素を産生するのかも知れない。
【０１８８】本来のヒトプラスミノーゲンと同様にＰ．
ｐａｓｔｏｒｉｓの発現するプラスミノーゲンがどちら
も糖鎖修飾されている形とされていない形として産生さ
れるのは大変興味深い。ヒトプラスミノーゲンの場合単
一の遺伝子に相当する単一の転写物が両方の形状を生産
し得る。ＴＰＡで認められるものと同様に、ヒトプラス
ミノーゲンの異なった翻訳後修飾のメカニズムは不明で
ある。
【０１８９】アンジオスタチンはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ
によって極めて良く発現される。上清は１００ｍｇ／Ｌ
のタンパク質を含んでいる。従って、臨床試験に必要と
される量は簡単に産生され、その技術の習熟者には良く
知られた一般的な方法を用いて精製することができる。
この発現系の開発と、精製された組換えアンジオスタチ
ンのインビトロとインビボの転移に対する活性が、これ
らの断片の腫瘍増殖の抑制と癌患者あるいは血管新生が
介在する疾患を患っている他の患者の延命を来たす能力
を評価する上での基礎をなしている。
【０１９０】
【実施例２９】アンジオスタチン凝集体の産生と投与 この実施例は、内皮細胞増殖および腫瘍成長を阻害する
ためにアンジオスタチン凝集体の産生と投与について記
載する。一般的に、大腸菌から産生される組み換えタン
パク質はインビボで活性を獲得するためには可溶化した
後再び折り畳むこと（復元、還元し、アルキル化する）
が必要と考えられる。この過程において、しばしばかな
りの量のタンパク質が失われてしまう。本実施例におい
ては、凝集型のアンジオスタチンが精製後に作製され、
その後の復元、還元、アルキル化を経ずに、血管新生と
腫瘍増殖を抑制する目的で直接使用された。従って、本
実施例においては驚くべきほどにアンジオスタチンの生
産と使用が効率的な方法を提示している。この凝集型の
アンジオスタチンと、運搬供与の方法についてもアンジ
オスタチンの持続放出の手段を提供している、従ってそ
の効率を最適化している。ここで用いている”凝集型の
アンジオスタチン”と言う用語は、後でより詳細に記載
するように、本質的に精製されているが、手で再折たた
みをしていないアンジオスタチンを意味している。
【０１９１】＜アンジオスタチンの発現＞迅速で生産性
が高く廉価であるという利点を持つ大腸菌を用いた発現
系が、マウスアンジオスタチンの発現に用いられた。Ｐ
ＣＲを基礎にしたアンジオスタチンの発現系を構築する
作戦に沿って、プラスミノーゲンのクリングル１−４の
ｃＤＮＡ配列（プラスミノーゲンのｃＤＮＡはＡＴＣＣ
より購入した）の両外側に位置する２つのオリゴプライ
マーを作製した。(一例としてMenhart，N.，Shel，L.
C.，Kelly，R.F.，and Castellino，F.J．（1991）Bioc
hem．30，1948-1957);Marti，D.，Schaller，J.，Ochen
sberger，B.，and Rickli，E.E．（1994）Eur．J．Bioc
hem．219，455-462; Sondel，S.，Hu，C.-K.，Marti，
D.，Affolter，M.，Schaller，J.，Llinas，M.，and Ri
ckli，E.E．（1996）Biochem．印刷中;Rejante，M.R.，
Byeon，I.-J.L.，and Llinas，M．（1991）Biochem．3
0，11081-11092を参照）ＰＣＲ産物は、Ｔ７ ｌａｃプ
ロモーターとオリゴヒスチジン配列を持つｐＥＴ２２ベ
クター（Ｎｏｖｅｇｅｎ社）のＮｃｏＩとＸｈｏＩ制限
酵素部位に挿入した。次いでｃＤＮＡはｌａｃ ＵＶ５
の制限下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を染色体
上に持つ大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）系統）を形質転換
させた。組換えアンジオスタチンの発現はＩＰＴＧの添
加によって誘導された。発現されたアンジオスタチン
は、宿主細胞内で封入体として蓄積し、典型的にはクマ
シ−ブルー染色によれば全細胞中のタンパク質の４０％
以上を占める。本発明は、どのような種由来であっても
組換えアンジオスタチンとその断片は、本技術に習熟し
ている者に良く知られている多様なベクターと宿主の系
列において発現することが可能であると期待している。
【０１９２】＜アンジオスタチンの精製と凝集＞超音波
処理した封入体を含んだ宿主細胞の不溶性画分は、９０
００ｒｐｍで２５分の遠心と洗浄の繰り返しで精製し
た。結果得られた産物は、クマシーブルー染色によって
評価したところ８０％のアンジオスタチンを含んでい
る。融合タンパク質のＮ末端オリゴヒスチジン部位は、
封入体を６Ｍウレアで可溶化することによる変性条件下
でＮｉ2+−ＮＴＡアガロースカラム（１．５ｃｍｘ５ｃ
ｍ）を用いたキレートアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いることによって便利で経済的に精製することを
可能にする。図４３のレーン７に見られるように、精製
したアンジオスタチンはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でクマシー
ブルー染色によって、およそ４５キロダルトン〜６５キ
ロダルトンの間、より好ましくは約５５キロダルトンの
単一のバンドとして認められる。この一段階のクロマト
グラフィーは本質的にタンパク質を均質なまでに精製す
ることができるが、本発明は、本技術分野にに習熟して
いる者に良く知られている多様な他の精製法についても
この製品を得るために適用することができると期待す
る。
【０１９３】溶出液中のタンパク質は、次いでリン酸緩
衝生理食塩液（ＰＢＳ）に対して２４時間に３回透析液
を交換して４℃で透析（分子量１５,０００カットオ
フ）した。透析の間、白い沈殿が認められた。試料を透
析チューブから回収し、沈殿物を遠心によって取り去っ
た。沈殿物は次いでボルテックスを用いてＰＢＳ中に再
懸濁し、動物実験に供するように微細な懸濁液を作製し
た、あるいは−２０℃で保存した。この沈殿物は凝集型
アンジオスタチンを成す。他の選択として一例を示せ
ば、２０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．９／１５０ｍＭ食塩も
透析液として用いることができる。本発明は、本開示の
視点から本技術分野で習熟するものによって日常的に決
定できる制限内で、より多くのあるいはより少ない透析
あるいは多様な他の透析用緩衝液が、相当量の凝集型の
アンジオスタチンを得るために利用可能であることを期
待している。
【０１９４】＜凝集型アンジオスタチンのインビトロ試
験＞実施例８にて概略を示したように、ウシ微小血管内
皮（ＢＣＥ）細胞が本評価に用いられた。細胞に本実施
例で示した様に作製された凝集型組換えヒトアンジオス
タチンを添加した。結果は、凝集型アンジオスタチンに
曝露した内皮細胞が有意に阻害されることを明らかにし
ている図４４に示した。
【０１９５】＜凝集型アンジオスタチンのインビボ試験
＞全ての動物実験は小児病院の動物実験施設において、
施設のガイドラインに従って行われた。 Ａ．本実施例に記載されているように作製された凝集型
組換えマウスアンジオスタチンは、ニワトリＣＡＭ試験
によって評価した。（O'Reilly，M.S.，Holmgren，L.，
Shing，Y.，Chen，C.，Rosenthal，R.A.，Moses，M.，L
ane，W.S.，Cao，Y.，Sage，E.H.，and Folkman，J．Ce
ll（1994）79:315-328）２５μｇの用量で微小血管の形
成に対する阻害効果は１００％であった（５個のニワト
リＣＡＭ試験の全てにおいて、２〜３+の阻害範囲を示
した）。１００μｇの用量では、微小血管形成に対する
阻害効果は９６時間持続した。他の血管新生阻害剤とプ
ラスミノーゲン由来のアンジオスタチンの効果は約４８
時間持続することが知られている。このことは、凝集型
アンジオスタチンが持続性放出という利点をもたらすこ
とを示唆している。 Ｂ．Ｌｅｗｉｓ肺癌は、Ｃ５７Ｂ１６マウスの後背部中
央の皮下に接種した。マウスは、既に記載したように調
製した０．１ｍｌのＰＢＳ中の１ｘ１０6個の 細胞を植
え付けられ、飼育ケージに６匹以下の群で入れられた。
腫瘍は、ダイアル式ノギスで測定し、腫瘍容積は幅ｘ幅
ｘ長さｘ０．５２と言う式で決定された。処置群対対照
との腫瘍容積の比（Ｔ／Ｃ）は、最終の時点で算出し
た。
【０１９６】３から５日経って腫瘍容積が１００−２０
０立方ミリメーターになった後、マウスをランダムに２
つの独立の試験に分けた。最初の試験においては、マウ
スは２−３ｍｇ／ｋｇの凝集型組換えマウスアンジオス
タチンのＰＢＳ懸濁液を２４時間おきに腫瘍部位とは離
れた場所に皮下投与された（ｎ=３匹／群）。対照群で
は、相当する量の生理食塩液を投与された。２つ目の独
立の試験においては（ｎ=６匹／群）、実験用マウスは
１０ｍｇ／ｋｇの凝集型組換えマウスアンジオスタチン
のＰＢＳ懸濁液を２４時間おきに腫瘍部位とは離れた場
所に皮下投与された。対照群では、相当する量の生理食
塩液を投与された。
【０１９７】凝集型組換えマウスアンジオスタチン懸濁
液を投与されたいずれのマウスにおいても毒性、体重減
少は認められなかった。マウスにおいては凝集型アンジ
オスタチンが注射後皮下の固形物質として認められ、数
時間かけて吸収した。このことは、それが徐々に可溶化
される事を示唆し、凝集型アンジオスタチンは持続性放
出の効率的な手段であることを示している。両方の用量
においてＬｅｗｉｓ肺癌の原発巣において処置群のマウ
スにおいては有意な成長の阻害が認められた。図４５、
４６を参照のこと。（対照の生理的食塩液群において
は、死亡例が出始め、処分しているが）１９日間に渡っ
て１日１回、１０ｍｇ／ｋｇ／日を投与されて得られた
Ｔ／Ｃ値は０．０６であり、この発明の知見以前では得
られなかったような腫瘍容積の縮小である。
【０１９８】本実施例におけるインビトロとインビボの
結果は、ヒトにおいて内皮細胞増殖、血管新生、腫瘍の
成長の阻害のために記載した製品と過程との使用がうま
くいくことを期待させる基礎をなすものである。理論に
縛られることを望むわけではないが、この方法で作製さ
れた凝集型組換えアンジオスタチンは、通常復元されて
いるエラスターゼによって作製されるアンジオスタチン
や他の精製タンパク質と異なる立体構造を持ち、従って
異なる物理学的特性を持つ可能性がある。精製した組換
えアンジオスタチンは、凝集型の懸濁液を作製するため
に比較的大量の緩衝液か水に対して透析することによっ
て沈殿させられる。これは、不正確に折り畳まれたタン
パク質が不溶性になり凝集するために起こると考えられ
ている。以前は、変性した凝集型タンパク質が生体にお
いてこのように極めて有効であることは期待されなかっ
たであろう。明かにされた強力な抗腫瘍活性は、皮下か
らの凝集タンパク質の遅いが持続的な溶解と放出に因る
ものと信じられる。本発明はさらに、天然界に存在する
あるいは組換えのアンジオスタチンとアンジオスタチン
断片が、復元する必要無しに内皮細胞の増殖と腫瘍の成
長を効果的に阻害できる凝集型の天然あるいは組換えの
アンジオスタチンあるいはアンジオスタチンの凝集型断
片を得るために記載された精製法を用いることによって
使用されることを期待している。
【０１９９】なお、これまでに記載した事項は、本発明
の好ましい実施態様にのみ関連し、後記に添付される特
許の請求範囲に記載される本発明の範囲と精神から逸脱
することなく多くの修飾や変更を加えることができるも
のである。様々な参考文献がここで引用されており、こ
の記載によってその全体を包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１完全なマウスの
プラスミノーゲンのアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、マウスのアンジオスタチンの開始配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、マウスのプラスミノーゲン
タンパク質フラグメントの配列とヒト（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：３）、アカゲザル（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ブタ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ウシ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
６）の配列の相当部分との比較を示す。マウスの配列が
１番目、次いでヒト、アカゲザル、ブタ、ウシの順であ
る。
【図３】図３は、図２の配列の続きである。
【図４】図４は、図３の配列の続きである。
【図５】図５は、一次腫瘍の存在または非存在下におけ
る、肺の腫瘍細胞のＢｒｄＵ標識インデックスである。
【図６】図６は、インビボにおけるｂＦＧＦに誘導され
た血管新生に対するルイスラット肺一次腫瘍の影響のマ
トリゲル分析を示す。
【図７】図７は、ルイスラット肺癌（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）
を宿すマウスから得た血清と正常マウスから得た血清の
用量反応曲線を示す。ウシ毛細血管内皮細胞をｂＦＧＦ
誘導７２時間増殖アッセイを使用して検定した。
【図８】図８は、腹水中では低および高転移性腫瘍のい
ずれもが内皮細胞分裂活性を有するが、血清中では低転
移性腫瘍系のみが内皮阻害活性を有することを示す。
【図９】図９は、腫瘍を宿す動物から得た粗精製の血清
と尿のＣ４逆相クロマトグラフィーのプロファイルを示
す。
【図１０】図１０は、完全なプラスミノーゲン分子、ヒ
トのプラスミノーゲンリジン結合サイトＩ調製物から得
た活性画分、腫瘍を宿すマウスから得た濃縮尿、および
正常マウスから得た濃縮尿で処置後１３日目のマウスの
肺表面転移を示す。
【図１１】図１１は、ヒトのプラスミノーゲンの完全な
プラスミノーゲン分子、リジン結合サイトＩ調製物から
得た活性画分、腫瘍を宿すマウスから得た濃縮尿、およ
び正常マウスから得た濃縮尿で処置後１３日目のマウス
の肺重量を示す。
【図１２】図１２は、ｐＴｒｃＨｉｓベクターの概略図
である。
【図１３】図１３は、１０リットルの大量培養されたヒ
トアンジオスタチンを発現する大腸菌の、ヒトプラスミ
ノーゲンクリングル領域１〜３に対するモノクローナル
抗体をプローブとした免疫ブロットである。矢印は組み
換えられたヒトアンジオスタチンを示す。Ａ）は、０．
２Ｍアミノカプロン酸で溶出された組み換えアンジオス
タチンを示す。Ｂ）は、リジンカラムの１ＸＰＢＳでの
最後の洗浄液を示す。Ｃ）は破損した細胞からの透明な
細胞溶解産物を示す。
【図１４】図１４は、成長するウシ毛細血管内皮細胞の
パーセント阻害を保存液の希釈の関数として示す；Ａ
１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、およびＥはヒトアンジオスタチ
ン抗血管新生活性を発現する組み換えクローンである；
Ｃ１、Ｃ２、Ｄ１、およびＤ２対照は、アンジオスタチ
ンをコードするヒトのＤＮＡ配列を含まないベクターを
含有する負の対照クローンである。
【図１５】図１５は、インビトロにおけるウシ毛細血管
内皮細胞に対する組み換えヒトアンジオスタチンの増殖
阻害作用を示す。
【図１６】図１６は、一次腫瘍の除去および生理食塩水
または抗血管新生作用を有するフマギリンアナログを使
用した処置後の、成長増殖インデックスおよびアポプト
シスインデックスを示す。
【図１７】図１７は、インビボにおけるヒトアンジオス
タチンの４０ｍｇ／ｋｇ／日の単回投与による治療によ
るマウスのＴ２４１一次腫瘍の成長の阻害を示す。
【図１８】図１８は、インビボにおけるヒトアンジオス
タチンの４０ｍｇ／ｋｇ／投与（８０ｍｇ／ｋｇ／日）
二回投与による治療によるマウスのＬＬＣ−ＬＭ一次腫
瘍の成長の阻害を示す。
【図１９】図１９は、ルイスラット肺癌の一次腫瘍の除
去のその肺転移の成長に与える作用を示す。
【図２０】図２０は、腫瘍切除後の成長増殖およびアポ
プトシスインデックスを示す。
【図２１】図２１は、Ｔ２４１線維肉腫細胞を移植され
たマウスにおける腫瘍総容積に対するアンジオスタチン
タンパク質投与の作用を時間の関数として示した。
【図２２】図２２は、ルイスラットの肺癌（ＬＭ）細胞
を移植されたマウスにおける腫瘍総容積に対するアンジ
オスタチンタンパク質投与の作用を時間の関数として示
した。
【図２３】図２３は、細網肉腫細胞を移植されたマウス
における腫瘍総容積に対するアンジオスタチンタンパク
質投与の作用を時間の関数として示した。
【図２４】図２４は、ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞を移植
された免疫欠損ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍総容積に対
するアンジオスタチンタンパク質投与の作用を、２４日
以上の期間にわたり、時間の関数として示した。
【図２５】図２５は、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ細胞を移植
された免疫欠損ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍総容積に対
するアンジオスタチンタンパク質投与の作用を、２４日
以上の期間にわたり、時間の関数として示した。
【図２６】図２６は、マウスのプラスミノーゲンｃＤＮ
Ａに由来するマウスアンジオスタチンタンパク質をコー
ドするマウスＤＮＡ配列のクローニングの概略図であ
る。マウスアンジオスタチンは、マウスのプラスミノー
ゲンクリングル領域１〜４を含む。ＰＣＲは、ポリメラ
ーゼチェイン反応の略である；Ｐ１は、ＰＣＲのための
５’末端オリゴヌクレオチドプライマーである；Ｐ２
は、ＰＣＲのための３’末端オリゴヌクレオチドプライ
マーである；ＳＳは、シグナル配列である；ＡＴＧは、
翻訳開始コドンである；ＴＡＡは、翻訳停止コドンであ
る；ＨＡは、ヘマグルチニンエピトープタグ（ＹＰＹＤ
ＶＰＤＹＡＳＬ）；Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３およびＫ４は、そ
れぞれマウスのプラスミノーゲンクリングル領域１、
２、３、および４である。ＣＭＶはサイトメガロウイル
スプロモーターである；Ｔ７は、バクテリオファージプ
ロモーターである；ＰＡは未活性化タンパク質である；
ＳＰ６は、Ｓｐ６プロモーターである。
【図２７】図２７は、非感染細胞（ｍｏｃｋ）；アンジ
オスタチンをコードするＤＮＡ配列を含まないベクター
（ベクター５）のみで感染させた細胞、および２つのア
ンジオスタチン発現クローン（ＡＳＴ３１およびＡＳＴ
３７）における日数の関数とした細胞数を示す。パネル
（ａ）は、Ｔ２４１細胞の感染結果を示す。パネル
（ｂ）は、ＬＬ２細胞の感染結果を示す。
【図２８】図２８は、アンジオスタチンクローンを含有
する大腸菌細胞に由来する細胞培養液の細胞数について
の結果を示す。非感染細胞（ｍｏｃｋ）；アンジオスタ
チンをコードするＤＮＡ配列を含まないベクターのみで
感染させた細胞（ベクター５）、および３つのアンジオ
スタチン発現クローン（ＡＳＴ２５、ＡＳＴ３１および
ＡＳＴ３７）。パネル（Ａ）は、対照（ｍｏｃｋ）およ
び全てのアンジオスタチンクローン（発現および非発
現）の細胞培養液の細胞数についての培養結果を示す。
パネル（Ｂ）は、対照（ｍｏｃｋ）、ベクターのみ（ベ
クター６）、およびマウスのアンジオスタチンを発現す
るアンジオスタチンクローンの細胞培養液の細胞数につ
いての培養結果を示す。パネル（Ｃ）は、対照（ｍｏｃ
ｋ）およびマウスのアンジオスタチンを発現するアンジ
オスタチンクローンの精製培養液の細胞数についての培
養結果を示すが、ここにおいて培養液はリジン結合組成
物を回収するためにリジン−セファロースカラムで精製
された。
【図２９】図２９は、Ｔ２４１線維肉腫細胞の移植時の
関数とした、マウスにおける腫瘍総容積に対する作用を
示すが、ここでは線維肉腫細胞は、アンジオスタチンタ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列を保有するベクターで
感染させ、およびベクターはアンジオスタチンタンパク
質を発現することができる。「非感染」とは、マウスに
移植された無加工のＴ２４１線維肉腫細胞である。「ベ
クター６」は、マウスに移植された、アンジオスタチン
タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含まないベクター
のみで感染させたＴ２４１線維肉腫細胞である。「クロ
ーン２５、クローン３１、クローン３７」は、マウスに
移植された、アンジオスタチンタンパク質をコードする
ＤＮＡ配列を含むベクターで感染させたＴ２４１線維肉
腫細胞の３種のアンジオスタチン産生クローンである。
【図３０】図３０は、ヒトプラスミノーゲンおよびその
クリングルフラグメントの構造を図示したものである。
ヒトプラミノーゲンは、Ａｓｎ289に一ヶ所のＮ−結合
糖鎖付加部位を有する、７９１個のアミノ酸を含む一本
鎖タンパク質である。５個の分れたドメインに存在する
Ｎ末端の５６１個のアミノ酸を含むヒトプラスミノーゲ
ンのプロテアーゼでない領域はクリングルと呼ばれ、こ
れらの構造を分けているタンパク質と共に○で示してい
る（Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４およびＫ５）。三重のＳ−
Ｓ結合で結合されたクリングルのそれぞれは、８０個の
アミノ酸を含む。アンジオスタチンは最初の４個のクリ
ングルドメイン（Ｋ１−４）にあたり、クリングル３
（Ｋ１−３）とクリングル４（Ｋ４）はエラスターゼで
ヒトプラスミノーゲンを消化することによって得られ
る。残りのクリングルフラグメントは、大腸菌で発現さ
れた組み換えタンパク質である。ＳＳ＝シグナル配列。
ＰＡ＝ 前活性化タンパク質。
【図３１】図３１は、還元条件下での、プラスミノーゲ
ンの精製した組み換え体および変成していないクリング
ルフラグメントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。（Ａ）
大腸菌溶解産物から精製した個々の組み換えクリングル
フラグメントを、１５％ＳＤＳゲルに流し、クマシーブ
ルーで染色した。レーンあたり各タンパク質５μｇを流
した。（レーン２＝クリングル１（Ｋ１）；レーン３＝
クリングル２（Ｋ２）；レーン４＝クリングル３（Ｋ
３）；レーン５＝クリングル４（Ｋ４）；レーン１＝分
子量マーカー）。（Ｂ）精製された大きなクリングルフ
ラグメントをクマシーブルーで染色した。クリングル１
−４（レーン２）およびクリングル１−３（レーン３）
を、ヒトプラスミノーゲンをエラスターゼで消化するこ
とにより、リジン−セファロースクロマトグラフィーに
よって精製した。クリングル２−３（レーン４）の組み
換えフラグメントを、大腸菌で発現させ、インビトロで
再度折りたたみさせた。分子量マーカーは左に示してい
る（レーン１）。
【図３２】図３２は、アンジオスタチンの各々の組み換
えクリングルフラグメントによる内皮細胞増殖の阻害を
示す。クリングルフラグメントを、１ｎｇ／ｍｌｂＦＧ
Ｆの存在下で７２時間、ウシ毛細血管内皮細胞でアッセ
イした。（Ａ）２種類のリジン−結合クリングル、ｒＫ
１およびｒＫ４の抗内皮細胞増殖効果。高親和性リジン
結合クリングル、Ｋ１（−○−）は、用量依存性にＢＣ
Ｅ細胞の増殖を阻害した。中親和性リジン結合クリング
ル、Ｋ４（−●−）は、高濃度の時にのみわずかな阻害
活性を示した。（Ｂ）非リジン結合Ｋ２およびＫ３によ
るＢＣＥ細胞増殖の阻害。Ｋ２（−■−）およびＫ３
（−□−）は両方とも、用量依存性にＢＣＥ細胞増殖を
阻害した。データは、３回の測定の平均＋／−ＳＥＭを
示す。
【図３３】図３３は、アンジオスタチンの大きなクリン
グルフラグメントの抗内皮細胞増殖活性を示す。タンパ
ク分解フラグメント、Ｋ１−４（アンジオスタチン）
（−○−）およびＫ１−３（−■−）は、用量依存性に
ＢＣＥ細胞増殖を阻害した。組み換えＫ２−３（−●
−）フラグメントは、Ｋ１−３およびＫ１−４よりも阻
害は弱かった。データは、阻害のパーセントとして、３
回の測定の平均（＋／−ＳＥＭ）を示す。
【図３４】図３４は、組み換えクリングル２およびクリ
ングル３の相加的阻害活性を示す。（Ａ）ｒＫ２−３の
完全なフラグメント（図３３も参照）は、３２０ｎＭの
濃度でのみ弱い阻害効果を示した。１６９番目のシステ
インをセリンに置換したｒＫ２の変異フラグメントとＫ
３（２９７番目のシステインをセリンに置換）をＢＣＥ
細胞で共にアッセイしたときに、相加的阻害が見られ
た。各値は３回の測定の平均＋／−ＳＥＭを示す。
（Ｂ）Ｋ２とＫ３の構造図示およびアミノ酸配列。鎖内
クリングルＳ−Ｓ結合が、Ｋ２のシステイン169および
Ｋ３のシステイン297間に存在することが以前に報告さ
れた（Sohndel，S.，Hu，C．−K.，Marti，D.，Affolte
rm M.，Schaller，J．Llinas，M.，and Rickli，E．E．
（1996）Biochem．印刷中）。
【図３５】図３５は、クリングルフラグメントの組合せ
による内皮細胞増殖の阻害を示す。アッセイは、３２０
ｎＭ濃度の各クリングルフラグメントを用いて行った。
値は、阻害のパーセントとして３回の測定の平均（＋／
−ＳＥＭ）を示す。（Ａ）様々な独立のクリングルフラ
グメントの組合せによるフラグメントの阻害効果。
（Ｂ）組合せたクリングルフラグメントの組合せによる
阻害活性。
【図３６】図３６は、還元およびアルキル化後の内皮細
胞におけるアンジオスタチンの阻害活性を示す。（Ａ）
ヒトアンジオスタチンの還元（レーン２）および非還元
（レーン１）型のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。精製したヒト
アンジオスタチンは、ＤＴＴで還元し、過剰量のヨード
アセトアミドでタンパク質のアルキル化を行った。処置
した標品は透析し、ＢＣＥ細胞でアッセイした。（Ｂ）
３２０ｎＭ濃度での還元および非還元型のアンジオスタ
チンによるＢＣＥ細胞増殖の阻害。データは、３回測定
の平均の阻害＋／−ＳＥＭを示す。
【図３７】図３７は、ヒトアンジオスタチンの推定され
るクリングルドメインのアミノ酸配列を示す。４個のク
リングルドメインの配列を、保存されたシステイン残基
に従って並べた。同一で保存されたアミノ酸残基は、影
を付けている。クリングル４中の四角で囲ったアミノ酸
残基は、２２番目と８０番目の保存されたシステイン残
基に隣接した、プラスに荷電した２個のリジン酸基を示
す。
【図３８】図３８は、発現したアンジオスタチンのリジ
ン結合性と反応性を示す。 図３８Ａは、クマシーで染
色したゲル（４０μｌ泳動）を示す。 図３８Ｂは、同
じゲルの免疫ブロット（２０μｌ泳動）を示す。レーン
１は、誘導された培養の震盪フラスコからの培養液を示
し、５０キロダルトンの位置のアンジオスタチンタンパ
ク質と数種の他のタンパク質を示す。誘導された培養か
らの培養液を緩衝液で１：１に希釈し、リジンセファロ
ース上で直接泳動した。レーン２は、リジンセファロー
スを通り抜けた非結合画分を示す。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓによって発現されたアンジオスタチンタンパク質は、
全てリジンカラムに結合する。レーン３は、０．２Ｍア
ミノカプロン酸による特異的な溶出を示し、Ｐ．ｐａｓ
ｔｏｒｉｓによって発現されたアンジオスタチンタンパ
ク質はリジンと結合し、リジンセファロース上の同一性
のために１ステップで精製することができることを示
す。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現されたアンジオ
スタチンタンパク質は、また、クリングル１〜３に対す
る立体配座依存性のモノクローナル抗体（ＶＡＰ）によ
って認識される。
【図３９】図３９は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発
現されたアンジオスタチンタンパク質は、変成非還元Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲルにおいて、４９キロダ
ルトンと５１．５キロダルトンの位置に泳動される二量
体であるようであることを示す。高マンノース構造に特
異的なＮ−グリカナーゼを用いて、発現されたアンジオ
スタチンタンパク質から１本のＮ−結合複合体を除去す
ると、４９．５キロダルトンの一本のバンドになる。パ
ネルＡおよびパネルＢはそれぞれ、クマシー染色をした
ゲルと、同じゲルの免疫ブロットを示す。レーン１は、
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現された精製されたア
ンジオスタチンタンパク質を示す。レーン２は、Ｎ−グ
リカナーゼなしで消化条件下でインキュベートしたＰ．
ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現された精製されたアンジ
オスタチンタンパク質を示す。レーン３は、Ｎ−グリカ
ナーゼで消化したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現さ
れた精製されたアンジオスタチンタンパク質を示す。
【図４０】図４０Ａは、クマシーゲル上で二連で泳動さ
れた、４μｇのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現され
た精製されたアンジオスタチンタンパク質を示す。図４
０Ｂは、精製された組み換え体がＢＣＥ増殖を阻害する
ことを示す。ｂＦＧＦの存在下（●）あるいは非存在下
（○）、対照としてＰＢＳとｂＦＧＦの存在下（△）、
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現されたアンジオスタ
チンタンパク質とｂＦＧＦの存在下（△）における７２
時間後のＢＣＥアッセイ細胞数を示す。図４０Ｃは、阻
害が用量依存性であることを示す。
【図４１】図４１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発
現された精製アンジオスタチンタンパク質を一次腫瘍と
共にマウスの全身に（皮下）に与えたことを示す。 図
４１ＡとＢは、生理食塩水、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによ
って発現されたアンジオスタチンタンパク質、あるいは
プラスミノーゲン由来アンジオスタチンタンパク質で毎
日処置したそれぞれのマウスの転移巣の数と肺重量を示
す。生理食塩水で処置したマウスの肺と比較して、Ｐ．
ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現されたアンジオスタチン
タンパク質あるいはプラスミノーゲン由来アンジオスタ
チンタンパク質で処置したマウスの肺は、血管新生を伴
わず、転移は有効に抑制されていた。
【図４２】図４２は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発
現されたアンジオスタチンで処置したマウスの肺は微小
転移のためにピンク色であったが、生理食塩水で処置し
た対象グループの肺は血管新生した転移巣によって完全
に覆われていたことを示す。
【図４３】図４３は、ニッケルアフィニティクロマトグ
ラフィーのもとでの様々なステージの精製及び凝集段階
における組み換えマウスアンジオスタチンの、還元ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）写真
を示す（レーン１−３はｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ
(封入体)洗浄液、レーン４は尿中の不溶性画分、レーン
５はアフィニティカラム開始材料、レーン６はカラムの
通り抜け、レーン７は溶出アンジオスタチン）。
【図４４】図４４は、ウシ毛細血管内皮細胞に対する組
み換えマウスアンジオスタチン凝集体。
【図４５】図４５は、ルイスラット肺癌を移植したマウ
スにおいてアンジオスタチン凝集体を２ｍｇ／ｋｇ／日
投与したときの腫瘍容量に対する効果を示す。
【図４６】図４６は、ルイスラット肺癌を移植したマウ
スにおいてアンジオスタチン凝集体を１０ｍｇ／ｋｇ／
日投与したときの腫瘍容量に対する効果を示す。
【配列表】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【表３１】
【表３２】
【表３３】
【表３４】
【表３５】
【表３６】
【表３７】
【表３８】
【表３９】
【表４０】
【表４１】
【表４２】
【表４３】
【表４４】
【表４５】
【表４６】
【表４７】
【表４８】
【表４９】
【表５０】
【表５１】
【表５２】
【表５３】
【表５４】
【表５５】
【表５６】
【表５７】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/745 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 37/47 Ｃ１２Ｒ 1:84） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 オーレイリー，マイケル，エス. アメリカ合衆国，01890 マサチューセッ ツ，ウィンチェスター，メイン ストリー ト 336番地 (72)発明者 カオ，イーハイ スウェーデン，ストックホルム エス− 116 32，アソガータン 184 ４ティーア ール. (72)発明者 リン，ジー アメリカ合衆国，02159 マサチューセッ ツ，ニュートン センター，エリジン ス トリート 70番地

Claims (47)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】プラスミノーゲン分子のクリングル領域断
    片を含む、薬学的組成物であって、クリングル領域断片
    は抗血管新生活性を有することを特徴とする薬学的組成
    物。
  2. 【請求項２】クリングル領域断片は、ほぼ１個のクリン
    グル領域である請求項１に記載の薬学的組成物。
  3. 【請求項３】クリングル領域断片は、ほぼ２個のクリン
    グル領域である請求項１に記載の薬学的組成物。
  4. 【請求項４】クリングル領域断片は、ほぼ３個のクリン
    グル領域である請求項１に記載の薬学的組成物。
  5. 【請求項５】クリングル領域断片は、ほぼ４個のクリン
    グル領域である請求項１に記載の薬学的組成物。
  6. 【請求項６】クリングル領域断片は、ほぼ５個のクリン
    グル領域である請求項１に記載の薬学的組成物。
  7. 【請求項７】クリングル領域断片は、約３８キロダルト
    ンから４５キロダルトンの分子量を有する請求項１に記
    載の薬学的組成物。
  8. 【請求項８】クリングル領域断片は、ヒトプラスミノー
    ゲン由来である請求項１に記載の薬学的組成物。
  9. 【請求項９】クリングル領域断片は、インビボで抗血管
    新生活性を有する請求項１に記載の薬学的組成物。
  10. 【請求項１０】クリングル領域断片は、インビトロで抗
    血管新生活性を有する請求項１に記載の薬学的組成物。
  11. 【請求項１１】クリングル領域断片は、血管新生依存性
    の疾患を阻害することができる請求項１に記載の薬学的
    組成物。
  12. 【請求項１２】クリングル領域断片は、腫瘍の成長を阻
    害することができる請求項１に記載の薬学的組成物。
  13. 【請求項１３】請求項１のクリングル領域断片をコード
    する核酸を含む薬学的組成物。
  14. 【請求項１４】クリングル領域断片は、ほぼ１個のクリ
    ングル領域である請求項１３に記載の薬学的組成物。
  15. 【請求項１５】クリングル領域断片は、ほぼ２個のクリ
    ングル領域である請求項１３に記載の薬学的組成物。
  16. 【請求項１６】クリングル領域断片は、ほぼ３個のクリ
    ングル領域である請求項１３に記載の薬学的組成物。
  17. 【請求項１７】クリングル領域断片は、ほぼ４個のクリ
    ングル領域である請求項１３に記載の薬学的組成物。
  18. 【請求項１８】クリングル領域断片は、ほぼ５個のクリ
    ングル領域である請求項１３に記載の薬学的組成物。
  19. 【請求項１９】クリングル領域断片は、約３８キロダル
    トンから４５キロダルトンの分子量を有する請求項１３
    に記載の薬学的組成物。
  20. 【請求項２０】クリングル領域断片は、ヒトプラスミノ
    ーゲン由来である請求項１３に記載の薬学的組成物。
  21. 【請求項２１】クリングル領域断片は、インビボで抗血
    管新生活性を有する請求項１３に記載の薬学的組成物。
  22. 【請求項２２】クリングル領域断片は、インビトロで抗
    血管新生活性を有する請求項１３に記載の薬学的組成
    物。
  23. 【請求項２３】クリングル領域断片は、血管新生依存性
    の疾患を阻害することができる請求項１３に記載の薬学
    的組成物。
  24. 【請求項２４】クリングル領域断片は、腫瘍の成長を阻
    害することができる請求項１３に記載の薬学的組成物。
  25. 【請求項２５】宿主細胞中に存在するときにクリングル
    領域断片を発現することができるベクターを更に含むこ
    とを特徴とする請求項１３に記載の薬学的組成物。
  26. 【請求項２６】ヒトの血管新生を阻害する方法であっ
    て、プラスミノーゲン分子のクリングル領域断片のイン
    ビボにおける濃度を、血管新生を阻害する量までヒトに
    おいて増加させる工程を含み、前記クリングル領域断片
    は抗血管新生活性を有することを特徴とする方法。
  27. 【請求項２７】クリングル領域断片は、ほぼ１個のクリ
    ングル領域である請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】クリングル領域断片は、ほぼ２個のクリ
    ングル領域である請求項２６に記載の方法。
  29. 【請求項２９】クリングル領域断片は、ほぼ３個のクリ
    ングル領域である請求項２６に記載の方法。
  30. 【請求項３０】クリングル領域断片は、ほぼ４個のクリ
    ングル領域である請求項２６に記載の方法。
  31. 【請求項３１】クリングル領域断片は、ほぼ５個のクリ
    ングル領域である請求項２６に記載の方法。
  32. 【請求項３２】クリングル領域断片は、約３８キロダル
    トンから４５キロダルトンの分子量を有する請求項２６
    に記載の方法。
  33. 【請求項３３】クリングル領域断片は、ヒトプラスミノ
    ーゲン由来である請求項２６に記載の方法。
  34. 【請求項３４】クリングル領域断片は、血管新生依存性
    の疾患を阻害することができる請求項２６に記載の方
    法。
  35. 【請求項３５】クリングル領域断片は、腫瘍の成長を阻
    害することができる請求項２６に記載の方法。
  36. 【請求項３６】ヒトの血管新生を阻害する方法であっ
    て、プラスミノーゲン分子のクリングル領域を、血管新
    生を阻害する量でヒトに投与する工程を含み、前記クリ
    ングル領域断片は抗血管新生活性を有することを特徴と
    する方法。
  37. 【請求項３７】クリングル領域断片は、ほぼ１個のクリ
    ングル領域である請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】クリングル領域断片は、ほぼ２個のクリ
    ングル領域である請求項３６に記載の方法。
  39. 【請求項３９】クリングル領域断片は、ほぼ３個のクリ
    ングル領域である請求項３６に記載の方法。
  40. 【請求項４０】クリングル領域断片は、ほぼ４個のクリ
    ングル領域である請求項３６に記載の方法。
  41. 【請求項４１】クリングル領域断片は、ほぼ５個のクリ
    ングル領域である請求項３６に記載の方法。
  42. 【請求項４２】クリングル領域断片は、約３８キロダル
    トンから４５キロダルトンの分子量を有する請求項３６
    に記載の方法。
  43. 【請求項４３】クリングル領域断片は、ヒトプラスミノ
    ーゲン由来である請求項３６に記載の方法。
  44. 【請求項４４】クリングル領域断片は、血管新生依存性
    の疾患を阻害することができる請求項３６に記載の方
    法。
  45. 【請求項４５】クリングル領域断片は、腫瘍の成長を阻
    害することができる請求項３６に記載の方法。
  46. 【請求項４６】抗血管新生活性を有する、３次元クリン
    グル様配座またはシステインモティーフを有する、単離
    された蛋白質またはペプチド。
  47. 【請求項４７】前記蛋白質またはペプチドはプラスミノ
    ーゲン由来であることを特徴とする、請求項４６に記載
    の単離された蛋白質またはペプチド。
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